JP2017527261A - 蛍光団を活性化し、シフトするタグ(fast) - Google Patents
蛍光団を活性化し、シフトするタグ(fast) Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017527261A JP2017527261A JP2016575350A JP2016575350A JP2017527261A JP 2017527261 A JP2017527261 A JP 2017527261A JP 2016575350 A JP2016575350 A JP 2016575350A JP 2016575350 A JP2016575350 A JP 2016575350A JP 2017527261 A JP2017527261 A JP 2017527261A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- protein
- polypeptide
- pyp
- range
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 120
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 112
- 101710141175 Photoactive yellow protein Proteins 0.000 claims abstract description 95
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 36
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 30
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 150
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 137
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 136
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 105
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 101
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- -1 carboxy, amino Chemical group 0.000 claims description 27
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 25
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 25
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 23
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 19
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 18
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 16
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 16
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 claims description 14
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 14
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 125000004438 haloalkoxy group Chemical group 0.000 claims description 13
- 125000004404 heteroalkyl group Chemical group 0.000 claims description 13
- 125000000592 heterocycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 13
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 13
- ZIHQUWYJSTVYAT-UHFFFAOYSA-N [NH-][N+]([O-])=O Chemical compound [NH-][N+]([O-])=O ZIHQUWYJSTVYAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 12
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000004040 coloring Methods 0.000 claims description 5
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 claims description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 4
- 101100516568 Caenorhabditis elegans nhr-7 gene Proteins 0.000 claims description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 3
- 239000003574 free electron Substances 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 claims description 3
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 claims description 3
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 claims description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 108
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 100
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 83
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 33
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 23
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 23
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 23
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 20
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 16
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 16
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 16
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 15
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 15
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 15
- RGHHSNMVTDWUBI-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzaldehyde Chemical compound OC1=CC=C(C=O)C=C1 RGHHSNMVTDWUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 12
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 10
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical group OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 9
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 8
- KIWUVOGUEXMXSV-UHFFFAOYSA-N rhodanine Chemical compound O=C1CSC(=S)N1 KIWUVOGUEXMXSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 8
- 101000760456 Anguilla japonica Bilirubin-inducible fluorescent protein UnaG Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000544058 Halophila Species 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-M phenolate Chemical compound [O-]C1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229940031826 phenolate Drugs 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- IUNJCFABHJZSKB-UHFFFAOYSA-N 2,4-dihydroxybenzaldehyde Chemical compound OC1=CC=C(C=O)C(O)=C1 IUNJCFABHJZSKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WBIZZNFQJPOKDK-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-2-methoxybenzaldehyde Chemical compound COC1=CC(O)=CC=C1C=O WBIZZNFQJPOKDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 4
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- BGWLYQZDNFIFRX-UHFFFAOYSA-N 5-[3-[2-[3-(3,8-diamino-6-phenylphenanthridin-5-ium-5-yl)propylamino]ethylamino]propyl]-6-phenylphenanthridin-5-ium-3,8-diamine;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCNCCNCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 BGWLYQZDNFIFRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102100035971 Molybdopterin molybdenumtransferase Human genes 0.000 description 3
