JP2018057364A - 修飾された癌細胞株及びその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】癌細胞のさらなる増殖を防止するために、癌細胞を破壊することの代わりに、修飾することによって自己又は異種の免疫応答を引き起こすことで、効果的な癌治療法、及び潜在的な癌治療のためのより効果的なスクリーニング方法の提供。
【解決手段】修飾された癌細胞におけるＳＴ３Ｇａｌ１糖転移酵素（ＳＴ３Ｇａｌ１）の発現が減少する、修飾された癌細胞。前記ＳＴ３ＧＩＩの発現が従来の癌細胞と比較して、１〜９９％減少する修飾された癌細胞。
【選択図】図１Ａ

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１６年８月４日に出願された米国仮出願第６２／３７１，０９１号から優先権を主張するものであり、該特許出願の記載事項は、本明細書において全体が参照として引用される。

本発明は、修飾された癌細胞株及びその用途に関する。

グリコシル化はタンパク質にとって非常に重要な翻訳後修飾である。異常なグリコシル化は、糖タンパク質の炭水化物部分の末端部分に主に影響し、腫瘍関連抗原を発現すると共に、より進行した癌病期及び転移を発生することになる。

癌細胞は現在、腫瘍関連抗原を発現することが知られているが、免疫系から腫瘍抗原を隠す能力及び／又は曝露された腫瘍抗原がヒト免疫系に正常として認識又は許容される正常な非突然変異性分化分子又はタンパク質であるため、免疫応答を回避することができる。癌細胞が制御されない状態で増殖するが、身体にとってその癌細胞が必ずしも「外来物」として認識されるわけではないので、標的化することが困難であり、癌の除去は挑戦的な課題である。

癌を効果的に治療するためには、身体の免疫系がこれらの癌に対して陽性の免疫応答を示すことが好ましい。さらに、癌と闘うために、新型且つより効果的な抗癌治療剤は重要である。細胞ベースのスクリーニング法は、前臨床薬開発の初期段階において、新型の抗癌治療剤の有効性及び毒性を評価する際の重要な情報源である。

したがって、癌細胞のさらなる増殖を防止するために、癌細胞を破壊することの代わりに、修飾することによって自己又は異種の免疫応答を引き起こすことで、効果的な癌治療法が必要とされている。また、さらに必要とされるのは、潜在的な癌治療のためのより効果的なスクリーニング方法である。本発明によれば、これらの需要及び他の需要を満たすことができる。

本発明の実施形態において、修飾された癌細胞を提供し、修飾された癌細胞におけるＳＴ３ β−ガラクトシド α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ３ ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ ａｌｐｈａ−２，３−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １，「ＳＴ３Ｇａｌ１」、配列番号１を参照）の発現が、従来の癌細胞と比較して低減される。例示的な実施形態において、修飾された癌細胞におけるＳＴ３Ｇａｌ１の発現を効果的に減少するために、少なくとも１つの遺伝子構築物が使用される。

本発明の一実施形態により、潜在的な癌治療剤をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、（ａ）潜在的な癌治療剤の存在下で本明細書に記載の修飾された癌細胞を増殖させ、及び前記潜在的な癌治療剤の非存在下で本明細書に記載の修飾された癌細胞を増殖させるステップと、（ｂ）潜在的な癌治療剤の存在下で修飾された癌細胞の増殖速度を測定し、及び潜在的な癌治療剤の非存在下で修飾された癌細胞の増殖速度又は細胞数を測定するステップと；（ｃ）潜在的な癌治療剤の存在下及び潜在的な癌治療剤の非存在下で、修飾された癌細胞の増殖速度又は細胞数を比較するステップとを含み、その中、潜在的な癌治療剤の存在下で修飾された癌細胞のより低い増殖速度の遅延又はより低い細胞数は、癌治療剤として働くことを示す。

本発明の他の実施形態により、ＳＴ３Ｇａｌ１の発現を抑制する有効量の遺伝子構築物及び抗癌剤を投与するステップを含み、対象の癌細胞増殖を抑制するための方法であって、有効量の遺伝子構築物及び前記抗癌剤が、相乗作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｍａｎｎｅｒ）で前記対象における癌細胞増殖を抑制する。

この特許において用いられている「発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、「前記発明（ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、「この発明（ｔｈｉｓ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」及び「本発明（ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、広義には、この特許及び添付の特許請求の範囲の全ての主題事項を指すことを意図している。これらの用語を含む陳述は、本明細書に記載された主題事項又は添付の特許請求の範囲の意味もしくは範囲を限定することが理解すべきである。この特許によってカバーされる本発明の実施例は、この概要ではなく、以下の特許請求の範囲によって定義される。この概要は、本発明の様々な態様の高レベルの概要であり、以下の「発明を実施するための形態」のセクションでさらに説明する概念のいくつかを紹介している。この概要は、特許請求される主題事項の重要な特徴、又は本質的な特徴を特定することを意図したものではなく、特許請求される主題事項の範囲を決定するために単独で使用されることを意図するものでもない。この主題は、明細書全体、任意の図面又は全ての図面及び各請求項の適切な部分を参照することによって理解されるべきである。

