JP2018046806A - 二段階作動の核酸反応検出管 - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明は二段階作動の核酸反応検出管を提供する。【解決手段】 検出管は液体を収容可能な収容空間及び試験紙を設置する検出空間を含み、試薬又は液体の移送を回避でき、直接核酸の増幅反応を行うことができ、検出空間に設置された試験紙を観察することで反応結果を知ることができる。【選択図】 図１
Description
本発明は、生物学の分野に関し、特に液体の移送を回避する、核酸ポリメラーゼ連鎖反応及び核酸反応結果の検出を順次行う二段階作動の検出管に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ。以下はＰＣＲと略称する）はＤＮＡシグナルを迅速に増幅する技術であり、その原理及び主な動作ステップは下記の（ａ）〜（ｃ）である。（ａ）変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）：高温（９０〜９５℃）で二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離し、一本鎖ＤＮＡを複製のテンプレートとする。（ｂ）プライマー結合（ｐｒｉｍｅｒ ａｎｎｅａｌｉｎｇ）：温度が適切な温度まで低下すると、プライマーが正しい標的遺伝子位置に付着する。（ｃ）プライマー伸長（ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）：反応温度を７２℃に調整し、マグネシウムイオンを酵素補因子として用いて、ＤＮＡポリメラーゼにおいてテンプレートにおけるヌクレオチド組み合わせに基づいてデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ。以下はｄＮＴＰｓと略称する）をプライマーに順次付着させて、もう一本鎖の新たなＤＮＡフラグメントを合成する。この３つのステップを用いて昇温及び降温の温度変化を繰り返して標的核酸シグナルの増幅を行う。３つのステップの作動を１回だけ繰り返すと、標的核酸の数は１倍増大でき、３つのステップの作動を４０回繰り返すと、標的核酸の数は大体１０９倍増大でき、それに伴って標的核酸のシグナルも増幅する。このため、現在、ＰＣＲ技術は、分子診断の技術として臨床的診断に広く使われ、遺伝病の診断、病原体診断、癌腫瘍の診断予測評価などに適用されてもよい。ＰＣＲ技術に由来するＲＴ−ＰＣＲも類似の応用原理を有するため、現在、同様に臨床的診断に広く使われている技術となる。
現在、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ反応を行うために用いられる装置は、殆ど耐熱性プラスチックを反応試薬設置用の試験管とし、３つのステップの反応温度を達成し、標的核酸シグナルの増幅効果を達成するように、温度制御金属を用いて試験管の昇温又は降温動作を繰り返し行う。従来のシステムでは、温度制御金属を反応システムとするため、その反応体積が大きく、温度制御システム全体は大きな体積及び比熱比を有しなければならない。また、現在の実務上の操作では、通常試験に必要な繰り返し回数は約３０〜３５回であり、必要な反応時間は約２〜３時間であり、そのうち温度制御金属の昇温又は降温に多くの時間がかかるため、反応時間の短縮は困難となる。
更に、上記のＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲは、通常ゲル電気泳動（ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）の方法を用いて標的遺伝子のシグナルの増幅が成功したか否かを確認するため、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲを完了した後に、標的遺伝子増幅シグナルを含む所定体積の産物（以下はＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ産物を略称する）を反応試験管から取り出し、予め製造されたゲルウェル（ｗｅｌｌ）に注入し、核酸分子が中性又はアルカリ性溶液に負の荷電を有するという特性を利用して、核酸分子を電界の作用で正極方向に移動させ、移動の速度はその分子量に反比例する。この方法の操作により、標的遺伝子の核酸増幅が成功したか否かを検出でき、ゲル電気泳動による検出の正確率が高いが、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲの進行からゲル電気泳動の完了まで、数時間の反応時間が必要となり、即時又は短時間内に検出結果を知る必要がある測定項目について、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲの進行及び電気泳動の測定結果の確認の時間が長すぎるため、通常ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲの方法を用いて診断又は検査の補助手段として利用することは困難である。また、ゲル電気泳動の方法を用いて結果を判断する場合は、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ産物を反応管からゲルウェルに移送する必要があるため、このプロセスはＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ産物が外部物質により汚染され、誤判断となることに繋がる。