- 101800001494 Protease 2A Proteins 0.000 description 3
- 101800001066 Protein 2A Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 3
- 229940013640 flavin mononucleotide Drugs 0.000 description 3
- FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N flavin mononucleotide Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011768 flavin mononucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 3
- 108010024999 gephyrin Proteins 0.000 description 3
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 3
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- WUYJNCRVBZWAOK-UITAMQMPSA-N (5Z)-5-[(4-hydroxy-3-methylphenyl)methylidene]-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-4-one Chemical compound CC1=C(O)C=CC(\C=C2/SC(=S)NC2=O)=C1 WUYJNCRVBZWAOK-UITAMQMPSA-N 0.000 description 2
- GZGFGVYXIOPNPH-BAQGIRSFSA-N (5z)-5-[(2,4-dihydroxyphenyl)methylidene]-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-4-one Chemical compound OC1=CC(O)=CC=C1\C=C/1C(=O)NC(=S)S\1 GZGFGVYXIOPNPH-BAQGIRSFSA-N 0.000 description 2
- OWXPWWRBBBGOLO-UITAMQMPSA-N (5z)-5-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methylidene]-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-4-one Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C/2C(NC(=S)S\2)=O)=C1 OWXPWWRBBBGOLO-UITAMQMPSA-N 0.000 description 2
- CCWKDSPKUCORRF-TWGQIWQCSA-N (5z)-5-[(4-hydroxyphenyl)methylidene]-3-methyl-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-4-one Chemical compound O=C1N(C)C(=S)S\C1=C/C1=CC=C(O)C=C1 CCWKDSPKUCORRF-TWGQIWQCSA-N 0.000 description 2
- JGRMXPSUZIYDRR-UHFFFAOYSA-N 2-(4-oxo-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-3-yl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CN1C(=O)CSC1=S JGRMXPSUZIYDRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKLZCQWVERBDEZ-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-4-one Chemical compound CN1C(=O)CSC1=S JKLZCQWVERBDEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAKYASSDAXQKKY-UHFFFAOYSA-N 4-Hydroxy-3-methylbenzaldehyde Chemical compound CC1=CC(C=O)=CC=C1O BAKYASSDAXQKKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 4-coumaric acid Chemical compound OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RAYIDZVPIAJJPF-UHFFFAOYSA-N 5-[(4-hydroxyphenyl)methylidene]-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-4-one Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C=C1C(=O)NC(=S)S1 RAYIDZVPIAJJPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N Biliverdin Natural products CC1=C(C=C)C(=C/C2=NC(=Cc3[nH]c(C=C/4NC(=O)C(=C4C)C=C)c(C)c3CCC(=O)O)C(=C2C)CCC(=O)O)NC1=O GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N Biliverdin IX Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(\C=C/2C(=C(C)C(=C/C=3C(=C(C=C)C(=O)N=3)C)/N\2)CCC(O)=O)N1 RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 2
- 101000690563 Escherichia coli (strain K12) Antigen 43 Proteins 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 0 O=*(CS1)NC1=S Chemical compound O=*(CS1)NC1=S 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N biliverdin-IXalpha Natural products N1C(=O)C(C)=C(C=C)C1=CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(C=C2C(=C(C)C(C=C3C(=C(C=C)C(=O)N3)C)=N2)CCC(O)=O)N1 QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N chelidonic acid Natural products OC(=O)C1=CC(=O)C=C(C(O)=O)O1 PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 2
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 2
- YAMHXTCMCPHKLN-UHFFFAOYSA-N imidazolidin-2-one Chemical group O=C1NCCN1 YAMHXTCMCPHKLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N monobenzene Natural products C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 2
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 description 2
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 2
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 2
- 230000004844 protein turnover Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 102200081810 rs5952410 Human genes 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000005250 spinal neuron Anatomy 0.000 description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 2
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 2
- RAYIDZVPIAJJPF-VMPITWQZSA-N (5e)-5-[(4-hydroxyphenyl)methylidene]-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-4-one Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\1C(=O)NC(=S)S/1 RAYIDZVPIAJJPF-VMPITWQZSA-N 0.000 description 1
- NDACOWBVQLGBIP-UITAMQMPSA-N 2-[(5z)-5-[(4-hydroxyphenyl)methylidene]-4-oxo-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-3-yl]acetic acid Chemical compound O=C1N(CC(=O)O)C(=S)S\C1=C/C1=CC=C(O)C=C1 NDACOWBVQLGBIP-UITAMQMPSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHOFGBJTSNWTDT-UHFFFAOYSA-M 2-[n-ethyl-4-[(6-methoxy-3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium-2-yl)diazenyl]anilino]ethanol;methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC(N(CCO)CC)=CC=C1N=NC1=[N+](C)C2=CC=C(OC)C=C2S1 MHOFGBJTSNWTDT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M 4-Hydroxycinnamate Natural products OC1=CC=C(\C=C\C([O-])=O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M 0.000 description 1
