JP2017537640A

JP2017537640A - ゲノムアーキテクチャマッピング

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Publication number: JP2017537640A
Application number: JP2017531604A
Authority: JP
Inventors: アナ・ポンボ; ポール・エドワーズ; マリオ・ニコデミ; アントニオ・シャルドーネ; ロバート・ビーグリー
Original assignee: マックス−デルブリュック−ツェントルムフューアモレキュラーレメディツィンインデアヘルムホルツ−ゲマインシャフト
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2015-12-11
Publication date: 2017-12-21
Anticipated expiration: 2035-12-11
Also published as: CA2968629C; EP3031929A1; EP3230465A1; IL252591A0; CA2968629A1; US20170342462A1; WO2016092070A1; JP6837970B2; US10526639B2; CN107406873A; CN107406873B; DK3230465T3; IL252591B; EP3230465B1

Abstract

本発明は、ゲノムの三次元構造の解析の分野、すなわち、ゲノムアーキテクチャマッピング(ＧＡＭ)に関する。本発明は、細胞核のような区画における複数の核酸座位の空間的近接を決定する方法であって、区画における局在化に応じて互いの核酸座位の分離により特定される、その区画の画分中の共分離を利用して、例えば、区画の凍結切片化または例えば凍結粉砕により、画分のコレクションを得て；該画分内の該複数の座位の存在または不存在を決定し；そして、該複数の座位の共分離を決定する、方法を提供する。次いで、共分離を、空間的近接を決定するための統計的方法で解析し得る。本方法を、例えば、複数の座位間の物理的距離の決定；および例えば、核における座位および／またはゲノムアーキテクチャのマッピング；空間的接触により特定の遺伝子の発現を支持する制御領域の特定；核における外来性核酸の核位置の特定および／または座位の共分離の乱れと関係する疾患の診断に使用できる。

Description

本発明は、ゲノムの三次元構造の解析の分野、すなわち、ゲノムアーキテクチャマッピング(ＧＡＭ)に関する。本発明は、細胞核のような区画における複数の核酸座位の空間的近接を決定する方法であって、区画における局在化に応じて互いの核酸座位の分離により特定される、その区画の画分中の共分離(co-segregation)を利用して、例えば、区画の凍結切片化または例えば凍結粉砕により、画分のコレクションを得て；該画分内の該複数の座位の存在または不存在を決定し；そして、該複数の座位の共分離を決定する、方法を提供する。次いで、共分離を、空間的近接を決定するための統計的方法で解析し得る。本方法は、例えば、複数の座位間の物理的距離の決定；および例えば、核における座位および／またはゲノムアーキテクチャのマッピング；空間的接触により特定の遺伝子の発現を支持する制御領域の特定；核における外来性核酸の核内位置の特定；クロマチン凝縮の決定および／または座位の共分離の乱れと関係する疾患の診断に使用できる。

ゲノムおよびクロマチン相互作用の機構を解析するためにいくつかの試みがなされている。直線的ゲノム距離は、シークエンシング、例えばショットガン・シークエンシングによりしばしば解析される。ゲノムにおける局在配列での、特に、反復配列の場合の、問題は、例えば、ＨＡＰＰＹマッピング^１により取り組むことができ、これは、無作為画分化およびゲノムＤＮＡ希釈後の座位共分離の頻度に基づき座位間の直線的ゲノム距離を測定し、約２００kb直線距離まで機能する。

クロマチンの三次元構造に関する情報も、特に、制御領域と遺伝子プロモーターの接触を発見するために、極めて興味深い。遺伝子発現に影響する染色体相互作用の一例は、エンハンサーと転写因子を、遺伝子のすぐ近くにもってくるために折りたたまれ得る、染色体領域である。染色体の構造的性質および空間的構成の研究は、遺伝子発現、ＤＮＡ複製および修復ならびに組換えの制御の理解および評価のために重要である。染色体の折りたたみおよびそれらの接触は、例えば、癌または先天性疾患における、疾患機構および治療アプローチのための標的の解明に重要な意味を有する。

クロマチンは、相互作用および非相互作用状態で存在する。相互作用状態は、相互作用に関与する結合部位の特徴、すなわち(ａ)それらの数、距離および分布、(ｂ)それらの結合因子に係る特異性および親和性および(ｃ)結合手の濃度および特異性により、種々の性質を有する。クロマチン相互作用は、同時に結合する種々の座位の数も関与し得る(相互作用の多重性)。

蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)は、ゲノム座位間の空間的距離を直接的に測定するために顕微鏡法を使用するが、同じ核の少数のゲノム領域での同時検討にしか適用できない(例えば、Pombo A. 2003. Cellular genomics: which genes are transcribed when and where? Trends Biochem. Sci. 28, 6)。同じ細胞または組織切片を異なるプローブセットで再プローブすることは理論的には可能であるが、例えば座位の人工的凝集(接触)(すなわち相対的なおよび核目印、例えば核ラミナに対するサブゲノム領域再配置)を誘発する、例えばプローブの後のセットを解離するために必要なＤＮＡ変性により、反復再プロービングが構造的アーチファクトを生じるとの懸念がある。より凝縮された(かつ予想されるように安定な)クロマチンを代表する中期染色体の場合、再プロービングは、最高６回反復できるが(Pauciullo A et al., 2014, Development of a sequential multicolor-FISH approach with 13 chromosome-specific painting probes for the rapid identification of river buffalo (Bubalus bubalis, 2n=50) chromosomes. J Appl Genet. 55(3):397-401)、染色体形態の分解に関する懸念は、２回目のプロービング後にすでに見られることがあり、これは、染色体または核の喪失に至り得る(Heslop-Harrison JS, Harrison GE, Leitch IJ (1992) Reprobing of DNA: DNA in situ hybridization preparations. Trends Genet 8: 372-373)。ＲＮＡ−ＦＩＳＨは、ＤＮＡ変性が関与しない穏やかなＦＩＳＨアプローチであるが、活発に転写されている遺伝子(サイレント遺伝子ではない)の核位置の決定にしか使用できない。機能的クロマチン接触が最もしばしばマップされる細胞周期の静止期にある細胞からのサンプルは、構造の保持は詳細には検定されていないが、約３回しかＲＮＡ−ＦＩＳＨのために再プローブできない。ＤＮＡ−またはＲＮＡ−ＦＩＳＨで同時に適用できるプローブ数は、識別可能な蛍光マーカーにより限定され、例えば原則として５つの色、４つの色彩比および異なる２つの色強度レベルの組み合わせにより１８１バーコードを得ることが可能である(Pombo A. 2003. Cellular genomics: which genes are transcribed when and where? Trends Biochem. Sci. 28, 6)。しかしながら、このアプローチ(蛍光色素多重化)は、解析する座位が、１プローブにおける蛍光色の組み合わせが、他の組み合わせと識別可能ではなく、それゆえに、空間的に近位である座位の特定に適さないほど空間的に近いときは、機能しない。さらに、各特定座位に対する標識プローブの必要性により、ＦＩＳＨは、目的の既知座位の相互作用の解析にしか使用できず、例えば、事前に、例えばウイルスサブタイプ組込み位置および外来性ＤＮＡの正確な配列が知られていない限り、内在性または外来性ＤＮＡ配列の検出は機能しない。ＦＩＳＨはまた、直線的ゲノム構成の事前の推定によって混乱し、これは、例えばヒトサンプルにおいて、例えば生物集団におけるゲノム配列の自然変異の影響が主題であるとき、ＦＩＳＨが、事前のプローブ設計またはサンプルの事前のゲノム全体のシークエンシングと続くプローブ設計なしでは、コピー数変動またはゲノム再配列のような配列変動を本質的に検出しないため、クロマチン配置特性、例えばクロマチン接触の試験では許容されない。

ＩＮＧＲＩＤ(IN-Gel Replication of Interacting DNA segments; Gavrilov, A.A. et al., 2014 Quantitative analysis of genomic element interactions by molecular colony technique. Nucl. Acids Res. 42 (5):e36)と呼ばれる別のアプローチにおいて、架橋クロマチンフラグメントは、ポリアクリルアミドゲル層の広範囲にわたり広げられ、続いて、分離したおよび結合した要素は、それぞれ、選択ＤＮＡフラグメントのゲル内増幅中に産生された単および多成分分子コロニーの形で可視化され、これらは、分子ビーコンテクノロジーにより可視化される(Chetverin AB, Chetverina HV. Molecular colony technique: a new tool for biomedical research and clinical practice. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2008;82:219-255)。このテクノロジーもまたゲノム構成の事前の知識に頼り、ＤＮＡ配列変動、その空間的構成およびそれがゲノム全体の空間的構成にどのように影響するかを本質的に検出しない。

ゲノムの三次元構造を解析するための別の現在のアプローチは、主に染色体コンフォメーションキャプチャ(３Ｃ)技術に基づき、多くの現行版および改訂版がある(図４)。３Ｃベースの方法は、一般にゲノム接触に介在するタンパク質の弱い化学的架橋から出発する。クロマチン抽出後、ＤＮＡの架橋画分をＤＮＡ画分化のために制限酵素で処理する。続くリガーゼ添加が、ＤＮＡの２画分を接続(ライゲート)する。３Ｃの種々の異形が、このようなライゲーション事象の検出に種々の方法を使用しており、一般的な一つはシークエンシング(Ｈｉ−Ｃ、４Ｃ−ｓｅｑ)である。

これらのテクノロジーの限界は図４に記載され、文献で論じられている(例えば、Belmont A.S., 2014. Large scale chromatin organization: the good, the surprising, and the still perplexing. Curr Op Cell Biol 26, 69; O’Sullivan J.M. et al., 2013. The statistical-mechanics of chromosome conformation capture. Nucleus 4, 390; Williamson, I. et al. 2014. Spatial genome organization: contrasting views from chromosome conformation capture and fluorescence in situ hybridization. Genes Dev. 28, 2778-2791.)。

現時点で、不偏の方法でゲノムワイドな結合部位の特定は不可能であり、その結果、どの核成分が、染色体アーキテクチャの様々な側面を確立し、どれだけ長距離のクロマチン接触がゲノム安定性の維持を助け、ゲノム機能(例えば遺伝子発現)に影響するか理解していない。それゆえに、結合部位の特定および結合部位が互いに相互作用する頻度の決定が、現在の大きな課題である。

本発明者らは、核酸相互作用の検出のための画分化核酸のライゲーションに基づくバイアスを避け、数個の高多重性相互作用(各々２を超える座位が関与)、特に、２を超える相互作用の同時の解析を、ある態様において、ゲノム内の実質的に全ての核酸相互作用およびそれらの相互依存の同時解析を可能にする、改善された核酸の空間的近接を決定する方法の提供という課題に取り組んだ。この課題は、下記および特許請求の範囲に記載する本発明の方法により解決される。この方法を、ゲノムアーキテクチャマッピング(ＧＡＭ)と呼ぶ。

本発明は、区画における複数の核酸座位の空間的近接を決定する方法であって、
(ａ)画分のコレクションを得るために、核酸をそれらの区画における局在化に応じて互いに分離し；
(ｂ)該画分における複数の座位の存在または不存在を決定し；そして
(ｃ)該複数の座位の共分離を決定する
ことを含む、方法を提供する。

座位(複数座位)は、遺伝子、ＤＮＡ配列の特定の位置または染色体上の位置である(Wikipedia)。各染色体は多くの遺伝子を担持し、一倍体ヒトゲノムにおけるタンパク質コード化遺伝子は、２３の異なる染色体上、２０,０００〜２５,０００と概算される。ある座位に位置する類似ＤＮＡ配列のバリアントは、アレルと呼ばれる。本発明においては、核酸は、例えば、活発に転写されている遺伝子と他のゲノム領域の間の相互作用を解析する場合、ＤＮＡでもＲＮＡでも両者の組み合わせでもよい。通常、ＤＮＡの共分離を、本発明の方法で解析する。座位の共分離は、真核細胞の核、ミトコンドリアまたは原核細胞のような、核酸を含むあらゆる細胞または臓器区画で解析され得る。通常、真核細胞の核における核酸座位、特に、ＤＮＡ座位の共分離が解析される。本発明の方法は、それゆえに、分画された核における共分離の頻度の測定により、核における座位近接を解析するための解決を包含する。

区画が由来する細胞は、細菌、原生動物、植物細胞、真菌細胞または動物細胞、例えば、疾患または障害を有するもしくは障害を診断するための、患者(好ましくは、ヒト患者)または健常対象からの細胞のような哺乳動物細胞である。細胞は、例えば、腫瘍細胞または、例えば、ヒト組織の再プログラムにより産生された誘導多能性幹細胞のような幹細胞であり得る。このような細胞を使用して、有利にヒト発達障害または先天性疾患を研究するために、ＧＡＭを適用できる。細胞が胚性幹細胞であるならば、好ましくは、ヒト胚破壊を含む方法では産生されない。

哺乳動物は、好ましくはヒトであるが、大腸菌、酵母、シロイヌナズナ、線虫、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、キイロショウジョウバエ、マウス、ラットまたは霊長類のような他の生物のゲノムアーキテクチャを研究し、場合によっては、比較するのも有意義であり得る。

細胞は細胞培養に由来するかまたは生存生物または死亡した、すなわち、死後の生物の特定の組織からまたは実験生物全体(例えばキイロショウジョウバエ胚または線虫全体)からエクスビボで解析できる。解析に使用する細胞は、好ましくは、例えば、細胞周期が共通の期にあるようにまたは特定の発生系譜または細胞型(例えばヒト臓器の１生検の)に属する細胞のみを解析するように選択する。例えば、膵臓中、インスリン産生β細胞のみを解析し得る。このアプローチは(ａ)これらのアプローチが、目的の区画における核酸の配置を、その測定前に変えることができ、そして(ｂ)下流解析で問題となり得る小数の細胞しか生じない(例えばサイズが限られた生検)ため、細胞周期の特定の期に細胞を同調させるか、特定の細胞型を捕捉するために例えば蛍光活性化細胞選別により細胞を選別するのが好ましい。同調化細胞または例えば蛍光活性化細胞選別により選別された細胞も本発明で使用できる。マーカーが、例えば、目的の細胞型または細胞分裂期で特異的に発現されるタンパク質に特異的な、若しくは、例えば目的の細胞型に特異的に発現される、特定の、例えばｍＲＮＡまたは他のＲＮＡを検出する核酸プローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションにより検出される、抗体、または特定の遺伝子の発現または特定の期にの特徴を示すＧＦＰのような蛍光マーカーが、細胞選択に役立つように使用できる。例えば、Ｐｉｔｘ３転写因子のプロモーター制御下のＧＦＰ導入遺伝子を使用して、ドーパミン発現神経細胞をマークできる(Maxwell et al., 2005, Pitx3 regulates tyrosine hydroxylase expression in the substantia nigra and identifies a subgroup of mesencephalic dopaminergic progenitor neurons during mouse development, Dev. Biol., 282 (2): 467-479)。細胞を、例えば、座位の共分離または座位の配置に対する薬物の効果を試験するための薬剤で前処理できる。

