JP2017536833A - 異種タンパク質骨格に組み込まれた機能性ポリペプチドに関連する方法および組成物 - Google Patents

異種タンパク質骨格に組み込まれた機能性ポリペプチドに関連する方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、異なるタンパク質骨格（例えば抗体骨格）に組み込まれたエフェクターポリペプチド（例えばホルモンおよび受容体リガンド）の機能性誘導体を作製するための方法を提供する。この方法は、エフェクターポリペプチドを末端リンカー配列のコンビナトリアルライブラリで修飾すること、修飾された配列をホスト骨格に挿入すること、およびその後ホスト骨格に組み込まれた修飾ポリペプチド配列のライブラリから機能性誘導体を選択することを含む。例示として、本発明は、抗体骨格に組み込まれたレプチン、ｓｃＦＳＨおよびｓｃリラキシンの特定の機能性誘導体、ならびにこのような機能性融合分子の治療適用も提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、米国特許仮出願第６２／０８５，８０７号（２０１４年１２月１日出願）および同第６２／２２２，３８４号（２０１５年９月２３日出願）に対する優先権を主張する。優先出願の全開示は、その全体がすべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれる。
機能性タンパク質またはポリペプチド（例えばホルモン）は、より望ましい生物学的特徴、例えば改善された安定性、薬物動態特性または薬理学的特性を与えるためにしばしば修飾する必要がある。基本的にタンパク質は、Ｎ末端とＣ末端の結合部によって相互に連結された二次構造フォールドの集合体とみなすことができる。タンパク質構造決定の進歩により、現在ではタンパク質の二次構造フォールドの大きくかつますます増え続ける一覧メニューが存在する。したがって、新たな機能性ポリペプチドを、これらの二次構造エレメントの一部（ゲスト）を新たなタンパク質パートナー（ホスト）に挿入することによって修飾し得る。機能性タンパク質を修飾するこのような認識されているアプローチに関連した問題が存在する。例えばタンパク質の機能は、しばしば三次元での接近および二次構造エレメントの正しい折りたたみを必要とし、これは、現在当分野で利用可能な知識と技術ではハイブリッドタンパク質において容易に達成することはできない。
関心対象の機能性ポリペプチドの一例は、ヒトリラキシン２（リラキシン）である。これは、ヒトインスリン−リラキシンスーパーファミリーに属する５３残基のペプチドホルモンであり、このスーパーファミリーには、インスリン、ＩＧＦ１および２、ならびにリラキシン１および３も含まれる。このペプチドは、恥骨靭帯へのその弛緩作用（これが名称の由来である）および分娩を容易にするために子宮頸を軟化することに起因して、妊娠ホルモンとして最初に発見された。リラキシンは、妊娠中に心拍出量の２０％の増加、全身血管抵抗の３０％の減少、全体的な動脈コンプライアンスの３０％の増大および腎血流量の４５％の増加を誘導することが報告された。リラキシンが男性および女性の両方において心臓血管作用を与えることは現在公知であり、心臓血管機能および腎機能を調節するうえでの潜在的な薬理学的有用性を実証する。
リラキシンの生理学的作用は、リラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体１（ＲＸＦＰ１）を介したそのシグナル伝達によって媒介され、これはいくつかのシグナル伝達経路の調節をもたらす。リラキシンによるＲＸＦＰ１の活性化は、（１）血管拡張をもたらすエンドセリン系の上方調節；（２）コラーゲン沈着、マトリックスメタロプロテイナーゼおよびメタロプロテイナーゼ発現の組織阻害剤の調節ならびに全体的な組織ホメオスタシスを介した細胞外マトリックスのリモデリング；（３）炎症性サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子αおよびトランスフォーミング増殖因子βのレベルを低下させることによる炎症の緩和；ならびに（４）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写を活性化することによる血管新生、を誘導する。リラキシンはまた、急性心不全、子癇前症、高血圧症、強皮症、子宮頸管熟化、線維筋痛症および歯科矯正術を処置するための薬理学的物質として様々な臨床または非臨床試験でも評価されている。リラキシンは、例えば急性心不全を処置するための臨床試験において、高い特異性と優れた安全性プロフィールを有することが認められた。しかし、リラキシンペプチドは経口的に使用可能ではなく、また５〜１５分の範囲の短い血清半減期を有する。
改善された生物学的および薬学的特性を有する誘導または修飾機能性タンパク質またはポリペプチド（例えばリラキシン誘導体）を作製する有効で堅固な手段が当分野で求められている。本発明は、この必要性および当分野における他の満たされていない必要性に対処する。
１つの態様では、本発明は、異種タンパク質骨格に組み込まれた機能性誘導体エフェクターポリペプチドを作製するための方法を提供する。この方法は、（ａ）標的エフェクターポリペプチドをＮ末端リンカーのコンビナトリアルライブラリおよびＣ末端リンカーのコンビナトリアルライブラリで修飾し、修飾されたエフェクターポリペプチドの集団を作製すること、（ｂ）修飾されたエフェクターポリペプチドを異種タンパク質骨格に挿入し、候補誘導体エフェクターポリペプチドのコンビナトリアルライブラリを作製すること、（ｃ）候補誘導体エフェクターポリペプチドのライブラリから、エフェクターポリペプチドの生物学的機能またはシグナル伝達活性を有する１つ以上の成員を同定することを包含する。この方法は、したがって、異種タンパク質骨格に組み込まれた機能性誘導体エフェクターポリペプチドの作製および同定を可能にする。
本発明の一部の方法では、用いられる異種タンパク質骨格は抗体骨格である。これらの方法の一部では、修飾されたエフェクターポリペプチドを、抗体骨格の相補性決定領域（ＣＤＲ）を置換することによって抗体骨格に挿入する。一部の方法では、Ｎ末端リンカーおよびＣ末端リンカーの各々は、ランダム化されたペプチド配列を含む。例えばＮ末端リンカーは、アミノ酸配列Ｘａ（ＧｂＳｃ）ｎ（配列番号：８６）またはＸａ（ＳｃＧｂ）ｎ（配列番号：８７）を含むことができ、Ｃ末端リンカーは、アミノ酸配列（ＧｅＳｆ）ｍＸｄ（配列番号：８８）または（ＳｆＧｅ）ｍＸｄ（配列番号：８９）を含み得る。これらの配列において、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンであり、ｍおよびｎは、各々独立して境界を含む１から６の間であり、ａおよびｄは、各々独立して境界を含む１から５の間であり、ｂおよびｅは、各々独立して境界を含む０から６の間であり、ならびにｃおよびｆは、各々独立して境界を含む０から２の間である。加えて、ｎ（またはｍ）が１より大きい場合、任意のＧＳリッチリピート中のｂ（またはｅ）およびｃ（またはｆ）は、それぞれ、その他のＧＳリッチリピート中のｂ（またはｅ）およびｃ（またはｆ）とは異なり得る。
本発明の方法の様々な実施形態では、（ａ）と（ｂ）は各々組換えによって実施される。一部の方法では、（ｃ）は、候補誘導体エフェクターポリペプチドが発現されるレポーター細胞の自己分泌に基づく表現型スクリーニングによって実施される。これらの方法の一部では、用いられるエフェクターポリペプチドは細胞受容体のリガンド、例えばホルモンである。本発明の一部の方法では、用いられるエフェクターポリペプチドは、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、自己分泌選択において用いられるレポーター細胞は、この細胞におけるエフェクターポリペプチドの発現に応答性である。一部の方法では、候補誘導体エフェクターポリペプチドは、レンチウイルスベクターによってレポーター細胞中で発現される。一部の実施形態では、発現された候補誘導体エフェクターポリペプチドのライブラリは細胞膜に係留される。一部の他の実施形態では、発現された候補誘導体エフェクターポリペプチドは細胞から分泌される。本発明の様々な実施形態では、エフェクターポリペプチドを組み込むために用いられる抗体骨格は、一本鎖抗体、例えば一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態では、抗体骨格は、修飾されたエフェクターポリペプチドの挿入後にその抗原結合活性を保持する。
本発明の一部の方法は、異種タンパク質骨格に組み込まれたレプチンまたは一本鎖卵胞刺激ホルモン（ｓｃＦＳＨ）の機能性誘導体ポリペプチドを作製し、選択することを対象とする。これらの方法の一部では、Ｎ末端リンカーおよびＣ末端リンカーは各々、（ａ）３〜５個のランダムな残基の配列および（ｂ）ＧＧＧＧＳ（配列番号：４）の１〜５個の縦列反復配列を含む。一部の実施形態では、Ｎ末端リンカーは、ＸＸＸ（ＧＧＧＧＳ）１〜３（配列番号：３５）の配列を含み、Ｃ末端リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）１〜３ＸＸＸ（配列番号：３６）の配列を含む。
本発明の一部の方法は、ヒトリラキシン２などのリラキシンの一本鎖変異体（ｓｃリラキシン）分子の機能性誘導体ポリペプチドを作製し、選択することを対象とする。これらの方法の一部では、リラキシン分子の一本鎖変異体は、（ＧＳ）ｎ（配列番号：４４）［式中、ｎ＝３〜５］の配列を有するリンカーによって連結されたＡ鎖およびＢ鎖を含む。一部の方法では、Ｎ末端リンカーは、アミノ酸配列Ｘａ（ＧＧＧＧＳ）ｂ（ＧＧＧＳ）ｃ（ＧＧＳ）ｄ（配列番号：８２）またはＸａ（ＧＧＳ）ｅ（配列番号：８３）を含み、Ｃ末端リンカーは、アミノ酸配列（ＳＧＧＧＧ）ｆ（ＳＧ）ｇＸａ（配列番号：８４）または（ＳＧＧＧＧ）ｆＳｇＸａ（配列番号：８５）を含む。これらの配列式の各々において、Ｘはランダム化されたアミノ酸残基であり、ａは、境界を含む２から４の間であり、ｂおよびｆは、各々境界を含む１から２の間であり、ｅは、境界を含む１から３の間であり、ならびにｃ、ｄおよびｇは、各々独立して境界を含む０から２の間である。
別の態様では、本発明は、抗体骨格に組み込まれて、抗体骨格の相補性決定領域（ＣＤＲ）を置換するエフェクターポリペプチドを含む、修飾されたエフェクターポリペプチドを提供し、ここでエフェクターポリペプチドは、Ｎ末端リンカーおよびＣ末端リンカーによって抗体配列に連結されている。一部の実施形態では、Ｎ末端リンカーは、アミノ酸配列Ｘａ（ＧｂＳｃ）ｎ（配列番号：８６）またはＸａ（ＳｃＧｂ）ｎ（配列番号：８７）を含み、Ｃ末端リンカーは、アミノ酸配列（ＧｅＳｆ）ｍＸｄ（配列番号：８８）または（ＳｆＧｅ）ｍＸｄ（配列番号：８９）を含む。これらの配列において、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンであり、ｍおよびｎは、各々独立して１から６のランダムな数であり、ａおよびｄは、各々独立して１から５のランダムな数であり、ｂおよびｅは、各々独立して０から６のランダムな数であり、ならびにｃおよびｆは、各々独立して０から２のランダムな数である。加えて、ｎ（またはｍ）が１より大きい場合、任意のＧＳリッチリピート中のｂ（またはｅ）およびｃ（またはｆ）は、それぞれ、その他のＧＳリッチリピート中のｂ（またはｅ）およびｃ（またはｆ）とは異なり得る。また、本明細書で述べる修飾されたエフェクターポリペプチドをコードする単離されたまたは組換えポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチド配列を保有する発現ベクターおよび宿主細胞が、本発明において提供される。
本発明の修飾されたエフェクターポリペプチドの一部では、エフェクターポリペプチドは細胞受容体のリガンドである。例えば、エフェクターポリペプチドはホルモン分子であり得る。一部の実施形態では、抗体骨格に組み込まれたエフェクターポリペプチドは、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、エフェクターポリペプチドを受け入れるための抗体骨格は、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。本発明の一部の修飾エフェクターポリペプチドでは、一本鎖抗体骨格は配列番号：１に示すアミノ酸配列を有し、抗体骨格内のＨＣＤＲ３（ＬＧＩＴＫＴＳＴＣＹＴ；配列番号：３）はエフェクターポリペプチドで置換されている。
本発明の一部の修飾エフェクターポリペプチドでは、エフェクターポリペプチドはレプチンまたはｓｃＦＳＨである。これらの実施形態の一部では、Ｎ末端リンカーおよびＣ末端リンカーの各々はランダム化配列を含む。一部の実施形態では、Ｎ末端リンカー配列は、配列ＸＸＸ（ＧＧＧＧＳ）１〜３（配列番号：３５）を含み、Ｃ末端リンカー配列は、配列（ＧＧＧＧＳ）１〜３ＸＸＸ（配列番号：３６）を含む。本発明の一部の修飾エフェクターポリペプチドは、（１）それぞれ、ＬＧＶＧＧＧＧＳ（配列番号：５）およびＧＧＧＧＳＥＲＴ（配列番号：６）；（２）それぞれ、ＨＬＴＧＧＧＧＳ（配列番号：７）およびＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＤＰＳ（配列番号：８）；（３）それぞれ、ＰＷＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：９）およびＧＧＧＧＳＱＰＰ（配列番号：１０）；（４）それぞれ、ＫＴＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：１１）およびＧＧＧＧＳＳＤＥ（配列番号：１２）；（５）それぞれ、ＫＶＴＧＧＧＧＳ（配列番号：１３）およびＧＧＧＧＳＱＬＥ（配列番号：１４）；または（６）それぞれ、ＲＨＭＧＧＧＧＳ（配列番号：３７）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＤＴ（配列番号：３８）と実質的に同一であるＮ末端リンカーおよびＣ末端リンカーを有するｓｃＦｖ骨格に組み込まれたヒトレプチンを含む。本発明の一部の修飾エフェクターポリペプチドは、（１）それぞれ、ＲＳＨＧＧＧＧＳ（配列番号：１５）およびＧＧＧＧＳＶＮＰ（配列番号：１６）；（２）それぞれ、ＱＲＶＧＧＧＧＳ（配列番号：１７）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＡ（配列番号：１８）；または（３）それぞれ、ＲＶＬＧＧＧＧＳ（配列番号：１９）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＳＳ（配列番号：２０）と実質的に同一であるＮ末端リンカーおよびＣ末端リンカーを有するｓｃＦｖ骨格に組み込まれた一本鎖ヒトＦＳＨを含む。
本発明の一部の他の修飾エフェクターポリペプチドでは、組み込まれたエフェクターポリペプチドは、一本鎖ヒトリラキシン２（ｓｃリラキシン）である。これらの分子の一部では、一本鎖リラキシンポリペプチドは、コネクタ配列（ＧＳ）ｎ（配列番号：４４）［式中、ｎ＝３〜５］によって連結されたＡ鎖およびＢ鎖を含む。一部の実施形態では、ｓｃリラキシンは、Ｎ末端リンカー配列ＸＸＸＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：７８）またはＸＸＸＧＧＳＧＧＳ（配列番号：７９）、およびＣ末端リンカー配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＸＸＸ（配列番号：８０）またはＳＧＧＧＧＳＸＸＸ（配列番号：８１）［式中、Ｘは任意のランダム化された残基である］を有するホストｓｃＦｖ抗体骨格に組み込まれている。一部の実施形態では、ｓｃリラキシンを組み込むためのＮ末端リンカー配列およびＣ末端リンカー配列は、それぞれ、（１）ＲＴＲＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５０）およびＳＧＧＧＧＳＬＭＳ（配列番号：５１）（クローンＡ３）；（２）ＲＴＲＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５０）およびＳＧＧＧＧＳＫＰＰ（配列番号：５２）（クローンＡ１２−２）；（３）ＰＬＮＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５３）およびＳＧＧＧＧＳＫＰＰ（配列番号：５２）（クローンＣ１２−１）；（４）ＬＰＲＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５４）およびＳＧＧＧＧＳＬＤＳ（配列番号：５５）；（５）ＱＴＴＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５６）およびＳＧＧＧＧＳＫＧＴ（配列番号：５７）；（６）ＨＭＦＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５８）およびＳＧＧＧＧＳＫＡＰ（配列番号：５９）；（７）ＱＲＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：６０）およびＳＧＧＧＧＳＷＳＰ（配列番号：６１）；（８）ＲＱＲＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：６２）およびＳＧＧＧＧＳＶＲＡ（配列番号：６３）；（９）ＲＬＴＧＧＳＧＧＳ（配列番号：６４）およびＳＳＧＧＷＳＡＧＧＧＳＧＶＲＳ（配列番号：６５）；または（１０）ＲＮＲＧＧＧＧＳＧＧＲＳＧＧＳ（配列番号：６６）およびＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＲＰ（配列番号：６７）に示す配列と実質的に同一である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖ抗体骨格内にｓｃリラキシンを組み込むためのＮ末端リンカー配列およびＣ末端リンカー配列は、それぞれ、（１）ＲＴＲＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５０）およびＳＧＧＧＧＳＬＭＳ（配列番号：５１）（クローンＡ３）；（２）ＲＴＲＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５０）およびＳＧＧＧＧＳＫＰＰ（配列番号：５２）（クローンＡ１２−２）；または（３）ＰＬＮＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５３）およびＳＧＧＧＧＳＫＰＰ（配列番号：５２）（クローンＣ１２−１）に示す配列と同一である。本発明の一部の修飾されたリラキシン分子では、リンカー配列を含む、ＨＣＤＲ３ループ、ＬＧＩＴＫＴＳＴＣＹＴ（配列番号：３）に組み込まれてこれを置換するｓｃリラキシンポリペプチドは、配列番号：６９、配列番号：７１または配列番号：７２に示すアミノ酸配列を有する。本発明の修飾されたヒトリラキシン分子の一部の特定の例は、配列番号：６８〜７７から成る群より選択される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本発明は、被験体においてレプチン欠損に関連するまたはレプチン欠損によって媒介される疾患または障害の発症を処置するまたは予防するための方法を提供する。前記方法は、本明細書で述べる修飾または誘導体レプチンポリペプチドの治療有効量を含有する医薬組成物を被験体に投与することを含む。これらの方法の一部は、肥満、脂肪異栄養症、視床下部性無月経または先天性レプチン欠損症に罹患している被験体を処置することを対象とする。別の態様では、本発明は、被験体においてＦＳＨ欠損に関連するまたはＦＳＨ欠損によって媒介される疾患または障害の発症を処置するまたは予防するための方法を提供する。これらの方法は、本発明の修飾または誘導体ｓｃＦＳＨポリペプチドの治療有効量を含有する医薬組成物を被験体に投与することを包含する。これらの方法の一部は、性腺機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、カルマン症候群、視床下部抑制、下垂体機能低下症、過プロラクチン血症または性腺刺激ホルモン欠損症に罹患している被験体を処置することを対象とする。さらに別の態様では、本発明は、被験体においてリラキシン２欠損またはリラキシン２シグナル伝達障害に関連するまたはこれによって媒介される疾患または障害の発症を処置するまたは予防するための方法を提供する。前記方法は、本発明の修飾または誘導体リラキシン分子の治療有効量を含有する医薬組成物を被験体に投与することを含む。これらの方法の一部は、心不全、線維症、高血圧症、強皮症または癌に罹患している被験体を処置することを対象とする。
本発明のさらなる態様および実施形態、ならびに本発明の具体的な特性および利点を本明細書の残りの部分および特許請求の範囲において説明する。
自己分泌に基づく安定な細胞株の構築を示す。ＬｅｐＲ ＳＩＥ−Ｂｌａ細胞の自己分泌細胞構築に使用されるエレメントの概略図。 自己分泌に基づく安定な細胞株の構築を示す。抗ＨＡ抗体で検出される、ＬｅｐＲ ＳＩＥ−Ｂｌａ細胞におけるＨＡ標識ＬｅｐＲの発現。 自己分泌に基づく安定な細胞株の構築を示す。１ｎｇ／ｍｌレプチンに対するＬｅｐＲ ＳＩＥ−Ｂｌａ細胞の応答。 自己分泌に基づく安定な細胞株の構築を示す。ＦＳＨＲ ＣＲＥ−Ｂｌａ細胞の自己分泌細胞構築に使用されるエレメントの概略図。 自己分泌に基づく安定な細胞株の構築を示す。１ｎｇ／ｍｌ ＦＳＨに対するＦＳＨＲ ＣＲＥ−Ｂｌａ細胞の応答。 抗体骨格に組み込まれたレプチンまたはｓｃＦＳＨ分子のインビトロ活性を示す。選択した、組み込まれたレプチンクローンのレプチンＥＣ５０を測定する、ＬｅｐＲ ＳＩＥ−Ｂｌａ細胞を使用したＦＲＥＴアッセイ。Ｆａｂ、ＩｇＧおよび天然レプチンのＥＣ５０は、それぞれ１１８．３ｐＭ、５８．７ｐＭおよび３１３．４ｐＭであった。 抗体骨格に組み込まれたレプチンまたはｓｃＦＳＨ分子のインビトロ活性を示す。選択した、組み込まれたレプチンクローンのＥＣ５０を測定する、Ｂａｆ３ ＬｅｐＲ細胞を使用した増殖アッセイ。Ｆａｂ、ＩｇＧおよび天然レプチンのＥＣ５０は、それぞれ１３１．９ｐＭ、３７．２ｐＭおよび３０９．６ｐＭであった。 抗体骨格に組み込まれたレプチンまたはｓｃＦＳＨ分子のインビトロ活性を示す。選択した、組み込まれたＦＳＨクローンにおけるＦＳＨのＥＣ５０を測定する、ＦＳＨＲ ＣＲＥ−Ｂｌａ細胞を使用したＦＲＥＴアッセイ。ＩｇＧ−ｓｃＦＳＨ、ｓｃＦＳＨおよび天然ＦＳＨのＥＣ５０は、それぞれ５．５ｐＭ、５．７ｐＭおよび４．６ｐＭであった。 ＩｇＧ−レプチンがインビボで代謝を調節することを示す。ＩｇＧ−レプチンは体温で安定であり、循環中で半減期の延長を有する。上のパネル：レプチンまたはＩｇＧ−レプチンを浸透圧ポンプに充填し、これを皮下移植した。ポンプの内部のレプチンおよびＩｇＧ−レプチンの濃度を移植の３日後にＥＬＩＳＡによって測定した。下のパネル：レプチンまたはＩｇＧ−レプチンの単回用量を頸静脈から投与し、血漿中のタンパク質濃度を、様々な時点で眼窩採血を介して決定した。 ＩｇＧ−レプチンがインビボで代謝を調節することを示す。ＩｇＧ−レプチンは視床下部においてＳＴＡＴ３を活性化する。レプチンまたはＩｇＧ−レプチンを末梢または中枢に投与し、視床下部におけるＳＴＡＴ３の神経細胞活性化を免疫組織化学によって検査した。 ＩｇＧ−レプチンがインビボで代謝を調節することを示す。ＩｇＧ−レプチンはインビボで代謝機能を発揮する。レプチンまたはＩｇＧ−レプチンをｏｂ／ｏｂマウスに末梢もしくは中枢投与するか、または野生型マウスに末梢投与した。体重および食物摂取を処置の前後に指示されている時点で記録した。処置の開始時と終了時に体脂肪組成を測定した。 図４は、ｄｂ／ｄｂまたはＤＩＯマウスではＩｇＧ−レプチンの代謝作用が消失することを示す。レプチンまたはＩｇＧ−レプチンをｄｂ／ｄｂまたはＤＩＯマウスに末梢投与した。体重および食物摂取を処置の前後に指示されている時点で記録した。処置の開始時と終了時に体脂肪組成を測定した。 図５は、９個の抗体骨格ｓｃリラキシンクローンのアゴニスト活性および細胞培養上清中のこれらの発現レベルを示す。 図６は、１０個の同定された、抗体に組み込まれたｓｃリラキシン−Ｈ２クローンのアミノ酸配列（それぞれ配列番号：６８〜７７）を示す。末端リンカー、リラキシン−Ｈ２のＡ鎖およびＢ鎖、ならびに鎖間コネクタの配列も示す。 図７は、クマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける、精製した、抗体に組み込まれｓｃリラキシンアゴニスト分子、Ａ３、Ｃ１２−２およびＣ１２−１を示す。 図８は、精製した、抗体に組み込まれたｓｃリラキシンアゴニスト分子、Ａ３、Ｃ１２−２およびＣ１２−１のインビトロ活性を示す。 図９は、ｓｃＦｖ抗体骨格の構造および短いランダムなペプチドを置換して抗体骨格のＣＤＲ領域の外側でのゲスト配列の挿入の耐性を検討するためのその上の５つの部位を示す。
１．概説
本発明は、一部には、異種タンパク質骨格（例えば抗体骨格）に挿入された、もとの機能性ポリペプチドの完全なシグナル伝達または生物学的活性を保持する修飾または誘導体機能性ポリペプチド（例えばレプチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）およびリラキシン分子）を作製するために発明人によって実施された試験に基づく。具体的には、発明人は、機能性ポリペプチド分子を挿入した抗体を自己分泌に基づく表現型スクリーニングで機能に関して選択することができるかどうかを検討した。好ましくは、ホストタンパク質骨格は、本明細書で述べるｓｃＦｖヒト抗体などのヒト抗体骨格である。例示として、ゲスト抗体骨格中のＣＤＲループ（例えばＨＣＤＲ３タンパク質ループ）を、それぞれ、ホルモンであるレプチン、一本鎖ＦＳＨまたは一本鎖リラキシン−Ｈ２の完全長配列で置換した。これらのスクリーニングにより、発明人は、ゲストポリペプチド配列をホスト骨格に連結するための結合配列のコンビナトリアルライブラリから実験的に選択することができた。非常に大きな数の異なる結合部を試験することにより、ゲストエレメントの適切な機能を許容する結合部が決定される。
