JP2017531657A - Recombinant Borrelia protein and method for its use - Google Patents
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Abstract
ボレリア・ブルグドルフェリ組換えタンパク質およびボレリア・ブルグドルフェリのあるタンパク質に対する抗体の存在についてサンプルを判断するための方法が記載され、ライム病を診断するための方法も記載される。ボレリア・ブルグドルフェリのタンパク質のマイクロアレイもまた、記載される。A method for determining a sample for the presence of an antibody against a Borrelia burgdorferi recombinant protein and a protein of Borrelia burgdorferi is described, and a method for diagnosing Lyme disease is also described. A microarray of Borrelia burgdorferi proteins is also described.
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2014年11月6日に提出された米国仮特許出願第62/076,059号明細書および2014年10月7日に提出された米国仮特許出願第62/060,867号明細書の利益を主張する。上記の出願の全教示は、参照によって本明細書において組み込まれる。
CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS This application is filed in US Provisional Patent Application No. 62 / 076,059 filed on November 6, 2014 and US Provisional Patent Application No. 62/0 filed on October 7, 2014. Claims the benefit of 060,867. The entire teachings of the above applications are incorporated herein by reference.
ASCIIテキストファイル中の資料の参照による組み込み
本出願は、これとともに同時に提出されている以下のASCIIテキストファイルに含有される配列表を参照により組み込む。
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政府による支援
本発明は、疾病対策センター(CDC)からのCK000150の下での政府による支援によりなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
Government Support This invention was made with government support under CK000150 from the Centers for Disease Control (CDC). The government has certain rights in the invention.
ライム病は、北米および欧州において、最も多い、媒介動物によって運ばれる疾患であり、その範囲および発生率は、増加しつつある。ヒトライム病は、ライム病の原因となる細菌複合種(Borrelia burgdorferi sensu lato species complex)に属する密接に関係のあるスピロヘータのグループのいくつかのメンバーによって引き起こされる。スピロヘータは、マダニ属のマダニを介してヒトに伝染する(Steere,A.C.,N.Engl.J.Med.1989;321:586−96)。それは、神経系、心臓、および関節を含む二次的な部位に感染で初期に広がり得る初期皮膚感染症によって特徴付けられる進行性の多臓器障害である(Masuzawa,T.et al.,Microbiol.Immunol.1996;40:539−45;Stanek,G.,Infection 1991;19:263−7)。ライム病の正確な診断および治療は、客観的な臨床的異常を、B.ブルグドルフェリへの暴露についての血清学的な証拠と相関させることに依存している。 Lyme disease is the most common vector-borne disease in North America and Europe, and its scope and incidence is increasing. Human Lyme disease is caused by several members of a closely related group of spirochetes belonging to the bacterial complex that causes Lyme disease (Borrelia burgdorferi sen lato species complex). Spirochetes are transmitted to humans through ticks of the tick genus (Steel, AC, N. Engl. J. Med. 1989; 321: 586-96). It is a progressive multi-organ disorder characterized by early skin infections that can spread early in infection to secondary sites including the nervous system, heart, and joints (Maszawa, T. et al., Microbiol. Immunol. 1996; 40: 539-45; Stanek, G., Infection 1991; 19: 263-7). Accurate diagnosis and treatment of Lyme disease is an objective clinical abnormality. Rely on correlating with serological evidence of exposure to burgdorferi.
本発明は、新規な組換えボレリア・ブルグドルフェリタンパク質および対象におけるライム病を診断するための非常に高感度で特異的な方法におけるそれらの使用を包含する。特に、本発明は、少なくとも3つの組換えボレリア・ブルグドルフェリタンパク質抗原を含む組換えボレリア融合タンパク質構築物に関する。これらの構築物はまた、ボレリアキメラタンパク質抗原またはボレリアキメラとも本明細書において呼ばれる。融合タンパク質構築物は、表4、5、6および8に本明細書において記載される。 The present invention encompasses novel recombinant Borrelia burgdorferi proteins and their use in a very sensitive and specific method for diagnosing Lyme disease in a subject. In particular, the present invention relates to a recombinant Borrelia fusion protein construct comprising at least three recombinant Borrelia burgdorferi protein antigens. These constructs are also referred to herein as Borrelia chimeric protein antigens or Borrelia chimeras. Fusion protein constructs are described herein in Tables 4, 5, 6 and 8.
本発明はまた、試験サンプル中のボレリア・ブルグドルフェリに対する抗体の存在を検出するために試験サンプルを判断するためのアッセイにおいて、これらの組換えボレリア融合タンパク質の1つまたは複数またはすべてを使用するための方法にも関する。たとえば、本明細書において記載されるボレリア融合タンパク質(たとえば表4、5、6、および8)は、検出方法においておよびELISA、他の免疫学的アッセイ、または抗体−抗原結合もしくは抗体−抗原結合複合体を検出することができる任意のアッセイ方法において使用するためのタンパク質アレイまたはマイクロアレイを調製するために使用することができる。これらの検出アッセイにおける表4、5、6、および8のボレリア融合タンパク質の使用に加えて、1つまたは複数のさらなる組換えボレリア抗原を、表1に列挙される組換えボレリア抗原などのように、そのようなアッセイまたはマイクロアレイに含むことができる。本発明の一実施形態では、マイクロアレイが、表6の25の組換えボレリア抗原およびキメラタンパク質を含む。別の実施形態では、マイクロアレイが、表8の11の組換えボレリア抗原およびキメラタンパク質を含む。 The invention also uses one or more or all of these recombinant Borrelia fusion proteins in an assay to determine the test sample to detect the presence of antibodies against Borrelia burgdorferi in the test sample. Also relates to a method for For example, the Borrelia fusion proteins described herein (eg, Tables 4, 5, 6, and 8) can be used in detection methods and ELISA, other immunological assays, or antibody-antigen binding or antibody-antigen binding complexes. It can be used to prepare protein arrays or microarrays for use in any assay method that can detect the body. In addition to the use of the Borrelia fusion proteins of Tables 4, 5, 6, and 8 in these detection assays, one or more additional recombinant Borrelia antigens, such as the recombinant Borrelia antigens listed in Table 1, etc. Can be included in such assays or microarrays. In one embodiment of the invention, the microarray comprises the 25 recombinant Borrelia antigens and chimeric proteins of Table 6. In another embodiment, the microarray comprises 11 recombinant Borrelia antigens and chimeric proteins of Table 8.
表4、5、6、もしくは8の1つもしくは複数の組換えボレリア・ブルグドルフェリ融合タンパク質またはさらに1つもしくは複数の表1に列挙される組換えボレリア抗原と反応性の抗体について、対象から得られた試験サンプルを判断することによって、対象(ヒトを含む哺乳動物など)におけるライム病を診断するための方法であって、抗体−抗原反応物(抗体−抗原反応産物とも本明細書において呼ばれる抗体−抗原結合複合体など)の検出が、その個人がライム病であることを示す方法が、本発明によってさらに包含される。抗体−抗原複合体を検出するためのそのようなアッセイは、当業者らによく知られている。本発明の特定の実施形態では、マイクロアレイが、検出/診断アッセイにおいて使用され、マイクロアレイは、表4、5、6、および8に本明細書において記載される組換えボレリアキメラタンパク質ならびにさらに表1に記載される組換えボレリア抗原を含む。本発明の一実施形態では、マイクロアレイが、表6の25の組換えボレリア抗原およびキメラタンパク質を含む。別の実施形態では、マイクロアレイが、表8の11の組換えボレリア抗原およびキメラタンパク質を含む。 For one or more recombinant Borrelia burgdorferi fusion proteins of Tables 4, 5, 6, or 8 or antibodies reactive with the recombinant Borrelia antigens listed in Table 1 or more A method for diagnosing Lyme disease in a subject (such as a mammal including a human) by determining an obtained test sample, also referred to herein as an antibody-antigen reactant (antibody-antigen reaction product) Further encompassed by the present invention is a method wherein detection of an antibody-antigen binding complex, etc.) indicates that the individual has Lyme disease. Such assays for detecting antibody-antigen complexes are well known to those skilled in the art. In certain embodiments of the invention, microarrays are used in detection / diagnostic assays, the microarrays are recombinant Borrelia chimeric proteins described herein in Tables 4, 5, 6, and 8, and further in Table 1. Including the recombinant Borrelia antigen described. In one embodiment of the invention, the microarray comprises the 25 recombinant Borrelia antigens and chimeric proteins of Table 6. In another embodiment, the microarray comprises 11 recombinant Borrelia antigens and chimeric proteins of Table 8.