核、細胞、組織または生物全体を、工程(ａ)実施前に好ましくは架橋剤で処理する。好ましくは、架橋剤はホルムアルデヒドまたはＤＮＡ抽出に適合性の他の安定化剤を含み得る。ホルムアルデヒドを、好ましくは、例えば、ｐＨ７.０〜８.０、好ましくは哺乳動物細胞のためにｐＨ７.６〜７.８の２５０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨの緩衝化溶液中、０.５〜８％、好ましくは、１〜８％、２〜８％または最も好ましくは、４〜８％(全てｗ／ｗ)の濃度で、１０分〜２４時間、好ましくは４％で１０分、続いて８％で２時間、使用する。例えば、実験生物の場合、組織全体を、ＨＥＰＥＳ緩衝化ホルムアルデヒド溶液(例えば、４％)で、好ましくは少なくとも３０分かん流することにより架橋し、続いて氷冷４％ホルムアルデヒドの２５０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ７.６溶液で３０分〜１時間、続いて氷冷８％ホルムアルデヒドの２５０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ７.６溶液で１〜３時間、組織解体(dissection)する(Moeller et al., 2012, Proteomic analysis of mitotic RNA polymerase II complexes reveals novel interactors and association with proteins dysfunctional in disease. Mol. Cell. Proteomics 11(6):M111.011767)。

懸濁液中の細胞(例えばヒト白血球、ショウジョウバエＳ２細胞または懸濁液中の他の単離細胞)の場合、細胞を遠心(例えば哺乳動物細胞について１５０〜３００×ｇ)により沈降させ、その後細胞沈渣(ペレット)を、例えば４％ホルムアルデヒドの２５０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ７.６溶液に再懸濁する。細胞を、遠心(例えば哺乳動物細胞について１５０〜３００×ｇ)により沈降させ、その後細胞ペレットを壊すことなく、上清をデカントした後、８％ホルムアルデヒドの２５０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ７.６溶液を添加する。細胞ペレットを、例えば１時間架橋させる。細胞ペレットを、遠心力を上げながら(例えば５００×ｇ、１０００×ｇ、２０００×ｇ、４０００×ｇ、８０００×ｇおよびある細胞型では最大１００００×ｇまで段階的に；各２分、最終工程５〜１０分)、遠心することにより徐々に圧縮小型化する。上記のような８％濃縮固定液の総時間は、最大２４時間、好ましくは約２時間である。運搬(例えば病院と臨床検査室の間)または短期保存(１時間〜１週間)のために、８％ホルムアルデヒド上清を最後の遠心で除き、細胞ペレットを壊すことなく、１％ホルムアルデヒドの２５０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ７.６溶液に置き換える。長時間の保存は推奨されないが、新鮮ホルムアルデヒド(例えば１％ホルムアルデヒドの２５０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ７.６溶液)の補充により短時間は可能である。表面に接着して増殖する細胞(例えばヒト皮膚線維芽細胞、ヒト筋肉細胞)の固定のために、細胞培養培地をデカントし、その後例えば４％ホルムアルデヒドの２５０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ７.６溶液ですすぎ、続いて例えば４％ホルムアルデヒドの２５０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ７.６溶液を新たに添加し、例えば１０分インキュベーションする。固定液をデカントし、例えば８％ホルムアルデヒドの２５０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ７.６溶液に置き換える。好ましくは１時間後、細胞を穏やかに削り取り、チューブに集める。１５０〜３００×ｇで遠心後、細胞ペレットを、懸濁液細胞について上記のように、力を上げながら遠心することにより小型化する。輸送または短期保存のために、固定細胞または組織を、例えば１％ホルムアルデヒドの２５０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ７.６溶液中、理想的にはしばしば、例えば連日または隔日、新鮮溶液に置き換えて保存できる。固定液非存在下または新鮮固定液の補充無しでの保存は、ホルムアルデヒド架橋の逆転により、核酸位置または品質の構造的変質を生じ得る。

架橋剤は、タンパク質相互および核酸とタンパク質の連鎖を誘発する。本発明の方法は、現在の３Ｃベースの方法に適合性であるものより強い架橋条件を、それゆえに核構造の良好な保持を可能とする。核酸のシークエンシングが、核酸を細胞内構造の最適構造的保存に適合する架橋工程に付した後もなお可能であったことは、発明者らにとって驚きであった。本方法はまた、核の分画がガラス化細胞の切片化(例えばDubochet et al., 1988. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21: 129に記載のとおり)またはガラス化細胞の凍結粉砕(Oeffinger M, Wei KE, Rogers R, DeGrasse JA, Chait BT, Aitchison JD, Rout MP, 2007 Comprehensive analysis of diverse ribonucleoprotein complexes. Nat Methods. 4, 951-6; Hakhverdyan et al. 2015. Rapid, optimized interactomic screening. Nature Methods 12, 553)により可能であるために、理論上は架橋工程無しで可能である。いずれの場合も、細胞超微細構造保持のためのガラス化(すなわち急速凍結)の使用が、化学的架橋剤(例えばホルムアルデヒド)の適用により導入される可能性のある何らかのアーチファクトを避ける。例えば、化学的架橋剤、例えばホルムアルデヒドでの処理は、相対的におよび／または核目印、例えば核ラミナに対してサブゲノム領域の再配置をもたらし得るが、再配置のこの可能性はガラス化サンプルでは生じない。ガラス化を使用して構造的に保存されるこのような細胞または組織サンプルは、３Ｃベースの方法またはＦＩＳＨ法でアッセイできない。

工程(ａ)における、複数の画分を得るための、区画における局在化に応じて、核酸を互いに分離する方法は、区画の切片化、好ましくは、区画の凍結超薄切片化により実施する。切片化を含む本発明の方法は、ｓＧＡＭとも称する。あるいは、分離を、凍結粉砕により実施できる(Oeffinger M, Wei KE, Rogers R, DeGrasse JA, Chait BT, Aitchison JD, Rout MP, 2007 Comprehensive analysis of diverse ribonucleoprotein complexes. Nat Methods. 4, 951-6; Hakhverdyan et al. 2015. Rapid, optimized interactomic screening. Nature Methods 12, 553)。

核凍結切片は、樹脂包埋なしで、例えば、Tokuyasu法(Tokuyasu, K. T., 1973, J. Cell Biol. 57, 551-65, A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues.)により産生し、これは、０℃〜２５℃の温度、好ましくは、室温(２０〜２５℃)で少なくとも約３０分または少なくとも約２時間または少なくとも約１日または最大１週間または約４℃での、飽和スクロース溶液中の包埋を使用する固定組織の凍結保護を含み、例えば、２時間、室温または２時間、室温が、１日〜１週間までの約４℃での短期保存に続く。包埋に続いて、スクロース包埋細胞ペレットまたは組織または生物を、例えば、サンプルホルダーとして役立つ金属スタブに置き、その後液体窒素で凍結し、好ましくは−８０〜−１１０℃で、組織によって、例えば、約−１００℃で切片化する。わずかに改変された方法(Guillot PV, Xie SQ, Hollinshead M, Pombo A (2004) Fixation-induced redistribution of hyperphosphorylated RNA polymerase II in the nucleus of human cells. Exp. Cell Res. 295, 460-468; Pombo A, Hollinshead M, Cook PR (1999) Bridging the resolution gap: Imaging the same transcription factories in cryosections by light and electron microscopy. J. Histochem. Cytochem. 47, 471-480)が良好な結果を提供することが示されている。これらの方法は、非固定凍結切片で観察されるのと同等に細胞アーキテクチャを保存し、活性ＲＮＡポリメラーゼおよび核アーキテクチャの最適保存を提供する。Chen et al., 2014, Small 10:3267の方法を別法として使用できる。非固定切片は、例えば、Lucic V., et al., 2013. J. Cell Biol. 202 (3), 407に記載のように製造できる。

例えば、核の切片は、５〜１５マイクロメートル直径の核について、約７０nm〜約１０００nm、好ましくは、１５０〜２２０nmまたは１８０〜２００nmの厚さを有し得る。本発明者らは、例えば、確立されたプロトコール^３により、マウス胚性幹(ＥＳ)細胞(ｍＥＳＣ；９μm直径核を有する)を２２０nmの厚さに凍結切片化した(図５ａ、ｂ)。固定細胞のためのスクロース媒体中の凍結切片化のための市販装置が利用可能である(例えば、Leica UltraCut UCT 52ウルトラクリオミクロトーム)。

切片作製により画分のコレクション、すなわち複数の画分が生じる。切片の最適な厚さは区画のサイズにより、これは、工程(ａ)において、下に詳細に説明するように、マウスまたはヒト細胞核(または類似のサイズを有する核)で適切であることが判明している、好ましくは５〜３００画分、１０〜１００画分、より好ましくは、４０〜６０画分または約４５〜５０画分に分けられる。画分の厚さは解析全体で均一でなければならない。

本発明のある態様において、１区画の、特に、１核の全切片を本発明の方法で解析し、単一細胞のゲノムアーキテクチャの解析を可能とする。しかしながら、これは必要ではなく、解析画分は、目的の細胞の集団の全域にわたり、複数の区画、例えば、複数の核からサンプリングされ得る。本発明の方法を使用して、好ましくは、１８０を超える画分が解析され、例えば、約１８０〜約１００００画分、好ましくは、約２００〜５０００、約２２０〜４０００、約２３０〜３５００、約２５０〜３０００、３００〜２０００または５００〜１０００画分を解析でき、ここで、これらの画分は複数の細胞(または核酸含有細胞区画)から得てよい。

単一核プロファイル(ＮＰ)が、例えば、レーザーマイクロダイセクション^４により、切片から単離される(図５ｃ)。

工程(ｂ)において、複数の座位の存在または不存在は、非顕微鏡的方法、例えば、シークエンシング、好ましくは、次世代シークエンシングにより決定し得る。例えば、単一細胞全ゲノム増幅(ＷＧＡ)を使用し得る。好ましくは、画分における座位の核酸が、実質的にまたは完全に配列決定される。これは、本方法が、研究の場で種々の座位間の相互作用の可能性を検出するために実施されたときおよび使用する生理学的条件での目的の細胞型で“正常”共分離パターンがまだ確立されていないとき、特に興味深い。本発明の方法は、故に、未知および／または不特定座位での空間的近接(および結果として相互作用)の解析に使用され得る。

例えば、ＤＮＡのような核酸を画分から抽出し(例えば、単一核プロファイルから)、画分化し、単一細胞全ゲノム増幅(ＷＧＡ)^５を使用して増幅する(図５ｄ)。ＷＧＡ増幅ＤＮＡを、例えば、Illumina HiSeqテクノロジーを使用して、配列決定し得る。単一ＮＰからのトラックの目視検査は、薄い核切片のクロマチン出入りから予測されるとおり、各々が、亜染色体領域の異なる補体を含むことを示す(図２ａ)。さらに、各ＮＰは、染色体の限定されたサブセットのみ含む。

しかしながら、特定の相互作用(共分離)の存在または不存在が以前に調査され、目的の相互作用座位がすでに知られている状況があるかもしれない。特に診断の現場において、相互作用座位の顕著な差異が、種々の患者群(例えば、健常対象と腫瘍または先天性疾患のような疾患を有する対象)で判明しているかもしれない。このような状況において、目的の２(またはそれを超える)座位の存在または不存在も、特定のＰＣＲにより決定でき、または、例えば次世代シークエンシングのためのＩＤＴ標的捕捉(IDT, Coralville, Iowa, USA)により、目的の座位を網羅する核酸の選択後、例えば、サザンブロットまたはIllumina HiSeqテクノロジーにより、その存在にすいて他に特異的に確認できる。

ｓＧＡＭは、ゆえに、好ましくは凍結超薄切片化とＤＮＡ検出(例えば全ゲノム増幅および次世代シークエンシングによる)を合わせる。薄凍結切片が個々の核全体にわたり切断されたら、核空間で互いに近い(しかし必ずしも直線的ゲノムでは近くない)座位は、遠い座位よりもより頻繁に同じ切片で見られる(すなわちより頻繁に共分離する、図１ｂ)。次いで、ゲノム座位間の核距離を、個々の核にわたる切片の数から、座位の存在または不存在をスコア化することにより推測できる(図１ｃ)。得られた表を使用して、他の全ての座位に対する各座位の共分離頻度を計算し(図１ｄ)、座位間の推測相対距離のマトリクスを作成する。それゆえにＧＡＭは、ゲノムワイドのクロマチン接触の計算を可能とする。

共分離を、空間的近接を決定するための統計的手法で解析し得る(例えばWeibel, E.R., 1979. Stereological Methods: Practical Methods for Biological Morphometry. Vol.1 Academic Press, London, UK; Weibel, E.R., 1980. Stereological Methods: Theoretical Foundations. Vol. 2. Academic Press, London, UK)。密接な空間的近接は、座位の特定の相互作用のサインであり得る。座位の特定の相互作用は、ゆえに、統計的手法を用いる共分離の解析により決定し得る。本発明の方法において使用する統計手法は、例えば、推測統計法であり得る。実施例で使用する統計的手法も本発明の方法に使用して、例えば、ここに記載するように、異なる起源のサンプルおよび／または異なる目的の座位についてサンプルを解析できる。

好ましくは、染色体上の直線的ゲノム距離から予測されるよりも高頻度で共分離されるとき、これらの座位は、互いに近位であるかまたは特異的に相互作用すると決定される。統計的手法は、例えば、診断用の設定において、クロマチンの特定の相互作用および一般的凝集および／または核体積の減少も区別できる。ＧＡＭを相対距離の決定に使用できる。絶対的距離は、相対距離を核のサイズと関連付けることにより計算できる。ＧＡＭを使用して、例えば球形区画における、目的の区画中の目的の座位放射状位置を評価でき、切片化は、多様性が大きなＤＮＡ座位を含む赤道切片および多様性が小さなＤＮＡ座位を含む頂点切片を生じ、ゆえに球形区画における座位の放射状位置は、検出する場所の切片における複雑なＤＮＡ座位から推測できる。ＤＮＡ座位の放射状配置における変化は、例えばヒト疾患と関係する(例えばMaeburn K.J. et al. 2009 Disease-specific gene repositioning in breast cancer. J. Cell Biol. 187(6):801-12; Kubben N. et al. 2012. Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions. Chromosoma 121(5): 447-64)。あるゲノム(直線状)距離でのゲノムの座位の全ての可能な対が考慮され、それらの核(３Ｄ)距離が測定されたら、相互作用しない座位の対は、２座位間のゲノム距離およびクロマチンの凝縮の程度により、およそ平均３Ｄ距離での分布が見られる。対照的に、相互作用対は、その特定の細胞型の核におけるゲノム距離の平均よりしばしば互いに近接していることが判明する。より複雑な議論も考慮されるが(下記参照)、相互作用は、非無作為行動への何らかの付加的寄与因子を考慮に入れながら、クロマチン線維の無作為配置からの逸脱として最も単純に定義できる。

ＧＡＭは、同一核プロファイルにおける２座位共分離の頻度を測定し、全ゲノム座位の共分離を同時に測定でき、(ａ)他のゲノム領域とより頻繁に相互作用するゲノム座標の特定だけでなく、(ｂ)ある無作為(予測)行動を超える座位相互作用の可能性を計算する広範な数学的処理を受けやすい定量的情報を生じる。