別のタンパク質骨格に組み込まれた機能性ポリペプチドを選択する場合、発明人は最初に、ゲスト二次または三次構造（ゲストポリペプチドまたはタンパク質）を異種ホストタンパク質骨格に組み込むために多様な結合配列のライブラリを作製した。具体的には、機能性ポリペプチドを約１０７の異なるＮ末端およびＣ末端結合部の大きなコンビナトリアルライブラリの間に挿入した。次に自己分泌に基づく表現型スクリーニングにおいて機能を許容する結合部を選択した。非常に大きな数の候補物を検討するので、堅固な自己分泌レポーター系を許容結合部の選択のために使用した。このような自己分泌選択系を用いて、数百万個の潜在的アゴニストとそれらの受容体を、各細胞がコグネイト受容体および潜在的アゴニストのレパートリーの１つの成員を有するように細胞において発現させる。最新の細胞選別法を用いて、１時間当たり約２千万個のコンビナトリアル結合部を、機能を許容するものに関してスクリーニングすることができる。本明細書で例示するように、ゲストポリペプチドを挿入するためのコンビナトリアル結合部および自己分泌選択形式の使用により、発明人は、抗体骨格に組み込まれた機能性誘導体レプチン、ｓｃＦＳＨおよびｓｃリラキシン分子を同定することができた。
これらの試験に従って、本発明は、別のタンパク質骨格（例えば抗体骨格）に組み込まれたエフェクターポリペプチドの機能性誘導体を作製するための方法を提供する。本明細書で述べる大きな多様性の系および堅固な選択スキームは、例えば改善された薬物動態特性を有する組換え治療用ポリペプチドを設計し、選択するための方法において、公知の治療用ポリペプチドまたはタンパク質物質からの新たな誘導体治療用タンパク質の構築に適用できる。本発明の方法はまた、タンパク質内のどこかに挿入された新しい配列のいずれが、その折りたたみ経路が天然のまたはさらには新しい道筋を通ることを可能にするかを検討することができる、全般的なタンパク質折りたたみの問題を取り上げるのにも用いることができる。本発明はさらに、抗体骨格に組み込まれた特定の機能性レプチン、ｓｃＦＳＨまたはｓｃリラキシンポリペプチドを提供する。これらの改善された生物学的および／または薬理学的特性（例えば安定性およびインビボ半減期）のために、本発明の誘導体エフェクターポリペプチド（例えば本明細書で例示するレプチン、ｓｃＦＳＨまたはｓｃリラキシン誘導体ポリペプチド）は、様々な治療適用または他の工業適用において有用であり得る。以下の項は、本発明を実施するためのより詳細な指針を提供する。
ＩＩ．定義
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ ｅｄ．，１９９２）；Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄ．，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ （Ｅｄ．），Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）； Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（３ｒｄ ｅｄ．，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（Ｅｄ．），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔ ｅｄ．，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ（Ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ａｎａｎｄａｎｄ（Ｅｄｓ．），Ａｎｍｏｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；およびＡ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐａｐｅｒｂａｃｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｈｉｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈ ｅｄ．，２０００）。加えて、以下の定義は、読者が本発明を実施するのを助けるために提供される。
本発明の実施において用いられる分子的、遺伝的および生化学的方法には標準的な技術が使用される。一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（３ｒｄ ｅｄ．，２０００）；Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ ｅｄ．， ２００３）；Ｇｕｔｈｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（２００５）；およびＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（１９９１）参照。
「抗体」または「抗原結合フラグメント」という用語は、所与の抗原、１または複数のエピトープに、強い一価、二価または多価結合を示すポリペプチド鎖を指す。特に断りのない限り、本発明で使用される抗体または抗原結合フラグメントは、任意の脊椎動物、ラクダ、鳥類または魚類種に由来する配列を有し得る。これらは、任意の適切な技術、例えばハイブリドーマ技術、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、遺伝子シャッフリングライブラリ、半合成もしくは完全合成ライブラリまたはこれらの組み合わせを用いて作製することができる。特に断りのない限り、本発明で使用される「抗体」という用語は、無傷抗体、抗原結合ポリペプチドフラグメントおよび以下で述べるまたは当分野で周知の他のデザイナー抗体（例えばＳｅｒａｆｉｎｉ，Ｊ Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：５３３−６，１９９３参照）を包含する。
無傷「抗体」は、典型的にはジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖（約５０〜７０ｋＤ）および２本の軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤ）を含む。広く認められている、抗体鎖をコードする免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに数え切れないほどの免疫グロブリン可変領域遺伝子を包含する。軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類され、これらは次に、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ定義する。
抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域から成る。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から成る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから成る。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞および古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む、ホスト組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
抗体のＶＨおよびＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各々のＶＨおよびＶＬは、以下の順にアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＣＤＲおよびＦＲ領域の位置ならびにナンバリングシステムは、例えばＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ（１９８７ ａｎｄ １９９１）によって定義されている。
本発明で使用されるべき抗体はまた、コグネイト抗原に結合する能力を保持する無傷抗体の抗原結合部分を含む抗体フラグメントまたは抗原結合フラグメントも包含する。このような抗体フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）無傷抗体の１本の腕のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｖ）構造的に保存されたフレームワーク領域の間で操作された鎖間ジスルフィド結合を有する、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）；（ｖｉ）ＶＨドメインから成る単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（例えばＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６，１９８９参照）；ならびに（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。本発明の一部の実施形態では、抗体骨格は、組み込まれたエフェクターポリペプチドを有するが、コグネイト抗原に対するその結合活性を保持する。
本発明を実施するのに適した抗体は、一本鎖抗体も包含する。「一本鎖抗体」という用語は、一般にスペーサーペプチドによって連結された、アミノ末端および／またはカルボキシル末端に付加的なドメインまたはアミノ酸配列を含んでもよい、ポリペプチド結合内にＶＨドメインとＶＬドメインを含むポリペプチドを指す。例えば、一本鎖抗体は、コーディングポリヌクレオチドに連結するための係留セグメントを含み得る。一例として、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）は一本鎖抗体である。別々の遺伝子によってコードされるＦｖフラグメントのＶＬおよびＶＨドメインと比べて、ｓｃＦｖは合成リンカーによって（例えば組換え法によって）結合された２つのドメインを有する。これは、ｓｃＦｖを、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価分子を形成している１本のタンパク質鎖として作製することを可能にする。一部の好ましい実施形態では、本発明で使用される一本鎖抗体はヒト抗体である。
本発明の実施において使用し得る抗体は、ラクダ科動物骨格を有する単一ドメインの抗原結合単位も包含する。ラクダ科の動物には、ラクダ、ラマおよびアルパカが含まれる。ラクダ科動物は、軽鎖を欠く機能性抗体を産生する。重鎖可変（ＶＨ）ドメインは自律的に折りたたまれ、抗原結合単位として独立して機能する。その結合表面は、古典的抗原結合分子（Ｆａｂ）または一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）における６つのＣＤＲと比べて３つのＣＤＲしか含まない。ラクダ抗体は、従来の抗体に匹敵する結合親和性を達成することができる。
本明細書で述べる様々な抗体または抗原結合フラグメントは、無傷抗体の酵素的もしくは化学的修飾によって生成する、または組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成する、またはファージディスプレイライブラリを用いて同定することができる。これらの抗体または抗原結合分子を作製するための方法は、すべて当分野で周知である。例えば、一本鎖抗体は、ファージディスプレイライブラリまたはリボソームディスプレイライブラリ、遺伝子シャッフリングライブラリを用いて同定することができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４，１９９０；および米国特許第４，９４６，７７８号参照）。特に、ｓｃＦｖ抗体は、例えばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３，１９８８に記載されている方法を用いて得ることができる。Ｆｖ抗体フラグメントは、Ｓｋｅｒｒａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−４１，１９８８に記載されているように作製することができる。ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）は、例えばＲｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６７：１１３−２３，１９９６に記載されている方法を用いて作製できる。同様に、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、例えばＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６，１９８９；およびＣａｉ ａｎｄ Ｇａｒｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：６２８０−８５，１９９６に記載されている様々な方法によって生成することができる。ラクダ単一ドメイン抗体は、当分野で周知の方法、例えばＤｕｍｏｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１１：５００−５１５，２００２；Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１４：５２１−５２６，１９９７；およびＢｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３３２：６４３−５５，２００３の方法を用いて生成できる。他の種類の抗原結合フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｄフラグメント）も、日常的に実施される免疫学の方法で容易に生成することができる。例えばＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８参照。
結合親和性は、一般に平衡会合定数または解離定数（それぞれＫａまたはＫｄ）を単位として表され（それぞれＫａまたはＫｄ）、これらは順に解離速度定数および会合速度定数（それぞれｋｄおよびｋａ）の逆比である。したがって、等価の親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数に対応し得る。
本明細書で使用される場合、「含むこと」または「含む」という用語は、本発明に必須である組成物、方法およびこれらのそれぞれの成分に関連して用いられるが、必須であるか否かに関わらず、特定されない要素の包含も受け入れる。
本明細書で使用される場合、「から基本的に成る」という用語は、所与の実施形態に必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のその実施形態の基本的な新規の特徴または機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。
「から成る」という用語は、本明細書で述べる組成物、方法およびこれらのそれぞれの成分を指し、その実施形態の説明において列挙されないいかなる要素も除外する。
「接触」という用語は、その通常の意味を有し、２つ以上の作用物質（例えばエフェクターポリペプチド物質と受容体タンパク質）を組み合わせることまたは作用物質と細胞を組み合わせることを指す。本明細書で使用される接触は、インビトロで、例えば試験管または他の容器中でポリペプチドのライブラリを細胞の集団と混合することで起こり得る。接触はまた、インビボでも、例えば宿主細胞の内部でまたは被験体の体内でポリペプチドと受容体タンパク質などの別の分子との間でも起こり得る。
「抗体骨格に組み込まれたエフェクターポリペプチドの誘導体」または「エフェクターポリペプチドの抗体骨格に組み込まれた誘導体」は、エフェクターポリペプチド（ゲストポリペプチド）が抗体配列の特異的エピトープまたはドメイン（例えばホスト骨格）に挿入されて、特異的エピトープまたはドメインを置換している融合ポリペプチドを指す。典型的には、エフェクターポリペプチドはＮ末端リンカー配列および／またはＣ末端リンカー配列を介してホスト骨格に挿入される。
本明細書で使用される場合、エフェクターポリペプチドまたは機能性ポリペプチドは、細胞（例えばシグナル伝達）機能または生化学的（例えば酵素的）機能を有する任意のポリペプチド、オリゴペプチドまたは短いペプチド配列を指す。一部の実施形態では、本発明の実施において使用されるエフェクターまたは機能性ポリペプチドは、宿主細胞中で受容体分子に選択的に結合することによって細胞応答を調節するまたはシグナル伝達事象を誘発することができる。エフェクターポリペプチドによって調節される細胞活性は、例えば酵素活性、遺伝子発現または細胞シグナル伝達であり得る。エフェクターポリペプチドの例には、サイトカイン、増殖因子、神経栄養因子、インテグリン、細胞接着分子、酵素基質、他のホルモンおよび細胞表面受容体のポリペプチドリガンドが含まれるが、これらに限定されない。
「融合」タンパク質またはポリペプチドは、少なくとも２つのポリペプチドおよび連結配列または２つのポリペプチドを１つの連続するポリペプチドに作動可能に連結する結合から成るポリペプチドを指す。融合ポリペプチド中で連結される２つのポリペプチドは、典型的には２つの独立した供給源に由来し、それゆえ自然界では通常連結して存在しない２つの連結したポリペプチドを含む。
ＦＳＨは、ヒトおよびタンパク質の動物において認められるホルモンである。これは脳下垂体前葉の性腺刺激細胞によって合成され、分泌される。ＦＳＨは、身体の発達、成長、思春期成熟および生殖過程を調節する。ヒトＦＳＨは、αおよびβサブユニットを含む３５．５ｋＤの糖タンパク質ダイマーである。αサブユニット（ＦＳＨα）は９２個のアミノ酸を含み、βサブユニット（ＦＳＨβ）は１１１個のアミノ酸を有する。その特異的な生物学的作用を付与し、ＦＳＨ受容体との相互作用の役割を担うのはβサブユニットである。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して、「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、同じである２つ以上の配列またはサブ配列を指す。２つの配列を、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いてまたは手作業によるアラインメントと目視検査によって測定されるように、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって比較し、最大の対応関係が得られるように整列した場合、２つの配列が、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定されるパーセンテージ（すなわち指定領域にわたって、または指定されない場合は配列全体にわたって６０％の同一性、場合により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性）を有すれば、２つの配列は「実質的に同一」である。同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド長（もしくは１０アミノ酸長）である領域にわたって、またはより好ましくは１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド長（もしくは２０、５０、２００以上のアミノ酸長）である領域にわたって存在してもよい。
「単離された」という用語は、分子がその天然環境から取り出されていることを意味する。しかし、分子と共に存在する成分の一部が「単離された」タンパク質と共に存在し続けてもよい。したがって、「単離されたポリペプチド」は、これが自然界で出現する通りではないが、実質的に１００％未満の純度のタンパク質であり得る。
比較のための配列のアラインメントの方法は当分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えばＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃ，１９７０の局所相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の相同性アラインメントアルゴリズムによって； Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８の類似性検索法によって；これらのアルゴリズムのコンピュータを用いた実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）；または手作業によるアラインメントと目視検査によって（例えばＢｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ ｅｄ．，２００３）参照）、実施することができる。配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの２つの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０にそれぞれ記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。
上述した配列同一性のパーセンテージ以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、以下で述べるように、第一核酸によってコードされるポリペプチドが、第二核酸によってコードされるポリペプチドに対して惹起される抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、あるポリペプチドは、例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、典型的には第二のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、以下で述べるように、これら２つの分子またはその相補物がストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅できることである。
満腹ホルモンであるレプチンは、体内に貯蔵される脂肪の量を調節する脂肪細胞によって産生されるホルモンである。レプチンは、空腹の感覚とエネルギー消費量の両方を調節することによってこれを行う。空腹は、貯蔵される脂肪の量が一定のレベルに達したとき抑制される（満腹）。その後レプチンが分泌され、身体中を循環して、最終的に視床下部の弓状核においてレプチン受容体を活性化する。エネルギー消費量は、脳へのシグナルによっておよび直接末梢標的上のレプチン受容体を介して増大する。レプチンの作用は、「空腹ホルモン」であるグレリンの作用と逆である。グレリン受容体はレプチン受容体と同じ脳細胞上に存在し、そのためこれらの細胞は、競合する満腹シグナルと空腹シグナルを受け取る。レプチンとグレリンは、多くの他のホルモンと共に、エネルギーホメオスタシスの複雑な過程に関与する。
「結合」は、２つの生体分子（例えばポリペプチドまたは２つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を作動可能にまたは機能的に連結する手段を指し、これには、限定されることなく、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合および静電結合が含まれる。「融合した」とは、共有結合による結合を指す。「リンカー」または「スペーサー」は、２つの生体分子を連結する分子または分子の群を指し、これら２つの分子を最小限の立体障害を伴う好ましい立体配置に置くのに役立つ。
核酸に言及する場合の「作動可能に連結された」という用語は、機能的関係にあるポリヌクレオチドエレメントの結合を意味する。ある核酸は、これが別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結されて」いる。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、これがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるとは、連結されているＤＮＡ配列が、典型的には近接しており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合は、近接して、リーディングフレーム内にある。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、プリンおよびピリミジン塩基、または他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有する、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。本発明の実施形態のポリヌクレオチドは、デオキシリボポリヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボポリヌクレオチド（ＲＮＡ）、または天然供給源から単離され得る、組換え生産され得るもしくは人工的に合成され得るリボポリヌクレオチドのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）の配列を包含する。ポリヌクレオチドのさらなる例は、ポリアミドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）である。ポリヌクレオチドおよび核酸は、一本鎖または二本鎖として存在し得る。ポリヌクレオチドの骨格は、ＲＮＡもしくはＤＮＡにおいて典型的に認められ得るように、糖類およびリン酸基、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分によって中断され得る。核酸、ポリヌクレオチドなどのヌクレオチドで作られたポリマーおよびポリヌクレオチドも、本明細書ではヌクレオチドポリマーと称され得る。