本発明の本質及び利点のさらなる説明は、明細書及び図面の残りの部分を参照することによって理解されることができる。

図１Ａは、スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅ）ｓｉＲＮＡ（「ｓｃ」）又はＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ（「ｓｉ」、配列番号２のアンチセンス鎖及び配列番号３のセンス鎖を含む）でトランスフェクトした乳癌細胞のＳＴ３Ｇａｌ１ ｍＲＮＡの発現を示す棒グラフである。 図１Ｂは、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした乳癌細胞におけるＰＮＡ結合信号の増加を示す図である。 図１Ｃは、乳癌細胞のＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシング後に、ＰＮＡ結合タンパク質の中の１つというＣＤ５５の信号が増加した（２．６倍）ことを示す図である。 図１Ｄは、乳癌細胞におけるＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡサイレンシング後のＣＤ５５結合信号の増加を示す図である。 図２Ａは、ＳＴ３Ｇａｌ１スクランブルＲＮＡ（「ｓｃ」）でトランスフェクトした乳癌細胞と比較して、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ（「ｓｉ」）でトランスフェクトした乳癌細胞が抗ＨＬＡ抗体媒介性補体依存性細胞傷害（ａｎｔｉ−ＨＬＡ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ）に対してより敏感であることを示す線グラフである。 図２Ｂは、ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングがＣＤ５５の分子量に影響することを示すウエスタンブロット画像である。 図３は、ＳＴ３Ｇａｌ１スクランブルＲＮＡ（ｓｃ）でトランスフェクトした乳癌細胞と比較して、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ（ｓｉ）でトランスフェクトした乳癌細胞のＣ３沈着の増加を示す線グラフである。 図４は、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした乳癌細胞が、ＳＴ３Ｇａｌ１スクランブルＲＮＡでトランスフェクトした乳癌細胞と比較して、抗ＳＳＥＡ４抗体媒介抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に対してより敏感であることを示す棒グラフである。 図５は、ＣＤ５５分子のシアリル化（ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）を特徴付けるウエスタンブロット画像である。 図６Ａは、ＣＤ５５分子のＮ−グリカン（Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ）を示す直接ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析である。 図６Ｂは、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ（ｓｉ）及びスクランブルＲＮＡ（ｓｃ）でトランスフェクトした乳癌細胞におけるｍ／ｚ８６４．４２６（２＋）でのジシアリル化コア２構造及びｍ／ｚ６８３．８３９（２＋）でのモノシアリル化コア２構造のパーセンテージを示す図である。 図７Ａ及び図７Ｂは、（スクランブルＲＮＡでトランスフェクトした）従来の前立腺癌細胞及び（スクランブルＲＮＡでトランスフェクトした）従来の神経芽細胞腫細胞と比較して、ＳＴ３Ｇａｌ１の抑制が前立腺癌細胞（図７Ａ）及び神経芽細胞腫細胞（図７Ｂ）の増殖を有意に減少されたことを示す棒グラフである。 図７Ａ及び図７Ｂは、（スクランブルＲＮＡでトランスフェクトした）従来の前立腺癌細胞及び（スクランブルＲＮＡでトランスフェクトした）従来の神経芽細胞腫細胞と比較して、ＳＴ３Ｇａｌ１の抑制が前立腺癌細胞（図７Ａ）及び神経芽細胞腫細胞（図７Ｂ）の増殖を有意に減少されたことを示す棒グラフである。 図８Ａ〜８Ｃは、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃ）又は種々のＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ及びＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｈＲＮＡでトランスフェクトした乳癌細胞のＳＴ３Ｇａｌ１ ｍＲＮＡの発現を示す棒グラフである。 図８Ａ〜８Ｃは、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃ）又は種々のＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ及びＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｈＲＮＡでトランスフェクトした乳癌細胞のＳＴ３Ｇａｌ１ ｍＲＮＡの発現を示す棒グラフである。 図８Ａ〜８Ｃは、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃ）又は種々のＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ及びＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｈＲＮＡでトランスフェクトした乳癌細胞のＳＴ３Ｇａｌ１ ｍＲＮＡの発現を示す棒グラフである。 図９は、対照グループ（ＳＴ３Ｇａｌ１スクランブルＲＮＡとタモキシフェン及び／又はバンデタニブとの組み合わせ）と比較して、タモキシフェン（Ｔａｍ）及び／又はバンデタニブ（Ｖａｎ）とＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡとの組み合わせの相乗効果を示す棒グラフである。

本明細書で使用される場合、冠詞「１つ（ａ）」及び「１つ（ａｎ）」は、その冠詞の文法的目的の１つ又は複数（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。

本明細書で使用される「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、ＳＴ３Ｇａｌ１を抑制する、又は癌の症状及び徴候、例えば、体重減少、疼痛及び臨床的に触診可能な腫瘍量又は放射線学的に様々な撮像手段を介して検出可能な腫瘍量を有効的に減少するのに十分である遺伝子構築物の投与量を指す。用語「有効量」及び「治療上有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、交換可能に使用される。

用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、癌を有する脊椎動物、又は癌治療を必要とするとみなされる脊椎動物を指すことができる。対象としては、例えば、霊長類の哺乳動物のような全ての温血動物が含まれ、より好ましくはヒトである。非ヒト霊長類の動物は、同様に対象である。用語「対象」は、飼い慣らされた動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、アレチネズミ、モルモットなど）を含む。したがって、獣医学的使用及び医学的製剤が本明細書において企図される。

用語「ノックダウン」及び「サイレンシング」は交換可能に使用され、遺伝子構築物の導入前に、ＳＴ３Ｇａｌ１ ＲＮＡ又はタンパク質の発現がそのＲＮＡ又はタンパク質の発現と比較して、低下することを指す。

（修飾された癌細胞）
本発明は、前記修飾された癌細胞におけるＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質及び／又はＲＮＡの発現が低減された、修飾された癌細胞を提供する。一実施形態において、修飾された癌細胞は、従来の癌細胞と比較して、約１％〜約９９％のＳＴ３Ｇａｌ１糖転移酵素を含む。他の実施例において、修飾された癌細胞におけるＳＴ３Ｇａｌ ＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現が従来の癌細胞と比較して、１％〜１００％低減されることができる。さらに他の実施例において、従来の癌細胞におけるＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質又はＲＮＡの発現は、本明細書に記載の遺伝子構築物又は他の任意の手段によって改変されない。

