JP2017534583A

JP2017534583A - 脳転移を治療するための方法

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Publication number: JP2017534583A
Application number: JP2017515756A
Authority: JP
Inventors: ジョアンマッサーグ，; エイドリアンボワール，; チンチェン，
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2014-09-19
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2035-09-18
Also published as: EP3193865A4; EP3193865B1; WO2016044790A1; CA2961894A1; EP3685832B1; AU2021202257A1; CN107106544A; NZ730319A; US10413522B2; US20170258758A1; AU2015317330A1; CN107106544B; AU2015317330B2; AU2021202257B2; EP3193865A1; AU2023219864A1; EP3685832A1; US20200085781A1; JP6898848B2; CA2961894C

Abstract

本発明は、ギャップジャンクション機能性を阻害することによって脳転移を治療するための方法に関する。これは、少なくとも一部において、プロトカドヘリン７およびコネキシン４３を発現するがん細胞が、脳転移の成長を促進する、アストロサイトとのギャップジャンクションを形成するという発見、およびがん細胞におけるプロトカドヘリン７および／またはコネキシン４３の発現を阻害することにより脳転移の進行が低減するという発見に基づく。これは、さらに、ギャップジャンクション阻害剤であるトナベルサットおよびメクロフェナメートを用いた治療により、脳転移病変の進行が阻害され、また、従来の化学療法剤であるカルボプラチンの抗がん活性が増強されたという発見に基づく。

Description

優先権主張
この出願は、２０１４年９月１９日に出願された米国仮出願第６２／０５２，９６６号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。

助成金の情報
この発明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈによって付与された助成金番号Ｐ０１−ＣＡ１２９２４３およびＰ３０−ＣＡ００８７４８ならびにＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｆｅｎｓｅ（ＤｏＤ）によって付与された助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ−１２−００７４の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

１．導入
本発明は、脳転移の治療において使用するためのギャップジャンクション阻害剤に関する。これらの阻害剤は、そのようなものとして、がん患者を治療する方法において使用することができる。

２．発明の背景
脳転移は、進行期がんの２０〜４０％で生じ、成人において最も蔓延している頭蓋内悪性疾患を表す（ＧａｖｒｉｌｏｖｉｃおよびＰｏｓｎｅｒ、２００５年；Ｍａｈｅｒら、２００９年）。最も一般的な供給源は肺がんおよび乳がんである。他の転移部位における治療は進歩しているにもかかわらず、脳転移に関する現行の臨床管理では、限られた疾患制御しかもたらされず、大多数の患者が診断後１２カ月未満に腫瘍の進行により死亡する（ＧａｖｒｉｌｏｖｉｃおよびＰｏｓｎｅｒ、２００５年；Ｓｔｅｌｚｅｒ、２０１３年）。したがって、この疾患プロセスの基礎をなす機構を、合理的な治療戦略に活用することができるように理解しなければならない。

脳の独特の微小環境により、転移がん細胞にとって厄介な関門がもたらされる。最近の進歩により、脳転移の開始に関与する複雑な細胞間相互作用および分子間相互作用が解明され始めている。脳毛細血管中に機械的に留まる循環がん細胞は、まず、血液脳関門（ＢＢＢ）を構成する強化血管壁を横断しなければならない（Ｅｉｃｈｌｅｒら、２０１１年）。実験モデルにおいてがん細胞のＢＢＢを通じた血管外遊出を媒介する遺伝子および診療所において脳転移を予測する遺伝子が同定されている（Ｂｏｓら、２００９年；Ｌｉら、２０１３年）。転移細胞は、いちど脳実質の内側に入れば、微小血管系に付随したまま残る（Ｋｉｅｎａｓｔら、２０１０年；ＬｏｒｇｅｒおよびＦｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ、２０１０年）。がん細胞において細胞接着分子Ｌ１ＣＡＭが発現することにより、転移性増生（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）開始に必要である、がん細胞の反管腔側毛細血管基底板への密接な接着が媒介される（Ｖａｌｉｅｎｔｅら、２０１４年）。Ｗｎｔは増生を支持するシグナル伝達経路の１つである（Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年）。しかし、脳に浸潤するがん細胞の大部分は消滅し（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、２００２年；Ｈｅｙｎら、２００６年；Ｋｉｅｎａｓｔら、２０１０年）、また、それらは脳において最も豊富な細胞型であるアストロサイトによって拒絶される（Ｖａｌｉｅｎｔｅら、２０１４年）。

機能的に多面的なアストロサイトは、ＢＢＢを維持し、神経血管カップリングを調整し、ストリンジェントな代謝的要求の下で組織の恒常性を持続させ（Ｏｂｅｒｈｅｉｍら、２０１２年）、また、傷害または浸潤細胞のような妨害に対して急性に反応する（ＰｅｋｎｙおよびＮｉｌｓｓｏｎ、２００５年）。反応性アストロサイトは、プラスミンを生成し、それにより、アポトーシス促進性サイトカインであるＦａｓＬが動員されて浸潤がん細胞を死滅させる（Ｖａｌｉｅｎｔｅら、２０１４年）。プラスミンは、さらに、がん細胞の細胞表面Ｌ１ＣＡＭを切断して、がん細胞が脈管構造を利用する能力を抑制する（Ｖａｌｉｅｎｔｅら、２０１４年）。アストロサイトによる攻撃から逃れるために、乳がんおよび肺がん由来の脳転移細胞は、プラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）のセルピン阻害剤を発現する（Ｖａｌｉｅｎｔｅら、２０１４年）。これらの観察結果から、アストロサイトにより脳が転移性浸潤から保護されていることが示されるが、転移におけるアストロサイトの役割は、均一にアンタゴニスト性ではない場合があるという証拠も存在する。ｉｎｖｉｔｒｏでは、アストロサイト共培養物により、メラノーマ細胞株が化学療法薬から保護され（Ｋｉｍら、２０１１年）、また、ｉｎｖｉｖｏでは、アストロサイトによりがん細胞におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達が活性化され得る（Ｘｉｎｇら、２０１３年）。

Ｖａｌｉｅｎｔｅら、Ｃｅｌｌ（２０１４）１５６、１００２〜１０１６Ｋｉｍら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ（２０１１）１３、２８６〜２９８Ｘｉｎｇら、ＥＭＢＯＭｏｌＭｅｄ（２０１３）５、３８４〜３９６

３．発明の要約
本発明は、ギャップジャンクション機能性を阻害することによって脳転移を治療するための方法に関する。これは、少なくとも一部において、プロトカドヘリン７およびコネキシン４３を発現するがん細胞が、脳転移の成長を促進する、アストロサイトとのギャップジャンクションを形成するという発見、およびがん細胞におけるプロトカドヘリン７および／またはコネキシン４３の発現を阻害することにより脳転移の進行が低減するという発見に基づく。これは、さらに、ギャップジャンクション阻害剤であるトナベルサット（ｔｏｎａｂｅｒｓａｔ）およびメクロフェナメート（ｍｅｃｌｏｆｅｎａｍａｔｅ）を用いた治療により、脳転移病変の進行が阻害され、また、従来の化学療法剤であるカルボプラチンの抗がん活性が増強されたという発見に基づく。

特定の非限定的な実施形態は、がんを有する被験体を治療するための方法であって、被験体に、脳のがんの転移性進行を阻害する量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。特定の非限定的な例では、ギャップジャンクション阻害剤は、コネキシン４３阻害剤またはプロトカドヘリン７阻害剤、またはこれらの組合せである。特定の非限定的な例では、阻害剤は、トナベルサットまたはメクロフェナメートまたはこれらの組合せである。特定の非限定的な例では、がんは、乳がんまたは肺がんであり、かつ／または、被験体のがん細胞はコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する。特定の非限定的な例では、方法は、被験体に、治療有効量の抗がん剤、例えば、これだけに限定されないが、カルボプラチンなどを投与するステップをさらに含む。本発明の方法を適用する時に、被験体は、１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた場合もあり、あるいは、治療前に脳転移を有することが分かっていなかった。

特定の非限定的な実施形態は、被験体の脳において転移がん細胞の成長および／または生存を阻害するための方法であって、被験体を治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を用いて治療するステップを含む方法を提供する。

特定の非限定的な例では、ギャップジャンクション阻害剤は、コネキシン４３阻害剤またはプロトカドヘリン７阻害剤、またはこれらの組合せである。特定の非限定的な例では、阻害剤は、トナベルサットまたはメクロフェナメートまたはこれらの組合せである。特定の非限定的な例では、がんは、乳がんまたは肺がんであり、かつ／または、被験体のがん細胞はコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する。特定の非限定的な例では、方法は、被験体に、治療有効量の抗がん剤、例えば、これだけに限定されないが、カルボプラチンなどを投与するステップをさらに含む。本発明の方法を適用する時に、被験体は、１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた場合もあり、あるいは、治療前に脳転移を有することが分かっていなかった。

特定の非限定的な実施形態は、がんを有する被験体において脳転移を治療するための方法であって、被験体に治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。特定の非限定的な例では、ギャップジャンクション阻害剤は、コネキシン４３阻害剤またはプロトカドヘリン７阻害剤、またはこれらの組合せである。特定の非限定的な例では、阻害剤は、トナベルサットまたはメクロフェナメートまたはこれらの組合せである。特定の非限定的な例では、がんは、乳がんまたは肺がんであり、かつ／または、被験体のがん細胞はコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する。特定の非限定的な例では、方法は、被験体に、治療有効量の抗がん剤、例えば、これだけに限定されないが、カルボプラチンなどを投与するステップをさらに含む。本発明の方法を適用する時に、被験体は、１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた場合もあり、あるいは、治療前に脳転移を有することが分かっていなかった。

特定の非限定的な実施形態は、がんを有する被験体においてがんの脳への転移を予防する方法であって、被験体に治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。特定の非限定的な例では、ギャップジャンクション阻害剤は、コネキシン４３阻害剤またはプロトカドヘリン７阻害剤、またはこれらの組合せである。特定の非限定的な例では、阻害剤は、トナベルサットまたはメクロフェナメートまたはこれらの組合せである。特定の非限定的な例では、がんは、乳がんまたは肺がんであり、かつ／または、被験体のがん細胞はコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する。特定の非限定的な例では、方法は、被験体に、治療有効量の抗がん剤、例えば、これだけに限定されないが、カルボプラチンなどを投与するステップをさらに含む。本発明の方法を適用する時に、被験体は、１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた場合もあり、あるいは、治療前に脳転移を有することが分かっていなかった。

特定の非限定的な実施形態は、がんを有する被験体においてがんの脳への検出可能な転移のリスクを低減する方法であって、被験体に治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。特定の非限定的な例では、ギャップジャンクション阻害剤は、コネキシン４３阻害剤またはプロトカドヘリン７阻害剤、またはこれらの組合せである。特定の非限定的な例では、阻害剤は、トナベルサットまたはメクロフェナメートまたはこれらの組合せである。特定の非限定的な例では、がんは、乳がんまたは肺がんであり、かつ／または、被験体のがん細胞はコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する。特定の非限定的な例では、方法は、被験体に、脳において治療レベルを実現することができる治療有効量の抗がん剤、例えば、これだけに限定されないが、カルボプラチンなどを投与するステップをさらに含む。本発明の方法を適用する時に、被験体は、１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた場合もあり、あるいは、治療前に脳転移を有することが分かっていなかった。

特定の非限定的な実施形態は、がんを有する被験体においてがんの脳への検出可能な転移のリスクを低減する方法であって、被験体に治療有効量のプロトカドヘリン７阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。特定の非限定的な例では、プロトカドヘリン７阻害剤は、干渉ＲＮＡである。特定の非限定的な例では、がんは、乳がんまたは肺がんであり、かつ／または、被験体のがん細胞はコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する。特定の非限定的な例では、方法は、被験体に、治療有効量の抗がん剤、例えば、これだけに限定されないが、カルボプラチンなどを投与するステップをさらに含む。本発明の方法を適用する時に、被験体は、１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた場合もあり、あるいは、治療前に脳転移を有することが分かっていなかった。

特定の非限定的な実施形態は、がんを有する被験体の生存期間を延長する方法であって、被験体に有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法であり、例えば、ギャップジャンクション阻害剤を投与が、脳のがんの転移性進行を阻害する方法を提供する。特定の非限定的な例では、ギャップジャンクション阻害剤は、コネキシン４３阻害剤またはプロトカドヘリン７阻害剤、またはこれらの組合せである。特定の非限定的な例では、阻害剤は、トナベルサットまたはメクロフェナメートまたはこれらの組合せである。特定の非限定的な例では、がんは、乳がんまたは肺がんであり、かつ／または、被験体のがん細胞はコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する。特定の非限定的な例では、方法は、被験体に、治療有効量の抗がん剤、例えば、これだけに限定されないが、カルボプラチンなどを投与するステップをさらに含む。本発明の方法を適用する時に、被験体は、１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた場合もあり、あるいは、治療前に脳転移を有することが分かっていなかった。

特定の非限定的な実施形態は、ギャップジャンクション活性を評価するため、例えば、ｃＧＡＭＰの低下がギャップジャンクション阻害と相関する場合に、ｃＧＡＭＰのレベルを測定することによって阻害を評価するためのアッセイを提供する。特定の非限定的な実施形態は、被験体の脳において転移がん細胞の成長および／または生存を阻害するための方法であって、被験体を治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を用いて治療するステップであり、当該治療有効量のギャップジャンクション阻害剤が、その量のギャップジャンクション阻害剤の非存在下でのｃＧＡＭＰのレベルと比較してｃＧＡＭＰの低下をもたらすものであるステップを含む方法を提供する。さらなる非限定的な実施形態は、被験体において脳腫瘍または転移性脳腫瘍がギャップジャンクション阻害剤を用いた治療から治療的利益を受けるかどうかを決定する方法であって、前記腫瘍に由来する試料において、ギャップジャンクション阻害剤への曝露によりｃＧＡＭＰの低下が導かれるかどうかを決定するステップを含み、ｃＧＡＭＰの低下が、治療的利益を示す、方法を提供する。

図１Ａ〜Ｋ、脳転移とのＣｘ４３およびＰＣＤＨ７の関連。（Ａ）マウスにおける心臓内接種後の初期（７日目）および後期（２１日目）の時点で、脳実質内でＧＦＰ＋Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞（緑色）がＧＦＡＰ＋活性化アストロサイト（赤色）で囲まれている。青色は、血管におけるＩＶ型コラーゲン（ＣｏｌＩＶ）染色である。スケールバーは１０μｍである。（Ｂ）ＧＦＰ＋Ｈ２０３０−ＢｒＭ３（緑色）とＧＦＡＰ＋アストロサイト（青色）の界面におけるＣｘ４３染色（矢じり）。スケールバーは１０μｍである。（Ｃ）トリプルネガティブ乳がんおよび非小細胞肺癌由来のヒト脳転移試料におけるＣｘ４３染色の代表的な画像。原発性（１ｒｙ）腫瘍、脳転移、および正常な肺組織におけるＣＸ４３陽性試料の割合を定量化した。スケールバーは１００μｍである。（Ｄ）非小細胞肺癌患者由来の対応する原発性および脳転移試料におけるＣｘ４３免疫染色の代表的な画像および定量化。スケールバーは１００μｍである。（Ｅ）色素移行アッセイの概略図。（Ｆ）アストロサイトからがん細胞への色素移行の定量化。ヒストグラムは、親細胞（Ｐａｒ）およびＢｒＭ細胞における赤色蛍光シグナルを示す。全ての値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３の生物学的反復）。ｎ＝３の独立した実験。（Ｇ〜Ｉ）示されている親および脳転移派生物（（Ｇ）ｎ＝３の独立した実験）、脳細胞型と比較した脳転移細胞（（Ｈ）ｎ＝２の独立した実験）、ならびに脳、肺（ＬＭ）または骨（ＢｏＭ）に転移したＭＤＡ２３１派生物（（Ｉ）ｎ＝２の独立した実験）におけるＣｘ４３およびＰＣＤＨ７のウエスタン免疫ブロッティング。（Ｊ〜Ｋ）１８９症例のトリプルネガティブ乳がん（Ｊ）および１２９症例（ＭＳＫＣＣｓｅｔ２）および５８症例（ＧＳＥ３１４１）の肺腺癌（Ｋ）における、原発性腫瘍におけるＣｘ４３／ＰＣＤＨ７発現に基づく脳転移のない累積的な生存期間のカプラン・マイヤープロット。

図２Ａ〜Ｇ、Ｃｘ４３／ＰＣＤＨ７癌腫−アストロサイトギャップジャンクションにより脳転移が媒介される。（Ａ）アストロサイトから対照およびＣｘ４３枯渇またはＰＣＤＨ７枯渇脳転移細胞への色素移行のヒストグラム（上）および定量化（下）。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝３の生物学的反復）。ｎ＝３の独立した実験。（Ｂ）Ｃｘ４３−ＰＣＤＨ７相互作用を検出するためのルシフェラーゼ補完アッセイ。ＮＬｕｃおよびＣＬｕｃはホタルルシフェラーゼのＮ末端側半分およびＣ末端側半分である。表（上）は、アッセイ（下）、および代表的なプレートの生物発光イメージング（ＢＬＩ）において使用した細胞株組合せを数字で同定する。対照、Ｃｘ４３枯渇、またはＰＣＤＨ７枯渇脳転移細胞によって形成された脳転移病変のＢＬＩ（Ｃ）および定量化（Ｄ）。ｎ＝３の独立した実験。（Ｅ、Ｆ）野生型（ＷＴ）Ｃｘ４３またはＴ１５４Ａ変異体（Ｍｕｔ）Ｃｘ４３をＣｘ４３枯渇ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞（Ｃｘ４３ｓｈ２）において再発現させた。この細胞を、アストロサイト色素移行分析（（Ｅ）ｎ＝３の独立した実験）、または脳転移アッセイおよびＢＬＩ定量化（（Ｆ）ｎ＝２の独立した実験）に供した。（Ｇ）脳転移におけるがん細胞とアストロサイトの間のＣｘ４３媒介性相互作用およびＰＣＤＨ７媒介性相互作用の概略図。