この発見の結果として、非常に高感度で特異的な方法およびマイクロアレイが、ボレリアのタンパク質に対する抗体の存在についての試験サンプルの評価に現在利用可能である。そのような抗体の存在は、ライム病についての診断に役立つ。そのうえ、方法は、ライム病に関する、可能性として考えられる診断に役立つ候補およびワクチンの候補を同定するのに利用可能である。 As a result of this discovery, very sensitive and specific methods and microarrays are currently available for the evaluation of test samples for the presence of antibodies against Borrelia proteins. The presence of such antibodies is useful for diagnosis of Lyme disease. Moreover, the methods can be used to identify potential diagnostic candidates and vaccine candidates for Lyme disease.
同様の参照記号が様々な図の全体にわたって同じ部分を指す添付の図面において示されるように、前述のものは、本発明の例となる実施形態についての以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。図面は、必ずしも一定の縮尺ではなく、その代わりに、本発明の実施形態を説明することに重点を置いている。
本発明の例となる実施形態の説明が続く。 The description of exemplary embodiments of the present invention continues.
ライム病についての正確で信頼できる診断アッセイは、治療および回復の成功を確実にするのに不可欠である。しかしながら、その疾病の血清診断法は、B.ブルグドルフェリ分離株の遺伝子異質性が高レベルなために、一つの場所から収集されたものの中でさえ著しく困難となる。さらに、ライム病のための現在の血清診断試験は、その疾病の初期においてB.ブルグドルフェリ感染症を検出するための感度および特異度が不足している。本発明では、48の非常に抗原性のボレリア・タンパク質を同定した。これらの組換えボレリアタンパク質抗原は、初期のライム病を有する患者由来の血清を含む、分析されたすべての血清サンプルの大部分によって認識される。さらに、非常に抗原性のボレリアタンパク質のこのライブラリーは、表4、5、および6に示される組換えボレリアキメラ抗原タンパク質のセットならびに本明細書において記載される表6の25の組換えおよびキメラ抗原または11の組換え抗原および組換えキメラ抗原(表8)を含有する非常に高感度で特異的な組換えタンパク質ベースアッセイを開発するために使用された。 Accurate and reliable diagnostic assays for Lyme disease are essential to ensure successful treatment and recovery. However, serodiagnosis of the disease is described in B.C. The high level of genetic heterogeneity of Burgdorferi isolates makes it extremely difficult even among those collected from one place. In addition, current serodiagnostic tests for Lyme disease are found in the early stages of B. There is a lack of sensitivity and specificity for detecting Burgdorferi infections. In the present invention, 48 highly antigenic Borrelia proteins have been identified. These recombinant Borrelia protein antigens are recognized by the majority of all analyzed serum samples, including sera from patients with early Lyme disease. In addition, this library of highly antigenic Borrelia proteins includes the set of recombinant Borrelia chimeric antigen proteins shown in Tables 4, 5, and 6 and the 25 recombinant and chimerics of Table 6 described herein. It was used to develop a very sensitive and specific recombinant protein-based assay containing antigen or 11 recombinant antigens and recombinant chimeric antigen (Table 8).
ある細胞外被タンパク質に対する抗体が、ライム病を有する個人の血清中に存在することが発見された。本明細書において記載されるように、組換えボレリア・ブルグドルフェリ抗原性タンパク質およびキメラ抗原を含有するマイクロアレイを調製した。マイクロアレイを、播種性ライム病とあらかじめ診断された個人由来の血清などのような試験サンプルに暴露した。結果は、ライム病を有する個人の血清が、表1、4、5、6、および8に示される特異的な組換えボレリアタンパク質と反応したことを示した。特に、個人由来の多数の血清は、表6および8に示されるタンパク質のようなタンパク質の特異的なサブセットと反応した。結果は、ライム病を有する個人の血清が、表1および4および5に示す組換えおよびキメラボレリアタンパク質と、特に、表6および8に示す非常に免疫原性のタンパク質と反応したことを示した。本明細書において記載されるライム病アッセイの全体的な感度および特異度を表2、3、7、9、および10に示す。 It has been discovered that antibodies against certain cell coat proteins are present in the serum of individuals with Lyme disease. Microarrays containing recombinant Borrelia burgdorferi antigenic protein and chimeric antigen were prepared as described herein. The microarray was exposed to test samples such as serum from individuals previously diagnosed with disseminated Lyme disease. The results showed that the sera of individuals with Lyme disease reacted with the specific recombinant Borrelia proteins shown in Tables 1, 4, 5, 6, and 8. In particular, a number of sera from individuals reacted with a specific subset of proteins such as those shown in Tables 6 and 8. The results showed that the sera of individuals with Lyme disease reacted with the recombinant and chimeric Borrelia proteins shown in Tables 1 and 4 and 5, in particular with the highly immunogenic proteins shown in Tables 6 and 8. . The overall sensitivity and specificity of the Lyme disease assay described herein is shown in Tables 2, 3, 7, 9, and 10.
本発明のある方法およびマイクロアレイにおいて、1つまたは複数の組換え細胞外被タンパク質抗原、組換え抗原、および/またはキメラ抗原(融合タンパク質構築物)が、使用される。ある実施形態では、2つ以上の抗原のセットが、使用される。本明細書において包含される他の実施形態は、表8の3つの抗原、4つの抗原、5つの抗原など、11までの抗原、表4の16の抗原、表6の25の抗原、表5の96の抗原、もしくは表1の48の抗原または前述の表のすべての抗原を含む。代表的なセットは、表1、4、5、6、および8に示すタンパク質のセットを含む。そのようなセットは、細胞外被タンパク質の相同体およびパラログをさらに含むことができる。特定の一実施形態では、セットが、表6に示す抗原から本質的になる。別の特定の実施形態では、セットが、表8に示す抗原から本質的になる。 In certain methods and microarrays of the invention, one or more recombinant cell envelope protein antigens, recombinant antigens, and / or chimeric antigens (fusion protein constructs) are used. In certain embodiments, a set of two or more antigens is used. Other embodiments encompassed herein include up to 11 antigens such as 3 antigens in Table 8, 4 antigens, 5 antigens, 16 antigens in Table 4, 25 antigens in Table 6, Table 5 96 antigens, or 48 antigens of Table 1 or all antigens of the preceding table. A representative set includes the set of proteins shown in Tables 1, 4, 5, 6, and 8. Such a set can further include homologues and paralogs of the cell coat protein. In one particular embodiment, the set consists essentially of the antigens shown in Table 6. In another specific embodiment, the set consists essentially of the antigens shown in Table 8.
本発明のさらなる方法およびマイクロアレイでは、本明細書において同定される1つまたは複数の他のタンパク質が、使用され、タンパク質の他の組み合わせが、使用される(たとえば、表1、4、5、6、および8のいずれかから選択されるタンパク質を組み合わせて)。そのような組み合わせは、2つもしくはそれ以上、3つもしくはそれ以上、4つもしくはそれ以上、5つもしくはそれ以上、6つもしくはそれ以上、7つもしくはそれ以上、8つもしくはそれ以上またはタンパク質の他のグループのセット(たとえば、表1、表5、および/もしくは表6から選択される1つもしくは複数を有する)を含む。 In further methods and microarrays of the invention, one or more other proteins identified herein are used, and other combinations of proteins are used (eg, Tables 1, 4, 5, 6). And a protein selected from any one of 8). Such combinations include two or more, three or more, four or more, five or more, six or more, seven or more, eight or more or of proteins Other sets of groups (eg, having one or more selected from Table 1, Table 5, and / or Table 6).
本発明の別の実施形態では、個人由来の試験サンプルが、B.ブルグドルフェリの1つまたは複数のタンパク質(たとえば組換えまたはキメラ抗原)に対する抗体の存在について判断される。「試験サンプル」は、個人由来の血液、血清、脳脊髄液、または他の適切な生体液のサンプルである。方法において、試験サンプルは、当技術分野において確立されたルーチン的な方法を使用して、1つまたは複数のタンパク質に対する抗体の存在について判断される。特定の一実施形態では、評価が、ボレリアタンパク質のマイクロアレイを使用して実行される。ある方法では、たとえばアレイ、たとえば、下記に記載されるマイクロアレイまたは本明細書において記載されるタンパク質もしくはタンパク質のセットが、個人由来の試験サンプルに暴露され、タンパク質に対する抗体のあらゆる、結果として生ずる結合(試験サンプル中に存在する場合)が決定される。1つまたは複数の抗原に結合する(本明細書において「〜と反応性の」とも言われる)抗体の存在は、抗体がB.ブルグドルフェリのタンパク質に特異的であることを示す。そのような抗体の存在は、試験サンプルを得た個人におけるライム病についての診断に役立つ。 In another embodiment of the invention, a test sample from an individual is A determination is made of the presence of antibodies against one or more proteins (eg, recombinant or chimeric antigens) of Burgdorferi. A “test sample” is a sample of blood, serum, cerebrospinal fluid, or other suitable biological fluid from an individual. In the method, a test sample is determined for the presence of antibodies to one or more proteins using routine methods established in the art. In one particular embodiment, the assessment is performed using a microarray of Borrelia proteins. In one method, for example, an array, eg, a microarray described below or a protein or set of proteins described herein, is exposed to a test sample from an individual, and any resulting binding of an antibody to the protein ( Is determined) if present in the test sample. The presence of an antibody (also referred to herein as “reactive with”) that binds to one or more antigens indicates that the antibody It is specific for the protein of burgdorferi. The presence of such antibodies is useful for diagnosis of Lyme disease in the individual from whom the test sample was obtained.
