JP2017537644A - キラル毒性のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、低減された毒性を有する立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種の同定方法であって、立体的に規定されたキラルホスホロチオエート変種のライブラリを創製し、インビトロまたはインビボのいずれかで、低減された毒性を有する化合物について、それらをスクリーニングすることによる方法に関する。
Koziolkiewicz et al. (NAR 1995 24; 5000-5005)(非特許文献1)は、ホスホロチオエート連結が[全Rp]立体配置、もしくは[全Sp]立体配置、またはジアステレオマーの無作為混合物のいずれかである、15マーのDNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを開示している。ハイブリッドまたは[全Sp]オリゴヌクレオチドに比べて、[全Rp]は、RNアーゼH依存性分解に対して「より感受性である」ことが判明し、より高い二重鎖熱安定性を有することが判明した。実用化のために、[全Rp]オリゴはそれらの3'末端で[Sp]ホスホロチオエートによって保護すべきであることが示唆されている。
a. 親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種(子オリゴヌクレオチド)のライブラリを創製する段階;
b. 段階a.で創製したライブラリを、細胞におけるそれらのインビトロまたはインビボ毒性についてスクリーニングする段階;
c. 親オリゴヌクレオチドに比べて細胞における低減された毒性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階
を含み、ここで、例えば、この方法によって同定した1つまたは複数の立体的に規定された変種をスクリーニング法の次の回で親オリゴヌクレオチドとして用いるために、任意で方法を繰り返す(反復スクリーニング)方法を提供する。立体的に規定されたなる用語は、本明細書において立体的に特定されたなる用語と交換可能である。
a. インビボまたはインビトロで毒性表現型を有する、立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(親)を提供する段階;
b. 親ギャップマーオリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(子)のライブラリを創製する段階;
c. 段階b.で創製したライブラリをインビボまたはインビトロ毒性アッセイでスクリーニングする段階;
d. 立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性を有する、1つまたは複数の立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを同定する段階
を含む方法を提供する。
本発明の方法は、細胞内で標的核酸を阻害するなどの、調節する際に用いるための立体的に特定されたオリゴマー化合物(本明細書においてオリゴマーまたはオリゴヌクレオチドとも呼ぶ)を提供する。オリゴマーはアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドであってもよい。本発明の方法を用いて同定または製造したオリゴマーは、低減された腎毒性または低減された肝毒性などの、低減されたインビトロまたはインビボ毒性を有する。
インビボおよびインビトロ最適化
本発明は、インビボ(例えば、薬理学的)有用性のための、遺伝子歩行(gene-walk)により同定したオリゴヌクレオチドなどの、オリゴヌクレオチドを最適化する方法を提供する。特に、本発明の方法を、オリゴヌクレオチド(配列)のインビトロまたはインビボ毒性を低減するため、ならびに低減された毒性や、任意で他の増強された有益な特性、例えば標的特異性、ミスマッチ識別、血清タンパク質結合、体内分布、RNアーゼH動員、効力、および細胞内取込を有するオリゴマーの合成および製造において用いてもよい。
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列(親オリゴヌクレオチド)の毒性を低減する方法であって:
a. 親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種(子オリゴヌクレオチド)のライブラリを創製する段階;
b. 段階a.で創製したライブラリを、細胞におけるそれらのインビトロまたはインビボ毒性についてスクリーニングする段階;
c. 親オリゴヌクレオチドに比べて細胞における低減された毒性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階
を含む方法を提供する。
実施例に示すとおり、いくつかの態様において、本発明の立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、そうではなく立体的に規定されていないオリゴヌクレオチド(親オリゴヌクレオチド)に比べて、増強されたRNアーゼH動員活性を有する。事実、本発明者らは、一般に、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結の、RNアーゼH動員LNAオリゴヌクレオチド、例えば、LNAギャップマーオリゴヌクレオチドへの導入が、親(立体的に規定されていない)の活性の最大30倍までの、増強されたRNアーゼH動員活性をもたらすことを見出して驚いた。したがって、本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないオリゴヌクレオチドに比べて、RNアーゼH動員活性が増強されたオリゴヌクレオチドの合成のための、立体制御された(立体特異的とも呼ぶ)ホスホラミダイトモノマーの使用を提供する。
a. 親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種(子オリゴヌクレオチド)のライブラリを作製する段階;
b. 段階a.で作製したライブラリを、RNA標的に対するそれらのインビトロRNアーゼH動員活性についてスクリーニングする段階;
c. 親オリゴヌクレオチドに比べて、増強されたRNアーゼH動員活性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階;
d. 任意で、段階c.で同定した立体的に規定された変種のうち少なくとも1つを製造する段階
を含む方法をさらに含み得る。
実施例に示すとおり、いくつかの態様において、本発明の立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、そうではなく立体的に規定されていないオリゴヌクレオチド(親オリゴヌクレオチド)に比べて、増強されたミスマッチ識別力(または増強された標的特異性)を有する。事実、本発明者らは、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結の、RNアーゼH動員LNAオリゴヌクレオチド、例えば、LNAギャップマーオリゴヌクレオチドへの導入が、増強されたミスマッチ識別力(または標的特異性)をもたらし得ることを見出して驚いた。したがって、本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないオリゴヌクレオチドに比べて、ミスマッチ識別力(または標的特異性)が増強されたオリゴヌクレオチドの合成のための、立体制御性ホスホロチオエートモノマーの使用を提供する。