反応時間を短縮するために、熱対流の反応原理を利用してＰＣＲを行う技術（以下は熱対流式ＰＣＲと略称する）が提出されている。この技術は、最初では、Ｋｒｉｓｈｎａｎらの人によりＲａｙｌｅｉｇｈ−Ｂｅｎａｒｄ ｃｅｌｌの円柱状管を設計し、上下２つの異なる加熱源を温度制御部として用い、一般的に、液面頂端の温度を６０℃程度に維持し、底部の温度を９５℃程度に維持し、該円柱状チャンバの上端と下端の温度により生じられた温度差により、チャンバ内の液体が流れるように駆動し、ＰＣＲ反応もそれと伴って行われ、この方式は同様にＲＴ−ＰＣＲにも適用されてもよい。その後、同様の原理を利用する派生技術が続々と開発され、商品化された。例えば単一箇所加熱方式を用いる絶縁式定温反応（ｉｎｓｕｌａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ｉｉＰＣＲ）は、閉鎖の毛細管内にポリメラーゼ連鎖反応を行い、或いは３箇所加熱源の方式の閉鎖回路式流路の設計を用いる。また、非接触式放射を用いる方法は、その加熱点が円柱管の中央の閉鎖回路に位置する設計、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲの効果を達成する複数の異なる設計がある。これらの熱対流反応原理を用いてＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲを行う方法は、３つのステップの反応温度を達成するように温度制御金属により試験管を昇温、降温の操作を繰り返し実行する必要がなくなるため、繰り返し昇温降温の時間を節約でき、温度制御金属の使用量を低減できる。
一方、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ産物が外部物質により汚染されることを低減し、検出結果の誤判断を回避するために、近年、従来のゲル電気泳動の代わりの判断技術は続々と開発されている。例えば、単一性蛍光物質と標的遺伝子配列との結合を利用し、検出器に適切な波長の光束を供給して該蛍光物質を励起すると、該蛍光物質は蛍光を放射し、検出器により感知され、該蛍光の輝度はＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ産物の量に比例するため、即時に定性又は定量の効果を達成でき、反応時間を節約できる。
別の例としては、標的遺伝子配列に対して特異性の標識を有する試験紙によりＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ産物を検出することも近年よく使われている検出方法の１つである。試験紙方法の検出原理としては、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ試薬に少なくとも２種類の異なる特異性の抗体の抗原を添加し、第１種類の抗原はＤＩＧ又はＴｅｘａｓＲであってもよく、第２種類の抗原はＡｖｉｄｉｎ又はＦＩＴＣであってもよく、これらの抗原の代わりに特異性を有する他の抗原を用いてもよい。反応が完了した後に、産物は２種類の異なる抗原を有する。それと共に、試験紙の一端にコロイド金、ラテックス粒子又は他の着色物質を吹付塗布し、該着色物質は該第２種類の抗原の特異性の抗体と結合し、この抗体はＢｉｏｔｉｎ、ａｎｔｉ−ＦＩＴＣ又は他の対応する特異性の抗体であってもよく、試験紙の他端に吸水コットンが接着されている。また、試験紙の特定の部位に該第１種類の抗原に対応する他の特異性の抗体、例えばａｎｔｉ−ＤＩＧ、ａｎｔｉ−ＴｅｘａｓＲ又は他の対応する特異性の抗体を吹付塗布する。反応が終了した後に、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ産物を取り出して、適切な体積の試薬を試験紙の着色物質が吹付塗布された一端に滴下し、個の際に第１種類の抗原は第１種類の抗体と特異的結合し、第１種類抗原−第１種類抗体−着色物質の複合物を形成し、この複合物は試薬の毛細管現象により着色端から吸水コットン端に移動し、第２種類抗体が吹付塗布された位置に移動した場合、第２種類抗原は第２種類抗体と特異的結合した後に、その箇所に定着して着色し、使用者は着色しているか否かに基づいて結果を判断する。試験紙に基づく検出法に必要な時間は数分間であり、従来のゲル電気泳動検出法に比べて実験時間を節約し、異なる要求に応じて、該特異性抗体の代わりに核酸プローブを用いてもよい。