本明細書において記載されるアッセイ方法は、B.ブルグドルフェリ抗原のアレイを包含する。一実施形態では、アレイが、表1、4、5、6、または8に記載されるタンパク質セットなどのような、B.ブルグドルフェリの組換えタンパク質のサブセットを含む。他の実施形態では、他のアレイが、表1、5、または6に記載される抗原性タンパク質の2つもしくはそれ以上、4つもしくはそれ以上、6つもしくはそれ以上、8つもしくはそれ以上または他のグループのセットなどのような、B.ブルグドルフェリのタンパク質の様々なサブセットを含む。特定の一実施形態では、マイクロアレイが、表6に記載されるタンパク質のすべてから本質的になるまたは表6に記載されるタンパク質のすべてからなる。別の特定の実施形態では、マイクロアレイが、表8に記載されるタンパク質のすべてから本質的になるまたは表8のタンパク質のすべてからなる。さらなる実施形態では、他のマイクロアレイが、表1または表5に記載されるタンパク質のサブセットなどのような、B.ブルグドルフェリのタンパク質の様々なサブセットを含む(2つもしくはそれ以上、4つもしくはそれ以上、6つもしくはそれ以上、8つもしくはそれ以上または表6もしくは表8に記載されるタンパク質の他のグループのセット)。 The assay methods described herein are described in B.A. Includes an array of burgdorferi antigens. In one embodiment, the array is a B.I., such as a protein set as described in Tables 1, 4, 5, 6, or 8. Contains a subset of recombinant proteins from Burgdorferi. In other embodiments, the other array is two or more, four or more, six or more, six or more, or eight or more of the antigenic proteins listed in Tables 1, 5, or 6. B. Like other group sets, etc. Includes various subsets of Burgdorferi proteins. In one particular embodiment, the microarray consists essentially of all of the proteins listed in Table 6 or consists of all of the proteins listed in Table 6. In another specific embodiment, the microarray consists essentially of all of the proteins listed in Table 8 or consists of all of the proteins in Table 8. In further embodiments, other microarrays may be used for B. cerevisiae, such as a subset of the proteins described in Table 1 or Table 5. Including various subsets of Burgdorferi proteins (2 or more, 4 or more, 6 or more, 8 or more, or other groups of proteins listed in Table 6 or Table 8 Set).
本発明の他の実施形態は、ライム病のための診断試験の開発のための有力候補としてのB.ブルグドルフェリの他のまたはさらなるタンパク質の判定/評価のためのおよびさらにライム病から保護するためのワクチンの開発のための有力候補としてのB.ブルグドルフェリのタンパク質の評価のための方法を包含する。これらの方法において、表6または表8において本明細書において記載されるものなどのようなB.ブルグドルフェリの1つまたは複数のタンパク質は(たとえば上記に記載されるマイクロアレイにおいて)、ライム病を有することが知られている1つまたは複数の個人由来の血清に暴露され、次いで、血清由来の抗体が結合するタンパク質が、決定される。たとえば、蛍光のCy5強度/Cy3強度比が、実施例において記載されるように、使用することができる。ネガティブコントロールに対するライム血清の反応性の平均の比プラス標準偏差の3倍を超える任意のタンパク質の比は、ライム血清中に存在する抗体およびB.ブルグドルフェリタンパク質の間の有意な相互作用を示す。そのようなタンパク質は、下記に記載されるように、対象において免疫応答を誘発するためのワクチン組成物に有用であると考えるのは合理的である。そのようなタンパク質はまた、ライム病のための診断試験において(たとえば上記に記載される方法において)および本明細書において記載されるマイクロアレイにおいて使用することができるタンパク質であり、そのうえ、可能性として考えられるワクチン候補として使用することができる。 Another embodiment of the present invention is the use of B. cerevisiae as a potential candidate for the development of a diagnostic test for Lyme disease. B. as a potential candidate for the determination / evaluation of other or additional proteins of Burgdorferi and for the development of vaccines to further protect against Lyme disease. Includes methods for the assessment of Burgdorferi proteins. In these methods, B.D., such as those described herein in Table 6 or Table 8. One or more proteins of burgdorferi (eg, in the microarray described above) are exposed to serum from one or more individuals known to have Lyme disease and then derived from the serum The protein to which the antibody binds is determined. For example, a fluorescence Cy5 intensity / Cy3 intensity ratio can be used as described in the examples. The ratio of the average reactivity of lye serum to the negative control plus the ratio of any protein that exceeds 3 times the standard deviation is the antibody present in A significant interaction between the burgdorferi proteins is shown. It is reasonable to consider such proteins useful in vaccine compositions for eliciting an immune response in a subject, as described below. Such proteins are also proteins that can be used in diagnostic tests for Lyme disease (eg, in the methods described above) and in the microarrays described herein, as well as possible. Can be used as a vaccine candidate.
ライム病を有する個人の血清と反応するとして本明細書において同定されたタンパク質は、ボレリア感染症に対するワクチン免疫原として有用である。したがって、本発明はまた、動物またはヒトにおいてワクチン接種するおよび/またはボレリア感染症を治療するために使用することができる医薬組成物にも関する。特定の実施形態では、医薬組成物が、表5、6、もしくは8に示されるものなどのような、1つもしくは複数のボレリア・ブルグドルフェリ抗原または表1に示されるものなどのような別のボレリア・ブルグドルフェリ抗原または細胞外被タンパク質に由来するタンパク質または他のタンパク質(たとえば、全教示が本明細書において参照によって組み込まれる米国特許第6,248,562号明細書;米国特許第7,008,625号明細書;米国特許第7,060,281号明細書;および米国特許第7,179,448号明細書において記載されるものなどのような、挿入、欠失、もしくは他の改変などのような修飾を有するタンパク質またはキメラタンパク質の一部を形成するタンパク質)を含む。本明細書において記載されるタンパク質(たとえば表1、5、6、および8のタンパク質)の組み合わせもまた、使用することができる。 The proteins identified herein as reactive with the serum of individuals with Lyme disease are useful as vaccine immunogens against Borrelia infections. Accordingly, the present invention also relates to pharmaceutical compositions that can be used to vaccinate and / or treat Borrelia infections in animals or humans. In certain embodiments, the pharmaceutical composition is one or more Borrelia burgdorferi antigens such as those shown in Tables 5, 6 or 8, or another such as those shown in Table 1. Or other proteins derived from the Borrelia burgdorferi antigen or cell coat protein (eg, US Pat. No. 6,248,562, the entire teachings of which are incorporated herein by reference) , 008,625; U.S. Pat. No. 7,060,281; and U.S. Pat. No. 7,179,448, etc. Proteins that have modifications such as alterations or proteins that form part of a chimeric protein). Combinations of the proteins described herein (eg, the proteins of Tables 1, 5, 6, and 8) can also be used.
医薬組成物はまた、生理学的に許容され得るキャリヤ、賦形剤、および/または補助剤と一緒に投与することができる。適した補助剤は、当技術分野においてよく知られており(たとえば、全教示が本明細書において参照によって組み込まれる国際公開第96/40290号パンフレットを参照)、たとえば、治療される動物におけるタンパク質の免疫原性、効力、または半減期を増強するために使用することができる。 The pharmaceutical composition can also be administered with physiologically acceptable carriers, excipients, and / or adjuvants. Suitable adjuvants are well known in the art (see, eg, WO 96/40290, the entire teachings of which are incorporated herein by reference), eg, of proteins in animals to be treated It can be used to enhance immunogenicity, efficacy, or half-life.