a. 親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種(子オリゴヌクレオチド)のライブラリを作製する段階;
b. 段階a.で作製したライブラリを、RNA標的に対するそれらの活性および存在する少なくとも1つの他のRNAに対するそれらの活性についてスクリーニングする段階;
c. 親オリゴヌクレオチドに比べて、少なくとも1つの他のRNAに対する低減された活性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階
を含む方法を、さらに含み得る。
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列(親オリゴヌクレオチド)の体内分布を変更する方法であって:
a. 親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種(子オリゴヌクレオチド)のライブラリを創製する段階;
b. 段階a.で創製したライブラリを、それらの体内分布についてスクリーニングする段階;
c. 親オリゴヌクレオチドに比べて、変更された(好ましいなどの)体内分布を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階;
d. 任意で段階c.で同定した1つまたは複数の立体的に規定された変種を製造する段階
を含む方法を提供する。
本発明の文脈における「オリゴマー」または「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー化合物」なる用語は、複数のヌクレオチドの共有結合により生成される分子(すなわち、オリゴヌクレオチド)を意味する。本明細書において、1つのヌクレオチド(ユニット)をモノマーまたはユニットと呼んでもよい。いくつかの態様において、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「ユニット」および「モノマー」なる用語は交換可能に用いられる。ヌクレオチドまたはモノマーの配列に言及する場合、言及されるものは、A、T、G、CまたはUなどの、塩基の配列であることが理解されよう。オリゴヌクレオチドなる用語は本明細書において、オリゴマー化合物およびオリゴマーなる用語と交換可能に用いられる。
いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドは立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、すなわち、ホスホロチオエート連結のキラリティーが規定されていない個々の分子の混合物、例えば、ラセミ混合物を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。すなわち、いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドは、立体的に特定されていないホスホロチオエートヌクレオシド間連結だけを有してもよい(すなわち、立体的に特定されていないオリゴヌクレオチド)。
本発明の方法は、親オリゴヌクレオチドの変種のライブラリを創製する段階を含み、ここで変種は親オリゴヌクレオチドとは異なる少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有する。適切には、変種のライブラリの各メンバーは、親とは異なる規定の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結の別のパターンを有する。
子オリゴヌクレオチドのライブラリは、親化合物の中心的核酸塩基配列を保持する、2個以上の立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドおよび子オリゴヌクレオチドはギャップマーオリゴヌクレオチドである。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、アンチセンスメカニズムにより、mRNAまたはウイルスRNAなどの、細胞中の標的RNAを阻害するために広く用いられる(したがって、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドと呼んでもよい)。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、LNAまたは2'置換ヌクレオチドなどの親和性増強修飾ヌクレオシドを含む領域が5'および3'に隣接する、DNAヌクレオチド、例えば、6〜14個のDNAヌクレオチドの領域などの、RNアーゼHを動員することができる少なくとも5個の連続ヌクレオチドの領域(ギャップ領域)を含む。いくつかの態様において、隣接領域は1〜8ヌクレオチド長であってもよい。
本発明の方法によって同定した子オリゴヌクレオチドを、本発明の方法の一部として試験して、それらがその標的核酸を阻害することができるなどの、それらが有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを判定してもよい。したがって、本発明の方法は、子オリゴヌクレオチドのライブラリを、それらの標的を調節する、例えば、阻害する際のその有効性について、スクリーニングする(例えば、段階bの前、最中または後に)さらなる段階を含んでもよい。または、本発明の方法は、低減された毒性を有する選択した立体的に規定された変種のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての有効性を判定するために、それらを試験するさらなる段階を含んでもよい。いくつかの態様において、有効性は、RNアーゼHを動員するオリゴヌクレオチドの能力によって判定するか、またはいくつかの態様において、インビトロ、もしくはいくつかの態様において、インビボで、細胞中の標的の発現を調節する能力であってもよい。
いくつかの態様において、親および子オリゴヌクレオチドはLNAオリゴヌクレオチドであり、すなわち、それらは少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む。
オリゴヌクレオチドの標的は、典型的には、生理的条件下でオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な選択された核酸である。アンチセンス療法に関しては、医学的疾患において標的核酸が指示される。標的核酸は、例えば、mRNAまたはマイクロRNAであってもよい(標的遺伝子なる用語に含まれる)。そのようなオリゴヌクレオチドを、アンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ぶ。
オリゴマーは、長さが7〜30、例えば7〜26または8〜25、例えば9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25ヌクレオチド、例えば長さが10〜20ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列からなってもよく、またはそれを含んでもよい。いくつかの態様において、LNAオリゴマーの長さは10〜16ヌクレオチド、例えば12、13または14ヌクレオシドである。
本発明は、立体的に特定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチド配列の毒性を低減する方法であって:
a. インビボまたはインビトロで毒性表現型を有する、立体的に特定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(親)を提供する段階;