図３Ａ〜Ｉ、ギャップジャンクションによりがん細胞におけるＳＴＡＴ１およびＮＦ−κＢ経路が活性化される。（Ａ）アストロサイトと共培養した後のＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞からのＴＲＡＰ−Ｓｅｑデータのシグナル伝達経路分析。Ｌ１０ａ−ＧＦＰリボソームタンパク質融合物を発現する対照（Ｃｔｒｌ）またはＣｘ４３枯渇ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞をアストロサイトと２４時間にわたって共培養した後、ポリソーム免疫沈降およびｍＲＮＡ配列決定を行った。ヒートマップは、青色（下方制御された）経路および赤色（上方制御された）経路を示す。ｎ＝２の生物学的反復。（Ｂ、Ｃ）アストロサイト共培養からの馴化培地（ＣＭ）と一緒に２時間インキュベートした後のＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞におけるＳＴＡＴ１およびＮＦ−κＢｐ６５リン酸化。ＣＭを、アストロサイトを対照またはＣｘ４３枯渇ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞と２４時間共培養した後に回収したか（Ｂ）、または、野生型Ｃｘ４３（ＷＴ）もしくはＣｘ４３（Ｔ１５４Ａ）変異体（Ｍｕｔ）を形質導入したＣｘ４３枯渇ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞から回収した（Ｃ）。ｎ≧３の独立した実験。（Ｄ）アストロサイトと、示されているＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞との共培養からのＣＭにおけるＩＦＮαおよびＴＮＦαのＥＬＩＳＡ。全ての値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝４の技術的反復）。ｎ≧２の独立した実験。（Ｅ）ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２がん細胞と共培養した後に再単離したアストロサイトにおけるＩＦＮＡおよびＴＮＦＡの相対的なｍＲＮＡレベル。全ての値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝３の生物学的反復）。ｎ＝２の独立した実験。（Ｆ）１０ユニット／ｍｌ（３９ユニット／ｎｇ）のＩＦＮαＡまたは１０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦαの存在下または非存在下で様々な濃度のカルボプラチン（Ｃａｒｂｏ）を用いて処理したＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞における切断カスパーゼ３の相対的なレベル。全ての値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝５の技術的反復）。ｎ＝３の独立した実験。（Ｇ）対照およびＳＴＡＴ１ノックダウンＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞におけるＳＴＡＴ１レベル。（Ｈ）対照ｐＢＡＢＥまたはＳＲ−ＩκＢαベクターを発現するＭＤＡ２３１−ＢｒＭ細胞におけるＮＦ−κＢウミシイタケルシフェラーゼレポーターアッセイ。全ての値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝３の技術的反復）。（Ｉ）対照、ＳＴＡＴ１ノックダウン、およびＳＲ−ＩκＢα ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞によって形成された脳転移からのＢＬＩシグナルの定量化。ｎ＝２の独立した実験。

図４Ａ〜Ｈ、ギャップジャンクションによりアストロサイトにおける細胞質ｄｓＤＮＡ応答が媒介される。（Ａ）対照ｓｈＲＮＡ（Ｃｔｒｌｓｈ）またはＣｘ４３を標的とするｓｈＲＮＡを発現するＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞を、アストロサイトを伴ってまたは伴わずに１８時間にわたって培養し、リン酸化ＴＢＫ１およびＩＲＦ３の免疫ブロッティング分析に供した（ｎ＝３の独立した実験）。（Ｂ）ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２単独、アストロサイト単独、または１８時間共培養物を試料の調製およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるｃＧＡＭＰ分析のために採取した。ヒストグラム（右）は、（左）の正規化されたｃＧＡＭＰピークに対応し、５つの生物学的反復を表す。ｎ＝３の独立した実験。図１６も参照されたい。（Ｃ）ＩＲＦ３およびＧＦＰの二重免疫蛍光染色の代表的な画像。ＤＡＰＩは核染色である。共培養において、白色の矢印はアストロサイトにおけるＩＲＦ３の核内蓄積であり、緑色の矢印は、ＧＦＰ＋ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞におけるＩＲＦ３の均一な分布である。スケールバーは２０μｍである。ｎ＝２の独立した実験。（Ｄ）２×１０^７個の細胞からの示されている細胞画分におけるｄｓＤＮＡの定量化。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝３の生物学的反復）。ｎ＝２の独立した実験。（Ｅ）ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞におけるｄｓＤＮＡ、ＧＦＰ、およびＣｏｘＩＶ（ミトコンドリアのマーカー）の免疫蛍光染色の代表的な画像。ＤＡＰＩは核染色である。スケールバーは１０μｍである。ｎ＝２の独立した実験。（Ｆ、Ｇ）ＥｄＵ標識したＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞をアストロサイトと６時間にわたって共培養した。ＥｄＵ標識されたＤＮＡのがん細胞からアストロサイトへの移行を、共焦点顕微鏡を使用して可視化したか（Ｆ）、またはフローサイトメトリーによって定量化した（Ｇ）。がん細胞およびアストロサイトはそれぞれ緑色の点線および白色の点線で描写されている。スケールバーは１０μｍである。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝３の生物学的反復、ｎ＝２の独立した実験）。（Ｈ）脳転移を支持するための、ギャップジャンクション媒介性抗ｄｓＤＮＡ応答、アストロサイトにおけるＩＦＮαおよびＴＮＦαの産生、および結果としてのがん細胞におけるＳＴＡＴ１およびＮＦ−κＢ経路の活性化の概略図。

図５Ａ〜Ｉ、ギャップジャンクション活性の阻害により脳転移増生が制御される。（Ａ）示されている濃度のトナベルサットまたはメクロフェナメートの存在下でのアストロサイトからＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞への色素移行。ｎ≧３の独立した実験。（Ｂ）示されている濃度のトナベルサット（Ｔｏｎａ）またはメクロフェナメート（Ｍｅｃｌｏ）の存在下で共培養されたＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞とアストロサイトからの馴化培地におけるＩＦＮαおよびＴＮＦαのＥＬＩＳＡ。示されているグラフは全て平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝４の技術的反復）。ｎ＝２の独立した実験。（Ｃ）トナベルサットまたはメクロフェナメートを、マウスへのがん細胞接種の１日後に開始して毎日投与した。脳転移病変をＢＬＩに基づいて定量化した。ｎ＝２の独立した実験。（Ｄ）１４日目の脳転移病変のＧＦＰ染色。代表的な画像は、大きな進行性病変を示す。ＤＡＰＩは核染色である。スケールバーは４０μｍである。ｎ＝１０の実験マウス。（Ｅ）スキームに例示されている通り、誘導性対照、ＣＸ４３またはＰＣＤＨ７ｓｈＲＮＡを形質導入したＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞を接種した１４日後にマウスをドキシサイクリンおよびカルボプラチンを用いて処置した。脳転移病変をＢＬＩに基づいて定量化した。（Ｆ、Ｇ）対応するｅｘｖｉｖｏ脳ＢＬＩおよび赤色蛍光イメージングの代表的な画像。ｎ＝２の独立した実験。（Ｈ）ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞を接種した１４日後にマウスをトナベルサット、メクロフェナメート、およびカルボプラチンを用いて処置した。示されているレジメンに従って、脳転移病変をＢＬＩに基づいて定量化した。ｎ＝２の独立した実験（Ｉ）。

図６Ａ〜Ｄ、がん細胞−アストロサイト相互作用。（Ａ）この研究において使用したがん細胞。（Ｂ）アストロサイト共培養によりがん細胞が保護される。模式図（左）において例示されている通り、ｓＦａｓＬ処理または化学的処理後の切断カスパーゼ３＋／ＧＦＰ＋アポトーシス性ＢｒＭ細胞を定量化した。ｎ＝３の独立した実験。（Ｃ、Ｄ）アストロサイトとＢｒＭ細胞との間のギャップジャンクションコミュニケーション。ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞からアストロサイトへの色素移行の微速度撮影画像（Ｃ）。スケールバーは１００μｍである。アストロサイトからＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞への色素移行の、時間をわたってのフローサイトメトリーによる定量化（Ｄ）。ｎ＝３の独立した実験。

図７、脳転移がん細胞およびアストロサイトにおけるＣｘ４３およびＰＣＤＨ７の発現の上昇。（Ａ）親細胞（Ｐａｒ）およびＢｒＭ細胞におけるＣｘ４３ｍＲＮＡおよびＰＣＤＨ７ｍＲＮＡ。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝３の技術的反復）。ｎ＝３の独立した実験。（Ｂ）ＥｒｂＢ２親細胞および脳細胞、ならびにＫｒａｓ／ｐ５３細胞株におけるＣｘ４３およびＰＣＤＨ７のウエスタンブロッティング。ｎ＝３の独立した実験。（Ｃ）脳細胞と比較した、ＢｒＭ細胞におけるＣｘ４３ｍＲＮＡおよびＰＣＤＨ７ｍＲＮＡ。ｎ＝３の独立した実験。（Ｄ）ＭＤＡ２３１親細胞（Ｐａｒ）ならびに脳（ＢｒＭ２）、肺（ＬＭ）および骨（ＢｏＭ）の転移派生物におけるＣｘ２６ｍＲＮＡおよびＣｘ３０ｍＲＮＡ。（Ｅ）原発性腫瘍におけるＣｘ４３／ＰＣＤＨ７発現に基づく、６３症例（ＧＳＥ８８９３）の肺腺癌における累積的な無転移生存の確率を例示するカプラン・マイヤープロット。（Ｆ、Ｇ）ＲＴ−ＰＣＲ（Ｆ）およびウエスタンブロッティング（Ｇ）によって評価される、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いたＣｘ４３およびＰＣＤＨ７のノックダウン。Ｃｔｒｌは対照である。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝３の技術的反復）。ｎ＝３の独立した実験。

図８Ａ〜Ｈ、ＰＣＤＨ７によりギャップジャンクションコミュニケーションが容易になる。（Ａ、Ｂ）カルベノキソロン（５０μＭ）処理と比較した、アストロサイトから対照およびＣｘ４３枯渇またはＰＣＤＨ７枯渇Ｋｒａｓ／ｐ５３−３９３Ｎ１細胞への色素移行（Ａ）、ならびにアストロサイトから対照またはＣｘ４３枯渇ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞への色素移行（Ｂ）のヒストグラムおよび定量化。（Ｃ、Ｄ）アストロサイト内のＰＣＤＨ７によりギャップジャンクションが容易になる。対照またはＰＣＤＨ７枯渇アストロサイトにおけるＰＣＤＨ７のウエスタンブロッティング（Ｃ）。ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞からＰＣＤＨ７枯渇アストロサイトへの色素移行の定量化（Ｄ）。（Ｅ）ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）から対照、Ｃｘ４３枯渇またはＰＣＤＨ７枯渇ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞への色素移行の定量化。（Ｆ）ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞からアストロサイトとＨＢＭＥＣの混合集団への色素移行。（Ｇ）対照またはＣｘ４３枯渇ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞からヒトミクログリアへの色素移行の定量化。（Ｈ）模式図において例示されている通り、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞（左）またはアストロサイト（右）におけるＣｘ４３ｍＲＮＡを、トランスウェルによって分離されたミクログリア、アストロサイトまたはがん細胞を用いた２４時間の共培養後に検出した。色素移行アッセイに関して、値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝３の生物学的反復）。ｎ≧２の独立した実験。ｈでは、値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝４の生物学的反復）。

図９Ａ〜Ｄ、Ｃｘ４３はＰＣＤＨ７とは直接相互作用するが、ＥカドヘリンまたはＮカドヘリンとは直接相互作用しない。（Ａ）融合タンパク質を過剰発現するがん細胞におけるＣｘ４３およびＰＣＤＨ７のウエスタン免疫ブロッティング。（Ｂ）Ｃｘ４３−ＣＬｕｃ／ＰＣＤＨ７−ＮＬｕｃ（＋）がん細胞とアストロサイトを１５分にわたって共培養した後のＢＬＩの定量化。ｃ〜ｅ、Ｃｘ４３−ＥカドヘリンまたはＣｘ４３−Ｎカドヘリン相互作用を検出するためのルシフェラーゼスプリットアッセイ。ＮＬｕｃおよびＣＬｕｃは、ホタルルシフェラーゼのＮ末端側半分およびＣ末端側半分である。表（Ｃ）は、アッセイ、融合タンパク質を過剰発現するがん細胞におけるＥカドヘリン発現またはＮカドヘリン発現を示すウエスタン免疫ブロッティング（Ｄ）、および代表的なプレートの生物発光イメージング（ＢＬＩ）（ｅ）において使用した細胞株組合せを数字で同定するものである。ｎ≧２の独立した実験。

図１０Ａ〜Ｅ、ギャップジャンクション活性の阻害により脳転移増生が予防される。（Ａ）対照（Ｃｔｒｌ）、Ｃｘ４３枯渇またはＰＣＤＨ７枯渇Ｋｒａｓ／ｐ５３−３９３Ｎ１細胞によって形成された脳転移病変の生物発光イメージング（ＢＬＩ）定量化。ｎ＝２の独立した実験。（Ｂ）対照、Ｃｘ４３枯渇またはＰＣＤＨ７枯渇ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞によって形成されたＧＦＰ＋脳転移病変の代表的な画像。脳切片または脳転移病変がそれぞれ白色の点線または赤色の点線で描写されている。スケールバーは１０００μｍである。（Ｃ）ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞によって形成された肺転移病変のＢＬＩ（画像）および定量化（棒グラフ）。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（各群ｎ＝５のマウス）。ｎ＝２の独立した実験。（Ｄ、Ｅ）ギャップジャンクション媒介性脳転移にはＣｘ４３のチャネル機能が必要である。野生型（ＷＴ）Ｃｘ４３またはＴ１５４Ａ変異体（Ｍｕｔ）Ｃｘ４３をＣｘ４３枯渇ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞（ＣＸ４３ｓｈ２）において再発現させた。ウエスタンブロッティングによってＣｘ４３発現を検出し（Ｄ）、これらの細胞によって形成された脳転移をＢＬＩによって定量化した（Ｅ）。ｎ＝２の独立した実験。

図１１Ａ〜Ｄ、脳転移におけるＣｘ４３およびＰＣＤＨ７の役割。（Ａ）Ｃｘ４３およびＰＣＤＨ７により、ＢＢＢを越える遊走は媒介されない。７日目の脳病変における対照（Ｃｔｒｌ）、Ｃｘ４３枯渇またはＰＣＤＨ７枯渇ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞の定量化。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（各群ｎ＝５の脳）。（Ｂ）１４日目の脳病変において、Ｃｘ４３およびＰＣＤＨ７によりがん細胞コロニー形成が媒介される。代表的な画像は、ＧＦＰ染色（緑色）およびＫｉ６７染色（赤色）である。ＤＡＰＩは核染色である。スケールバーは２０μｍである。棒グラフは、Ｋｉ６７＋がん細胞の割合である。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（各群ｎ＝５の脳）。（Ｃ）Ｃｘ４３およびＰＣＤＨ７により、がん細胞生存が媒介される。脳スライスアッセイ。代表的な画像は、ＧＦＰ染色（緑色）および切断カスパーゼ３（Ｃａｓｐ３）染色（赤色）である。スケールバーは３０μｍである。ヒストグラムは、カスパーゼ３＋アポトーシス性がん細胞の割合である。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（各群ｎ＝５の脳スライス）。スケールバーは３０μｍである。（Ｄ）１４日目の脳病変において、Ｃｘ４３およびＰＣＤＨ７はがん細胞による血管の利用には影響を及ぼさない。代表的な画像は、ＧＦＰ染色（緑色）であり、血管構造はＴＲＩＴＣデキストランで満たされた（赤色）。スケールバーは２０μｍである。ｎ＝２の独立した実験。

図１２Ａ〜Ｄ、翻訳リボソームアフィニティー精製（ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇｒｉｂｏｓｏｍｅａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＲＡＰ）およびサイトカインアレイ。（Ａ）３つの条件（＃１、＃２、＃３）の下でＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞から翻訳ｍＲＮＡを単離するためのＴＲＡＰ実験設定の概略図。（Ｂ）ＴＲＡＰｍＲＮＡ配列決定の主成分（ＰＣ）分析。（Ｃ）アストロサイト、およびＢｒＭ細胞とアストロサイトとの間のギャップジャンクションコミュニケーションによって調節されるｌｏｇ２倍率変化の散布図。（Ｄ）アストロサイト共培養からの馴化培地（ＣＭ）と一緒に２時間インキュベートした後のＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞におけるＳＴＡＴ１およびＮＦ−κＢｐ６５リン酸化。アストロサイトを対照またはＣｘ４３枯渇Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞と２４時間共培養した後にＣＭを回収した。ｎ＝３の独立した実験。

図１３Ａ〜Ｆ、ギャップジャンクションにより生じるシグナル伝達によってがん細胞におけるＩＦＮおよびＮＦ−κｂ経路が活性化される。（Ａ）アストロサイトを対照またはＣｘ４３枯渇ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞と２４時間共培養した後に回収した馴化培地のサイトカインアレイ分析。Ｌｏｇ２倍率変化をプロットした。（Ｂ）アストロサイトと示されているＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞との共培養物からのＣＭにおけるＩＦＮαおよびＴＮＦαのＥＬＩＳＡ。示されている全ての値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝４の技術的反復）。ｎ＝２の独立した実験。（Ｃ）１０ユニット／ｍｌ（３９ユニット／ｎｇ）の組換えＩＦＮαＡまたは１０ｐｇ／ｍｌの組換えＴＮＦαの存在下または非存在下で様々な濃度のタキソールを用いて処理したＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞における切断カスパーゼ３の相対的なレベル。全ての値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝５の技術的反復）。ｎ＝３の独立した実験。（Ｄ、Ｅ）対照およびＳＴＡＴ１ノックダウンＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞におけるＳＴＡＴ１レベル。（Ｆ）対照、ＳＴＡＴ１ノックダウン細胞によって形成された脳転移からのＢＬＩシグナルの定量化。ｎ＝２の独立した実験。