ポリペプチドは、アミド結合（ペプチド結合）を介して結合されたアミノ酸残基モノマーから成るポリマー鎖である。アミノ酸は、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体であり得る。一般に、ポリペプチドは、アミノ酸残基の長いポリマー、例えば少なくとも１０、２０、５０、１００、２００または５００以上のアミノ酸残基のモノマーから成るものを指す。しかし、特に断りのない限り、本明細書で使用されるポリペプチドという用語は、典型的には２個以上のアミノ酸モノマーを含むが、通常は１０、１５または２０個以下のアミノ酸モノマーを含む短いペプチドも包含する。
タンパク質は、ペプチド結合によって連結された、２本以上のポリペプチド鎖で構成され得るアミノ酸の長いポリマーである。より具体的には、「タンパク質」という用語は、特定の順序、例えばタンパク質をコードする遺伝子中のヌクレオチドの塩基配列によって決定される順序で、アミノ酸の１本以上の鎖で構成される分子を指す。タンパク質は、身体の細胞、組織および器官の構造、機能および調節に必須であり、各々のタンパク質は固有の機能を有する。例は、ホルモン、酵素および抗体である。一部の実施形態では、ポリペプチドおよびタンパク質という用語は交換可能に使用され得る。
「参照ポリペプチド」または「標的ポリペプチド」という用語も、別のタンパク質骨格（例えば抗体骨格）に組み込まれた誘導体ポリペプチドを作製するために本発明の方法において使用できる関心対象の分子を指すのに本明細書で使用される。好ましくは、本発明を実施するための標的ポリペプチドは、宿主細胞において細胞応答を調節するまたは誘発することができるシグナル伝達分子である。
天然の機能性リラキシン分子は、典型的にはＡ鎖およびＢ鎖を含む。インスリンと同様に、リラキシンは、最初に、Ｎ末端シグナル配列に結合した一本鎖構造として、未熟なプレプロホルモン、プロリラキシンとしてリボソーム上で合成される。シグナル配列は、リボソームユビキチンからのペプチドの輸送を指令する。シグナルペプチドの喪失後、プロリラキシンは共翻訳修飾によってプロホルモンに変換される。プロホルモンのタンパク質分解によってＣ鎖が除去され、Ａ鎖とＢ鎖の組み合わせが生じて、成熟した活性二本鎖ヘテロダイマーペプチドを形成する。この二本鎖構造では、Ａ鎖とＢ鎖は３つのジスルフィド結合によって架橋されており、２つはＡ鎖とＢ鎖の両方を連結し、１つはＡ鎖内の鎖内ジスルフィド結合である。ヒトリラキシン２の場合、そのＡ鎖とＢ鎖はそれぞれ２４アミノ酸（ＱＬＹＳＡＬＡＮＫＣＣＨＶＧＣＴＫＲＳＬＡＲＦＣ）（配列番号：４２）および２９アミノ酸（ＤＳＷＭＥＥＶＩＫＬＣＧＲＥＬＶＲＡＱＩＡＩＣＧＭＳＴＷＳ）（配列番号：４３）を含み、これらは３つのジスルフィド結合によって架橋されている。
細胞は、外因性または異種ポリヌクレオチドが細胞の内部に導入されている場合、このような外因性または異種ポリヌクレオチドによって「形質転換」されている。形質転換ポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに組み込まれて（共有結合で連結されて）いてもよくまたは組み込まれて（共有結合で連結されていなくてもよい。例えば原核生物、酵母および哺乳動物細胞では、形質転換ポリヌクレオチドはプラスミドなどのエピソームエレメント上に維持され得る。真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、形質転換ポリヌクレオチドが、染色体複製を介して娘細胞によって継承されるように染色体内に組み込まれたものである。この安定性は、形質転換ポリヌクレオチドを含有する娘細胞の集団から成る細胞株またはクローンを樹立する真核細胞の能力によって実証される。「クローン」は、有糸分裂によって単細胞からまたは共通の祖先から誘導される細胞の集団を指す。「細胞株」は、多数の世代にわたってインビトロで安定に増殖することができる初代細胞のクローンである。
参照ポリペプチドの「変異体」は、参照ポリペプチドの構造に由来する構造または参照ポリペプチドのものと類似の構造を有する分子を指す。典型的には、変異体は、制御されたまたはランダムな方法で参照ポリペプチドの化学的または生物学的修飾によって得られる。ポリペプチドの組換え修飾を実施するための方法は当分野で周知であり、例えば部位特異的突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ、制限消化と再連結、およびポリヌクレオチドシャッフリングが挙げられる。
「ベクター」または「構築物」は、別のポリヌクレオチドセグメントを、結合したセグメントの複製を生じさせるように結合し得る、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を指令することができるベクターは、「発現ベクター」と称される。
ＩＩＩ．別のタンパク質に組み込まれた機能性ポリペプチドを作製するための一般的スキーム
本発明は、エフェクターポリペプチド（または「ゲストポリペプチド」）が異なるまたは異種タンパク質骨格に組み込まれた機能性誘導体タンパク質またはポリペプチドを作製し、選択するための方法を提供する。異種タンパク質骨格は、天然または野生型環境ではこのエフェクターポリペプチドに連結されていない任意のタンパク質またはポリペプチド配列であり得る。一部の実施形態では、異種骨格（「ホストタンパク質」または「アクセプター骨格」）は抗体骨格である。様々なエフェクターポリペプチドまたはエフェクター分子を本発明の実施において使用することができる。本明細書ではエフェクターポリペプチドと称されるが、本発明に適するエフェクターポリペプチドには、短い機能性ペプチド、例えばわずか１０個のアミノ酸残基を含むペプチドも包含される。その生物学的活性の観点から、エフェクターポリペプチドは任意の生化学的性質であり得る。これらには、例えばサイトカイン、ホルモン、増殖因子およびホルモン、細胞受容体のペプチドまたはポリペプチドリガンドが含まれる。別のタンパク質に組み込まれた誘導体ポリペプチドを作製するのに本発明で使用できるエフェクターポリペプチドまたはペプチドの具体的な例には、例えばレプチン、グレリン、ＦＳＨ、リラキシン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターロイキン、インターフェロンおよびＴＮＦαが含まれる。本発明を、エフェクターポリペプチドの例としていくつかの機能性ポリペプチド（例えばレプチン、ＦＳＨ、リラキシンおよび他の免疫またはシグナル伝達調節因子）に関して本明細書で少し詳細に説明するが、他のエフェクターポリペプチドまたは機能性タンパク質も本発明の実施において用いることができる。
生物学的機能または細胞機能の多様性に加えて、本発明に適するエフェクターポリペプチドは、それらの大きさおよび天然構造においても実質的に異なり得る。一部の実施形態では、エフェクターポリペプチドは野生型一本鎖タンパク質である。一部の実施形態では、エフェクターポリペプチドは、複数鎖タンパク質に由来する一本鎖分子である。一般に、エフェクターポリペプチドは、少なくとも約１０個のアミノ酸残基を含む任意の機能性ポリペプチドまたはペプチドであり得る。一部の実施形態では、エフェクターポリペプチドは、約１０〜約１０，０００アミノ酸残基の長さを含む。一部の実施形態では、エフェクターポリペプチドは、約２５〜約１０００アミノ酸残基の長さを含む。一部の好ましい実施形態では、エフェクターポリペプチドは、約５０〜約２５０アミノ酸残基の長さを含む。したがって、本発明に適するポリペプチドまたはタンパク質は、約１ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ、好ましくは約２．５ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの分子量を有し得る。一部のより好ましい実施形態では、用いられるエフェクターポリペプチドは、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａまたは５０ｋＤａの分子量を有する。
別のタンパク質骨格（例えば抗体骨格）に組み込まれた機能性誘導体ポリペプチドを選択するために、天然エフェクターポリペプチド（またはその機能性フラグメント）を、エフェクターポリペプチドの機能および安定性を維持するまたは増強する助けとなる任意の位置でホスト骨格に導入し得る。これは、選択した挿入部位が、理想的にはエフェクターポリペプチドの生化学的機能または他の生物学的特性に負の影響を及ぼすべきでないことを意味する。一部の好ましい実施形態では、生じるキメラまたは融合分子は、天然ゲストポリペプチドの細胞または生化学的活性の少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上を保持すべきである。一部の実施形態では、エフェクターポリペプチドを、ホストタンパク質の特定のエピトープ、例えばＣＤＲループを置換することによってホスト骨格に挿入する。様々な実施形態では、挿入部位の選択は、挿入配列を収容できる領域を決定する、ホスト骨格の配列相同性分析に基づくことができる。
一部の実施形態では、ホスト骨格は抗体または抗原結合フラグメントである。抗体骨格は、本明細書で例示するｓｃＦｖなどの一本鎖抗体フラグメントであり得る。抗体骨格はまた、完全抗体、例えばＩｇＧ分子であり得る。複数鎖の抗体分子を使用する場合、エフェクターポリペプチド配列は、典型的には１本の免疫グロブリン鎖（例えば軽鎖または重鎖）に挿入される。これらの実施形態では、誘導体ポリペプチドを発現するため（および／または機能性選択のため）の宿主細胞は、典型的にはその他の抗体鎖も発現する。あるいは、誘導体ポリペプチドを発現するベクターは、その他の抗体鎖を発現する第二のオープンリーディングフレームも保有することができる。抗体をホスト骨格として使用する場合、機能性ポリペプチドによって置換すべきエピトープは、本明細書で例示するように、ＣＤＲまたはその部分であり得る。例えば、エフェクターポリペプチドは、アクセプター骨格のＣＤＲＨ１ループを置換することによって抗体骨格に挿入することができる。一部の他の実施形態では、ゲストポリペプチドは、ＣＤＲＨ１の外側の部位および／または他のＣＤＲ領域でホスト骨格に挿入することができる。本明細書（例えば実施例９）で詳述するように、ＣＤＲループ外のいくつかの部位における、本明細書で例示するｓｃＦｖ抗体骨格への短いペプチドの挿入も許容されることが認められた。
挿入したゲストエフェクターポリペプチドの天然の生化学的または細胞機能を維持するのを助けるために、ホスト骨格に天然エフェクターポリペプチドを挿入するのにＮ末端リンカーおよびＣ末端リンカーを使用する。天然ポリペプチドをホスト骨格に挿入するための結合部に多様性をもたらすため、リンカー配列のコンビナトリアルライブラリ（「コンビナトリアル結合部ライブラリ」）を使用して、ホストタンパク質骨格と組み込まれた天然エフェクターポリペプチドを含むハイブリッド分子のコンビナトリアルライブラリを作製する。エフェクター配列のＮ末端とＣ末端の両方で結合部を付加することにより、およそ１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０以上の誘導体分子の多様性をエフェクターポリペプチドに関して生み出すことができる。リンカー配列の多様性は、ハイブリッド分子のライブラリから、組み込まれた天然ポリペプチドがその生物学的またはシグナル伝達活性の１つ以上を保持することを可能にするリンカー配列を含む１つ以上の成員を選択することを可能にする。ホストタンパク質骨格に組み込まれる特定のエフェクターポリペプチドに依存して、結合部の異なるコンビナトリアルライブラリを本発明の選択方法において使用することができる。
一部の実施形態では、Ｎ末端リンカーおよびＣ末端リンカーは同一の配列を含む。一部の実施形態では、エフェクター配列に隣接するリンカー配列は異なる。様々な実施形態において、本発明のコンビナトリアル結合部ライブラリの成員は、少なくとも４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５または１００以上のアミノ酸残基の長さを含み得る。一部の好ましい実施形態では、ライブラリの成員リンカーは、短いペプチド、例えば約５〜約３０アミノ酸のペプチドである。ペプチドは、天然に存在するタンパク質の消化物、ランダムなペプチドまたは「偏りのある」ランダムペプチドであり得る。一部の実施形態では、ランダム化されたアミノ酸配列を、例えば機能性レプチン、ｓｃＦＳＨまたはｓｃリラキシン誘導体ポリペプチドを選択するために本明細書で例示するように、リンカーにおいて使用する。一部の実施形態では、コンビナトリアルライブラリの成員リンカーは完全にランダム化されており、いかなる位置においても配列の選択性または一定性を伴わない。一部の他の実施形態では、ライブラリにバイアスをかけることができる、すなわち配列内の一部の位置は、不変のままであるかまたは限られた数の可能性から選択される。例えば一部の場合には、アミノ酸残基は、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、架橋のためのシステイン、ＳＨ−３ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシンまたはヒスチジンの創出の方へ、またはプリンへと立体的に偏った（小さいまたは大きい）残基の規定されたクラスの中でランダム化される。
一部の実施形態では、ゲストポリペプチドを挿入するためのＮ末端リンカーおよびＣ末端リンカーの各々は、非ランダム化配列部分とランダム化配列セグメントを含む。これらの実施形態の一部では、Ｎ末端リンカーは、配列Ｘａ（ＧｂＳｃ）ｎ（配列番号：８６）またはＸａ（ＳｃＧｂ）ｎ（配列番号：８７）を含み、Ｃ末端リンカーは、アミノ酸配列（ＧｅＳｆ）ｍＸｄ（配列番号：８８）または（ＳｆＧｅ）ｍＸｄ（配列番号：８９）を含む。これらの配列式において、Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンであり、ｍおよびｎは、各々独立して１から６のランダムな数であり、ａおよびｄは、各々独立して１から５のランダムな数であり、ｂおよびｅは、各々独立して０から６のランダムな数であり、ならびにｃおよびｆは、各々独立して０から２のランダムな数である。加えて、複数のＧＳリッチリピートまたはセグメント（ＧｂＳｃ、ＳｃＧｂ、ＧｅＳｆまたはＳｆＧｅ）がリンカー配列中に存在する場合（すなわちｎおよび／またはｍが１より大きい場合）、各セグメント中のＧｌｙまたはＳｅｒ残基の数は、独立して、その他のセグメント中のＧｌｙまたはＳｅｒ残基の数と異なり得る。従来の遺伝子操作技術を、典型的には、リンカー配列を作製するためおよび別のタンパク質骨格に組み込まれた誘導体エフェクターポリペプチドのライブラリを発現するために本発明で使用する。本明細書で例示するように、エフェクターポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチド配列を、最初に、ランダム化されたＮ末端およびＣ末端結合配列を付加することによって修飾する。結合配列のコンビナトリアルライブラリによって隣接されたエフェクター配列を、次に、ホストタンパク質骨格（例えば抗体骨格）にクローニングすることができる。
別のタンパク質骨格に組み込まれた候補機能性誘導体ポリペプチド（例えばレプチンまたは他のホルモン）のライブラリを作製するために、参照エフェクターポリペプチド（例えばレプチン）をコードする遺伝子またはｃＤＮＡ配列の任意のものを用いることができる。完全長配列に加えて、参照エフェクターポリペプチドの機能的活性変異体またはフラグメントも使用し得る。一部の実施形態では、様々な種からの参照エフェクターポリペプチドの変異体を使用し得る。一部の実施形態では、変異体は、参照エフェクターポリペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重のために保存的に異なる配列である。これらはまた、参照ポリペプチドをコードする野生型配列と実質的に同一である配列も包含する。したがって、適切な変異体は、例えばコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらす配列多型に起因する、天然対立遺伝子変異体を包含する。このような変異体は、集団、例えばヒト集団内の個体間で存在し得る。本発明を実施するため、用いられる配列のヌクレオチド配列多型またはアミノ酸配列相違は、コードされるエフェクターポリペプチド（例えばレプチンまたはリラキシン）の機能的活性を変化させてはならない。参照エフェクターポリペプチドの適切な変異体は、例えば部位指定突然変異誘発を用いることによって作製されるが、本明細書で開示される参照エフェクターポリペプチドの生物学的またはシグナル伝達活性をまだ保有する、合成的に誘導されたヌクレオチド配列をさらに包含する。これらには、例えば生物学的またはシグナル伝達活性の変化をもたらさない、１つ以上の必須ではない残基における保存的アミノ酸置換を有する変異体が含まれる。
コンビナトリアル結合部配列のライブラリによって隣接されるエフェクター配列がひとたびホスト骨格に挿入されると、ホスト骨格に組み込まれた候補誘導体エフェクター分子のライブラリを、発現および機能性選択のために適切な系に導入することができる。最初に、候補誘導体または修飾エフェクターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適切な発現系に挿入し、候補エフェクターポリペプチドのライブラリを作製する。一部の実施形態では、発現ベクターは、改善されたタンパク質産生でクローンの選択を可能にするタンパク質収率パラメータを組み込むことができる。例えば、本明細書で例示するように、ベクターは、ｓｃＦｖ骨格のＣ末端に融合したｍＣｈｅｒｒｙをコードする配列を含むことができる。これは、機能アッセイ（例えば本明細書で例示するＦＲＥＴアッセイ）による選択の前に、高いｍＣｈｅｒｒｙシグナルに関する付加的なゲートを使用することによって高発現クローンの選択を可能にする。
発現後、様々な候補誘導体ポリペプチドを、機能性選択のために適切な宿主細胞の集団と接触させるまたは前記集団に導入することができる。一部の実施形態では、機能性レプチン、ＦＳＨおよびリラキシンポリペプチドを選択するために本明細書で例示するように、自己分泌に基づく選択系を機能性選択のために用いる。細胞受容体を介してシグナル伝達経路を媒介するエフェクターポリペプチド、例えばホルモン、サイトカインまたは他の種類のシグナル伝達媒介物質もしくは受容体リガンドのために、宿主細胞は、典型的にはエフェクターポリペプチドの対応する細胞受容体を発現する。一部の実施形態では、選択のために選ばれる宿主細胞は、エフェクターポリペプチドの細胞受容体を内因性に発現しない。これらの方法では、候補エフェクターポリペプチドの機能性選択のための宿主細胞を、受容体を発現するように操作することもできる。他の生化学的性質のエフェクターポリペプチド、例えば酵素に関しては、細胞によって発現されるエフェクターポリペプチドの酵素活性に応答する適切なレポーター系を容易に開発することができる。例えば、受容体シグナル伝達または酵素活性を観測するためのハイスループット形式の多くの周知のレポーターアッセイが使用でき、本発明の実施に適合させることができる。例えばＡｎｄｒｉｃｏｐｕｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００９，９，７７１；Ｄａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．，２００９，８６，１４１；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，２０１０，７３，５００；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２５，１６１参照。
本発明の候補エフェクターポリペプチドのライブラリを発現するおよび／または選択するための細胞株の構築は、当分野で周知の標準的な手順でまたは本明細書で述べる具体的な例示を用いて実施することができる。ポリペプチドライブラリを発現するための適切な宿主細胞または細胞株には、本明細書で例示するＨＥＫ２９３Ｔ細胞および当分野で周知の多くの他の細胞株、例えばＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＡｔＴ２０、ＢＶ２およびＮ１８細胞株が含まれる。一部の実施形態では、抗体骨格に組み込まれた候補エフェクターポリペプチドをウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターから発現させる。これらの方法では、候補エフェクターポリペプチドのコンビナトリアルライブラリをコードするベクター（例えばレンチウイルスベクター）のライブラリを、最初にウイルス産生細胞株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ）に導入し、ポリペプチドをコードするウイルスのライブラリを提供することができる。ウイルス産生細胞株は、機能性エフェクターポリペプチドの選択のための宿主細胞と同じ（例えば本明細書で例示するＨＥＫ２９３Ｔ細胞）であってもよくまたは異なっていてもよい。エフェクターポリペプチドの受容体を発現する宿主細胞にウイルスをトランスフェクトした後、候補ポリペプチドのライブラリを細胞において発現させる。
一部の実施形態では、候補エフェクターポリペプチドのライブラリを可溶性分子および分泌粒子（例えば本明細書で例示する可溶性ｓｃリラキシン分子）として発現させる。一部の他の実施形態では、候補エフェクターポリペプチドを、細胞膜に係留された分子のライブラリとして発現させる。候補エフェクターポリペプチドの膜係留ライブラリを発現させるために、抗体骨格配列をＮ末端またはＣ末端で膜貫通ドメインに作動可能に連結する。当分野で公知の任意の膜貫通タンパク質ドメイン、例えばＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインを本発明のこれらの実施形態において使用し得る。例えばＲｅｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：１６７９−１６８９，２０００；およびＨｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ａｄｈ．Ｍｉｇｒ．４：３１３−３２４，２０１０参照。一部の実施形態では、骨格配列を、短いリンカーペプチドまたはリンカー配列を介して膜貫通ドメインと結合する。例えばＧＧＧＧＳ（配列番号：４）の縦列反復配列を含むリンカーペプチドを、膜貫通ドメインを結合するのに使用することができる。
ホスト骨格に組み込まれた機能性ポリペプチドを同定するために、クローニングおよび選択工程を各回の選択後に反復することができる。ひとたびレポーターアッセイ（例えばコグネイト受容体の活性化）から候補機能性ポリペプチドが同定されれば、候補ポリペプチドをコードする対応するポリヌクレオチド配列を単離し、増幅し、発現ベクターに再クローニングして、候補エフェクターポリペプチドの濃縮されたライブラリを提供することができる。このような濃縮された候補エフェクターライブラリを、機能性ｓｃリラキシン−Ｈ２アゴニストポリペプチドの選択に関して本明細書で例示するように、次の回の選択において用いることができる。その後の回の選択では、先の選択で同定されたＮ末端またはＣ末端リンカーのいずれかを不変のままに保つことができ、その他のリンカーは、先に使用された同じランダムな配列で構成することができる。
本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターの構築は、分子生物学の日常的に実施される方法に従って容易に行うことができる。本発明の必要な段階を実施するための一部の具体的なプロトコルも本明細書で例示する。ポリペプチドの発現は、例えば細菌、ウイルス、酵母、真菌、昆虫または哺乳動物発現系を含むベクターを包含する、数多くの種類の当分野で公知の適切な発現ベクターを用いることができる。本明細書で例示するように、本発明の融合ポリペプチドライブラリを作製するための好ましい発現系は、レンチウイルスに基づく。このような発現ベクターを得るおよび使用するための方法は周知である。本発明の組成物または方法に使用されるこの分子生物学技術や他の分子生物学技術の指針については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８：２７７−２９８（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６２，（Ｔｕａｎ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｄｉｔｉｏｎ）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｕｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｄｉｔｉｏｎ）参照。
選択した、ホスト骨格に組み込まれた機能性エフェクターポリペプチドを、インビトロおよびインビボでの生物学的またはシグナル伝達活性に関してさらに検討することができる。選択に使用される特定のエフェクターポリペプチドに依存して、同定された誘導体ポリペプチドが所望の特性を有することを確認するために様々な方法が使用できる。例えば、機能性レプチン誘導体ポリペプチドを選択することに関して本明細書で例示するように、同定された、抗体骨格に組み込まれた機能性レプチン分子のインビボ活性をＦＲＥＴアッセイまたは本明細書で詳述する直交増殖アッセイによって検討することができる。同定された分子のインビボ試験も、これらのインビボ活性、例えば安定性ならびに他の生物活性、例えば血液脳関門を横断する能力および代謝応答を誘発する能力を検討するために実施できる。いくつかの特定の抗体に組み込まれたｓｃリラキシン−Ｈ２アゴニストに関して本明細書で例示するように、異種タンパク質骨格に組み込まれた任意の他の同定されたエフェクターポリペプチドのインビトロおよびインビボ活性を検討するために同様の試験を設計することもできる。