- DFYRUELUNQRZTB-UHFFFAOYSA-N Acetovanillone Natural products COC1=CC(C(C)=O)=CC=C1O DFYRUELUNQRZTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000757378 Acidithiobacillus caldus SM-1 Species 0.000 description 1
- 241000605272 Acidithiobacillus thiooxidans Species 0.000 description 1
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001344325 Caenispirillum salinarum Species 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026206 Conalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000206596 Halomonas Species 0.000 description 1
- 241001653918 Halomonas sp. Species 0.000 description 1
- 241000191005 Halorhodospira halophila Species 0.000 description 1
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 241000815603 Leptospira biflexa serovar Patoc strain 'Patoc 1 (Paris)' Species 0.000 description 1
- 241001148629 Leptospira meyeri Species 0.000 description 1
- 241001152480 Leptospira terpstrae Species 0.000 description 1
- 241001152433 Leptospira vanthielii Species 0.000 description 1
- 241001148613 Leptospira wolbachii Species 0.000 description 1
- 241000900331 Leptothrix cholodnii SP-6 Species 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000215495 Massilia timonae Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000601856 Methylotenera versatilis 301 Species 0.000 description 1
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010020004 Microtubule-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- RAYIDZVPIAJJPF-YVMONPNESA-N Oc1ccc(/C=C(/C(N2)=O)\SC2=S)cc1 Chemical compound Oc1ccc(/C=C(/C(N2)=O)\SC2=S)cc1 RAYIDZVPIAJJPF-YVMONPNESA-N 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000933512 Paraburkholderia phytofirmans PsJN Species 0.000 description 1
- 241000190965 Phaeospirillum fulvum Species 0.000 description 1
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241001473233 Rheinheimera sp. Species 0.000 description 1
- 241000191023 Rhodobacter capsulatus Species 0.000 description 1
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 description 1
- 241000191033 Rhodomicrobium vannielii Species 0.000 description 1
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 1
- 241001478323 Rhodospirillum centenum Species 0.000 description 1
- 241000190982 Rhodothalassium salexigens Species 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241001069981 Roseomonas cervicalis ATCC 49957 Species 0.000 description 1
- CPBNSMHJCDWYOP-XTKZWJJBSA-N S1C(=S)NC(=O)C1.Br.OC1=CC=C(\C=C/2\C(NC(S2)=S)=O)C=C1 Chemical compound S1C(=S)NC(=O)C1.Br.OC1=CC=C(\C=C/2\C(NC(S2)=S)=O)C=C1 CPBNSMHJCDWYOP-XTKZWJJBSA-N 0.000 description 1
- 241000981395 Salinibacter ruber DSM 13855 Species 0.000 description 1
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000862997 Sorangium cellulosum Species 0.000 description 1
- 241000346874 Spirosoma linguale DSM 74 Species 0.000 description 1
- 241000197447 Stigmatella aurantiaca DW4/3-1 Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 241000310017 Thiorhodospira sibirica ATCC 700588 Species 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000012436 analytical size exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 125000002529 biphenylenyl group Chemical group C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3C12)* 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000000451 chemical ionisation Methods 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006690 co-activation Effects 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000000942 confocal micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000006165 cyclic alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005595 deprotonation Effects 0.000 description 1
- 238000010537 deprotonation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 125000004663 dialkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 125000006575 electron-withdrawing group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001317 epifluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002060 fluorescence correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 241000889394 gamma proteobacterium NOR5-3 Species 0.000 description 1
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 125000002346 iodo group Chemical group I* 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004491 isohexyl group Chemical group C(CCC(C)C)* 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229940107698 malachite green Drugs 0.000 description 1
- FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M malachite green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 238000004452 microanalysis Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 102000021160 microtubule binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091011150 microtubule binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008832 photodamage Effects 0.000 description 1
- 238000007699 photoisomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000010377 protein imaging Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000010869 super-resolution microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical group 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 1
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
- C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