一実施形態において、修飾された癌細胞は、細胞内ＳＴ３Ｇａｌ１糖転移酵素を減少する、又はＳＴ３Ｇａｌ１ ＲＮＡ又はタンパク質の発現を抑制するために、本明細書に記載の遺伝子構築物でトランスフェクトされる。他の実施形態において、修飾された癌細胞は、良性又は悪性（転移性又は非転移性）の固形又は血液癌細胞であってもよい。修飾された癌細胞の非限定的な例は、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、結腸癌、肝臓癌、脳癌（例えば、神経芽細胞腫）、膵臓癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部癌（例えば、鼻咽頭癌）、腎臓癌、皮膚癌（例えば、メラノーマまたは扁平上皮癌）、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、肺癌、白血病とリンパ腫、及び骨髄腫が挙げられる。

癌細胞におけるＳＴ３Ｇａｌの発現は、癌細胞に遺伝子構築物を投与することにより、従来の癌細胞と比較して１〜１００％減少することができる。例えば、ＳＴ３Ｇａｌ１の発現は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９％、又は１％の単位で上記間隔内の範囲％又は任意％（例えば、約２８％、約１０〜４０％、約１５−２５％など）減少することができる。ＲＮＡ又はタンパク質の発現は、伝子発現の逐次分析（ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＳＡＧＥ）、リアルタイムＰＣＲ又はウェスタンブロットなどの技術分野で公知の方法によって測定することができる。

１つの例示的な実施形態において、修飾された癌細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６１０（２０１５年１０月２０日にアメリカ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ， ２０１１０，ＵＳＡに寄託される）に寄託した乳癌細胞である。

（潜在的な癌治療剤のスクリーニング）
本発明は、潜在的な癌治療剤をスクリーニングして、癌治療に適する薬物を特定する方法を提供する。本明細書に記載される遺伝子構築物は、細胞又は実験動物におけるＳＴ３Ｇａｌ１ ＲＮＡ又はタンパク質の発現を抑制して、潜在的な癌治療剤を評価する研究目的で使用され得る。一実施例において、ＳＴ３Ｇａｌ１の発現を抑制するために遺伝子構築物でトランスフェクトされた本明細書に記載の修飾された癌細胞は、ＣＤＣ及びＡＤＣＣに対してより敏感であり、モノクローナル抗体のような潜在的な癌治療剤をスクリーニングするために使用され得る。

これにより、本発明は、潜在的な癌治療剤をスクリーニングする方法を提供し、その方法は、潜在的な癌治療剤を修飾された癌細胞と接触させ、潜在的な癌治療剤の存在下および非存在下で、当技術分野で周知の方法、例えば分光光度法により（ｉ）修飾された癌細胞の増殖速度又は（ｉｉ）修飾された癌細胞の細胞数を測定することにより、その潜在的な癌治療剤が癌細胞の増殖を抑制することができるかどうかを決定することを含む。いくつかの実施例において、潜在的な癌治療剤の存在下での修飾された癌細胞のより遅い増殖速度及び／又はより低い細胞数は、その癌治療剤が癌細胞に対して有効であることを示す。

（癌細胞の増殖を抑制する方法）
本発明により、（ａ）ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質及び／又はＲＮＡの発現を阻害又は抑制するための有効量の遺伝子構築物及び（ｂ）有効量の抗癌剤を投与することによって、癌細胞の増殖を阻害する方法が提供される。有利には、それぞれの抗癌剤が単独療法で使用される場合、抗癌剤の１つ又はすべての低い用量の治療効果が不十分であるが、その組み合わせは、癌細胞抑制に対して相乗効果を有する。

ＣＤ５５分子は、ＳＴ３Ｇａｌ１の標的タンパク質の１つとして認識される。ＣＤ５５は、Ｃ３及びＣ５の分解（ｄｅｃａｙ）を加速して補体系の活性化を抑止して、補体媒介性細胞傷害から癌細胞への損傷を予防することにより、細胞を補体攻撃から保護する。

癌細胞におけるＳＴ３Ｇａｌ１の発現の抑制は、ＣＤ５５分子のＯ−結合型シアリル化の減少及び癌細胞表面上のＣ３の沈着の増加に関連する。ＣＤ５５機能の喪失及びＣ３の沈着の増加は、ＣＤＣ及びＡＤＣＣに対する癌細胞の感受性及び抗体ベースの免疫療法の有効性を増強する。

いくつかの実施形態において、遺伝子構築物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ混合物又はそれらの誘導体や修飾型であってもよく、一本鎖又は二本鎖であってもよい。他の実施形態において、遺伝子構築物は、限定されないが、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（標準的なワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成相互作用によってセンスＲＮＡ鎖および相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を互いにアニーリングし、長さが約１７ヌクレオチド〜約２９ヌクレオチドの短い二本鎖ＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、エンドリボヌクレアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ）、天然アンチセンス短干渉ＲＮＡ（ｎａｔｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などの任意のＲＮＡ種であってもよい。それは、マウス及びゼブラフィッシュを含む数種の脊椎動物種及び植物における特定の遺伝子の発現をノックダウンすることができる。例えば、米国特許第７，４１６，８４９号を参照する。

遺伝子構築物は、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するように、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格をさらに含むことができる。遺伝子構築物は、（例えば、宿主細胞受容体をターゲティングするための）ペプチドなどの付随基（ａｐｐｅｎｄｅｄ ｇｒｏｕｐ）、又は細胞膜を通る輸送を容易にする剤を含むことができる（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：６５５３−６５５６を参照）。

いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、配列番号２、４、６、及び８から選択される配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％相同又は実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。ＡＳＯは、生存して、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｍＲＮＡの相補的標的配列に結合して、一本鎖として単独で翻訳されることを防止しなければならない。

いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列番号３、５、７及び９から選択される配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％相同又は実質的に同一のセンス鎖ヌクレオチド配列と、配列番号２、４、６及び８から選択される配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％または１００％相同または実質的に同一のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列とを含む。

いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、配列番号１０、１１及び１２から選択される配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％相同又は実質的に同一のヌクレオチド配列を有する。

アンチセンスアプローチには、配列番号１３、１４又は１５などのＳＴ３Ｇａｌ１ ｍＲＮＡの標的配列に相補的な遺伝子構築物の設計が含まれる。配列番号１３の標的領域は３ＵＴＲであり、配列番号１４及び１５の標的領域はＣＤＳである。絶対的な相補性は好ましいが、必要ではない。本明細書で言及されるように、ＳＴ３Ｇａｌ１標的配列に「相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」配列とは、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズして安定な二重鎖を形成することができるように十分な相補性を有する配列を意味する。二本鎖アンチセンス核酸である場合、二本鎖ＤＮＡの一本鎖が検出され、又は三本鎖の形成が検出されることができる。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度及びアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズするＲＮＡが長いほど、標的ＲＮＡとミスマッチする塩基をより多く含んでなお安定する二重鎖（場合によっては三重鎖）を形成する。当業者であれば、標準的な方法を用いてハイブリダイズした複合体の融点を決定することにより、ミスマッチの許容度を確認することができる。

本明細書に開示される遺伝子構築物とＳＴ３Ｇａｌ１標的配列（配列番号１３、１４又は１５）との間の「相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」の程度を決定する際に、相補性の程度は、遺伝子構築物とそれと最適に整列するＳＴ３Ｇａｌ１標的配列の逆相補体との間の同一性のパーセンテージとして表される。パーセンテージは、２つの配列間で同一である整列塩基の数を計数し、遺伝子構築物の総数で割そして１００を乗じることによって計算されることができる。ポリヌクレオチドのアラインメント（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、配列の同一性のパーセンテージ、及び相補性の程度は、標準的な設定を使用するＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて本発明の目的のために決定することができる。

いくつかの実施形態において、遺伝子構築物はＳＴ３Ｇａｌ１の最適に整列した標的配列と比較して１、２、３又は４（又はそれ以上）のミスマッチを含み、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の抑制を達成するために標的配列に十分に結合している。ワトソン−クリック水素結合二重鎖に対するミスマッチの不安定化効果は、例えば、遺伝子構築物の長さの増加によって補償され得る。

ＳＴ３Ｇａｌ１標的配列の選択に関係なく、ＳＴ３Ｇａｌ標的配列に相補的な試験遺伝子構築物と対照オリゴヌクレオチド（例えば、スクランブルＲＮＡ）とのＳＴ３Ｇａｌ１ ＲＮＡのレベル又はタンパク質発現を比較するために、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）研究を当業者が行うことができる。対照オリゴヌクレオチドは、試験遺伝子構築物とほぼ同じ長さであることが好ましい。

組換え及び染色体外維持のための遺伝子構築物を導入するためのベクターは、当該技術分野において公知であり、任意の適切なベクターを用いることができる。ウイルストランスフェクションのような遺伝子構築物を細胞に導入する方法は当該分野で公知であり、方法の選択は当業者に周知である。

本発明のいくつかの実施形態において、癌細胞に送達可能なベクターが利用される。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、任意のウイルス又は非ウイルスベクターを指し、並びに自己伝達性であってもよいし、動員可能であってもよい任意のプラスミド、コスミッド、ファージ、或いは二本鎖、一本鎖直鎖または環状型の任意のバイナリーベクターを指し、並びに細胞ゲノムへに整合することにより、原核又は真核宿主細胞を形質転換することができ、染色体外（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）に存在してもよい。当技術分野で公知の任意のベクターが、本発明の実施において使用するために想定される。ウイルスベクターの非限定的な例としては、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はマウスベースウイルスベクターが含まれる。非ウイルスベクターの非限定的な例には、流体力学的注入又は直接注入、コレステロールコンジュゲーション、リポソーム及びリポプレックス、ポリマー及びペプチド送達システム又は表面修飾されたＬＰＤナノ粒子が含まれる（Ｋ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， ｓｉＲＮＡ送達のための非ウイルス方法、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２００９ Ｊｕｎ １； ６（３）：６５１−６５８）。

ＳＴ３Ｇａｌ１の発現を阻害する遺伝子構築物及び抗癌剤は、任意の有効量で投与されることができる。いくつかの実施例において、それは約０．０１μｇ〜約５ｇ又は約０．１μｇ／ｋｇ体重〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で投与され得る。ＳＴ３Ｇａｌ１の発現を阻害する遺伝子構築物又は抗癌剤の投与量は、扱われる疾患状態の重篤度、特定の製剤、ならびに対象の体重及び全身状態且つ投与経路のような他の臨床因子によって決定される。

ＳＴ３Ｇａｌ１の発現を阻害する遺伝子構築物及び抗癌剤の有用な用量は、インビトロ活性及び動物モデルにおけるインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）活性を比較することによって決定される。マウス及び他の動物における有効な投与量のヒトへの外挿法は、当技術分野で公知である、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９３８，９４９号を参照する。