b. 親ギャップマーオリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に特定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(子)のライブラリを作製する段階;
c. 段階b.で作製したライブラリをインビボまたはインビトロ毒性アッセイでスクリーニングする段階;
d. 立体的に特定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性を有する、1つまたは複数の立体的に特定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを同定する段階
を含む方法を提供する。
Wanらにおいて報告されたとおり、ホスホロチオエート連結の無作為ラセミ混合物に比べて、ギャップマー中に全てがRpであるまたは全てがSpであるギャップ領域を導入することに利点はほとんどない。本発明は、少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結の導入がオリゴヌクレオチドの生物学的特性を実質的に改善し得るという、驚くべき利点、例えば低減された毒性、に基づいている。これは、ギャップ領域中に1箇所またはいくつか、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13もしくは14箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を導入すること、あるいはすべてのホスホロチオエート連結を立体的に特定することのいずれかによって達成し得る。
本発明者らは以前、あるDNAジヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの毒性側面に寄与し得ることを特定した(Hagedorn et al., Nucleic Acid Therapeutics 2013, 23; 302-310)。本発明のいくつかの態様において、本明細書に記載のLNAギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のDNAジヌクレオチドの毒性は、DNAジヌクレオチド、特に毒性、例えば、肝毒性に寄与することが公知のジヌクレオチドのDNAヌクレオシドの間に立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を導入することにより調節してもよい。いくつかの態様において、本発明の方法によって同定されたオリゴヌクレオチドは、cc、tg、tc、ac、tt、gt、caおよびgcからなる群より選択されるDNAジヌクレオチドモチーフを含み、ここでジヌクレオチドのDNAヌクレオシドの間のヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結、例えばSpまたはRpホスホロチオエートヌクレオシド間連結のいずれかである。典型的には、そのようなジヌクレオチドは、LNAギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内にあってもよい。いくつかの態様において、本方法によって同定されたオリゴヌクレオチドは、前述のDNAジヌクレオチドモチーフのリストから、独立せずにまたは独立して選択される少なくとも2つ、例えば少なくとも3つのジヌクレオチドを含む。
オリゴマー化合物は、翻訳の立体障害、または他の方法などによる、標的mRNAの非RNアーゼ仲介性分解を介して機能し得ることが理解され、いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、RNアーゼHなどのエンドリボヌクレアーゼ(RNアーゼ)を動員することが可能である。
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、LNAギャップマーを含むか、またはLNAギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、RNアーゼHなどのRNアーゼを動員することができるヌクレオチドの連続配列、例えば本明細書において領域Y'(Y')と呼ぶ、少なくとも5、6または7個のDNAヌクレオチドの領域を含むオリゴマーであり、ここで領域Y'は5'および3'の両方で、親和性増強ヌクレオチド類縁体、例えば1〜6個の親和性増強ヌクレオチド類縁体の領域(これらの領域はそれぞれ領域X'(X')およびZ'(Z')と呼ばれる)が、(RNアーゼを動員することができるヌクレオチドの連続配列の5'および3'で)隣接している。ギャップマーの例はWO2004/046160、WO2008/113832、およびWO2007/146511に開示されている。本発明のLNAギャップマーオリゴマーは、領域X'またはZ'に少なくとも1つのLNAヌクレオシド、例えば、領域X'に少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび領域Z'に少なくとも1つのLNAヌクレオチドを含む。
本発明の方法によって同定されるオリゴマーは、少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む。治療のために用いられる化合物の大多数はホスホロチオエートヌクレオチド間連結を用いるが、他のヌクレオシド間連結を用いることもできる。しかし、いくつかの態様において、本発明のオリゴマーのすべてのヌクレオシド間連結はホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、ギャップ領域中の連結はすべてホスホロチオエートであり、かつウィング領域のヌクレオシド間連結はホスホロチオエートまたはホスホジエステル連結のいずれであってもよい。
立体制御されたモノマーは、オリゴヌクレオチド中の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結、すなわちSpまたはRpのいずれかを付与する、オリゴヌクレオチド合成において用いられるモノマーである。いくつかの態様において、モノマーはホスホラミダイトなどのアミダイトであってもよい。したがって、モノマーは、いくつかの態様において、立体制御性/制御されたホスホラミダイトなどの、立体制御性/制御されたアミダイトであってもよい。適切なモノマーは実施例、またはOka et al., J. AM. CHEM. SOC. 2008, 130, 16031-16037 9 16031において提供される。同様に、WO 10064146、WO 11005761、WO 13012758、WO 14010250、WO 14010718、WO 14012081、およびWO 15107425も参照されたい。立体制御された/立体制御性なる用語は本明細書において交換可能に用いられ、立体特異的/立体的に特定されたまたは立体的に規定されたモノマーと呼んでもよい。
いくつかの態様において、「ヌクレオシド類縁体」および「ヌクレオチド類縁体」なる用語は、交換可能に用いられる。
「LNA」なる用語は、「ロックド核酸」として公知の、二環式ヌクレオシド類縁体を意味する。これはLNAモノマーを指してもよく、または、「LNAオリゴヌクレオチド」の文脈で用いる場合、LNAは1つまたは複数のそのような二環式ヌクレオチド類縁体を含むオリゴヌクレオチドを指す。LNAヌクレオチドは、例えば、以下に記載するビラジカルR4* - R2*として示す、リボース糖環のC2'とC4'との間のリンカー基(架橋などの)の存在によって特徴付けられる。