座位の共分離のゲノムワイドなマップは特定の物理的相互作用ならびに無作為接触に起因し、これらは、座位間の直線的ゲノム距離に高度に依存し、また共分離頻度に影響する。ＧＡＭは、あるゲノム距離の座位の非無作為接触を予測無作為行動と区別する統計モデルを適用することにより、無作為レベルを有意に超える相互作用をする座位を特定する可能性を有する。これは、例えばＳＬＩＣＥ計算プラットフォーム(StatisticaL Inference of locus Co-sEgregation；図１１参照)により達成できる。ＳＬＩＣＥは、無作為近接効果を、異なるクロマチン領域および染色体テリトリー位置で見られる異なる凝縮レベルのような他の効果と同様最大に考慮して、マトリクスと統計的に有意な直接相互作用を返す。ＳＬＩＣＥはまた同時、三方向相互作用(トリプレット)、より一般に数座位間の多価接触の可能性を精査する。ＧＡＭパイプライン内のＳＬＩＣＥ解析はまた、ウィンドウ分割および検出能の効果を考慮に入れて、ある閾値を超えるクロマチン相互作用の堅固な検出を達成するのに必要な理想的な切片厚およびチューブあたりの核プロファイルの最小数ならびにチューブ数のような目的の特定の適用下の費用および効率を最適化するための実験法の微調整に必要な対照パラメータの最適値の概算にも利用できる。

数学的には、最も単純なアプローチは、あるゲノム距離にある座位が、クロマチンが核内に均一に分布との仮説から計算される最大距離まで、３Ｄ空間中無作為に分布している無作為例を考慮することである。しかしながら、より高度な数学的計算はＧＡＭおよびＳＬＩＣＥで完全に互換性であり、これは、例えば他の空間的パラメータを考慮に入れることができ、そのいくつかを実験的に測定できまたはＧＡＭデータ自体から推測できる。例えば、染色体、亜染色体領域または単一座位が目的の核内で占める体積は、各その座位が核プロファイル(ＮＰ)において見られる頻度に比例する。

複数の座位は、同時に解析される、２以上の座位、所望により、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００または少なくとも１０００座位および最大数百万または数十億座位を意味する。例えば、５kb分解能でのヒト細胞のアレル特異的解析は、１３０万座位の同時の解析を必要とする。一つの選択肢において、区画における実質的に全ての座位または全ての座位を、本発明の方法で、例えば、区画における実質的に全ての核酸、好ましくは、全ＤＮＡのシークエンシングにより解析する。解析する座位は、バイアスのある方法で(例えばヒト細胞における全２３０００タンパク質コード化遺伝子の選択により)または不偏の方法で、例えばゲノムを一定サイズのウィンドウ、例えば、１００bp〜１０Mbのウィンドウ、好ましくは、１kb〜１Mb、５kb〜５０kbまたは１０kb〜３０kbウィンドウに分割することにより決定し得る。さらに、本発明の方法は、異なるアレルを区別しない(例えば正常ヒト細胞に存在する遺伝子の２相同コピー)方法で適用でき、あるいは、同一細胞の座位における２(または例えば多倍数体性両生類細胞の場合それより多い)アレルの区別に使用できる。

本発明の方法は、複数共分離座位、特に、２を超える共分離座位、好ましくは、３を超える、４を超える、８を超えるまたは２０を超える、共分離座位の検出を可能とする。対照的に、３Ｃベースの方法を使用する複数相互作用の特定が試みられており、無効かつ高度のバイアスがあることが示されている(Sexton et al., 2012, Cell 148:458-72)。３Ｃベースの方法でのこれらの実験的限界は、徐々の改善に係わらず、克服できないままであることを示す数学的証拠がある(O’Sullivan J.M. et al., 2013, Nucleus 4:390-8)。特に、３Ｃベースの方法における相互作用の特定のための基盤としての画分化ＤＮＡ分子 − ２末端しか有しない − の互いのライゲーションは、高次多重性相互作用の検出が、同時に相互作用する座位の数が、３相互作用座位を超えると、より困難になる現象を起こす。しかしながら、活性遺伝子がしばしば３またはそれより多くのエンハンサーと相互作用すること(Markenscoff-Papadimitriou E et al., 2014. Enhancer Interaction Networks as a Means for Singular Olfactory Receptor Expression. Cell 159: 543-557)および活性遺伝子が互いに相互作用すること(Schoenfelder et al., 2010. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42: 53-61)が知られている。さらに、制限部位はゲノムに無作為に分布しておらず、検出におけるバイアスを生じる。ライゲーションの効率はＤＮＡフラグメントの長さの違いに影響され、これは、３Ｃベースの結果にさらにバイアスをかける。本発明の方法は、好ましくはこれらのバイアスに影響されないかまたは実質的に影響されない(図１０)。

先行技術の３Ｃベースの方法とは対照的に、核酸の制限消化は、区画の切片化を含むＧＡＭ法では必要ない。本発明の全工程または方法において、区画に元々存在した核酸間でライゲーションは生じず、特に、ライゲーションを工程(ｂ)の前に行う必要はない。しかしながら、例えば、外部リンカーとのライゲーションは、例えば、増幅またはシークエンシングのために、核酸座位の存在または不存在を検出する状況で可能である。互いの区画に由来する核酸の制限消化およびライゲーションの両者を避けることは、３Ｃベースの方法の構造的バイアスを克服する。

この意味では、ＧＡＭは、ある切片に存在する全座位を同時に特定でき(これは、ＦＩＳＨでは技術的に不可能である)、３を超える座位相互作用が同時にある座位相互作用の多重性同時の検出と共に、相互作用しているときおよびしていないときの両者で座位の近接を特定できるため(３Ｃベースの方法では不可能である)、競合テクノロジーと比較して独特である。本方法の実施前には知られていなかった座位の空間的近接の特定に使用できる、すなわち、相互作用が新しく発見されたまたは定義されていない座位の間で特定できるのも、本発明の方法の利点の一つである。例えば、本発明の方法を使用して、特定の目的の座位と相互作用する全座位を特定でき、ここで、これらの座位のいずれかが解析実施前に知られている必要はない。

ＦＩＳＨの最も重要な制限は、ゲノムのどの領域が興味深いかを前もって知っておく必要があるが、一方ＧＡＭは、どれが興味深いかを前もって知ることなく全配列のマッピングを可能とする。これは、重要な遺伝子再配列が、しばしば多くのバリアントを有するため、研究および診断の状況の両方で重要なである。例えば、ＥＴＳ遺伝子ファミリーの全前立腺癌メンバーの約半分から３／４が、ゲノム再配列により種々の遺伝子プロモーターに連結し、これは、診断上重要であり(Mehra et al 2007. “Comprehensive Assessment of TMPRSS2 and ETS Family Gene Aberrations in Clinically Localized Prostate Cancer.” Modern Pathology 20 (5): 538-44). In any one case, the ETS gene can be ERG, ETV1, ETV4, ETV5 and probably others (Brenner et al, 2009, Translocations in Epithelial Cancers. Biochimica Et Biophysica Acta 1796 (2): 201-15)、そしてＥＴＳ遺伝子はＴＭＰＲＳＳ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＫＬＫ２および他の遺伝子に連結でき(Brenner et al, 2009)、これは種々の再配列により達成され得る(Clark et al, 2008, Complex Patterns of ETS Gene Alteration Arise During Cancer Development in the Human Prostate. Oncogene 27 (14): 1993-2003)。その結果、ＦＩＳＨは特定の選択した再配列で検出できるが(Clark et al, 2008)、ＦＩＳＨによる全ての既知組み合わせの試験は実際的ではなく、一方ＧＡＭは、全既知例を見つけるのみならず、新規患者特異的バリアントを発見する。類似する例は、治療標的である肺癌のキナーゼ遺伝子融合であり、治療標的である肺癌におけるＥＭＬ４とＡＬＫ遺伝子の融合は、ＦＩＳＨにより通常検出されるが、常には検出されず(Maus et al, 2012, Identification of Novel Variant of EML4-ALK Fusion Gene in NSCLC: Potential Benefits of the RT-PCR Method. International Journal of Biomedical Science 8: 1-6)、しかし、ＡＬＫは、ＫＩＦ５Ｂ、ＴＦＧ、ＫＬＣ１、ＰＴＰＮ３およびＳＴＲＮを含む多くの他の遺伝子と融合でき(Hallberg & Palmer, 2013, Mechanistic Insight Into ALK Receptor Tyrosine Kinase in Human Cancer Biology. Nature Reviews Cancer 13 (10): 685-700)、少なくとも５パートナーと融合するＲＯＳ１を含む、融合する他のキナーゼが存在する(Takeuchi et al 2012. RET, ROS1 and ALK Fusions in Lung Cancer. Nature Medicine 18 (3): 378-81)。

本発明はまた、次のための本発明の方法の使用も提供する：
(ａ)複数の座位間の物理的距離の決定。工程(ａ)における分画が、区画における座位の物理的距離によるため、距離を計算できる。画分が作製された区画の平均サイズならびに区画が分割された画分数を知ることが必要である；
(ｂ)区画における座位および／またはゲノムアーキテクチャのマッピング。マップは、決定した物理的距離に基づき、特定の座位または染色体アーキテクチャについて作成できる；
(ｃ)複数の座位間の相互作用の可能性の決定。記載するとおり、本発明の方法を使用して特定の相互作用を決定でき、先導相互作用とバイスタンダー相互作用を区別できる；
(ｄ)区画における座位または染色体の末梢または中枢位置の決定。染色体および単一座位の放射状位置は、ある染色体からの配列が、異なる染色体からしばしば少ない他のウィンドウと共に見られ、この理由のために赤道(中枢)ではなく、頂点(末梢)の核プロファイルで見られる可能性が高い(およびその逆)か否かを問うことにより推測できる；
(ｅ)プロモーター、エンハンサー、例えば、転写に関係する酵素、転位性要素、転写因子結合部位、リプレッサー、遺伝子体、スプライシングシグナルまたはＲＮＡからなる群から選択される異なる機能的要素の相互作用の解析；
(ｆ)特定の遺伝子の発現を制御する制御領域の特定；
(ｇ)座位の共分離に影響し得る薬物の標的および／または効果の特定；
(ｈ)座位の共分離に対する遺伝子治療の効果の解析。遺伝子治療または他の遺伝子工学アプローチによる染色体挿入または単に核酸の存在はゲノムアーキテクチャに英子湯し得て、例えば、制御領域と特定のプロモーターの相互作用を増強または阻止し、そうして、“無関係”遺伝子の転写に影響し得る。本発明の方法は、異なる座位間の相互作用のレベルに対する遺伝子治療または遺伝子工学の影響の評価を可能にする；
(ｉ)例えば再配列のクローン進化を研究するための、特定の組織下細胞集団を含む、例えば、癌における染色体再配列(例えば転座、欠失、縦列重複、逆位)のマッピング；
(ｊ)疾患における座位の共分離の乱れの解析；
(ｋ)座位の共分離の乱れと関係する疾患の診断；
(ｌ)特定の疾患を有する患者のある座位または染色体の近接または位置に応じた、特定の薬物処置に応答する可能性が高いまたは低いサブグループへの層別化；
(ｍ)単位体積あたりの塩基数として定義される、クロマチンの凝縮の決定。特に、試験座位でのクロマチンの凝縮のグレードは、本発明の方法での各座位により占拠される体積の測定により決定され得る；および／または
(ｎ)内在性座位と相互作用する、外来性核酸(例えばウイルスまたは細菌由来)上の、例えば、外来性ＤＮＡまたはＲＮＡ上の座位の特定または外来性核酸の座位と相互作用する内在性座位の特定。

本発明は、ゆえに、患者における座位の共分離の乱れと関係する疾患を診断する方法であって、該患者から採ったサンプルにおいて、患者における複数の座位の共分離を解析し、該共分離と該疾患を有することがすでに診断されている対象における該座位の共分離を比較することを含み、ここで、共分離は好ましくは健常対象における共分離とも比較される、方法も提供する。あるいは、座位の共分離を、同一患者から由来し得る特定の細胞サブグループ、例えば、腫瘍細胞と正常組織で比較し得る。本発明の状況において、単数表現は、他に特に断らない限り、“少なくとも１”を意味する。

本発明を患者における座位の共分離の乱れ、すなわち、クロマチンミスフォールディングの研究に使用できるため、クロマチンミスフォールディングと関係する疾患を有する患者が、本発明の方法での診断後、クロマチンミスフォールディングを正すための処置に付され得るため、このような患者の処置にも貢献し得る(Deng et al., 2014, Curr Op Genet Dev. 25:1-7)。

例えば、ヒト疾患は、エンハンサーの通常制御しない遺伝子の近接空間的近接への不適切な局在化である、“エンハンサー養子縁組”により誘発され得る(Lettice et al., 2011, Hum Mutat. 32:1492-1499)。本発明の方法を使用して、例えば、特定のサブタイプの癌を有する患者を診断するために、患者由来組織におけるエンハンサーの空間的近接を試験し得る(Nortcott et al. 2014, Nature 511:428-434)。あるいは、患者が、通常特定の遺伝子の過発現により引き起こされる症状を呈するならば、本発明の方法を使用して、目的の遺伝子の近位に局在化されているエンハンサーを特定でき、それゆえに治療介入のための可能性のある標的を提供し得る。他の状況において、ある遺伝子のコーディング領域における疾患関連遺伝子バリアントが、疾患表現型を直接説明するが、クロマチン接触の不偏のマッピングによってのみ明らかにされる誤制御クロマチン接触の発見を混乱させる、その遺伝子の遺伝子発現改変をもたらし得る(Smemo et al. 2014 Obesity-associated variants within FTO form long-range functional connections with IRX3. Nature 507, 371)。本発明の方法を、ゆえに、例えば、癌または遺伝的な肥満の素因の診断に使用できる。

臨床遺伝学の多くは、発達遅滞児(Cooper, G.M., et al. 2011. A copy number variation morbidity map of developmental delay. Nat. Genet. 43, 838-846)または統合失調症(Cook, E.H., Jr., and Scherer, S.W. 2008. Copy-number variations associated with neuropsychiatric conditions. Nature 455, 919-923)のような遺伝子疾患の診断であり、これらは、しばしば、欠失および染色体転座のようなゲノムにおける構造的変異が原因である。大部分は、細胞遺伝学が再配列の一部を検出できても、細胞遺伝学の能力を超え(Gribble et al, 2005. The Complex Nature of Constitutional De Novo Apparently Balanced Translocations in Patients Presenting with Abnormal Phenotypes. Journal of Medical Genetics 42 (1): 8-16; De Gregori, M., et al. 2007. Cryptic Deletions Are a Common Finding in ‘Balanced’ Reciprocal and Complex Chromosome Rearrangements: a Study of 59 Patients. Journal of Medical Genetics 44 (12): 750-62)、症例の大多数において、候補遺伝子はない − ゲノムのほとんどあらゆる部分が改変され得る− したがってＦＩＳＨは価値がない。ゲノム全体のシークエンシングは、候補再配列接合部を発見し得るが、全てが検出されるわけではなく、ある再配列接合部はアーチファクトであり、欠失、挿入または転座の点で見られた接合部の解釈は堅固なものではなく、確認が困難である。ＧＡＭは、ゲノムの大きなストレッチの異常近接に関する情報を提供し、少なくともこれはゲノム全体のシークエンシングを補完し、実質的構造的変化の発見のための良好な最初のアプローチである可能性が高い。

