JP2018042469A - 配向性を有する短繊維−細胞複合凝集塊を製造するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
一方、例えば、角膜実質はコラーゲン線維が規則正しく配向して密に会合した層が多数積層した構造が形成されており、上下の層ではその配向が90度異なった構造(以下、「ラメラ構造」と称する場合がある。)をしているために、透明度と物理的強度を維持している。
そのため、特許文献1に記載の足場材料では、角膜実質、靭帯等の細胞の配向性を必要とする組織、又は器官の再生に使用するためには改良の余地があった。
[1]配向性を有する短繊維−細胞複合凝集塊を製造するための方法であって、0.1質量%未満の短繊維と、5.0×104個/mL以上1.0×105個/mL以下の細胞とを含む培養液を調製し、培養することで配向性を持たせながら凝集させる培養工程を備え、前記短繊維の平均長が10μm以上500μm以下であり、かつ平均直径が200nm以上4μm以下であり、前記短繊維の表面にポリマーブラシが形成されていることを特徴とする製造方法。
[2]前記ポリマーブラシが親水性を有する材料からなる[1]に記載の製造方法。
[3]前記細胞が線維芽細胞、筋細胞、骨芽細胞、又はそれらに分化し得る細胞である[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4]前記培養液は、さらに血清又は成長因子を含む[1]〜[3]のいずれか一つに記載の製造方法。
一実施形態において、本発明は、配向性を有する短繊維−細胞複合凝集塊を製造するための方法であって、0.1質量%未満の短繊維と、5.0×104個/mL以上1.0×105個/mL以下の細胞とを含む培養液を調製し、培養することで配向性を持たせながら凝集させる培養工程を備え、前記短繊維の平均長が10μm以上500μm以下であり、かつ平均直径が200nm以上4μm以下であり、前記短繊維の表面にポリマーブラシが形成されている製造方法を提供する。
これに対し、本実施形態の製造方法では、短繊維及び細胞を特定の濃度で混合培養することにより、一定の方向に配向された短繊維−細胞複合構造を自己組織的に構成された短繊維−細胞複合凝集塊を得ることができる。さらに、得られた短繊維−細胞複合凝集塊同士を所望の角度、例えば、細胞として角膜実質細胞を用いた短繊維−細胞複合凝集塊同士を90度ずらして積層しラメラ構造を形成させることで、角膜の再生等に使用することができる。
本実施形態の製造方法に用いられる短繊維は、従来の微粒子等の足場材料と比較して、大きなアスペクト比を有する。これにより、細胞と共に凝集させると、従来の微粒子等の足場材料では微粒子同士が密集してしまうのに対し、短繊維同士が密集することなく、一定の配向性を持ちながら、短繊維間に十分な隙間を残した状態で凝集が起こる。従って、このようにして形成された短繊維−細胞複合凝集塊は、多数の孔が自己形成された多孔質城となるので、形成された短繊維−細胞複合凝集塊のサイズが大きい場合でも、表面から内部までの酸素や栄養の供給、又は細胞からの老廃物や有用産物の外部への放出のための循環系として機能する多数の経路を有することができる。
短繊維の平均長が上記下限値以上であることにより、初期の細胞密度の制御や異方性の制御することができる。一方、短繊維の平均長が上記上限値以下であることにより、短繊維の絡み合いが起こることを防ぎ、短繊維の充分な分散状態を得ることができる。
また、短繊維の平均直径が上記下限値以上であることにより、細胞同士の接着を抑制することができ、大きな細胞凝集塊を作成した場合に、内部への栄養供給を担保することができる。一方、短繊維の平均直径が上記上限値以下であることにより、形成細胞凝集塊における細胞の占める割合が少なくなることを防ぎ、高機能な細胞凝集塊を得ることができる。
また、これらの材料には、細胞の接着性を促進させる官能基(例えば、アミン基、カルボキシ基、チオール基等)を有する、又は細胞の接着性を促進させる低分子化合物(例えば、RGDモチーフ等)が吸着若しくは結合していてもよい。
また、短繊維の材料としては、生体適合性を有する材料であることが好ましく、生体吸収性を有する材料であることがより好ましい。