ここで、すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよく;
式中、Xは-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-から選択され、例えば、いくつかの態様において、-O-であり;
Bは水素、置換されていてもよいC1-4-アルコキシ、置換されていてもよいC1-4-アルキル、置換されていてもよいC1-4-アシルオキシ、天然および核酸塩基類縁体を含む核酸塩基、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され;好ましくは、Bは核酸塩基または核酸塩基類縁体であり;
Pは、隣接モノマーへのヌクレオチド間連結、または5'末端基を示し、そのようなヌクレオチド間連結または5'末端基は任意で置換基R5または同等に適用可能な置換基R5*を含み;
P*は、隣接モノマーへのヌクレオチド間連結、または3'末端基を示し;
R4*およびR2*は一緒に、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zから選択される1〜4つの基/原子からなる二価のリンカー基を示し、ここでZは-O-、-S-、および-N(Ra)-から選択され、かつRaおよびRbはそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、置換されていてもよいC1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基RaおよびRbは一緒に、置換されていてもよいメチレン(=CH2)を示してもよく、ここですべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよく、かつ;
存在する置換基R1*、R2、R3、R5、R5*、R6およびR6*はそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基は一緒に、オキソ、チオキソ、イミノ、または置換されていてもよいメチレンを示してもよく;;ここでRNは水素およびC1-4-アルキルから選択され、かつここで2つの隣接(非ジェミナル)置換基はさらなる結合を示して二重結合をもたらしてもよく;かつRN*は、存在し、ビラジカルに関与しない場合、水素およびC1-4-アルキルから選択される。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。
式中、Yは-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)および/または-CH2-からなる群より選択され;ZおよびZ*は独立にヌクレオチド間連結、RH、末端基または保護基の間で選択され;Bは天然または非天然ヌクレオチド塩基部分(核酸塩基)を構成し、かつRHは水素およびC1-4-アルキルから選択され;Ra、Rb Rc、RdおよびReは、任意で、独立に、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドからなる群より選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基RaおよびRbは一緒に、置換されていてもよいメチレン(=CH2)を示してもよく;かつRHは水素およびC1-4-アルキルから選択される。いくつかの態様において、Ra、Rb、Rc、RdおよびReは、任意で、独立に、水素およびC1-6アルキルからなる群より選択され、例えばメチルである。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよく、例えば、2つの例示的な立体化学異性体にはベータ-Dおよびアルファ-Lイソ型が含まれ、これらは以下のとおりに例示されうる。
この文脈において、「結合体」なる用語は、本明細書に記載のオリゴマーの1つまたは複数の非ヌクレオチド、または非ポリヌクレオチド部分への共有結合(「結合」)によって形成される、不均一分子を示すことが意図される。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例には、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはその組み合わせなどの、高分子作用物質が含まれる。典型的には、タンパク質は標的タンパク質に対する抗体であり得る。典型的ポリマーはポリエチレングリコールであり得る。
本明細書において用いられる「活性化オリゴマー」なる用語は、オリゴマーの1つまたは複数の結合部分、すなわち、それ自体は核酸またはモノマーではない部分への共有結合を可能にして、本明細書に記載の結合体を形成する、少なくとも1つの官能性部分に共有結合した(すなわち、官能基化した)、本発明のオリゴマーを意味する。典型的には、官能性部分は、例えば、3'-ヒドロキシル基またはアデニン塩基の環外NH2基を介してオリゴマーに共有結合することができる化学基、好ましくは親油性であるスペーサー、および結合部分に結合することができる末端基(例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基)を含む。いくつかの態様において、この末端基は保護されておらず、例えば、NH2基である。他の態様において、末端基は、例えば、“Protective Groups in Organic Synthesis” by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載のものなどの、任意の適切な保護基で保護されている。適切なヒドロキシル保護基の例には、酢酸エステルなどのエステル、ベンジル、ジフェニルメチル、またはトリフェニルメチルなどのアラルキル基、およびテトラヒドロピラニルが含まれる。適切なアミノ保護基の例には、ベンジル、アルファ-メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、およびトリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルなどのアシル基が含まれる。いくつかの態様において、官能性部分は自己切断性である。他の態様において、官能性部分は生体分解性である。例えば、米国特許第7,087,229号を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明のオリゴマーを、薬学的製剤および組成物中で用いてもよい。適切には、そのような組成物は薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。PCT/DK2006/000512は、適切かつ好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントを提供しており−これは参照により本明細書に組み入れられる。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤もPCT/DK2006/000512において提供され−これは参照により本明細書に組み入れられる。
本発明のオリゴマーを、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として用いてもよい。
本発明のオリゴマーおよび他の組成物を、標的の変異体の過剰発現または発現に関連する状態の処置のために用いることができる。