ＩＶ．抗体に組み込まれた機能性レプチンまたはｓｃＦＳＨポリペプチドの選択
例示として、いくつかの特定の機能性ポリペプチドをｓｃＦｖ抗体骨格に挿入し、生じた融合ポリペプチドのライブラリを、上述したスキームに従って機能性に関して選択した。これらには、以下の実施例で詳述するレプチンおよびＦＳＨが含まれる。ヒトおよび多くの非ヒト種由来のレプチン遺伝子が当分野で単離され、特徴付けられている。これらのレプチン配列のいずれもが、本発明の実施において容易に使用できる。例えばＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：４２５−３２，１９９４；Ｉｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（４６），２７７２８−２７７３３，１９９５；Ｉｗａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．６８（２），１０９−１１４，２０００；Ｋｏｎｆｏｒｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ １０，１１４２−１１４５，１９９９；およびＭｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０９（３），９４４−９５２，１９９５参照。加えて、様々なレプチン類似体も、本発明のレプチン融合分子を構築するのに使用し得る。例としては、メトレレプチン、ＰＥＧ−レプチン類似体および様々な他のレプチン類似体が含まれる。例えばＭｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．１８：３８３−９３，２０１２；Ｓａｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．４７：１２８−１３６，２００６参照。メトレレプチン（商品名Ｍｙａｌｅｐｔ）はヒトレプチンの類似体である。この化合物は、脂肪異栄養症を含む代謝障害に関して日本で、ならびに先天性または後天性の全身性脂肪異栄養症を有する人々における、糖尿病および高トリグリセリド血症を含むレプチン欠損の合併症のための処置として米国でも承認されている。本発明の方法で作製し、選択することができるこれらのレプチン類似体の機能性誘導体は、改善された活性を有する治療薬を提供する。
ヒトＦＳＨのαおよびβサブユニットならびに多くの他の非ヒト種由来のオルソログのヌクレオチドおよびアミノ酸配列も当分野で公知である。例えばＳａｘｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，９９３−１００５，１９７６；Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ６，２０５−２１２，１９８７；Ｓｈｏｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．７，３２５−３３９，１９８８；Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１６８９９−１６９０３，２００２；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １６６，３３３−３３４，１９９５；Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，６３９１，１９８９；Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎ．Ｃｏｍｐ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４７，２３１−２３５，２００６；およびＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎ．Ｃｏｍｐ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２５，３７５−３８６，２００２参照。これらの特定のレプチンおよびＦＳＨ配列に加えて、レプチン（例えばヒトレプチン）またはＦＳＨ（例えばヒトＦＳＨ）の実質的に同一の配列を有する変異体または機能性フラグメントも、抗体骨格に組み込まれた誘導体分子を作製するために本発明において使用できる。
本明細書で明らかにされるように、機能性誘導体分子を選択するため、ホスト骨格に挿入するために天然ダイマーＦＳＨを一本鎖分子に変換することができる。一本鎖ＦＳＨ分子の生物学的機能を確保するため、コネクタまたはリンカーを使用することができる。本明細書で例示するように、天然ヒトＦＳＨダイマーは、ＧＳＧＳＮＡＴＧＳＧＳＮＡＴＳＧＳＴＳ（配列番号：３３）ペプチドリンカーをコードする、
ＧＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＧＡＡＣＧＣＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＡＡＴＧＣＡＡＣＴＴＣＡＧＧＡＴＣＧＡＣＴＡＧＴ（配列番号：２）
の配列を有するコネクタを介してαおよびβサブユニットをコードする配列を連結することによって一本鎖分子に変換できる。その後、結合した一本鎖分子を、本明細書で述べるＮ末端リンカー配列およびＣ末端リンカー配列のライブラリでさらに修飾することができる。生じた誘導体ｓｃＦＳＨ分子のライブラリを、次に、組換えによってホスト骨格にクローニングすることができる。
レプチンまたはｓｃＦＳＨをｓｃＦｖ骨格に挿入するためのリンカーのコンビナトリアルライブラリは、上述した結合部配列を用いて調製できる。エフェクターポリペプチドへのランダム化リンカー配列の融合は、本明細書で例示する標準的なＤＮＡクローニング技術で容易に実施できる。抗体に組み込まれたレプチンまたはｓｃＦＳＨの候補融合分子のライブラリの発現後、機能性部分を実施することができる。具体的には、本発明の一部の実施形態は、機能性レプチン誘導体の選択を対象とする。これらの実施形態では、レプチン受容体によって媒介されるシグナル伝達活性に応答して検出可能なレポーター分子（例えばβ−ラクタマーゼ）を発現するレポーター細胞株を用いることができる。例えば、レポーター細胞株は、本明細書で例示するＳｉｓ誘導エレメント（ＳＩＥ）の制御下でβ−ラクタマーゼレポーター遺伝子を発現することができる。レポーター細胞株を誘導体または融合レプチン分子のライブラリと接触させた後、レポーター分子（例えばβ−ラクタマーゼ）の最も強い発現を有する細胞を、例えばＦＡＣＳを用いて、容易に単離することができる。同様に、機能性ＦＳＨ誘導体分子を選択するために、宿主細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）は、ＦＳＨ受容体およびレポーター分子（例えばβ−ラクタマーゼ）をサイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の制御下で発現することができる。次に、誘導体または融合ｓｃＦＳＨ分子のライブラリを、最強応答を与える機能性ＦＳＨ誘導体に関して選択する。
抗体骨格に組み込まれた機能性レプチンまたはｓｃＦＳＨ分子を選択するために、最初に、連結リンカーに隣接するレプチンまたはｓｃＦＳＨポリペプチドのライブラリを上記で論じたように作製する。Ｎ末端およびＣ末端のランダムなリンカー配列は、２、３、４、５または６以上のランダム化残基のペプチドセグメントを含むことができる。リンカー配列はさらに、１つ以上のＧｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチドセグメントも含有できる。一部の実施形態では、リンカーは、同じＧｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチドセグメントの２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の縦列反復配列（例えばＧＧＧＧＳ配列）を含む。他の実施形態では、いくつかの異なるＧｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチドセグメントの各々の１つ以上のコピーがランダムなリンカー配列中に存在する。具体的な例として、リンカーは、レプチンおよびｓｃＦＳＨを挿入することに関して本明細書で例示するように、ランダムな３残基モチーフおよびＧＧＧＧＳ（配列番号：４）配列の数コピーを含むことができる。
候補融合分子のライブラリから機能性レプチンまたはｓｃＦＳＨポリペプチドを同定するために、自己分泌に基づくレポーター系を、一部の実施形態では、エフェクターポリペプチドによるシグナル伝達を証明する表現型の検出に用いる。レポーター系を用いて、エフェクターポリペプチドの受容体（例えばレプチン受容体）および検出可能なレポーター（例えばエフェクターポリペプチドのシグナル伝達に応答性である調節配列の制御下でのβ−ラクタマーゼ）を発現するベクターを宿主細胞に導入することができる。レプチンおよびＦＳＨに関して本明細書で例示するように、改変される特定の表現型は、活性、シグナル伝達経路またはレポーター細胞の集団においてエフェクターポリペプチドによって媒介される細胞過程である。関心対象の表現型の変化を引き起こすことができる候補ペプチドを、「抗体骨格に組み込まれたエフェクターポリペプチドの機能性誘導体分子」（または「エフェクターポリペプチドの抗体に組み込まれた機能性誘導体」）として同定する。特定のエフェクターポリペプチドおよびその細胞受容体に依存して、本発明において観測される表現型またはシグナル伝達経路は、受容体によって媒介される任意の細胞活性または生理的機能であり得る。しかし、一部の好ましい実施形態では、選択方法において観測される表現型またはシグナル伝達経路は、宿主細胞に導入されたレポーター分子の応答（例えばレポーター遺伝子の発現）である。これは、候補ポリペプチドのライブラリから、エフェクターポリペプチドの受容体を活性化することによってレポーター分子の発現を誘導することができる１つ以上の機能性誘導体エフェクターポリペプチドを自己分泌選択することを可能にする。本明細書で例示する自己分泌レポーター系以外に、古典的内分泌、パラ分泌または細胞内分泌シグナル伝達に基づく他のレポーター系も、エフェクターポリペプチドの特定の生化学的性質に依存して、開発し、本発明の実施において用いることができる。
Ｖ．抗体に組み込まれた機能性ｓｃリラキシンポリペプチドの選択
別のタンパク質骨格に組み込まれた機能性ポリペプチドを同定するための本発明の方法の一般的適用性のさらなる例示として、本発明は、ｓｃＦｖに組み込まれた機能性リラキシンアゴニストを選択するための方法も提供する。本発明の機能性リラキシンアゴニストは、異種抗体骨格（例えばｓｃＦｖ骨格）に組み込まれた一本鎖リラキシン関連ポリペプチドを含む。任意のリラキシン分子またはインスリン−リラキシンスーパーファミリーの他の成員（特にヒトリラキシン分子）およびこれらのオルソログもしくは変異体を、本発明の機能性一本鎖抗体−リラキシン誘導体融合物の構築において使用することができる。リラキシン誘導体を構築するために、天然リラキシン分子のＡ鎖およびＢ鎖を含む一本鎖ポリペプチドを、好ましくは組換え法によって、最初に作製する。一本鎖リラキシン分子の生物学的機能を確保するため、ループ配列（コネクタまたはリンカー）を使用して２本の鎖を連結することができる。本発明の一部の実施形態では、天然リラキシン鎖を、（ＧＳ）ｎ（配列番号：４４）［式中、ｎ＝３〜５］の配列を有するコネクタによって連結できる。本明細書で例示するように、一部の抗体に組み込まれた機能性ｓｃリラキシン−Ｈ２アゴニストは、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号：４５）のループ配列によって連結されたＡ鎖およびＢ鎖を有する。その後、結合した一本鎖分子を、本明細書で述べるＮ末端リンカー配列およびＣ末端リンカー配列のライブラリでさらに修飾することができる。生じた誘導体ｓｃリラキシン分子のライブラリを、次に、組換えによってホスト骨格にクローニングすることができる。
任意の天然リラキシン分子からのＡ鎖およびＢ鎖を、タンパク質骨格に組み込まれた候補機能性ｓｃリラキシン誘導体を作製するために本発明において使用することができる。一部の好ましい実施形態では、本発明の候補機能性リラキシン誘導体は、ヒトリラキシン２（Ｈ２）のＡ鎖およびＢ鎖から構築された一本鎖ポリペプチドを含む。ヒトリラキシン２は、コラーゲン代謝および多数の血管制御経路の調節を含む、多くの治療上関わりのある生理的作用に関連するペプチドホルモンである。リラキシン−Ｈ２の２本の鎖の配列は周知であり、当分野で特徴付けられている。ヒトプロリラキシン２アミノ酸配列（およびコードヌクレオチド配列）は、受入番号Ｐ０４０９０、ＮＰ＿６０４３９０．１（ＮＭ＿１３４４４１．２）、ＮＰ＿００５０５０．２（ＮＭ＿００５０５９．３）およびＮＰ＿６０４３９０（ＮＭ＿１３４４４１．２）で報告されている。リラキシン−Ｈ２のヒトリラキシン２のＡ鎖およびＢ鎖は、組換え技術によって容易に得られる。ヒトリラキシン２に加えて、他の天然リラキシン分子およびオルソログの配列も、本発明の候補機能性リラキシン誘導体の構築において使用できる。これらには、例えばヒトリラキシン１、ヒトリラキシン３、ならびに他の霊長動物からのリラキシン１およびリラキシン２オルソログ、ならびに他の哺乳動物からのリラキシン分子が含まれる。これらのリラキシン分子の配列も当分野で周知である。これらには、ヒトリラキシン１配列（Ｐ０４８０８、ＮＰ＿００８８４２．１、ＮＭ＿００６９１１）、ヒトリラキシン３（Ｑ８ＷＸＦ３、ＮＰ＿５４３１４０、ＮＭ＿０８０８６４）、チンパンジープロリラキシン２（ＥＵ４３７４４２．１）、サルプロリラキシン（ＡＣＡ１３５７４．１、ＥＵ４３７４４３）、マウスプロリラキシン（ＡＡＩ３２６５７．１、ＢＣ１３２６５６）、ゼブラフィッシュリラキシン（ＡＥＬ２２１１５．１、ＪＮ２１５２１２）、オオカミプロリラキシン（ＡＡＦ６０３０２．１、ＡＦ２３３６８７）およびブタプレプロリラキシ（Ｋ０１０８８、ＡＡＡ３１１１４．１）が含まれる。例えばＣｒａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：２３４１−２３４５，１９８４；Ｓｔｕｌｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９：６５５−６６４，１９９０；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３，２３３３−２３３９，１９８４；Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６６５６−６６６４，１９８８；およびＢａｔｈｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，１１４８−１１５７，２００２参照。これらのリラキシン配列のいずれもが、本発明の候補リラキシン融合分子を構築するのに容易に使用できる。
天然リラキシン分子に加えて、天然リラキシン分子に由来する他の変異体または類似体も、本発明を実施するために候補ｓｃリラキシン誘導体ポリペプチドを構築するのに使用できる。これらには、例えば天然リラキシンペプチド（例えばヒトリラキシン２）と実質的に同一（例えば少なくとも９０％または９５％同一）である配列を含むリラキシン変異体または類似体が含まれる。一部の実施形態では、変異体は、参照リラキシンポリペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重のために保存的に異なる配列である。これらは、リラキシンの生物学的機能に必須ではない１つ以上の部位に構造的変化を有する機能性誘導体も包含する。したがって、一部の実施形態では、本発明に適するリラキシン変異体または機能性誘導体は、天然リラキシン分子（例えばヒトリラキシン２）に比べて、その結合またはシグナル伝達活性に必須の保存された残基を含むが、それ以外は配列多様性、例えば保存されていない位置における置換またはＡ鎖のＮ末端における欠失を有するペプチドを包含する。例として、本発明を実施するための機能性の抗体に組み込まれたｓｃリラキシン−Ｈ２は、Ａ鎖におけるＡ２１Ｓ置換および／またはＢ鎖におけるＡ２１Ｖ置換を有する分子を含む。
アゴニスト選択に適するリラキシン変異体を設計するために、受容体相互作用に重要であることが公知の構造モチーフまたは残基のいずれかが維持されるべきである。例えば、ヒトリラキシン２の活性部位がＢ鎖ヘリックスの中間領域およびＡ鎖のＣ末端領域から成ることは公知である。例えばＰａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，３２０９９−３２１０９，２００８；およびＨｏｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．１１，７１９−７２４，２０１０参照。具体的には、ヒトリラキシン２の一次構造と異なる種由来のリラキシンペプチドとの比較は、２個のアルギニン残基がαヘリックスの同じ表面に位置するＢ鎖の中間領域における顕著な配列類似性を明らかにする。これら２個のアルギニン（Ａ１３およびＡ１７）は、正電荷および各Ａｒｇの側鎖のグアニジン基によって作られる水素結合ネットワークの両方によってＲＸＦＰ１受容体に結合する。加えて、Ｂ鎖の３番目のアミノ酸、ＩｌｅＢ２０も、ＲＸＦＰ１への結合に必須であることが報告されている。Ｂ鎖中のこのモチーフ以外に、ヒトリラキシン２のＡ鎖中の残基Ｔｈｒ１６、Ｌｙｓ１７およびＰｈｅ２３も、ＲＸＦＰ１またはＲＸＦＰ２受容体のいずれかとの相互作用に関与する。さらに、ヒトリラキシン２のＡ鎖のＮ末端は機能的役割を持たないこと、ならびにＡ鎖のＮ末端の４残基までの短縮はＲＸＦＰ１およびＲＸＦＰ２の結合または活性化に影響を及ぼさないことが報告された。例えばＢｕｌｌｅｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５，５９９８−６００４，１９８６；Ｂｕｌｌｅｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１２４９６−１２５０１，１９８７；およびＨｏｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１７２８７−１７２９７，２００８参照。
一本鎖リラキシンポリペプチドをホスト骨格に挿入するためのＮ末端およびＣ末端リンカーのライブラリは、上述したスキームに従って設計することができる。一部の実施形態では、リンカーは、３〜５個のランダム化残基のランダムなモチーフおよび１つ以上の付加的なＧＳリッチセグメントを含むことができる。リラキシン−Ｈ２に関して本明細書で例示するように、ｓｃリラキシンポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチド配列は、配列Ｘａ（ＧＧＧＧＳ）ｂ（ＧＧＧＳ）ｃ（ＧＧＳ）ｄ（配列番号：８２）またはＸａ（ＧＧＳ）ｅ（配列番号：８３）を有するＮ末端リンカーおよび配列（ＳＧＧＧＧ）ｆ（ＳＧ）ｇＸａ（配列番号：８４）または（ＳＧＧＧＧ）ｆＳｇＸａ（配列番号：８５）を有するＣ末端リンカーをそれぞれコードする結合配列を付加することによって修飾される。これらの配列式の各々において、Ｘはランダム化されたアミノ酸残基であり、ａは２から４のランダムな数であり、ｂおよびｆは、各々独立して１から２のランダムな数であり、ｅは１から３のランダムな数であり、ならびにｃ、ｄおよびｇは、各々独立して０から２のランダムな数である。一部の実施形態では、Ｎ末端リンカーは、ランダム化残基に加えてＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：４６）またはＧＧＳＧＧＳ（配列番号：４７）の配列を含み、Ｃ末端リンカーは、ランダム化残基に加えてＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号：４８）またはＳＧＧＧＧＳ（配列番号：４９）の配列を含む。末端リンカーが修飾されたｓｃリラキシンポリペプチドは、挿入がゲスト分子の機能を阻害しないまたは生じる融合ポリペプチドの構造的完全性を実質的に損なわない限り、抗体配列の任意の部分に挿入するおよび／または任意の部分を置換することができる。一部の実施形態では、修飾されたｓｃリラキシン配列を相補性決定領域（ＣＤＲ）に挿入することができる。典型的には、挿入部位の選択は、挿入配列を収容できる領域を位置付けるためのホスト骨格の配列相同性分析に基づき得る。ヒトリラキシン２に関して本明細書で例示するように、末端リンカーが修飾されたｓｃリラキシン−Ｈ２配列（例えばクローンＡ３、Ｃ１２−２およびＣ１２−１に関してそれぞれ配列番号：６９、７１および７２）を、抗体のＨＣＤＲ３領域（配列番号：３）を置換することによってｓｃＦｖホスト配列（配列番号：１）に挿入し、候補の抗体に組み込まれたｓｃリラキシンポリペプチドを作製することができる。
リンカーに隣接するｓｃリラキシン配列のｓｃＦｖ骨格への挿入およびその結果生じた、ホスト骨格に組み込まれた候補ｓｃリラキシン分子のライブラリの宿主細胞における発現は、上述したように実施することができる。発現後、抗体に組み込まれた様々な候補ｓｃリラキシンポリペプチドを、機能性選択のために適切な細胞集団と接触させるまたは前記集団に導入することができる。これらの細胞は、典型的にはリラキシンポリペプチドの対応する細胞受容体（例えばＲＸＦＰ１、ＲＸＦＰ２、ＲＸＦＰ３またはＲＸＦＰ４）を発現する。一部の実施形態では、選択のために選ばれる宿主細胞は、リラキシンポリペプチドの細胞受容体を内因性に発現しない。これらの方法では、候補ｓｃリラキシンポリペプチドの機能性選択のための宿主細胞を、受容体を発現するように、例えば本明細書で例示するヒトＲＸＦＰ１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のように操作することもできる。
ライブラリから機能性ｓｃリラキシンポリペプチドを同定するために、リラキシンポリペプチドによるシグナル伝達を証明する表現型の検出にレポーター系を用いる。ヒトリラキシン２の場合、レポーター細胞株は、ＲＸＦＰ１受容体およびレポーター分子（例えばβ−ラクタマーゼ）を発現する細胞株であり得る。レポーター細胞は、本明細書で例示するＨＥＫ２９３Ｔ細胞または当分野で周知の任意の他の細胞または細胞株であり得る。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を例示として使用して、ＲＸＦＰ１受容体（またはＲＸＦＰ２、ＲＸＦＰ３、ＲＸＦＰ４）の発現を適切なプロモーター配列、例えばＥＦ−１αプロモーターの制御下に置くことができ、β−ラクタマーゼなどのレポーター分子をサイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の制御下で発現させることができる。レポーター細胞株を、抗体に組み込まれたｓｃリラキシン分子のライブラリと接触させた後、レポーター分子（例えばβ−ラクタマーゼ）の最も強い発現を有する細胞を、例えばＦＡＣＳを用いて、容易に選択することができる。次に、機能性ｓｃリラキシンアゴニストポリペプチドまたは誘導体を、選択した細胞から単離することができる。
Ｖ．抗体骨格に組み込まれた修飾エフェクターポリペプチド
本発明は、異種タンパク質骨格に組み込まれた誘導体または修飾エフェクターポリペプチドを提供する。これらの修飾エフェクターポリペプチドの一部は、組み込まれたポリペプチドの天然の生化学的または細胞活性を実質的に維持する。上記で述べたように、任意のエフェクターポリペプチド（例えばホルモン、受容体リガンドまたは酵素）を、本明細書で述べる方法に従ってこのような機能性誘導体分子を構築するのに使用することができる。したがって、本発明の修飾エフェクターポリペプチドの一部は、細胞受容体のリガンドに由来する。本発明の一部の修飾エフェクターポリペプチドは、異なるタンパク質骨格に組み込まれたホルモン分子である。一部の実施形態では、異種骨格に組み込まれたエフェクターポリペプチドは、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａの分子量を有する。
一部の実施形態では、誘導体エフェクターポリペプチドにおけるホストタンパク質骨格は抗体骨格である。例えば、本発明の一部の好ましい実施形態は、ゲストエフェクターポリペプチドを組み込むためにｓｃＦｖ抗体を利用する。これらの修飾エフェクターポリペプチドの一部では、抗体骨格の相補性決定領域（ＣＤＲ）がエフェクターポリペプチドで置換されている。例えば、本発明の一部の修飾エフェクターポリペプチドは、抗体配列のＨＣＤＲ３ループ（ＬＧＩＴＫＴＳＴＣＹＴ；配列番号：３）を置換することによって配列番号：１のｓｃＦｖ抗体骨格に組み込まれたゲストポリペプチドを含む。
典型的には、エフェクターポリペプチドは、挿入されたゲストポリペプチドの正しい構造および生化学的または細胞機能を維持するためのＮ末端リンカーおよびＣ末端リンカーを有する抗体配列に連結される。様々な実施形態において、Ｎ末端リンカーは、アミノ酸配列Ｘａ（ＧｂＳｃ）ｎ（配列番号：８６）またはＸａ（ＳｃＧｂ）ｎ（配列番号：８７）を含むことができ、Ｃ末端リンカーは、アミノ酸配列（ＧｅＳｆ）ｍＸｄ（配列番号：８８）または（ＳｆＧｅ）ｍＸｄ（配列番号：８９）を含むことができる。これらの配列において、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンであり、ｍおよびｎは、各々独立して、境界を含む１から６のランダムな数であり、ａおよびｄは、各々独立して１から５のランダムな数であり、ｂおよびｅは、各々独立して０から６のランダムな数であり、ならびにｃおよびｆは、各々独立して０から２のランダムな数である。加えて、ＧＳリッチセグメントの複数のコピーが存在する場合（すなわちｎおよび／またはｍが１より大きい場合）、各ＧＳリピート中のｂ、ｃ、ｅまたはｆは、それぞれその他のＧＳリピート中のｂ、ｃ、ｅまたはｆとは異なり得る。