図１４Ａ〜Ｇ、ギャップジャンクションにより、アストロサイトにおける細胞質ＤＮＡ応答が開始されることを示す図である。（Ａ）対照またはＣｘ４３枯渇Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞を、アストロサイトを伴ってまたは伴わずに１８時間にわたって共培養し、リン酸化ＴＢＫ１およびＩＲＦ３の免疫ブロッティング分析に供した（ｎ＝３の独立した実験）。（Ｂ）ｃＧＡＭＰ同定。４．４７分におけるピークは、ｃＧＡＭＰに特異的な３つのＳＲＭトランジション全てを含有する。ＲＴ：保持時間、ＡＡ：自動的に積分されたピーク面積。（Ｃ）２×１０^７個のＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞からの示されている細胞画分におけるｄｓＤＮＡの定量化。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝３の生物学的反復）。ｎ＝２の独立した実験。（Ｄ）示されているがん細胞および非新生物細胞における細胞質ｄｓＤＮＡと核ｄｓＤＮＡの比。（Ｅ）Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞におけるｄｓＤＮＡ、ＧＦＰ、ＣｏｘＩＶ（ミトコンドリアマーカー）の免疫蛍光染色の代表的な画像。ＤＡＰＩは核染色である。スケールバーは１０μｍである。（Ｆ）アストロサイトにおけるｄｓＤＮＡ、ＣｏｘＩＶ（ミトコンドリアマーカー）の免疫蛍光染色の代表的な画像。ＤＡＰＩは核染色である。ファロイジンは細胞骨格染色である。スケールバーは１０μｍである。（Ｇ）ＥｄＵ標識したＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞をアストロサイトと６時間にわたって共培養した。ＥｄＵ標識されたＤＮＡのがん細胞からアストロサイトへの移行を、共焦点顕微鏡を使用して可視化した。がん細胞またはアストロサイトをそれぞれ緑色または白色の点線で描写した。スケールバーは１０μｍである。ｎ＝２の独立した実験。

図１５、ギャップジャンクション活性の阻害により脳転移増生が予防される。（Ａ〜Ｄ）トナベルサット（Ｔｏｎａ）またはメクロフェナメート（Ｍｅｃｌｏ）を用いた処理後（Ａ）、脳転移（Ｂ）、乳房脂肪パッドにおける原発性腫瘍成長（Ｃ）、または肺転移（Ｄ）をＢＬＩによって定量化した。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（各群ｎ＝５のマウス）。ｎ＝２の独立した実験。（Ｅ、Ｆ）ｉｎｖｉｔｒｏにおけるドキシサイクリン処理後のＲＴ−ＰＣＲ（Ｅ）およびウエスタン免疫ブロッティング（Ｆ）によって評価される、ｔｅｔ−ｏｎ誘導性低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いたＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞におけるＣｘ４３およびＰＣＤＨ７のノックダウン。ｎ＝２の独立した実験。（Ｇ）ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞を接種した１４日後の脳ｅｘｖｉｖｏ生物発光イメージング（ＢＬＩ）。

図１６、ｃＧＡＭＰ同定の確認。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した、図４ｂに示されている全ての実験条件からのプールした試料。４．４７分におけるピークのみがｃＧＡＭＰに特異的な３つのＳＲＭトランジションを全て含有する。４．４７分におけるピークは、プールした試料に４０ｎＭの環状［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ｃＧＡＭＰ）５μＬを添加することによって増大する。内部対照および陰性対照として、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰは、４．９７分のピークにおいて２つのＳＲＭトランジションの全てを含有し、このピークは標準ｃＧＡＭＰを添加することによって変化しない。ｄＲＴ：保持時間、ＡＡ：自動的に積分されたピーク面積。

５．詳細な説明
明確にするために、また、限定するものではなく、本発明の詳細な説明を以下の小節に分ける：
（ｉ）ギャップジャンクション阻害剤；
（ａ）コネキシン４３阻害剤；および
（ｂ）プロトカドヘリン７阻害剤；
（ｃ）ギャップジャンクション活性／阻害についてのアッセイ；
（ｉｉ）がん標的；
（ｉｉｉ）医薬製剤；ならびに
（ｉｖ）治療方法

５．１ギャップジャンクション阻害剤
本発明は、開示されている方法において使用するための、ギャップジャンクションの阻害剤（例えば、ギャップジャンクションアンタゴニスト）を提供する。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、ギャップジャンクション構成成分の発現および／もしくは活性を阻害および／もしくは低減する、または、ギャップジャンクションの形成、開通性、シグナル伝達および／または活性を阻害および／または低減する化合物、小分子、化学物質、ポリペプチド、核酸およびタンパク質を含み得る。

ある特定の非限定的な実施形態では、小分子であるギャップジャンクション阻害剤としては、カルベノキソロン、グリチルレチン酸、キニーネ、キニジン、メフロキン、ヘプタノール、オクタノール、アナンダミド、フェナメート、２−アミノエトキシンジフェニルボレート（２−ＡＰＢ）、レチノイン酸、オレアミド、スペルミン、アミノスルホネート、プロピオン酸ナトリウム、トナベルサットおよびメクロフェナメート（ｍｅｃｌｏｆｅｎａｍａｔｅ）（メクロフェナム酸）が挙げられる。ギャップジャンクション阻害剤のさらなる非限定的な例は、米国特許第５，８４３，９８９号；同第６，２１１，２１１号；同第７，６３２，８６６号、同第６，２５１，９３１号；同第７，７０４，９４６号；およびＰＣＴ特許出願第ＷＯ１９９９／０２６５８４号に開示されている。

ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、以下の構造：
を有する式Ｉの化合物を含む。

ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、以下の構造：
を有する式ＩＩの化合物を含む。

ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、以下の構造：
を有する式ＩＩＩの化合物を含む。

ある特定の非限定的な実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、式Ｉ〜ＩＩＩの化合物の塩、立体異性体、類似体または誘導体の形態であってよい。限定するものではなく、例として、ギャップジャンクション阻害剤は、式ＩＩのナトリウム塩の形態を含んでよい。

ある特定の非限定的な実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、細胞間のギャップジャンクションの形成および／またはギャップジャンクションの開通性、ギャップジャンクションシグナル伝達および／または活性を部分的に、または完全に遮断することができる抗体または抗体断片であってよい。例えば、ＥｒｎｅｓｔｏＯｖｉｅｄｏ−Ｏｒｔａら、ＴｈｅＦＡＳＥＢＪｏｕｒｎａｌ、１５巻：７６８〜７７４頁（２００１年）を参照されたい。ある特定の非限定的な実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、抗コネキシン化合物および／またはコネキシン模倣ペプチドであってよい。例えば、ＥｖａｎｓおよびＢｏｉｔａｎｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、２９巻（４号）：６０６〜６１２頁（２００１年）；Ｄａｈｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、６７巻（５号）：１８１６〜１８２２頁（１９９４年）；欧州特許出願第ＥＰ２５１０９３９号および同第ＥＰ２２５２３２０号；ならびに米国特許出願第２００９／０１４２２９５号を参照されたい。

ギャップジャンクション阻害剤のさらなる非限定的な例としては、ギャップジャンクション構成成分の発現または活性を特異的に阻害および／または低減するリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子およびｓｉＲＮＡ分子が挙げられる。「リボザイム」とは、特定の核酸配列を切断することができる核酸を指す。ある特定の非限定的な実施形態では、リボザイムとは、特異的認識のためのアンチセンス配列、およびＲＮＡ切断酵素活性を含有するＲＮＡ分子を指す。例えば、米国特許第６，７７０，６３３号を参照されたい。対照的に、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、一般に、遺伝子の発現に影響を及ぼすための、その遺伝子の一部と相補的な小さなオリゴヌクレオチドである。遺伝子発現は、特定の遺伝子またはそのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）にオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって阻害することができる。配列が分かっている遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためにアンチセンス技法を使用する方法は当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；同第６，５６６，１３１号；同第６，３６５，３５４号；同第６，４１０，３２３号；同第６，１０７，０９１号；同第６，０４６，３２１号；および同第５，９８１，７３２号を参照されたい）。「低分子（ｓｍａｌｌ）干渉ＲＮＡ」もしくは「低分子（ｓｈｏｒｔ）干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」もしくは「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」もしくは「ｓｈＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の形態である。干渉ＲＮＡは、標的核酸配列と相補的な二本鎖ＲＮＡまたは部分的に二本鎖のＲＮＡ分子であってよい。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）もこのカテゴリーに入れることができる。本発明のオリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子に、細胞内での安定性および半減期を増大させる手段として種々の修飾を導入することができる。そのような修飾の非限定的な例としては、分子の５’末端および／もしくは３’末端に、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列を付加すること、またはオリゴヌクレオチド骨格内にホスホジエステラーゼ連結ではなくホスホロチオエートもしくは２’−Ｏ−メチルなどの非定型的なもしくは天然に存在しない残基を使用することが挙げられる。

本発明のＲＮＡ分子は、ベクターから発現させることもでき、化学的にまたは合成により作製することもできる。適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、配列が分かっている遺伝子に関して当技術分野で周知である（例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら（１９９９年）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら（２００１年）；Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．（２００２年）；ＭｃＭａｎｕｓ，ＭＴ．ら（２００２年）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲ．ら（２００２年）；米国特許第６，５７３，０９９号および同第６，５０６，５５９号；ならびにＰＣＴ特許出願第ＷＯ２００１／０３６６４６号、同第ＷＯ１９９９／０３２６１９号および同第ＷＯ２００１／０６８８３６号を参照されたい）。

５．１．１コネキシン４３阻害剤
ある特定の非限定的な実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、ギャップジャンクション構成成分に特異的であり得る。限定するものではなく、例として、ギャップジャンクション構成成分としては、タンパク質のコネキシンファミリーが挙げられる。コネキシンタンパク質の非限定的な例は、ギャップジャンクションタンパク質、α１（ｇｊａ１）という遺伝子によりコードされるコネキシン４３（Ｃｘ４３）である。Ｃｘ４３核酸またはタンパク質は、ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＭ＿０００１６５、ＮＧ＿００８３０８もしくはＭ６５１８８に記載されている配列を有するヒトＣｘ４３核酸、または、ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＰ＿０００１５６に記載されているアミノ酸を有するヒトＣｘ４３タンパク質分子をコードする核酸であってよい。本発明によると、そのようなＣｘ４３核酸および／またはタンパク質の発現および／または機能の阻害剤をギャップジャンクション阻害剤として使用することができる。限定するものではなく、例として、ギャップジャンクション阻害剤としては、例えば、これだけに限定されないが、イオキシニルまたはオクタン酸イオキシニルなどのＣｘ４３阻害剤を挙げることができる。ある特定の実施形態では、Ｃｘ４３阻害剤としては、Ｃｘ４３抗体、抗体断片または模倣ペプチドを挙げることができる（Ｄａｎｅｓｈ−Ｍｅｙｅｒら、Ｂｒａｉｎ、１３５巻：５０６〜５２０頁（２０１２年）を参照されたい）。

ギャップジャンクション阻害剤の１つの非限定的な例は、上に開示されているＣｘ４３核酸配列の少なくとも一部分と相同なアンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ核酸配列を含み、Ｃｘ４３配列に対する部分の相同性は、少なくとも約７５パーセントまたは少なくとも約８０パーセントまたは少なくとも約８５パーセントまたは少なくとも約９０パーセントまたは少なくとも約９５パーセントまたは少なくとも約９８パーセントであり、パーセント相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡソフトウェアによって決定することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、相補的な部分は、少なくとも１０ヌクレオチドまたは少なくとも１５ヌクレオチドまたは少なくとも２０ヌクレオチドまたは少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも３０ヌクレオチドを構成してよく、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子の長さは１５ヌクレオチドまで、または２０ヌクレオチドまで、または２５ヌクレオチドまで、または３０ヌクレオチドまで、または３５ヌクレオチドまで、または４０ヌクレオチドまで、または４５ヌクレオチドまで、または５０ヌクレオチドまで、または７５ヌクレオチドまで、または１００ヌクレオチドまでであってよい。Ｃｘ４３を阻害するｓｈＲＮＡの非限定的な例は、下の実施例に記載されている。非限定的な実施形態では、核酸であるＣｘ４３阻害剤を、Ｃｘ４３を発現するがん細胞において、前記がん細胞に選択的にターゲティングすることができるベクター、例えばレンチウイルスによってもたらすことができ、かつ／または、Ｃｘ４３阻害剤核酸の発現を、腫瘍細胞において選択的に活性なプロモーターによって導くことができる。

５．１．２プロトカドヘリン７阻害剤
本発明は、開示されている方法において使用するためのプロトカドヘリン７（ＰＣＤＨ７）阻害剤を提供する。ＰＣＤＨ７阻害剤の非限定的な例としては、ＰＣＤＨ７の発現および／または活性を阻害および／または低減する化合物、分子、化学物質、ポリペプチド、タンパク質が挙げられる。ＰＣＤＨ７核酸またはタンパク質は、ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＭ＿００１１７３５２３、ＮＭ＿０３２４５７、ＮＭ＿０３２４５６もしくはＮＭ＿００２５８９に記載されている配列を有するヒトＰＣＤＨ７核酸、またはＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＰ＿００１１６６９９４、ＮＰ＿１１５８３２、ＮＰ＿１１５８３３もしくはＮＰ＿００２５８０に記載されているアミノ酸を有するヒトＰＣＤＨ７タンパク質分子をコードする核酸であってよい。

ある特定の非限定的な実施形態では、ＰＣＤＨ７阻害剤として、ＰＣＤＨ７の発現または活性を特異的に阻害および／または低減するリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ分子およびｓｉＲＮＡ分子を挙げることができる。ＰＣＤＨ７阻害剤の１つの非限定的な例は、ＰＣＤＨ７核酸配列の少なくとも一部分と相同なアンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ核酸配列を含み、ＰＣＤＨ７配列に対する部分の相同性は、少なくとも約７５パーセントまたは少なくとも約８０パーセントまたは少なくとも約８５パーセントまたは少なくとも約９０パーセントまたは少なくとも約９５パーセントまたは少なくとも約９８パーセントであり、パーセント相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡソフトウェアによって決定することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、相補的な部分は、少なくとも１０ヌクレオチドまたは少なくとも１５ヌクレオチドまたは少なくとも２０ヌクレオチドまたは少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも３０ヌクレオチドを構成してよく、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子の長さは、１５ヌクレオチドまで、または２０ヌクレオチドまで、または２５ヌクレオチドまで、または３０ヌクレオチドまで、または３５ヌクレオチドまで、または４０ヌクレオチドまで、または４５ヌクレオチドまで、または５０ヌクレオチドまで、または７５ヌクレオチドまで、または１００ヌクレオチドまでであってよい。ある特定の実施形態では、本発明のアンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子は、ＤＮＡ、または、上に開示されている非定型的なもしくは天然に存在しない残基、例えば、これだけに限定されないが、ホスホロチオエート残基を含んでよい。ＰＣＤＨ７を阻害するｓｈＲＮＡの非限定的な例は下の実施例に記載されている。非限定的な実施形態では、核酸であるＰＣＤＨ７阻害剤を、ＰＣＤＨ７を発現するがん細胞において、前記がん細胞に選択的にターゲティングすることができるベクター、例えばレンチウイルスによってもたらすことができ、かつ／または、ＰＣＤＨ７阻害剤核酸の発現を、腫瘍細胞において選択的に活性なプロモーターによって導くことができる。

非限定的な実施形態では、ＰＣＤＨ７阻害剤は、ＰＣＤＨ７に特異的に結合する抗体もしくは抗体断片または単鎖抗体であってよい。そのような抗体の非限定的な例としては、ａｂ５５５０６（ＡｂｃａｍＩｎｃ．）およびＨＰＡ０１１８６６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられる。ある特定の非限定的な実施形態では、抗ＰＣＤＨ７抗体または抗体断片を使用して、本発明に従って使用するための、ＰＣＤＨ７に対して特異的なヒト、ヒト化またはその他のキメラ抗体を調製することができる。

５．１．３ギャップジャンクション活性／阻害についてのアッセイ
本発明の特定の非限定的な実施形態は、ギャップジャンクション活性を評価するため、例えば、環状グアノシン一リン酸−アデノシン一リン酸、例えば、［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（「ｃＧＡＭＰ」）の低減がギャップジャンクション阻害と相関する場合、ｃＧＡＭＰのレベルを測定することによって阻害を評価するためのアッセイを提供する。本発明のこの態様は、少なくとも一部において、アストロサイトと脳に転移したがん細胞との間でギャップジャンクションが形成されるとｃＧＡＭＰが増加するという発見、および、前記ｃＧＡＭＰの上昇はコネキシン４３の阻害により低下するという発見に基づく（例えば、図４Ｂおよび１４Ｂを参照されたい）。

特定の非限定的な実施形態は、被験体の脳において転移がん細胞の成長および／または生存を阻害するための方法であって、被験体を治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を用いて治療するステップであり、当該治療有効量のギャップジャンクション阻害剤が、その量のギャップジャンクション阻害剤の非存在下でのｃＧＡＭＰのレベルと比較してｃＧＡＭＰの低下をもたらすものであるステップを含む方法を提供する。

特定の非限定的な実施形態は、被験体において脳腫瘍または転移性脳腫瘍がギャップジャンクション阻害剤を用いた治療から治療的利益を受けるかどうかを決定する方法であって、前記腫瘍に由来する試料において、ギャップジャンクション阻害剤への曝露によりｃＧＡＭＰの低下が導かれるかどうかを決定するステップを含み、ｃＧＡＭＰの低下が、治療的利益を示す方法を提供する。