- C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D277/32—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D277/36—Sulfur atoms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【選択図】図1
Description
約25℃の温度で測定した場合に約0.05〜約10μMの範囲、好ましくは約0.1〜約2μMの範囲、より好ましくは約0.13〜約1.02μMの範囲のKD、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約1〜約50s−1、好ましくは約5〜約20s−1、より好ましくは約6.3〜約17s−1の範囲のkoff、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約0.1×107〜約50×107M−1s−1、好ましくは約1×107〜約10×107M−1s−1、より好ましくは約3×107〜約6.3×107M−1s−1の範囲のkon
を伴う蛍光発生発色団を可逆的に結合する、
ポリペプチドまたはそのフラグメントに関する。
R1、R2、R5、およびR6が同一または異なるものであってもよく、それぞれが、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも1つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、H、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し、
R3が、非結合二重項(すなわち遊離電子対)または、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、またはハロアルキルから選択される少なくとも1つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、H、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し、
R4が、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも1つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、H、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基から選択される少なくとも1つの基により任意に置換されている、S、O、またはN原子により中断または終結された単結合または二重結合であり、
Xが、OH、SH、NHR7、またはN(R7)2であり、R7が、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択されている少なくとも1つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、H、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基であり、
YがO、NH、またはSであり、
上記ポリペプチドが、これに複合体形成した後、上記蛍光発生発色団の輝度を高め、
上記ポリペプチドが、その助色団基のイオン化を介して蛍光発生発色団のスペクトルシフトを誘導し、
上記ポリペプチドが、明らかな光安定性を表すのに適している更新時間で上記蛍光発生発色団を結合する、
式(I)の蛍光発生発色団を、可逆的に結合する。
97位のプロリン、
94位のトリプトファン、
96位の、分枝脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくはイソロイシン、バリン、もしくはロイシン、および/または
98位のスレオニン
のうちの少なくとも1つを含む機能的なPYP誘導体またはその機能的なフラグメントを含む。
R1、R2、R3、R4、R5、R6、X、およびYが上述に定義されており、粒子、好ましくはタンパク質または表面を可逆的に着色するための、
式(I)を有する蛍光発生発色団の使用に関する。
約25℃の温度で測定した場合に約0.05〜約10μMの範囲、好ましくは約0.1〜約2μMの範囲、より好ましくは約0.13〜約1.02μMの範囲のKD、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約1〜約50s−1、好ましくは約5〜約20s−1、より好ましくは約6.3〜約17s−1の範囲のkoff、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約0.1×107〜約50×107M−1s−1、好ましくは約1×107〜約10×107M−1s−1、より好ましくは約3×107〜約6.3×107M−1s−1の範囲のkon
を伴う少なくとも2つの蛍光発生発色団に結合した少なくとも2つのポリペプチド(好ましくは2つの本発明のPYP誘導体、または2つの本発明の融合タンパク質)の使用を含み、
本発明の方法が、
第1の蛍光発生発色団と上記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
上記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
第2の蛍光発生発色団と上記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
上記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
各蛍光発生発色団を用いて前のステップを反復することと
を含む、方法である。
約25℃の温度で測定した場合に約0.05〜約10μMの範囲、好ましくは約0.1〜約2μMの範囲、より好ましくは約0.13〜約1.02μMの範囲のKD、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約1〜約50s−1、好ましくは約5〜約20s−1、より好ましくは約6.3〜約17s−1の範囲のkoff、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約0.1×107〜約50×107M−1s−1、好ましくは約1×107〜約10×107M−1s−1、より好ましくは約3×107〜約6.3×107M−1s−1の範囲のkon
を伴う蛍光発生発色団に結合できるPYP誘導体を同定する方法であって、
上記方法が、
PYP配列(PYP配列は、SEQ ID NO:48〜81、好ましくはSEQ ID NO:48から選択される)を無作為に変異させる(たとえば飽和変異によるなど)ことと、
上記蛍光発生発色団と変異したPYPの結合の速度定数を測定することと、
特定のKD、kon、および/またはkoffを有する変異したPYPを選択することと
を含む、方法である。
本明細書中で使用されるように、タンパク質の「誘導体」という用語は、当該タンパク質のフラグメントまたは変異体を表し得る。
よって本発明は、機能的光活性黄色タンパク質(PYP)誘導体またはその機能的なフラグメントを含むポリペプチドであって、
約25℃の温度で測定した場合に約0.05〜約10μMの範囲、好ましくは約0.1〜約2μMの範囲、より好ましくは約0.13〜約1.02μMの範囲のKD、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約1〜約50s−1、好ましくは約5〜約20s−1、より好ましくは約6.3〜約17s−1の範囲のkoff、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約0.1×107〜約50×107M−1s−1、好ましくは約1×107〜約10×107M−1s−1、より好ましくは約3×107〜約6.3×107M−1s−1の範囲のkon
を伴う蛍光発生発色団を可逆的に結合する、ポリペプチドに関する。
R1、R2、R5、およびR6が同一または異なるものであってもよく、それぞれが、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも1つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、H、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し、
R3が、非結合二重項(すなわち遊離電子対)または、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも1つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、H、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し、
R4が、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも1つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、H、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基から選択される少なくとも1つの基により任意に置換されている、S、O、またはN原子により中断または終結された単結合または二重結合であり、
Xが、OH、SH、NHR7、またはN(R7)2であり、R7が、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択されている少なくとも1つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、H、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基であり、
YがO、NH、またはSである、
式(I)を有する。
約25℃の温度で測定した場合に約0.1〜約10μMの範囲、好ましくは約0.5〜約2μMの範囲、より好ましくは約0.59〜約1.02μMの範囲のKD、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約1〜約50s−1、好ましくは約5〜約20s−1、より好ましくは約8〜約17s−1の範囲のkoff、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約0.1×107〜約50×107M−1s−1、好ましくは約1×107〜約10×107M−1s−1、より好ましくは約3×107M−1s−1の範囲のkon
を伴うHBRを可逆的に結合する。
約25℃の温度で測定した場合に約0.05〜約10μMの範囲、好ましくは約0.1〜約1μMの範囲、より好ましくは約0.13μMの範囲のKD、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約1〜約50s−1、好ましくは約5〜約10s−1、より好ましくは約6.3s−1の範囲のkoff、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約0.1×107〜約50×107M−1s−1、好ましくは約5×107〜約10×107M−1s−1、より好ましくは約6.3×107M−1s−1の範囲のkon
を伴うHMBRを可逆的に結合する。
97位のプロリンによるアミノ酸置換、
94位のトリプトファンによるアミノ酸置換、
96位の、分枝脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくはイソロイシン、バリン、もしくはロイシンによるアミノ酸置換、および/または
98位のスレオニンによるアミノ酸置換
からなる群から選択される修飾のうちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、好ましくは少なくとも4つ、好ましくはすべてを含み、