上述したように、熱対流式ＰＣＲ及び試験紙検出法に基づく検出は、従来のＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ及びゲル電気泳動検出法に比べて反応時間を多く節約し、研究及び商業上に広く使われているが、熱対流式ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ反応及び製品の検出という２つの異なる操作を直接行うことができる検出試験管の開発はまだ成功していない。このため、核酸の検出を完了するために、操作する際に先に試験管において熱対流式ＰＣＲを完了した後に、産物を試験管から取り出して試験紙に適切な体積だけ滴下する必要がある。産物の取り出しは困難であり、操作は非常に不便であると共に、外部物質による汚染を確実に回避することができない。
従って、本発明は、試薬又は液体を移送する必要がなく、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ反応が終了した後に、同一の装置で試験紙を用いて核酸反応結果を検出する二段階作動の検出管を提供する。
上記の問題点を鑑み、本発明は二段階作動の検出管に関する。この検出管を使用する際に、試薬又は液体を移送する必要がなく、熱対流式ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ反応が終了した後に、試験紙が設けられた連結管と検出管を連結することで、同一の装置で試験紙を用いて核酸反応結果を直接検出できる。
上記の目的を達成するために、本発明の好ましい実施例では、第１連結部、及び試験紙を収容可能な検出空間を有する第１管と、第２連結部、及び液体を収容可能な収容空間を有する第２管と、前記第１管の第１連結部及び前記第２管の第２連結部にそれぞれ連結されている第１部分及び第２部分を有する連結器であって、前記連結器の第１部分は案内部及び集液空間を有し、前記案内部は前記収容空間の液体を前記集液空間に導くことができ、前記第２部分は試験紙設置空間を有し、前記試験紙設置空間は前記集液空間と連通する、連結器と、を含む、二段階作動の核酸反応検出管を提供する。
熱対流式ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ反応が完了した後に、第１管、第２管及び連結器を組み合わせて、閉鎖的な検出管を形成し、検出用試験紙は第１管及び連結器の中に予め設置された。組み合わせが完了した後に、検出管を１８０度で引っ繰り返し、試薬は連結器の案内部を介して集液空間に入り、試験紙設置空間において試験紙と接触する。試験紙の一端に設けられた吸水コットンによる毛細管現象によりＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ産物を試験紙の着色物質が吹付塗布された一端から吸水コットン端に引っ張って、このプロセスでは、産物の持っている特異性抗原は試験紙に予め吹付塗布された特異性抗体と結合して着色し、使用者は第１管の観察部により検出結果を観察できる。本発明の上記の技術的手段により、同一の装置において熱対流式ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲを行い、且つ産物を検出するという目的を達成できる。
以下は図面を参照しながら本発明の好ましい実施例の構成及び効果を詳細に説明する。なお、本明細書では、構造又はその部位の位置について、使用者が好ましい実施例を操作する時の空間的関係を「前」、「後」、「左」、「右」、「上」、「下」等で説明する。
図１に示すように、本発明の好ましい実施例の検出管１は主に第１管１０、第２管３０、及び第１管と第２管との間に接続されている連結管２０を含む。
図１、図２ａ、図２ｂ及び図３に示すように、本実施例では、第１管１０は、ＰＣプラスチックからなる透明管であり、第１連結部１０１、把持部１０３、第１連結部１０１と把持部１０３との間に位置する観察部１０２、及び検出空間１０４を有する。本実施例では、第１管１０の観察部１０２の外周は円形の周面となり、滑らかな表面をする。また、第１管１０の一端は把持部１０３であり、管の外周は、使用者が判断を行うように指で把持するための対向する２つの平面を有する。把持部１０３の相対的な一端に位置する第１連結部１０１は管の内側に第１嵌合構造１０５を有し、本実施例では、第１嵌合構造１０５は連結器２０を連結するための少なくとも１つの環状突出部１０５１を有する。第１管１０の内部は検出空間１０４であり、検出空間１０４は先端に吸水コットンが付いている試験紙を収容するために用いられ、横断面が長円状の空間となり、即ちこの空間は２つの平行する壁面及び対向位置に位置する２つの曲面を有する。よって、使用者が観察部１０２から第１管１０を観察する際に、円形の外周面と内部の平坦な壁面は平凸レンズ構造を構成し、試験紙が検出空間１０４に設置された場合、容易に判断するように試験紙における情報を拡大できる。また、先端に吸水コットンが付いている試験紙の検出空間１０４における設置方向として、吸水コットンが付いている一端が第１嵌合構造１０５の他端に位置する。