さらなる非限定的な本発明の実施形態は、被験体の脳において転移がん細胞の成長および／または生存を阻害する方法であって、（ｉ）被験体が、ギャップジャンクション阻害剤を用いた治療から治療的利益を受けるかどうかを決定するステップであり、被験体のがん細胞（脳転移、原発腫瘍、または脳の外の転移性腫瘍から得ることができる）をギャップジャンクション阻害剤に曝露させた場合に、阻害剤の非存在下でのｃＧＡＭＰレベルと比較してｃＧＡＭＰの低下が示されるかどうかを決定することを含み、ｃＧＡＭＰの低下により治療的利益が示されるステップと、（ｉｉ）ｃＧＡＭＰの低下が観察された場合にはギャップジャンクション阻害剤を用いて被験体を治療するか、または、ｃＧＡＭＰの低下が観察されなかった場合には別のギャップジャンクション阻害剤を腫瘍細胞におけるｃＧＡＭＰを低下させるその能力についてアッセイするかもしくは化学療法、免疫療法、放射線療法などの別のモダリティを用いて被験体を治療するステップとを含む方法などを提供する。前記決定は、例えば、以下の実際に機能する実施例に記載のｉｎｖｉｔｒｏアッセイ、または当技術分野で公知の同等のｃＧＡＭＰ測定システムを使用して行うことができる。

さらなる非限定的な本発明の実施形態は、被験体において脳腫瘍の成長を阻害する方法であって、（ｉ）被験体が、ギャップジャンクション阻害剤を用いた治療から治療的利益を受けるかどうかを決定するステップであり、被験体の腫瘍細胞をギャップジャンクション阻害剤に曝露させた場合に、阻害剤の非存在下でのｃＧＡＭＰレベルと比較してｃＧＡＭＰの低下が示されるかどうかを決定することを含むステップであり、ここでｃＧＡＭＰの低下が、治療的利益を示す、ステップと、（ｉｉ）ｃＧＡＭＰの低下が観察された場合にはギャップジャンクション阻害剤を用いて被験体を治療するか、または、ｃＧＡＭＰの低下が観察されなかった場合には別のギャップジャンクション阻害剤を腫瘍細胞におけるｃＧＡＭＰを低下させる能力についてアッセイするかもしくは化学療法、免疫療法、放射線療法などの別のモダリティを用いて被験体を治療するステップとを含む方法などを提供する。前記決定は、例えば、以下の実際に機能する実施例に記載のｉｎｖｉｔｒｏアッセイ、または当技術分野で公知の同等のｃＧＡＭＰ測定システムを使用して行うことができる。

ｃＧＡＭＰは、当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。本発明のある特定の非限定的な実施形態では、液体クロマトグラフィー質量分析／質量分析（「ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ」）によってｃＧＡＭＰレベルを決定する。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、内部標準に対して正規化することができる（例えば、精製ステップにおけるあらゆる損失を説明するために）。特定の非限定的な一例として、あるアッセイを、この発明の詳細な説明に参照により組み込まれる以下の実際に機能する実施例「ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるｃＧＡＭＰ定量化」の節に記載する。図１６も参照されたい。

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、前記アッセイにおいて使用するためのキットであって、少なくとも１つのｃＧＡＭＰ標準物質、および脳腫瘍におけるギャップジャンクション阻害を用いたｃＧＡＭＰの低下に関する情報を含むキットを提供する。

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、試料中に存在するｃＧＡＭＰの量を検出するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、同位体標識されたｃＧＡＭＰを含んでよい。限定するものではなく、例として、同位体標識されたｃＧＡＭＰを、分析化学技法、例えば質量分析（ＭＳ）および液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−ＭＳ／ＭＳにおける内部対照として使用することができる。ある特定の実施形態では、同位体標識されたｃＧＡＭＰは、存在量の少ない安定な同位元素、例えば、これだけに限定されないが、２Ｈ（重水素）、１３Ｃ（炭素−１３）、１５Ｎ（窒素−１５）または１８Ｏ（酸素−１８）などが富化されたものであってよい。

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明のキットは、試料中のｃＧＡＭＰの量を検出するためにキットを使用するための指示をさらに含んでよい。限定するものではなく、例として、指示には、分析前に試料に添加する同位体標識されたｃＧＡＭＰの量を記載することができる。ある特定の実施形態では、指示には、さらに、試料に添加した同位体標識されたｃＧＡＭＰの量からどのように試料中のｃＧＡＭＰの量を算出するかを記載することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、指示には、ギャップジャンクション阻害剤に応答して被験体由来の試料中のｃＧＡＭＰの量またはレベルが参照対照レベルと比較して低減することにより、ギャップジャンクション阻害剤の使用の治療的利益が示されることを記載することができる。

５．２がん標的
ある特定の実施形態では、本発明は、脳転移を治療するための方法を提供する。「転移」とは、本明細書で使用される場合、がんの元の位置（例えば、原発がん）と物理的に連続していない位置に１つまたは複数のがん細胞が存在することを指す。限定するものではなく、例として、がんとしては、肺がん、乳がん、黒色腫、結腸がん、腎がん、腎細胞癌、中皮腫、卵巣がん、膵がん、肉腫、白血病、リンパ腫、尿路上皮がん、頭頸部がん、骨肉腫および膀胱がんを挙げることができる。ある特定の実施形態では、がんとして、神経膠芽腫および星状細胞腫を挙げることができる。

「検出可能な」転移とは、磁気共鳴画像法、コンピュータ化断層撮影法または陽電子放出断層撮影法によって同定可能であり得る細胞のクラスターである。ある特定の非限定的な実施形態では、転移細胞のクラスターは、少なくとも約１×１０^７個の細胞を含み得る。ある特定の実施形態では、検出可能な転移は、サイズが約５ｍｍまたは約１０ｍｍを超える細胞のクラスターを含み得る。

５．３医薬製剤
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、治療に使用するための、上の節５．１に開示されているギャップジャンクション阻害剤の医薬製剤を提供する。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、ギャップジャンクション阻害剤および薬学的に許容される担体を含む。

「薬学的に許容される」とは、本明細書で使用される場合、活性成分、例えば阻害剤の生物活性の有効性に干渉せず、かつ、投与される患者に対して有毒でない任意の担体を含む。適切な医薬担体の非限定的な例としては、リン酸緩衝食塩溶液、水、油／水エマルションなどのエマルション、種々の型の湿潤剤および滅菌溶液が挙げられる。薬学的に許容される担体のさらなる非限定的な例としては、阻害剤および／または任意の他の適切なビヒクル、送達または分散手段または材料を含有するゲル、生体吸収性（ｂｉｏａｄｓｏｒｂａｂｌｅ）マトリックス材料、埋め込み要素を挙げることができる。そのような担体は、従来の方法によって製剤化することができ、被験体に投与することができる。

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明の医薬製剤は、経口投与に適した当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を使用して製剤化することができる。そのような担体により、医薬組成物を、治療される患者による経口または経鼻摂取用の錠剤、丸剤、カプセル剤、液体、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することが可能になる。ある特定の実施形態では、医薬製剤は固体剤形であってよい。ある特定の実施形態では、錠剤は、即時放出錠剤であってよい。その代わりにまたはそれに加えて、錠剤は、持続放出または制御放出錠剤であってよい。ある特定の実施形態では、固体剤形は、即時放出部分と持続放出または制御放出部分の両方を含んでよい。ある特定の実施形態では、本発明の医薬製剤は、非経口投与に適した当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を使用して製剤化することができる。

ある特定の実施形態では、本発明において使用するために適した医薬製剤は、活性成分、例えばギャップジャンクション阻害剤が治療有効量で含有される製剤を含み得る。「治療有効量」とは、抗がん効果、生存の延長および／または再発までの期間の延長のうちの１つまたは複数を達成することができる量を指す。活性成分の治療有効量は、活性成分、例えばギャップジャンクション阻害剤、使用される製剤、がんおよびその重症度、ならびに治療される被験体の年齢、体重などに応じて変動し得る。ある特定の実施形態では、患者は、治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を１つまたは複数の製剤の単回投与または複数回投与で受けることができ、これは、患者により要求および耐容される投与量および頻度に左右され得る。

「抗がん効果」または「治療的利益」とは、本明細書で使用される場合、凝集したがん細胞塊の縮小、がん細胞成長速度の低減、がん細胞増殖の低減、腫瘍塊の縮小、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞増殖の低減、腫瘍成長速度の低減および／または腫瘍転移の減少のうちの１つまたは複数を指す。ある特定の実施形態では、抗がん効果とは、がんの診断を受けた患者における完全奏効、部分奏効、安定病態（進行も再発も伴わない）および／または後の再発もしくは無増悪生存を伴う応答を指し得る。ある特定の実施形態では、抗がん効果は、被験体において原発がんの転移を予防および／または減少すること、例えば、被験体においてがんの脳への転移を予防および／または減少することを指し得る。

ある特定の非限定的な実施形態では、上記のギャップジャンクション阻害剤は、単独で、または１種または複数種の抗がん剤と組み合わせて使用することができる。「抗がん剤」とは、本明細書で使用される場合、抗がん効果を有する任意の分子、化合物、化学物質または組成物であってよい。抗がん剤としては、これだけに限定されないが、化学療法剤、放射線療法剤（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｇｅｎｔ）、サイトカイン、抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤、抗がん抗体、抗サイクリン依存性キナーゼ剤、ならびに／または、これだけに限定されないが、サイトカイン、例えば、これだけに限定されないが、インターロイキン２、インターフェロンなど、抗ＣＴＬＡ４抗体および／もしくは抗ＰＤ−１抗体を含めた、免疫系の活性を促進する薬剤が挙げられる。抗がん剤の非限定的な例としては、パクリタキセル、テモゾロミド、ビノレルビン、プロカルバジン、ロムスチン、ビンクリスチン、ｓＦａｓＬおよびカルボプラチンが挙げられる。例えば、限定するものではないが、ギャップジャンクション阻害剤、例えば、メクロフェナメートおよび／またはトナベルサットをカルボプラチンと組み合わせて使用することができる。「と組み合わせて」とは、本明細書で使用される場合、ギャップジャンクション阻害剤および１種または複数種の抗がん剤を治療レジメンまたは計画の一部として被験体に投与することを意味する。ある特定の実施形態では、組み合わせて使用することとは、阻害剤および１種または複数種の抗がん剤を投与する前に物理的に併せること、または同じ時間枠にわたってそれらを投与することを必要としない。

ある特定の実施形態では、阻害剤を抗がん剤と組み合わせて使用する場合、それぞれの量は、いくつかの場合には、その薬剤を単独で摂取することについては治療有効量未満であり得るが、両方を使用すると治療的有効性が達成される。

５．４治療方法
本発明は、ギャップジャンクション機能性を阻害することによって脳転移を治療するための方法に関する。以下の実際に機能する実施例の節において詳細に記載されている通り、本出願において示されている研究により、がん細胞とアストロサイトとの間のギャップジャンクションシグナル伝達および／または形成の阻害を使用して脳転移を治療することができることが示される。これは、少なくとも一部において、プロトカドヘリン７およびコネキシン４３を発現するがん細胞がアストロサイトとギャップジャンクションを形成し、それにより脳転移の成長が促進されるという発見、ならびにがん細胞におけるプロトカドヘリン７および／またはコネキシン４３の発現を阻害することにより脳転移の進行を低減するという発見に基づく。これは、さらに、ギャップジャンクション阻害剤であるトナベルサットおよびメクロフェナメートを用いた治療により、脳転移病変の進行が阻害され、また、従来の化学療法剤であるカルボプラチンの抗がん活性が増強されるという発見に基づく。

したがって、本発明は、上に開示されているギャップジャンクション阻害剤を投与することによってギャップジャンクションシグナル伝達および／または形成を阻害することにより脳転移を治療する方法を提供する。ギャップジャンクション阻害剤、およびその医薬製剤の非限定的な例は、上の節５．１および５．３において開示されている。本発明の方法を用いて治療することができるがんは上の節５．２において開示されている。そのように、本発明は、被験体において抗がん効果を生じさせるギャップジャンクション機能性を阻害するための方法に関する。

「被験体」または「患者」とは、本明細書では互換的に使用され、ヒトまたは非ヒト被験体を指す。非ヒト被験体の非限定的な例としては、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、家禽、ウマ、ウシ、ヤギおよびヒツジが挙げられる。

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、がんを有する被験体を治療する方法であって、被験体に、脳のがんの転移性進行を阻害する量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、メクロフェナメート、トナベルサット、Ｃｘ４３阻害剤および／またはＰＣＤＨ７阻害剤であってよい。ある特定の実施形態では、がんは、乳がんであってよい。ある特定の実施形態では、がんは、肺がんであってよい。ある特定の非限定的な実施形態では、被験体のがんの１つまたは複数の細胞は、コネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する。ある特定の実施形態では、治療前に被験体が１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた。本発明のある特定の非限定的な実施形態では、治療前に被験体が脳転移を有することが分かっていなかった。

ある特定の実施形態では、がんを有する被験体を治療する方法は、被験体に、脳のがんの転移性進行を阻害する量のトナベルサットを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、がんを有する被験体を治療する方法は、被験体に、脳のがんの転移性進行を阻害する量のメクロフェナメートを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、がんを有する被験体を治療する方法は、被験体に、脳のがんの転移性進行を阻害する量のＣｘ４３阻害剤を投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、がんを有する被験体を治療する方法は、被験体に、脳のがんの転移性進行を阻害する量のＰＣＤＨ７阻害剤を投与するステップを含む。

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、被験体の脳において転移がん細胞の成長および／または生存を阻害するための方法であって、被験体に、治療有効量の上に開示されているギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、メクロフェナメート、トナベルサット、Ｃｘ４３阻害剤および／またはＰＣＤＨ７阻害剤であってよい。ある特定の実施形態では、がんは、肺がんおよび／または乳がんである。ある特定の非限定的な実施形態では、被験体のがんの１つまたは複数の細胞は、コネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する。ある特定の実施形態では、治療前に被験体が１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた。本発明のある特定の非限定的な実施形態では、治療前に被験体が脳転移を有することが分かっていなかった。

ある特定の実施形態では、被験体の脳において転移がん細胞の成長および／または生存を阻害するための方法は、被験体に、治療有効量のトナベルサットを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、被験体の脳において転移がん細胞の成長および／または生存を阻害するための方法は、被験体に、治療有効量のメクロフェナメートを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、被験体の脳において転移がん細胞の成長および／または生存を阻害するための方法は、被験体に、治療有効量のＣｘ４３阻害剤を投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、被験体の脳において転移がん細胞の成長および／または生存を阻害するための方法は、被験体に、治療有効量のＰＣＤＨ７阻害剤を投与するステップを含む。

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、被験体において脳転移を治療する方法であって、被験体に、上に開示されている、治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、メクロフェナメート、トナベルサット、Ｃｘ４３阻害剤および／またはＰＣＤＨ７阻害剤であってよい。ある特定の実施形態では、がんは、肺がんおよび／または乳がんである。ある特定の非限定的な実施形態では、被験体のがんの１つまたは複数の細胞は、コネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する。ある特定の実施形態では、脳転移は、検出可能な転移である。

ある特定の実施形態では、被験体において脳転移を治療する方法は、被験体に、治療有効量のトナベルサットを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、被験体において脳転移を治療する方法は、被験体に、治療有効量のメクロフェナメートを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、被験体において脳転移を治療する方法は、被験体に、治療有効量のＣｘ４３阻害剤を投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、被験体において脳転移を治療する方法は、被験体に、治療有効量のＰＣＤＨ７阻害剤を投与するステップを含む。

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、被験体においてがんの脳への転移を予防する方法であって、被験体に、上に開示されている、治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、メクロフェナメート、トナベルサット、Ｃｘ４３阻害剤および／またはＰＣＤＨ７阻害剤であってよい。ある特定の実施形態では、がんは、肺がんおよび／または乳がんである。ある特定の非限定的な実施形態では、被験体のがんの１つまたは複数の細胞は、コネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する。本発明のある特定の非限定的な実施形態では、治療前に被験体が脳転移を有することが分かっていなかった。

ある特定の実施形態では、被験体においてがんの脳への転移を予防する方法は、被験体に、治療有効量のトナベルサットを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、被験体においてがんの脳への転移を予防する方法は、被験体に、治療有効量のメクロフェナメートを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、被験体においてがんの脳への転移を予防する方法は、被験体に、治療有効量のＣｘ４３阻害剤を投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、被験体においてがんの脳への転移を予防する方法は、被験体に、治療有効量のＰＣＤＨ７阻害剤を投与するステップを含む。

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、がんを有する被験体においてがんの脳への検出可能な転移のリスクを低減する方法であって、被験体に、上に開示されている、治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、メクロフェナメート、トナベルサット、Ｃｘ４３阻害剤および／またはＰＣＤＨ７阻害剤であってよい。ある特定の実施形態では、がんは、肺がんおよび／または乳がんである。ある特定の非限定的な実施形態では、被験体のがんの１つまたは複数の細胞は、コネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する。ある特定の実施形態では、治療前に被験体が１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた。本発明のある特定の非限定的な実施形態では、治療前に被験体が脳転移を有することが分かっていなかった。

ある特定の実施形態では、がんを有する被験体においてがんの脳への検出可能な転移のリスクを低減する方法は、被験体に、治療有効量のトナベルサットを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、がんを有する被験体においてがんの脳への検出可能な転移のリスクを低減する方法は、被験体に、治療有効量のメクロフェナメートを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、がんを有する被験体においてがんの脳への検出可能な転移のリスクを低減する方法は、被験体に、治療有効量のＣｘ４３阻害剤を投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、がんを有する被験体においてがんの脳への検出可能な転移のリスクを低減する方法は、被験体に、治療有効量のＰＣＤＨ７阻害剤を投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、本発明は、がんを有する被験体の生存期間を延長する方法であって、被験体に、上に開示されている、治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤は、メクロフェナメート、トナベルサット、Ｃｘ４３阻害剤および／またはＰＣＤＨ７阻害剤であってよい。ある特定の実施形態では、がんは、肺がんおよび／または乳がんである。ある特定の非限定的な実施形態では、被験体のがんの１つまたは複数の細胞は、コネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する。ある特定の実施形態では、治療前に被験体が１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた。本発明のある特定の非限定的な実施形態では、治療前に被験体が脳転移を有することが分かっていなかった。