本明細書で提供される方法によれば、ＳＴ３Ｇａｌ１の発現を阻害する遺伝子構築物及び抗癌剤は、注射（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内）、皮膚的、経皮的、経口（例えば、錠剤、丸剤、液剤、可食用フィルムストリップ））、植込式浸透圧ポンプ、坐剤、エアゾールスプレー、局所、関節内、眼、鼻腔吸入、肺吸入、皮膚と膣への圧入、又は適切に形質転換された細胞を含む移植物中の浸透圧ポンプのようなインプラントを含むが、これに限定されず、様々な経路のいずれかによって投与することができる。

遺伝子構築物と抗癌剤との組み合わせは、治療される状態に適切な期間にわたって、単剤療法又は多剤併用療法を行うように投与されることができる。ＳＴ３Ｇａｌ１の発現を阻害する遺伝子構築物及び抗がん剤は、少なくとも３ヶ月、又は疾患状態の症状と徴候が解消されるまでの期間にわたって、例えば、一日一回、一日二回、一日三回、二日一回、三日一回又は一週一回などの適切な時間間隔で便宜的に投与されことができる。

抗癌剤の非限定的な例は、ＶＴ Ｄｅｖｉｔａ、Ｔ． Ｌａｗｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（編集者）、第９版（２０１１）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ出版社による腫瘍学の癌原理と実践（Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）に見出すことができる。当業者であれば、薬物の特定特徴及びそれに関与する癌に基づいてどのような抗癌剤との組み合わせが有用であることを識別することができる。このような抗癌剤の非限定的な例は、化学療法（例えば、アルキル化剤、白金アナログ（ｐｌａｔｉｎｕｍ ａｎａｌｏｇｓ）、代謝拮抗剤、エストロゲン受容体（ＥＲ）阻害剤及びトランスフェクション中の再構成（ＲＥａｒｒａｎｇｅｄ ｄｕｒｉｎｇ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，ＲＥＴ）阻害剤などの標的治療）、手術、放射線療法、生物療法（例えば、抗血管新生剤、インターロイキン療法、遺伝子療法、癌ワクチン、抗体、免疫療法）、又はそれらの組み合わせを含む。例示的な実施例において、抗体は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇｂ４又はＢｂ４から選択される腫瘍関連炭水化物抗原に対するものである。

一実施形態において、抗癌剤は、癌ワクチン、抗体、エストロゲン受容体（ＥＲ）阻害剤、ＲＥＴ（トランスフェクション中の再構成）阻害剤又はそれらの組み合わせである。ＥＲ阻害剤の非限定的な例は、タモキシフェン及びバゼドキシフェン（ｂａｚｅｄｏｘｉｆｅｎｅ）である。ＲＥＴ阻害剤の非限定的な例は、カボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、バンデタニブ、アレクチニブ（ａｌｅｃｔｉｎｉｂ）、レンバチニブ（ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ）、ニンテダニブ（ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ）、ポナチニブ（Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ）、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、及びソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）が挙げられる。

本発明の実施形態は、以下の実施例によって説明されるが、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。むしろ、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な他の実施形態、修正、および同等物を含み、さらに、当業者が本明細書の記載を読んだ後に想到し得ることが明確に理解されるべきである。以下の実施例に記載の研究では、他に明記しない限り、従来の手順に従った。

（実施例１：ＳＴ３Ｇａｌ１標的化タンパク質の同定）
インビトロ研究は、ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシング細胞と対照細胞との間のＰＮＡ結合タンパク質を比較してＳＴ３Ｇａｌ１標的タンパク質を同定するために行われた。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから購入可能、台湾）は、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃ）又はアンチセンス鎖（配列番号２）及びセンス鎖（配列番号３）を有するＳＴ３Ｇａｌ１（ｓｉ）ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた。ＳＴ３Ｇａｌ１ ｍＲＮＡの発現レベルをｑＰＣＲ分析によって分析し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに標準化した。図１Ａに示すように、ＳＴ３Ｇａｌ１ＲＮＡの発現は、ＳＴ３Ｇａｌ１ｓｉＲＮＡによってｓｃでトランスフェクした乳癌細胞胞のＲＮＡの発現の２８．５±８．２％に有意に減少された。

乳癌細胞におけるＳＴ３Ｇａｌ１のタンパク質標的を調べるため、スクランブルｓｉＲＮＡ又はＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡで処理した乳癌細胞からの全細胞溶解物を、アガロース結合ＰＮＡによる沈降後にＰＮＡレクチンブロット分析のために調製された。ＳＴ３Ｇａｌ１は、コア１ Ｏ−グリカンにシアル酸を添加することにより、ガラクトシル（β−１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ （β−１， ３） Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）のシアリル化に触媒作用を及ばした。ピーナッツアグルチニン（Ｐｅａｎｕｔ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ， ＰＮＡ）はコア１ Ｏ−グリカンに優先的に結合する（シアル酸が添加されていない）ので、ＳＴ３Ｇａｌ１ノックダウンはコア１ Ｏ−グリカンへ結合のＰＮＡが増加すると予想される。

予想通りに、乳癌細胞におけるＰＮＡ結合信号は、ＳＴ３Ｇａｌ１ノックダウン後、約７２，１３０及び２５０ｋＤａの分子量で増加した（図１Ｂ）。ゲル内消化及びＬＴＱ−ＦＴＤ質量分析を使用して、ＳＴ３Ｇａｌ１のノックダウンの後、ＰＮＡ結合タンパク質の１つとするＣＤ５５の信号が（２．６倍）増大したと共に、ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシング細胞におけるＣＤ５５の分子量がやや低い（図１Ｃ）。しかし、総ＣＤ５５タンパク質レベルが類似している（ｓｃ対ｓｉ：１．０対１．１）（図１Ｄ）。