本発明は、ある単一態様における放射状位置、クロマチン接触およびクロマチンの凝縮に関する統合されたゲノムワイドな情報を提供し、これは、疾患状態のより精密化された予測マーカーを提供する可能性を有する。現在、別々のアプローチを使用して、３パラメータが独立して試験されている。例えば、特定のゲノム座位の座位特異的放射状再配置が、前立腺癌および／または肥大と関係して特定されており、これは、疾患進行中の座位特異的再構築および患者層別化の可能性を示す(Leshner M et al. 2015. Locus-specific gene repositioning in prostate cancer. Mol Biol Cell. 2015. pii: mbc.E15-05-0280. [印刷前のEpub])。特定のゲノム座位の改変された放射状位置は、正常乳房組織と比較してヒト浸潤性乳癌で特定されており、これは、ゲノム不安定性と無関係である(Meaburn KJ et al. 2009 Disease-specific gene repositioning in breast cancer. J Cell Biol.;187(6):801-12. doi: 10.1083/jcb.200909127)。２つの異なる染色体間および亜染色体領域間の接触減少のような改変されたクロマチン接触は、異なる乳癌進行段階と関係して見られている(Barutcu AR et al. 2015. Chromatin interaction analysis reveals changes in small chromosome and telomere clustering between epithelial and breast cancer cells. Genome Biol. 16(1):214. doi: 10.1186/s13059-015-0768-0)。

次の実施例は、本発明を説明するために包含され、その範囲を限定するものではない。実施例で使用するサンプル調製および解析の方法および／または統計法を本発明の方法においても使用し、例えば、ここに記載するように、異なる起源のサンプルおよび／または異なる目的の座位の解析にも使用し得る。引用する文献は、全ての目的で、本明細書に完全に包含させる。

ゲノムアーキテクチャマッピングは、核切片における共分離の測定により、座位の核近接を測定できる。ａ、直線的ゲノムに沿って近接である座位は必ずしも核のすぐ近くにはなく、それゆえに、核空間における座位間の距離を測定する方法が必要である。ｂ、薄切片を、核を通して取ったとき(核プロファイルまたはＮＰ)、核空間で互いに近い座位は、より頻繁に同一ＮＰで見られる。ｃ、原則として、ＤＮＡ検出の任意の方法(ＰＣＲ、次世代シークエンシングなど)を、各ＮＰにおける座位存在または不存在のスコア化に使用できる。ｄ、座位が、十分に大きな数のＮＰでスコア化されたとき、座位の共分離を使用して、座位の対間の核距離を示す共分離マトリクスを作成できる。

ＧＡＭは、Ｈｉ−Ｃ試験で先に見られたゲノムアーキテクチャの特性を独立して再現する。ａ、個々のＮＰからのシークエンシングトラックは、薄切片内外でクロマチン線維ルーピングと一致するパターンを示す。ｂ、単一ＨｉＳｅｑレーン上の４８ＮＰの多重化により得たシークエンシング深度は、各サンプルにおける３０kbウィンドウの検出を飽和させるのに十分である。さらに、ほとんど全てのＮＰにおいて特定されたゲノム３０kbウィンドウのパーセンテージは、９μm直径球の２２０nm切片から予測される核体積のパーセンテージの範囲内である。ｃ、ＧＡＭおよびＦＩＳＨは、ＨｏｘＢ座位における３個の約４０kb領域で類似の検出効率を示す。ｄ、ＧＡＭおよびＨｉ−Ｃは、ＰＣＡにより１Mb分解能で類似のＡおよびＢ区画を特定する(６５％区画重複)。ｅ、ＧＡＭは、Ｈｉ−Ｃで特定されたのに類似する形態的に関係するドメインを特定する。

単純モデリングアプローチにより抽出される相互作用確率マトリクスを、エンハンサーと活性遺伝子間の接触について富化する。ａ、無作為クロマチンフォールディングにより予測されるより近い核空間にある座位を、座位が無作為例に従い分布している細胞の大集団およびより近い相互作用を示す細胞の小亜集団としてモデルかできる。このモデルは、それゆえに核距離の二峰性分布を仮定する。ｂ、強く相互作用するまたは無作為に折りたたまれた状態の混合物としての座位の対のモデリングは、Ｐｏｕ５ｆ１座位における別々の相互作用焦点を特定する。ｃ、３０kbウィンドウ重複エンハンサーまたは活性遺伝子内および間の相互作用の統計的富化を、２つの特定の特性が重複する全３０kbウィンドウ間(例えば活性遺伝子および重複エンハンサーが重複する全ウィンドウ間)のSLICEで概算した平均相互作用確率の計算およびマトリクス対角線の無作為化後に得られた同一値の比較により、特定した。

クロマチン接触測定に関する現在のゲノムワイドな方法の制限。ａ、クロマチン相互作用を測定するための現在のゲノムワイドな方法を挙げ、それらの種々の制限を比較する表。ｂ、ＧＡＭは、ゲノムアーキテクチャマッピングのための現在のゲノムワイドな方法に影響する制限をほとんど受けない。

ＧＡＭ法の概要。ａ、本発明の提示する態様において、ＧＡＭは、新規な一連の工程において凍結切片化、レーザー捕捉マイクロダイセクション、全ゲノム増幅および次世代シークエンシングの既存のテクノロジーを組み合わせる。ｂ、凍結切片化は、核の領域をとおして、極めて薄い切片厚で切片を生じる。ｃ、個々のＮＰは、レーザー捕捉マイクロダイセクションを使用して凍結切片から特定および単離される。ｄ、全ゲノム増幅を使用して、マイクロダイセクションを経て単離されたＮＰからＤＮＡを抽出および増幅する。ｈｇＤＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ。ｅ、次世代シークエンシングは、マウスゲノムのどの座位が各最初のＮＰに存在したかを特定する。無作為切片化から予測されるとおり、各ＮＰは、その中に異なる補数の染色体および亜染色体座位を含み、全ての染色体が各ＮＰにおいて特定されるわけではない。

ＧＡＭデータセットの品質管理。ａ、マウスゲノムにマッピングされた解読のパーセンテージおよび特定されたウィンドウの総数は、陰性対照の最良の弁別子であることが判明した。同日に集め、一緒に処理したＮＰの群間で、これらのパラメータでバッチ効果は特定されなかった。マウスゲノムにマップされた解読が＜１５％のＮＰをさらに処理する前に廃棄した。ｂ、３０kb〜１Mbの分解能でのほとんど全てのゲノムウィンドウが少なくとも１つのＮＰ(灰色棒)で検出される。いくつかのウィンドウは、ｍｍ９アセンブリ(例えばセントロメアで)で定義された配列を有さず、それゆえに検出されない(黒色線)。少なくとも一つのＮＰで検出されるウィンドウの比率は、ゲノム分解能の減少(すなわちウィンドウサイズ増加)により増加する。ｃ、各染色体の平均６％が単一ＮＰで見られ、この比率は、染色体をとおして一定である。

座位検出頻度の差異を説明するための共分離マトリクスの正規化。ａ、個々の３０kbウィンドウの検出頻度の分布は、全ての座位が独立して検出されるならば予測される二項式分布からわずかに逸脱する。ｂ、３０kbウィンドウの検出頻度は、大部分そのＧＣ含量またはゲノム反復としてアノテートされるウィンドウの画分と無関係である。検出頻度はマッピング能と相関する。ｃ、座位間の検出頻度の差異は、共分離マトリクスに微妙に影響するが、正規化連鎖不平衡の計算により補正され得る。

４０８個のＮＰが、３０kb分解能での座位の対の共分離に関する情報の大部分の抽出に十分である。ａ、品質管理を通過した４０８個のＮＰデータセットの最初のバッチを６回縮小し、各回無作為に６８個のＮＰを除去した。次いで、マウス染色体１２上のＥｓｒｒｂ座位の共分離マトリクスを、ＮＰ数を増加させながらプロットした。マトリクスの構造は、少なくとも約２００個のＮＰが包含されるとき、安定化に近づく。ｂ、共分離マトリクスの同じ安定化が、大きな領域で観察される(３０Mb、パネルａからの小さなＥｓｒｒｂ座位は右下角に対応)。ｃ、縮小データセットの各々と４０８ＮＰ完全データセットの各々のピアソン相関係数(ＰＣＡ)のプロットは、共分離マトリクスが、約２００個のＮＰの採取後に飽和され始めることを示す。

ＧＡＭは、先に特定されたＴＡＤ境界周囲の非対角接触の顕著な欠乏を再現する。ａ、非対角接触を、マトリクス対角線から２のオフセットで移動させた３ｘ３ボックスにおける平均正規化連鎖として定量した。この平均正規化連鎖は、Ｈｉ−Ｃで特定されたＴＡＤ境界周囲で低減した(Dixon J.R. et al., 2012. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature 485, 376-380)。ｂ、非対角欠乏を、マウスＥＳ細胞(ｍＥＳＣ)におけるＴＡＤ境界の先に公開された一覧における各ＴＡＤ境界について計算し、これらの境界の中央欠乏は、ＴＡＤ境界の５０００の無作為にシャッフルした任意のリストで見られるより大きいことが判明した。ｃ、全ＴＡＤ境界にわたり平均化した非対角相互作用のプロファイルは、境界での大きな欠乏を示す。シャッフルした境界の５０００リストで観察された最大欠乏を比較用に示す。

正規化前および後のＨｉ−ＣおよびＧＡＭデータにおけるクロマチン接触強度の測定におけるバイアス。生Ｈｉ−Ｃデータは、生ＧＡＭデータよりもａ、制限部位密度、ｂ、ＧＣ含量、ｃ、マッピング能、ｄ、複製時間およびｅ、反復被覆率に関して高いバイアスレベルを示す。Ｈｉ−Ｃデータの正規化(ＩＣＥ)はバイアスを一部しか除かず、一方ＧＡＭデータにおけるバイアスは、正規化後効果的に除かれる。バイアスの各々の可能性のある源について、我々は、マウスゲノムにおける全５０kbウィンドウを、可能性のある問題のバイアスに基づき、１０の等しい群(またはＨｉｎｄIII部位密度の場合９群)に分けた。各群の平均±上部および下部四分位点を、上部左棒グラフに示す。次いで、我々は、１０群の各々におけるウィンドウ間の観察されるクロマチン接触(生Ｈｉ−Ｃ：ライゲーション頻度、正規化Ｈｉ−Ｃ：ＩＣＥ正規化ライゲーション頻度、生ＧＡＭ：共分離頻度、正規化ＧＡＭ：正規化連鎖不平衡)を計算し、各観察値を、ゲノム距離により分離した全ウィンドウの平均値で除した(予測値)。ヒートマップは、群の各対間の平均観察／予測値を示す。上段(％正バイアス)は、ゲノム距離を考慮して、予測クロマチン接触より高い群の組み合わせを示し、下段(％負バイアス)は、予測接触より低い群の組み合わせを示す。下右ボックスプロットは、群の全ての可能な組泡得にわたる絶対的バイアス(すなわち正および負バイアス両者)を要約する。

ＧＡＭデータから顕著に相互作用する座位対を検出するためのＳＬＩＣＥ統計法。ａ)本発明者らの座位対共分離の統計モデリングを、ＳＬＩＣＥ(Statistical Inference of Co-segregation)と呼ぶ。ゲノムにわたる座位対(各相同コピー)は、相互作用または非相互作用状態で存在する。核全体の切片は、両座位を含む(Ｍ_２)、一座位のみを含む(Ｍ_１)または座位を含まない(Ｍ_０)ものであり得る。相互作用または非相互作用座位対は、核の集団にわたり、異なる切片共分離頻度を有する。最初の集団における任意の２座位の相互作用の確率(Ｐｉ)は、観察される共分離頻度から概算される。ｂ)ＳＬＩＣＥは、異なる例における座位対の予測共分離頻度、すなわち、対における０座位、１座位または２座位が、相互作用(ｔ_０,ｔ_１,ｔ_２)または非相互作用状態(ｕ_０,ｕ_１,ｕ_２)にあるとき共分離される確率を導く。一例として、我々は、本明細書で、距離ｄにあり、分布ρで核に位置する座位の対に対する切片Ｖ_切片(ｚ)におけるｕ_２の式を提供する。ｃ)ゆえに、ＮＰの予測数は、核状態Ｐ_２、Ｐ_１およびＰ_０の確率が定義されたら、Ｐｉの関数として導き、観察データと比較できる。

ＳＬＩＣＥ統計モデルにより特定されたクロマチン相互作用は多くの異なるゲノム特性を含み、大きなゲノム距離にわたり伸長する。ａ、遺伝子が重複するまたは重複しない３０kbウィンドウが関与する有意な相互作用の数。ｂ、各ウィンドウに存在する重複特性による有意な相互作用の数。ｃ、重複特性により有意な相互作用を有するウィンドウの対間のゲノム距離。ｄ、エンハンサーまたは活性遺伝子重複３０kbウィンドウ内および間の相互作用に対する統計的富化は、正規化連鎖不平衡マトリクスからの各ゲノム距離での座位の上位５％相互作用対を特定し、次いで、２つの特定の特性(例えば活性遺伝子および重複エンハンサー重複ウィンドウ間で特定される上位５％相互作用の数)が重複するウィンドウが関与するこれらの相互作用の数を計数することにより、ＳＬＩＣＥ解析なしで再現された。次いで、富化を、相互作用位置無作為化後に得た同一値との比較により計算した。

ＳＬＩＣＥにより特定された顕著に相互作用する座位対は、全ゲノム距離にわたり、非相互作用座位対より頻繁に共分離する。ＳＬＩＣＥにより特定された顕著に相互作用するウィンドウの対の平均共分離頻度(黒色線)は、広範なゲノム距離にわたり、一貫して非相互作用ウィンドウの平均共分離頻度(破線)±標準偏差(斜線領域)より高い。