本発明はまた、抗体骨格に組み込まれた特定の機能性レプチンホルモン分子または修飾された誘導体も提供する。同様に、抗体骨格に組み込まれた修飾ＦＳＨホルモン分子も本発明で提供される。本発明はさらに、抗体骨格に組み込まれた特定の機能性一本鎖ヒトリラキシン２（ｓｃリラキシン−Ｈ２）アゴニスト分子または修飾された誘導体を提供する。抗体骨格は、本明細書で述べるまたは当分野で周知の一本鎖形式で作製され得る任意の抗体フラグメントであり得る。一部の実施形態では、リラキシン誘導体融合物を構築するために使用される抗体骨格はｓｃＦｖ配列である。ｓｃＦｖ配列は、任意の公知のｓｃＦｖ抗体配列（例えば公知のヒトｓｃＦｖ）または他の免疫グロブリン分子の可変フラグメントから容易に作製できるものであり得る。例示的なヒトｓｃＦｖ骨格抗体配列を配列番号：１に示す。これらの分子の一部では、ｓｃリラキシン−Ｈ２ポリペプチドは抗体骨格のＨＣＤＲ３ループに組み込まれて、これを置換する。
本明細書の実施例で詳述するように、本発明の特定の抗体骨格に組み込まれたレプチンまたはｓｃＦＳＨ分子は、自己分泌に基づく機能性選択を介して同定される。これらの特定の機能性レプチンまたはＦＳＨ誘導体は、天然のホルモンと比べて類似のまたはより良好な生物学的および／または医薬活性を有する。ホスト抗体配列および天然ホルモンポリペプチド配列に加えて、これらの機能性分子は、挿入された天然ホルモン配列とホスト抗体配列を結合する特定のＮ末端およびＣ末端リンカー配列を含む。これらのリンカー配列は、正しい折りたたみを確保し、生物学的活性を維持することを意図する。例えば、抗体骨格に組み込まれたレプチン分子の一部は、（１）ＬＧＶＧＧＧＧＳ（配列番号：５）およびＧＧＧＧＳＥＲＴ（配列番号：６）；（２）ＨＬＴＧＧＧＧＳ（配列番号：７）およびＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＤＰＳ（配列番号：８）；（３）ＰＷＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：９）およびＧＧＧＧＳＱＰＰ（配列番号：１０）；（４）ＫＴＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：１１）およびＧＧＧＧＳＳＤＥ（配列番号：１２）；または（５）ＫＶＴＧＧＧＧＳ（配列番号：１３）およびＧＧＧＧＳＱＬＥ（配列番号：１４）に示す配列とそれぞれ同一または実質的に同一であるＮ末端リンカー配列およびＣ末端リンカー配列を含む。同様に、本発明の一部の抗体骨格に組み込まれたｓｃＦＳＨ分子は、（１）ＲＳＨＧＧＧＧＳ（配列番号：１５）およびＧＧＧＧＳＶＮＰ（配列番号：１６）；（２）ＱＲＶＧＧＧＧＳ（配列番号：１７）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＡ（配列番号：１８）；または（３）ＲＶＬＧＧＧＧＳ（配列番号：１９）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＳＳ（配列番号：２０）に示す配列とそれぞれ同一または実質的に同一であるＮ末端リンカー配列およびＣ末端リンカー配列を含む。
同様に、本発明の特定の抗体骨格に組み込まれたｓｃリラキシン−Ｈ２分子も、機能性選択を介して同定される。これらの特定の機能性リラキシン誘導体は、天然のリラキシン−Ｈ２分子と比べて類似のまたはより良好な生物学的および／または医薬活性を有する。ホスト抗体配列ならびに天然リラキシンポリペプチド配列のＡ鎖およびＢ鎖配列に加えて、これらの機能性分子は、挿入された天然ホルモン配列とホスト抗体配列を結合する特定のＮ末端およびＣ末端リンカー配列を含む。これらのリンカー配列は、ｓｃリラキシン−Ｈ２ポリペプチドの正しい折りたたみを確保し、生物学的活性を維持することを意図する。本発明の一部の実施形態では、ｓｃリラキシンアゴニストは、ＨＣＤＲ３中のＬＧＩＴＫＴＳＴＣＹＴ（配列番号：３）ループがｓｃリラキシンポリペプチドで置換されていることを除き、配列番号：１に示すｓｃＦｖ抗体骨格配列を含む。これらの実施形態の一部では、Ｎ末端リンカー配列は、配列ＸＸＸＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：７８）またはＸＸＸＧＧＳＧＧＳ（配列番号：７９）を含み（またはこれから成り）、およびＣ末端リンカー配列は、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＸＸＸ（配列番号：８０）またはＳＧＧＧＧＳＸＸＸ（配列番号：８１）を含み（またはこれから成り）、式中、Ｘはランダム化されたアミノ酸残基である。
本発明の一部の特定のリラキシンアゴニストポリペプチドは、本明細書で例示する一対のリンカー配列を用いてｓｃＦｖ抗体骨格に挿入されたｓｃリラキシン−Ｈ２配列を有する。これらは、（１）ＲＴＲＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５０）およびＳＧＧＧＧＳＬＭＳ（配列番号：５１）（クローンＡ３）；（２）ＲＴＲＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５０）およびＳＧＧＧＧＳＫＰＰ（配列番号：５２）（クローンＡ１２−２）；（３）ＰＬＮＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５３）およびＳＧＧＧＧＳＫＰＰ（配列番号：５２）（クローンＣ１２−１）；（４）ＬＰＲＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５４）およびＳＧＧＧＧＳＬＤＳ（配列番号：５５）；（５）ＱＴＴＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５６）およびＳＧＧＧＧＳＫＧＴ（配列番号：５７）；（６）ＨＭＦＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５８）およびＳＧＧＧＧＳＫＡＰ（配列番号：５９）；（７）ＱＲＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：６０）およびＳＧＧＧＧＳＷＳＰ（配列番号：６１）；（８）ＲＱＲＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：６２）およびＳＧＧＧＧＳＶＲＡ（配列番号：６３）；（９）ＲＬＴＧＧＳＧＧＳ（配列番号：６４）およびＳＳＧＧＷＳＡＧＧＧＳＧＶＲＳ（配列番号：６５）；または（１０）ＲＮＲＧＧＧＧＳＧＧＲＳＧＧＳ（配列番号：６６）およびＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＲＰ（配列番号：６７）に示す配列とそれぞれ同一または実質的に同一であるＮ末端リンカー配列およびＣ末端リンカー配列を含む。本明細書で例示するいくつかの機能性の抗体に組み込まれたｓｃリラキシン−Ｈ２アゴニスト中の、リンカーに隣接されたｓｃリラキシン−Ｈ２配列の完全長配列を、それぞれ配列番号：６８〜７７に示す。本明細書で例示する特定の抗体に組み込まれたｓｃリラキシンポリペプチドに加えて、本発明のヒトリラキシン２アゴニストは、例示するアゴニスト分子のいずれかの配列と実質的に同一（例えば少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％以上）であるアミノ酸配列を有する、抗体に組み込まれたリラキシンポリペプチドも包含する。本発明のアゴニストはまた、本明細書で例示するリンカー配列と実質的に同一である末端リンカー配列を有する、抗体に組み込まれたリラキシン分子、ならびに本明細書で例示する末端リンカーが修飾されたｓｃリラキシン−Ｈ２配列の配列と実質的に同一である、挿入された末端リンカー修飾ｓｃリラキシン配列を有する、抗体に組み込まれた分子も包含する。
本発明の抗体骨格に組み込まれたエフェクターポリペプチドは、精製のためのペプチド配列を付加的に含み得る。使用し得る精製のためのペプチド配列も当分野で公知である。精製のためのペプチド配列の例には、少なくとも４個、好ましくは少なくとも６個の連続するヒスチジン残基を含むアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ中のグルタチオン結合ドメインのアミノ酸配列が含まれる。
本明細書で述べる抗体骨格に組み込まれた機能性エフェクター（例えばレプチン、ｓｃＦＳＨおよびｓｃリラキシン）ポリペプチドは、日常的に実施される組換え法で作製することができる。このような技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（３ｒｄ ｅｄ．，２０００）；およびＢｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ ｅｄ．，２００３）に記載されている。本明細書で詳述するように、誘導体ポリペプチドは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）を適切なベクターに挿入し、この発現ベクターを適切な発現系に導入することによって作製できる。
ＶＩＩ．抗体に組み込まれた機能性ポリペプチドを発現するためのベクターおよび宿主細胞
本発明は、本明細書で述べる抗体骨格に組み込まれた機能性ポリペプチド（レプチン、ＦＳＨおよびリラキシン）をコードするポリヌクレオチド配列、前記ポリヌクレオチド配列を保有する発現ベクター、ならびに前記ポリヌクレオチドまたは発現構築物を保有する宿主細胞を提供する。細胞は、例えば動物細胞、植物細胞、細菌または酵母などの真核細胞または原核細胞であり得る。様々な発現ベクター／宿主系が、本発明の融合ポリペプチドを発現するのに適する。例としては、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクトされたまたは細菌発現ベクター（例えばＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が含まれる。
特定のベクターの選択は、融合ポリペプチドの意図される用途に依存する。例えば、選択したベクターは、細胞型が原核細胞であるか真核細胞であるかに関わらず、所望の細胞型において融合ポリペプチドの発現を駆動することができなければならない。多くのベクターは、作動可能に連結された遺伝子配列の原核細胞ベクターの複製および真核細胞での発現の両方を可能にする配列を含む。本発明に有用なベクターは、自律的に複製し得る、すなわちベクターは染色体外に存在し、その複製は必ずしも宿主細胞のゲノムの複製に直接結びつかない。あるいは、ベクターの複製は宿主の染色体ＤＮＡの複製に結びついてもよく、例えばベクターは、レトロウイルスベクターによっておよび安定にトランスフェクトされた細胞株において達成されるように宿主細胞の染色体に組み込まれてもよい。
本発明に有用なベクターは、好ましくはコードポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を可能にする融合ポリペプチドコード配列に作動可能に連結された配列を含む。連結された融合ポリペプチドコード配列の転写を可能にする配列にはプロモーターが含まれ、またエンハンサーエレメントまたは連結配列の強力な発現を可能にするエレメントも含まれてもよい。「転写調節配列」という用語は、プロモーターと、作動可能に連結された核酸配列に所望の発現特徴（例えば高レベルの発現、誘導的発現、組織特異的または細胞型特異的発現）を付与する任意の付加的な配列との組み合わせを指す。プロモーター配列は構成的または誘導的であり得る。構成的ウイルスプロモーターの例には、ＨＳＶ、ＴＫ、ＲＳＶ、ＳＶ４０およびＣＭＶプロモーターが含まれる。適切な誘導的プロモーターの例には、シトクロムＰ４５０遺伝子、熱ショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、エストロゲン遺伝子プロモーターなどのホルモン誘導的遺伝子等のような遺伝子からのプロモーターが含まれる。プロモーターは組織特異的であってもよい。本発明の発現ベクターと共に使用し得るこのようなプロモーターの例には、結腸上皮細胞に特異的な、肝臓脂肪酸結合（ＦＡＢ）タンパク質遺伝子；膵細胞に特異的な、インスリン遺伝子；肝細胞に特異的な、トランスフィレチン、α１−アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター１型（ＰＡＩ−１）、アポリポタンパク質ＡＩおよびＬＤＬ受容体遺伝子；乏突起神経膠細胞に特異的な、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子；神経膠細胞に特異的な、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）遺伝子；眼の標的化に特異的な、ＯＰＳＩＮ；ならびに神経細胞に特異的な神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターが含まれる。選択したプロモーターを、これを誘導的または組織特異的にする他の配列に連結してもよい。例えば、選択したプロモーターの上流に組織特異的エンハンサーエレメントを付加すると、所与の組織または細胞型においてプロモーターをより活性にし得る。
プロモーター／エンハンサーエレメントに加えて、本発明のベクターは適切なターミネータをさらに含み得る。このようなターミネータには、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは、酵母もしくは真菌宿主に関して、ＴＰＩ１（Ａｌｂｅｒ ＆ Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｊ Ｍｏｌ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．１：４１９−３４，１９８２）もしくはＡＤＨ３ターミネータ（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯ Ｊ．４：２０９３−２０９９）が含まれる。本発明に有用なベクターは、ポリアデニル化配列（例えばＳＶ４０またはＡｄ５Ｅ１ｂポリ（Ａ）配列）および翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ由来の配列）も含み得る。さらに、本発明に有用なベクターは、融合ポリペプチドを特定の細胞区画に向かわせるシグナル配列をコードし得るか、または選択的に、融合ポリペプチドの分泌を指令するシグナルをコードし得る。
一部の好ましい実施形態では、本発明の融合ポリペプチドを発現するベクターは、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。融合ポリペプチドまたはその変異体をコードする配列の細胞への導入および細胞における発現を許容する任意のウイルスベクターが、本発明の方法における使用のために許容される。異種核酸を細胞内に送達するのに使用できるウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイルス（アルファウイルス）ベクターが含まれるが、これらに限定されない。欠損レトロウイルスは遺伝子導入における使用に関して十分に特徴付けられている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１参照）。本発明の融合ポリペプチドをクローニングし、発現するのに適したレトロウイルスベクターの具体的な例は、本明細書で例示するレンチウイルスベクターｐＬＶ２である。組換えレトロウイルスを作製し、細胞をインビトロまたはインビボでこのようなウイルスに感染させるためのプロトコルは、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．前出、および他の標準的な研究室マニュアルにおいて見出すことができる。
レトロウイルスベクターに加えて、アデノウイルスを、関心対象の遺伝子産物をコードし、発現するが、正常な溶解ウイルス生活環において複製する能力に関して不活性化されるように操作することができる（例えばＢｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５参照）。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄ１３２４またはアデノウイルスの他の株（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）に由来する適切なアデノウイルスベクターは当業者に周知である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および増殖生活環のためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである。（総説についてはＭｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ．＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９参照）。Ｔｒａｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０）が述べたようなＡＡＶベクターは、核酸を細胞に導入するのに使用できる。様々な核酸が、ＡＡＶベクターを使用して種々の細胞型に導入されている（例えばＨｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０；およびＴｒａｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１参照）。
融合ポリペプチドを発現するために使用される特定のベクターに依存して、様々な公知の細胞または細胞株を本発明の実施において用いることができる。宿主細胞は、本発明の融合物を担持する組換えベクターを導入することができ、ベクターが本発明に有用な融合ポリペプチドの発現を駆動することを許容される、任意の細胞であり得る。宿主細胞は、多くの細菌株のいずれかのような原核細胞であり得るか、または酵母もしくは他の真菌細胞、昆虫もしくは両生類細胞、または、例えばげっ歯動物、サルもしくはヒト細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞であり得る。本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞は、初代培養細胞、例えば初代ヒト線維芽細胞もしくはケラチノサイトであり得るか、またはＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８もしくはＣＨＯ細胞などの樹立された細胞株であり得る。さらに、本発明の融合ポリペプチドの発現に有用な哺乳動物細胞は、表現型的に正常であってもよくまたは腫瘍形成的に形質転換されていてもよい。これらには、例えば本明細書で例示する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株Ａ５４９またはＥμ−Ｍｙｃリンパ腫細胞などの腫瘍細胞が含まれる。任意の他の初代哺乳動物細胞または形質転換腫瘍細胞も、本発明のレポーター融合ポリペプチドの実施において使用し得る。当業者は、融合ポリペプチドを発現する、培養下の選択した宿主細胞型を容易に樹立し、維持することができる。融合ポリペプチドの発現において使用できる適切な細胞株の多くの他の具体的な例が当分野で記述されている。例えばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８３．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ４６：５８４；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：３２２４；Ｌｏｇａｎ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，８１：３６５５；Ｓｃｈａｒｆ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ，２０：１２５；Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５３：５１６；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：５５０３；Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６；Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１；Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７；Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ ３：１６７１；Ｂｒｏｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：８３８；Ｗｉｎｔｅｒ Ｊ ａｎｄ Ｓｉｎｉｂａｌｄｉ Ｒ Ｍ，１９９１，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．，１７：８５；Ｈｏｂｂｓ Ｓ ｏｒ Ｍｕｒｒｙ Ｌ Ｅ ｉｎ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．，ｐｐ１９１−１９６またはＷｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ４２１−４６３参照。
融合ポリペプチドを発現するベクターを、当業者に公知の多くの適切な方法のいずれかによって選択した宿主細胞に導入し得る。例えば、融合ポリペプチドを発現するベクターを、λもしくはＭ１３などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バクテリオファージベクター粒子の場合は感染によって、または適合性プラスミドベクターもしくはバクテリオファージＤＮＡに関しては多くの形質転換法のいずれかによって、適切な細菌細胞に導入し得る。例えば、標準的な塩化カルシウム媒介性細菌形質転換が、裸のＤＮＡを細菌に導入するのに依然として一般的に使用されるが（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前出）、電気穿孔法も使用され得る（Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，前出）。融合遺伝子の大腸菌への共形質転換のためには、各々が異なる抗生物質耐性遺伝子を含む、２つの異なる適合性プラスミド発現ベクターを使用する必要がある。
抗体骨格に組み込まれたポリペプチドを発現する構築物の酵母または他の真菌細胞への導入に関しては、化学的形質転換法が一般的に使用される（例えばＲｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．によって記述されているように）。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換に関しては、例えば細胞を酢酸リチウムで処理して、およそ１０４コロニー形成ユニット（形質転換細胞）／μｇＤＮＡの形質転換効率を達成する。次に、使用する選択マーカーに適した選択培地上で形質転換細胞を単離する。あるいはまたは加えて、プレートまたはプレートから取り上げたフィルタを蛍光およびルシフェラーゼ媒介生物発光に関して走査し、融合ポリペプチドをコードする構築物を有する形質転換クローンを同定し得る。
融合ポリペプチドをコードするベクターの哺乳動物細胞への導入に関して、使用される方法はベクターの形態に依存する。プラスミドベクターについては、融合ポリペプチド配列をコードするＤＮＡを、例えば脂質媒介性トランスフェクション（「リポフェクション」）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、電気穿孔またはリン酸カルシウム沈殿を含む、多くのトランスフェクション方法のいずれかによって導入し得る。これらの方法は、例えばＢｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，前出で詳述されている。多種多様な形質転換および非形質転換細胞または初代細胞の一過性トランスフェクションに適するリポフェクション試薬および方法は広く入手可能であり、リポフェクションを、構築物を培養下で真核細胞、特に哺乳動物細胞に導入する魅力的な方法にしている。例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＬｉｐｏＴａｘｉ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）キットが利用可能である。リポフェクションのための試薬および方法を提供する他の会社としては、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、ＪＢＬ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ＰａｎＶｅｒａ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＷａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡが挙げられる。