（実施例２：ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングが乳癌細胞を補体依存性細胞傷害に敏感する）
細胞表面のＣＤ５５は、Ｃ３ｂＢｂ複合体の分解を加速し、補体カスケード（ｃａｓｃａｄｅ）を中断し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を予防することによって補体系を調節する。インビトロ実験は、変化したＳＴ３Ｇａｌ１媒介性Ｏ−結合型シアリル化がＣＤ５５の機能に影響するかどうかを決定するために行われた。図２Ａは、抗ＨＬＡ抗体（０．２μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌ）の存在で、乳癌細胞におけるスクランブル（ｓｃ）またはＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ（ｓｉ）の効果を示す。

図２Ａに示すように、ＳＴ３Ｇａｌ１ノックダウンは、抗体及び／又は補体の存在下で細胞死を用量依存的に促進する。

具体的に言うと、０．２μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ抗体及び１０％ウサギ補体の存在下でＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングした乳癌細胞の溶解％は２９．６±０．９〜５１．１±２．２％の範囲である。１μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ抗体及び１０％のウサギ補体の存在下でのＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングした乳癌細胞の溶解％は、４０．９±５．９〜５７．４±４．２％の範囲である（図２Ａ）。乳癌細胞のＳＴ３Ｇａｌ１がサイレンシングされ、且つ表面ＣＤ５５が脱シアリル化（ｄｅ−ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）される場合、ＣＤＣ攻撃に対してより敏感である。

図２Ｂは、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡが、ＣＤ４６及びＣＤ５９などの他のＣＤＣ調節タンパク質の分子量ではなく、ＣＤ５５の分子量を修飾しかないことを示す。さらに、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした乳癌細胞におけるＣＤ４６又はＣＤ５９の発現レベルが影響しない。

（実施例３：ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングがＣ３沈着の増加によって乳癌細胞をＣＤＣに敏感する）
インビトロ評価は、癌細胞表面上のＣ３断片の沈着を測定することにより、脱シアリル化ＣＤ５５を有するＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングの乳癌細胞の分解促進能力を評価するために行われた。

乳癌細胞を非溶解条件下でヒト血清で培養し、沈着したＣ３を抗Ｃ３抗体を用いたフローサイトメトリー分析により検出した。図３に示すように、癌細胞表面上のＣ３沈着物は、抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体の濃度と相関する。抗ＨＬＡ抗体の非存在下において、スクランブルＲＮＡ（ｓｃ）およびＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ（ｓｉ）でトランスフェクトした乳癌細胞の両方に最小量のＣ３沈着が存在する（幾何平均蛍光：ｓｃが３１．５±０．２×１０^３であり、ｓｉが３５．２±０．６×１０^３である）。１０μｇ／ｍｌ及び２５μｇ／ｍｌの抗体では、ｓｉでトランスフェクトした乳癌細胞の表面上のＣ３沈着物は、ｓｃでトランスフェクトした乳癌細胞のＣ３沈着より有意に高い（幾何中央蛍光：１０μｇ／ｍｌの抗体では、ｓｃが７２．１±４．８ｘ１０^３であり、ｓｉが８９．５±５．５ｘ１０^３であり、２５μｇ／ｍｌの抗体では、ｓｃが１１８．０±６．４ｘ１０^３であり、ｓｉが１６４．８±０．８ｘ１０^３である）。この結果は、ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングがＣ３沈着を増加させ、表面発現ＣＤ５５の分解促進活性を減少させることを示唆している。

（実施例４：ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングが乳癌細胞を抗体依存性細胞媒介性（ＡＤＣＣ）細胞傷害性に敏感する）
ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングした乳癌細胞の表面上の脱シアリル化ＣＤ５５及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）媒介性ＡＤＣＣの相互作用を調べた。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を実施例１に従ってスクランブルＲＮＡ（ｓｃ）又はＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ（ｓｉ）でトランスフェクトした。４日後、細胞を回収し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって膜補体調節タンパク質（ｍＣＲＰ）及び標的抗原の発現について分析した。ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングを用いたｍＣＲＰ（ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９）及び標的抗原（ＨＬＡ及びＳＳＥＡ４）の発現レベルに変化はなかった。

ＡＤＣＣアッセイは、エフェクターとするヒトＰＢＭＣ細胞、抗体としての抗ＳＳＥＡ４、及び標的としてのＳＴ３Ｇａｌ１ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いて行われた。図４は、ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングした乳癌細胞が、スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトした乳癌細胞よりもＡＤＣＣに対する敏感度が有意に高いことを示す。エフェクター：標的の比が１０：１（Ｅ／Ｔ１０）である場合、ｓｃとｓｉに対する平均溶解率はそれぞれ２４．２±１．７％及び４１．５±２．４％であり、その差は統計的に有意である。ＩｇＧ３アイソタイプ対照抗体（Ａｂ１）及び抗ＳＳＥＡ４抗体（Ａｂ２）は単独ではＰＭＢＣの非存在下で細胞の溶解が最小限であった。

（実施例５：ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングした乳癌細胞におけるＣＤ５５のグリコシル化のパターン）
ＣＤ５５のグリコシル化パターンは、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解したＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした乳癌細胞を用いて分析された。トランスフェクトされ、溶解した乳癌細胞を脱グリコシル化酵素（ＰＮＧｓｓｅ Ｆ、Ｏ−グリコシダーゼ（Ｏ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）及びノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ））で処理し、ウェスタンブロットを用いて分析する。計算したＣＤ５５の分子量は約４１ｋＤａである。ｓｃでトランスフェクトした乳癌細胞（対照）のＣＤ５５は７０ｋＤａタンパク質として移動したが、ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングした乳癌細胞のＣＤ５５は低分子量でより速く移動する（図１Ｃ）。ＰＮＧａｓｅ ＦによりＮ−グリカンを除去する後、ｓｃでトランスフェクトした乳癌細胞におけるＣＤ５５の分子量がわずかに減少する。しかし、ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングした乳癌細胞におけるＣＤ５５の分子量は、ｓｃで処理した乳癌細胞におけるＣＤ５５の分子量よりも低いである。この結果は、ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理の後、ｓｃでトランスフェクトした乳癌細胞およびＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングした乳癌細胞のＣＤ５５分子量が異なるので、ＳＴ３Ｇａｌ１がＣＤ５５上のＯ−結合型グリカンのシアリル化を媒介することを示す。