ワクチン接種するおよび/またはボレリア感染症を治療するために使用される医薬組成物は、当技術分野においてよく知られているワクチンを調製するための方法を使用して調製することができる。たとえば、本明細書において記載されるタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、調製用の電気泳動法、選択的沈殿、またはその組み合わせによってなどのように、既知の技術によって単離するおよび/または精製することができる。調製されたタンパク質は、タンパク質が適した濃度となるように、本明細書において記載される適切な他の試薬と混合することができる。タンパク質の投薬量は、変動するであろう、また、治療されることとなる動物、たとえば哺乳動物、ヒトの年齢、体重、および/または身体的な状態に依存する。最適な投薬量は、適した動物モデルを使用し、ルーチン的な最適化技術によって決定することができる。 Pharmaceutical compositions used to vaccinate and / or treat Borrelia infections can be prepared using methods for preparing vaccines well known in the art. For example, the proteins described herein can be obtained by known techniques, such as by size exclusion chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative electrophoresis, selective precipitation, or combinations thereof. It can be isolated and / or purified. The prepared protein can be mixed with other suitable reagents described herein such that the protein is at a suitable concentration. The dosage of protein will vary and will depend on the age, weight, and / or physical condition of the animal, eg, mammal, human, to be treated. Optimal dosages can be determined by routine optimization techniques using suitable animal models.
ワクチンとして使用される医薬組成物の投与は、任意の適した技術によるものとすることができる。医薬組成物の投与に適した技術は、注射、たとえば皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射;粘膜投与、たとえば、本発明のタンパク質を含有する点鼻剤への鼻粘膜の暴露;経口投与;およびDNA免疫を含むが、これらに限定されない。 Administration of a pharmaceutical composition used as a vaccine can be by any suitable technique. Suitable techniques for administration of the pharmaceutical composition include injection, eg subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection, intraperitoneal injection; mucosal administration, eg exposure of nasal mucosa to nasal drops containing the protein of the invention Oral administration; and DNA immunization, including but not limited to:
そのうえ、ライム病を有する個人の血清と反応するとして本明細書において同定されたタンパク質(たとえば、表1および/または表4および/または表5、特に表6および8に示されるタンパク質)ならびに本明細書において記載される方法は、当業者がそれらの特異的なタンパク質を標的にすることによって疾患のための治療を調整するのを可能にする予診マーカーとして使用することができる。たとえば、万一、個人の血清がタンパク質の特定のサブセットと反応性を示せば、それらのタンパク質との個人の血清の反応性を低下させるおよび/または排除することによって示されるように、個人におけるそれらのタンパク質の存在を低下させるおよび/または排除するために療法を開始することができる。 Moreover, the proteins identified herein as reacting with the sera of individuals with Lyme disease (eg, the proteins shown in Tables 1 and / or Tables 4 and / or Tables 5, especially Tables 6 and 8) and the present specification The methods described in the book can be used as prognostic markers that allow one of ordinary skill in the art to tailor treatment for a disease by targeting their specific proteins. For example, if an individual's serum is reactive with a particular subset of proteins, those in an individual can be demonstrated, as indicated by reducing and / or eliminating the reactivity of the individual's serum with those proteins. Therapy can be initiated to reduce and / or eliminate the presence of other proteins.
本発明はまた、本明細書において記載されるタンパク質を含む診断および/または予診キットにも関する(たとえば、上記に記載されるマイクロアレイにおいて)。キットはまた、タンパク質およびサンプル、たとえば使用者により提供された宿主サンプル中に存在する抗体の間で形成される抗体−抗原複合体を検出するための試薬をも含む。 The present invention also relates to diagnostic and / or prognostic kits comprising the proteins described herein (eg, in the microarray described above). The kit also includes a reagent for detecting antibody-antigen complexes formed between the protein and the antibody, eg, an antibody present in a host sample provided by the user.
本発明の特定の実施形態は、以下の実施例において記載され、これらは、限定するものとして決して解釈されないものとする。 Particular embodiments of the present invention are described in the following examples, which are not to be construed as limiting in any way.
実施例1:48のボレリア抗原の発見
タンパク質アレイ。合計416の遺伝子がB.ブルグドルフェリゲノムの比較で同定された。これらのうち、350(84%)が、PCRを実行した場合にサイズが正確であった産物を産生し、350すべてがT7発現ベクターpET28bへのクローニングに成功した。配列を確認したプラスミドは、その一晩自動発現系を使用して発現させ、発現したタンパク質は、IDA樹脂を使用して精製し、ニトロセルロースコーティングFASTスライド上にプリントした(たとえば、教示が本明細書において組み込まれる米国特許出願公開第12/784,584号明細書および米国特許出願公開第12/989,003号明細書を参照)。そのうえ、代表的ないくつかの異なるOspC型をヒト分離株から増幅した。この研究に含まれたOspC型は、A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、およびU型であった。この研究はまた、初期のタンパク質アレイ研究において同定された非常に抗原性のB31細胞外被タンパク質をも含んだ(Xu Yet al,2008)。全体で、アレイは、発現ボレリアタンパク質、陰性コントロール、およびブランクを含めて、およそ400のサンプルを含有した。アレイをライム病患者由来の血清によりプローブし、抗体は、抗体アイソタイプを決定するためにCy5コンジュゲートヤギ抗ヒトIgGまたはCy5コンジュゲートヤギ抗ヒトIgMにより視覚化した(Xu Y et al,2008)。
Example 1: Discovery of 48 Borrelia antigens Protein array. A total of 416 genes are Identified by comparison of the Burgdorferi genome. Of these, 350 (84%) produced products that were accurate in size when PCR was performed, and all 350 were successfully cloned into the T7 expression vector pET28b. The sequence verified plasmid was expressed using its overnight automated expression system, and the expressed protein was purified using IDA resin and printed on nitrocellulose coated FAST slides (eg, the teachings herein are U.S. Patent Application Publication No. 12 / 784,584 and U.S. Patent Application Publication No. 12 / 989,003, which are incorporated herein by reference). Moreover, several representative different OspC types were amplified from human isolates. The OspC types included in this study were A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, and U types. This study also included the highly antigenic B31 cell coat protein identified in early protein array studies (Xu Yet al, 2008). In total, the array contained approximately 400 samples, including expressed Borrelia protein, negative controls, and blanks. Arrays were probed with sera from patients with Lyme disease and antibodies were visualized with Cy5-conjugated goat anti-human IgG or Cy5-conjugated goat anti-human IgM to determine antibody isotype (Xu Y et al, 2008).
血清サンプル。初期アレイ研究のために、ライム病を有する患者の血清を疾病対策センター(CDC)から得た。CDCサンプルは、初期症状(サンプルC=0日)の際にならびに症状が出た10日(サンプルD)、20日(サンプルE)、30日(サンプルF)、60日(サンプルG)、および90日(サンプルH)後に収集された31人の患者由来の血清を含んだ。Stony Brook UniversityのLyme Disease Centerから得られた末期臨床症状(ライム関節炎または神経ボレリア症)を示した患者由来の14の末期ライムサンプル(末期)もまた分析した。21のサンプルC、29のサンプルD、15のサンプルE、8のサンプルF、1のサンプルG、および12のサンプルHを含んだ合計115のサンプルを分析した。正常コントロール血清(n=14)は、健康なドナーから得た。 Serum sample. Sera from patients with Lyme disease were obtained from the Centers for Disease Control (CDC) for early array studies. The CDC samples are for initial symptoms (sample C = 0 day) and on day 10 (sample D), 20 days (sample E), 30 days (sample F), 60 days (sample G), and Serum from 31 patients collected after 90 days (Sample H) was included. Fourteen end-stage lime samples (end-stage) from patients with end-stage clinical symptoms (Lyme arthritis or neuroborreliosis) obtained from the Lyme Disease Center at Stoney Brook University were also analyzed. A total of 115 samples were analyzed, including 21 samples C, 29 samples D, 15 samples E, 8 samples F, 1 samples G, and 12 samples H. Normal control serum (n = 14) was obtained from a healthy donor.