組換え融合ポリペプチドの長期間の高収率生産のために、安定な発現が好ましい。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位等）によって制御される融合ポリペプチドコード配列および選択マーカーで形質転換することができる。組換えベクター中の選択マーカーは、選択物に耐性を付与し、細胞がその染色体内にベクターを安定に組み入れることを可能にする。一般的に使用される選択マーカーには、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１，１９８１）およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３０：１４７，１９８４）が含まれる。適切な選択を介して、トランスフェクト細胞は、組み込まれた融合ポリペプチドコード配列のコピーを含有することができる。
多くの他の選択系も使用でき、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１：２２３，１９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６，１９６２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２２：８１７，１９８０）遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗物質耐性も、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５６７，１９８０；Ｏ’Ｈａｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８：１５２７，１９８１）、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２，１９８１）についての選択の基礎として使用できる。さらに、さらなる選択可能な遺伝子、すなわち細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ ＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８０４７，１９８８）およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ Ｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄ．，１９８７）が記述されている。
ＶＩＩＩ．治療適用および医薬組成物
本明細書で述べる別のタンパク質骨格に組み込まれた機能性エフェクターポリペプチドは、多くの治療または予防適用を見出すことができる。例えば、本発明の機能性レプチン誘導体ポリペプチドは、レプチン欠損が役割を果たす様々な疾病または疾患の処置および予防において用いることができる。これらには、エネルギーバランス、体重、代謝および内分泌機能の調節におけるレプチン活性の不全または異常に関連するまたはこれによって媒介される多くの障害、例えば一般的な肥満、脂肪異栄養症、視床下部性無月経および先天性レプチン欠損症が含まれる。同様に、本明細書で述べるホストタンパク質骨格に組み込まれた機能性ｓｃＦＳＨポリペプチドは、低いＦＳＨレベルまたはＦＳＨレベルの低下に関連する疾病を処置するのに使用できる。ＦＳＨの分泌低下は、性腺機能不全（性腺機能低下症）をもたらし得る。この疾病は、典型的には雄性において正常な数の精子の産生不全として現れる。雌性では、生殖サイクルの停止が一般的に認められる。低いＦＳＨレベルに関連する疾病の具体的な例としては、多嚢胞性卵巣症候群、カルマン症候群、視床下部抑制、下垂体機能低下症、過プロラクチン血症および性腺刺激ホルモン欠損症が含まれる。これらおよび他の疾病のいずれかに罹患しているまたはいずれかを発現する危険性がある被験体は、本発明の機能性ｓｃＦＳＨ誘導体ポリペプチドでの処置に適している。
同様に、本明細書で述べる別のタンパク質骨格に組み込まれた機能性ｓｃリラキシンポリペプチドも、多くの治療または予防適用を見出すことができる。例えば、本明細書で例示する機能性ヒトｓｃリラキシン−Ｈ２アゴニストは、リラキシン２シグナル伝達の増強が望ましい様々な疾病または疾患の処置および予防において用いることができる。このような疾患または疾病には、例えば急性心不全、慢性心不全、うっ血性心不全、肺高血圧症、強皮症、デュシェーヌ筋ジストロフィ、肝線維症、腎線維症、肺線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、骨格筋損傷、外傷、熱傷、線維筋痛症、および固形または転移性腫瘍が含まれる。本発明のリラキシンアゴニストでの処置に適している他の障害には、例えば骨変性、関節痛、他の疼痛、アルツハイマー病、２型糖尿病、多発性硬化症、腎血管拡張およびデュピュイトラン病が含まれる。
一部の実施形態では、本明細書で述べる組成物および方法は、癌または腫瘍を処置するのに用いられる。これらには、心臓の癌（例えば肉腫、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫）；肺癌（例えば気管支原性癌、肺胞癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫）；様々な消化器癌（例えば食道、胃、膵臓、結腸、小腸および大腸の癌）；尿生殖路癌（例えば腎臓、膀胱および尿道、前立腺、精巣）；肝癌（例えばヘパトーム、胆管癌、肝芽細胞腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫）；骨癌（例えば骨原性肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫および巨細胞腫瘍）；神経系の癌（例えば頭蓋、髄膜、脳および脊髄の癌）；婦人科系の癌（例えば子宮、頸部、卵巣、外陰部、膣）；血液癌（例えば血液に関連する癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫）；皮膚癌（例えば悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、母斑、異形成性母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬）；ならびに副腎の癌（例えば神経芽細胞腫）が含まれる。
本明細書で述べる抗体骨格に組み込まれた機能性ポリペプチド（例えばレプチン、ｓｃＦＳＨまたはｓｃリラキシン）は、予防または治療適用に使用することができる。予防適用では、医薬組成物または薬剤を、疾患または疾病（すなわち肥満、強皮症または心不全）を発症しやすいまたは発症する危険性がある被験体に、疾患の生化学的、組織学的および／または行動症状、その合併症ならびに疾患の発症の間に現れる中間的な病理学的表現型を含む、疾患の危険性を取り除くもしくは低減する、重症度を低下させる、または発症を遅らせるのに十分な量で投与する。治療適用では、組成物または薬剤を、このような疾患に罹患していることが疑われるまたは既に罹患している患者に、疾患の合併症および疾患の発症における中間的な病理学的表現型を含む、疾患の症状（生化学的、組織学的および／または行動症状）を治癒するまたは少なくとも部分的に進行を止めるのに十分な量で投与する。しばしば、治療上の恩恵を観測し、恩恵が減弱し始めた場合は反復投与を行う。
本発明の方法における使用のための抗体骨格に組み込まれた機能性ポリペプチドは、所望の治療効果（例えば当該疾病に関連する症状を取り除くまたは改善する）を達成するのに十分な量で被験体に投与すべきである。治療または予防処置を達成するのに適切な量は、治療的または予防的に有効な用量と定義される。したがって、機能性誘導体エフェクターポリペプチドの治療的もしくは予防的に有効な用量または有効用量が本発明の医薬組成物において使用される。予防および治療の両方のレジメンにおいて、作用物質は通常、十分な恩恵が達成されるまで数回投与される。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、被験体に毒性であることなく、特定の被験体、組成物および投与方法に関して所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量が得られるように変化させ得る。選択される用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与の時間、および使用される特定の化合物の排出速度を含む様々な薬物動態因子に依存する。選択用量レベルはまた、処置の期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物および／または物質、処置される被験体の年齢、性別、体重、状態、全般的健康およびこれまでの病歴、ならびに同様の因子にも依存する。最適な投与量を決定するための方法は、当分野で、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，２０ｔｈ ｅｄ．，２０００において記述されている。典型的には、医薬的有効用量は、処置される被験体の体重ｋｇ当たり約０．００１〜１００ｍｇである。
典型的には、本発明の抗体骨格に組み込まれた機能性ポリペプチドは、本明細書で開示される治療または予防適用のために医薬組成物に製剤化される。医薬組成物は、様々な形態に、例えば顆粒、錠剤、丸剤、坐剤、カプセル、懸濁液、軟膏、ローション等に調製することができる。医薬組成物は、典型的には治療有効量の活性エフェクターポリペプチド（例えば本発明のレプチン、ｓｃＦＳＨまたはｓｃリラキシン誘導体ポリペプチド）を含有する。製剤中の治療的に活性な化合物の濃度は、約０．１〜１００重量％にわたり得る。活性エフェクターポリペプチドに加えて、組成物は、薬学的に許容される担体および投与を容易にするおよび／または取込みを増強することが公知の他の成分を含有し得る。非経口投与用の製剤は、例えば賦形剤、滅菌水、または食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、または水素化ナフタレンを含有し得る。生体適合性の生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、化合物の放出を制御するのに使用し得る。本発明の分子のための他の潜在的に有用な非経口的送達系には、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システムおよびリポソームが含まれる。吸入用の製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含有してもよく、または例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩を含有する水溶液であってもよく、または点鼻薬の形態もしくはゲルとしての投与のための油性溶液であってもよい。治療用製剤は、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製される。治療用製剤は、処置のために使用できる任意の有効な手段によって送達することができる。例えばＧｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（１０ｔｈ ｅｄ．，２００１）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０ｔｈ ｅｄ．，２００３）；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（７ｔｈ ｅｄ．，１９９９）参照。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。
医薬組成物は、通常は被験体に複数回投与される。各々の投与の間隔は、毎日、週１回、月１回または年１回であり得る。間隔は、被験体における誘導体エフェクターポリペプチドおよび使用されるその他の治療薬の血中レベルを測定することによって指示されるように不規則であってもよい。一部の方法では１〜１０００μｇ／ｍｌ、一部の方法では２５〜３００μｇ／ｍｌまたは１０〜１００μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するように用量を調整する。あるいは、治療薬を持続放出製剤として投与することができ、この場合はより低い頻度の投与しか必要としない。用量および頻度は、被験体におけるエフェクターポリペプチドおよびその他の薬剤の半減期に依存して異なる。投与の用量および頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに依存して異なり得る。予防適用では、比較的低い用量を比較的低頻度の間隔で長期間にわたって投与する。一部の被験体は、その後終生にわたって処置を受け続けることもある。治療適用では、比較的短い間隔で比較的高用量を、時として疾患の進行が軽減するまたは終了するまで、好ましくは被験体が疾患の部分的または完全な改善を示すまで必要とする。その後、被験体に予防レジメンを投与することができる。
本発明はまた、本明細書で開示する治療適用を実施するためのキットも提供する。例えば、本発明は、本明細書で述べる障害、例えばレプチン、ＦＳＨまたはリラキシンの欠損に関連する疾病に罹患している被験体の処置における使用のための治療用キットを提供する。本発明の治療用キットは、典型的には上述した機能性ポリペプチドの１つ以上を活性物質として含む。キットは、活性物質を投与するための適切な薬学的に許容される担体または賦形剤を含有してもよい。キットに適した薬学的に許容される担体または賦形剤は、剤皮、等張剤および吸収遅延剤、結合剤、接着剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、甘味料、吸収剤、界面活性剤および乳化剤であり得る。キットに含めることができる他の試薬は、酸化防止剤、ビタミン、無機物、タンパク質、脂肪および炭水化物を包含する。
治療用キットは、試薬および告知書を包装材料の中または上にパッケージするための包装材料をさらに含むことができる。キットは、キットの内容物の意図される使用を示す、使用のための適切な指示書およびラベルを付加的に含み得る。指示書は、キット上にもしくはキットと共に供給されるまたはキットに添付される任意の文書資料または記録資料上に存在し得る。
本発明の治療用キットは、例示した機能性ポリペプチド（例えばレプチン、ＦＳＨまたはリラキシン）の各々に関する上述した障害の１つの処置において単独で使用できる。本発明の治療用キットはまた、他の公知の治療レジメンと共に使用することもできる。例えば、肥満を患っている被験体は、別の肥満薬（例えばＸｅｎｉｃａｌ）と共に治療用キットを使用することができる。本発明の治療組成物と他の公知の処置レジメンを連続的にまたは同時に被験体に投与することができる。本発明のこれらの治療適用は、すべてキットの指示書で示され得る。
［実施例］
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するためではない。
［実施例１］
ゲスト分子の選択
ゲストをタンパク質ホストに挿入するコンビナトリアル工程が一般的であり得るかどうかを判定するため、２つの全く異なるタンパク質ホルモン、レプチンと卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を検討した。ホルモンは、ホスト分子に組み込んだときそれらが機能性であるかどうかを容易に判定できるため、試験対象物として選択した。各々のホルモンは、特有の利点と難点が問題となる。レプチンは、コンパクトな４ヘリックスバンドルに折りたたまれた１４６アミノ酸長のタンパク質である（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８７，２０６−２０９，１９９７）。互いに対するヘリックスの強力な結合エネルギーは、結合部の選択の重要性を低下させ得る。しかし、ゲストのこの同じ剛性は、複合体全体が折りたたまれる経路を妨げ得る。ＦＳＨは、大部分がβシート二次構造に折りたたまれた２０３アミノ酸を有する。これらの実験に関して、ＦＳＨの特有の問題は、これがヘテロダイマーであることである。ＦＳＨモノマーサブユニットを個別に処理する場合、その工程は４つのリンカーのコンビナトリアル問題となるが、ヘテロダイマーのモノマーサブユニットが共有結合している場合は、この工程が３つのリンカーのコンビナトリアル問題に低減される。そこで、ＧＳＧＳＮＡＴＧＳＧＳＮＡＴＳＧＳＴＳ（配列番号：３３）ペプチドリンカーを使用して２つのサブユニットを連結することにより、一本鎖ＦＳＨ（ｓｃＦＳＨ）を構築した。最初に、レポーター細胞株を使用してこのｓｃＦＳＨ共有結合ダイマーが機能性であることを示した（下記参照）。
［実施例２］
コンビナトリアル結合部の構築
ホスト骨格は、１９アミノ酸残基を含むＣＤＲ Ｈ３（Ｋａｂａｔナンバリング）を有する抗体である。結合部の柔軟性を最大化しつつ、抗体コアの正しい折りたたみを維持するために、ＣＤＲ Ｈ３のコアであるＬＧＩＴＫＴＳＴＣＹＴループ（配列番号：３）をコンビナトリアルＮ末端およびＣ末端結合部ライブラリの成員によって置換し、レプチンおよびｓｃＦＳＨゲストに隣接する配列の極めて多様なアレイを作製した。挿入部位のこの選択は、親骨格の相同性モデルに基づいた。この構築物において、ゲストの塩基の一部は、ホスト抗体の他の変化していないＣＤＲの一部に詰め込まれ、残りは溶媒中に伸びると予想される。
コンビナトリアル結合部ライブラリを、ランダムな３残基リンカーの結合部ならびにレプチンおよびｓｃＦＳＨのＮ末端およびＣ末端の両方にＧＧＧＧＳ（配列番号：４）の１〜３コピーを含むように設計した。タンパク質の結合配列スペースの多様性は、Ｎ末端およびＣ末端ライブラリの組み合わせに関して２．８８×１０７である。ライブラリを構築するため、ランダムなＸＸＸリンカー、次いで（ＧＧＧＧＳ）１〜３（配列番号：３４）リンカーおよびゲストホルモンに相補的な配列を含む３つの順方向プライマー、ならびにゲストに相補的な配列、次いで（ＧＧＧＧＳ）１〜３（配列番号：３４）リンカーおよびＸＸＸリンカーを含む３つの逆方向プライマーの組み合わせを使用してＰＣＲを実施した。増幅したＰＣＲ産物を消化し、親骨格抗体に移入した。両方のライブラリの品質と多様性を２０個のコロニーの配列決定によって確認した。
［実施例３］
レポーター細胞株の構築
β−ラクタマーゼレポーター遺伝子の発現が様々な細胞シグナル伝達応答エレメントによって誘導される、細胞の自己分泌に基づくフローサイトメトリ選別は、その高い精度と感受性のために広く使用されている。ヒトレプチン受容体（ＬｅｐＲ）に関してこのようなレポーター細胞株を構築するため、Ｓｉｓ誘導エレメント（ＳＩＥ）の制御下でβ−ラクタマーゼレポーター遺伝子を発現することができるＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ ＳＩＥ−Ｂｌａ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターによって駆動されるＣ末端ＨＡ標識ヒトＬｅｐＲ遺伝子を発現するレンチウイルスを形質導入した（図１Ａ）。ヒトレプチンタンパク質に対する応答に基づく選別後に単一クローンを試験し、最も強い応答を有するものをＬｅｐＲ ＳＩＥ−Ｂｌａ細胞と称して、さらなる試験に使用した。ＬｅｐＲ ＳＩＥ−Ｂｌａ細胞は、ＨＡ標識ヒトレプチン受容体を安定に発現し（図１Ｂ）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイにおいてヒトレプチンに対して８．５の応答率を有する（図１Ｃ）。応答率は、ＬｅｐＲ ＳＩＥ−Ｂｌａ細胞において生成されたシグナルをＬｅｐＲなしの細胞のシグナルで除したものである。
ヒトＦＳＨＲのためのレポーター細胞株を構築するため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｃ末端ＨＡ標識ヒトｓｃＦＳＨ遺伝子を安定に発現するレンチウイルスおよびサイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の制御下でβ−ラクタマーゼ遺伝子を発現するレンチウイルスを共形質導入した（図１Ｄ）。形質導入細胞を組換えヒトＦＳＨタンパク質に暴露し、最良応答するものを選択するために選別した。ＦＳＨＲ ＣＲＥ−Ｂｌａ細胞は、ＦＲＥＴアッセイにおいてヒトＦＳＨタンパク質に対して６．４の応答率を有する（図１Ｅ）。
［実施例４］
機能性結合部の自己分泌に基づく選択
機能性抗体クローンを単離するため、ストリンジェントなゲーティングを用いてＦＲＥＴに基づくＦＡＣＳ選別を実施した。ＬｅｐＲ ＳＩＥ−ＢｌａおよびＦＳＨＲ ＣＲＥ−Ｂｌａ細胞に、約２の感染多重度で対応するレンチウイルスコンビナトリアル結合部ライブラリを形質導入した。感染の５時間後にレンチウイルスを除去し、メチルセルロース培地を細胞の上に置いて、分泌された抗体の近接細胞への拡散を制限した。レンチウイルス感染の２４時間後、メチルセルロース培地を培地で洗い流し、細胞をトリプシン処理して、ＬｉｖｅＢＬＡｚｅｒ−ＦＲＥＴ Ｂ／Ｇ基質を充填し、選別した。
ＬｅｐＲ ＳＩＥ−Ｂｌａ細胞に関して、２回の選別後に有意の濃縮が存在し、１回目のわずかに０．０６％の陽性細胞から、２回目には３．３０％の陽性細胞になった。ＦＳＨ ＣＲＥ−Ｂｌａ細胞に関しては、１回の選別が０．１８％の陽性細胞を生じた。各回の選別後、細胞溶解物を鋳型として用いたＰＣＲによって抗体遺伝子フラグメントを回収し、必要に応じて、次の回の選別のためにレンチウイルスベクターに再挿入した。２４個のクローンを、ＬｅｐＲ ＳＩＥ−Ｂｌａ細胞については２回目から採取し、ＦＳＨＲ ＣＲＥ−Ｂｌａ細胞については１回目後に採取した。これらのクローンからプラスミドを抽出し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトして、分泌された抗体を発現させた。レプチンおよびＦＳＨ選別からの上清をトランスフェクションの２日後に試験し、陽性クローンを同定した。これらのそれぞれの細胞選別から、１４個のうち６個のクローンはＬｅｐＲ ＳＩＥ−Ｂｌａ細胞を活性化することができ、１４個のうち３個のクローンはＦＳＨＲ ＣＲＥ−Ｂｌａ細胞の活性化に関して陽性であった。これらのクローンを配列決定し、許容される結合部の配列を分析した（表１および２）。
Figure 2017536833
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レプチンゲストを含む６個の活性抗体クローンのうちで、２個の最も活性なクローン（表１のクローンＣおよびＥ）は、同じＮ末端配列（ＬＧＶＧＧＧＧＳ）（配列番号：５）およびＣ末端配列（ＧＧＧＧＳＥＲＴ）（配列番号：６）を有していた。その他の４個の活性クローンは、一見したところランダムな無関係の配列を有していた。興味深いことに、このＮ末端結合配列（ＬＧＶＧＧＧＧＳ）は、典型的なグリシンリッチループに高度に類似する。ＮＡＤＨ依存性ブタノールデヒドロゲナーゼＡにおけるＬＧＶＧＧＧＳ（配列番号：４０）（ＰＤＢコード：１ＶＬＪ）および原核細胞分裂タンパク質ＦｔｓＺにおけるＩＧＶＧＧＧＧＳ（配列番号：４１）（ＰＤＢコード：２Ｒ６Ｒ）などの、コンセンサスＧｘＧｘｘＧ（配列番号：３９）モチーフが天然タンパク質中に出現し、これらの前にβ鎖が先行し、後にαヘリックスが続く。興味深いことに、コンセンサスＧｘＧｘｘＧ配列は、リン酸結合がヘリックスを安定化すると思われる、リン酸結合モチーフである。
これらの活性ｓｃＦＳＨクローンの発現レベルおよびＦＳＨＲに対するアゴニスト活性を試験した。クローンＢが最も活性であった。興味深いことに、Ｎ末端結合配列（ＱＲＶＧＧＧＧＳ）（配列番号：１７）は、天然の４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ５中に存在し、そこでβ／β結合を形成する、配列（ＲＶＧＧＧＧ）（配列番号：９０）を含む（ＰＤＢコード：１Ｓ１Ｈ、３ＪＹＶ）。
［実施例５］
結合部の改善された選択
１回目の選択は機能性タンパク質を生じたが、これらの産生は最適ではなかった。改善されたタンパク質産生を有するクローンを選択するために、タンパク質収率パラメータを組み込んだ別の選択を実施した。これを行うため、ｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子をｓｃＦｖ遺伝子のＣ末端に融合した新たなベクターを使用した。これは、ＦＲＥＴゲートの前に高いｍＣｈｅｒｒｙシグナルについての付加的なゲートを使用することによって高発現クローンを選択することを可能にした。３つのライブラリを検討した。１つはもとのライブラリであった。その他の２つのライブラリでは、Ｎ末端リンカーまたはＣ末端リンカーのいずれかは先の選択から一定に保たれ、他方のリンカーは再びランダムであった。この選択は、Ｎ末端にＲＨＭＧＧＧＧＳ（配列番号：３７）およびＣ末端にＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＤＴ（配列番号：３８）を有する新しいクローン（クローン２）を生じた。このタンパク質は、完全なレプチン活性を保持しつつ、先に選択したクローンよりはるかに良好に発現した。
［実施例６］
インビトロ活性
レプチンゲストを含む抗体の最も活性で最も良好に産生するｓｃＦｖクローンをＦａｂ型（Ｆａｂ−レプチン）または完全ＩｇＧ型（ＩｇＧ−レプチン）に変換した。変化していない骨格、Ｆａｂ−レプチンおよびＩｇＧ−レプチンをｐＦＵＳＥベースのベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）にクローニングし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で発現させた。一段階アフィニティ精製後、すべての抗体を高純度に精製した。精製抗体の活性を２つの異なるアッセイで試験した。β−ラクタマーゼに基づくＬｅｐＲ ＳＩＥ−Ｂｌａ細胞株を使用したＦＲＥＴアッセイでは、Ｆａｂ−レプチン、ＩｇＧ−レプチンおよび天然レプチンの測定されたＥＣ５０は、それぞれ１１８．３ｐＭ、５８．７ｐＭおよび３１３．４ｐＭであった（図２Ａ）。増殖がＩＬ−３またはレプチンに依存するＢａｆ３ ＬｅｐＲ細胞株を使用した増殖アッセイでは、Ｆａｂ−レプチン、ＩｇＧ−レプチンおよび天然レプチンのＥＣ５０は、それぞれ１３１．９ｐＭ、３７．２ｐＭおよび３０９．６ｐＭであった（図２Ｂ）。