図１及び図４に示すように、本実施例の第２管３０はＰＣプラスチックにより形成された透明の中空管であり、一端の内径は連結器２０を連結するように比較的に広く、他端は内径が比較的に狭い毛細管部３０２である。第２管３０は第２連結部３０１、及び収容空間３０３を有する。本実施例では、第１管１０の第１連結部１０１と同様に、第２連結部３０１は管の内側に第２嵌合構造３０４を有し、第２嵌合構造３０４は連結器２０を連結するための少なくとも１つの環状突出部３０４１を有する。第２管３０の内部の収容空間３０３は、検出すべき液体、例えば反応試薬を収容するために用いられる。
図１及び図５に示すように、本実施例の連結器２０はシリコーンからなるものであり、硬度が第１管１０及び第２管３０よりも低い弾性体を有する。連結器２０は、第１管１０の第１連結部１０１及び第２管３０の第２連結部３０１にそれぞれ連結されることができる第１部分２０１及び第２部分２０２を有する。具体的には、第１部分２０１及び第２部分２０２は第３嵌合構造２０３をそれぞれ有し、本実施例では、その外周面に複数の環状突出部２０３１があり、連結器が第１管１０又は第２管３０と連結する際に、第１管１０又は第３管３０の内管壁の環状突出部１０５１、３０４１により、連結器２０の対応部分がわずかに変形し、第１部分２０１、２０２の環状突出部は対応する第１管１０、第２管３０の連結部の環状突出部１０５１、３０４１に相互に嵌め合い、しっかり連結、且つ密封する状態となる。
図５に示すように、第１部分２０１は案内部２０４及び集液空間２０５を有し、第２部分２０２は試験紙設置空間２０６を有し、試験紙設置空間２０６は同一の管径を有する細長い通路である。試験紙設置空間２０６は開口２０７を有し、試験紙設置空間は試験紙を試験紙設置空間２０６に押し入れるために用いられ、開口は案内部の入口及び試験紙設置空間の出口に隣接し、開口２０７の長さ及び幅は検出用試験紙の幅及び厚さに略等く、該出口の開口面積は該入口の開口面積よりも大きく、その目的は、反応試薬が試験紙と接触し、且つ毛細管現象により試験紙の他端に移動して徐々に試験紙に吹付塗布された特異性抗体と反応することなく、直接隙間を介して第１管１０の検出空間１０４に流れ、検出結果の誤判断となることである。
本実施例では、案内部２０４は、集液空間２０５に向かう案内斜面２０４１であり、使用者が検出管１を１８０度で引っ繰り返し、即ち図１の上下を引っ繰り返す場合に、案内斜面２０４１は第２管２０２の内部の液体を集液空間２０５に導入することができる。集液空間２０５は液体を収容可能な中空のチャンバであり、集液空間２０５は試験紙設置空間２９０６と連通する。液体は集液空間２０５に流入した場合に、試験紙設置空間２０６に置かれた検出すべき試験紙と接触し、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ産物の検出反応を行う。また、集液空間２０５の入口、即ち案内部に隣接するものの開口面積は、集液空間２０５の出口、即ち試験紙設置空間２０６に隣接するものの開口面積よりも狭く、これによって液体は一定の方向にスムーズに流れることができる。また、反応を加速し、液体と試験紙との接触面積を増加させるために、集液空間２０５の出口試験紙設置空間２０６の長辺に設けられ、これによって、液体が集液空間２０５から流出する際に、直接試験紙と広い範囲において接触でき、反応を加速できる。
使用上、まず解析すべき標的遺伝子フラグメント、特異性抗原及び他の試薬を第２管３０に注入し、熱対流式ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲを行い、反応が完了した後に、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ産物はＤＩＧ及びＡｖｉｄｉｎという２種類の抗原を同時に有する。一方、着色物質及び特異性抗体が吹付塗布され、且つ先端に吸水コットンが付いている試験紙を連結器２０の試験紙設置空間２０６内に設置し、連結器２０と第２管３０の第２連結部３０１と連結して組み合わせ、試験紙を第２管３０の収容空間３０３内に設置して固定する。本実施例では、着色物質はコロイド金であり、第１種類の特異性抗原はＤＩＧであり、第２種類の特異性抗原はＡｖｉｄｉｎであり、それらに対応する特異性抗体はＡｎｔｉ−ＤＩＧ及びＢｉｏｔｉｎであり、Ｂｉｏｔｉｎとコロイド金とはコロイド金−Ｂｉｏｔｉｎ複合物に結合する。