スーパーエンハンサーは、ＧＡＭにより特定された最も高度に相互作用するＴＡＤトリプレットで高度に富化される。ａ、２Ｄ相互作用マトリクスは、３領域間の重複接触を示すことができ、これは、単一の同時のトリプレット相互作用として誤って解釈され得る。対での接触データ単独で、同時例は、別の対での事象(または２者の複雑な混合物)と識別不可能である。ｂ、ＴＡＤを特定する戦略は、真に同時の、３方向相互作用に関与している可能性が最も高い。下部グラフは、トリプレット相互作用スコアによるＴＡＤトリプレットの最終順位を示し、そのＴＡＤトリプレットを超える閾値の位を真に同時に相互作用するとして解釈した。ｃ、染色体１上のＴＡＤ間の三方向相互作用例。マトリクスは、領域全体にわたり顕著な対での相互作用を示し、挿入図は、３個のＴＡＤ間の有意な相互作用の拡大表示である。ＴＡＤの分類を下に示す。ｄ、ゲノム領域が重複すする非隣接上位５％ＴＡＤトリプレットを示す。各垂直線は、(ＮＰの集団にわたるその頻繁な共分離により)同時に相互作用する可能性のある３個のＴＡＤを結ぶ。ｅ、ＴＡＤの分類。スーパーエンハンサーと重複するＴＡＤをＳＥと呼ぶ。非ＳＥＴＡＤを、そのＧＲＯ−ｓｅｑ被覆率が下位２５％四分位にあるとき低転写または上位２５％にあるとき高転写と呼ぶ。ｆ、ＴＡＤクラスによる上位５％トリプレット相互作用のゲノム全長。ｇ、上位５％トリプレットは、ＳＥ領域を含むＴＡＤおよび高度転写ＴＡＤについて高度に濃縮されており、３個のＳＥＴＡＤ間の相互作用は、唯一かつ最大の富化組み合わせである。赤色または青色で示す棒は、それぞれ、トリプレット位置の無作為シャッフル後に得られた値に比して富化または枯渇されている。ｈ、Peric-Hupkes et al.(２０１０)^５０からのラミナ結合ドメイン(ＬＡＤ)と重複する各クラスにおけるＴＡＤのパーセンテージ。ｉ、最小トリプレット接触を形成する高度に転写されたＴＡＤとＳＥＴＡＤは、最大トリプレット接触由来のＴＡＤと比較して、高頻度にＬＡＤと重複するかまたは近い。

トリプレットで相互作用するＴＡＤの解析。ａ、図１４ｇにおけるような富化解析は、さらに、他のクラスのいずれにも入らないＴＡＤ(中央ＴＡＤ)を示す。ｂ、各３０kbウィンドウ内の、５kb分解能での平均連鎖の特定による特異的結合部位の発見を精密化するための戦略。活性またはエンハンサークラスにおける３０kbウィンドウを接続するＳＬＩＣＥにより特定された各顕著な相互作用について、我々は、特定の大きな３０kbウィンドウ内のサブウィンドウが、パートナー３０kbウィンドウと最高連鎖を示したかを問うた。特に、我々は、例えば活性遺伝子プロモーター(またはＴＳＳ、転写開始部位)または活性遺伝子ＴＥＳ(転写終了部位)またはエンハンサーを重複する５kbウィンドウが、パートナー３０kbウィンドウと最も頻繁に共分離されるか否かを問うことに興味を持った。ｃ、顕著に相互作用する活性３０kbウィンドウ(黒色線)またはエンハンサー３０kbウィンドウ(破線)への平均連鎖は、活性遺伝子ＴＳＳ(左)、活性遺伝子ＴＥＳ(中央)またはエンハンサー(右)と重複する５kbウィンドウについて、これらの特性の１５kb上流または下流にある全５kbウィンドウと比較して富化される。この富化は、同様に活性遺伝子ＴＳＳ、ＴＥＳまたはエンハンサーと重複するが、同一活性３０kbウィンドウと顕著に相互作用しない(対照ウィンドウ；点線)、他の全５kbウィンドウでは見られない。ｄ、４０kb分解能で平均三方向連鎖を特定するための戦略。３スーパーエンハンサー(ＳＥ)ＴＡＤを結合する各上位トリプレット相互作用について、我々は、ＴＡＤ全体内で、直接スーパーエンハンサーを重複する４０kbウィンドウが、他の２個の相互作用スーパーエンハンサーＴＡＤと最高三方向連鎖を示すか否かを問うた。ｅ、上位トリプレット(黒色線)を形成する２個の他のスーパーエンハンサーＴＡＤとの平均三方向連鎖は、スーパーエンハンサーの１２０kb上流または下流の４０kbウィンドウと比較して、スーパーエンハンサーと直接重複する４０kbウィンドウについて富化される。この富化は、上位トリプレット(破線)を形成するスーパーエンハンサー(ＳＥ)と、２個の高度に発現される(高)ＴＡＤの間でも、スーパーエンハンサーと、上位トリプレットに関与しない２個の他のスーパーエンハンサーＴＡＤの間でも観察されない(点線)。

ＧＡＭはまた座位放射状配置および凝縮に関する情報も提供する。ａ、核内の中央に位置する座位は、大きな体積を有する赤道ＮＰに、より頻繁に見られる。対照的に、核末梢に近接して位置する座位は、小さな体積を有する頂点切片に、より頻繁に見られる。ｂ、ＮＰあたり網羅されるゲノムの平均パーセンテージ(ＮＰ体積の代理として)は、放射状位置データが入手可能な５マウス常染色体における放射状配置と負に相関する。ｃ、大きな体積を有するより脱小型化された座位は、大きな体積を有する対応する小型化座位よりも頻繁に交差する(すなわち多くのＮＰで検出される)。ｄ、検出頻度の高位四分位点における３０kbウィンドウは、より小型のクロマチンは到達しにくいため、検出頻度がクロマチンの凝縮の指標であるならば、予測とおり、大きな平均ＤＮａｓｅシグナル(局所クロマチン到達性の指標)を示す。ｅ、検出頻度の高位四分位点における３０kbウィンドウはまたＧＲＯ−ｓｅｑにより高い被覆率を示し、活性転写の高いレベルを示す。これは、活発に転写しているクロマチン領域一般的脱凝縮と一致し、検出頻度の体積誘発増加に至る。

薄核凍結切片を、飽和スクロース溶液への包埋を使用する固定組織の凍結保護、続いて液体窒素での凍結および−１００℃での切片化を含む、改変Tokuyasu法(Tokuyasu, K. T., 1973, J. Cell Biol. 57, 551-65, A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues; Guillot PV, Xie SQ, Hollinshead M, Pombo A (2004) Fixation-induced redistribution of hyperphosphorylated RNA polymerase II in the nucleus of human cells. Exp. Cell Res. 295, 460-468; Pombo A, Hollinshead M, Cook PR (1999) Bridging the resolution gap: Imaging the same transcription factories in cryosections by light and electron microscopy. J. Histochem. Cytochem. 47, 471-480)により、樹脂包埋を行わずに産生した。凍結切片化材料からのＤＮＡ抽出および検出の実行可能性を試験した。ｍＥＳＣを、確立されたプロトコール^３に従い２２０nmの厚さで凍結切片化した(図５ａ、ｂ)。単一核プロファイル(ＮＰ)を、レーザーマイクロダイセクション^４により切片から単離した(図５ｃ)。次いで、ＤＮＡを抽出し、画分化し、単一細胞全ゲノム増幅(ＷＧＡ)^５を使用して増幅した(図５ｄ)。

単一ＮＰからのＷＧＡ増幅ＤＮＡを、Illumina HiSeqテクノロジーを使用して配列決定した。単一ＮＰからのトラックの目視検査は、薄い核切片のクロマチン出入りから予測されるとおり、各々が、亜染色体領域の異なる補体を含むことを示す(図５ａ)。さらに、各ＮＰは、染色体の限定されたサブセットのみを含んだ(平均、ＮＰあたり７染色体；図５ｅ)。

ゲノムワイドなシークエンシング方法によるＤＮＡの抽出および検出の実行可能性確認後、マウスゲノムを、その共分離測定のために等サイズのウィンドウに分けた。適切なゲノム分解能(ウィンドウサイズ)を決定するために、１０kb〜１Mb範囲のサイズにわたる規則的ゲノムウィンドウを規定し、先に記載された負の二項式アプローチの適応を使用して、個々のＮＰにおけるこれらのウィンドウの存在を検出した。シークエンシング解読の逐次的収縮処理を使用して、各サンプルにおける正のウィンドウの検出を飽和させるのに必要なシークエンシングの深度を決定した(図２ｂ)。６００ｋの独特な解読が試験サンプルの＞９５％について３０kbウィンドウの検出に十分であり、これは、単一ＨｉＳｅｑレーン上の４８個のＮＰの多重化を可能とする。

ＧＡＭを使用するクロマチン接触マッピング
ＧＡＭを使用してゲノムワイドにクロマチン接触をマッピングするために、４９０個の独立したＮＰを配列決定した。各データセットの品質を、マッピングされた解読のパーセンテージを含む基準の組み合わせに基づき評価した。サンプルを、最大４８個のＮＰの１５バッチで厚め、品質管理計量基準は、独立して集めたバッチ間で再現可能であった(図６ａ)。少数の単一ＮＰデータセット(８２サンプル)を、マウスゲノムにマッピングされた解読のパーセンテージの低さ(＜１５％)に基づき、品質管理後のさらなる処置から除いた。

４０８個のＮＰの本発明者らのデータセットで達成されたゲノム被覆率の程度を探索するために、データセット全体にわたる異なるゲノム領域および各ＮＰの検出の程度を算出した。全ゲノム３０kbウィンドウの９６％が、少なくとも１ＮＰで検出された(図６ｂ)。単一ＮＰは、３０kbウィンドウの平均６±４％を含んだ。これは、ｍＥＳＣ核が９μmの平均直径を有し、切片が０.２２μm厚であるため、単一ＮＰに含まれると予測される核体積の範囲内である。ＮＰにわたる富化ウィンドウの平均画分は、異なる染色体間で一定であった(図６ｃ)。まとめると、これらの結果は、ＷＧＡとIlluminaシークエンシングの組み合わせによる、単一ＮＰからの堅固なＤＮＡ抽出および検出を示す。

検出の堅固性をさらに試験するために、単一座位の検出頻度を約４０kb分解能でＧＡＭと蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)で比較した。ＨｏｘＢ座位にわたる３ゲノムウィンドウを試験し、ＦＩＳＨとＧＡＭで卓越した一致が判明し、両者の方法で３個の４０kbウィンドウについて７〜１２％の検出頻度であった(図２ｃ)。次に、座位検出のゲノムワイドな頻度を、ＮＰのデータセット全体にわたり測定した。予想どおり、座位検出頻度の分布は、二項式分布により良好に近似される(図７ａ)。この分布からの軽微な逸脱はＧＣ含量またはゲノム反復により被覆されるウィンドウの画分と弱くしか相関せず、マッピング能と最も強く相関する(図７ｂ)。このような逸脱は、おそらく、座位間の検出確率の不完全な独立性を引き越す、あるＮＰにおける互いに相互作用する座位の小さな比率に起因するものである。結論として、３Ｃベースの方法とは対照的に、ＧＡＭデータセットは、異なるゲノムウィンドウの検出における体系的バイアスによる影響が最小である(図１０)。これは、おそらく、３Ｃベースの方法が、特定の制限酵素部位に近接する少数の解読の正確なマッピングを利用することによるものであり、一方ＧＡＭは、はるかに大きなゲノム領域内のあらゆる核酸画分を検出できる。

ＧＡＭにより測定されたクロマチン接触をマッピングするために、ＮＰコホート全体にわたる座位共分離のマトリクスを、各個々の染色体についてプロットした。個々の座位の検出に影響するわずかな体系的バイアスは検出されたが、それにもかかわらず、ある座位は、単純に無作為配向でのＮＰ切断の確率的性質によってのみ、他よりも高頻度で検出される。異なる座位の検出頻度のこれらの差異は、先に記載されたように^６、連鎖不平衡の正規化バージョンを使用するために、補正された(図７ｃ、図１０)。４０８個のＮＰが、それより少ないＮＰを使用して得た共分離マトリクスが、約２８０個のＮＰから劇的差異を示さなかったため、ゲノムアーキテクチャ探索開始に十分である(図８ａ)。この観察は、４０８個のＮＰの完全データセットと縮小データセットの間の相関の計算により確認され、ピアソン相関係数が約３００個のＮＰで飽和することが判明した(図８ｂ)。

４０８個のＮＰデータセットに基づき、接近したゲノム距離にある座位は、一般に同一核プロファイルでより頻繁に見られ、３Ｄ空間におけるこれらの接近した距離を反映する。ＧＡＭは、先に記載された位相的ドメイン^７に似たクロマチン接触の局所優先傾向を特定した。座位間の近い物理的近接を示す高共分離頻度も、染色体全体の長さまでの、極めて大きなゲノム距離で観察された(図２ｄ、ｅ)。これらの相互作用は、Ｈｉ−Ｃデータセットではあまり明瞭であはなく、２アプローチ間の何らかの方法論的差異により説明され得る(図４)。

ＧＡＭデータセットを、ｍＥＳＣからの先に公開されたＨｉ−Ｃデータセット^７と比較した。目視比較は、特に小さい長さの規模での両データセットの類似パターンを確認した(図２ｄ,ｅ)。Ｈｉ−ＣおよびＧＡＭデータセットを全体的相関係数０.６３および０.４３〜０.７１の範囲の個々の染色体間の対での相関(スピアマンの順位相関係数)で、１Mb分解能で相関させた。

先のＨｉ−Ｃ試験は、接触に基づき、全ゲノム座位を２区画に分けるために主成分分析(ＰＣＡ)を使用している^８。同じアプローチを適用して、ＧＡＭデータセットにおける区画ＡおよびＢを特定した(図２ｄ)。１Mbウィンドウの６６％がＧＡＭおよびＨｉ−Ｃの両者で同一区画に割り当てられたため、区画の良好な重複が見られた。

ＧＡＭデータセットにおいて、Ｈｉ−Ｃにおいて特定された位相的ドメインと類似するように見える、高度に自己相互作用する領域を視覚的に特定することが可能であった。“ムービング・ボックス”アプローチ(図９ａ)を使用して、非対角接触の高度に有意な欠乏が、マウスｍＥＳＣにおける先に特定されたＴＡＤ境界^７で観察され、本発明者らデータセットにおけるＴＡＤの存在を確認する(図９ｂ,ｃ)。

ＳＬＩＣＥを用いるＧＡＭデータからの相互作用確率(頻度)の抽出
ＤＮＡＦＩＳＨ試験は、クロマチンフォールディングが、細胞をとおして均一ではないことを示しており、２個の定義された座位間の相互作用を顕微鏡下に直接試験するとき、それらは通常細胞の小亜集団においてしか見られない(Simonis M., et al. 2006. Nuclear organisation of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nat. Genet. 38 (11): 1348-54)。共局在化の測定は、それゆえに集団平均を表す。相互作用の強度の生物学的に最も適切な尺度は、それが起こる細胞の集団の分数であると考えられる。細胞集団に適用したとき、配座捕捉ベースの方法は、予測よりも高頻度で互いに接触する座位を特定できるが、単一細胞におけるこれらの接触の頻度に関する定量的情報はアクセスできない。

個々の細胞で生じる相互作用の可能性を概算するために、単純統計モデルが本発明者らにより開発された(SLICE計算プラットフォーム、Statistical Inference of Co-segregation)。極めて接近して(＜１００nm)相互作用するまたは無作為に折りたたまれた座位対を有する細胞の集団の混合を考慮する。データを最良に描写する相互作用の確率(Ｐｉ)は、数個の単純化仮説下の数学的アプローチにより導かれ、核体積は球により近似され、異なる染色体上のアレル間の相互作用は、無視できると考慮され^９、２座位の物理的距離をそれらのゲノム距離でスケーリングする。座位の大部分が非相互作用である(あるゲノム距離の座位間の平均相互作用確率は小さい)ことも仮定して、このスケーリングを、あるゲノム距離での全座位対の平均共分離により近似できる。このタイプのモデリングアプローチは、測定パラメータ(ライゲーション頻度)が距離の直接の関数ではないため、Ｈｉ−Ｃデータでは極めて困難である。この基本的モデリングアプローチのさらなる精緻化を使用して、“先導的”クロマチン相互作用を、隣接または近隣座位の“先導的”相互作用により生じる“後続的”相互作用と切り離し得る。