ＣＤ５５分子のシアル酸残基は、糖タンパク質及びオリゴ糖からのα２−３、α２−６及びα２−８結合型シアル酸残基の加水分解を触媒するノイラミニダーゼを用いて除去される。ノイラミニダーゼを用いたＣＤ５５分子の処理は、ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングした乳癌細胞及びｓｃでトランスフェクトした乳癌細胞（対照）のＣＤ５５の分子量を減少させる（図５）。ＰＮＧａｓｅ Ｆ及びノイラミニダーゼによるＣＤ５５分子の二重消化は、ＣＤ５５の分子量をさらに減少させる。これらの発見は、ＣＤ５５のシアリル化がＯ−結合型であることを示唆している。

この発見をさらに確認するために、ｓｃでトランスフェクトした乳癌細胞及びＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした乳癌細胞をＯ−グリコシダーゼで処理して、糖タンパク質からのコア１及びコア３ Ｏ−結合型二糖の除去を触媒する。ＣＤ５５分子の分子量は、ｓｃでトランスフェクトした乳癌細胞及びＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングした乳癌細胞の両方で減少したが、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした乳癌細胞のＣＤ５５の分子量は、ｓｃでトランスフェクトした乳癌細胞の分子量より低いである。図５に示すように、ＰＮＧａｓｅ Ｆ、ノイラミニダーゼ、及びＯ−グリコシダーゼによるＣＤ５５分子の三重消化は、ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシング及びｓｃでトランスフェクトした乳癌細胞のＣＤ５５分子の分子量を約５０ＫＤに減少させる。これらの発見は、ＣＤ５５がＳＴ３Ｇａｌ１によって触媒されるＯ−結合型シアリル化糖タンパク質であることを確認する。

（実施例６：ＣＤ５５のＮ−及びＯ−グリコシル化の概要）
直接ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果において、ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシング及びｓｃでトランスフェクトした乳癌細胞は、ＣＤ５５分子のＮ−グリカンの大部分が、コアのフコシル化（ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）された又はされない末端シアル酸を有する複合二分岐及び三分岐構造を含むことを示す。二分岐立体構造および三分岐立体構造は、予想のトリプシンペプチドであるＧＳＱＷＳＤＩＥＥＦＣＮＲのグリコフォームとして検出され、それは単一のＮ結合グリコシル化部位として報告されている。二分岐及び三分岐構造の相対量は、ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングでは有意に変化しなかった（図６Ａ）。ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシング及びｓｃでトランスフェクトした乳癌細胞におけるＣＤ５５分子の同一分析は、セリン／スレオニンリッチ−ストーク領域に位置する可能性のある２４個の予測されたＯ−結合型グリコシル化部位のいずれも同定されなかった（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｎｅｔｏｇｌｙ）。その代わりに、放出されたペルメチル化Ｏ−グリカンのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、ＣＤ５５分子の主な構造が、シアル酸を含む及び含まないコア１、及び最大２つのシアル酸を有するコア２に基づくことを示した。ＣＤ５５上のコア１及びコア２ Ｏ−グリカンのシアリル化は、ＣＤ５５の活性を調節する。

ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシングした乳癌細胞において、ｍ／ｚ６３８．４３９（２＋）でのジシアリル化コア２構造の相対量が有意に減少するが、ｍ／ｚ６８３．８３９（２＋）でのモノシアリル化コア２構造の相対量が増加する（図６Ｂ）。ＬＣ−ＭＳデータは、ＳＴ３Ｇａｌ１が、ＣＤ５５分子のＮ−グリカンではなく、Ｏ−グリカンの２−３シアリル化に重要な役割を果たすことを示唆している。ＣＤ５５分子のＯ−グリカンの２−３シアリル化の障害は、ジシアリル化コア２構造を犠牲にして、非シアリル化コア１及びモノシアリル化コア２を増加する。一方、ＣＤ５５分子（ｍ／ｚ８９５．４６２）のモノシアリル化コア１ Ｏ−グリカンの相対量は、２−６シアリル化の補償などにより、ＳＴ３Ｇａｌ１サイレンシング及びｓｃでトランスフェクトした乳癌細胞において同様であった。

（実施例７：ＳＴ３Ｇａｌ１ノックダウンが前立腺癌細胞及び神経芽細胞腫細胞の増殖に及ぼす影響）
前立腺癌細胞（ＰＣ３、バイオリソースの収集と研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）、台湾）及び神経芽細胞腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ｙｉ−Ｃｈｅｎｇ Ｃｈｅｎ教授、マッカイ医科大学（Ｍａｃｋａｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ）（台湾）から入手した）は、実施例１に従ってスクランブルＲＮＡ（ｓｃ）又はＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ（ｓｉ）でトランスフェクトした。細胞増殖は、細胞増殖のレベルを表すために使用された蛍光（５９０ｎｍ）を測定することで、ＶｉｃｔｏｒＸ３プレートリーダーでアラマーブルーアッセイによって測定された。