ある特定の実施形態では、がんを有する被験体の生存期間を延長する方法は、被験体に、治療有効量のトナベルサットを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、がんを有する被験体の生存期間を延長する方法は、被験体に、治療有効量のメクロフェナメートを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、がんを有する被験体の生存期間を延長する方法は、被験体に、治療有効量のＣｘ４３阻害剤を投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、がんを有する被験体の生存期間を延長する方法は、被験体に、治療有効量のＰＣＤＨ７阻害剤を投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、本発明の方法により、がんを有する被験体の生存期間を約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約６カ月、約８カ月、約１０カ月、約１２カ月、約１４カ月、約１８カ月、約２０カ月、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年またはそれを超えて延長することができる。

ある特定の実施形態では、そのような治療を必要とする被験体においてがん細胞転移を治療するための方法は、がん細胞−アストロサイトギャップジャンクション機能性を阻害するために、被験体に、上に開示されている、治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、本発明は、がんを有する被験体において抗がん効果を生じさせる方法であって、被験体に、上に開示されている、治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、がんを有する被験体において抗がん効果を生じさせる方法であって、がん細胞−アストロサイトギャップジャンクション機能性を阻害するために、被験体に、上に開示されている、治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、がんを有する被験体において抗がん効果を生じさせる方法であって、ギャップジャンクション機能性を阻害するために被験体に治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、がんを有する被験体を治療するため、がん細胞の成長および／または生存を阻害するため、がんの再発を予防するおよび／または遅延させるため、がん細胞の浸潤を阻害するため、ならびにがんを有する被験体の生存期間を延長するための方法であって、被験体に、上に開示されている、治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、がんは、神経膠芽腫および／または星状細胞腫である。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、被験体に上記の抗がん剤を投与するステップをさらに含み得る。限定するものではなく、例として、本発明の方法は、被験体に治療有効量のギャップジャンクション阻害剤、および、例えば、これだけに限定されないが、ＡＣＮＵ、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、ヒドロキシウレア、トポテカン、テモゾロミド、ダカルバジン、メトトレキサート、Ａｒａ−Ｃ、カペシタビン、シスプラチン、ビノレルビン、カルボプラチン、またはこれらの組合せなどの、血液脳関門を透過して治療レベルを達成することができる、治療有効量の抗がん剤を投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、被験体に、治療有効量のメクロフェナメートおよび治療有効量のカルボプラチンを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、被験体に、治療有効量のトナベルサットおよび治療有効量のカルボプラチンを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、被験体に、治療有効量のＣｘ４３阻害剤および治療有効量のカルボプラチンを投与するステップを含む。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、被験体に、治療有効量のＰＣＤＨ７阻害剤および治療有効量のカルボプラチンを投与するステップを含む。

特定の非限定的な実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤を約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。限定するものではなく、例として、ギャップジャンクション阻害剤を約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまたは約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤を約０．０８ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる（Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗら、ＴｈｅＦＡＳＥＢＪ．、２２巻：６５９〜６６１頁（２００８年）を参照されたい）。ある特定の非限定的な実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤を約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１８ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。

ある特定の非限定的な実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤を約１ｍｇ〜約２００ｍｇの量で投与することができる。限定するものではなく、例として、ギャップジャンクション阻害剤を約１ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約３０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約４０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約６０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約７０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約８０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約９０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１１０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１２０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１３０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１４０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１６０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１７０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１８０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１９０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１９０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１８０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１７０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１６０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１４０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１３０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１２０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１ｍｇ〜約９０ｍｇ、約１ｍｇ〜約８０ｍｇ、約１ｍｇ〜約７０ｍｇ、約１ｍｇ〜約６０ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、約１ｍｇ〜約２０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇまたは約１ｍｇ〜約５ｍｇの量で投与することができる。

ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤であるトナベルサットを約１０ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤であるトナベルサットを約０．８ｍｇ／ｋｇ〜約１．２ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤であるトナベルサットを約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約９ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤であるメクロフェナメートを約２０ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤であるメクロフェナメートを約１．６ｍｇ／ｋｇ〜約２．４ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤であるメクロフェナメートを約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１９ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤であるメクロフェナメートを毎日約１００ｍｇ〜約４００ｍｇの間の量で投与することができる。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤であるメクロフェナメートを１日２回、約１００ｍｇの量で投与することができる。ある特定の実施形態では、被験体を、プロトンポンプ阻害剤およびメクロフェナメートを同時に用いて治療する。ある特定の実施形態では、ギャップジャンクション阻害剤であるメクロフェナメートを１日２回、約１００ｍｇの量で投与することができ、被験体をプロトンポンプ阻害剤およびメクロフェナメートを同時に用いて治療することができ、また、治療期間は少なくとも約２カ月、少なくとも約４カ月、または少なくとも約６カ月であってよい。

特定の非限定的な実施形態では、抗がん剤を約１ｎＭ〜約１μＭおよび／または約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。特定の非限定的な実施形態では、抗がん剤を約０．８ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。特定の非限定的な実施形態では、抗がん剤を約１．２ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。限定するものではなく、例として、抗がん剤であるカルボプラチンを約５００ｎＭおよび／または約５０ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。ある特定の実施形態では、抗がん剤であるカルボプラチンを約４〜約６ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。ある特定の実施形態では、抗がん剤であるパクリタキセルを約２５ｎＭの量で投与することができる。

ある特定の実施形態では、本発明のギャップジャンクション阻害剤を１週間あたり１回、２回、３回、４回、５回もしくは６回または毎日投与することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗がん剤を１週間あたり１回、２回、３回、４回、５回もしくは６回または毎日投与することができる。ある特定の実施形態では、本開示の主題の阻害剤および／または抗がん剤を１日あたり１回または複数回投与することができる。限定するものではなく、例として、本発明のギャップジャンクション阻害剤および／または抗がん剤を１日に１回、２回、３回、４回、５回またはそれより多い回数投与することができる。

本明細書に開示されている阻害剤および／または抗がん剤は、標準の投与方法を使用して被験体に投与することができる。ある特定の実施形態では、阻害剤は、被験体に経口的にまたは非経口的に投与することができる。限定するものではなく、例として、投与経路は、静脈内、動脈内、髄腔内、腹腔内、筋肉内、皮下、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、皮内、局部（ｌｏｃａｌｌｙ）またはこれらの組合せであってよい。ある特定の実施形態では、阻害剤は、患者に埋め込まれた供給源から患者に投与することができる。ある特定の実施形態では、阻害剤の投与は、選択された期間にわたって持続注入することによって行うことができる。

以下の実施例は、ただ単に本開示の発明を例示するものであり、いかなる形でも限定するものとはみなされるべきでない。

６．実施例１：プロトカドヘリン７およびコネキシン４３により、癌腫−アストロサイトギャップジャンクションおよび脳転移が媒介される
６．１材料および方法
細胞培養。ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ２３１）、マウスＭＭＴＶ−ｎｅｕ、それらの転移派生物、およびマウス３７３Ｎ１、３９３Ｎ１、４８２Ｎ１、２６９１Ｎ１細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および２ｍＭのＬ−グルタミンを伴うＤＭＥＭ中で培養した。ヒトＨ２０３０細胞および転移派生物を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。レンチウイルス産生のために、２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清および２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥ培地中で培養した。ヒト初代アストロサイト、脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、成人皮膚線維芽細胞、およびミクログリアを供給者（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）による指定培地中で培養し、継代２〜６の間で使用した。全ての試験した細胞がマイコプラズマ（ｍｉｃｏｐｌａｓｍａ）検査陰性であった。

動物研究。動物を使用する実験は全て、ＭＳＫＣＣＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコールに従って行った。胸腺欠損ＮＣＲｎｕ／ｎｕマウス（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）、Ｃｒ：ＮＩＨｂｇ−ｎｕ−ｘｉｄマウス（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）およびＢ６１２９ＳＦ１／Ｊマウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）を５〜６週齢時に使用した。長期間脳転移アッセイに関しては、以前に記載された手順（Ｂｏｓ，Ｎｇｕｙｅｎら、２０１０年）に従った。簡単に述べると、ＰＢＳ１００μｌに懸濁させた、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞１０^４個、Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞５×１０^４個、または３９３Ｎ１細胞１０^５個を左心室に注射した。実験のエンドポイントにおいて、麻酔したマウス（１００ｍｇ／ｋｇのケタミン、１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン）にＤ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）を後眼窩に注射し、脳コロニー形成をｅｘｖｉｖｏ生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって定量化した。短期（７日および１４日）脳転移実験に関しては、５×１０^５個の細胞を注射した。ＴＲＩＴＣデキストラン（７０ＫＤ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を静脈内注射して血管構造を染色した。誘導性ノックダウン実験に関しては、マウスに、がん細胞を注射した１４日後にドキシサイクリンハイクラート（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅｈｙｃｌａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を飲料水（２ｍｇ／ｍＬ）および食餌（Ｈａｒｌａｎ）において与えた。肺コロニー形成アッセイに関しては、ＰＢＳ１００μＬ中２×１０^５個のＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞を外側尾静脈に注射した。同所性腫瘍移植に関しては、ＰＢＳ／増殖因子低減マトリゲル（ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｄｕｃｅｄｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１：１混合物５０μＬ中５×１０^３個の細胞を雌マウスの第４の右乳房脂肪パッドに注射した。薬物処置実験に関しては、マウスに、カルボプラチン（Ｈｏｓｐｉｒａ）（５０ｍｇ／ｋｇ／５日）、トナベルサット（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）（１日あたり１０ｍｇ／ｋｇ）、またはメクロフェナム酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１日あたり２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。対照マウスにはビヒクル（ポリエチレングリコール４００中１０％ＤＭＳＯ）を使用した。ＩＶＩＳＳｐｅｃｔｒｕｍＸｅｎｏｇｅｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＢＬＩを実施し、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖ．２．５０を使用して分析した。脳転移アッセイに関しては、各群８〜１０匹のマウスを使用した。薬物処置実験に関しては、マウスにがん細胞を接種し、処置群にランダムに割り当てた。ＭＳＫＣＣＡｎｔｉｔｕｍｏｕｒＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔＣｏｒｅにおいて、ギャップジャンクションモジュレーターおよび化学療法剤を盲検で投与した。

ノックダウンおよび過剰発現構築物。Ｃｘ４３およびＰＣＤＨ７を安定にノックダウンするために、レンチウイルスベクターにおけるｓｈＲＮＡを使用した。誘導性ノックダウンのために、ＴＲＩＰＺレンチウイルスベクターにおけるｓｈＲＮＡを使用した。１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンハイクラート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加してｓｈＲＮＡの発現を誘導した。ｓｈＲＮＡの標的化された配列を下の表１に列挙する。ＳＲ−ＩｋＢを安定発現させるためにｐＢａｂｅ−Ｐｕｒｏ−ＩＫＢａｌｐｈａ−ｍｕｔ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用した。野生型Ｃｘ４３（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、またはＣｘ４３（Ｔ１５４Ａ）変異体（ＡＣＣからＧＣＣへ）を発現させるために、本発明者らは、ｐＬＶＸベクターを使用した。

ｍＲＮＡおよびタンパク質検出。ＰｒｅｐＥａｓｅＲＮＡｓｐｉｎｋｉｔ（ＵＳＢ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを調製するために、全ＲＮＡ１μｇをＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して処理した。Ｃｘ４３、Ｃｘ３０およびＣｘ２６の発現をＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイプライマー：（Ｃｘ４３：Ｈｓ００７４８４４５＿ｓ１、Ｍｍ００４３９１０５＿ｍ１；Ｃｘ３０：Ｈｓ００９２２７４２＿ｓ１、Ｍｍ００４３３６６１＿ｓ１；Ｃｘ２６：Ｈｓ００２６９６１５＿ｓ１、Ｍｍ００４３３６４３＿ｓ１；ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって定量化した。相対的な遺伝子発現をβ２−ミクログロブリン（Ｈｓ９９９９９９０７＿ｍ１、Ｍｍ００４３７７６２＿ｍ１）に対して正規化した。全てのＰＣＤＨ７アイソフォームを検出するためにＰＣＤＨ７プライマー対を設計した：５’−ａｇｔｔｃａａｃｇｔｇｇｔｃａｔｃｇｔｇ−３’（センス）、５’−ａｃａａｔｃａｇｇｇａｇｔｔｇｔｔｇｃｔｃ−３’（アンチセンス）。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して反応を行った。ＡＢＩＰｒｉｓｍ７９００ＨＴＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量的発現データを分析した。ウエスタン免疫ブロッティングのために、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて細胞ペレットを溶解させ、タンパク質濃度をＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。初代ヒトアストロサイト、ニューロン、ミクログリアおよびＨＢＭＥＣのタンパク質溶解物はＳｃｉｅｎＣｅｌｌから購入した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースメンブレン（ＢｉｏＲａｄ）に転写した。ウエスタンブロッティングのために使用した抗体を下の表２に列挙する。

色素移行およびＥｄＵ移行アッセイ。単層のがん細胞またはアストロサイトを２．５μｇ／ｍｌのカルセインＲｅｄ−ＯｒａｎｇｅＡＭｄｙｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて３７℃で３０分にわたって標識した。単一細胞懸濁物を、標識細胞：非標識細胞２：１の比で６時間にわたって混合した。ある特定の実験では、３種の細胞集団、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２（ＧＦＰ＋）、ＨＢＭＥＣ（ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇＤｙｅＦｌｕｏｒ＠６７０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅを用いて予め標識したもの）、および非標識アストロサイトの混合物を使用した。異なる時点において、色素移行をＺｅｉｓｓＬＳＭ５Ｌｉｖｅ共焦点顕微鏡（２０分の微速度撮影）によって可視化したか、またはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって定量化した。ＤＮＡ移行アッセイのために、がん細胞を、ＥｄＵ（１０μＭ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を用いて一晩にわたって標識し、培養物中でさらに３日間維持した。標識されたがん細胞およびアストロサイトの単一細胞懸濁物を６時間にわたって２：１の比で混合した。ＥｄＵ移行を、製造者（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）の指示に従って、ＺｅｉｓｓＬＳＭ５Ｌｉｖｅ共焦点顕微鏡を使用して可視化したか、またはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって定量化した。

がん細胞およびアストロサイト共培養実験。アストロサイトとがん細胞を１：１の比で混合した。アポトーシスアッセイのために、一晩共培養物を、無血清培地中５００ｎｇ／ｍｌのｓＦａｓＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５００ｎＭのカルボプラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または２５ｎＭのパクリタキセル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて２４時間にわたって処理した。単一細胞懸濁物を、ＡＰＣとコンジュゲートした切断カスパーゼ３抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて染色し、アポトーシス性ＧＦＰ＋がん細胞をフローサイトメトリーによって検出した。翻訳リボソームアフィニティー精製（ＴＲＡＰ）のために、ＥＧＦＰ−Ｌ１０ａ発現がん細胞をアストロサイトと２４時間にわたって共培養した。以前公開されたプロトコール（Ｈｅｉｍａｎ，Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２００８年、Ｚｈａｎｇ，Ｊｉｎら、２０１３年）に従って、がん細胞から精製したｍＲＮＡを、ＴｒｕＳｅｑＲＮＡＳａｍｐｌｅＰｒｅｐＫｉｔｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を製造者の指示に従って用いたライブラリー構築のために使用した。試料をバーコード化し、Ｈｉｓｅｑ２０００プラットフォームにおいて、ＴｒｕＳｅｑＳＢＳＫｉｔｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、５０ｂｐ／５０ｂｐペアエンド実行で実行した。試料あたり平均５千万の、対になったリードを生成した。馴化培地分析のために、培地を２４時間後に回収し、馴化培地中のサイトカインを、ＨｕｍａｎＣｙｔｏｋｉｎｅＡｒｒａｙ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して同定したか、またはＩＦＮαもしくはＴＮＦα ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。回収した馴化培地中のＩＦＮαまたはＴＮＦαの活性を検出するために、回収した馴化培地を用いてがん細胞を２時間にわたって処理し、ＳＴＡＴ１またはＮＦ−κＢｐ６５のリン酸化の状態をウエスタンブロッティングによって決定した。ｃＧＡＭＰおよびＴＢＩ−ＩＲＦ３活性化実験のために、がん細胞とアストロサイトを１８時間にわたって共培養した。ＴＢＫ１、ＩＲＦ３のリン酸化の状態をウエスタン免疫ブロッティングによって決定した。ＩＲＦ３の核移行をＺｅｉｓｓＬＳＭ５Ｌｉｖｅ共焦点顕微鏡を用いた免疫蛍光染色によって決定した。ｃＧＡＭＰレベルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。

サイトカイン処理および経路レポーターアッセイ。がん細胞を、１０ユニット／ｍｌ（３９ｕ／ｎｇ）の組換えＩＦＮαＡ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）または１０ｐｇ／ｍｌの組換えＴＮＦα（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）をカルボプラチンまたはタキソール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と組み合わせて用いて２４時間にわたって処理した。アポトーシスをカスパーゼ−Ｇｌｏ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって定量化した。ＮＦκＢレポーターアッセイのために、ｐＨＡＧＥＮＦＫＢ−ＴＡ−ＬＵＣ−ＵＢＣ−ｄＴｏｍａｔｏ−Ｗ構築物（Ａｄｄｇｅｎｅ）由来のＮＦ−κＢ応答性配列（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｋｗｏｋら、２０１３年）をｐＧＬ４．８２ウミシイタケルシフェラーゼレポーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。がん細胞にこのベクターとＬｅＧＯ−Ｃ２ｍＣｈｅｒｒｙベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）を同時トランスフェクトした。ウミシイタケルシフェラーゼ活性をＲｅｎｉｌｌａＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定した。赤色蛍光シグナルを使用してトランスフェクション効率を正規化した。