本モデルを、座位のカップル間の相互作用マトリクスの概算に適用した。統計的に決定した閾値を、次いでデータセットに適用して、統計的信頼をもたらすのに十分高い頻度である相互作用のみを保持した。

ＳＬＩＣＥモデルを使用して、ゲノム距離から予測されるよりも核空間において短い物理的距離(＜１００nm)により高頻度で位置する全座位対を特定し、細胞の集団にわたる座位相互作用の頻度を概算した。１００nmを、ＦＩＳＨにより最近測定されたように、特定の接触の厳格な距離として選択した(Williamson et al. 2014^５８)。最初に、同一染色体の座位の全ての可能性のある対について、Ｐｉを概算した。次いで、本発明者らは、偶然予測より大きなＰｉを有するものを意味する、顕著な相互作用を有する座位のみを選択した。

ＳＬＩＣＥにより特定された最も顕著な相互作用は、同一切片で最もしばしば共分離される座位対に対応した(図１３)。例えば、１０Mb離れた座位は、平均４０８個のＮＰ中、５.３共分離された(１.２９％)。対照的に、１０Mb離れた顕著に相互作用する座位は、４０８個のＮＰ中、１０.１共分離された(２.４７％)。このアプローチは、Ｈｉ−ＣまたはＧＡＭ共分離マトリクスとも遙かに同種性ではないパターンを有する相互作用マトリクスを生じる(図３ｂ)。マップは、はるかに多くの別々のスポットを含み、これは、ある閾値を超える相互作用により形成されたクロマチンループの特定の塩基(座位)を意味する。

このモデルが確立されると、ＳＬＩＣＥを使用して、種々の分解能で検出効率を概算した。このアプローチは、３０kb分解能で検出効率が８０％であることを示唆し、このデータセットの最適分解能として３０kbを確認し、ＧＡＭとｃｒｙｏＦＩＳＨの比較から概算した効率とよく一致する。本モデルを、各チューブへの１を超えるＮＰの切断および異なる厚さの範囲で切片を切断する可能性の考慮にも使用した。２２０nmの厚さで、チューブあたり１ＮＰが、本目的のためには最適であったが、はるかに大きなまたは小さな核を有する生物の研究には最良の選択ではないかもしれず、１を超える、好ましくは２、３またはそれより多いＮＰを単一チューブで同時に解析し得る。

Ｐｉマトリクスにおける相互作用の性質を探索するために、異なるゲノム要素を含む３０kbウィンドウの相互作用確率を探索した。本発明者らは、ＳＬＩＣＥを使用して１０００万高信頼度常染色体相互作用(可能性のある１億８９００万の染色体内対から)を特定し、その中の７２０万が遺伝子領域に関与した(図１２ａ)。平均、２５４個の顕著な相互作用が、各３０kbウィンドウで特定された(±１８３標準偏差；図１２ｂ)。特定された相互作用数は、予想とおり、ゲノム距離により低減したが、数十Mbに及んだ。例えば、活性遺伝子が関与する４５０万の顕著な相互作用の中で、３００万が６０Mb未満に広がり、一方１５０万が６０Mbを超えて広がった(図１２ｃ)。

先に公開されたｍＥＳＣにおけるｍＲＮＡ−ｓｅｑおよびＣｈＩＰ−ｓｅｑ^１１を使用して、遺伝子を３クラスに分けた：活性(ＦＰＫＭ＞１)、ポリコーム抑制(ＦＰＫＭ＜１、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３＋および／またはＨ３Ａｕｂ１＋)または不活性(ＦＰＫＭ＜１、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３またはＨ３Ａｕｂ１なし)。予測されるエンハンサーの一覧も先の研究^１２から取り込んだ。遺伝子またはエンハンサーと重複する全３０kbウィンドウをスコア化し、異なる遺伝子／エンハンサーカテゴリー間の顕著な相互作用数を、無作為予測値と比較した。相互作用マトリクスが、特に高い数の活性遺伝子およびエンハンサーカテゴリー内およびそれらの間の顕著な相互作用を含むことが判明した(図３ｃ)。例えば、活性遺伝子を含むウィンドウは、無作為対照よりも、他の活性遺伝子含有ウィンドウと有意に多く接触する。対照的に、不活性遺伝子間の接触は、偶然から予想されるとおりの頻度で起こる。類似結果が、ＳＬＩＣＥ解析を用いずに、連鎖データにおける各距離での相互作用の上位５％に適用することにより、富化解析により得られ(図１２ｄ)、これらがＧＡＭデータセットに固有の特性であることが示される。これは、制御要素とその同族遺伝子の間の相互作用を特定するＧＡＭ法の有効性を強調する。ＧＡＭが機能的ゲノム領域間の接触を検出する特異性は、ＧＡＭが、ゲノムフォールディングおよび誤制御遺伝子発現における特定のＳＮＰと他のゲノムバリアントの切り離しのための強力な方法であることを示す。

相互作用トリプレット検出
ＧＡＭは、多価クロマチン相互作用(２、３以上のゲノム領域が関与する相互作用)、染色体および亜染色体領域の放射状分布およびクロマチンの凝縮のようなゲノムワイドなクロマチン空間的構成の多くのさらなる面を捕捉する可能性がある。本発明者らは、ｍＥＳＣ−４００データセットが、３以上の座位間の多価相互作用を明らかにするための十分な情報を保っていることを示した。ＧＡＭ統計の詳細な解析は、現在のｍＥＳＣ−４００データセットが、ＴＡＤのクロマチン構成レベルに匹敵する、数百キロベースの分解能でトリプレット接触の検出を可能にすることを示す。

対での接触マトリクスは、同一細胞で生じない同時のトリプレット相互作用と、独立した対での事象を区別できない(図１４ａ)。真のトリプレット相互作用を特定するために、本発明者らは、ＳＬＩＣＥをトリプレットの考慮に拡大し、３ＴＡＤ内の全ての可能性のあるウィンドウの組み合わせについて、＜１００nmの同一の厳格な空間的距離での同時、三方向相互作用(Ｐｉ_３)の確率を計算した(図１４ｂ)。顕著な対での相互作用により接続されるＴＡＤのトリプレットのみを使用し、公開されたＴＡＤ定義と分解能をマッチさせるために４０kbウィンドウを使用した(Dixon et al., 2012)(方法)。次いで、候補ＴＡＤトリプレットを、構成する４０kbウィンドウの平均Ｐｉ_３によりランク付けし(図１４ｃ、図１５ａ)、最高相互作用スコアを有する上位５％のＴＡＤトリプレットを保持した。これらの上位５％は、マウス常染色体にわたる１７０,０００の高度に相互作用するトリプレットを表す(図１４ｄ)。

単一分子トラッキング実験による生存ｍＥＳＣ核におけるエンハンサー結合Ｓｏｘ２転写因子の顕著なクラスタリングの最近の観察を考慮して(Liu et al., 2014)、多能性転写因子結合について富化された高密度の制御要素を含むＴＡＤが、上位相互作用ＴＡＤトリプレット内に入るか否かを試験した。それゆえに、全ＴＡＤを、ストロング、ストレッチまたはスーパーエンハンサー(ＳＥ)のように様々に呼ばれている、転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇが高占拠率であるクラスター化エンハンサーの存在によりｂun類した(Whyte et al., 2013)。ＳＥを含まなかったＴＡＤを、転写活性の指標としての公開されたゲノムＲｕｎ−Ｏｎ(ＧＲＯ−ｓｅｑ)データセット(Min et al., 2011)を使用してその転写レベルにより細分化した(図１４ｅ)。注目すべきことに、本発明者らは、ＳＥ、低転写および高転写ＴＡＤが、広範なゲノム距離(例えば、ＳＥが関与する４１９８２トリプレット中、１９％は、３０Mb未満のゲノム距離に広がり、８１％は３０〜１１６Mbに広がる)にわたり、最も高度に相互作用するトリプレットのセットに存在することを発見した(図１４ｆ)。

次に、本発明者らは、特定のクラス間の相互作用が上位の相互作用するＴＡＤトリプレットを統計的に富化するか否かを試験した。際立つのは、最も高度に相互作用するＴＡＤトリプレットが、３個のＳＥ含有ＴＡＤを接続するトリプレットについて有意に富化されていることを発見した(図１４ｇ、図１５ａ)。これは、直線的染色体においてクラスター化されているエンハンサーのこれらのアレイが、ｍＥＳＣにおいて高多重性で３Ｄ空間でも団結し、生存ｍＥＳＣの単一分子画像化によるクロマチン結合Ｓｏｘ２の核クラスタリング(Liu et al., 2014)およびＨｉ−Ｃにより検出されるスーパーエンハンサー間の対での接触(Ing-Simmons et al., 2015)の最近の観察を拡張する結果である。注目すべきことに、本発明者らはまた、高度転写ＴＡＤ間またはＳＥと高度転写ＴＡＤの組み合わせで形成されるトリプレットの富化が、活性遺伝子が共局在化する先の観察と一致する(Pombo et al., 1999; Osborne et al., 2004)。対照的に、最小転写ＴＡＤからなるトリプレットは、偶然による予測より少なく生じ、これは、核ラミナとの優先的結合の可能性である可能性がある(Peric-Hupkes et al., 2010)(図１４ｈ)。興味深いことに、ラミナ結合ドメイン(ＬＡＤ)と重複または近接するＳＥおよび高転写ＴＡＤも、３方向相互作用への関与が少なく、隣接ＴＡＤのラミナ結合が活性領域を抑制し、より中枢のエンハンサークラスターへのそれらのアクセスを制限することを示唆する(図１４ｉ)。

これらの解析は、染色体フォールディングの主要決定因子としてウィンドウ重複エンハンサーおよび活性遺伝子を特定する。相互作用が相互作用ウィンドウ内の活性遺伝子および／またはエンハンサーにより核で発生するはずであるか否かを試験するために、本発明者らは、５kb分解能で正規化連鎖を計算した(図１５ｂ)。活性遺伝子のエンハンサー、プロモーター(ＴＳＳ)または転写終了部位(ＴＥＳ)と重複する５kbウィンドウは、これらの特性の１５kb上流または下流の５kbウィンドウより、顕著に相互作用している活性３０kbウィンドウと高い平均連鎖を有する。この富化は、エンハンサー３０kbウィンドウとの相互作用でも見られたが、３０kb分解能では相互作用しない活性ウィンドウではなかった(図１５ｃ)。同様に、上位トリプレットを形成するＳＥＴＡＤ間の平均三方向連鎖は、１２０kb上流または下流の４０kbウィンドウと比較して、スーパーエンハンサーと直接重複する４０kbウィンドウについて富化されることが判明した(図１５ｄ,ｅ)。

放射状配置および凝縮を探索するためのＧＡＭの使用
ＧＡＭは、３Ｄ核空間でクロマチン構成のさらなる空間的特性を探索する力を有する。本発明者らは、ｍＥＳＣ−４００データセットを使用するＧＡＭ法の２個の立体解析学的適用を探索した。核に対する切片化の無作為配向の結果として、核の異なる緯度から生じるＮＰのＤＮＡ含量を使用して、ゲノム領域の放射状分布を概算できる。例えば、核近接から末梢までを通して切断したＮＰは、定義上は、赤道ＮＰより核の体積(またはＤＮＡ含量；Branco et al., 2008)の比率が小さい(図１６ａ)。それゆえに、核ＮＰにより網羅されるゲノムのパーセンテージを、最も赤道のＮＰと相対的な緯度の代理として使用できた。実際、本発明者らは、染色体が小さいＮＰで検出される頻度は、その放射状位置(ｍＥＳＣにおける５染色体で先に測定(Mayer et al., 2005))と相関し、より末梢位置に対応して低い平均ＤＮＡ含量であることを発見した(図１６ｂ)。

本発明者らは、さらに原則としてまたＧＡＭによって評価できる、クロマチンフォールディングのより局所的特性を探索した。本発明者らは、脱凝縮ゲノム座位は、より凝縮された座位より大きな体積を占拠する(またはより伸長した高次構造を取る)と判断した。より脱凝縮された座位は、それゆえに小さいまたはより球状の座位より高頻度で交差する(そして無作為に配向された核プロファイルにおいてより高頻度で検出される)はずである(図１６ｃ)。脱凝縮されたクロマチンは、例えば、ＤＮＡｓｅＩを使用する酵素開裂により到達可能であるはずであり、本発明者らは、公開されたＤＮａｓｅ−ｓｅｑデータセットにおける３０kbウィンドウの被覆率が、ＧＡＭｍＥＳＣ−４００データセットにおける検出頻度と相関することを発見した(スピアマンのｒ＝０.４７、ｐ≦１０^−６；図１６ｄ)。転写活性は、構造的タンパク質の過発現後、個々の座位についてまたは包括的にクロマチン脱凝集と相関することが示されている。本発明者らは、さらにＧＲＯ−ｓｅｑ被覆率(Min et al., 2011)により測定した３０kbゲノムウィンドウの転写活性が、単一ＮＰにおける検出頻度と正に相関することを発見した(スピアマンのｒ＝０.２７、ｐ≦１０^−６；図１６ｄ)。これらの結果は、マウスＥＳＣにおける３０kb分解能での転写レベルとクロマチン体積(凝集)の間のゲノムワイドな結合を初めて報告することを可能とさせた。これらの解析は、すでに、現在まで到達不可能であり、ゲノムワイドな規模では未探索のままであった、核構成の特性を試験するＧＡＭの可能性を説明する。

考察
ＧＡＭは、３Ｄゲノム位相幾何学および配置の測定に使用された他の全ての現在のテクノロジーとは無関係の、不偏の方法でクロマチン接触を捕捉するための新規の、無ライゲーション方法である。ＧＡＭは、機能的ゲノム領域が特異的クロマチン接触で根底にある、ｍＥＳＣにおけるクロマチンの３Ｄ構造の複雑な構成を明らかにする。特に注目すべきは、エンハンサー要素および転写している領域内および間の対でのクロマチン相互作用についての富化である。複数の強いエンハンサーおよび高度に転写された領域が同時に同一核内で結合する、ＴＡＤ間の豊富な３方向相互作用の特定は、高次接触からの制御要素が大きなゲノム領域にわたることを確認する。対照的に、核ラミナの近接は、より中枢のエンハンサークラスターへのアクセスの制限によりまたは複数接触の形成に利用可能な表面の制限により、高度転写ＴＡＤが関与する高い複雑性の接触の形成を抑える。

重要なことに、ＧＡＭにより得た結果は、５Ｃ／Ｈｉ−Ｃによる優先的に自己結合するゲノム領域(ＴＡＤ)の特定および生存細胞画像化における転写因子Ｓｏｘ２(エンハンサーマーカー)によりクロマチン結合される観察されるクラスタリングを含む、他の方法を使用してなした発見をどく利敵に確認する。同時に、ＧＡＭのゲノムワイドな規模および位置的情報の異なる面(接触、放射状配置および凝縮)の統合されたコレクションは、先の技術が提供し得なかった新しい解析の機会を加える。