また、本明細書において、「生体吸収性」とは、生体内に一定期間、材料がその形状又は物性を保持し、その後分解及び吸収されることで生体内への導入部分から消失しうる性質を意味する。
前記細胞外マトリックス由来成分としては、例えば、コラーゲン(例えば、I型、II型、III型、V型、XI型等)、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ゼラチン等が挙げられ、これらに限定されない。
前記セルロースには、合成により改質されたものも含み、例えば、セルロース誘導体(例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、キトサン等)等が挙げられる。より具体的なセルロース誘導体としては、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、セルローススルフェートナトリウム塩等が挙げられる。
前記ポリアクリレート(アクリル樹脂)としてより具体的には、例えば、ポリ(メタクリル酸メチル)、ポリ(メタクリル酸エチル)、ポリ(メタクリル酸ブチル)、ポリ(メタクリル酸イソブチル)、ポリ(メタクリル酸ヘキシル)、ポリ(メタクリル酸イソデシル)、ポリ(メタクリル酸ラウリル)、ポリ(メタクリル酸フェニル)、ポリ(アクリル酸メチル)、ポリ(アクリル酸イソプロピル)、ポリ(アクリル酸イソブチル)、ポリ(アクリル酸オクタデシル)等が挙げられる。
表面にポリマーブラシが形成された短繊維を使用することにより、短繊維表面に親水性を付与して水流への分散性を向上させること、又は細胞との親和性を向上させることができる。
前記ポリマーブラシを構成する親水性を有する材料としては、天然有機高分子化合物の誘導体(例えば、細胞と特異的に結合可能な糖鎖等を側鎖に有する天然高分子化合物等)であってもよく、合成有機高分子化合物であってもよい。
前記無機化合物としては、短繊維の材料として上述したものと同様のものが挙げられる。
前記天然有機高分子化合物としては、短繊維の材料として上述したものと同様のものが挙げられる。
前記合成有機高分子化合物としては、例えば、ポリ(ビニルアルコール)、ポリスチレンスルホン酸塩(例えば、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、ポリスチレンスルホン酸カルシウム等)、ポリアルキレングリコール(例えば、ポリエチレングリコール等)、ポリアルキレンオキシド(例えば、ポリエチレンオキシド等)、ポリアルキレンテレフタレート(例えば、ポリエチレンテレフタレート等)、ポリオルトエステル、ポリビニルエーテル、ポリヒドロキシ酸(例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド等)、ポリ(ヒドロキシ酪酸)、ポリ(ヒドロキシ吉草酸)、ポリ[ラクチド−co−(ε−カプロラクトン)]、ポリ[グリコリド−co−(ε−カプロラクトン)]等)、ポリ(ヒドロキシアルカノエート)、及びこれらのコポリマー等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態の製造方法において用いられる細胞としては、例えば、生殖細胞(精子、卵子等)、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離されたがん細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞(細胞株)、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
また、本明細書において、「癌」とは、診断名を表す際に用いられ、「がん」とは、悪性新生物の総称を表す際に用いられる。
なお、一般に、「線維芽細胞」とは、結合組織の固有細胞であって、コラーゲン等の細胞外マトリックスを産生することが知られている。
前記結合組織は、固有結合組織、特殊結合組織、及び胚性結合組織に分類される。本実施形態の製造方法によって得られる短繊維−細胞複合凝集塊は、主に固有結合組織の再生に有用である。