免疫組織化学染色。マウスの脳を、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）またはクライオスタット（Ｌｅｉｃａ）によって切片作製し、確立されたプロトコールに従って染色した（Ｖａｌｉｅｎｔｅ，Ｏｂｅｎａｕｆら、２０１４年）。脳スライスアッセイ（Ｖａｌｉｅｎｔｅ，Ｏｂｅｎａｕｆら、２０１４年）のために、成体マウスの脳の２５０μｍ厚のスライスをビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）を用いて調製し、脳スライス培養培地（ＤＭＥＭ、完全ＨＢＳＳ、５％ＦＢＳ、１ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）中の０．８μｍ孔のメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の上部に置いた。３×１０^５個のがん細胞をスライスの表面上に置いた。４８時間インキュベートした後、脳スライスを４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、染色した。チャンバースライド培養物中での免疫染色のために、細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、染色した。免疫化学染色のために使用した抗体を表２に列挙する。ＺｅｉｓｓＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ．Ｚ１顕微鏡またはＬｅｉｃａＳＰ５直立共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、ＩｍａｇｅＪ、ＩｍａｒｉｓおよびＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを用いて分析した。免疫染色のために使用した抗体を表２に列挙する。

スプリットルシフェラーゼアッセイ。ヒトＣｘ４３（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、ＰＣＤＨ７（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、Ｅ−カドヘリン（Ａｄｄｇｅｎｅ）またはＮ−カドヘリン（Ａｄｄｇｅｎｅ）のｃＤＮＡにおいて終止コドンを欠失させ、ホタルルシフェラーゼのＮ末端またはＣ末端断片をスプライシングすることによって融合ｃＤＮＡを生成した（Ｌｕｋｅｒ，Ｓｍｉｔｈら、２００４年）。（Ａｄｄｇｅｎｅ）。構築物をｐＬＶＸレンチウイルス発現ベクターにクローニングし、非ＧＦＰ−ルシフェラーゼ標識した親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＨ２０３０細胞に形質導入した。ルシフェラーゼ活性を検出するために、７．５ｍｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリンカリウム塩を培養培地に添加した。ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅｓｏｆｔｗａｒｅｖ．２．５０を使用してＩＶＩＳＳｐｅｃｔｒｕｍＸｅｎｏｇｅｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔによるＢＬＩを実施した。

細胞質ｄｓＤＮＡ検出。ｄｓＤＮＡを可視化するために、細胞を抗ｄｓＤＮＡ抗体で免疫染色した。がん細胞体を描出するために抗ＧＦＰ染色を使用し、核を識別するためにＤＡＰＩを使用し、ミトコンドリアを識別するために抗ＣｏｘＩＶ抗体（ミトコンドリアのマーカー）を使用した。アストロサイト細胞体を描出するためにファロイジン染色（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ）を使用した。ｄｓＤＮＡを定量化するために、ミトコンドリア単離キット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して核画分、細胞質画分およびミトコンドリア画分を調製した。全ての細胞内画分からのＤＮＡをＱＩＡａｍｐＤＮＡｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、ＱｕａｎｔｏＦｌｕｏｒｄｓＤＮＡｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって定量化した。

バイオインフォマティクスおよび統計分析。バイオインフォマティクス分析は、特に断りのない限り、Ｒ（ｖｅｒ．３．１．２）で実施した。ＴｏｐＨａｔ２−ＨＴＳｅｑ−ＤＥＳｅｑ２パイプライン（Ａｎｄｅｒｓ，ＭｃＣａｒｔｈｙら、２０１３年、Ｋｉｍ，Ｐｅｒｔｅａら、２０１３年、Ｌｏｖｅ，Ｈｕｂｅｒら、２０１４年）を使用してデータを分析した。示差的な遺伝子発現をｃｏｏｋｓＣｕｔｏｆｆと比較し、ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔＦｉｌｔｅｒｉｎｇをオフにした。ｇｇｐｌｏｔ２パッケージを使用して、倍率変化を示す散布図を作成した。ｐｒｃｏｍｐを使用して主成分分析（ＰＣＡ）を実施した。以前に記載されている通り（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｃｈｉａｎｇら、２００９年、Ｇａｔｚａ，Ｌｕｃａｓら、２０１０年）、経路遺伝子応答シグネチャを分析し、ｚスコア法＿（Ｚｈａｎｇ，Ｊｉｎら、２０１３年）の合計によってスコア化した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ＆Ｈｏｃｈｂｅｒｇ偽陽性率法（ｆａｌｓｅ−ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−ｒａｔｅｍｅｔｈｏｄ）を使用して多重仮説検定を調整した。ＧｒａｐｈＰａｄｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｒｉｓｍ）およびスチューデントのｔ検定（両側）を使用して統計分析を実施した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。値は、平均±平均値の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）である。

臨床試料分析。原発性乳がんのマイクロアレイデータ（ＥＭＣ−ＭＳＫ）および腺癌データセット（ＭＳＫＣＣｓｅｔ２、ＧＳＥ３１４１およびＧＳＥ８８９３）においてＣＸ４３およびＰＣＤＨ７の転写物レベルを分析した。同じ遺伝子にマッピングされる複数のプローブを、試料にわたって最大の分散を有するプローブを選択することによって組み合わせた。データセットの臨床的アノテーションに基づいて、またはＥＳＲ１およびＥＲＢＢ２の転写物レベルに基づいて、トリプルネガティブ乳がん亜型を同定した。ＣＸ４３とＰＣＤＨ７の値のハザード比を、Ｒの「ｃｏｘｐｈ」コマンドによって実行されるコックス比例ハザードモデルに基づいて計算した。ＣＸ４３発現およびＰＣＤＨ７発現を連続変数として扱って、コックス比例ハザードモデルからＰ値を算出した。Ｃｘ４３免疫組織化学のために、正常な肺組織アレイ（７５症例）、原発性トリプルネガティブ乳がん組織アレイ（９８症例）および原発性非小細胞肺癌組織アレイ（１３８症例）をＵＳＢｉｏｍａｘから購入した。脳転移由来のパラフィン包埋組織マイクロアレイ（トリプルネガティブ乳がん１１７症例、非小細胞肺癌９１症例）をＭＳＫＣＣＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙからＭＳＫＣＣＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗＢｏａｒｄに従って入手した。被験体全員からインフォームドコンセントを得た。Ｃｘ４３についての免疫組織化学染色を、ＭＳＫＣＣＰａｔｈｏｌｏｇｙＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙによって、標準化された自動プロトコールを使用して実施した。対応する原発性−脳転移病変について、Ｃｘ４３染色画像を陽性染色面積によって定量化した（Ｍｅｔａｍｏｒｐｈｓｏｆｔｗａｒｅ）。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるｃＧＡＭＰ定量化。細胞（２４０万個のＭＤＡ２３１−ＢＲＭ２またはヒトアストロサイト単独、２４０万個のヒトアストロサイト＋２４０万個のＭＤＡ２３１−ＢＲＭ２共培養物）を１０ｃｍのディッシュに播いた。１８時間後に培養培地を吸引し、４ｎＭのｃ−ｄｉ−ＧＭＰ内部標準を含有する８０：２０メタノール：水２ｍＬで置き換えた。ディッシュを−８０℃で一晩インキュベートしてタンパク質沈殿を促進し、こすり取って２ｍＬの遠心管に移した。試料を２回のボルテックス、液体窒素での凍結／解凍サイクルに供し、氷水浴中、最大出力で５分にわたって超音波処理し、４℃、２１，０００×ｇで２０分にわたって遠心分離することによって清澄化した。卓上エバポレーター（Ｇｅｎｅｖａｃ）を使用して抽出物を乾燥させ、水中０．１％ギ酸１００μＬ中に再構成した。ＳｈｉｍａｄｚｕＨＰＬＣ、ＡｃｃｅｌａＯｐｅｎオートサンプラー（Ｔｈｅｒｍｏ）およびＣｏｒｔｅｃｓＣ１８＋カラム（Ｗａｔｅｒｓ、１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、２．７μｍ）を使用して液体クロマトグラフィー分離を実施した。試料は４℃で維持し、注射体積は１５μＬとした。水性移動相（Ａ）は水中０．１％ギ酸であり、有機移動相（Ｂ）はアセトニトリル中０．１％ギ酸であった。最初の条件は０％Ｂ、勾配プログラム：１．０分：０％Ｂ；７分：２０％Ｂ；７．１分：９０％Ｂ；９．０分：９０％Ｂおよび５分の再平衡化時間であった。流量は毎分４００μＬであり、９０：１０アセトン：ＤＭＳＯであるカラム後溶媒を、デッドボリュームのないＴ継手（ｚｅｒｏ−ｄｅａｄｖｏｌｕｍｅｔｅｅ）を使用して毎分１２０μＬでＬＣ流に添加して検出感度を増強した。ＳＲＭおよび陽イオン化モードで作動するＴＳＱＶａｎｔａｇｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して環状ヌクレオチドを検出した。ソースパラメータは、スプレー電圧：４０００Ｖ；気化器温度：２００℃、シースガス圧：７０ｐｓｉ；補助ガス圧：２０ｐｓｉ、キャピラリー温度：４００℃であった。化合物特異的Ｓレンズ値は１６４Ｖ（ｃＧＡＭＰ）および１９０Ｖ（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）であった。個々の反応をモニターし、衝突エネルギーは、ｃＧＡＭＰｍ／ｚ６７５．１→ｍ／ｚ５１２．１（ＣＥ：１９Ｖ）、ｍ／ｚ３１２．０（ＣＥ：４０Ｖ）、ｍ／ｚ１３６．０（ＣＥ：３９Ｖ）^＊およびｃ−ｄｉ−ＧＭＰｍ／ｚ６７５．１→ｍ／ｚ５４０．１（ＣＥ：１９Ｖ）、ｍ／ｚ２４８．０Ｖ（ＣＥ：２７Ｖ）、ｍ／ｚ１５２．０（ＣＥ：３１Ｖ）^＊であり、^＊は、各環状ヌクレオチドを定量化するために使用した一次トランジションを示す。保持時間およびトランジションを環状［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］およびｃ−ｄｉ−ＧＭＰ代謝産物標準物質（ＢｉｏＬｏｇ）と比較して確認した。Ｘｃａｌｉｂｕｒｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）およびＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してデータ分析を行った。

６．２結果
脳転移は、Ｃｘ４３ギャップジャンクション形成と関連した肺がんおよび乳がんは最も一般的な脳転移の供給源である（ＧａｖｒｉｌｏｖｉｃおよびＰｏｓｎｅｒ２００５年）。ヒトまたはマウス起源の乳房（ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２、ＥｒｂＢ２−ＢｒＭ）または肺腺癌（Ｈ２０３０−ＢｒＭ３、Ｋｒａｓ／ｐ５３−ＢｒＭ）に由来する４つの脳転移モデルを用いた（図６ａ）（Ｂｏｓ，Ｚｈａｎｇら、２００９年、Ｎｇｕｙｅｎ，Ｃｈｉａｎｇら、２００９年、Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｄａｙｔｏｎら、２０１１年、Ｖａｌｉｅｎｔｅ，Ｏｂｅｎａｕｆら、２０１４年）。これらの細胞は、同所性腫瘍として移植するかまたはマウスの動脈循環中に接種すると、顕著なアストロサイト増加を含めた脳転移の重要な病理組織学的特徴を再現する病変を形成する（図１ａ）（Ｂｏｓ，Ｚｈａｎｇら、２００９年、Ｎｇｕｙｅｎ，Ｃｈｉａｎｇら、２００９年、Ｖａｌｉｅｎｔｅ，Ｏｂｅｎａｕｆら、２０１４年）。これらのモデルの全てにおいて、脳転移細胞は、反応性アストロサイトによる致死的プラスミンの生成を妨げるために抗ＰＡセルピンを産生する（Ｖａｌｉｅｎｔｅ，Ｏｂｅｎａｕｆら、２０１４年）。しかし、アストロサイトと共培養することにより、がん細胞が化学療法およびアポトーシス促進性サイトカインであるＦａｓＬから保護され（図６ｂ）、これは、以前のｉｎｖｉｔｒｏにおける所見と一致する（Ｋｉｍ、Ｋｉｍら、２０１１年）。これらの結果から、脳転移におけるアストロサイトの可能性のある二重の役割が示唆される。

アストロサイトは、巨大なギャップジャンクションネットワークの中で相互作用する（ＴｈｅｉｓおよびＧｉａｕｍｅ２０１２年、ＨａｙｄｏｎおよびＮｅｄｅｒｇａａｒｄ２０１５年）。コネキシン４３（Ｃｘ４３）は、アストロサイト内の主要なギャップジャンクションタンパク質の１つである。本発明者らの脳転移マウスモデルにおいて、がん細胞と周囲のアストロサイトの界面においてＣｘ４３発現が観察された（図１ｂ）。Ｃｘ４３によりがん細胞と内皮細胞との間の相互作用が媒介され得（Ｃａｉ，Ｊｉａｎｇら、１９９８年）、また、アストロサイト（Ｚｈａｎｇ，Ｉｗａｋｕｍａら、２００９年）は転移促進性（Ｐｏｌｌｍａｎｎ，Ｓｈａｏら、２００５年）または抗転移性（Ｓｈａｒｍａ，Ａｂｒａｈａｍら、２０１０年）であることが提唱された。Ｃｘ４３と脳転移の臨床的関連性を決定するために、本発明者らは、患者の組織試料をアッセイした。トリプルネガティブ乳がんおよび非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）において、本発明者らは、Ｃｘ４３染色のレベルが脳転移では原発性腫瘍または正常組織よりも高いことが見いだされた（図１ｃ〜ｄ）。

ギャップジャンクションは、六量体コネキシンヘミチャネルによって形成される。隣接する細胞上のヘミチャネル間の対になった相互作用により、細胞質分子の輸送のためのポアが形成される（ＢｅｎｎｅｔｔおよびＧｏｏｄｅｎｏｕｇｈ１９７８年、Ｏｓｈｉｍａ２０１４年）。全てのギャップジャンクションが機能的なポアを形成するとは限らない（Ｓｔｏｌｅｔｏｖ，Ｓｔｒｎａｄｅｌら、２０１３年）、（Ｓｈａｒｍａ，Ａｂｒａｈａｍら、２０１０年）。しかし、微速度撮影蛍光顕微鏡によって示される通り、脳転移細胞からアストロサイトへのカルセインの時間依存的な移行（図１ｅ；図６ｃ）、およびフローサイトメトリーによって示される通り、アストロサイトから転移細胞へのカルセインの時間依存的な移行（図６ｄ）が観察された。

脳転移はプロトカドヘリン７を上方制御する。アストロサイトカルセイン移行は、脳転移細胞でそれらの親対応物よりも容易に起こった（図１ｆ）。この表現型は、脳転移派生物ではＣｘ４３発現がより高いことによっては十分に説明できなかった（図１ｇ、図７ａ、ｂ）。さらに、転移細胞におけるＣｘ４３発現は、アストロサイト、ニューロン、または脳微小血管内皮細胞におけるＣｘ４３発現よりも低いか、またはそれと同様であった（図１ｈ、図７ｃ）。脳転移細胞における他のアストロサイトコネキシン（Ｃｘ２６、Ｃｘ３０）の発現レベルは、親細胞での発現レベルと同様であった（図７ｄ）。これらの知見から、転移細胞がどのようにして常在アストロサイトとギャップジャンクション形成について競合し得るのかという疑問が生じた。

がん細胞がアストロサイトと会合するためにＣｘ４３に加えて別の構成成分を使用するに違いないと推論して、本発明者らは、乳房腫瘍由来の脳転移細胞および肺腫瘍由来の脳転移細胞にどちらにおいても上方制御される小さな遺伝子群のうちの１つであるプロトカドヘリン７（ＰＣＤＨ７）について調査した（Ｂｏｓ，Ｚｈａｎｇら、２００９年、Ｎｇｕｙｅｎ，Ｃｈｉａｎｇら、２００９年、Ｖａｌｉｅｎｔｅ，Ｏｂｅｎａｕｆら、２０１４年）。プロトカドヘリンは、同種親和性相互作用（ｈｏｍｏｐｈｉｌｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）による細胞間接触を導くカドヘリンリピートを７つ有する内在性膜タンパク質である。ＰＣＤＨ７（カドヘリン関連ニューロン受容体としても公知である）は、主に脳において発現する唯一のプロトカドヘリンであり（Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｙｏｓｈｉｔｏｍｏ−Ｎａｋａｇａｗａら、１９９８年、Ｋｉｍ，Ｃｈｕｎｇら、２００７年）、その機能は分かっていない。ＰＣＤＨ７レベルは、脳転移派生物において、親細胞株（図１ｇ、図７ａ、ｂ）または骨もしくは肺には高転移性であるが脳には高転移性ではない対応する派生物（図１ｉ；図６ａ参照）におけるものよりも高かった。脳転移細胞におけるＰＣＤＨ７レベルは、アストロサイト、ニューロン、ミクログリアまたは内皮細胞におけるものよりも高かった（図１ｈ、図７ｃ）。

再発部位のアノテーションを伴うトリプルネガティブ乳がんの臨床コホートでは、原発性腫瘍におけるＰＣＤＨ７とＣｘ４３の組合せ発現が脳転移には関連したが、骨転移にも肺転移にも関連しなかった（図１ｊ）。大多数のＮＳＣＬＣデータセットは部位特異的転移情報がアノテートされていないが、これらの患者における再発は高い割合（７０％まで）で脳転移を含む（Ｇａｓｐａｒ，Ｃｈａｎｓｋｙら、２００５年）。脳転移に関連する罹患率および死亡率は極めて高いので（Ｇａｓｐａｒ，Ｓｃｏｔｔら、２０００年）、これらは、無転移生存期間に対して不均衡に寄与する。実際に、Ｃｘ４３発現およびＰＣＤＨ７発現は、３つのコホートにおけるＮＳＣＬＣ患者の無転移生存期間の低下に関連した（図１ｋ、図７ｅ）。これらの結果は全て、ＰＣＤＨ７およびＣｘ４３が脳転移に関連するという仮説を裏付けるものである。