アミノ酸配列のナンバリングが、SEQ ID NO:48の配列を参照して作製されている、
PYP由来の機能的な誘導体、またはその機能的なフラグメントを含む。
約25℃の温度で測定した場合に約0.05〜約10μMの範囲、好ましくは約0.1〜約2μMの範囲、より好ましくは約0.13〜約1.02μMの範囲のKD、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約1〜約50s−1、好ましくは約5〜約20s−1、より好ましくは約6.3〜約17s−1の範囲のkoff、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約0.1×107〜約50×107M−1s−1、好ましくは約1×107〜約10×107M−1s−1、より好ましくは約3×107〜約6.3×107M−1s−1の範囲のkon
を伴う蛍光発生発色団を結合することができるPYP誘導体を同定する方法であって、
PYP配列(上記PYP配列は、SEQ ID NO:48〜81、好ましくはSEQ ID NO:48から選択される)を無作為に変異(たとえば飽和変異により変異)させることと、
蛍光発生発色団と変異したPYPの結合の速度定数を測定することと、
上述のKD、kon、および/またはkoffを有する変異したPYPを選択することと
を含む、方法に関する。
約25℃の温度で測定した場合に約0.05〜約10μMの範囲、好ましくは約0.1〜約2μMの範囲、より好ましくは約0.13〜約1.02μMの範囲のKD、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約1〜約50s−1、好ましくは約5〜約20s−1、より好ましくは約6.3〜約17s−1の範囲のkoff、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約0.1×107〜約50×107M−1s−1、好ましくは約1×107〜約10×107M−1s−1、より好ましくは約3×107〜約6.3×107M−1s−1の範囲のkon
を伴う少なくとも2つの蛍光発生発色団に結合した少なくとも2つのポリペプチド(好ましくは上述の2つのPYP誘導体)の使用を含み、
本発明の方法が、
第1の蛍光発生発色団と上記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
上記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
第2の蛍光発生発色団と上記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
上記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
各蛍光発生発色団を用いて前のステップを反復することと
を含む、方法に関する。
約25℃の温度で測定した場合に約0.05〜約10μMの範囲、好ましくは約0.1〜約2μMの範囲、より好ましくは約0.13〜約1.02μMの範囲のKD、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約1〜約50s−1、好ましくは約5〜約20s−1、より好ましくは約6.3〜約17s−1の範囲のkoff、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約0.1×107〜約50×107M−1s−1、好ましくは約1×107〜約10×107M−1s−1、より好ましくは約3×107〜約6.3×107M−1s−1の範囲のkon
を伴う少なくとも2つの蛍光発生発色団に結合した少なくとも1つのポリペプチド(好ましくは2つの、上述のPYP誘導体)、ならびに
少なくとも1つの光により切り替え可能なポリペプチド(たとえばDronpaなど)
の使用を含み、
本発明の方法が、
光により切り替え可能なポリペプチドを視覚化することと、
蛍光を測定することと、
光により切り替え可能なポリペプチドをオフに切り替えることと、
蛍光発生発色団と上記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
上記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
各蛍光発生発色団および/または各光により切り替え可能なポリペプチドを用いて前のステップを反復することと
を含む、方法に関する。
蛍光発生リガンドの付加または除去により自在に、黄色の蛍光をオンおよびオフにすることができる;
吸収レッドシフトは、励起波長の選択を介して遊離した蛍光団および結合した蛍光団を区別することにより特異性を上げることができる;
微生物から、哺乳類の細胞およびゼブラフィッシュの胚に至る様々な宿主のタンパク質の効率的な標識を可能にする;
ほぼリアルタイムで迅速なプロセス(たとえばタンパク質の合成など)をモニタリングすることができる;
マルチプレックスの実験に使用し得る。
本発明を、さらに以下の実施例により例証する。
蛍光団/タンパク質の複合体の熱動力学的な特性の測定
蛍光団およびポリペプチドが蛍光性複合体を提供するように相互作用することを考慮して、本出願人は、相互作用の熱力学および動力学を解析するために、2状態モデルを採用した。蛍光団、ポリペプチド、および複合体は、それぞれA、B、およびABを意味し、相互作用
AtotおよびBtotは、AおよびBの総濃度を意味し、平衡時の3種のA、B、およびBの濃度Afin、Bfin、およびABfinは、
観察可能な実験は蛍光性の発光である。空のポリペプチドBの輝度を無視すると、蛍光強度IFは、それぞれQAおよびQABの輝度を有する蛍光団Aおよびその複合体ABの寄与からもたらされ、これにより、
熱力学定数Kを、一定のタンパク質濃度Btotで、蛍光団の総濃度Atotへの蛍光強度IFの依存性を解析することにより決定した。まず本出願人は、ABfin=Btotとなるように、(i)遊離蛍光団の寄与(QAAtot)からIF(Atot)を補正すること、および(ii)十分に大きなAtotの濃度で上限値
HBRおよびHMBRの結合定数Kを、25〜45℃の範囲の異なる温度で決定して、反応(1)に関連したエンタルピーΔH0およびエントロピーΔS0を得た。本出願人は、二状態モデルがその後の解析に有効であったことを確認するために考慮した温度範囲でY−FASTが安定であったことを、円二色性により検証したことに留意されたい。
次に本出願人は、ストップトフロー実験を使用して、3種のA、B、およびABの濃度A、B、およびABの時間的発展から、速度定数konおよびkoffを推定した。
所定の温度での速度定数konおよびkoffの推定を、一連のストップトフロー実験における蛍光強度の時間的依存性を解析することにより行った。まず本出願人は、式(8、12、13)から式(16)を得た。
最初に、本出願人は、本出願人が様々な初期の濃度AtotおよびBtotを使用した一連の実験において、15℃でτを測定した。この一連の実験は、15℃で独立してkonおよびkoffを推定することを可能にした。本出願人は、HBRおよびHMBRで、それぞれ(2.5±0.4)×107M–1s–1および4.1±0.7s–1、および(2.0±0.5)×107M–1s–1および2.1±0.5s–1を見出した。
次に、本出願人は、本出願人が様々な初期の濃度AtotおよびBtotを使用した一連の実験で、10〜25℃の範囲の様々な温度範囲でτを測定した。後者のばらつきは、上述のようにkonおよびkoffを独立して推定するには狭すぎるため、本出願人は、考慮した温度範囲における緩和時間τから式K=kon/koff、ならびに結合定数Kの温度依存性によってkonおよびkoffの値を推定した。特に、15℃で推定したkonおよびkoffの値は、先に決定した値とほぼ一致していた。
市販のロダニン(Alfa Aesar)、3−メチルロダニン(Aldrich)、ロダニン−3−酢酸(Aldrich)、4−ヒドロキシベンズアルデヒド(Acros)、2,4−ジヒドロキシベンズアルデヒド(Aldrich)、4−ヒドロキシ−2−メトキシベンズアルデヒド(Fluka)、4−ヒドロキシ−3−メチルベンズアルデヒド(Acros)を、さらなる精製を行うことなく出発物質として使用した。分析用薄層クロマトグラフィー(TLC):Merckのシリカゲル60 F−254でプレコーティングしたプレート:UV(254nm)による検出。NMRスペクトルを、1Hで300MHzおよび13Cで75.5MHzのAC Bruker分光計で記録した;化学シフトを、内部参照としてプロトン化溶媒を用いてppmで報告し(1H、CD3SOCD3中のCHD2SOCD3 2.52ppm、CD3COD中のCHD2OD 3.34ppm;13C、CD3SOCD3中の13CD3SOCD3 40.4ppm)、結合定数JをHzで報告する。質量スペクトル(化学イオン化およびNH3を用いた電子衝撃)を、ParisTech化学質量分析サービス(Service de Spectrometrie de Masse de Chimie ParisTech)により行った。微量分析を、ジフシュルイヴェット微量分析(Service de Microanalyses de Gif sur Yvette)により行った。
コドンを酵母での発現に最適化したハロロドスピラ・ハロフィラ(Halorhodospira halophila)PYP−C69Gの遺伝子(SEQ ID NO:139)、コドンを酵母での発現に最適化したY−FASTの遺伝子(SEQ ID NO:140)、およびコドンをヒトの細胞での発現に最適化したY−FASTの遺伝子(SEQ ID NO:141)は、Eurofins Genomicsによって合成された。酵母の細胞表面での発現のためAga2pに融合したPYP−C69Gの発現を可能にするプラスミドpAG14を、pCTCON2ベクターのNhe IおよびBamH Iの制限部位の間にPYP−C69Gの遺伝子(コドンを酵母での発現に最適化した配列)を挿入することにより、得た。クローン2(SEQ ID NO:2)、クローン3(=Y−FAST、SEQ ID NO:3)、クローン4(SEQ ID NO:4)、クローン5(SEQ ID NO:5)、クローン6(SEQ ID NO:6)、およびN末端Hisタグを含むPYP−C69G(SEQ ID NO:48)のそれぞれの細菌での発現を可能にするプラスミドpAG86、pAG87、pAG88、pAG89、pAG90、pAG91およびpAG95を、pET28aベクターのNhe IおよびXho Iの制限部位の間にENLYFQG–クローンXをコードする遺伝子(酵母ディスプレイにより選択された配列)(X=2〜6)(またはPYP−C69G)を挿入することにより、得た(この配列ENLYFQG(SEQ ID NO:148)は、TEVプロテアーゼにより認識される配列に対応し、TEV消化によるHisタグの除去を可能にする)。Y−FASTまたはPYP−C69Gに融合したmCherry(SEQ ID NO:149)の哺乳類での発現を可能にするプラスミドpAG96およびpAG97を、pIRESベクター(Clontech)のBgl IIおよびNot Iの制限部位の間にmCherry–GGGS–Y−FASTをコードする配列(SEQ ID NO:150)(またはPYP−C69G、SEQ ID NO:151)をクローニングすることにより、得た。EGFP、Y−FAST、Y−FAST−NLS、Lyn11–Y−FAST、Ensconsin–Y−FAST、Dronpa−NLS、Lyn11−Dronpaのそれぞれの哺乳類での発現を可能にするプラスミドpAG29、pAG104、pAG105、pAG106、pAG55およびpAG59を、pIRESベクターのBgl IIおよびNot Iの制限部位の間にEGFP−GGGSGGGSPG(SEQ ID NO:130)、Y−FAST–GSEQKLISEEDL(SEQ ID NO:131)、Y−FAST–GSEQKLISEEDLGAGA PKKKRKVPKKKRK(SEQ ID NO:132)、MGCIKSKGKDSAGGGS–Y−FAST−GSEQKLISEEDL(SEQ ID NO:133)、Ensconsin−SAGG GS–Y−FAST–GSEQKLISEEDL(SEQ ID NO:134)、Dronpa–GSEQKLISEEDLGAGAPKKKRKVPKK KRK(SEQ ID NO:135)、およびMGCIKSKGKDSAGGGS–Dronpa−GSEQKLISEEDL(SEQ ID NO:136)をコードする配列を挿入することにより、得た。ゼブラフィッシュの注入のためのmCherry−P2A−Y−FASTおよびmCherry–P2A–PYP−C69GをコードするmRNAの合成を可能にするプラスミドpAG113およびpAG114を、pCS2の改変版のBamH IおよびSnaB Iの間にmCherry−GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPSRGGGS−Y−FASTをコードする配列(SEQ ID NO:137)(またはPYP−C69G、SEQ ID NO:138)を挿入することにより、得た。In vitroでのタンパク質合成のためのT7プロモーターの制御下でのmCherry–Y FASTの発現を可能にするプラスミドpAG101を、pET28aベクターのNhe IおよびXho Iの制限部位の間のmCherry−GSSSENLYFQG−Y−FASTをコードする配列(SEQ ID NO:152)を挿入することにより、得た。