DNA 3'-O-オキサザホスホリジンモノマーの合成を、以前に記載された通りに実施した(Oka et al., J. Am. Chem. Soc. 2008 130: 16031 - 16037、およびWan et al., NAR 2014, November, online publication)。
L-3-OAP-LNA Tの合成:
PCl3(735μL、6.30mmol)をトルエン(7mL)に溶解し、0℃(氷浴)まで冷却し、トルエン(7mL)中のP5-L(1.12g、6.30mmol)およびNMM(1.38mL、12.6mmol)の溶液を滴加した。反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエン(4mL)で洗浄し、ろ液を40℃、減圧下(シュレンク法)で濃縮した。残渣をTHF(8mL)に溶解し、次の段階で用いた。
PCl3(1.05mL、9.0mmol)をトルエン(12mL)に溶解し、0℃(氷浴)まで冷却し、トルエン(12mL)中のP5-D(1.13g、12mmol)およびNMM(2.06mL、24mmol)の溶液を滴加した。反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下(シュレンク法)で濃縮した。残渣をTHF(18mL)に溶解し、次の段階で用いた。
L-3-OAP-LNA MeCの合成
PCl3(110μL、1.25mmol)をトルエン(3mL)に溶解し、0℃(氷浴)まで冷却し、トルエン(3mL)中のP5-L(222mg、1.25mmol)およびNMM(275μL、2.5mmol)の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下(シュレンク法)で濃縮した。残渣をTHF(5mL)に溶解し、次の段階で用いた。
PCl3(1.10mL、12.3mmol)をトルエン(10mL)に溶解し、0℃(氷浴)まで冷却し、トルエン(10mL)中のP5-D(2.17g、12.3mmol)およびNMM(2.70mL、2.5mmol)の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下(シュレンク法)で濃縮した。残渣をTHF(10mL)に溶解し、次の段階で用いた。
L-3-OAP-LNA Aの合成
PCl3(184μL、2.1mmol)をトルエン(5mL)に溶解し、0℃(氷浴)まで冷却し、トルエン(5mL)中のP5-L(373mg、2.10mmol)およびNMM(463μL、4.20mmol)の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエン(4mL)で洗浄し、ろ液を40℃、減圧下(シュレンク法)で濃縮した。残渣をTHF(5mL)に溶解し、次の段階で用いた。
PCl3(0.84mL、9.63mmol)をトルエン(12mL)に溶解し、0℃(氷浴)まで冷却し、トルエン(12mL)中のP5-D(1.70g、9.63mmol)およびNMM(2.12mL、19.3mmol)の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下(シュレンク法)で濃縮した。残渣をTHF(12mL)に溶解し、次の段階で用いた。
D-3-OAP-LNA Gの合成
PCl3(1.09mL、12.4mmol)をトルエン(12.5mL)に溶解し、0℃(氷浴)まで冷却し、トルエン(12.5mL)中のP5-D(2.20g、12.4mmol)およびNMM(2.73mL、27.8mmol)の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下(シュレンク法)で濃縮した。残渣をTHF(19mL)に溶解し、次の段階で用いた。
PCl3(1.00mL、11.4mmol)をトルエン(10mL)に溶解し、0℃(氷浴)まで冷却し、トルエン(10mL)中のP5-L(2.02g、11.4mmol)およびNMM(2.50mL、22.7mmol)の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下(シュレンク法)で濃縮した。残渣をTHF(7mL)に溶解し、次の段階で用いた。
蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの合成:PCl3(1当量)をトルエンに溶解し、0℃(氷浴)まで冷却し、トルエン中のP5-L(1当量)およびNMM(2.1当量)の溶液を滴加した。反応混合物を室温で撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下(シュレンク法)で濃縮した。残渣をTHFに溶解し、次の段階で用いた。
前記LNAモノマーをオリゴヌクレオチド合成において用い、HPLCにより判定して、立体制御ホスホラミダイトLNAオリゴヌクレオチドを生じたことが示された。
Myd88を標的とする以下のLNAオリゴヌクレオチドを合成する。
大文字はベータ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、小文字はDNAヌクレオシドである。
下付き文字x=RpおよびSpモノマーのラセミ混合物から無作為に組み込まれたホスホロチオエート連結。
下付き文字s=Spモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
下付き文字r=Rpモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
大文字Cの前の上付き文字mは5-メチルシトシンLNAヌクレオシドを表す。
親化合物#1はマウスにおいて肝毒性があることがわかっている。化合物#1〜27#をインビボアッセイでそれらの肝毒性について評価する:1群につき5匹のNMRI雌マウスを用い、15mg/kgの化合物を各マウスに第0、3、7、10および14日に投与し、第16日に屠殺する。血清ALTを測定する。肝毒性は、NMRIマウスを用いる以外は、EP 1 984 381、実施例41に記載の通りに測定してもよく、またはインビトロ肝細胞毒性アッセイを用いて測定してもよい。
Seth et al J. Med. Chem 2009, 52, 10-13において毒性であると同定された以下のLNAオリゴヌクレオチドを合成する。
大文字はベータ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、小文字はDNAヌクレオシドである。
下付き文字x=RpおよびSpモノマーのラセミ混合物から無作為に組み込まれたホスホロチオエート連結。
下付き文字s=Spモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
下付き文字r=Rpモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
大文字Cの前の上付き文字mは5-メチルシトシンLNAヌクレオシドを表す。
親化合物#28はマウスにおいて肝毒性があることがわかっている。化合物#28〜27#をインビボアッセイでそれらの肝毒性について評価する:1群につき5匹のNMRI雌マウスを用い、15mg/kgの化合物を各マウスに第0、3、7、10および14日に投与し、第16日に屠殺する。血清ALTを測定する。肝毒性は、NMRIマウスを用いる以外は、EP 1 984 381、実施例41に記載の通りに測定してもよく、またはインビトロ肝細胞毒性アッセイを用いて測定してもよい。
C57BL6/Jマウス(5匹/群)に、単一用量の食塩水または食塩水中の30mg/kg LNA-アンチセンスオリゴヌクレオチド(seq ID # 1、10、または14)を第0日に静脈内注射し、第8日に屠殺した。