ＳＬＩＣＥの開発は、ＧＡＭデータセットからクロマチン相互作用に関する定量的情報を抽出できる、ＧＡＭのための一般的統計モデルを提供する。これは、ゲノム距離を考慮した、卓越した対でのおよび三方向接触の特定を可能にする。大きなＧＡＭデータセットで、ＳＬＩＣＥを、異なる核または染色体形状または体積、核末梢への結合および核アーキテクチャの他の特性を統合するように拡張でき、高分解能で特異的に相互作用するクロマチン領域の検出を増強する。

数千ＮＰを含む大きなＧＡＭデータセットは、対での、トリプレットでのおよびより高次の多重性接触の高い分解能定量化、ゲノムワイドな体積および放射状配置ならびに異なる接触の相互依存を含む、さらなる解析的可能性の探索を可能にするはずである(図４)。重要なことに、ＧＡＭは、これらの解析を、貴重な組織サンプル、例えば個々の患者の生検により得たものからのマイクロダイセクションにより特異的に選択された稀な細胞型に向けることができる。さらに、ＧＡＭは、単一細胞における特異的クロマチン接触および活性転写の同時の検出に適合性であるはずであり(Dey et al., 2015. Integrated genome and transcriptome sequencing of the same cell. Nature Biotechnology, 33(3): 285-289)、これは、因果関係精査に極めて重要である。

要約すると、ＧＡＭは、ゲノム生物学者のレパートリーに強力な新規ツールを追加し、３次元クロマチン構造を細かく精査する我々の能力を顕著に拡大させ、広範なモデル系、細胞型および価値あるヒトサンプルにおいて多くの以前は回答不可能であった問題を実験的に扱いやすくする。稀な細胞型における染色体フォールディングの試験に対するＧＡＭの独特な適合性は、ヒト疾患における天然の配列変動の役割の精査に貴重である。

方法
細胞培養
本実験に使用したマウスＥＳ細胞(ｍＥＳＣ)は、Ｅ１４ｔｇ２ａのＳｏｘ１−ＧＦＰ誘導体である４６Ｃ系統^１３であり、Domingos Henrique(Institute of Molecular Medicine, Lisbon, Portugal)から恵与された。ｍＥＳＣ培養を、先に記載のとおり実施した^１４。簡潔にいうと、細胞を、３７℃で５％ＣＯ_２インキュベーター中、０.１％ゼラチン被覆皿の、１０％ウシ胎児血清、２ng／ml ＬＩＦおよび１mM ２−メルカプトエタノール添加グラスゴー改変イーグル培地で増殖させた。細胞を隔日で継代した。採取２４時間前の最後の継代後、ｍＥＳＣを無血清ＥＳＧＲＯComplete Clonal Grade培地(Millipore Inc.)に再播種した。代わりに他の細胞を使用し得る。

凍結切片の調製
細胞を、先に記載するとおり凍結切片化のために調製した^２。簡潔にいうと、細胞を、２５０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ中４％および８％パラホルムアルデヒドで固定し(ｐＨ７.６；それぞれ１０分および２時間)、ペレット化し、２.１ＭスクロースのＰＢＳ溶液で包埋し(２時間)、液体窒素で凍結させた。凍結細胞を液体窒素で無限に保存できる。超薄凍結切片を、UltraCut UCT 52凍結超ミクロトーム(Leica, Milton Keynes, UK)を使用して、約２２０nm厚で切断した。切片を、スクロース溶液的に捕捉し、レーザーマイクロダイセクション(Leica, Milton Keynes, UK)用１mm厚ＰＥＮ膜被覆グラスガラスに移した。スクロース包埋媒体を除去するために、スライドを、０.２μm濾過分子生物学グレードＰＢＳ(各５分)(３×)、次いで濾過超高純度Ｈ_２Ｏ(各５分)(３×)で洗浄し、１５分乾燥させた。数例で、三回目のＰＢＳ洗浄を、分子生物学グレードヨウ化プロピジウム(１μg／mlのＰＢＳ溶液)での５分染色に置き換えた。

核プロファイルの単離
個々のＮＰを、PALM Microbeam Laserマイクロダイセクション顕微鏡(Carl Zeiss, Jena, Germany)を使用するレーザーマイクロダイセクションにより、凍結切片から単離した。核を、明視野画像化下に特定し、レーザーを使用して、各核を囲むスライド膜を切断した。次いで、切断ＮＰを、不透明粘着性材料を満たしたPCR Cap Stripに、Laser Pressure Catapultを使用して発射した。８個の各ストリップにおける１ウェルを空のままにし、陰性対照としてＷＧＡ処理に使用した。これらの陰性対照中５個をまた品質管理目的でのシークエンシングライブラリー作成に使用した(図６ａ)。

全ゲノム増幅
ＷＧＡ４キット(Sigma)を使用する全ゲノム増幅を、先に記載されたプロトコール^５をわずかに改変して実施した。水(１３μl)を、単離ＮＰを含む上に向けたＰＣＲふたの各々に添加した(このおよび続く工程において、緩衝液の体積は、ＰＣＲキャップふたの内部表面全体を覆うように、提供業者のプロトコールに比して増加させている)。ＰＫマスターミックス(８μl プロテイナーゼＫ溶液、１２８μl １０×単一細胞溶解および画分化緩衝液)を各ふたに添加し(１.４μl／ふた)および１μlのヒトゲノムＤＮＡを、陽性対照として作用する核プロファイルを用いず、一ふたに添加した。ふたを９６ウェルＰＣＲプレートに押しつけ、５０℃で４時間、倒置してインキュベートした。
インキュベーション後、ＰＣＲプレートを室温で５分冷まし、その後、倒置させ、８００×ｇで３分遠心分離した。プレートを９９℃で４分、ＰＣＲ機中で熱不活性化させ、氷上で２分冷却させた。２.９μl １×単一細胞ライブラリー調製緩衝液および１.４μl ライブラリー安定化溶液を各ウェルに添加し、プレートを９５℃で４分インキュベートし、続いて氷上で２分冷却した。１.４μlのライブラリー調製酵素を各反応物に添加し、次いでプレートをＰＣＲ機で１６℃で２０分、２４℃で２０分、３７℃で２０分、最後に７５℃で５分インキュベートした。

ＷＧＡライブラリー調製後、ＰＣＲプレートを、８００×ｇで３分遠心分離した。１０×増幅マスターミックス(１０.８μl)、水(６９.８μl)およびＷＧＡＤＮＡポリメラーゼ(７.２μl)を各ウェルに添加し、サンプルを、業者により提供されたプログラムを使用してＰＣＲ増幅した。
全ゲノム増幅を、一般に一日で実施したが、数例において、サンプルをプロトコールの途中で一夜、−２０℃で保存し、この変数についての制御された試験におけるＤＮＡ検出で検出可能な再はなかった。

ハイスループットシークエンシングのためのライブラリー調製
ＷＧＡ増幅ＤＮＡをQiagen MinElute PCR Purification Kitを使用して精製し、５０μlの提供された溶出緩衝液に溶出した。各サンプルの濃度を、PicoGreen定量化により測定した。次いで、シークエンシングライブラリーをIllumina TruSeq DNA HT Sample Prep KitまたはTruSeq Nano DNA HTキットのいずれかを使用して製造した。いずれの場合も、サンプルを再懸濁緩衝液で５５μlとした。ＤＮＡＨＴキットについて、最大１.１μg ＤＮＡを各反応物に添加し、一方Ｎａｎｏキットでは、最大２００ngを使用した。ライブラリーを、製造業者の指示に従い調製した。ＤＮＡＨＴキットについて、サンプルを、Pippin Prep機(Sage Science, Beverly, MA, USA)を無ＥｔＢｒ１.５％アガロースカセットと共に使用して、３００〜５００ヌクレオチドにサイズ選択した。Ｎａｎｏキットで調製したサンプルは、ビーズベースの選択プロトコールを使用して３５０ヌクレオチドサイズに選択した。

ライブラリー調製後、ライブラリー濃度を、Qubit 2.0蛍光光度計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を使用して概算し、ライブラリーを、９６のバッチに一緒にプールした。各ライブラリープールを、ラピッドランモードのIllumina HiSeq機の２レーンでの単一末端、１００bpランで配列決定した。全解読の両端の３０bp ＷＧＡアダプターの存在により、各ランの最初の３０bpを、Illuminaにより提供されたカスタム・ラン・レシピを使用して、フローセル画像化なしに実施した(これらは暗サイクルとして知られる)。

ハイスループットシークエンシングデータ解析
解読を、Ｂｏｗｔｉｅ２を使用するマウスゲノムのｍｍ９アセンブリにマッピングした^１５。一意的にマッピングされなかった、２０未満の品質スコアを有したまたはＰＣＲデュプリケートであった解読は除いた。

ＧＡＭサンプルにおける正のウィンドウの呼び出し
マウスゲノムを、bedtools^１６を使用して等サイズウィンドウに分け、bedtools multibamcovを使用して、各ゲノムウィンドウで重複する各核プロファイルにおける解読数を計算した。PandasおよびNumPy pythonパッケージ^１７を、各ウィンドウで重複する解読数からヒストグラムを計算するのに使用し、ＳｃｉＰｙからのｆｍｉｎ関数を使用して、陰性二項式分布(シークエンシングノイズを表す)および対数正規分布(真のシグナルを表す)を深度ヒストグラムにフィットさせた。二項式分布へのフィットのためのパラメータを使用して、単一ゲノムウィンドウへのｘ解読マッピングを観察する確率が０.００１未満であった、解読ｘの閾値数を決定した。このような閾値は、ゆえに、各サンプルで独立して決定され、ウィンドウを、配列決定解読の数が決定した閾値より大きかったならば、正としてスコア化した。

サンプル品質管理
低品質データセットを解析から除くために、多数の品質計量基準を各サンプルで測定した。マッピングした解読のパーセンテージおよび非ＰＣＲデュプリケート解読のパーセンテージを、カスタムpythonスクリプトにより測定した。シークエンシング品質計量基準を、FastQC(bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)を使用して各サンプルについて決定し、カスタム・スクリプトを、ＦａｓｔＱＣアプトプットファイルからの塩基あたりの平均シークエンシング品質スコア、ジヌクレオチド反復数および単一ヌクレオチド反復数の抽出に使用した。サンプル汚染の可能性をFastq-screen(bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen)を使用して確認した。核をとおした薄切片は、全ゲノムの特徴を含み、クラスターに組織化され、全常染色体性染色体を含まないと予測された。それゆえに、カスタムpythonスクリプトを、正とスコア化されたウィンドウの総数、他の正のウィンドウのすぐ隣の正のウィンドウの数および各サンプルに対する正の染色体の数を測定するために開発した。これらの品質計量基準の全ては、Principle Components Analysisに供給され、５個の陰性対照を最良に区別する成分を探索した。この解析は、マッピングした解読のパーセンテージが、最も予測的な計量基準であることを決定した。陰性対照は、最大で２％のマッピングした解読を有し、ゆえに、マッピングした解読が＜１５％である全サンプルを保存的閾値として除外した。

シークエンシング深度飽和点計算
ＮｕｍＰｙを使用して、サンプルあたりウィンドウあたりの解読深度のマトリクスから解読を収縮処理した。１３の新マトリクスを、１０％〜９５％の収縮処理率で作成し、正のウィンドウを、縮小データセットの各々のために呼び出した。各サンプルを縮小データセットにわたり比較して、特定された正のウィンドウ数が収縮処理後残っている解読のパーセンテージに対してプロットされる、飽和曲線を得た。サンプルを、飽和曲線を２部に分け、２部の線形回帰を全曲線と比較することにより飽和または不飽和として分類した。推定飽和点は、２部フィットからのＲ二乗値の平均が最高であった点として定義した。サンプルを、２部の二つ目の勾配が最初の勾配未満であるならば(すなわち、特定されたさらなる正のウィンドウの数が、高い解読深度でよりゆっくり増加するならば)および２部フィットの平均Ｒ二乗が、曲線全体に対する直線的フィットのＲ二乗より０.２５を超えて大きいならば(すなわち、曲線が直線と有意に異なるならば)、飽和として分類した。

蛍光インサイチュハイブリダイゼーション
ＤＮＡＦＩＳＨを、先に記載のとおり実施した^１８。マウスＥＳ−ＯＳ２５細胞(W. Bickmoreから恵与)を、先に記載のとおり増殖させた^３６。ＨｏｘＢ１３、ＨｏｘＢ１−３およびＳｋａｐ１座位を、フォスミドプローブ(それぞれＧ１３５Ｐ６７９９Ｂ３、Ｇ１３５Ｐ６７６３７Ｄ６およびＧ１３５Ｐ６０６７４Ａ４)で検出した。フォスミドプローブは、BACPAC Resources(California, USA)から得た。フォスミドプローブの特異性を、特定のプライマーを使用するＰＣＲで確認した(示していない)。プローブをニックトランスレーション(Roche)によりジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰまたはテトラメチル−ローダミン−５−ｄＵＴＰで標識し、MicroBioSpin P-30クロマトグラフィーカラム(BioRad, Hertfordshire, UK)を使用して、取り込まれていないヌクレオチドと分けた。ローダミン標識プローブのシグナルを、ウサギ抗ローダミン抗体(２時間；１：５００；Invitrogen)およびウサギＩｇＧに対するＣｙａ９３接合ロバ抗体(１時間；１：１０００；Jackson ImmunoResearch Laboratories)で増幅させた。ジゴキシゲニンで標識されたプローブをヒツジ抗ジゴキシゲニンＦａｂフラグメント(２時間；１：２００；Roche)およびヒツジＩｇＧに対するAlexaFluor555ロバ抗体(１時間；１：１０００；Invitrogen)で検出した。ＦＩＴＣで標識したプローブは、ＦＩＴＣに対するマウス抗体(１時間、１：５００；Jackson ImmunoResearch Laboratories)およびマウスＩｇＧに対するAlexaFluor488ロバ抗体(１時間、１：１０００；Invitrogen)で検出した。核をＤＡＰＩで染色し、カバーガラスをVectaShield(Vector Laboratories)を用いてマウントして、画像化した。４０５nmダイオードおよびアルゴン(４８８nm)、ＨｅＮｅ(５４３nm)およびＨｅＮｅ(６３３nm)レーザーを備えた共焦点レーザー走査型顕微鏡(Leica TCS SP5; 63x oil objective, NA 1.4)で、１Ａｉｒｙディスクと等価なピンホールを使用して画像を得た。異なるチャネルからの画像を、蛍光表面滲みを防止するために逐次的に回収した。生画像(ＴＩＦＦファイル)をＩｍａｇｅＪで統合し、Adobe Photoshopで二値化せずにコントラストを拡張した。

連鎖マトリクスの計算
定義ゲノム領域の連鎖マトリクスを計算するために、目的の領域と重複する各サンプルからのゲノムウィンドウをまず抽出した。ウィンドウが重複するウィンドウの全ての可能性のある対について、共分離は、両ウィンドウが核プロファイルの総数で除して正としてスコア化される核プロファイルの数である。