タンパク質アレイをさらに判断するために、血清をMark Soloski博士、Johns Hopkins School of Medicine、Baltimore MDから得た。サンプルは、初期症状(サンプルV1=初期ライムと診断、治療前)の際にならびに症状が出た3週間(サンプルV2=診断の3週間後/および治療の始め)、7週間(サンプルV3=診断/治療の7週間後)、ならびに15〜17週間(サンプルV4=診断/治療の約15〜17週間後)後に収集された50人の患者由来の血清を含んだ。グループ当たり合計46のサンプルを分析した。特異度研究のために、ライム病試験において交差反応性を生ずることが知られている血清学的な応答に関連する疾患を有する患者から血清を得た。これらは、梅毒、狼瘡、および関節リウマチを有する患者を含んだ。正常コントロール血清は、健康なドナーから得た。 Serum was obtained from Dr. Mark Soloski, Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore MD to further determine the protein array. Samples were taken during initial symptoms (sample V1 = diagnosed early lime, before treatment) and 3 weeks when symptoms occurred (sample V2 = 3 weeks after diagnosis / and beginning of treatment), 7 weeks (sample V3 = diagnosis) Sera from 50 patients collected after / 7 weeks after treatment), as well as after 15-17 weeks (sample V4 = about 15-17 weeks after diagnosis / treatment). A total of 46 samples per group were analyzed. For specificity studies, sera were obtained from patients with diseases associated with serological responses known to produce cross-reactivity in Lyme disease testing. These included patients with syphilis, lupus, and rheumatoid arthritis. Normal control serum was obtained from a healthy donor.
結果。アレイタンパク質のおよそ140が、喜ばしいことに、両方の二次抗体を使用し、自然感染を有するヒトにおいて抗体応答を誘発した。これらの140の抗原のうち、80のタンパク質が、各時点由来の血清サンプルの少なくとも半分によって認識された。重要なことには、大部分の血清は、IgMおよびIgG二次抗体を使用し、48の非常に抗原性のボレリアタンパク質のサブセット由来の少なくとも1つの抗原を認識した(表1)。この高度な陽性は、患者に遊走性紅斑が最初に見られた時に収集された血清をすべて含んだ。これらの48のタンパク質のCy5/Cy3比は、アレイにおいて最高水準で観察され、平均して、ネガティブコントロールに対するライム血清の反応性の平均の比を標準偏差の5倍超えた。そのうえ、記録されたボレリア配列をすべて除くNCBI非重複タンパク質データベースに対する、非常に免疫原性のボレリアタンパク質によるBLASTx検索は、他の生物体に対する有意なマッチを示さなかった。興味深いことには、48の抗原のうちの40は、プラスミドにコードされており、大部分のコードタンパク質は、細胞表層タンパク質、リポタンパク質、または推定外膜タンパク質である。プラスミド遺伝子配列の90%超は、非B.ブルグドルフェリ遺伝子に対して有意な相同体を有していない。プラスミド配列の特有性は、それらが自然界および種々様々の宿主においてボレリアの生存および増殖のための特殊な、適応を助ける役割を果たすことを示唆する。さらに、プラスミド配列の変異性に関連する、プラスミドによってコードされる多数の細胞表層リポタンパク質は、これらの配列が寄生動物−宿主相互作用に直接関与し、そのため、ほぼ間違いなく鍵となる免疫原となるという見解を支持する。(Casjens et al,2000)。 result. Approximately 140 of the array proteins were happy to elicit an antibody response in humans with natural infection using both secondary antibodies. Of these 140 antigens, 80 proteins were recognized by at least half of the serum samples from each time point. Importantly, most sera recognized at least one antigen from a subset of 48 highly antigenic Borrelia proteins using IgM and IgG secondary antibodies (Table 1). This high degree of positivity included all sera collected when migrating erythema was first seen in the patient. The Cy5 / Cy3 ratio of these 48 proteins was observed at the highest level in the array, and on average exceeded the average ratio of lyse serum reactivity to negative controls by 5 times the standard deviation. Moreover, BLASTx searches with highly immunogenic Borrelia proteins against the NCBI non-redundant protein database, excluding all recorded Borrelia sequences, showed no significant matches to other organisms. Interestingly, 40 of the 48 antigens are encoded in plasmids and most of the encoded proteins are cell surface proteins, lipoproteins, or putative outer membrane proteins. Over 90% of the plasmid gene sequence is non-B. It has no significant homologue to the Burgdorferi gene. The peculiarities of the plasmid sequences suggest that they play a special, adaptive aid for the survival and growth of Borrelia in nature and in a wide variety of hosts. In addition, many cell surface lipoproteins encoded by plasmids that are related to the variability of plasmid sequences are those sequences that are directly involved in parasite-host interactions, and thus are almost certainly the key immunogen and Support the view that (Casjens et al, 2000).
本明細書において記載されるアッセイの感度は、疾病の初期の患者において、市販で入手可能なライム病アッセイにはるかにまさっている。本発明のアッセイの感度を、29人の初期ライム病患者を使用して、48のボレリア抗原で2段階制試験(two−tier testing)において比較した。EMを有する29人の患者の中で、IgMまたはIgG二次抗体を用いる発明者らのタンパク質アレイの感度は、初期症状時に96%(サンプルV1)および3週間後の回復期の間で97%(サンプルV2)であった。比較すると、パーセンテージは、標準の2段階制試験について、それぞれ48%および69%であった。血清検体のこのセットについての本明細書において記載されるライムアッセイの全体的な感度および特異度を、表2および表3において下記に示す。 The sensitivity of the assay described herein is far superior to the commercially available Lyme disease assay in early patients with disease. The sensitivity of the assay of the present invention was compared in a two-tier testing with 48 Borrelia antigens using 29 patients with early Lyme disease. Among 29 patients with EM, the sensitivity of our protein array using IgM or IgG secondary antibodies is 96% during initial symptoms (sample V1) and 97% during the recovery phase after 3 weeks (Sample V2). In comparison, the percentages were 48% and 69%, respectively, for the standard two-stage test. The overall sensitivity and specificity of the lime assay described herein for this set of serum samples is shown below in Tables 2 and 3.
実施例2:組換えキメラボレリアタンパク質を使用するタンパク質アレイ。
概要。48の非常に抗原性のボレリアタンパク質を使用するキメラタンパク質のライブラリーは、ライム病についての組換えキメラベースの診断アッセイを開発する際に使用するためにデザインした。いくつかの遺伝種由来の遺伝子を含有する組換えキメラ構築物は、複数の株に抗原性を付与するあるタンパク質を生成することを可能にし、この技術の素晴らしい可能性および適応性を示す。そのうえ、抗原としての純粋なタンパク質調製物の使用は、様々なアッセイ方式に試験を適応させる際に、より素晴らしい柔軟性を与える。組換えキメラタンパク質のアッセイが、最良の全細胞アッセイと比較した場合に、初期の疾患についてB.ブルグドルフェリに対する抗体を検出する際に優れた感度および末期の疾病について同等の感度を示すであろうと考えることは合理的である。
Example 2: Protein array using recombinant chimeric Borrelia protein.
Overview. A library of chimeric proteins using 48 highly antigenic Borrelia proteins was designed for use in developing a recombinant chimera-based diagnostic assay for Lyme disease. Recombinant chimeric constructs containing genes from several genetic species make it possible to produce certain proteins that confer antigenicity to multiple strains, indicating the great potential and adaptability of this technology. Moreover, the use of pure protein preparations as antigens provides greater flexibility in adapting the test to various assay formats. B. Recombinant chimeric protein assay for early disease when compared to the best whole cell assay. It is reasonable to think that it will show excellent sensitivity in detecting antibodies against Burgdorferi and equivalent sensitivity for end-stage disease.
キメラタンパク質。48の非常に抗原性のボレリアタンパク質の発明者らのライブラリーから、発明者らは、ボレリア抗原のうちの3つをそれぞれ含有する16セットのキメラタンパク質を構築した(表4)。それぞれのボレリアタンパク質を、ある融合構築物に無作為に割り当て、二次構造の特徴がタンパク質エピトープの提示に影響を与え得るかどうかを決定するために、6つの考え得るタンパク質の順序の組み合わせをすべて合成した。96の融合構築物を表5に示す。3つのボレリア抗原のキメラは、タンパク質サイズが有意に影響を与え得るタンパク質収率を最適化するために、約100kDaまたはそれ以下(それより下)の分子量の融合タンパク質を保つように選んだ。 Chimeric protein. From our library of 48 highly antigenic Borrelia proteins, we constructed 16 sets of chimeric proteins each containing 3 of the Borrelia antigens (Table 4). Randomly assign each Borrelia protein to a fusion construct and synthesize all six possible protein order combinations to determine whether secondary structure characteristics can affect the presentation of protein epitopes did. The 96 fusion constructs are shown in Table 5. Three Borrelia antigen chimeras were chosen to keep the fusion protein at a molecular weight of about 100 kDa or less (below) in order to optimize protein yields where protein size could be significantly affected.