前記固有結合組織は、さらに、疎性結合組織(器官や上皮を保持し、コラーゲンやエラスチンを含む多様なタンパク質性の細胞外マトリックスを有する。)、密性結合組織(靭帯や腱を形成し、強力な伸長強度を示すコラーゲン線維が詰め込まれている。繊維の配列に基づいて交織繊維性と平行線維性との2種類に細分される。)、脂肪組織(脂肪細胞で構成され、緩衝材、断熱材、潤滑剤、エネルギー貯蔵の役割を果たす。)、及び細網組織(リンパ器官(例えば、リンパ節、骨髄、脾臓等)を支持する軟骨格を形成する。)に分類される。
よって、本実施形態の製造方法において、細胞として線維芽細胞を使用し、一定の方向に配向させながら凝集させた短繊維−細胞複合凝集塊は靭帯の再生に有用である。
よって、本実施形態の製造方法では、使用する短繊維は平均長及び平均直径が制御されたものであり、さらに角膜実質細胞と共に培養することで、一定の方向に配向させながら凝集させた短繊維−細胞複合凝集塊を製造することができるため、得られた短繊維−細胞複合凝集塊は角膜実質の再生に有用である。
前記筋線維芽細胞とは、線維芽細胞の亜種であり、筋細胞にも分類される細胞である。皮膚の創傷治癒過程において、線維芽細胞がαアクチンを発現する強い収縮能をもつ筋線維芽細胞へと分化し、さらに盛んな免疫応答をかねそなえた平滑筋様の細胞へと変化することが知られている。
よって、本実施形態の製造方法において、細胞として線維芽細胞を使用し、線維芽細胞を筋線維芽細胞に分化させて、一定の方向に配向させながら凝集させた短繊維−細胞複合凝集塊を製造することができる。さらに、得られた短繊維−細胞複合凝集塊と筋細胞とを共培養することで、骨格筋又は内臓筋等の筋系の器官を構築することができる。
まず、短繊維と細胞とを含む培養液を調製する。次いで、前記調製した培養液を培養することで、短繊維と細胞とを配向性を持たせながら凝集させる。
培養液に含まれる短繊維の濃度が上記範囲であることにより、細胞と共培養させた際に、一定の方向に配向させながら凝集することができる。
培養液に含まれる細胞濃度が上記範囲であることにより、短繊維と共培養させた際に、一定の方向に配向させながら凝集することができる。
前記血清としては、例えば、FBS/FCS(Fetal Bovine/Calf Serum)、NCS(Newborn Calf serum)、CS(Calf Serum)、HS(Horse Serum)等が挙げられ、これらに限定されない。
細胞培養液に含まれる血清の濃度は、例えば2質量%以上10質量%以下であればよい。
前記成長因子としてより具体的には、例えば、血管内皮成長因子(Vascular Endothelial Growth Factor:VEGF)、内皮細胞成長因子(Endothelial cell growth factor:ECGF)、内皮細胞増殖因子(Endothelial cell growth supplement:ECGS)、内皮細胞由来成長因子(Endothelial cell−derived growth factor:ECDGF)、上皮成長因子(Epidermal growth factor:EGF)、酸性繊維芽細胞成長因子(acidic fibroblast growth factor:aFGF)、塩基性繊維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor:bFGF)、インスリン様成長因子−1(Insulin―like growth factor−1:IGF−1)、マクロファージ由来成長因子(Macrophage−derived growth factor:MDGF)、血小板由来成長因子(Platelet−derived growth factor:PDGF)、腫瘍血管新生因子(Tumor angiogenesis factor:TAF)等が挙げられる。これらの成長因子を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
培養液に含まれる成長因子の濃度は、特別な限定はなく、例えば1ng/mL以上10μg/mL以下であればよい。
培養温度としては、例えば25℃以上40℃以下であってもよく、例えば30℃以上39℃以下であってもよく、例えば35℃以上39℃以下であってもよい。
また、培養環境は、例えば約5%のCO2条件下であってもよい。
培養時間としては、細胞の種類、細胞数等により適宜選択することができ、例えば1日以上10日以下であってもよく、例えば2日以上8日以下であってもよく、例えば4日以上14日以下であってもよい。