pHの測定を、Crison 5208電極(Barcelona, Spain)を備える標準的なpHメーター PHM210(Radiometer Analytical)(pH4および7または10の水性バッファーで較正)で行った。UV/Vis吸収スペクトルを、ダイオードアレイUV/Vis分光光度計(Evolution array, Thermo Scientific)上の1cm×1cmの石英のキュベット(Hellma)中で記録した。1光子励起において較正した蛍光スペクトルを、ペルチェセルホルダー(TLC50, Quantum Northwest, Shoreline, WA)を備えたPhoton Technology InternationalのQuantaMaster QM−1分光蛍光光度計(PTI, Monmouth Junction, NJ)で記録した。1光子励起後の全発光量子収率φを、1つの光子励起φを、関係式
ライブラリーの構築
酵母ディスプレイライブラリーを、NNK縮重プライマーを使用した飽和変異によりPYP−C69Gの遺伝子から構築した。52、53、65、66、67、68、69位で無作為化したライブラリー1を、以下のように構築した。2つのPCRフラグメントを、プライマー対AG42/AG43およびAG44/AG46を使用して作製し、次に、AG42/AG46を使用したPCRによりまとめた(プライマーは以下に列挙されている)。PCR産物を、Nhe IおよびBamH Iで消化し、次にNhe I/BamH I制限部位を使用してpCTCON2に連結した。DH10B E. coliの細胞のエレクトロポレーションにより行った大規模な形質転換は、7×107個の形質転換体をもたらした。次にDNAをミニプレップし、大規模な高効率の形質転換プロトコルを使用してEBY100酵母株に再度形質転換し、8×107個の形質転換体を得た。94、95、96、97、98、99、100、101位で無作為化したライブラリー2を、以下のように構築した。PCR産物を、プライマー対AG42/AG45を使用して作製した。PCR産物を、Nhe IおよびSty Iで消化し、次にNhe I/Sty I制限部位を使用してpAG14において連結した。DH10B E. coli細胞におけるエレクトロポレーションにより行われた大規模な形質転換は、3×107個の形質転換体をもたらした。次にDNAをミニプレップし、大規模な高効率の形質転換プロトコルを使用してEBY100酵母株において再度形質転換して、8×106個の形質転換体を得た。52、53、65、66、67、68、69、94、95、96、97、98、99、100、101位で無作為化したライブラリー3を、以下のように構築した。2つのPCRフラグメントを、プライマー対AG42/AG43およびAG44/AG45を使用して作製し、次にAG42/AG45を使用してPCRによりまとめた。PCR産物をNhe IおよびSty Iで消化し、次にNhe I/Sty I制限部位を使用してpAG14において連結した。DH10B E. coli細胞におけるエレクトロポレーションにより行われた大規模な形質転換は、1.5×107個の形質転換体をもたらした。次にDNAをミニプレップし、大規模な高効率の形質転換プロトコルを使用してEBY100酵母株において再度形質転換し、8×107個の形質転換体を得た。
ライブラリー(概して1×1010個の細胞)を、SD(20g/Lのデキストロース、6.7g/Lの酵母窒素ベース、トリプトファンを含まない1.92g/Lの酵母合成ドロップアウト、7.44g/LのNaH2PO4および10.2g/LのNa2HPO4−7H2O、1%のペニシリン−ストレプトマイシン10,000U/mL)1l中で一晩(30℃、280rpm)増殖させた。次に、1×1010細胞の酵母細胞を回収し、1LのSG(20g/Lのガラクトース、2g/Lのデキストロース、6.7g/Lの酵母窒素ベース、トリプトファンを含まない1.92g/Lの酵母合成ドロップアウト、7.44g/LのNaH2PO4、10.2g/LのNa2HPO4−7H2O、1%のペニシリン−ストレプトマイシン 10,000U/mL)中で、36時間(23℃、280rpm)で増殖させた。次に、6×108個の誘導した細胞を、遠心(25℃、3分、2,500g)によりペレット状にし、10mLのDPBS−BSA(137mMのNaCl、2.7mMのKCl、4.3mMのNa2HPO4、1.4mMのKH2PO4、1g/Lのウシ血清アルブミン、pH7.4)で洗浄し、DPBS−BSA中の1/250の一次抗体のニワトリ抗−c−Myc IgY(Life Technologies)溶液200μL中で、室温で30分間インキュベートした。次に細胞を10mLのDPBS−BSAで洗浄し、氷上で、DPBS−BSA中1/100の二次抗体Alexa Fluor(登録商標)647−ヤギ抗ウサギIgG(Life Technologies)溶液200μL中で30分間インキュベートした。DPBS−BSAで洗浄した後、20μMのHBRを補充したDPBS−BSA10mL中で細胞をインキュベートし、488nmおよび633nmのレーザーを備えたMoFlo(商標)XDP高速セルソーターで選別した。選別した細胞をSDに回収し、一晩増殖させ(30℃、240rpm)、SDプレート(182g/Lのソルビトール、15g/Lの寒天を補充したSD)に広げた。プレートを30℃で60時間インキュベートした。細胞の菌叢を、30%のグリセロールを補充したSDに回収し、アリコートし、凍結または次のラウンドに直接使用した。
発現ベクターをRosetta(DE3)pLysS E. coli(New England Biolabs)に形質転換した。細胞を、50μg/mlのカナマイシンおよび34μg/mlのクロラムフェニコールを補充した溶原ブロス(LB)培地中で、0.6のOD600nmとなるまで37℃で増殖させた。1mMの最終濃度となるまでイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加することにより、発現を4時間誘導した。細胞を、遠心(4℃で15分間、6,000g)することにより回収し、凍結した。細胞のペレットを溶解バッファー(リン酸緩衝液50mM,NaCl 150mM、MgCl2 2.5mM、プロテアーゼ阻害剤、DNase、pH7.4)に再度懸濁し、超音波処理した(20%の振幅、5分)。ライセートを4℃で2時間インキュベートし、DNaseによるDNAの消化を可能にした。細胞フラグメントを、遠心(15,000g、1時間、4℃)により除去した。10mMのイミダゾールを補充したリン酸緩衝食塩水(PBS)(リン酸ナトリウム50mM、NaCl 150mM、pH7.4)中のNi−NTAアガロースビーズとのゆっくりとした攪拌下で、上清を4℃で一晩インキュベートした。20mMのイミダゾールを補充した20容量のPBS、および40mMのイミダゾールを補充した5容量のPBSを用いて、ビーズを洗浄した。Hisタグ化タンパク質を、0.5Mのイミダゾールを補充した5容量のPBSで溶出した。大規模な透析により、PBSとバッファーを交換することを可能にした。Hisタグを、His−タグ化TEV(TEVプロテアーゼ;Tobacco Etch Virus protease)とタンパク質試料の、18℃、18時間のインキュベーションにより、切断した。Ni−NTAビーズを使用したTEVプロテアーゼの除去の後、タンパク質の試料を、その後の凍結乾燥のための2.5mMのリン酸ナトリウムに対して最終的に大規模に透析した。凍結乾燥したタンパク質を4℃で保存した。
無細胞タンパク質合成を、製造社のプロトコルにしたがってPURExpressのin vitroでのタンパク質の合成キット(New England Biolabs)を使用して行った。発光を、SpectraMax(登録商標)M5eプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して経時的に追跡した。
HEK293細胞およびヒーラ細胞を、フェノールレッド、Glutamax I、10%のウシ胎仔血清、および1%のペニシリン−ストレプトマイシンを補充したDMEMにおいて、5%のCO2雰囲気内、37℃で培養した。顕微鏡のイメージングのために、細胞を、ポリ−L−リジンでコーティングしたμDish IBIDI(Biovalley)に接種した。製造社のプロトコルにしたがいGenejuice(Merck)を使用して、細胞を一時的にトランスフェクトした。イメージングの前に、細胞をPBSで洗浄し、意図した濃度(最終的なDMSO含有量0.033%)のHBRまたはHMBRを補充したフェノールレッドを含まないDMEMでインキュベートした。
分離した脊髄ニューロンの培養物を、先に記載されたようにスプラーグドーリーラット(胎生期14日目)から調製した。ニューロンを、B27、2mMのglutamax、5U/mlのペニシリンおよび5μg/mlのストレプトマイシンを含むneurobasal培地中、36℃および5%のCO2で維持し、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を使用してY−FAST−ゲフィリンおよびmCerulean−ゲフィリンプラスミドDNAでin vitroでのDIV15の日に同時にトランスフェクトし、DIV17に実験に使用した。ニューロンを、フェノールレッドを用いず、33mMのグルコース、20mMのHEPES、2mMのglutamax、1mMのピルビン酸ナトリウム、およびB27を含むMEM培地中で、35℃でイメージングした。HMBRを、イメージングバッファー中で10μMの最終濃度で、バス適用により添加した。
ゼブラフィッシュを、Westerfieldにしたがい維持し、ステージ分類した。実験を、標準的なAb野生型株を使用して行った。胚を28℃でインキュベートした。行われるすべての実験に関して、動物施設は、フランスの農水省から同意を得たものであった(同意番号C 75−05−12)。mRNAの合成を、mMESSAGE mMACHINE転写キット(Ambion Inc)を使用して行った。当量の100ng/mlのmRNAを、1細胞期胚に注入した。胚を、イメージングまでボルビックのミネラルウォーターで増殖させた。