組換え融合タンパク質のクローニング。48のB.ブルグドルフェリ抗原をコードするボレリア遺伝子は、発明者らがキメラタンパク質構築のために特別にデザインした特有の遺伝子特異的プライマー対を使用して増幅した。プライマーは、B.ブルグドルフェリ株のゲノム配列からデザインし、それぞれ、遺伝子コード配列とインフレームである3つの制限エンドヌクレアーゼについての認識配列をコードする新規なDNAカセットを含有する。5’プライマー(5’−AATTGGTACCCCAGGATCCCATATG+15MER ORF特異的配列)(配列番号1)は、Kpnl(下線)、BamHI(太字)、およびNdel(イタリック体)認識配列を含有する。3’プライマー(5’GCGGGATCCGGTACCGTCGAC+15mer ORF特異的配列)(配列番号2)は、BamHI、Kpnl、およびSall(破線のアンダーライン)認識配列を含有する。増幅のために、10ngのゲノムDNAを、2つのORF特異的プライマー対を含有する50μl PCR反応液において鋳型として使用した。発現された細胞外被タンパク質の可溶性特性を増加させるために、プライマーセットは、膜アンカーシグナル配列なしのコード領域を増幅するようにデザインした(Dunn et al.,1990)。PCR増幅は、発明者らが以前に記載した条件を使用し、Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity(Invitrogen)を用いてストリンジェントな条件下で実行した(Xu et al.,2003)。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動法によって視覚化した。定量化のために、産物は、精製し(PCR精製キット、Qiagen)、UV吸光度によって定量化した。3つの遺伝子フラグメントから構成される組換え融合タンパク質のライブラリーを作るために、増幅産物は、NdeI/BamHI(1’1位置の断片について)またはBamHI/KpnI(第2の位置の断片について)またはKpnI/Sall(第3の位置の断片について)により切断した。第1の位置の断片は、T7ベースの発現ベクターpET−28(Novagen)の特有のNdeIおよびBamHI部位の中に方向性をもたせてクローニングした。このベクターは、ニッケル−Sepharoseカラム上での精製を助けるために、発現タンパク質に融合されるN−末端ポリ(His)アフィニティータグを提供する。ラーゲ−ション反応物は、大腸菌GC5コンピテント細胞の中に形質転換し、プラスミドは、Eppendorf Perfectprep Plasmid 96 VAC Direct Bind Kitを使用して精製し、挿入物全体にわたってシークエンシングすることによって検証した。ここで断片1を含有するプラスミドは、すべての続くクローニングのためのベクターとして果たした。断片2および3の方向性をもつクローニングのために、ベクターをBamHI/XhoIlにより消化し、断片2および3の制限消化アンプリコンを、消化されたベクターの中に同時にライゲーションした。形質転換後、プラスミドを精製し、シークエンシングした。 Cloning of recombinant fusion proteins. 48B. The Borrelia gene encoding the Burgdorferi antigen was amplified using a unique gene-specific primer pair specially designed by the inventors for the construction of chimeric proteins. The primer is B.I. Designed from the genomic sequence of a Burgdorferi strain, each contains a novel DNA cassette that encodes recognition sequences for three restriction endonucleases that are in frame with the gene coding sequence. The 5 'primer (5'-AATTGGTACCCAGGATCCCCATATG + 15MER ORF specific sequence) (SEQ ID NO: 1) contains Kpnl (underlined), BamHI (bold), and Ndel (italic) recognition sequences. The 3'primer (5'GCGGGATCCGGTACCGTCGAC + 15mer ORF specific sequence) (SEQ ID NO: 2) contains BamHI, Kpnl, and Sall (dashed underline) recognition sequences. For amplification, 10 ng genomic DNA was used as a template in a 50 μl PCR reaction containing two ORF specific primer pairs. In order to increase the solubility properties of the expressed cell coat protein, the primer set was designed to amplify the coding region without the membrane anchor signal sequence (Dunn et al., 1990). PCR amplification was performed under stringent conditions using Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen) using conditions previously described by the inventors (Xu et al., 2003). PCR products were visualized by agarose gel electrophoresis. For quantification, the product was purified (PCR purification kit, Qiagen) and quantified by UV absorbance. To create a library of recombinant fusion proteins composed of three gene fragments, the amplification products are NdeI / BamHI (for the fragment at the 1′1 position) or BamHI / KpnI (for the fragment at the second position) or Cleaved with KpnI / Sall (for the fragment at the third position). The fragment at the first position was cloned with orientation into the unique NdeI and BamHI sites of the T7-based expression vector pET-28 (Novagen). This vector provides an N-terminal poly (His) affinity tag fused to the expressed protein to aid in purification on a nickel-Sepharose column. The lagging reaction was transformed into E. coli GC5 competent cells and the plasmid was verified using an Eppendorf Perfectprep Plasmid 96 VAC Direct Bind Kit and sequenced across the insert. Here the plasmid containing fragment 1 served as the vector for all subsequent cloning. For cloning with the orientation of fragments 2 and 3, the vector was digested with BamHI / XhoIl and the restriction digest amplicons of fragments 2 and 3 were simultaneously ligated into the digested vector. After transformation, the plasmid was purified and sequenced.
タンパク質の発現および精製。精製されたプラスミドは、発現のために大腸菌BL21/DE3コンピテント細胞の中に形質転換した。N−末端ポリ(His)アフィニティータグを含有するキメラボレリアタンパク質は、Overnight Express Autoinductionプロトコールを使用して発現させる。誘導された細胞を遠心分離法によって回収し、8M尿素中に再懸濁する。一定分量をSDS−PAGE上に流した。N−末端ポリHisタグタンパク質は、Ni−NTA Spin Kit(Qiagen)を使用し、変性条件下でニッケル−Sepharoseカラム上で精製した。キットは、Hisタグ融合タンパク質の迅速なスクリーニングおよび精製のためにデザインする。タンパク濃度は、クーマシーブリリアントブルーG−250がタンパク質と反応した場合の吸光度シフトの測定によって決定した(Bio−Rad)。タンパク質純度は、SDS−PAGEによってチェックした。 Protein expression and purification. The purified plasmid was transformed into E. coli BL21 / DE3 competent cells for expression. Chimeric Borrelia proteins containing an N-terminal poly (His) affinity tag are expressed using the Overnight Express Autoinduction protocol. Induced cells are harvested by centrifugation and resuspended in 8M urea. An aliquot was run on SDS-PAGE. N-terminal poly-His tag protein was purified on a nickel-Sepharose column under denaturing conditions using Ni-NTA Spin Kit (Qiagen). The kit is designed for rapid screening and purification of His tag fusion proteins. The protein concentration was determined by measuring the absorbance shift when Coomassie Brilliant Blue G-250 reacted with the protein (Bio-Rad). Protein purity was checked by SDS-PAGE.
血清サンプル。キメラタンパク質の抗原性は、上記に記載されるCDC血清サンプルC(12のサンプル)およびE(11のサンプル)ならびにボルティモア血清サンプルV1(28のサンプル)およびV2(23のサンプル)を使用して試験した。そのうえ、さらに32の血清サンプルをCDC(CDC−R1)から得た。これらは、12のライム患者由来の血清を含んだ。ライム病試験における交差反応性に関連する疾患を有する12人の患者および8人の正常コントロール。さらに、ライム病試験において交差反応性を生ずることが知られている血清学的な応答に関連する疾患を有する患者から35の血清をBioreclamation LLC、Westbury、NYから得た。これらは、梅毒、狼瘡、および関節リウマチを有する患者を含んだ。7つの正常コントロール血清もまた、健康なドナーから得た。 Serum sample. The antigenicity of the chimeric protein was tested using CDC serum samples C (12 samples) and E (11 samples) and Baltimore serum samples V1 (28 samples) and V2 (23 samples) described above. did. In addition, an additional 32 serum samples were obtained from CDC (CDC-R1). These included sera from 12 lime patients. 12 patients with disease associated with cross-reactivity in Lyme disease test and 8 normal controls. In addition, 35 sera were obtained from Bioreclamation LLC, Westbury, NY from patients with diseases related to serological responses known to produce cross-reactivity in Lyme disease testing. These included patients with syphilis, lupus, and rheumatoid arthritis. Seven normal control sera were also obtained from healthy donors.