また、短繊維−細胞複合凝集塊内において、短繊維と細胞とは均一に分散した状態で配向している。
本実施形態の製造方法により得られた短繊維−細胞複合凝集塊は、一定の配向を有する組織(例えば、角膜、靭帯等)の再生に用いることができる。また、得られた短繊維−細胞複合凝集塊同士を所望の角度ずらして積層させることで、複雑な構造を有する組織を再生することができる。より具体的には、例えば、細胞として角膜実質細胞を用いた短繊維−細胞複合凝集塊同士を90度ずらして積層しラメラ構造を形成させることで、角膜の再生等に使用することができる。
よって、本実施形態の製造方法により得られた短繊維−細胞複合凝集塊は、1つの細胞系譜に由来する1種類の細胞を含む短繊維−細胞複合凝集塊を構築することにより、例えば、上皮組織、結合組織(例えば、角膜実質、靭帯等)、筋組織、神経組織等を再現することができる。
また、本明細書において、「器官」とは、2種類以上の組織から構成され、全体として一つの機能を担う。よって、本実施形態の製造方法により得られた短繊維−細胞複合凝集塊は、細胞系譜の異なる少なくとも2種類の細胞を含む短繊維−細胞複合凝集塊を構築することにより、例えば、角膜、骨格筋、胃、腸、肝臓、腎臓等を再現することができる。
よって、前記短繊維集合体は、細胞と共に再度共培養することで、手間をかけずに細胞に配向性を付与できる。そのため、配向性を必要とする組織(例えば、角膜実質、靭帯等)の再生のための足場材料として再利用することができる。
(1)短繊維の製造
(1−1)繊維の調製工程
まず、以下の式(1)に示す反応により、原始移動ラジカル重合(ATRP)の開始基を有する4-ビニルベンゼン−2-ブロモプロピオネート(4−vinylbenzyl−2−bromopropionate)(VBP)とスチレン(ST)のランダム共重合を行った。得られた共重合体であるポリ(ST−r−VBP)(Mn=175300、Mw/Mn=2.54)を用いて電界紡糸を行い、直径1.45〜1.54μmの電界紡糸繊維(不織布)を得た。
図1は、短繊維の製造方法でのポリマーブラシ形成工程及び切断工程を示す概略図である。図1に示す工程に従い、(1)で得られた不織布から短繊維を製造した。
具体的には、この不織布を含むスチレンスルホン酸ナトリウム(styrene sodium sulfonate;SSNa)、フリー開始剤(ブロモポリエチレングリコール)、Cu(I)Br、Cu(II)Br2、2,2−ビピリジン(2,2’−bipyridine)の1/3v/v%メタノール/水の溶液をAr雰囲気下、30℃で4時間加熱撹拌した。以下の表1にMn、Mn/Mw、理論分子量(Mn,c)、及びグラフト密度を示す。
また、グラフト密度から、電界紡糸繊維表面から伸びているポリスチレンスルホン酸ナトリウム(PSSNa)ブラシは濃厚ポリマーブラシであることが確認できた。
なお、No.1〜4の繊維を実施例1に使用し、No.5、6の繊維を実施例2及び3において使用した。
次いで、得られた表面にポリスチレンスルホン酸ナトリウムが被覆された短繊維(不織布)を水とヘキサンとの液−液界面に置き、この状態でホモジナイザーにより、3時間かけて切断を行った。切断後の短繊維化した短繊維の平均長は100〜150μmであった。
(1)短繊維懸濁培地の調製
製造1において得られた短繊維を70%エタノールに1時間分散させ、簡易的に滅菌を行った。次いで、クリーンベンチ内において、リン酸化緩衝液で十分に洗浄し、アルコールを除去した。これに10%FBSを含むEagle MEM培地を加え、短繊維懸濁培地を作成した。
ヒヨコ角膜実質細胞を用いて、細胞播種密度を6×104個/mLに固定し、短繊維濃度が0.2質量%、0.1質量%、及び0.02質量%になるよう調製した。ここでは、参照サンプルとして、培養1日のみ、直径1μm又は10μmの直径が異なるシリカ粒子に濃厚PSSNaブラシをグラフトしたものを用意し、同様に細胞と共に培養した。
次いで、各混合溶液を細胞培養用シャーレに播種し、炭酸ガスインキュベーター内で37℃、1、2、及び7日間静置し、短繊維−細胞複合凝集塊を得た。なお、7日のサンプルは培養4日目に培地交換を行った。
培養開始から1日後の短繊維−細胞複合凝集塊、又は直径1μm若しくは10μmのシリカ粒子−細胞複合凝集塊を、位相差顕微鏡を用いて観察した結果を図3に示す。