ｓｃＦＳＨを含む抗体の最も活性なクローンの活性を試験するため、ＩｇＧ−レプチンと同じ方法を用いてこれをＩｇＧ−ｓｃＦＳＨに変換した。ｓｃＦＳＨもｐＦＵＳＥベースのベクターにクローニングし、ＩｇＧ−ｓｃＦＳＨを産生させた。高純度のｓｃＦＳＨおよびＩｇＧ−ｓｃＦＳＨの両方を、一段階アフィニティ精製後に得た。これらの活性をβ−ラクタマーゼに基づくＦＳＨＲ ＣＲＥ−Ｂｌａ細胞株を使用したＦＲＥＴアッセイによって測定した。ＩｇＧ−ｓｃＦＳＨ、ｓｃＦＳＨおよび天然ＦＳＨのＥＣ５０は、それぞれ５．５ｐＭ、５．７ｐＭおよび４．６ｐＭであった（図２Ｃ）。
［実施例７］
レプチンホスト−ゲスト構築物の構造および動力学
円偏光二色性（ＣＤ）分光法は、タンパク質およびペプチドの二次構造および折りたたみ特性の迅速な決定のための構造生物学における非常に有用なツールである。ＩｇＧ−レプチンが抗体骨格のように自然に折りたたまれるかどうかを調べるため、抗体骨格およびＩｇＧ−レプチンの両方の遠紫外（ＵＶ）ＣＤ分光を測定した。抗体骨格およびＩｇＧ−レプチンの両方が２１７ｎｍ付近に負のピークおよび１９５ｎｍ付近に正のピークを有し、これは、抗体がすべてβシート二次構造から成るという事実と一致する。同様のＣＤ分光パターンは、ＩｇＧ−レプチンのホスト成分が自然に折りたたまれることを示す。予想されたように、レプチンゲストを含む抗体は、αヘリックスシグナルに対応する１９５ｎｍおよび２１７ｎｍにより強いピークを有していた。
次に、示差水素−重水素交換質量分析法（ＨＤＸ−ＭＳ）を使用して、遊離形態と抗体骨格に組み込まれた場合（ＩｇＧ−レプチン）のレプチンの配座動力学および安定性を検討した。最初に、レプチンとＩｇＧ−レプチン構築物の内因性重水素吸収動力学を比較した。レプチン配列（ＩｇＧ−レプチンまたはレプチン単独）の〜８５％をカバーする６３個の消化性ペプチドのＨＤＸ動態を測定し、レプチンおよびＩｇＧ−レプチン中の各ペプチドについての平均重水素取込みパーセントを６つのオン交換時点の三重の分析に基づいて計算した（方法参照）。ＨＤＸデータの分析は、２つのレプチン変異体についての平均重水素吸収が大部分のタンパク質領域にわたって非常に類似したままであり、残基５１〜６６、８１〜９３および１２４〜１３８は両方のレプチン変異体において溶媒重水素への交換に対して強力に保護されていたことを明らかにする。しかし、アミノ酸残基１８〜５２および６７〜８０は重水素交換により利用しやすく（黄色／緑色／赤色領域）、両方のレプチン変異体におけるこの領域のより大きな配座柔軟性を示す。これは、レプチンの全体的な位相構造が遊離形態とＩｇＧ−レプチンの間で高度に類似することを示唆する。
遊離レプチンとＩｇＧ−レプチンの構造相違をさらに特徴付けるため、次に２つのレプチン変異体の間の重水素吸収動力学の相違を検討した。アミド水素が溶媒重水素と交換する速度の差は、２つのレプチン変異体の間の構造相違についての情報を明らかにすることができる。示差ＨＤＸデータの分析は、遊離形態と組み込まれたレプチン変異体についての平均重水素吸収がほとんどのタンパク質領域に関して非常に類似したままであることを明らかにした。これらのデータはさらに、インビトロおよびインビボ（下記参照）の両方の活性を裏付け、レプチンの立体配座が遊離形態とＩｇＧ−レプチンの間で不変であることを示唆する。加えて、残基４３〜５４は、ＩｇＧ−レプチンと比較して遊離レプチンにおける重水素吸収に対する保護の増大を示す。これは、このタンパク質領域がＩｇＧ−レプチンに比べて遊離レプチンではより構造的に剛性であることを示唆するが、タンパク質領域の大部分についてのＨＤＸ挙動は不変のままであり、２つのレプチン形態が基本的に同じであることを示す。
［実施例８］
インビボ活性
ＩｇＧ−レプチンがレプチンのシグナル伝達活性を完全に保持することを明らかにしたインビトロ結果により、インビボでのＩｇＧ−レプチンの機能性を特徴付けることを促された。マウスの体温でのＩｇＧ−レプチンのタンパク質安定性を検討した。レプチンまたはＩｇＧ−レプチンを浸透圧ポンプに充填し、次にこれをマウスに皮下（ＳＣ）移植した。移植の３日後、ＥＬＩＳＡによって測定したときポンプの内部のレプチンおよびＩｇＧ−レプチンの両方の濃度が一定なままであることを認め、レプチンと同様に、ＩｇＧ−レプチンがこの条件で安定であることを示し、これにより長期のインビボ投与が可能となった。次に、抗体は一般に循環中で長い半減期を示すので、抗体骨格にレプチンを組み込むことは、腎臓および他の末梢器官によって自然に速やかに清掃される、ホルモンの半減期を増大させ得ると推論した。これを試験するため、レプチンまたはＩｇＧ−レプチンの単回用量を頸静脈を介して投与し、タンパク質クリアランスの速度を様々な時点で測定した。レプチンタンパク質は、予想されたように３０分未満の半減期を示したが、これに対し、ＩｇＧ−レプチンは有意に増大した血漿中半減期を有しており、タンパク質の５０％以上が投与後４時間目に残存していた（図３Ａ）。このクリアランス低下は、レプチンとメガリンなどのそのクリアランス受容体との結合を妨げる、ＩｇＧ−レプチン中の組み込まれたレプチンを取り囲む領域に起因すると考えられる。合わせて考慮すると、データは、レプチンと比較して、ＩｇＧ−レプチンが体温で同様のレベルのタンパク質安定性を有し、循環中で長い半減期を有することを示し、このことがＩｇＧ−レプチンをインビボでの代謝調節のための有効な候補物にする。
ＩｇＧ−レプチンはインビトロでレプチンシグナル伝達を強力に活性化することができるが、レプチンの抗体骨格への組み込みは、もとの単量体の１６ｋＤａホルモンよりはるかに大きい、１８７．２ｋＤａの二量体分子を生成した。これは、末梢に投与したＩｇＧ−レプチンが血液脳関門を効率よく通過して、中枢神経系のレプチン応答性ニューロンにアクセスすることができないかもしれない可能性を提起した。この問題に対処するため、最初に、ＩｇＧ−レプチンの中枢処理に応答した視床下部におけるニューロン活性化を比較した。タンパク質を脳室に直接送達する、ＩｇＧ−レプチンの脳室内（ＩＣＶ）注入後、視床下部の複数の領域においてＳＴＡＴ３の堅固なリン酸化が存在した。脳室に隣接するニューロンのＳＴＡＴ３活性化は、ＩｇＧ−レプチンがレプチンのシグナル伝達機能を完全に保持するというインビトロデータと一致して、等モル量のレプチンのＩＣＶ注入で認められたものに匹敵した（図３Ｂ）。脳室からさらに遠いニューロンでの相対的により弱いＳＴＡＴ３活性化は、おそらく組織を介したＩｇＧ−レプチンのより緩やかな拡散を反映する。注目すべきは、レプチンが中枢神経系に活発に輸送されることと一致して、レプチンの末梢投与は、中枢送達後に見られるのと類似のＳＴＡＴ３活性化のパターンをもたらした。これに対し、ＩｇＧ−レプチンの末梢投与もＳＴＡＴ３リン酸化を誘導することができたが、これは弓状核（ＡＲＣ）のニューロンに限定され、奇妙なことに、ＩｇＧ−レプチンの中枢投与によって活性化された視床下部の他のニューロン集団ではＳＴＡＴ３リン酸化は存在しなかった。この興味深い結果に対する１つの可能性のある説明は、ＡＲＣ中のプロオピオメラノコルチンおよび神経ペプチドＹ／アグーチ関連タンパク質ニューロンの樹状突起が正中隆起にごく近接して突き出していることは公知であり、血漿中の循環分子を直接感知することができ、それゆえ血液脳関門を横切る輸送の必要性を回避するということである。末梢投与したＩｇＧ−レプチンは、おそらくこの機構を用いてＡＲＣニューロンを活性化し得ると考えられる。合わせるとこれらの結果は、抗体骨格が脳血液関門を通過するＩｇＧ−レプチンの能力を低下させるにもかかわらず、ＩｇＧ−レプチンは視床下部においてレプチン応答性ニューロンを活性化できることを示す。
ＡＲＣニューロンは、満腹とエネルギー消費を調節するのに重要な役割を有する。ＩｇＧ−レプチンによるＡＲＣニューロンの活性化が代謝作用を誘発するのに十分であるかどうかを調べるため、タンパク質を皮下浸透圧ポンプによって肥満マウスに末梢的に送達した。興味深いことに、ビヒクル対照と比べて、ＩｇＧ−レプチンは投与後に食物摂取ならびに体重を有意に低減することができた（図３Ｃの左のパネル）。この所見は、ＡＲＣ中のレプチン応答性ニューロンを活性化できるだけであるにもかかわらず、末梢ＩｇＧ−レプチンがまだ異化機能を及ぼし得ることを明らかにするが、我々は、ＩｇＧ−レプチンの力価が等モル量のレプチンに比べて若干弱いことを認めた。他方で、脳注入ポンプを介してｏｂ／ｏｂマウスの脳室内にＩｇＧ−レプチンを慢性的に送達した場合、ＩｇＧ−レプチンはレプチンと同程度に食物摂取および体重を低下させた（図３Ｃの真ん中のパネル）。ＩｇＧ−レプチンはまた、野生型マウスにおいて食物摂取、体重および脂肪組成の低下をもたらすことができたが（図３Ｃの右のパネル）、食餌性肥満（ＤＩＯ）マウス（図４の左のパネル）またはｄｂ／ｄｂマウス（図４の右のパネル）では低下をもたらすことができず、ＩｇＧ−レプチンの異化作用が何らかの非特異的毒性に起因し得る可能性を排除した。合わせると、我々のインビボ結果は、ＩｇＧ−レプチンがレプチンのシグナル伝達機能を保持し、代謝を調節する視床下部のレプチン応答性ニューロンを活性化できることを示す。
［実施例９］
抗体骨格のＣＤＲ領域外のゲスト挿入の耐容性
この実施例は、ＣＤＲ領域外の抗体骨格へのゲストペプチドの挿入を述べる。ホスト−ゲストポリペプチド融合分子の構築の成功は、少なくとも２つのパラメータの関数である。第一に、どの位置が置換を許容するかを答えなければならない。そして第二には、どのリンカーが許容性であるか、である。ゲストポリペプチドの挿入を許容するホスト骨格中の付加的な部位を探索するため、他の部位における短いペプチドの挿入に対する、上述したｓｃＦｖ骨格に組み込まれた機能性レプチンの耐容性を検討することによる包括的な試験を実施した。具体的には、機能性のｓｃＦｖに組み込まれたレプチン融合分子を、ｓｃＦｖ骨格中の５つの異なる位置の各々で４残基ランダム化ペプチドのライブラリに置き換えることによって修飾した。４残基ランダム化ペプチドのライブラリをコードするＤＮＡフラグメントを、古典的ＮＮＫ戦略を用いて設計した（Ｂａｒｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０００３−１０００７，１９９３）。置換によって置き換えられたｓｃＦｖ骨格中の５つのもとのペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングに従ってセグメントＨ６〜Ｈ９（Ａ）、Ｈ２３〜Ｈ２６（Ｂ）、Ｈ３６〜Ｈ３９（Ｃ）、Ｈ４７〜Ｈ５０（Ｄ）およびＨ６４〜Ｈ６７（Ｅ）である（図９に示す通り）。これは、４残基ランダムペプチド配列で５つの非ＣＤＲ位置の各々において修飾されたｓｃＦｖ−レプチン融合分子の５つのライブラリをもたらした。これら５つのライブラリのレンチウイルスを作製し、ＬｅｐＲ ＳＩＥ−Ｂｌａ細胞に感染させた。
次に、抗体骨格中のレプチンを機能性プローブとして用いて、自己分泌に基づくフローサイトメトリ分析を実施した。その後、自己分泌アッセイからの各ライブラリにおいて、レプチン活性によって示される、レンチウイルスの機能性集団を含む細胞を定量化する。陰性対照（感染なし）における０．５０％の陽性集団および陽性対照（ランダムな４アミノ酸ペプチドを挿入していない、ｓｃＦｖ−レプチンを発現するレンチウイルスに感染させた）における３２．１８％の陽性集団と比較して、ライブラリＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥではそれぞれ４．２２％、１８．９１％、１．４３％、１．４３％および２．２２％の陽性集団が存在する。これらの結果は、異なる抗体領域での置換の耐容性のレベルに関して有意の差が存在するが、非ＣＤＲ部位におけるペプチド挿入がゲストレプチン分子の活性維持を許容することを示す。領域Ｂは最も高い置換の耐容性を示し、これは、この領域がＣＤＲＨ１に構造的に隣接するという事実と一致する。他の領域も異なるレベルの置換の耐容性を示し、機能性ゲストを抗体骨格に挿入できる潜在的な位置を明らかにした。
［実施例１０］
抗体骨格中のｓｃリラキシン分子のライブラリの構築
ヒトリラキシン２（リラキシン−Ｈ２）はヘテロダイマーホルモンである。これは、２本の鎖、すなわち２４残基のＡ鎖と２９残基のＢ鎖から成る。構造的には、リラキシン−Ｈ２は、その生物学的機能に必須である、２つの鎖間（Ａ鎖とＢ鎖の間）および１つの鎖内（Ａ鎖の内部）ジスルフィド結合を含む。リラキシン−Ｈ２は、７回膜貫通Ｇタンパク質共役受容体スーパーファミリーに属する、リラキシン受容体ＲＸＦＰ１（ＬＧＲ７）およびＲＸＦＰ２（ＬＧＲ８）と相互作用する。ＲＸＦＰ１は、ＲＸＦＰ２、ＲＸＦＰ３またはＲＸＦＰ４よりも適切に、リラキシン−Ｈ２の活性を測定する様々なアッセイで使用されている。それに加えて、ＲＸＦＰ１は、大きな細胞外ドメインを有する、まれなＧＰＣＲの１つである。
抗体骨格中のリラキシンのライブラリを構築するため、柔軟なリンカーを用いてリラキシン−Ｈ２のＡ鎖とＢ鎖を連結した。次にこの一本鎖リラキシン−Ｈ２を、作製したＮ末端およびＣ末端リンカーを介して抗体骨格のＣＤＲＨ３に挿入した。最終的なカセットは、［ＸＸＸ］−［ループ１］−［Ａ鎖］−［ループ２］−［Ｂ鎖］−［ループ３］−［ＸＸＸ］であり、ここでＸＸＸは３個のランダム化されたアミノ酸残基を表し、ループ１はＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：４６）またはＧＧＳＧＧＳ（配列番号：４７）のいずれかであり、ループ２はＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号：４５）であり、およびループ３はＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号：４８）またはＳＧＧＧＧＳ（配列番号：４９）のいずれかである。ホストｓｃＦｖ骨格（配列番号：１）は、１９アミノ酸残基を含むＣＤＲ Ｈ３（Ｋａｂａｔナンバリング）を有する抗体である。結合部の柔軟性を最大化しつつ、抗体コアの正しい折りたたみを維持するために、ＣＤＲ Ｈ３のコアであるＬＧＩＴＫＴＳＴＣＹＴループ（配列番号：３）をコンビナトリアルＮ末端およびＣ末端結合部ライブラリの成員によって置き換えた。リラキシン−Ｈ２カセットを含む骨格ｓｃＦｖのプールをレンチウイルスベクターに移入した。最終的なライブラリの大きさは３．６７×１０７である。ｓｃリラキシン−Ｈ２分子のライブラリを発現するレンチウイルスをＨＥＫ２９３Ｔ細胞において作製した。
［実施例１１］
抗体に組み込まれた機能性リラキシン−Ｈ２アゴニストの選択
β−ラクタマーゼレポーター遺伝子の発現が様々な細胞シグナル伝達応答エレメントによって誘導される、細胞のフローサイトメトリ選別は、その高い精度と感受性のために広く使用されている。膨大なコンビナトリアルライブラリからアゴニスト抗体を発見するハイスループットプラットフォームを作り上げるため、β−ラクタマーゼに基づくレポーター細胞株を構築した。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、一方はＥＦ−１αプロモーターの制御下でＲＸＦＰ１を発現し、他方はｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の刺激後にβ−ラクタマーゼを発現する、２つのレンチウイルスによって共感染させた。１０ｎｇ／ｍｌのリラキシン−Ｈ２タンパク質による刺激後にリラキシン−Ｈ２応答性細胞（ＲＸＦＰ１ ＣＲＥ−Ｂｌａ）を選別し、プールした。
機能性リラキシンアゴニストを選択するため、ＲＸＦＰ１ ＣＲＥ−Ｂｌａ細胞に、約２の感染多重度でレンチウイルスコンビナトリアル結合部ライブラリを形質導入した。感染の５時間後にレンチウイルスを除去し、メチルセルロース培地を細胞の上に置いて、分泌された抗体の近接細胞への拡散を制限した。レンチウイルス感染の２４時間後、メチルセルロース培地を培地で洗い流し、細胞をトリプシン処理して、ＬｉｖｅＢＬＡｚｅｒ−ＦＲＥＴ Ｂ／Ｇ基質を充填し、選別した。偽陽性クローンを避けるため、非常にストリンジェントなゲーティングを適用した。選別した細胞を溶解し、鋳型として使用して、必要に応じて次の回の選別のためにＰＣＲを用いてｓｃＦｖフラグメントを増幅した。
４回の選別後、６０個のクローンをリラキシン活性に関してスクリーニングした。各クローンからプラスミドを抽出し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトして、リラキシンを含むｓｃＦｖを発現させた。トランスフェクションの４８時間後、ＲＸＦＰ１ ＣＲＥ−Ｂｌａ細胞を使用するＦＲＥＴアッセイのために上清を移した。６０個のクローンのうちで、９個をアゴニスト性と同定した（図５）。これら９個のクローンの上清中のタンパク質レベルを、抗Ｆｌａｇ抗体を用いたウェスタンブロット法で測定した（図５）。上清中の活性およびタンパク質レベルに基づき、クローンＡ３およびＣ１２は最も高い力価を示した。これら２つのクローンを、ｐＦｕｓｅベクターを用いて完全なＩｇＧ１抗体に変換した。配列決定分析は、Ｃ１２が実際にはＣ１２−２とＣ１２−１の２つのクローンの混合物であることを示した。ＸＸＸ末端リンカーおよびループ配列を含む、１０個の組み込まれたｓｃリラキシン分子の配列情報を図６に示す。
［実施例１２］
同定された、抗体に組み込まれたｓｃリラキシンアゴニストの特徴付け
Ａ３（Ｉｇ１）、Ｃ１２−２（Ｉｇ２）およびＣ１２−１（Ｉｇ３）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において発現させた。重鎖および軽鎖の両方のプラスミドを製造者の指示に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞に共トランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、上清を収集し、一段階アフィニティ精製を用いて＞９５％の純度に精製した。純度を、クマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで検出した（図７）。
精製抗体を特徴付けるため、インビトロＦＲＥＴアッセイを用いてＥＣ５０値を測定した。ＲＸＦＰ１ ＣＲＥ−Ｂｌａ細胞を３８４ウェルプレートに接種し、段階希釈した抗体／リラキシン−Ｈ２タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をウェルに添加した。抗体／リラキシン−Ｈ２タンパク質の最終濃度は０．０３３ｎＭ〜１３５ｎＭの範囲であった。これに続いて、プレートを細胞培養器中で５時間インキュベートし、その後ＬｉｖｅＢＬＡｚｅｒ−ＦＲＥＴ Ｂ／Ｇ基質を充填して、室温でさらに２時間インキュベートする。ＦＲＥＴシグナルを収集し、分析した。予想されたように、骨格抗体は活性を示さなかった（図８）。他方で、図８に示すように、同定されたｓｃリラキシンのアゴニスト活性は、Ｉｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３についてそれぞれ７．９ｎＭ、１．４ｎＭ、９．６ｎＭの測定されたＥＣ５０値によって実証された（天然リラキシン−Ｈ２分子についてのＥＣ５０は４．９ｎＭである）。
［実施例１３］
実験材料および方法
この実施例は、本明細書で例示する抗体骨格に組み込まれた機能性ポリペプチドの一部を作製するのに用いられる材料および方法の一部を述べる。
試薬：ウサギ抗ホスホＳＴＡＴ３はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇからであった。ヒトレプチンＥＬＩＳＡキットはＲ＆Ｄから入手した。マウス組換えレプチンはＡｍｇｅｎから入手した。浸透圧ポンプおよび脳注入キットはＡｌｚｅｔから入手した。
細胞培養：ヒトＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含有するＤＭＥＭに維持した。ＬｅｐＲ ＳＩＥ−ＢｌａおよびＦＳＨＲ ＣＲＥ−Ｂｌａ細胞は、１０％透析ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＮＥＡＡおよびＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭ培地で増殖させた。Ｂａｆ３ ＬｅｐＲ細胞は、１０％ＦＢＳ、Ｐ／Ｓおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−３を含むＲＰＭＩ−１６４０で培養した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞は、４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に維持した。
コンビナトリアル抗体ライブラリの構築：ＢａｍＨＩおよびＸｍａＩ制限部位を骨格中のＣＤＲ Ｈ３ループに導入した。レプチンを３つの順方向プライマー（ＬＦ１、ＬＦ２、ＬＦ３）および３つの逆方向プライマー（ＬＲ１、ＬＲ２、ＬＲ３）（表３）の組み合わせで増幅し、ＢａｍＨＩおよびＸｍａＩを用いて骨格にクローニングした。一本鎖ＦＳＨ（ｓｃＦＳＨ）を、β鎖をコードする遺伝子の３’とα鎖をコードする遺伝子の５’を
ＧＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＧＡＡＣＧＣＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＡＡＴＧＣＡＡＣＴＴＣＡＧＧＡＴＣＧＡＣＴＡＧＴ（配列番号：２）で連結することによって構築した。次に、レプチン構築物に使用したのと同様の戦略を用いてｓｃＦＳＨを増幅した（表４）。
Figure 2017536833
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レンチウイルスの作製：ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、１：１：１のモル比のｐＣＭＶ−ｄＲ８．９１およびｐＶＳＶ−ＧパッケージングプラスミドとｐＬＶ２ベースのレンチウイルスプラスミドでトランスフェクトした。上清中のレンチウイルスをトランスフェクションの４８時間後に収集し、その後０．４５μｍのポリエーテルスルホン膜フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過した。Ｌｅｎｔｉ−Ｘ ｐ２４ Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて力価を測定した。
安定な細胞株の構築：Ｃ末端赤血球凝集素エピトープ（ＨＡ）標識と融合したヒトレプチン受容体（ＬｅｐＲ）遺伝子を、関心対象の遺伝子の発現が伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターによって駆動されるｐＬＶ２ベースのベクターにクローニングした。ＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ ＳＩＥ−Ｂｌａ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に１ｎｇ／ｍｌの組換えヒトレプチンタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を形質導入して、刺激した。４０９ｎｍの励起波長および４６０ｎｍと５３０ｎｍの発光波長でＬｉｖｅＢＬＡｚｅｒ−ＦＲＥＴ Ｂ／Ｇ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してレプチン応答性細胞を選別した。
ヒトＦＳＨＲ細胞株の構築は、ＣＲＥによって制御されるβ−ラクタマーゼを発現するレンチウイルスを細胞に共形質導入したことを除き、ヒトＬｅｐＲに関するのと同じ戦略に従った。
Ｂａｆ３ ＬｅｐＲ細胞株を構築するため、ヒトＬｅｐＲをｐＭＳＣＶｐｕｒｏベクターにクローニングし、次にこれをＰｈｅｏｎｉｘ細胞にトランスフェクトして、レトロウイルスを作製した。ＩＬ−３依存性Ｂａｆ３細胞を前記レトロウイルスに感染させ、細胞を１０μｇ／ｍｌピューロマイシンで選択した。ピューロマイシン耐性細胞を、その後、１０ｎｇ／ｍｌレプチンを含有する培地で培養した。
増殖アッセイ：Ｂａｆ３ ＬｅｐＲ細胞をＩＬ−３不含培地で３回洗浄し、２０万細胞／ｍｌに希釈して、９６ウェルプレートに接種した（８０μｌ／ウェル）。段階希釈したタンパク質（２０μｌ／ウェル）を細胞に添加し、１．２５ｐＭ、１２．５ｐＭ、１２５ｐＭ、１．２５ｎＭ、１２．５ｎＭおよび１２５ｎＭの濃度にした。細胞を３７℃でさらに４８時間培養した。＋ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に添加した（２０μｌ／ウェル）。４９０ｎｍの吸光度を記録した。
ＣＤ分光法測定：精製したタンパク質をリン酸ナトリウム緩衝液に２回透析し、次に０．５ｍＭに希釈した。遠紫外ＣＤシグナルを、１ｍｍの経路長キュベットを使用してＡｖｉｖ Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４２０で収集し、２６０〜１９０ｎｍにわたる測定を室温で行った。