マイクロアレイ。タンパク質マイクロアレイのために、組換えタンパク質および個々の48のボレリア抗原のそれぞれを、ニトロセルロースコーティングFASTスライドガラス上にプリントした。そのうえ、初期研究由来の組換えタンパク質OspB−OspC−フラジェリン(B−C−Fia)、OspA−p39−p93(A−39−93)、およびOspC B型およびH型から構成されるOspC二量体(OC2/9)もまたプリントした(Gomes Solecki et.al.,2000)。アレイ中のそれぞれのスライドはまた、バックグラウンド決定のために10の固定BSAスポットをも含有した。プロテオームチップは、Fast Pakタンパク質アレイキットを使用し、未治療初期ライム病を有する患者および非ライムの病気の患者由来の血清によりプローブした。手短かに言えば、スライドは、2時間、一次抗体(ヒト血清および定量化のためのマウス抗Hisタグ)中でのインキュベーションの前に、タンパク質アレイ遮断バッファー中で4℃で一晩、最初に遮断した。抗体は、Cy5コンジュゲートヤギ抗ヒトIgGまたはCy5コンジュゲートヤギ抗ヒトIgM(結合したヒト抗体を検出するため)およびCy3コンジュゲートヤギ抗マウスIgG(それぞれのスポットにおける組換えタンパク質の量を定量化するため)により視覚化した。2時間のインキュベーションの後、スライドは、厳重に洗浄し、次に、Axon GenePix 4200Aマイクロアレイスキャナによりスキャンした。未加工のデータを捕らえ、Gene Pix Pro画像解析ソフトウェアにより分析した。サンプルの間でばらつきを最小限にするために、PMT gainは、すべてのアレイにおいて等しく1.0に調節し、パワー設定は50%にした。グローバル背景差分法(global background subtraction method)は、それぞれのスライド由来のBSAの平均強度値を使用して、それぞれのスポットからバックグラウンドを差し引くために使用した(Xu et al.,2008)。 Microarray. For protein microarrays, each of the recombinant proteins and individual 48 Borrelia antigens were printed on nitrocellulose coated FAST glass slides. In addition, the recombinant proteins OspB-OspC-flagellin (BC-Fia), OspA-p39-p93 (A-39-93), and OspC dimers composed of OspC B and H forms derived from early studies (OC2 / 9) was also printed (Gomes Solecki et al., 2000). Each slide in the array also contained 10 fixed BSA spots for background determination. The proteome chip was probed with serum from patients with untreated early Lyme disease and non-Lyme disease patients using the Fast Pak protein array kit. Briefly, slides are first incubated overnight at 4 ° C. in protein array blocking buffer for 2 hours prior to incubation in primary antibody (human serum and mouse anti-His tag for quantification). Shut off. The antibody quantifies the amount of recombinant protein in each spot, Cy5-conjugated goat anti-human IgG or Cy5-conjugated goat anti-human IgM (to detect bound human antibody) and Cy3-conjugated goat anti-mouse IgG. For visualization). After 2 hours of incubation, the slides were washed extensively and then scanned with an Axon GenePix 4200A microarray scanner. The raw data was captured and analyzed with Gene Pix Pro image analysis software. To minimize variability between samples, the PMT gain was adjusted to 1.0 equally in all arrays and the power setting was 50%. A global background subtraction method was used to subtract the background from each spot using the average intensity value of BSA from each slide (Xu et al., 2008).
データ分析。ヒト血清を有するアレイから生成されたデータの分析のために、スポットの中央蛍光強度が1000を超え、かつスポットのSNR(シグナルノイズ比)が4を超える場合、スポットは、陽性と見なされ、さらなる比の分析に含めた。次いで、それぞれのタンパク質についてのCy5強度/Cy3強度(タンパク質/Hisタグ)の比を計算した。実験はすべて2回行い、それぞれのタンパク質のCy5/Cy3比を平均する。タンパク質に対する17人の非ライムの病気の患者の反応性の平均の比プラス標準偏差の3倍よりも大きな、いかなるキメラタンパク質のC5/C3比も、ライム血清中の抗体および固定タンパク質の間の有意な相互作用を示した。 Data analysis. For analysis of data generated from arrays with human sera, a spot is considered positive if the spot's median fluorescence intensity is greater than 1000 and the spot's SNR (signal to noise ratio) is greater than 4, and further Included in the ratio analysis. The ratio of Cy5 intensity / Cy3 intensity (protein / His tag) for each protein was then calculated. All experiments are performed in duplicate and the Cy5 / Cy3 ratio of each protein is averaged. The average ratio of the reactivity of 17 non-Lyme disease patients to protein plus a C5 / C3 ratio of any chimeric protein that is greater than 3 times the standard deviation is significant between antibody and immobilized protein in lime serum Interaction was shown.
結果。初期ライム病を有する患者由来のサンプルから構成される血清パネルは、抗B.ブルグドルフェリ抗体を検出するためのそれらの感度を決定するために、キメラタンパク質のアレイをスクリーニングするために使用した。アレイタンパク質に対する個々の血清サンプルの反応性においてかなりの不均一性が観察されたが、それぞれの組換えタンパク質の6つの組み合わせに対する個々のサンプルの反応性において著しい一貫性があった。実際、288のアレイタンパク質の中で、それらの大部分が、喜ばしいことに、両方の二次抗体を使用し、自然感染を有するヒトにおいて抗体応答を誘発した。さらに、キメラ構築物は、個々のタンパク質と比較した場合、それらの免疫反応性において有意に異ならなかった。サンプル特異的な応答があったが、血清の大部分によって共通して認識されるタンパク質のサブセットがあった。重要なことには、大部分の血清は、IgMおよびIgG二次抗体を使用し、25の非常に抗原性のボレリア組換えタンパク質およびキメラタンパク質のサブセット由来の少なくとも1つの抗原を認識した(表6 図の配列番号3〜27)。そのような抗原は、診断試験の開発のための最良の候補に相当し、これらの25の抗原のアレイをすべての続く感度および特異度評価において使用した。そのうえ、変異体を、キメラ抗原OC2/9(配列番号27)から作製し、図の配列番号28〜30として示す。本明細書において記載されるこれらの変異体および他のキメラ抗原の変異体は、作製し、本明細書において記載される手順を使用して効能について試験することができる。 result. A serum panel consisting of samples from patients with early Lyme disease is anti-B. To determine their sensitivity for detecting burgdorferi antibodies, they were used to screen an array of chimeric proteins. Although considerable heterogeneity was observed in the reactivity of individual serum samples to the array protein, there was significant consistency in the reactivity of individual samples for each of the six combinations of recombinant proteins. Indeed, among the 288 array proteins, most of them happily used both secondary antibodies to elicit an antibody response in humans with natural infection. Furthermore, the chimeric constructs were not significantly different in their immunoreactivity when compared to individual proteins. Although there was a sample-specific response, there was a subset of proteins that were commonly recognized by most of the sera. Importantly, most sera recognized at least one antigen from a subset of 25 highly antigenic Borrelia recombinant proteins and chimeric proteins using IgM and IgG secondary antibodies (Table 6). SEQ ID NO: 3-27). Such antigens represent the best candidates for the development of diagnostic tests, and an array of these 25 antigens was used in all subsequent sensitivity and specificity assessments. In addition, a mutant was made from the chimeric antigen OC2 / 9 (SEQ ID NO: 27) and is shown as SEQ ID NO: 28-30 in the figure. These variants and other chimeric antigen variants described herein can be made and tested for efficacy using the procedures described herein.
血清検体のこのセットについてのライムアッセイの全体的な感度および特異度を、表7において下記に示す。表から容易にわかるように、25の組換えボレリアタンパク質を含有するタンパク質アレイは、上記に記載されるライム病血清パネルを使用すると、2段階制試験よりも優れていた。たとえば、本明細書において記載されるタンパク質アレイの感度を、29人の初期ライム病患者を使用して、2段階制試験で比較した。EMを有する29人の患者の中で、IgMまたはIgG二次抗体を用いる本発明のタンパク質アレイの感度は、初期症状時に100%(サンプルV1)および3週間後の回復期の間で87%(サンプルV2)であった。比較すると、パーセンテージは、標準の2段階制試験について、それぞれ48%および71%であった。 The overall sensitivity and specificity of the lime assay for this set of serum samples is shown below in Table 7. As can be easily seen from the table, the protein array containing 25 recombinant Borrelia proteins was superior to the two-step system using the Lyme disease serum panel described above. For example, the sensitivity of the protein arrays described herein was compared in a two-stage trial using 29 patients with early Lyme disease. Among 29 patients with EM, the sensitivity of the protein arrays of the invention using IgM or IgG secondary antibodies is 100% during the initial symptoms (sample V1) and 87% during the recovery phase after 3 weeks ( Sample V2). In comparison, the percentages were 48% and 71%, respectively, for the standard two-stage test.
実施例3:ライム病のための診断試験。
概要。ゲノムおよびプロテオミクスアプローチを使用して、タンパク質マイクロアレイは、ライム病を検出する際に広範囲の特異性を有するであろう、非常に高感度で特異的な1段階制アッセイの開発において有用となり得る抗原を同定するために、ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクトの複数の遺伝子型に基づいて製造した。上記に記載される25の組換えボレリアタンパク質を含有するアッセイは非常に正確で高感度であるが、研究は、高い感度および特異度を維持しながら、最小の数まで組換え抗原性タンパク質の数を低下させるようにデザインした。
Example 3: Diagnostic test for Lyme disease.