3箇所のホスホロチオエートヌクレオシド間連結が、S(化合物#10)またはR(化合物#14)配置のいずれかに固定されている、LNAオリゴヌクレオチドの部分群の肝毒性の可能性(ALT)を、すべてのヌクレオシド間連結がRおよびS配置の混合物であるジアステレオ異性体の親混合物(化合物#1)のALTと比較した。1つの部分群(化合物#14)で、ALT読み出し値は親混合物(化合物#1)よりも有意に低く、他の化合物部分群(化合物#10)では、ALT読み出し値は親とほぼ同等であると認められる(図3)。さらに、肝臓取込の特徴(図4a)は、ALT読み出し値が低いLNAオリゴヌクレオチドの部分群(化合物#14)は、親LNA混合物(化合物#1)と同程度に肝臓に取り込まれるが、ALTが親混合物(化合物#1)と同等の他の部分群(化合物#10)は、肝臓への取込が少ないことを示している。腎臓取込(図4b)は、親LNA(化合物#1)および1つの部分群(化合物#10)でほぼ同等であり、他のLNAオリゴヌクレオチドの部分群(化合物#14)では高い。脾臓への取込は3つの化合物群すべてでほぼ同等である(図4c)。一般に、いくつかの位置において立体化学を固定し、それによりLNAオリゴヌクレオチドの部分群を生じることで、LNAオリゴヌクレオチドの親混合物に比べて、取込および肝毒性の可能性などの特性の相違が誘導されることがわかる。
用いた親化合物、3833を用いた:
ここで、大文字はベータ-D-オキシ-LNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドを表し、下付き文字sは無作為sまたはrホスホロチオエート連結(オリゴヌクレオチド合成中にキラルに規定されていない)を表し、かつCの前の上付き文字mは5-メチルシトシンLNAヌクレオシドを表す。
RNアーゼH1(組換えヒト)によるRNAのLNAオリゴヌクレオチド仲介性切断
LNAオリゴヌクレオチド15pmolおよび5'fam標識RNA 45pmolを13μLの水に加えた。アニーリング緩衝液6μL(200mM KCl、2mM EDTA、pH7.5)を加え、温度を90℃まで2分間上昇させた。試料を室温に戻し、3μLの750mM KCl、500mM トリス-HCl、30mM MgCl2、100mMジチオスレイトール、pH8.3中のRNアーゼH酵素(0,15U)を加えた。試料を37℃で30分間維持し、EDTA溶液4μL(0.25M)を加えて反応を停止した。
試料15μLを200μLの緩衝液A(10mM NaClO4、1mM EDTA、20mM トリス-HCL pH7.8)に加えた。試料をAIE−HPLCにかけた:注入量50μL(カラム:DNA pac 100 2×250、勾配:0分、0.25mL/分、100%A、22分、22%B(1mM NaClO4、1mM EDTA、20mMトリス-HCL pH7.8)、25分、0.25mL/分、100%B、30分、0.25mL/min、100%B、31分、0.5mL/分、0%B、35分、0.25mL/分、0%B、40分、0.25mL/分、0%B。シグナル検出:蛍光発光518nm、励起494nm。
すべてのリン連結がチオール化された、配列GmCattggtatTmCAを有するLNAオリゴヌクレオチド。連結中のチオホスフェートの特定のキラリティーを記す。何も記していない場合、キラリティーはRおよびSの混合である。AIE-HPLC保持時間の下に、すべてのピーク面積合計に対するピーク面積のパーセンテージを示す。異なるLNAオリゴヌクレオチドの活性の順位を、キラリティー混合LNAオリゴヌクレオチド3833の酵素反応後に残った全長RNAを、他のLNAオリゴヌクレオチドでの残ったRNAで除した%から計算する。
Sキラリティーが選択された最後の5'連結およびスポットキラリティーが選択されたLNAオリゴヌクレオチド17298〜17301を除いて、LNAオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート連結のキラリティーは無作為に選択されている。LNAオリゴヌクレオチドの完全ジエステルおよびギャップにおいてジエステルのみの変種は、混合キラル変種3833よりも低い活性を有する。キラル配列はRNAの活性化および切断を増強する。特定のキラルLNAオリゴヌクレオチドのほとんどについて、RNアーゼH1の活性化はキラリティー混合3833のものよりも良好にはたらいた。特定の配列のうち最良のものは、3833よりも実質的に多くのRNA切断を開始した(30分後に98.4%対47.7%)。特定のLNAオリゴヌクレオチドそれぞれの特徴は、1ヶ所から数ヶ所の切断点まで変動する、それらの独特なRNA切断パターンである。
マウス肝臓灌流
初代マウス肝細胞を、10〜13週齢雄C57B16マウスから、逆行性2段階コラゲナーゼ肝臓灌流により単離した。簡単に言うと、餌を与えたマウスをペントバルビタールナトリウム(120mg/kg、i.p.)で麻酔した。灌流チューブを右心室から尾大静脈中に挿入した。総腸骨静脈遠位の尾大静脈の結紮後、門脈を切開し、2段階肝臓灌流および細胞単離を行った。肝臓をまず、カルシウム無し、EGTA(0.5mM)を補充したHEPES(20mM)緩衝化ハンクス平衡塩溶液からなる前灌流溶液で5分間灌流し、続いてCaCl2(5mM)およびコラゲナーゼ(0.2U/ml;II型コラゲナーゼ、Worthington)を含むNaHCO3(25mM)補充ハンクス液で12分間灌流した。流速は7ml/分に維持し、すべての溶液を37℃に維持した。インサイチュー灌流後、肝臓を摘出し、肝臓被膜を機械的に切開し、フェノールレッドを含まないウィリアム培地E(WME)(Sigma W-1878)に細胞を懸濁し、1組のナイロンセルストレーナー(40および70メッシュ)を通してろ過した。死滅細胞をパーコール(Sigma P-4937)遠心分離段階(パーコール密度:1.06g/ml、50g、10分)およびWME中での追加の遠心分離(50xg、3分)により除去した。
大文字はベータ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、小文字はDNAヌクレオシドである。
下付き文字x=RpおよびSpモノマーのラセミ混合物から無作為に組み込まれたホスホロチオエート連結。
下付き文字s=Spモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
下付き文字r=Rpモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
大文字Cの前の上付き文字mは5-メチルシトシンLNAヌクレオシドを表す。
細胞培養のために、初代マウス肝細胞を、10%ウシ胎仔血清、ペニシリン(100U/mL)、ストレプトマイシン(0.1mg/mL)を補充したWMEに、約5×106細胞/mlの密度で懸濁し、コラーゲンコーティングした96穴プレート(Becton Dickinson AG、Allschwil、Switzerland)中に0.25×106細胞/ウェルの密度で播種した。細胞を3〜4時間予備培養して細胞培養プレートに接着させた後、オリゴヌクレオチド処理を開始した。PBSに溶解したオリゴヌクレオチドを細胞培養物に加え、細胞上に3日間放置した。細胞毒性レベルを、細胞毒性検出キット(Roche 11644793001、Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science Mannheim、Germany)を製造者のプロトコル通りに用いて、培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の量を測定することにより判定した。細胞ATPレベルの判定のために、本発明者らはCellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay(G9242、Promega Corporation、Madison WI、USA)を製造者のプロトコル通りに用いた。各試料を三つ組で試験した。