示差ＨＤＸ−ＭＳ：示差、溶液相アミドＨＤＸ実験を、少し変更を加えて以前に記述されているように、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と接続した完全自動化システム（ＣＴＣ ＨＴＳ ＰＡＬ、ＬＥＡＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｒｂｏｒｏ，ＮＣ； ４℃のキャビネット内に収納）を用いて実施した。示差ＨＤＸ実験のために、ＩｇＧ−レプチン（１０μＭ）またはレプチン（１０μＭ）単独のいずれか５μｌをＤ２Ｏ含有ＨＤＸ緩衝液（２０ｍＭトリス７．３、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ）２０μｌと混合し、４℃で所定の時間（０秒、１０秒、３０秒、６０秒、９００秒または３，６００秒）インキュベートした。オン交換後、望ましくない順方向または逆交換を最小限に抑え、クエンチ溶液（３Ｍ尿素および５０ｍＭ ＴＣＥＰ中１％ｖ／ｖ ＴＦＡ）２５μｌの添加によってタンパク質を変性した。次にタンパク質を、２００μｌ／分で固定化２ｍｍ×２ｃｍペプシンカラム（社内で調製した）に通す（０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ、１５℃）ことによって消化し、生じた消化性ペプチドを２ｍｍ×１ｃｍ Ｃ１８トラップカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に捕捉した。次に結合したペプチドを、２ｍｍ×５０ｍｍ Ｃ１８ＨＰＬＣカラム（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で直線勾配（５〜５０％ＣＨ３ＣＮ ｗ／ｖおよび０．３％ｗ／ｖギ酸）を用いて４℃で８分間溶出させた。Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｐｌｕｓ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて質量分析データを取得した。各々のＨＤＸ実験を３回重複して実施し、示差ＨＤＸデータを、ＰｙＭＯＬ（Ｄｅｌａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してヒトレプチンの結晶構造（ＰＤＢコード：１ＡＸ８）に重ね合わせた。
ペプチドの同定およびＨＤＸデータの処理：ＬＴＱ線形イオントラップ質量分析計（ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて７０分の勾配にわたってＭＳ／ＭＳ実験を実施した。プロダクトイオンスペクトルをデータ依存モードで取得し、５つの最も豊富なイオンをプロダクトイオン分析のために選択した。ＭＳ／ＭＳ＊．生データファイルを＊．ｍｇｆファイルに変換し、その後ペプチドの同定とスコアリングのためにＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）に供した。２０以上のＭＡＳＣＯＴスコアを有するペプチドだけをＨＤＸ検出に使用するペプチドセットに含めた。ＭＳ／ＭＳ ＭＡＳＣＯＴ検索をデコイ（逆）配列に対しても実施し、偽陽性を除外した。ＭＡＳＣＯＴ検索からのすべてのペプチドイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルを手作業でさらにチェックし、最も高いＭＡＳＣＯＴスコアを有するユニークな荷電イオンだけを配列包括度を評価するのに使用した。各ペプチドの同位体エンベロープの強度加重平均ｍ／ｚ値（質量中心）および各ペプチドについての重水素吸収レベルを、社内で開発したソフトウェア、ＨＤＸ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈの最新版を用いて計算した。７０％の推定重水素回収率に基づいて逆交換反応についての補正を行い、オン交換緩衝液の公知の８０％重水素含量を説明した。
動物の処置：マウスにおけるすべての外科的処置は、Ｔｈｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩＡＣＵＣによって承認されたプロトコルに従って実施した。野生型Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ、ｏｂ／ｏｂ、ｄｂ／ｄｂおよびＤＩＯ（食事性肥満）マウスはＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからであった。
末梢投与によるインビボ機能を特徴付けるため、タンパク質を、レプチンについては６００ｎｇ／時、ＩｇＧ−レプチンについては３６００ｎｇ／時または骨格対照については２９２０ｎｇ／時で、皮下移植した浸透圧ポンプを介して送達した。中枢投与に関しては、タンパク質を、レプチンについては５０ｎｇ／時およびＩｇＧ−レプチンについては３００ｎｇ／時で、浸透圧脳注入ポンプを介して側脳室に送達した。各マウスについての食物摂取および体重を、指示されている実験期間中毎日測定した。ＥｃｈｏＭＲＩ Ｂｏｄｙ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて脂肪組成を測定した。
タンパク質クリアランスの速度を測定するため、単回用量のレプチン（４．５μｇ）またはＩｇＧ−レプチン（２７μｇ）を、頸静脈を介してマウスに送達し、その後指示されている時点で血液を採取した。ヒトレプチンの血漿濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。
インビボでのニューロン活性化を調べるため、ｏｂ／ｏｂマウスを、腹腔内注射によってレプチン（２．５μｇ／グラム体重）もしくはＩｇＧ−レプチン（１５μｇ／グラム体重）で、または脳室内注入によってレプチン（１００ｎｇ）もしくはＩｇＧ−レプチン（６００ｎｇ）で処置した。処置の１時間後、マウスをＰＢＳ、次いで４％パラホルムアルデヒドで経心腔的に灌流した。次に脳試料を切除し、視床下部中４％で後固定して、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ ５，ｅ１１３７６，２０１０において以前に記述されたように浮遊免疫染色法によって測定した。
前記発明を、理解の明瞭さのために例証と実施例によって少し詳しく説明したが、付属の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく特定の変更および修正を本発明に加え得ることは、本発明の教示に照らして当業者には容易に明らかになる。
本明細書で引用するすべての出版物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許および特許出願は、各々が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に指示されているかのごとくに参照により本明細書に組み込まれる。
ホストｓｃＦｖ骨格配列（配列番号：１）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳ ＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧ ＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹ ＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩ ＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹ ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＳＱＧ ＩＬＧＩＴＫＴＳＴＣＹＴＲＶＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＶＶＳＳＲＡＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＱＡＧＬＴＱＰＰＳＶＳＫＧＬＲＱＴＡＴＬＴＣＴＧＮＳＮＮＶＧＮＱＧＡＡＷＬＱＱＨＱＧＨＰＰＫＬＬＳＹＲＮＮＮＲＰＳＧＩＳＥＲＬＳＡＳＲＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＬＱＰＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＱＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
クローンＡ３ ｓｃリラキシン−Ｈ２配列プラス末端リンカー（配列番号：６９）
ＲＴＲＧＧＳＧＧＳ−ＱＬＹＳＡＬＡＮＫＣＣＨＶＧＣＴＫＲＳＬＡＲＦＣ−ＧＳＧＳＧＳＧＳ−
ＤＳＷＭＥＥＶＩＫＬＣＧＲＥＬＶＲＡＱＩＡＩＣＧＭＳＴＷＳ−ＳＧＧＧＧＳＬＭＳ
クローンＣ１２−２ ｓｃリラキシン−Ｈ２配列プラス末端リンカー（配列番号：７１）
ＲＴＲＧＧＳＧＧＳ−ＱＬＹＳＡＬＡＮＫＣＣＨＶＧＣＴＫＲＳＬＡＲＦＣ−ＧＳＧＳＧＳＧＳ−
ＤＳＷＭＥＥＶＩＫＬＣＧＲＥＬＶＲＡＱＩＡＩＣＧＭＳＴＷＳ−ＳＧＧＧＧＳＫＰＰ
クローンＣ１２−１ ｓｃリラキシン−Ｈ２配列プラス末端リンカー（配列番号：７２）
ＰＬＮＧＧＳＧＧＳ−ＱＬＹＳＡＬＡＮＫＣＣＨＶＧＣＴＫＲＳＬＡＲＦＣ−ＧＳＧＳＧＳＧＳ−
ＤＳＷＭＥＥＶＩＫＬＣＧＲＥＬＶＲＡＱＩＡＩＣＧＭＳＴＷＳ−ＳＧＧＧＧＳＫＰＰ

Claims (46)

  1. 異種タンパク質骨格に組み込まれた機能性誘導体エフェクターポリペプチドを作製する方法であって、（ａ）標的エフェクターポリペプチドをＮ末端リンカーのコンビナトリアルライブラリおよびＣ末端リンカーのコンビナトリアルライブラリで修飾し、修飾されたエフェクターポリペプチドの集団を作製すること、（ｂ）前記修飾されたエフェクターポリペプチドを異種タンパク質骨格に挿入し、候補誘導体エフェクターポリペプチドのコンビナトリアルライブラリを作製すること、（ｃ）候補誘導体エフェクターポリペプチドの前記ライブラリから、前記エフェクターポリペプチドの生物学的機能またはシグナル伝達活性を有する１つ以上の成員を同定することを含み、これにより異種タンパク質骨格に組み込まれた機能性誘導体エフェクターポリペプチドを作製する、方法。
  2. 前記異種タンパク質骨格が抗体骨格である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記修飾エフェクターポリペプチドを、前記抗体骨格の相補性決定領域（ＣＤＲ）を置換することによって前記抗体骨格に挿入する、請求項２に記載の方法。
  4. 前記Ｎ末端リンカーおよび前記Ｃ末端リンカーの各々がランダム化されたペプチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記Ｎ末端リンカーがアミノ酸配列Ｘａ（ＧｂＳｃ）ｎ（配列番号：８６）またはＸａ（ＳｃＧｂ）ｎ（配列番号：８７）を含み、および前記Ｃ末端リンカーがアミノ酸配列（ＧｅＳｆ）ｍＸｄ（配列番号：８８）または（ＳｆＧｅ）ｍＸｄ（配列番号：８９）を含み、ここでＸは任意のアミノ酸残基であり、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンであり、ｍおよびｎは、各々独立して１から６のランダムな数であり、ａおよびｄは、各々独立して１から５のランダムな数であり、ｂおよびｅは、各々独立して０から６のランダムな数であり、ならびにｃおよびｆは、各々独立して０から２のランダムな数であり、ならびにここでｎまたはｍが１より大きい場合、各々のＧＳリピート中のｂ、ｃ、ｅまたはｆは、それぞれその他のＧＳリピート中のｂ、ｃ、ｅまたはｆとは異なり得る、請求項４に記載の方法。
  6. （ａ）および（ｂ）を各々組換えによって実施する、請求項１に記載の方法。
  7. （ｃ）を、前記候補誘導体エフェクターポリペプチドを保有するまたは前記候補誘導体エフェクターポリペプチドと接触するレポーター細胞の自己分泌に基づく表現型スクリーニングによって実施する、請求項１に記載の方法。
  8. 前記エフェクターポリペプチドが、前記レポーター細胞によって発現される細胞受容体のリガンドである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記エフェクターポリペプチドがホルモンである、請求項７に記載の方法。
  10. 前記エフェクターポリペプチドが、約５ｋＤａから約２５ｋＤａの分子量を有する、請求項７に記載の方法。
  11. 前記レポーター細胞が、前記エフェクターポリペプチドとの接触に応答性である、請求項７に記載の方法。
  12. 前記候補誘導体エフェクターポリペプチドがレンチウイルスベクターによって発現される、請求項７に記載の方法。
  13. 前記抗体骨格が一本鎖抗体である、請求項２に記載の方法。
  14. 前記抗体骨格が一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１３に記載の方法。
  15. 抗体骨格が、前記修飾エフェクターポリペプチドの挿入後にその抗原結合活性を保持する、請求項２に記載の方法。
  16. 前記エフェクターポリペプチドがレプチンまたは一本鎖卵胞刺激ホルモン（ｓｃＦＳＨ）であり、ならびに前記Ｎ末端リンカーおよび前記Ｃ末端リンカーが各々、（ａ）２から４個のランダムなアミノ酸残基の配列および（ｂ）ＧＧＧＧＳ（配列番号：４）の１から５個の縦列反復配列を含むまたはこれらから成る、請求項１に記載の方法。
  17. 前記Ｎ末端リンカーがＸＸＸ（ＧＧＧＧＳ）１〜３（配列番号：３５）を含むまたはこれから成り、および前記Ｃ末端リンカーが（ＧＧＧＧＳ）１〜３ＸＸＸ（配列番号：３６）を含むまたはこれから成る、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記エフェクターポリペプチドがリラキシンの一本鎖変異体（ｓｃリラキシン）分子である、請求項１に記載の方法。
  19. 前記リラキシン分子がヒトリラキシン２である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記リラキシン分子の前記一本鎖変異体が、（ＧＳ）ｎ（配列番号：４４）［式中、ｎ＝３〜５］のリンカーによって連結されたＡ鎖およびＢ鎖を含む、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記Ｎ末端リンカーがアミノ酸配列Ｘａ（ＧＧＧＧＳ）ｂ（ＧＧＧＳ）ｃ（ＧＧＳ）ｄ（配列番号：８２）またはＸａ（ＧＧＳ）ｅ（配列番号：８３）を含み、および前記Ｃ末端リンカーがアミノ酸配列（ＳＧＧＧＧ）ｆ（ＳＧ）ｇＸａ（配列番号：８４）または（ＳＧＧＧＧ）ｆＳｇＸａ（配列番号：８５）を含み、ここでＸはランダム化されたアミノ酸残基であり、ａは２から４のランダムな数であり、ｂおよびｆは、各々独立して１から２のランダムな数であり、ｅは１から３のランダムな数であり、ならびにｃ、ｄおよびｇは、各々独立して０から２のランダムな数である、請求項１８に記載の方法。
  22. エフェクターポリペプチドで置換された相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体骨格を含む、抗体骨格に組み込まれた修飾エフェクターポリペプチドであって、ここで前記エフェクターポリペプチドがＮ末端リンカーおよびＣ末端リンカーによって前記抗体配列に連結されており、ならびに前記Ｎ末端リンカーがアミノ酸配列Ｘａ（ＧｂＳｃ）ｎ（配列番号：８６）またはＸａ（ＳｃＧｂ）ｎ（配列番号：８７）を含み、および前記Ｃ末端リンカーがアミノ酸配列（ＧｅＳｆ）ｍＸｄ（配列番号：８８）または（ＳｆＧｅ）ｍＸｄ（配列番号：８９）を含み、ここでＸは任意のアミノ酸残基であり、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンであり、ｍおよびｎは、各々独立して１から６のランダムな数であり、ａおよびｄは、各々独立して１から５のランダムな数であり、ｂおよびｅは、各々独立して０から６のランダムな数であり、ならびにｃおよびｆは、各々独立して０から２のランダムな数であり、ならびにｎまたはｍが１より大きい場合、各々のＧＳリピート中のｂ、ｃ、ｅまたはｆは、それぞれその他のＧＳリピート中のｂ、ｃ、ｅまたはｆとは異なり得る、修飾エフェクターポリペプチド。
  23. 前記エフェクターポリペプチドが細胞受容体のリガンドである、請求項２２に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  24. 前記エフェクターポリペプチドがホルモンである、請求項２２に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  25. 前記エフェクターポリペプチドが、約５ｋＤａから約２５ｋＤａの分子量を有する、請求項２２に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  26. 前記抗体骨格が一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項２２に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  27. 前記抗体骨格が配列番号：１を含み、および前記抗体骨格中のＨＣＤＲ３（ＬＧＩＴＫＴＳＴＣＹＴ；配列番号：３）が前記エフェクターポリペプチドで置換されている、請求項２２に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  28. 前記エフェクターポリペプチドがレプチンまたはｓｃＦＳＨである、請求項２７に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  29. 前記Ｎ末端リンカーおよび前記Ｃ末端リンカーがランダム化された配列を含む、請求項２８に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  30. 前記Ｎ末端リンカーがアミノ酸配列ＸＸＸ（ＧＧＧＧＳ）１〜３（配列番号：３５）を含み、および前記Ｃ末端リンカーがアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）１〜３ＸＸＸ（配列番号：３６）を含む、請求項２８に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  31. 前記エフェクターポリペプチドがヒトレプチンであり、ならびに前記Ｎ末端リンカーおよび前記Ｃ末端リンカーが、（１）それぞれ、ＬＧＶＧＧＧＧＳ（配列番号：５）およびＧＧＧＧＳＥＲＴ（配列番号：６）；（２）それぞれ、ＨＬＴＧＧＧＧＳ（配列番号：７）およびＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＤＰＳ（配列番号：８）；（３）それぞれ、ＰＷＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：９）およびＧＧＧＧＳＱＰＰ（配列番号：１０）；（４）それぞれ、ＫＴＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：１１）およびＧＧＧＧＳＳＤＥ（配列番号：１２）；（５）それぞれ、ＫＶＴＧＧＧＧＳ（配列番号：１３）およびＧＧＧＧＳＱＬＥ（配列番号：１４）；または（６）それぞれ、ＲＨＭＧＧＧＧＳ（配列番号：３７）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＤＴ（配列番号：３８）と実質的に同一である、請求項２８に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  32. 前記エフェクターポリペプチドがｓｃＦＳＨであり、ならびに前記Ｎ末端リンカーおよび前記Ｃ末端リンカーが、（１）それぞれ、ＲＳＨＧＧＧＧＳ（配列番号：１５）およびＧＧＧＧＳＶＮＰ（配列番号：１６）；（２）それぞれ、ＱＲＶＧＧＧＧＳ（配列番号：１７）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＡ（配列番号：１８）；または（３）それぞれ、ＲＶＬＧＧＧＧＳ（配列番号：１９）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＳＳ（配列番号：２０）と実質的に同一である、請求項２８に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  33. 前記エフェクターポリペプチドが一本鎖ヒトリラキシン２（ｓｃリラキシン）である、請求項２７に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  34. 前記一本鎖リラキシンポリペプチドが、コネクタ配列（ＧＳ）ｎ（配列番号：４４）［式中、ｎ＝３〜５］によって連結されたＡ鎖およびＢ鎖を含む、請求項３３に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  35. 前記Ｎ末端リンカーがＸＸＸＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：７８）またはＸＸＸＧＧＳＧＧＳ（配列番号：７９）を含み、および前記Ｃ末端リンカーがＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＸＸＸ（配列番号：８０）またはＳＧＧＧＧＳＸＸＸ（配列番号：８１）を含み、ここでＸは任意のランダム化されたアミノ酸残基である、請求項３３に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  36. 前記Ｎ末端リンカーおよび前記Ｃ末端リンカーが、それぞれ、（１）ＲＴＲＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５０）およびＳＧＧＧＧＳＬＭＳ（配列番号：５１）（クローンＡ３）；（２）ＲＴＲＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５０）およびＳＧＧＧＧＳＫＰＰ（配列番号：５２）（クローンＡ１２−２）；（３）ＰＬＮＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５３）およびＳＧＧＧＧＳＫＰＰ（配列番号：５２）（クローンＣ１２−１）；（４）ＬＰＲＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５４）およびＳＧＧＧＧＳＬＤＳ（配列番号：５５）；（５）ＱＴＴＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５６）およびＳＧＧＧＧＳＫＧＴ（配列番号：５７）；（６）ＨＭＦＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５８）およびＳＧＧＧＧＳＫＡＰ（配列番号：５９）；（７）ＱＲＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：６０）およびＳＧＧＧＧＳＷＳＰ（配列番号：６１）；（８）ＲＱＲＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号：６２）およびＳＧＧＧＧＳＶＲＡ（配列番号：６３）；（９）ＲＬＴＧＧＳＧＧＳ（配列番号：６４）およびＳＳＧＧＷＳＡＧＧＧＳＧＶＲＳ（配列番号：６５）；または（１０）ＲＮＲＧＧＧＧＳＧＧＲＳＧＧＳ（配列番号：６６）およびＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＲＰ（配列番号：６７）に示す配列と実質的に同一である、請求項３３に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  37. 前記Ｎ末端リンカーおよび前記Ｃ末端リンカーが、それぞれ、（１）ＲＴＲＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５０）およびＳＧＧＧＧＳＬＭＳ（配列番号：５１）（クローンＡ３）；（２）ＲＴＲＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５０）およびＳＧＧＧＧＳＫＰＰ（配列番号：５２）（クローンＡ１２−２）；または（３）ＰＬＮＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５３）およびＳＧＧＧＧＳＫＰＰ（配列番号：５２）（クローンＣ１２−１）に示す配列と同一である、請求項３３に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  38. 前記ＬＧＩＴＫＴＳＴＣＹＴ（配列番号：３）ループが、配列番号：６９、配列番号：７１または配列番号：７２に示すリンカー修飾一本鎖ヒトリラキシン２配列で置換されている、請求項３３に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  39. 配列番号：６８〜７７から成る群より選択される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の修飾エフェクターポリペプチド。
  40. 請求項２２に記載の修飾エフェクターポリペプチドをコードする単離されたまたは組換えポリヌクレオチド。
  41. 被験体においてレプチン欠損に関連するまたはレプチン欠損によって媒介される疾患または障害の発症を処置するまたは予防する方法であって、請求項３１に記載の修飾または誘導体レプチンポリペプチドの治療有効量を含有する医薬組成物を前記被験体に投与することを含む方法。
  42. 前記疾患または障害が、肥満、脂肪異栄養症、視床下部性無月経または先天性レプチン欠損症である、請求項４１に記載の方法。
  43. 被験体においてＦＳＨ欠損に関連するまたはＦＳＨ欠損によって媒介される疾患または障害の発症を処置するまたは予防する方法であって、請求項３２に記載の修飾または誘導体ｓｃＦＳＨポリペプチドの治療有効量を含有する医薬組成物を前記被験体に投与することを含む方法。
  44. 前記疾患または障害が、性腺機能低下症、多嚢胞性卵巣症候群、カルマン症候群、視床下部抑制、下垂体機能低下症、過プロラクチン血症または性腺刺激ホルモン欠損症である、請求項４３に記載の方法。
  45. 被験体においてリラキシン２欠損またはリラキシン２シグナル伝達障害に関連するまたはこれによって媒介される疾患または障害の発症を処置するまたは予防する方法であって、請求項３６に記載の修飾または誘導体リラキシン分子の治療有効量を含有する医薬組成物を前記被験体に投与することを含む方法。
  46. 前記疾患または障害が、心不全、線維症、高血圧症、強皮症または癌である、請求項４５に記載の方法。
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