ＰＣＤＨ７により癌腫−アストロサイトギャップジャンクションが導かれる。ＰＣＤＨ７またはＣｘ４３のいずれかを低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）によって枯渇させた脳転移細胞（図７ｆ、ｇ）では、対照と比較してアストロサイトへの色素移行の能力の低減が示された（図２ａ、図８ａ）。Ｃｘ４３枯渇後の色素移行の阻害の程度は、汎コネキシン阻害剤であるカルベノキソロン（ｃａｒｂｅｎｏｌｏｘｏｎｅ）を用いて得られるものと同等であった（図８ｂ）。隣接する細胞上の分子間の同種親和性結合を確立するカドヘリンの能力を考慮して（ＹａｇｉおよびＴａｋｅｉｃｈｉ、２０００年）、本発明者らは、がん細胞とのギャップジャンクションの形成にアストロサイトＰＣＤＨ７が関与する可能性があるという仮説を立てた。実際に、アストロサイトにおけるＰＣＤＨ７枯渇（図８ｃ）によっても、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞からの色素移行が阻害された（図８ｄ）。

ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）は、アストロサイトよりもはるかに低レベルのＣｘ４３を発現し、また、ＰＣＤＨ７発現は検出可能でない（図１ｈ、図７ｃ）。がん細胞とＨＢＭＥＣとの間ではＰＣＤＨ７に依存しないギャップジャンクションコミュニケーションが低レベルで起こった（図８ｅ）。競合実験において、がん細胞とアストロサイトとの間での色素移行は、がん細胞と内皮細胞との間での色素移行よりも有利であった（図８ｆ）。初代ミクログリア細胞はＣｘ４３およびＰＣＤＨ７を非常に低レベルで発現し、がん細胞からカルセインを受容しなかった（図８ｇ）。アストロサイトおよびがん細胞におけるＣｘ４３レベルは、ミクログリアと共培養した後も一定のままであった（図８ｈ）。したがって、ＰＣＤＨ７により、がん細胞が優先的にアストロサイトとＣｘ４３ギャップジャンクションを形成するよう導かれる。

本発明者らは、スプリットルシフェラーゼ補完アッセイ（Ｌｕｋｅｒ，Ｓｍｉｔｈら、２００４年）を用いて、生細胞におけるＰＣＤＨ７のＣｘ４３との相互作用を検出した。ホタルルシフェラーゼのＮ末端側半分（ＮＬｕｃ）およびＣ末端側半分（ＣＬｕｃ）に融合したＰＤＣＨ７およびＣｘ４３をコードする構築物を、非ＧＦＰ−ルシフェラーゼ標識した親細胞において関連する組合せで発現させた（図２ｂ）。ＮＬｕｃとＣＬｕｃが近傍になると、ルシフェラーゼ活性が再構成される。Ｃｘ４３は細胞膜において六量体セミチャネルに自己組織化するので、Ｃｘ４３−ＮＬｕｃベクターおよびＣｘ４３−ＣＬｕｃベクターを用いた細胞への形質導入が陽性対照としての機能を果たした（図２ｂ）。本発明者らは、Ｃｘ４３−ＣＬｕｃとＰＣＤＨ７−ＮＬｕｃの両方を発現する細胞において特異的なルシフェラーゼ活性を検出した（図２ｂ）。ＰＣＤＨ７およびＣｘ４３の発現レベルは、親細胞における内在性レベルよりも高かったが、脳転移細胞におけるレベルよりは低いかまたはそれと同等であった（図９ａ）。さらに、アストロサイトとの共培養により、がん細胞におけるルシフェラーゼシグナルが上昇し（図９ｂ）、これにより、アストロサイトのＣｘ４３およびＰＣＤＨ７により、がん細胞のＣｘ４３−ＣＬｕｃおよびＰＣＤＨ７−ＮＬｕｃのさらなるクラスター化が誘導されることが示唆される。Ｎ−カドヘリンまたはＥ−カドヘリンをＮＬｕｃと融合し、Ｃｘ４３−ＣＬｕｃと同時発現させた場合には活性は検出されなかった（図９ｃ〜ｅ）。

Ｃｘ４３およびＰＣＤＨ７により脳転移コロニー形成が媒介される。異種移植モデル（図２ｃ〜ｄ）および免疫適格性モデル（図１０ａ）において、Ｃｘ４３またはＰＣＤＨ７のいずれかのｓｈＲＮＡ媒介性枯渇により、乳がん細胞および肺がん細胞による脳転移の形成が阻害された。脳切片におけるＧＦＰについての免疫組織化学染色により、この結果が確認され、Ｃｘ４３またはＰＣＤＨ７枯渇の結果として病変サイズの顕著な縮小が実証された（図１０ｂ）。Ｃｘ４３またはＰＣＤＨ７の枯渇は、尾静脈注射後のＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞による肺病変の形成には影響を及ぼさなかった（図１０ｃ）。

コネキシンは、チャネル機能とは独立して細胞間相互作用を媒介することができるので、本発明者らは、チャネル機能を欠くがそれでもヘミチャネルを組み立てるＣｘ４３（Ｔ１５４Ａ）変異体を用いた（図２ｅ）（Ｂｅａｈｍ、Ｏｓｈｉｍａら、２００６年）。野生型またはＴ１５４Ａ変異体のいずれかのＣｘ４３をＣｘ４３枯渇脳転移がん細胞において再発現させた（図１０ｄ）。変異体Ｃｘ４３はアストロサイトからＭＤＡ２３１−ＢｒＭ細胞へのカルセイン移行を媒介することができなかった（図２ｅ）。野生型Ｃｘ４３はＣｘ４３枯渇ＭＤＡ２３１−ＢｒＭおよびＨ２０３０−ＢｒＭ細胞における脳転移活性をレスキューしたが、Ｃｘ４３（Ｔ１５４Ａ）はレスキューしなかった（図２ｆ、図１０ｅ）。まとめると、これらの知見により、ＰＣＤＨ７が直接かつ特異的にＣｘ４３と相互作用してがん細胞とアストロサイトとの間の機能的なギャップジャンクション形成を選択的に促進するモデルが支持される（図２ｇ）。

ＰＣＤＨ７およびＣｘ４３が脳転移の形成に寄与する段階を定義するために、本発明者らは、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞を用いた短期転移アッセイを実施した。このモデルでは、ＢＢＢを横切る血管外遊出が接種後７日で完了し、血管の利用および顕性の増生が１４日目までに起こる（Ｖａｌｉｅｎｔｅ，Ｏｂｅｎａｕｆら、２０１４年）。がん細胞におけるＣｘ４３またはＰＣＤＨ７枯渇により、接種の７日後の脳実質内のＧＦＰ＋がん細胞の数は有意には減少しなかった（図１１ａ）。接種の１４日後に、Ｃｘ４３またはＰＣＤＨ７を枯渇させた細胞に起因する微小転移では、Ｋｉ６７染色によって決定された通り、増殖の低下が示された（図１１ｂ）。脳転移細胞のアポトーシスをｅｘ−ｖｉｖｏ脳スライスアッセイにおいて決定した（Ｖａｌｉｅｎｔｅ，Ｏｂｅｎａｕｆら、２０１４年）。この手法を用いて、本発明者らは、アポトーシスの増加と一致して、Ｃｘ４３またはＰＣＤＨ７を枯渇させた細胞においてカスパーゼ３染色が増加することを見いだした（図１１ｃ）。注目すべきことに、Ｃｘ４３枯渇細胞またはＰＣＤＨ７枯渇細胞は、それでもなお毛細血管と密接に相互作用することができた（図１１ｄ）。したがって、がん細胞−アストロサイトギャップジャンクションにより、最初の血管外遊出および血管の利用後の脳転移発生が支持される。

がん細胞ギャップジャンクションにより、アストロサイトによるサイトカインの放出が誘発される。このＣｘ４３媒介性脳転移成長の背後の機構を決定するために、本発明者らは、翻訳リボソームアフィニティー精製（ＴＲＡＰ）（Ｈｅｉｍａｎ，Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２００８年）を使用して、混合共培養物におけるがん細胞遺伝子発現をアッセイした（図１２ａ）。本発明者らは、ｅＧＦＰタグを付けたＬ１０ａリボソームサブユニットを、基底のＣｘ４３発現を伴うかまたはＣｘ４３発現が低減したＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞において発現させた。がん細胞とアストロサイトを２４時間にわたって共培養した後、ｅＧＦＰ免疫沈降およびがん細胞からのポリソーム関連ｍＲＮＡの採取を行い、その後、グローバルトランスクリプトーム配列決定（ＴＲＡＰ−ＲＮＡｓｅｑ）を行った（図１２ｂ、ｃ）。遺伝子シグネチャ分析により、インターフェロン（ＩＦＮ）およびＮＦ−κＢ経路が、アストロサイトとの共培養後に脳転移細胞において最も活性化される経路であり、これらの効果は、Ｃｘ４３を必要とすることが明らかになった（図３ａ）。他の上方制御された経路には、Ｈｅｒ２／ＡＫＴおよびＴＧＦβが含まれた。アストロサイト−ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２共培養からの馴化培地は、ＳＴＡＴ１およびＮＦ−κＢｐ６５のリン酸化の増加によって決定された通り、がん細胞におけるＩＦＮおよびＮＦ−κＢシグナル伝達を活性化するために十分であった（図３ｂ、図１２ｄ）。この効果は、アストロサイトとＣｘ４３枯渇またはＣｘ４３（Ｔ１５４Ａ）再構成がん細胞との共培養からの馴化培地では観察されなかった（図３ｃ）。

ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２−アストロサイト共培養において生成した馴化培地の分析（図３ｄ）により、Ｉ型インターフェロン、ＩＦＮα、およびＴＮＦαがギャップジャンクション依存的に蓄積されることが実証され（図３ｅ、図１３ａ〜ｂ）、ＩＩ型インターフェロン、ＩＦＮγは検出されなかった（データは示していない）。単独またはアストロサイトと共培養したＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２は、ＴＲＡＰ−ＲＮＡｓｅｑによって検出された通り、これらのサイトカインを発現しなかった（データは示していない）。共培養後に再単離したアストロサイトにおいてＩＮＦα ｍＲＮＡおよびＴＮＦα ｍＲＮＡの上方制御が検出された（図３ｆ）。これらの結果から、異種細胞ギャップジャンクションコミュニケーションにより、アストロサイトにおけるＩＦＮαおよびＴＮＦαの産生が引き出され、それにより、がん細胞におけるＳＴＡＴ１およびＮＦ−κＢ経路活性化が誘発されることが示唆された。ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、ＩＦＮαおよびＴＮＦαの添加により、脳転移がん細胞の細胞傷害性化学療法に対するアポトーシス性応答が阻害された（図３ｇ、図１３ｃ）。脳転移におけるこれらの経路の機能的重要性を評価するために、本発明者らは、脳転移細胞において、ＳＴＡＴ１をｓｈＲＮＡによってノックダウンしたか（図３ｈ、図１３ｄ）、または、ＩκＢα超抑制因子（ｓｕｐｅｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）（ＳＲ−ＩκＢα）を過剰発現させることによってＮＦ−κＢを阻害した（Ｂｏｅｈｍ，Ｚｈａｏら、２００７年）（図３ｉ）。マウスに接種すると、これらの細胞では対照対応物よりも小さな脳転移が生じ（図３ｊ、図１３ｅ）、これにより、ＳＴＡＴ１およびＮＦ−κＢ活性化因子により、脳における転移細胞に生存優位性がもたらされることが示唆される。

がん細胞ギャップジャンクションにより、アストロサイトにおける細胞質ｄｓＤＮＡ応答が活性化される。ＩＦＮαおよびＴＮＦαは、多様なインプットによって個別に誘導することができるが、両方のサイトカインの共同上方制御は細胞質二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対する細胞応答を想起させた（Ｃａｉ，Ｃｈｉｕら、２０１４年）。細胞質ｄｓＤＮＡにより、環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）が細胞質ｄｓＤＮＡを感知し二次メッセンジャーである２’３’−環状ＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）を合成するｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧ経路が誘発される。ｃＧＡＭＰがＳＴＩＮＧと結合することにより、ＴＢＫ１およびＩＲＦ３のリン酸化および活性化、ＩＲＦ３の核内蓄積、およびＩＲＦ３の標的遺伝子であるＩＦＮＡおよびＴＮＦＡの転写活性化が誘発される（Ｗｕ，Ｓｕｎら、２０１３年）。この経路は、古代抗ウイルス先天免疫応答である（Ｃａｉ，Ｃｈｉｕら、２０１４年）。

ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞とアストロサイトの共インキュベーションにより、Ｃｘ４３依存的様式でＴＢＫ１およびＩＲＦ３のリン酸化が誘発された（図４ａ、図１４ａ）。ＩＲＦ３の核内蓄積は共培養したアストロサイトにおいてのみ起こり、単独で培養したアストロサイトにおいてもがん細胞においても起こらなかった（図４ｂ）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して、本発明者らは、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞ではｃＧＡＭＰを検出したが、単独で培養したアストロサイトではｃＧＡＭＰは検出されなかった（図４ｃ〜ｄ、図１４ｂ）。固定数のＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞とアストロサイトの共培養により、ｃＧＡＭＰのレベルのＣｘ４３依存性の上昇が導かれた（図４ｃ〜ｄ）。ミトコンドリアｄｓＤＮＡが細胞質に放出されるストレス条件を使用して、本発明者らは、アストロサイトが、細胞質ｄｓＤＮＡに応答したｃＧＡＭＰの産生に対してコンピテントであることを確認した（Ｒｏｎｇｖａｕｘ，Ｊａｃｋｓｏｎら、２０１４年）。

細胞成分分画により、これらの脳転移細胞および他のヒトのがん細胞株は細胞質ｄｓＤＮＡを含有するが、アストロサイトおよび他の非新生物ヒト細胞は細胞質ｄｓＤＮＡを含有しないことが実証された（図４ｅ、図１４ｃ、ｄ）。免疫蛍光法により、本発明者らは、細胞質ｄｓＤＮＡを脳転移がん細胞では検出したが（図４ｆ、図９ｅ）、アストロサイトでは検出しなかった（図１４ｆ）。がん細胞ＤＮＡがＣｘ４３ギャップジャンクションを通じてアストロサイトまでわたるかどうかを決定するために、本発明者らは、がん細胞ＤＮＡを５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）で標識し、その細胞をアストロサイトと共培養し、標識したＤＮＡの分布を顕微鏡（図４ｇ、図１４ｇ）またはフローサイトメトリー（図４ｈ）によって分析した。どちらの方法でも、がん細胞からアストロサイトへのＤＮＡのＣｘ４３依存的様式での移行が実証された。

総合すると、これらの結果により、脳転移がん細胞が細胞質ｄｓＤＮＡおよびｃＧＡＭＰを含有し、Ｃｘ４３に基づくギャップジャンクションにおいてアストロサイトと会合するためにＰＣＤＨ７を用いるモデルが支持される。ギャップジャンクションにより、細胞質ｄｓＤＮＡ（およびｃＧＡＭＰ）ががん細胞からアストロサイトまで通過して、さらなるｃＧＡＭＰの生成、ＴＢＫ１およびＩＲＦ３の活性化、ならびにＩＦＮαおよびＴＮＦαの産生が誘発される。これらのサイトカインは、パラクリン因子として作用して、がん細胞におけるＳＴＡＴ１およびＮＦ−κＢシグナル伝達を活性化し、それにより、微小環境および化学療法薬によるストレスに際したがん細胞の成長および生存を支持する（図４ｉ）。

ギャップジャンクション活性の薬理的阻害。
ギャップジャンクション構成成分の遺伝子阻害によって脳転移増生が低減するという証拠により、脳転移に対するギャップジャンクション活性の薬理的抑制因子を試験することについての理論的根拠がもたらされた。この目的のために、本発明者らは、経口的に生物が利用可能な化合物を２種、前臨床試験のために選択した。抗炎症活性に加えて、メクロフェナメートは、Ｃｘ４３ギャップジャンクションゲーティングを阻害し（Ｈａｒｋｓ，ｄｅＲｏｏｓら、２００１年）、動物モデルにおけるてんかん発生を阻害し（Ｊｉｎ，Ｄａｉら、２０１３年）、全身投与後にＢＢＢを通過し（Ｈａｒｋｓ，ｄｅＲｏｏｓら、２００１年）、全身的に耐容性がよく（Ｈｏｌｍｅｓ、１９６６年）、また、現在ＦＤＡに認可されたＮＳＡＩＤである。トナベルサットは、アストロサイトにおける独特の立体選択的結合部位に結合するベンゾピラン誘導体であり（Ｈｅｒｄｏｎ，Ｊｅｒｍａｎら、１９９７年、Ｃｈａｎ，Ｅｖａｎｓら、１９９９年）、動物モデルにおける皮質拡延性抑制（Ｒｅａｄ，Ｓｍｉｔｈら、２０００年）および三叉神経節ニューロンサテライト細胞シグナル伝達（Ｄａｍｏｄａｒａｍ，Ｔｈａｌａｋｏｔｉら、２００９年）を含めた、ギャップジャンクション媒介性の病態生理学的プロセスを阻害し、そして片頭痛を有する患者において全身的に耐容性がよく、安全である（Ｄａｈｌｏｆ，Ｈａｕｇｅら、２００９年）。

フローサイトメトリーによって測定された通り、トナベルサットとメクロフェナメートのどちらによっても、アストロサイトからがん細胞への色素移行（図５ａ）、および、これらの細胞の共培養におけるＩＦＮαおよびＴＮＦαの放出（図５ｂ）が阻害され、Ｃｘ４３またはＰＣＤＨ７のノックダウンで見られる表現型が再現された。免疫不全マウスにおいてＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞またはＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞を動脈接種したか、または免疫適格マウスにおいてＫＲａｓ／ｐ５３−３９３Ｎ１細胞を動脈接種した後１日目から、マウスをビヒクルまたはこれらの化合物のいずれかを用いて処置した（図５ｃ、図１５ａ、ｂ）。どちらの薬物によっても脳転移の出現が妨げられ、これは、ギャップジャンクション活性が転移性増生と関連するという本発明者らの証拠と一致した。しかし、この処置では、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞の肺転移病変または同所性腫瘍としての成長は制限されなかった（図１５ｃ、ｄ）。