マウス肝細胞からのmRNA精製 製造者の指示に従ってのRNアーゼなしのDNアーゼIを含むRNeasy 96 Kit(Qiagen、Hombrechtikon、Switzerland)処理。cDNAをiScript一本鎖cDNA合成キット(Bio-Rad Laboratories AG、Reinach、Switzerland)を用いて合成した。定量的リアルタイムPCRアッセイ(qRT-PCR)を、Roche SYBR Green I PCR KitおよびLight Cycler 480(Roche Diagnostics、Rotkreuz、Switzerland)を、特異的DNAプライマーと共に用いて実施した。分析をΔCt閾値法により行って、RPS12 mRNAに比べての発現を判定した。各分析反応を、条件毎に2試料を用い、二つ組で実施した。結果を図5および6に示す。化合物#58および#60は、標的(Myd88)に対する有効なアンチセンス活性を保持しているが、有意に低減された毒性を有する。これらの化合物はRpの立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む。
実施例6および8で用いたのと同じ化合物を、以下のRPTEC-TERT1培養、オリゴヌクレオチド処理および生存度アッセイで用いた。
用いた実験手順は、親3833化合物と比べて様々な位置にミスマッチを導入した代替RNA基質を用いた以外は、実施例7に記載の通りであった。完全マッチRNA基質およびミスマッチRNA基質に対するRNアーゼH活性を判定した。
用いた親化合物、4358を用いた:
ここで、大文字はベータ-D-オキシ-LNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドを表し、下付き文字sは無作為sまたはrホスホロチオエート連結(オリゴヌクレオチド合成中にキラルに規定されていない)を表し、かつCの前の上付き文字mは5-メチルシトシンLNAヌクレオシドを表す。
[本発明1001]
以下の段階を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列(親オリゴヌクレオチド)の毒性を低減する方法:
a. 親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種(子オリゴヌクレオチド)のライブラリを創製する段階;
b. 段階a.で創製したライブラリを、細胞におけるそれらのインビトロまたはインビボ毒性についてスクリーニングする段階;
c. 親オリゴヌクレオチドに比べて細胞における低減された毒性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階。
[本発明1002]
親オリゴヌクレオチドがアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結をギャップマーのギャップ領域に挿入することによって、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーを創製する、本発明1002の方法。
[本発明1004]
少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結をギャップマーの一方または両方のウィング領域に挿入することによって、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーを創製する、本発明1002または1003の方法。
[本発明1005]
立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーが、少なくとも2箇所、例えば少なくとも3箇所、例えば少なくとも4箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含み、ここで残りの連結は任意で立体的に規定されていない規定のホスホロチオエート連結であってもよい、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーに存在するすべてのホスホロチオエート連結が、立体的に規定された規定のホスホロチオエート連結である、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーまたはそのギャップ領域に存在するすべてのヌクレオシド間連結が、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーが、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、親オリゴヌクレオチドに存在する修飾および未修飾ヌクレオシドのパターンを保持する、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
親ギャップマーオリゴヌクレオチドがLNAギャップマーである、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリ、または段階(c)で同定したライブラリ中に存在する1つまたは複数の立体的に規定された化合物のいずれかについて、インビトロまたはインビボでの効力を判定する段階をさらに含む、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
段階c.で同定した立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種が、親の効力の少なくとも25%、例えば少なくとも50%の、インビトロ(例えば、IC50)またはインビボ(例えば、ED50またはEC50)効力を保持している、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
段階c.で同定した立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種が、親化合物のEC 50 値の3〜10倍以下のEC 50 値を保持している、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
親ギャップマーオリゴヌクレオチドおよび立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリのメンバーが、ベータ-D-オキシ-LNAおよび6'メチルベータ-D-オキシLNAヌクレオシド(例えば、S(cET))のリストから選択される少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
親オリゴヌクレオチドが肝毒性であり、かつ段階(c)で同定した1つまたは複数の立体的に規定された化合物が親オリゴヌクレオチドよりも肝毒性が低い、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
段階(b)で実施したライブラリスクリーニングがインビトロまたはインビボでの肝毒性のスクリーニングを含む、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
段階(b)で実施したライブラリスクリーニングが、初代肝細胞、例えば初代哺乳動物、例えばマウスまたはラット肝細胞におけるインビトロでの肝毒性のスクリーニングを含む、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