Overview. Using genomic and proteomic approaches, protein microarrays can identify antigens that may be useful in the development of highly sensitive and specific one-step assays that will have a wide range of specificities in detecting Lyme disease. To identify, it was produced based on multiple genotypes of Borrelia burgdorferi sense strict. Although the assay containing the 25 recombinant Borrelia proteins described above is very accurate and sensitive, studies have shown that the number of recombinant antigenic proteins is minimized to a minimum while maintaining high sensitivity and specificity. Designed to lower
血清サンプル。70人のライム病患者由来の血清は、25の組換えタンパク質のタンパク質アレイの感度のために使用した。これは、上記に記載されるCDC、ボルティモアサンプルV1およびV2の28人の初期ライム患者ならびにこれらもまたCDC由来の8人のライム関節炎、6人の神経性ライム、および2人の心ライム患者を含んだ。そのうえ、特異度研究のために、梅毒、線維筋痛、および関節リウマチを含む、ライム病試験において交差反応性を生ずることが知られている血清学的な応答に関連する疾患を有する83人の患者(非ライムの病気)から血清を得た。正常コントロール血清は、風土性の地域の16人の健康なドナーおよび非風土性の地域の36人の健康なドナーから得た。 Serum sample. Sera from 70 Lyme disease patients were used for the protein array sensitivity of 25 recombinant proteins. This includes 28 early lime patients from CDC, Baltimore samples V1 and V2 as described above and 8 lime arthritis, 6 neurogenic lime, and 2 cardiac lime patients, also from CDC. Inclusive. Moreover, for specificity studies, 83 people with diseases related to serological responses known to produce cross-reactivity in Lyme disease trials, including syphilis, fibromyalgia, and rheumatoid arthritis. Serum was obtained from the patient (non-Lyme disease). Normal control serum was obtained from 16 healthy donors in endemic areas and 36 healthy donors in non-endemic areas.
マイクロアレイ。タンパク質マイクロアレイについては、表6の25の組換えタンパク質を、ニトロセルロースコーティングFASTスライドガラス上にプリントした。プロテオームチップは、上記に記載されるように、血清によりプローブし、分析した。 Microarray. For protein microarrays, 25 recombinant proteins in Table 6 were printed on nitrocellulose coated FAST glass slides. Proteome chips were probed with serum and analyzed as described above.
結果。様々なステージのライム病を有する患者由来の70のサンプルから構成される血清パネルは、キメラタンパク質のアレイをスクリーニングするために使用し、抗B.ブルグドルフェリを検出するためのそれらの感度を決定した。サンプル特異的な応答があったが、血清の大部分によって共通して認識されるタンパク質のサブセットがあった。重要なことには、大部分の血清は、合計11の個々のタンパク質について、IgM二次抗体を使用して、9の非常に抗原性のボレリアキメラおよびIgG二次抗体を使用して、7のキメラを認識した(表8)。 result. A serum panel consisting of 70 samples from patients with various stages of Lyme disease was used to screen an array of chimeric proteins and anti-B. Their sensitivity for detecting burgdorferi was determined. Although there was a sample-specific response, there was a subset of proteins that were commonly recognized by most of the sera. Importantly, the majority of sera used 7 highly antigenic Borrelia chimeras and IgG secondary antibodies using IgM secondary antibodies for a total of 11 individual proteins. Chimeras were recognized (Table 8).
これらの11の組換えおよびキメラ抗原のCy5/Cy3比は、アレイにおいて最高水準で観察され、それぞれ、正常な血清および他の慢性感染症または自己免疫性疾患を有する患者由来の血清を使用して、>99%の特異度を有した。11の抗原を、アレイスライド上にプリントし、感度および特異度の分析のために使用した。 The Cy5 / Cy3 ratio of these 11 recombinant and chimeric antigens was observed at the highest levels in the array, using normal sera and sera from patients with other chronic infections or autoimmune diseases, respectively. ,> 99% specificity. Eleven antigens were printed on array slides and used for sensitivity and specificity analysis.
11のタンパク質の発明者らのアレイの全体的な感度を表9に示す。初期のライム患者については、IgMまたはIgG二次抗体を用いるタンパク質アレイの感度は、CDC由来の血清については71%、ボルティモアサンプルについては、初期症状時88%(サンプルV1)および3週間後の回復期の間で88%(サンプルV2)であった。比較すると、感度は、これらの同じ初期ライム患者について標準の2段階制試験では44%であった。アレイの感度は、ライム関節炎、神経性ライム、および心ライム血清について100%であった(表9)。 The overall sensitivity of our array of 11 proteins is shown in Table 9. For early Lyme patients, the sensitivity of the protein array using IgM or IgG secondary antibodies is 71% for CDC-derived sera, 88% at the initial symptoms for Baltimore samples (sample V1), and recovery after 3 weeks 88% between samples (sample V2). By comparison, the sensitivity was 44% in the standard two-stage trial for these same early lime patients. The sensitivity of the array was 100% for Lyme arthritis, neurogenic lime, and cardiac lime serum (Table 9).
11の抗原アレイアッセイの特異度(表10)は、正常コントロール由来のおよび現在使用されている試験において交差反応性を生ずることが知られている血清学的な応答に関連する疾患(非ライムの病気)を有する患者由来の血清を試験することによって評価した。ライム病が風土性の地域の52の健康なコントロールの中で、誰もアッセイで陽性の結果を有しなかった。潜在的交差反応性患者については、83のサンプルのうちの11が、発明者らのアッセイにおいて陽性IgMまたはIgG抗体応答を有した。したがって、アレイアッセイについての全体的な特異度は、正常コントロールについて100%および非ライムの病気患者において87%であった。 The specificity of the eleven antigen array assays (Table 10) is related to serologic responses related to serological responses that are known to produce cross-reactivity in normal controls and in currently used tests (non-lyme). Serum from patients with (disease) was evaluated by testing. Of the 52 healthy controls in the endemic area, no one had a positive result in the assay. For potential cross-reactive patients, 11 of 83 samples had a positive IgM or IgG antibody response in our assay. Thus, the overall specificity for the array assay was 100% for normal controls and 87% in non-Lyme disease patients.
これらのデータは、本明細書において記載されるマイクロアレイアッセイは、疾病の初期に、B.ブルグドルフェリに対する抗体を検出する際に優れた感度、特異度、および精度を与え、それだけではなく、同様に、疾病の末期についても同等の感度を示すことを実証する。その結果、ライム病に対する広範囲のカバー度および特異性を潜在的に有するだろう組換えキメラボレリアタンパク質の標準化された高感度で特異的な1段階制ライム病アッセイが現在利用可能である。さらに、これらのアッセイは、次世代の迅速な1段階制ポイント・オブ・ケアアッセイの開発について、有意な商業上の可能性を有するであろう。 These data indicate that the microarray assay described herein can be used as an early Gives excellent sensitivity, specificity, and accuracy in detecting antibodies against Burgdorferi, but also demonstrates that it exhibits equivalent sensitivity for the end stage of the disease as well. As a result, standardized sensitive and specific one-step lyme disease assays of recombinant chimeric Borrelia proteins that would potentially have a broad coverage and specificity for Lyme disease are currently available. In addition, these assays will have significant commercial potential for the development of next generation rapid one-step point-of-care assays.
本明細書において引用されるすべての特許、公開出願、および参考文献の教示は、それらの全体が参照によって組み込まれる。
Casjens,S.,Palmer,N.,van Vugt,R.,Huang,W.G.,Stevenson,B.,Rosa,P.,et al.,A bacterial genome in flux: the twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.Mol.Microbiol.,2000;35,490−516.
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The teachings of all patents, published applications, and references cited herein are incorporated by reference in their entirety.
Casjens, S.M. Palmer, N .; , Van Vugt, R .; , Huang, W .; G. Stevenson, B .; Rosa, P .; , Et al. , A bacterial genome in flux: the twelve linear and nine circular extramosomal DNA in an infectious isolate of the lysedispiret. Mol. Microbiol. 2000; 35, 490-516.
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本発明が、その例となる実施形態への参照により特に示され、記載されたが、添付の請求項によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形式および詳細における様々な変化がその中でなされてもよいことが当業者らによって理解されるであろう。 Although the invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, various changes in form and detail may be made without departing from the scope of the invention as encompassed by the appended claims. It will be appreciated by those skilled in the art that it may be done in.
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