ギャップジャンクションを対象とする療法。確立された転移におけるＣｘ４３またはＰＣＤＨ７枯渇の影響を試験するために、本発明者らは、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞にＴｅｔ誘導性ｓｈＲＮＡ発現ベクターを用いた形質導入を行った（図５ｅ）。同じプロモーターの制御下にある赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）により、ｉｎｖｉｖｏにおけるヘアピン発現のマーカーがもたらされた（図１０ｅ）。誘導性Ｃｘ４３またはＰＣＤＨ７ｓｈＲＮＡベクターを用いて形質導入した細胞では、それぞれ、Ｃｘ４３またはＰＣＤＨ７のドキシサイクリン依存性の枯渇が示された（図１５ｆ）。これらの細胞を心臓内に注射し、１４日間にわたって脳転移を形成させた。この段階で、全てのマウスにおいてＢＬＩにより脳病変が明らかであり（図１５ｇ）、浸潤性病変が微小血管系を巻き込み（図５ｄ）、２〜３週間のうちに動物は死亡に至る（Ｂｏｓ，Ｚｈａｎｇら、２００９年、Ｖａｌｉｅｎｔｅ，Ｏｂｅｎａｕｆら、２０１４年）。ドキシサイクリン投与を１４日目に開始することにより、３週間後の脳転移負荷量が対照と比較して減少した（図５ｆ、ｇ）。

脳転移は、化学療法に対する著しい抵抗性によって識別される（Ｚｈａｎｇ，Ｐｒｉｃｅら、１９９２年、ＤｅｅｋｅｎおよびＬｏｓｃｈｅｒ、２００７年）。カルボプラチンはＢＢＢを横断し（Ｐｉｔｚ，Ｄｅｓａｉら、２０１１年）、乳がん（ＬｉｍおよびＬｉｎ、２０１４年）または肺がん（ＴａｉｍｕｒおよびＥｄｅｌｍａｎ、２００３年）からの脳転移を有する患者における全生存の改善はそれほど大きくない。カルボプラチンを単独で（５０ｍｇ／ｋｇ／５日間）１４日目に開始することにより、Ｃｘ４３またはＰＣＤＨ７の枯渇と同程度まで脳転移が阻害され（図５ｆ、ｇ）、カルボプラチンとドキシサイクリンの組合せでは転移負荷量がさらに減少した（図５ｆ、ｇ）。したがって、本発明者らは、ギャップジャンクション調節療法と化学療法の組合せの有効性を評価した（図５ｈ）。カルボプラチンを単独で用いた処置では、脳転移の成長が最小限しか阻害されなかった（図５ｉ）。単一薬剤としてのトナベルサット（１０ｍｇ／ｋｇ）またはメクロフェナメート（２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれか（図５ｉ）では、３５日の終点で転移病変の進行が有意に阻害された。カルボプラチンとトナベルサットまたはメクロフェナメートのいずれかとの組合せでは、脳転移が極めて大きく阻害された（図５ｉ）。

６．３考察
脳は、アストロサイトが微小環境の優勢な特徴である、独特な難しい転移標的を表す。本発明者らは、がん細胞が、極めて重要なＣｘ４３ギャップジャンクションでアストロサイトと選択的に会合するためにＰＣＤＨ７を用いるという証拠を示す。カドヘリンファミリーメンバーは、特に神経系における（Ｈｉｒａｎｏ、Ｓｕｚｕｋｉら、２００３年）、発生および組織恒常性における細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターである（ＹａｇｉおよびＴａｋｅｉｃｈｉ、２０００年）。脳転移細胞は、正常な発現が脳に大きく限定されるこのファミリーの特定のメンバーを用いることに注目すべきである（Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｙｏｓｈｉｔｏｍｏ−Ｎａｋａｇａｗａら、１９９８年）。したがって、ＰＣＤＨ７は、乳癌および肺癌に由来する脳転移細胞が選択的に発現して脳にコロニー形成する、脳に限定される構成成分として、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５（Ｂｏｓ，Ｚｈａｎｇら、２００９年）、およびニューロセルピン（Ｖａｌｉｅｎｔｅ，Ｏｂｅｎａｕｆら、２０１４年）と結びつく。

ＰＣＤＨ７およびＣｘ４３は、脳転移コロニー形成および化学療法抵抗性に寄与する。がん細胞とアストロサイトとの間の機能的なＣｘ４３に基づくギャップジャンクションにより、がん細胞が細胞質ｄｓＤＮＡをアストロサイトネットワークに拡散することが可能になる。これにより、アストロサイトｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧ経路が活性化し、結果的に、ＩＦＮαおよびＴＮＦαを含めたサイトカインが放出される。これらのサイトカインにより、脳転移細胞に対して、生理的ストレス要因および化学療法によるストレス要因からの保護による成長利点がもたらされる。他の上方制御される経路には、Ｈｅｒ２／ＡＫＴおよびＴＧＦβが含まれる。したがって、本発明者らの結果から、以前に観察されたｉｎｖｉｔｒｏにおけるアストロサイトのがん細胞に対する化学的保護効果（ｃｈｅｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔ）についてのｉｎｖｉｖｏにおける証拠および機構的な裏付けがもたらされる（Ｋｉｍ、Ｋｉｍら、２０１１年）。本証拠により、以前の研究と合わせて、がん細胞が、アストロサイトによる攻撃から２つのやり方で自身を保護し、第１のやり方は、細胞傷害性プラスミン生成のセルピン阻害物質の産生によるものであり、第２のやり方は、ギャップジャンクションを通じてアストロサイトと会合し、ｄｓＤＮＡ応答を流用するものであることが示唆される。

細胞質ｄｓＤＮＡは、ウイルス感染に対する先天免疫の活性化因子として最初に定義された（ＳｔｅｔｓｏｎおよびＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２００６年）。がん細胞では、ゲノムの不安定性、ミトコンドリアストレス、およびＤＮＡ損傷剤への曝露を含めた、ｄｓＤＮＡの可能性のある供給源がいくつも存在する。ＤＮＡにより誘発される先天免疫応答、そして具体的にはｃＧＡＭＰは、ギャップジャンクションを通じて他の細胞にわたることができる（Ｐａｔｅｌ，Ｋｉｎｇら、２００９年、Ａｂｌａｓｓｅｒ，Ｓｃｈｍｉｄ−Ｂｕｒｇｋら、２０１３年）。これらの知見と一致して、本発明者らは、脳転移派生物を含めた悪性細胞が、アストロサイトおよび他の間質細胞と比較して高レベルの細胞質ｄｓＤＮＡおよびｃＧＡＭＰを含有することが見いだされた。重要なことに、脳転移では、ｄｓＤＮＡ応答は、がん細胞における内因性の細胞質ｄｓＤＮＡから出現し、Ｃｘ４３依存性であり、また宿主組織アストロサイトが関与し、したがって、これは前例のない転移促進プロセスを表す。

脳転移は、がん患者の罹患率および死亡率の主要な一因であり、利用可能な治療選択肢はわずかである。がん細胞の拡散およびＢＢＢを通じた血管外遊出を含めた脳転移カスケードの初期ステップは、療法に適したものではなかった（Ｍａｈｅｒ，Ｍｉｅｔｚら、２００９年、Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｃｈｕｎｇら、２０１１年）。しかし、がん細胞が転移病変を生存および増生させるためにＣｘ４３／ＰＣＤＨ７ギャップジャンクションに依存することは、治療の機会を示唆する。化学療法とギャップジャンクションモジュレーターの組合せを使用した本発明者らの前臨床結果から、脳転移に対するこれらの介入の治療的潜在性についての原理証明がもたらされる。

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Claims

がんを有する被験体を治療するための方法であって、前記被験体に、脳における前記がんの転移性進行を阻害する量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む、方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がトナベルサットである、請求項１に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がメクロフェナメートである、請求項１に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がコネキシン４３阻害剤である、請求項１に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がプロトカドヘリン７阻害剤である、請求項１に記載の方法。
前記がんが乳がんである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
前記がんが肺がんである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
前記被験体に治療有効量の抗がん剤を投与するステップをさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
前記抗がん剤がカルボプラチンである、請求項８に記載の方法。
治療前に前記被験体が１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
治療前に前記被験体が脳転移を有することが分かっていなかった、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
前記被験体のがん細胞がコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
被験体の脳において転移がん細胞の成長および／または生存を阻害するための方法であって、前記被験体を治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を用いて治療するステップを含む、方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がトナベルサットである、請求項１３に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がメクロフェナメートである、請求項１３に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がコネキシン４３阻害剤である、請求項１３に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がプロトカドヘリン７阻害剤である、請求項１３に記載の方法。
前記がんが乳がんである、請求項１３から１７のいずれかに記載の方法。
前記がんが肺がんである、請求項１３から１７のいずれかに記載の方法。
前記被験体に治療有効量の抗がん剤を投与するステップをさらに含む、請求項１３から１９までのいずれかに記載の方法。
前記抗がん剤がカルボプラチンである、請求項２０に記載の方法。
治療前に前記被験体が１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた、請求項１３から２１のいずれかに記載の方法。
治療前に前記被験体が脳転移を有することが分かっていなかった、請求項１３から２１のいずれかに記載の方法。
前記被験体のがん細胞がコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する、請求項１３から２３のいずれかに記載の方法。
がんを有する被験体において脳転移を治療するための方法であって、前記被験体に治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む、方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がトナベルサットである、請求項２５に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がメクロフェナメートである、請求項２５に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がコネキシン４３阻害剤である、請求項２５に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がプロトカドヘリン７阻害剤である、請求項２５に記載の方法。
前記がんが乳がんである、請求項２５から２９のいずれかに記載の方法。
前記がんが肺がんである、請求項２５から２９のいずれかに記載の方法。
前記被験体に治療有効量の抗がん剤を投与するステップをさらに含む、請求項２５から３１のいずれかに記載の方法。
前記抗がん剤がカルボプラチンである、請求項３２に記載の方法。
治療前に前記被験体が１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた、請求項２５から３３のいずれかに記載の方法。
治療前に前記被験体が脳転移を有することが分かっていなかった、請求項２５から３３のいずれかに記載の方法。
前記被験体のがん細胞がコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する、請求項２５から３５のいずれかに記載の方法。
がんを有する被験体において前記がんの脳への転移を予防する方法であって、前記被験体に治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む、方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がトナベルサットである、請求項３７に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がメクロフェナメートである、請求項３７に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がコネキシン４３阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がプロトカドヘリン７阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
前記がんが乳がんである、請求項３７から４１のいずれかに記載の方法。
前記がんが肺がんである、請求項３７から４１のいずれかに記載の方法。
前記被験体に治療有効量の抗がん剤を投与するステップをさらに含む、請求項３７から４３のいずれかに記載の方法。
前記抗がん剤がカルボプラチンである、請求項４４に記載の方法。
治療前に前記被験体が１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた、請求項３７から４５のいずれかに記載の方法。
治療前に前記被験体が脳転移を有することが分かっていなかった、請求項３７から４５のいずれかに記載の方法。
前記被験体のがん細胞がコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する、請求項３７から４７のいずれかに記載の方法。
がんの脳への検出可能な転移のリスクを低減する方法であって、前記がんを有する被験体に治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む、方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がトナベルサットである、請求項４９に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がメクロフェナメートである、請求項４９に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がコネキシン４３阻害剤である、請求項４９に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がプロトカドヘリン７阻害剤である、請求項４９に記載の方法。
前記がんが乳がんである、請求項４９から５３のいずれかに記載の方法。
前記がんが肺がんである、請求項４９から５３のいずれかに記載の方法。
前記被験体に治療有効量の抗がん剤を投与するステップをさらに含む、請求項４９から５５のいずれかに記載の方法。
前記抗がん剤がカルボプラチンである、請求項５６に記載の方法。
治療前に前記被験体が１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた、請求項４９から５７のいずれかに記載の方法。
治療前に前記被験体が脳転移を有することが分かっていなかった、請求項４９から５７のいずれかに記載の方法。
前記被験体のがん細胞がコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する、請求項４９から５９のいずれかに記載の方法。
がんを有する被験体において前記がんの脳への検出可能な転移のリスクを低減する方法であって、前記被験体に治療有効量のプロトカドヘリン７阻害剤を投与するステップを含む、方法。
前記プロトカドヘリン７阻害剤が干渉ＲＮＡである、請求項６１に記載の方法。
前記がんが乳がんである、請求項６１または６２のいずれかに記載の方法。
前記がんが肺がんである、請求項６１または６２のいずれかに記載の方法。
前記被験体に治療有効量の抗がん剤を投与するステップをさらに含む、請求項６１から６４のいずれかに記載の方法。
前記抗がん剤がカルボプラチンである、請求項６５に記載の方法。
治療前に前記被験体が１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた、請求項６１から６６のいずれかに記載の方法。
治療前に前記被験体が脳転移を有することが分かっていなかった、請求項６１から６６のいずれかに記載の方法。
前記被験体のがん細胞がコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する、請求項６１から６８のいずれかに記載の方法。
がんを有する被験体の生存期間を延長するための方法であって、前記被験体に、有効量のギャップジャンクション阻害剤を投与するステップを含む、方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤を投与することにより、脳における前記がんの転移性進行が阻害される、請求項７０に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がトナベルサットである、請求項７０または７１に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がメクロフェナメートである、請求項７０または７１に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がコネキシン４３阻害剤である、請求項７０または７１に記載の方法。
前記ギャップジャンクション阻害剤がプロトカドヘリン７阻害剤である、請求項７０または７１に記載の方法。
前記がんが乳がんである、請求項７０から７５のいずれかに記載の方法。
前記がんが肺がんである、請求項７０から７５のいずれかに記載の方法。
前記被験体に治療有効量の抗がん剤を投与するステップをさらに含む、請求項７０から７７のいずれかに記載の方法。
前記抗がん剤がカルボプラチンである、請求項７８に記載の方法。
治療前に前記被験体が１つまたは複数の脳転移を有することが分かっていた、請求項７０から７９のいずれかに記載の方法。
治療前に前記被験体が脳転移を有することが分かっていなかった、請求項７０から７９のいずれかに記載の方法。
前記被験体のがん細胞がコネキシン４３および／またはプロトカドヘリン７を発現する、請求項７０から８１のいずれかに記載の方法。
がんを有する被験体を治療するための方法において使用するためのギャップジャンクション阻害剤であって、前記ギャップジャンクション阻害剤の投与が、脳における前記がんの転移性進行を阻害する、ギャップジャンクション阻害剤。
トナベルサットである、請求項８３に記載のギャップジャンクション阻害剤。
メクロフェナメートである、請求項８３に記載のギャップジャンクション阻害剤。
コネキシン４３阻害剤である、請求項８３に記載のギャップジャンクション阻害剤。
プロトカドヘリン７阻害剤である、請求項８３に記載のギャップジャンクション阻害剤。
被験体の脳において転移がん細胞の成長および／または生存を阻害するための方法であって、前記被験体を治療有効量のギャップジャンクション阻害剤を用いて治療するステップを含み、当該治療有効量のギャップジャンクション阻害剤が、その量のギャップジャンクション阻害剤の非存在下でのｃＧＡＭＰのレベルと比較してｃＧＡＭＰの低下をもたらすものである、方法。
被験体における脳腫瘍または転移性脳腫瘍がギャップジャンクション阻害剤を用いた治療から治療的利益を受けるかどうかを決定する方法であって、前記腫瘍に由来する試料において、ギャップジャンクション阻害剤への曝露によりｃＧＡＭＰの低下が導かれるかどうかを決定するステップを含み、ｃＧＡＭＰの低下が、治療的利益を示す、方法。
被験体の脳において転移がん細胞の成長および／または生存を阻害する方法であって、（ｉ）前記被験体が、ギャップジャンクション阻害剤を用いた治療から治療的利益を受けるかどうかを決定するステップであり、前記被験体のがん細胞（脳転移、原発腫瘍、または前記脳の外の転移性腫瘍から得ることができる）が、ギャップジャンクション阻害剤に曝露させた場合に、前記阻害剤の非存在下でのｃＧＡＭＰレベルと比較してｃＧＡＭＰの低下を示すかどうかを決定することを含み、ここでｃＧＡＭＰの低下が、治療的利益を示す、ステップと、（ｉｉ）ｃＧＡＭＰの低下が観察された場合には前記ギャップジャンクション阻害剤を用いて前記被験体を治療するか、または、ｃＧＡＭＰの低下が観察されなかった場合には別のギャップジャンクション阻害剤を腫瘍細胞におけるｃＧＡＭＰを低下させるその能力についてアッセイするかもしくは別のモダリティを用いて前記被験体を治療するステップとを含む、方法。
被験体において脳腫瘍の成長を阻害する方法であって、（ｉ）前記被験体が、ギャップジャンクション阻害剤を用いた治療から治療的利益を受けるかどうかを決定するステップであり、前記被験体の腫瘍細胞が、ギャップジャンクション阻害剤に曝露させた場合に、前記阻害剤の非存在下でのｃＧＡＭＰレベルと比較してｃＧＡＭＰの低下を示すかどうかを決定することを含むステップであり、ここでｃＧＡＭＰの低下が、治療的利益を示す、ステップと、（ｉｉ）ｃＧＡＭＰの低下が観察された場合には前記ギャップジャンクション阻害剤を用いて前記被験体を治療するか、または、ｃＧＡＭＰの低下が観察されなかった場合には別のギャップジャンクション阻害剤を前記腫瘍細胞におけるｃＧＡＭＰを低下させるその能力についてアッセイするかもしくは別のモダリティを用いて前記被験体を治療するステップとを含む、方法。
請求項８８から９１に従ってｃＧＡＭＰを測定するためのキットであって、少なくとも１つのｃＧＡＭＰ標準物質、および脳腫瘍におけるギャップジャンクション阻害を用いたｃＧＡＭＰの低下に関する情報を含む、キット。