図７Ａ及び７Ｂは、ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＳＴ３Ｇａｌ１の阻害が、ＳＴ３Ｇａｌ１阻害（ｓｃＲＮＡ）なしと比較して、前立腺癌細胞及び神経芽細胞腫細胞の増殖を有意に減少させたことを示す。

（実施例８：乳癌細胞におけるＳＴ３Ｇａｌ１阻害に対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの効果）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞をスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃ）、ｓｈＲＮＡを含まないベクター（ｐＶｏｉｄ）、ｓｈＲＮＡ１−３（配列番号１１）、ｓｈＲＮＡ１−４（配列番号１２）、又は以下の表１に列挙するｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。

ＳＴ３Ｇａｌ１ ｍＲＮＡの発現レベルをｑＰＣＲ分析により分析し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに標準化した。

図８Ａ〜８Ｃに示されるように、ｓｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ−Ａ又はｐＶｏｉｄでトランスフェクトした乳癌細胞と比較して、ｓｉＲＮＡ−１、ｓｉＲＮＡ−２、ｓｉＲＮＡ−３、ｓｉＲＮＡ−７、ｓｈＲＮＡ１−３及びｓｈＲＮＡ１−４でトランスフェクトした乳癌細胞のＳＴ３Ｇａｌ１ ＲＮＡの発現が減少した。

（実施例９：乳癌細胞における抗癌剤とＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡとの組み合わせの相乗効果）
乳癌細胞を用いて、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ（ＳＴ３Ｇａｌ１の発現をノックダウンするため）及び抗癌剤の効果のインビトロ評価を行った。

ＭＣＦ７乳癌細胞を表１のレジームの１つで処理し、細胞増殖をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）によって監視した。

図９は、タモキシフェン、バンデタニブ又はそれらの組み合わせの抗癌剤及びＳＴ３Ｇａｌ１ノックダウンの相乗効果を示す。癌細胞生存率について、タモキシフェンの単独使用が７６％であり、バンデタニブの単独使用が３７．５％であり、タモキシフェンとバンデタニブの併用が２２％であり、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡの単独使用が６５％であり、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ及びタモキシフェンの組み合わせが４０％であり、又はＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ及びバンデタニブの組み合わせが１７％であり、ＳＴ３Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ、タモキシフェン、及びバンデタニブの組み合わせが５％であった。

本発明の特定の実施例が説明及び記載されたが、本教示にアクセスする当業者は、本発明がこれらの実施例のみに限定されないことは明らかである。したがって、本発明は、当業者には明らかである多くの修正、変更、変形、置換、及び均等物を含むことが意図されていることを理解されたい。

Claims (16)

1. 修飾された癌細胞におけるＳＴ３Ｇａｌ１糖転移酵素（ＳＴ３Ｇａｌ１）の発現が減少することを特徴とする、修飾された癌細胞。
2. 前記修飾された癌細胞における前記ＳＴ３Ｇａｌ１の発現が、従来の癌細胞と比較して、１〜９９％減少することを特徴とする、請求項１に記載の修飾された癌細胞。
3. 前記修飾された癌細胞は、修飾された乳癌細胞、修飾された前立腺癌細胞又は修飾された神経芽細胞腫細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の修飾された癌細胞。
4. ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２２６１０を有することを特徴とする、請求項３に記載の修飾された乳癌細胞。
5. 潜在的な癌治療剤をスクリーニングする方法であって、
   （ａ）前記潜在的な癌治療剤の存在下で請求項１に記載の修飾された癌細胞を増殖し、及び前記潜在的な癌治療剤の非存在下で請求項１に記載の修飾された癌細胞を増殖するステップと、
   （ｂ）前記潜在的な癌治療剤の存在下での前記修飾された癌細胞の増殖速度又は細胞数を測定し、及び前記潜在的な癌治療剤の非存在下での前記修飾された癌細胞の増殖速度又は細胞数を測定するステップと、
   （ｃ）前記潜在的な癌治療剤の存在下及び前記潜在的な癌治療剤の非存在下で、前記修飾された癌細胞の増殖速度又は細胞数を比較するステップと、
   を含み、
   前記修飾された癌細胞の増殖速度の遅延又はより低い細胞数は、前記潜在的な癌治療剤が癌治療剤として働くことを示すことを特徴とする、潜在的な癌治療剤をスクリーニングする方法。
6. 前記潜在的な癌治療剤がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. ＳＴ３Ｇａｌ１の発現を抑制する有効量の遺伝子構築物及び抗癌剤を投与するステップを含み、その有効量の遺伝子構築物及び抗癌剤で対象における癌細胞増殖を抑制することを特徴とする、対象の癌細胞増殖を抑制する方法。
8. ＳＴ３Ｇａｌ１の発現を阻害する前記遺伝子構築物は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、及び８から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 前記ｓｉＲＮＡは、配列番号２、４、６、及び８から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同であるアンチセンス鎖、及び配列番号３、５、７、及び９から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同であるセンス鎖を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
11. 前記ｓｈＲＮＡは、配列番号１０、１１及び１２から選択される配列と少なくとも９０％相同であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
12. 前記遺伝子構築物は、配列番号１３、１４及び１５から選択される配列と少なくとも９０％相補的なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
13. 前記抗癌剤は、癌ワクチン、抗体、エストロゲン受容体（ＥＲ）阻害剤、トランスフェクション中の再構成（ＲＥＴ）阻害剤又はそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
14. 前記抗体は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇｂ４又はＢｂ４から選択される腫瘍関連炭水化物抗原に対するものであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ＥＲ阻害剤は、タモキシフェンであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
16. 前記ＲＥＴ阻害剤は、バンデタニブであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。