熱対流式ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ反応が完了した後に、第２管３０の反応試薬を除去する必要がなく、図１に示す第１管１０−連結器２０−第２管３０の組み合わせのように連結器２０と第１管１０を連結して組み合わせ、検出管１が閉鎖的な検出管となる。そして、検出管１を１８０度で引っ繰り返し、即ち検出管１の上下を引っ繰り返し、この際に、元々第２管３０に位置する熱対流式ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ産物を含む試薬は案内斜面２０４１に沿って集液空間２０５及び試験紙設置空間２０６に流れ、試験紙設置空間において検出すべき試験紙と接触する。試験紙の一端に吸水コットンが付いているため、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ産物を持つ試薬は毛細管現象の影響により試験紙設置空間２０６端から吸水コットン端へ徐々に移動する。ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ産物を持つ試薬が移動する過程では、ＡｖｉｄｉｎはＢｉｏｔｉｎと特異的結合し、Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ−コロイド金の複合物を形成し、この複合物は毛細管現象により吸水コットン端に移動し続け、Ａｎｔｉ−ＤＩＧが吹付塗布された位置に移動した場合は、ＤＩＧはＡｎｔｉ−ＤＩＧと特異的結合し、この箇所に定着して着色し、使用者は着色するか否かに基づいて結果を判断する。
以上は本発明の好ましい実施例を説明しているが、本発明の特許請求の範囲に基づいて均等的に変更、修正されたものは全て本発明の範囲に属する。
１ 検出管
１０ 第１管
１０１ 第１連結部
１０２ 観察部
１０３ 把持部
１０４ 検出空間
１０５ 第１嵌合構造
１０５１ 環状突出部
２０ 連結器
２０１ 第１部分
２０２ 第２部分
２０３ 第２嵌合構造
２０３１ 環状突出部
２０４ 案内部
２０４１ 案内斜面
２０５ 集液空間
２０６ 試験紙設置空間
２０７ 開口
３０ 第２管
３０１ 第２連結部
３０２ 毛細管部
３０３ 収容空間
３０４ 第２嵌合構造
３０４１ 環状突出部
１０ 第１管
１０１ 第１連結部
１０２ 観察部
１０３ 把持部
１０４ 検出空間
１０５ 第１嵌合構造
１０５１ 環状突出部
２０ 連結器
２０１ 第１部分
２０２ 第２部分
２０３ 第２嵌合構造
２０３１ 環状突出部
２０４ 案内部
２０４１ 案内斜面
２０５ 集液空間
２０６ 試験紙設置空間
２０７ 開口
３０ 第２管
３０１ 第２連結部
３０２ 毛細管部
３０３ 収容空間
３０４ 第２嵌合構造
３０４１ 環状突出部
Claims (10)
- 第１連結部、及び試験紙を収容可能な検出空間を有する第１管と、
第２連結部、及び液体を収容可能な収容空間を有する第２管と、
前記第１管の第１連結部及び前記第２管の第２連結部にそれぞれ連結されている第１部分及び第２部分を有する連結器であって、前記連結器の第１部分は案内部及び集液空間を有し、前記案内部は前記収容空間の液体を前記集液空間に導くことができ、前記第２部分は試験紙設置空間を有し、前記試験紙設置空間は前記集液空間と連通する、連結器と、を含む、二段階作動の核酸反応検出管。 - 前記第１管の外周面は円管となり、
前記検出空間は、２つの対向する平面を有する長円状空間である、請求項１に記載の二段階作動の核酸反応検出管。 - 前記第２管は毛細管部をさらに有する、請求項１に記載の二段階作動の核酸反応検出管。
- 前記連結器の試験紙設置空間は、同一の管径を有する細長い通路である、請求項１に記載の二段階作動の核酸反応検出管。
- 前記集液空間は、前記液体を導出し、且つ前記試験紙設置空間の長辺に位置する出口を有する、請求項４に記載の二段階作動の核酸反応検出管。
- 前記集液空間は、前記試験紙設置空間と連通するチャンバである、請求項１に記載の二段階作動の核酸反応検出管。
- 前記集液空間は前記案内部に隣接する入口と前記試験紙設置空間に隣接する出口を有し、前記出口の開口面積は前記入口の開口面積よりも大きい、請求項１に記載の二段階作動の核酸反応検出管。
- 前記案内部は、前記集液空間に向かい、且つ前記第２管内の液体を前記集液空間に導入することができる案内斜面である、請求項１に記載の二段階作動の核酸反応検出管。
- 前記第１連結部及び前記第２連結部は、前記連結器を連結するための第１嵌合構造及び第２嵌合構造をそれぞれ有する、請求項１に記載の二段階作動の核酸反応検出管。
- 前記第１嵌合構造及び前記第２嵌合構造は、前記連結器を連結するための少なくとも１つの環状突出部である、請求項９に記載の二段階作動の核酸反応検出管。
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