フローサイトメトリー解析を、Accuri C6(BD Biosciences)で行った。共焦点顕微鏡画像を、Plan Apochromat 63x/1.4 NA油浸対物レンズを備えたZeiss LSM 710 レーザー走査型顕微鏡で得た。Zenソフトウェアを使用して、データを収集した。画像を、Image Jで解析した。スピニングディスク共焦点顕微鏡画像を、4x/0.15 N.A対物レンズおよびcoolSnap HQ2/CDDカメラ(Princeton Instrument)を備えたNikon Eclipse Ti顕微鏡で得た。Metamorph premier 7.6ソフトウェア(Molecular Devices)を使用して、データを収集した。
迅速な試作技術を、装置の製作に使用した。デジタル切断機(Graphtec, CE6000)を使用して、厚さ50μmのプラスチックフィルムにより担持されている、厚さ0.5mmのシリコーン層に0.5mmの広いマイクロ流体チャネルを生成した。プラスチックフィルムを除去し、酸素プラズマ処置を行った後、シリコーン層を、平坦なシリコンウエハ上に10:1w/wの比率でRTV615(GE, France)のAおよびBの成分の混合物を成形し、これを80℃で2時間硬化させることにより調製した厚さ5mmのポリジメチルシロキサン(PDMS)の層に結合させた。次に、入口および出口の孔を、接続のため金属のチューブで穿孔した。その後、シリコーン−PDMS複合体を、酸素プラズマ処置の後に、厚さ160μmのカバースライドに結合した。最終的に、装置全体を、80℃のオーブンに10分間入れた。細胞の接種の前に、装置を30分間超のUV曝露下で滅菌した。0.1MのNaHCO3(pH8)中50μg/mlの濃度のフィブロネクチンの溶液を、チャネルに注入し、37℃で30分間インキュベートした。チャネルをPBS溶液で3回洗浄し、次に細胞密度100,000個の細胞/mlの細胞懸濁液200μLを装置に導入し、システム全体を37℃で1時間インキュベートした。細胞染色―イメージングプロセスの動的制御を、多機能流体制御機(FC−PVL−II,MesoBioSystem)を使用して達成した。通常の培養培地、HMBR含有培養培地のどちらかのマイクロ流体チャネルへの注入を、制御機にダウンロードしたホームメイドのプロジェクト(home−made project)を用いて制御することにより、細胞染色−イメージングプロセスの全体を自動的に行うことができる。
Y−FASTを、mCherryとのFRET対にドナーとして、そのスペクトルの特性を考慮して理論に基づいて使用することができる。これを例証するために、本出願人は、吸収および発光スペクトルの両方を記録するための条件を一定に保持した一連のキュベットの実験を行うことにより、融合タンパク質Y−FAST−mCherryにおける電子励起の蛍光共鳴エネルギー移動の収率を決定した。
最初に、本出願人は、ドナーHMBR:Y−FASTの蛍光発光の変分からφETを推定した。よって、本出願人は、
あるいは、本出願人は、アクセプターmCherryの蛍光発光の変分からφETを推定した。よって、本出願人は、
タンパク質のキャビティなどの動かない環境で固定化した場合に高い蛍光の増大を示すことができ、助色団基のイオン化後に吸収のシフトを呈する蛍光発生発色団を設計した。
蛍光性HBR結合性タンパク質を、SEQ ID NO:48のハロロドスピラ・ハロフィラ(Halorhodospira halophila)由来のC69G光活性黄色タンパク質(PYP)の活性部位をリモデリングすることにより、設計した。
表2:5つの蛍光性HBR結合性PYP変異体(クローン2、3、4、5、および6)の吸収および発光の特性を表す。
表3:25℃でのY−FASTおよびHBRまたはHMBRの間の複合体の熱動力学的特性および光物理的特性(KD:解離定数;kon:オンの速度定数;koff:オフの速度定数;λabs:最大吸収波長;λem:最大発光波長;ε:λabsでのモル吸収係数;φ:蛍光量子収率;εφ:輝度)。バッファー:pH7.4のPBS。
Claims (15)
- 機能的光活性黄色タンパク質(PYP)誘導体を含むポリペプチドまたはその機能的なフラグメントであって、前記ポリペプチドまたはそのフラグメントが、
約25℃の温度で測定した場合に約0.05〜約10μMの範囲、好ましくは約0.1〜約2μMの範囲、より好ましくは約0.13〜約1.02μMの範囲のKD、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約1〜約50s−1、好ましくは約5〜約20s−1、より好ましくは約6.3〜約17s−1の範囲のkoff、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約0.1×107〜約50×107M−1s−1、好ましくは約1×107〜約10×107M−1s−1、より好ましくは約3×107〜約6.3×107M−1s−1の範囲のkon
を伴う蛍光発生発色団を可逆的に結合する、ポリペプチドまたはそのフラグメント。 - SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、およびSEQ ID NO:81を含む群から選択される配列を有するPYPの誘導体、好ましくはSEQ ID NO:48の誘導体である、請求項1に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:48を参照して、
97位のプロリン、
94位のトリプトファン、
96位の、分枝脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくはイソロイシン、バリン、もしくはロイシン、および/または
98位のスレオニン
のうちの少なくとも1つを含む、請求項1または2に記載のポリペプチド。 - SEQ ID NO:48を参照した、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、またはSEQ ID NO:128のアミノ酸領域94〜101、好ましくはSEQ ID NO:48を参照した、SEQ ID NO:83のアミノ酸領域94〜101を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、またはSEQ ID NO:47、またはそれらのフラグメント、好ましくはSEQ ID NO:3またはそれらのフラグメントを含む群から選択された配列を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記蛍光発生発色団が、式(I)
R1、R2、R5、およびR6が同一または異なるものであってもよく、それぞれが、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも1つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、H、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し、
R3が、非結合二重項(すなわち遊離電子対)または、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも1つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、H、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し、
R4が、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも1つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、H、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基から選択される少なくとも1つの基により任意に置換されている、S、O、またはN原子により中断または終結された単結合または二重結合であり、
Xが、OH、SH、NHR7、またはN(R7)2であり、R7が、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択されている少なくとも1つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、H、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基であり、
YがO、NH、またはSである、
請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチド。 - 関心対象のタンパク質に融合した、請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは請求項7に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項8に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 関心対象のいずれかの固体または液体の試料、細胞、または組織、または生物におけるタンパク質の活性、タンパク質の局在性、タンパク質−タンパク質相互作用、および/またはタンパク質の再配置を定量化および/または検出するための、請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは請求項7に記載の融合タンパク質の使用。
- 表面または粒子、好ましくは関心対象のタンパク質を蛍光的に標識または着色する方法であって、
前記表面または粒子に請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドを結合するステップと、
蛍光発生発色団を提供するステップと
を含む、方法。 - タンパク質(好ましくは細胞中のタンパク質)を順次標識する方法であって、
約25℃の温度で測定した場合に約0.05〜約10μMの範囲、好ましくは約0.1〜約2μMの範囲、より好ましくは約0.13〜約1.02μMの範囲のKD、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約1〜約50s−1、好ましくは約5〜約20s−1、より好ましくは約6.3〜約17s−1の範囲のkoff、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約0.1×107〜約50×107M−1s−1、好ましくは約1×107〜約10×107M−1s−1、より好ましくは約3×107〜約6.3×107M−1s−1の範囲のkon
を伴う少なくとも2つの蛍光発生発色団に結合する少なくとも2つのポリペプチド(好ましくは請求項1〜6のいずれか1項に記載の2つのPYP誘導体または請求項7に記載の2つの融合タンパク質)の使用を含み、
本発明の方法が、
第1の蛍光発生発色団と前記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
前記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
第2の蛍光発生発色団と前記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
前記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
各蛍光発生発色団を用いて前のステップを反復することと
を含む、方法。 - 約25℃の温度で測定した場合に約0.05〜約10μMの範囲、好ましくは約0.1〜約2μMの範囲、より好ましくは約0.13〜約1.02μMの範囲のKD、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約1〜約50s−1、好ましくは約5〜約20s−1、より好ましくは約6.3〜約17s−1の範囲のkoff、および/または
約25℃の温度で測定した場合に約0.1×107〜約50×107M−1s−1、好ましくは約1×107〜約10×107M−1s−1、より好ましくは約3×107〜約6.3×107M−1s−1の範囲のkon
を伴う蛍光発生発色団に結合できるPYP誘導体を同定する方法であって、