また、培養開始から1日後、2日後、及び7日後の短繊維−細胞複合凝集塊、又は直径1μm若しくは10μmのシリカ粒子−細胞複合凝集塊を、走査型電子顕微鏡(Scanning Electron Microscope;SEM)を用いて観察した結果を図4〜6に示す。なお、図6において、縦の系列の画像はそれぞれ、一番上の画像について拡大倍率を上げて観察していたものである。
このことから、短繊維と細胞の濃度を調整することで、繊維を自発的に配向できることが明らかとなった。
(1)短繊維懸濁培地の調製
製造1において得られた短繊維を70%エタノールに1時間分散させ、簡易的に滅菌を行った。次いで、クリーンベンチ内において、リン酸化緩衝液で十分に洗浄し、アルコールを除去した。これに10%FBSを含むDMEM培地を加え、短繊維懸濁培地を作成した。
マウス繊維芽細胞(L929細胞)を用いて、細胞播種密度を8×104個/mLに固定し、短繊維濃度が0.1質量%、及び0.02質量%になるよう調製した。
次いで、各混合溶液を細胞培養用シャーレに播種し、炭酸ガスインキュベーター内で37℃、2、9、及び14日間静置し、短繊維−細胞複合凝集塊を得た。なお、それぞれのサンプルについて2日おきに培地交換を行った。
培養開始から2日後、9日後、及び14日後の短繊維−細胞複合凝集塊を、SEMを用いて観察した結果を図7〜9に示す。なお、図7〜9において、縦の系列の画像はそれぞれ、一番上の画像について拡大倍率を上げて観察していたものである。
次に、培養開始から9日後の短繊維−細胞複合凝集塊内部の3次元構造を共焦点レーザー顕微鏡により観察した。観察に先立ち、細胞の核を青(図10では灰色)、細胞骨格を赤(図10では白色)に蛍光染色した。結果を図10に示す。
また、配向性については培養開始から9日後に確かめられたが、培養開始から14日後においても配向性を保ちながらマウス繊維芽細胞(L929細胞)を培養できることが確かめられた。
(1)短繊維懸濁培地の調製
製造1において得られた短繊維を70%エタノールに1時間分散させ、簡易的に滅菌を行った。次いで、クリーンベンチ内において、リン酸化緩衝液で十分に洗浄し、アルコールを除去した。これに10%FBSを含むMEM培地を加え、短繊維懸濁培地を作成した。
ヒト骨肉腫細胞(MG63細胞)を用いて、細胞播種密度を8×104個/mLに固定し、短繊維濃度が0.1質量%、及び0.02質量%になるよう調製した。
次いで、各混合溶液を細胞培養用シャーレに播種し、炭酸ガスインキュベーター内で37℃、2、及び4日間静置し、短繊維−細胞複合凝集塊を得た。なお、それぞれのサンプルについて2日目に培地交換を行った。
培養開始から4日後の短繊維−細胞複合凝集塊を、SEMを用いて観察した結果を図11に示す。図11において、縦の系列の画像はそれぞれ、一番上の画像について拡大倍率を上げて観察していたものである。
次に、培養開始から4日後の短繊維−細胞複合凝集塊内部の3次元構造を共焦点レーザー顕微鏡により観察した。観察に先立ち、細胞の核を青(図12では灰色)、細胞骨格を赤(図12では白色)に蛍光染色した。結果を図12に示す。
Claims (4)
- 配向性を有する短繊維−細胞複合凝集塊を製造するための方法であって、
0.1質量%未満の短繊維と、5.0×104個/mL以上1.0×105個/mL以下の細胞とを含む培養液を調製し、培養することで配向性を持たせながら凝集させる培養工程を備え、
前記短繊維の平均長が10μm以上500μm以下であり、かつ平均直径が200nm以上4μm以下であり、前記短繊維の表面にポリマーブラシが形成されていることを特徴とする製造方法。 - 前記ポリマーブラシが親水性を有する材料からなる請求項1に記載の製造方法。
- 前記細胞が線維芽細胞、筋細胞、骨芽細胞、又はそれらに分化し得る細胞である請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記培養液は、さらに血清又は成長因子を含む請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
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