同じ核酸塩基配列および化学的修飾(立体的に規定されたホスホロチオエート連結以外)を有する立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性を有する、立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド。
[本発明1018]
オリゴヌクレオチドにおける立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結の使用であって、該オリゴヌクレオチドが、立体的に特定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含まない同一のオリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性を有する、使用。
[本発明1019]
毒性低減オリゴヌクレオチドの合成のための、立体制御性ホスホロチオエートモノマー(例えば、ホスホラミダイト)の使用。
Claims (19)
- 以下の段階を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列(親オリゴヌクレオチド)の毒性を低減する方法:
a. 親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種(子オリゴヌクレオチド)のライブラリを創製する段階;
b. 段階a.で創製したライブラリを、細胞におけるそれらのインビトロまたはインビボ毒性についてスクリーニングする段階;
c. 親オリゴヌクレオチドに比べて細胞における低減された毒性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階。 - 親オリゴヌクレオチドがアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結をギャップマーのギャップ領域に挿入することによって、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーを創製する、請求項2に記載の方法。
- 少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結をギャップマーの一方または両方のウィング領域に挿入することによって、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーを創製する、請求項2または3に記載の方法。
- 立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーが、少なくとも2箇所、例えば少なくとも3箇所、例えば少なくとも4箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含み、ここで残りの連結は任意で立体的に規定されていない規定のホスホロチオエート連結であってもよい、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーに存在するすべてのホスホロチオエート連結が、立体的に規定された規定のホスホロチオエート連結である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーまたはそのギャップ領域に存在するすべてのヌクレオシド間連結が、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーが、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、親オリゴヌクレオチドに存在する修飾および未修飾ヌクレオシドのパターンを保持する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 親ギャップマーオリゴヌクレオチドがLNAギャップマーである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリ、または段階(c)で同定したライブラリ中に存在する1つまたは複数の立体的に規定された化合物のいずれかについて、インビトロまたはインビボでの効力を判定する段階をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 段階c.で同定した立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種が、親の効力の少なくとも25%、例えば少なくとも50%の、インビトロ(例えば、IC50)またはインビボ(例えば、ED50またはEC50)効力を保持している、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 段階c.で同定した立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種が、親化合物のEC50値の3〜10倍以下のEC50値を保持している、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 親ギャップマーオリゴヌクレオチドおよび立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリのメンバーが、ベータ-D-オキシ-LNAおよび6'メチルベータ-D-オキシLNAヌクレオシド(例えば、S(cET))のリストから選択される少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 親オリゴヌクレオチドが肝毒性であり、かつ段階(c)で同定した1つまたは複数の立体的に規定された化合物が親オリゴヌクレオチドよりも肝毒性が低い、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 段階(b)で実施したライブラリスクリーニングがインビトロまたはインビボでの肝毒性のスクリーニングを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 段階(b)で実施したライブラリスクリーニングが、初代肝細胞、例えば初代哺乳動物、例えばマウスまたはラット肝細胞におけるインビトロでの肝毒性のスクリーニングを含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 同じ核酸塩基配列および化学的修飾(立体的に規定されたホスホロチオエート連結以外)を有する立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性を有する、立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドにおける立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結の使用であって、該オリゴヌクレオチドが、立体的に特定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含まない同一のオリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性を有する、使用。
- 毒性低減オリゴヌクレオチドの合成のための、立体制御性ホスホロチオエートモノマー(例えば、ホスホラミダイト)の使用。
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