連鎖不平衡(Ｄ)および正規化連鎖不平衡(Ｄ’)を先に定義されたとおり計算した^６。簡潔には、２ゲノムウィンドウＡおよびＢ間の連鎖を、ＡおよびＢの共分離(上記参照)から限界的検出頻度の積を減じたものとして定義した。Ａの限界的検出頻度は、単にＡが核プロファイルの総数の除算により検出される核プロファイルの数である。２ゲノムウィンドウＡおよびＢ間の正規化連鎖は、ＡおよびＢ間の可能性のある最高連鎖で除したＡおよびＢの連鎖として定義した(Ｄｍａｘ)。連鎖＞０であるならば、Ｄｍａｘは、ｍｉｎ((ｍａｒｇ(Ａ)＊(１−ｍａｒｇ(Ｂ)))、(ｍａｒｇ(Ｂ)＊(１−ｍａｒｇ(Ａ))))として計算され、式中、ｍａｒｇ(Ａ)はＡの限界的検出頻度である。連鎖＜０であるならば、Ｄｍａｘはｍｉｎ((ｍａｒｇ(Ａ)＊ｍａｒｇ(Ｂ))、((１−ｍａｒｇ(Ａ))＊(１−ｍａｒｇ(Ｂ))))として計算される。
ここで、ｍａｒｇ(Ａ)はＡの限界的検出頻度である。同一染色体上の全領域間の連鎖のヒートマップを結合マトリクスＬ(ｉ,ｊ)から計算し、ここで、各エントリーは、ｉおよびｊの正規化連鎖である。これらの計算を、座位数の考察に拡張できるのは自明である。例えば、３座位間の連鎖を、Ａ、ＢおよびＣの共分離から、Ａ、ＢおよびＣの限界的検出頻度の積を減じたものとして計算する。

相互作用データセットからの区画ＡおよびＢの定義
区画ＡおよびＢを、ＧＡＭおよび先に公開された方法^８,２３によるＨｉ−Ｃについて計算した。各染色体は、各エントリーが座位ｉと座位ｊ間の観察される相互作用を記録するマトリクスＯ(ｉ,ｊ)として表される。各エントリーが、ｉとｊの間と等距離のマトリクスＯにおける全位置についての相互作用の平均数である、新規マトリクスＥ(ｉ,ｊ)を作成した。ＯをＥで除して、予測値を超えた観察値のマトリクスであるＫ(ｉ,ｊ)を得た。次いで、各位置が、マトリクスＫのカラムｉとカラムｊの間の相関である、最終マトリクスＣ(ｉ,ｊ)を計算した。主成分分析を相関マトリクスＣ上で行い、最大偏差を説明する３成分を次いで抽出した。これらの３成分で、ＧＣ含量と最良の相関を有するものをＡおよびＢ区画の定義に使用する。

ＧＡＭ／Ｈｉ−Ｃマトリクスにおけるバイアスの概算
ＧＡＭおよびＨｉ−Ｃでバイアスを比較するために、５０kbゲノムウィンドウを、平均ＧＣ含量に基づき、１０個の等しい群に割り当てた。次いで、予測値を超える観察値(ＯＥ)マトリクスを、５０kb分解能でＧＡＭおよびＨｉ−Ｃデータ両者からの染色体について計算した(“相互作用データセットからの区画ＡおよびＢの定義”参照)。２ＧＣ含量群の各組み合わせについて、２群のウィンドウ間の接触について平均ＯＥ値を取り、ＧＣ含量による平均ＯＥ値のヒートマップを得た。次いで同じアプローチを繰り返し、平均マッピング能、含まれるＨｉｎｄIII部位数、平均複製時間またはアノテートゲノム反復と重複する各５０kbウィンドウのパーセンテージにより５０kbウィンドウを層別化した。

形態的に関係するドメインの特定
形態的に関係するドメイン境界の一覧を、ｍＥＳＣにおける先の研究^７から得た。平均正規化連鎖不平衡を、非対角相互作用の指標としての連鎖マトリクスの対角線からの２ウィンドウのオフセットとして移動させた３ｘ３ボックスにおいて測定した。先に記載された位相的ドメイン境界での非対角相互作用と、ドメイン境界の１５０kb上流および下流の非対角相互作用の比較により、非対角相互作用の欠乏が、データセットにおけるこれらの先に定義された境界について測定された。この欠乏の統計的有意性を、観察される非対角欠乏と、５０００の無作為にシャッフルしたＴＡＤセットで測定された欠乏を比較することにより評価した。

ＳＬＩＣＥ法を使用するＧＡＭデータからの相互作用確率の抽出
２座位を含むチューブ数と座位対の少なくとも１メンバーを含むチューブ数の比率を、マウスゲノムにおける３０kbウィンドウの全対について測定した。次いで、同一ゲノム距離での座位の全対にわたるこの比の平均を取り、各染色体について別々に計算した。このゲノム平均と、各個々の座位対について観察される比の比較により、同一染色体で同じ距離の座位の平均対より高頻度で共分離される座位の対を特定することが可能であった。数学的モデルを使用して、この比率の観察される値を生じるために、近接(＜１００nm)相互作用を有する必要があるであろう細胞の比を概算した。次いで、観察される比が、そのゲノム距離での非相互作用座位について予測される比率の第９５パーセンタイル内であったあらゆる座位を廃棄した。

トリプレットで相互作用するＴＡＤの解析
同時に相互作用するＴＡＤのトリプレットを特定するために、全３個のＴＡＤが、ＳＬＩＣＥにより特定して顕著な対での相互作用を示した、３個のＴＡＤのセットをまず特定した。全てのこのようなトリプレットについて、ＴＡＤを構成する４０kbウィンドウ全てのＰｉ_３を、ＳＬＩＣＥを使用して計算した。４０kbウィンドウを、ここでは、Dixon et al. (2012)が４０kb分解能で示したＴＡＤ位置として使用した。最後に、全トリプレットを、平均Ｐｉ_３によりランク付けし、上位５％を富化解析のために選択した。ＴＡＤを、先に定義したスーパーエンハンサー(ＳＥ；Whyte et al., 2013)のいずれかと重複するならば、ＳＥＴＡＤとして定義した。ＳＥと重複しないＴＡＤを、ＧＲＯ−ｓｅｑ被覆率が、それぞれ第一四分位であるか第三四分位を超えるならば、低転写または高転写として分類した。被覆率の２四分位点の中間にあるＴＡＤを、中位転写として分類した。富化を、各ＴＡＤトリプレットクラス(例えばＳＥ／ＳＥ／ＳＥ)の観察される数をＴＡＤトリプレットの平均５００を超える無作為に並べ換えた一覧で除して計算し、観察されるカウントが、無作為に並べ換えた値の全てより大きいかまたは小さいとき、有意と呼称した。

トリプレット形成に対する核ラミナ結合の影響を解析するために、ｍＥＳＣ細胞におけるＬＡＤ領域の一覧(Peric-Hupkes, D. et al. Molecular Maps of the Reorganization of Genome-Nuclear Lamina Interactions during Differentiation. Mol. Cell 38, 603-613 (2010))を使用した。ＴＡＤを、ＴＡＤを含む上位５％におけるトリプレットの数により、最高(上位１５％)および最小(下位１５％)トリプレット形成に分類した。各カテゴリーにおけるＴＡＤのＬＡＤへの距離を、closestBEDツール(Quinlan et al., 2010)を使用して計算した。

５kb分解能での平均連鎖の解析
３０kbウィンドウでのクロマチン相互作用が、それらが含む特性(ＴＳＳ、ＴＥＳおよびエンハンサー)の中心であるかを定義するために、エンハンサーまたは活性遺伝子(ＦＰＫＭ＞１；長さ＞１２０kb)のＴＳＳ／ＴＥＳの正確に１個と重複するが、他の遺伝子またはエンハンサーとはしない各３０kbウィンドウを、６非重複５kbウィンドウに細分した。続いて、他の相互作用“エンハンサー”または“活性”３０kbウィンドウとの正規化連鎖不平衡(包含３０kbウィンドウ対相互作用３０kbウィンドウのＳＬＩＣＥｐ値＝０.０５)を、目的の特性と重複する５kbウィンドウ±３５kbウィンドウ上流／下流について計算した。これにより、各列が３０kbウィンドウ間の単一相互作用を表し、行が目的の５kbウィンドウ±３５kbウィンドウ上流／下流の連鎖を表す、マトリクスを得た。距離効果について正規化するために、各裂をその平均で除した。次に、各行の平均を取って、目的の５kbウィンドウからの各距離で平均連鎖を得た。最後に、これらの平均値を、最初および最後の行の平均で除して、１５kb上流／下流に対するＴＳＳでの平均富化を得た。対照として、同一特性(エンハンサー、ＴＳＳ、ＴＥＳ)を含む非相互作用(ＳＬＩＣＥｐ値＞０.０５)３０kbウィンドウ対を使用した。類似の距離分布を確実にするために、各ゲノム距離範囲についてのビンカウントは同じであるように、真の相互作用をゲノム距離により１０ビンにソートし、対照群を無作為に減少させた。

４０kb分解能での平均三方向連鎖の解析
全てスーパーエンハンサー(“ＳＥ／ＳＥ／ＳＥ”)を含む３ウィンドウ間のトリプレットクロマチン接触が、含まれるスーパーエンハンサーについて中央に置かれるか否かを決定するために、４０kb長未満であった単一ＳＥを含む全ＴＡＤを選択した。４０kbウィンドウは、ＳＥならびに±３４０kbウィンドウ上流／下流について中央に置かれた。ＴＡＤ境界がこれらの４０kbウィンドウ内に入ったＴＡＤを廃棄した。次に、選択したＴＡＤに関与する全“ＳＥ／ＳＥ／ＳＥ”トリプレットに基づき、ＳＥ含有４０kbウィンドウおよび２パートナーＳＥＴＡＤにおける全４０kbウィンドウ間の平均三方向正規化連鎖不平衡を計算した。これを、選択したＳＥ含有４０kbウィンドウの４０kbウィンドウ上流／下流について繰り返した。対での平均結合について上に記載するとおり、各得られた列をその平均で除し、次いで、各行について平均を取り、最後に、結果を最初／最後の行の平均で除した。全プロセスを、“ＳＥ／高／高”ＴＡＤに対応する上位トリプレットの一覧における選択したＳＥ−ＴＡＤとこれらのパートナー高度転写(高)ＴＡＤの同一セットおよび同一ゲノム距離に伸長した非相互作用“ＳＥ／ＳＥ／ＳＥ”トリプレットＴＡＤ(対照)で繰り返した。

ＧＡＭデータからの染色体放射状位置の概算
核中心に対する各ＮＰの緯度の近似として、各染色体の被覆率を、各ＮＰについてのMbあたりの解読の平均数として計算した。各染色体について、その染色体が被覆率の上位四分位にあった全てのＮＰを取り、正であった全ゲノム１Mbウィンドウのパーセンテージを計算した。ＮＰのパーセンテージ被覆率は、その半径の指標であり(Branco et al., 2008)、それゆえにある染色体を含むＮＰの平均パーセンテージ被覆率は、その染色体がＮＰにおいて大きな半径(より中枢に位置する染色体として予測される)で出現する優先度の指標である。本発明者らは、染色体１、２、９、１１および１４を含むＮＰの平均パーセンテージ被覆率を、Mayer et al. (2005)において先に測定された放射状位置と相関させ、より末梢の染色体が、ＮＰで低ゲノム被覆率で見られるとの傾向を発見した。

ＧＡＭデータからの座位体積の概算
マウスゲノムを３０kbウィンドウに分け、各ウィンドウが検出されたＮＰの数を計算した(その検出頻度)。この値は、各３０kbウィンドウにわたり、先に公開されたＧＲＯ−ｓｅｑデータセットの平均被覆率(Min et al., 2011)およびＤＮＡｓｅ−ｓｅｑの平均被覆率(ヌクレオソームレベルでのクロマチン解放の指標；Yue, F. et al. 2014. Nature 515, 355-364)。

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Claims

区画における複数の核酸座位の空間的近接を決定する方法であって、
(ａ)区画における局在化に応じて、互いの核酸座位を凍結切片化または凍結粉砕により、好ましくは、凍結切片化により分離して、画分のコレクションを得て；
(ｂ)該画分における複数の座位の存在または不存在を決定し；そして
(ｃ)該複数の座位の共分離を決定する、
工程を含む、方法。
核酸がＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、好ましくは、ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
区画が真核細胞、ミトコンドリアまたは原核細胞の核である、請求項１または２に記載の方法。
工程(ａ)の前にホルムアルデヒドでの架橋がある、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
工程(ａ)における分離を、区画の凍結超薄切片化により行う、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
工程(ａ)において１区画が約５〜３００画分、好ましくは、約４０〜６０画分に分けられる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
画分のコレクションが１８０を超える画分を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
画分のコレクションを複数の区画から得る、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
複数の座位が、２座位乃至区画における全核酸座位である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
少なくとも３個の共分離座位の検出が可能である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
複数の座位の存在または不存在を非顕微鏡的方法を使用して検出する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
複数の座位の存在または不存在をシークエンシング、好ましくは、次世代シークエンシングにより決定する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
空間的近接が、座位が、好ましくは染色体上のそれらの直線的ゲノム距離から予測されるより高い頻度で共分離されるとき、空間において近位であると決定される、推計統計法を含む群から選択される統計法での共分離の解析により決定される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
(ａ)複数の座位間の物理的距離の決定；
(ｂ)区画における座位および／またはゲノムアーキテクチャのマッピング；
(ｃ)複数の座位間の相互作用の可能性の決定；
(ｄ)区画における座位または染色体の末梢または中枢位置の決定；
(ｅ)プロモーター、エンハンサー、例えば、転写に関係する酵素、ＲＮＡ、転位性要素、転写因子結合部位、リプレッサー、遺伝子体、スプライシングシグナルからなる群から選択される異なる機能的要素の相互作用の解析；
(ｆ)特定の遺伝子の発現を制御する制御領域の特定；
(ｇ)座位の共分離に影響し得る薬物の標的および／または効果の特定；
(ｈ)座位の共分離に対する遺伝子治療の効果の解析；
(ｉ)疾患における共分離の乱れの解析；
(ｊ)染色体再配列マッピング；
(ｋ)座位の共分離の乱れと関係する疾患の診断；
(ｌ)特定の疾患を有する患者のある座位の近接に応じた、特定の薬物処置に応答する可能性が高いまたは低いサブグループへの層別化；
(ｍ)クロマチンの凝縮決定；および／または
(ｎ)内在性座位と相互作用する外来性核酸上の座位の特定
のための、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法の使用。
患者における乱れた座位の共分離、放射状配置またはクロマチンの凝縮と関係する疾患を診断する方法であって、該患者から採取したサンプルにおいて、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法で患者における複数の座位の共分離または座位の検出頻度を解析し、該共分離または検出の頻度と、該疾患を有するとすでに診断されている対象における該座位の共分離または検出頻度を比較することを含み、ここで、共分離は好ましくはまた健常対象における共分離も含み、
所望により、患者における座位の共分離の乱れと関係する疾患を診断する方法でもあり、該患者から採取したサンプルにおいて、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法で患者における複数の座位の共分離を解析し、該共分離と、該疾患を有するとすでに診断されている対象における該座位の共分離を比較することを含み、ここで、共分離は好ましくはまた健常対象における共分離も含む、方法。