PYP配列(前記PYP配列は、SEQ ID NO:48〜81、好ましくはSEQ ID NO:48から選択される)を無作為に変異させる(たとえば飽和変異によるなど)ことと、
前記蛍光発生発色団と変異したPYPの結合の速度定数を測定することと、
特定のKD、kon、および/またはkoffを伴う変異したPYPを選択することと
を含む、方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP14175837 | 2014-07-04 | ||
EP14175837.5 | 2014-07-04 | ||
PCT/EP2015/065267 WO2016001437A2 (en) | 2014-07-04 | 2015-07-03 | Fluorogen activating and shifting tag (fast) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017527261A true JP2017527261A (ja) | 2017-09-21 |
JP6707472B2 JP6707472B2 (ja) | 2020-06-10 |
Family
ID=51062717
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016575350A Active JP6707472B2 (ja) | 2014-07-04 | 2015-07-03 | 蛍光団を活性化し、シフトするタグ(fast) |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10138278B2 (ja) |
EP (1) | EP3164411B1 (ja) |
JP (1) | JP6707472B2 (ja) |
WO (1) | WO2016001437A2 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK3439667T3 (da) | 2016-04-05 | 2024-04-02 | Immune Sensor Llc | Cgas antagonist forbindelser |
EP3575779A4 (en) * | 2017-01-27 | 2019-12-04 | Osaka University | METHOD FOR DETECTION OF BIOLOGICAL MATERIAL, AND CHEMILUMINESCENT INDICATOR USED IN THE METHOD |
EP3404022B1 (en) | 2017-05-19 | 2020-10-07 | Paris Sciences et Lettres - Quartier Latin | Membrane-impermeant fluorogenic chromophores |
EP3719007A1 (en) | 2019-04-05 | 2020-10-07 | Paris Sciences et Lettres - Quartier Latin | Split photoactive yellow protein complementation system and uses thereof |
CN110577606B (zh) * | 2019-08-29 | 2022-07-12 | 河南大学 | 一种荧光探针及其在pH值和氧化还原状态检测中的应用 |
WO2024052353A1 (en) * | 2022-09-05 | 2024-03-14 | Sorbonne Universite | Proximity inducing system and uses thereof |
-
2015
- 2015-07-03 US US15/321,378 patent/US10138278B2/en active Active
- 2015-07-03 EP EP15736425.8A patent/EP3164411B1/en active Active
- 2015-07-03 JP JP2016575350A patent/JP6707472B2/ja active Active
- 2015-07-03 WO PCT/EP2015/065267 patent/WO2016001437A2/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6707472B2 (ja) | 2020-06-10 |
WO2016001437A3 (en) | 2016-02-25 |
WO2016001437A8 (en) | 2019-01-31 |
WO2016001437A2 (en) | 2016-01-07 |
EP3164411B1 (en) | 2019-08-28 |
US10138278B2 (en) | 2018-11-27 |
EP3164411A2 (en) | 2017-05-10 |
US20170137473A1 (en) | 2017-05-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6707472B2 (ja) | 蛍光団を活性化し、シフトするタグ(fast) | |
Cheng et al. | Fluorescent amino acids as versatile building blocks for chemical biology | |
Kremers et al. | Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Förster radius | |
Chu et al. | A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions | |
Adams et al. | New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications | |
Telmer et al. | Rapid, specific, no-wash, far-red fluorogen activation in subcellular compartments by targeted fluorogen activating proteins | |
Watanabe et al. | Multicolor protein labeling in living cells using mutant β-lactamase-tag technology | |
Benaissa et al. | Engineering of a fluorescent chemogenetic reporter with tunable color for advanced live-cell imaging | |
Farhana et al. | Genetically encoded fluorescence/bioluminescence bimodal indicators for Ca2+ imaging | |
JP2018506285A (ja) | ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを検出するためのセンサー、方法及びキット | |
JP5570803B2 (ja) | 蛍光タンパク質およびpH測定方法 | |
US7381572B2 (en) | Reagents and procedures for multi-label high-specificity labeling | |
CN103502253A (zh) | 具有光致发光性质的新化合物及其应用 | |
JP2011097930A (ja) | 光活性化生理機能センサータンパク質 | |
Abraham et al. | Bidirectional fluorescence resonance energy transfer (FRET) in mutated and chemically modified yellow fluorescent protein (YFP) | |
US7141655B2 (en) | Reagents and procedures for high-specificity labeling | |
US20220169682A1 (en) | Split photoactive yellow protein complementation system and uses thereof | |
US11162951B2 (en) | Membrane-impermeant fluorogenic chromophores | |
Benaissa et al. | An engineered multifunctional protein tag for advanced fluorescence imaging | |
RU2515903C2 (ru) | Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор, кассета экспрессии, клетка продуцирующая флуоресцентный биосенсор, выделенный флуоресцентный биосенсор | |
RU2535981C1 (ru) | Нуклеиновая кислота, кодирующая основанный на fret дальне-красный биосенсор для измерения активности каспазы 3 внутри клеток | |
Jing et al. | Design, Synthesis, and Application of the Trimethoprim‐Based Chemical Tag for Live‐Cell Imaging | |
Marathe | Creation of novel photochangable fluorescent protein through directed evolution | |
Rakotoarison | Fluorescent reporters of protein-protein interactions optimized by orthology-based protein engineering | |
TWI412589B (zh) | 突變藍色螢光蛋白及其用於螢光共振能量傳遞與藍色螢光魚之方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180524 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190618 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190918 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190919 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191119 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200217 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20200408 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200428 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200520 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6707472 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |