JP2017522568A - 赤血球凝集抑制アッセイ（ｈａｉ）の自動イメージング及び分析 - Google Patents

Abstract

システム及び方法は、凝集状態の高スループットの決定を提供する。該システムは、回転テーブル及び複数のプレート傾斜ステーションを含む。該システムはまた、傾けられた及び／又は傾けられていない構成でプレートの全アレイをイメージングするために配置された１つ又は複数の光学通路を含む。該システムは、好ましくは、試験ウェルのアレイの画像を分析して、それぞれのウェルの凝集状態をその画像分析に基づき決定するための画像分析ソフトウェアを含む。【選択図】図８

Description

赤血球凝集抑制アッセイ（ＨＡＩ）は、７０年以上前に、血清中のインフルエンザ特異抗体レベルを測定する手段として開発された。ＨＡＩはそれ以来、多くの他のヘマグルチニン含有ウイルス、幾つか例を挙げれば、風疹ウイルス、はしかウイルス、おたふく風邪ウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ポリオーマウイルス及びアルボウイルス等のウイルスに適用されている。最近では、ＨＡＩは、ヒト及び動物におけるインフルエンザ抗体の型別のための、いわゆる代表的な（gold-standard）血清検査として認識されており、インフルエンザサーベイランス及びワクチン試験において広く使用されている。

本発明の実施形態による、プレートがフラットの場合及びプレートが傾いた場合のＨＡＩ ＲＢＣパターンの間の違いを示す図である。 本発明の実施形態による、様々な傾斜角度でのイメージャを示す図である。 本発明の実施形態による、様々な傾斜角度でのイメージャを示す図である。 本発明の実施形態による、様々な傾斜角度でのイメージャを示す図である。 本発明の実施形態による、イメージャを示す図である。 本発明の実施形態による、図３に示されたイメージャの光学系部分の更なる詳細を示す図である。 本発明の実施形態による、別のイメージャを示す図である。 本発明の実施形態による、９６ウェルプレートについての、小型レンズによるエッジ周りのディストーション及びシャドーイングとともに、上から下までの台形効果を示す図である。 本発明の実施形態による、テレセントリックレンズが、プレート画像のディストーション及びシャドーイングをどれほど減らすかを示す図である。 本発明の実施形態による、自動ＨＡＩ用（ＨＩＶＥ）自動イメージャを示す図である。 本発明の実施形態による、ＨＩＶＥ自動イメージャの様々な内部構成装置を示す図である。 本発明の実施形態による、ＨＩＶＥデュアルモード自動イメージャを示す図である。 本発明の実施形態による、画像分析アルゴリズムに関連したフローチャートである。 本発明の実施形態による、自動ＨＡＩイメージャに関連したプロセスを説明するフローチャートである。 本発明の実施形態による、Ｌ^＊ａ^＊ｂ^＊色空間マップである。 本発明の実施形態による、画像処理アルゴリズムの間に使用されたＲＢＣコントロールウェルの図である。 本発明の実施形態による、最適時点アルゴリズムを説明するフローチャートである。 本発明の実施形態による、平均標準偏差を画像取得時間に対して示すグラフである。 本発明の実施形態による、種々の凝集の程度についての、画像取得時間に応じた正規化されたパラメーターを示すグラフである。 本発明の実施形態による、種々の凝集の程度についての、画像取得時間に応じた正規化されたパラメーターを示すグラフである。 本発明の実施形態による、種々の凝集の程度についての、画像取得時間に応じた正規化されたパラメーターを示すグラフである。 本発明の実施形態による、単一プレートについての最適読取り時間のばらつきを示すグラフである。 本発明の実施形態による、単一プレートについての標準偏差のばらつきを示すグラフである。 本発明の実施形態による、時間及び凝集状態に応じたパラメーター偏差を示すグラフである。 本発明の実施形態による、時間及び凝集状態に応じたパラメーター偏差を示すグラフである。 本発明の実施形態による、自動ウェルマスクアルゴリズムを説明するフローチャートである。 本発明の実施形態による、凝集状態分類アルゴリズムを説明するフローチャートである。 本発明の実施形態による、フットパターンに関するエッジ検出を示す図である。 本発明の実施形態による、ＧＵＩについての画像取得タブを示す図である。 本発明の実施形態による、６枚のプレートの自動イメージングに関するタイミング図である。 本発明の実施形態による、３６枚のプレートの自動イメージングに関するタイミング図である。 本発明の実施形態による、ＧＵＩについての画像分析タブの更なる図解である。 本発明の実施形態による、ＧＵＩについてのデータ分析タブを示す図である。 本発明の一実施形態によるイメージャについての、手動試験と比較した場合の、一致結果を示す表である。 本発明の一実施形態によるイメージャについての、手動試験と比較した場合の、追加の一致結果を示す表である。 本発明の一実施形態によるＨＩＶＥ Ｔ６７０イメージャについての、手動試験と比較した場合の、一致結果を示す表である。 本発明の一実施形態によるＨＩＶＥ Ｔ６７０イメージャについての、手動試験と比較した場合の、追加の一致結果を示す表である。 本発明の実施形態による、ＨＡＩデータの曲線当てはめを示すグラフである。 本発明の実施形態による、従来の力価値とＩＣ_５０値とを比較するグラフである。 従来のイメージャシステムを示す図である。

図面全体を通して、同じ参照符号は、同じ構成要素、特徴及び構造を指すものと理解されるべきである。

インフルエンザのＨＡＩは、全てとは言わないものの多くのインフルエンザワクチンイニシアチブを支える重要な血清学試験である。現在では、この古典的なアッセイは、手動で行われ、全ての規制上の予想を満たしている。試験要件が増えるほど、インフルエンザの関係で使用されるか又は他のヘマグルチニン含有ウイルスの関係で使用されるかにかかわらず、インフルエンザのＨＡＩシステム及び方法の効率及びスループットを改善する必要がある。

ＨＡＩは、概して９６ウェルのＵ底又はＶ底のマイクロタイタープレート中で行われる３日間のアッセイである。１日目に、非特異的インヒビターは、ノイラミニダーゼ溶液で処理し、そして水浴中で約１８時間にわたりインキュベートすることによって試験血清から排除される。２日目に、血清試料は熱失活され、凝集素は血清から赤血球（ＲＢＣ）を用いて吸着される。２℃〜８℃での２時間のインキュベート時間後に、該ＲＢＣは、遠心分離により分離される。３日目に、対象のインフルエンザ抗原の力価測定を行って、ＨＡＩアッセイで使用するために４ＨＡＵ／２５μＬの目標値を保証する。抗原力価が検証されたら、処理された血清試料を連続希釈し、抗原と合する。血清のみの、すなわち抗原が存在しないコントロールウェルもこの時点で、最適読取り時間のための基準として後に使用するために確立される。ウイルス株に応じて、３７℃（±２℃）又は周囲温度での１時間のインキュベート後に、ＲＢＣ懸濁液を、試料及びコントロールへと添加する。

ＲＢＣ懸濁液を添加した後に、次いでそれらの試料を周囲温度で１時間にわたりインキュベートする。このインキュベートに続き、試料プレートをゆっくりと６０度〜７０度に傾け、ＲＢＣコントロールウェルの流れが「フット」パターンを生じたら、それぞれの試料希釈につき凝集状態を記録する。陰性の結果では、試料はＲＢＣコントロールと同じ速度で流れる。すなわち、完全な流れは凝集を意味せず、澄明な上清を有する。この状態は、図１の右上の四分の一区分の画像１００によって図示される。陽性の結果では、試料は赤血球凝集のためＲＢＣコントロールと同じ速度では流れない。この状態は、図１の右下の四分の一区分に位置する画像１０２によって図示される。ＨＡＩ力価は、赤血球凝集の完全な抑制を示す最高血清希釈の逆数として割り当てられる。

従来のＨＡＩ技法は、手動で、すなわち、力価測定の後にプレートを観察して、該プレートの各ウェルでの結果を判定するために特別に訓練された研究所技術者又は他の人員によって行われる。古典的なＨＡＩを手動で実施することの主な欠点の一つは、目視での読取りの主観性である。力価の割り当ては、分析者のなかでも、ＲＢＣパターンがどのように解釈されるか又はいつ解釈されるかに応じてしばしば変化する。流れるＲＢＣの素早い動態は、分析者が、プレート上の試料の全てを最適時間で読み取ること困難にする。さらに、分析者によるばらつき及び偏りは、結果の不一致をもたらすことがあり、試料の再試験が必要なこともある。

また、ＨＡＩプレートは、概して、展開の間にイメージングされず、それらの読取り後に破棄される。力価値は、手動で記録され、生データ（ＲＢＣパターン）は、アッセイの間に破棄され、それにより、他の分析者が該データをアッセイ後に検討する可能性が排除される。標準的な手動読取りＨＡＩ技術はまた、割り当てられた時間内に多数のプレートを取り扱うとともに、プレートをいつ読み取るかを把握することが必要とされる高スループット分析には適していない。例えば、３６枚の９６ウェルＨＡＩプレートという典型的な実行は、１時間未満で一人の分析者によって評価されねばならない。該プレートは、通常は、一度に３枚傾けられ、ストップウォッチも気に留めながら目視で監視される。最適読取り時間に達したら、力価を測定して、記録し、プレートを破棄し、分析者は、後続の組の３枚のプレートへと移る。ＨＡＩ試験の必要とされる容量が大きくなるほど、この状況は問題になっている。

自動ＨＡＩイメージャを提供するための少なくとも１つの既知の試みがあるが、このシステムは、手動試験に付随する問題点の少なくとも幾つかに悩まされている。図３４を参照して、この既知のシステムは、イスラエルのケフェア・サバのSciRobotics社によって販売されるＦｌｕＨｅｍａ（商標）イメージャシステムである。ＦｌｕＨｅｍａ（商標）システムは、一度に１枚のＨＡＩプレートを、すなわち表から裏に向かって、展開及びイメージングし、次いで画像分析を行って、陽性ウェル及び陰性ウェルを特定する。このシステムは、Tecan社製のＦｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ（商標）研究所用オートメーションプラットフォームと一緒に使用するために設計されている。結果として、該ＦｌｕＨｅｍａ（商標）システムのスループットは、現行の要求に応えるにはいまだ満足のいくものではない。また、ＦｌｕＨｅｍａ（商標）によって使用される、よりディストーションが高い非テレセントリックなイメージング光学系のため、該システムの効率も申し分ないものとは言えない。

米国特許第８，９６２，０１２号は、引用することによりその全体が全ての教示について本明細書の一部をなすが、それは今までに知られているものより大幅に感度が高いＨＡＩアッセイの別形を開示している。その’７０５号出願に開示されるＨＡＩアッセイは、溶液中ではなくて、特別にオプソニン化されたプレート及びＥＬＩＳＡプレートの活性化表面上で凝集を観察することを基礎としている。特に、’７０５号出願によれば、表面支援赤血球凝集／赤血球凝集抑制機能的アッセイ又は「ＳＡ−ＨＡＩ」と呼ばれる方法が開示されている。ＳＡ−ＨＡＩは、ウイルス並びにウイルス特異抗体及び血清の機能的特性分析のためのものである。様々なインフルエンザウイルスに対するＳＡ−ＨＡＩアッセイの感度は、使用されるウイルス及び赤血球のタイプに依存して、従来のＨＡアッセイより７倍〜２００倍高く、インフルエンザ特異抗体に対するＳＡ−ＨＡＩアッセイの感度は従来のＨＡＩよりも７倍〜５０倍高いことが判明した。ＳＡ−ＨＡＩは、概してイメージング技術を用いて評価されるものの、一度に１枚のウェルだけしかイメージングされない。

したがって、従来の方法論よりも高められたスループットを有し、またより一貫した確実な結果をも提供する、よりしっかりとしたＨＡＩ試験方法論が求められている。

手動ＨＡＩ試験システム及び限定的に利用可能な自動システムに関して、上述した問題及びおそらく他の問題にも対処するために、本発明の実施形態は、独自のハードウェア及びソフトウェアコンポーネントを含むＨＡＩ試験のためのイメージングの解決策を提供する。本発明の特定の実施形態は、一度に複数枚のプレートを、任意に裏から表に向かってイメージングし、低ディストーションのテレセントリックイメージング光学系を使用する。

本明細書に開示されるＨＡＩイメージングの解決策の例示的な実施形態は、コンピュータービジョン及び画像処理を使用してアッセイ読み出しを自動化するとともに、対象のウイルス株又はＲＢＣの種類とは無関係に任意のサンプルについての力価値を自動的に割り当てることにより、分析者の主観性を排除する独立型のシステムを含む。本発明の特定の実施形態は、インフルエンザ及び風疹から天然痘及びデング出血熱に至る広範囲のヒト及び動物の病気を引き起こすアデノウイルス、エンテロウイルス、レオウイルス、ミクソウイルス、ポックスウイルス及びフラビウイルスを含む多数の種々の病原性ウイルスに対して使用するように適合することができる。同様に、本発明の実施形態は、様々な種からのＲＢＣに対して使用するように適合することができる。例えば、ＷＨＯの勧告に従って、シチメンチョウ、ニワトリ及びウマのＲＢＣは、Ｖ底プレートで試験することができ、該プレートはイメージングのために傾けられ、その一方で、モルモット及びヒトのＯ型のＲＢＣは、Ｕ底プレートで試験され、フラットの状態でイメージングされ得る。１つ又は複数の実施形態と整合したシステムは、アッセイ後に評価することができる生データとして利用するためにＨＡＩプレート画像のアーカイブを生成し、概して手動の分析を上回るスループット能力を備える。

上述したように、本明細書に開示される本発明の実施形態は、ハードウェアコンポーネントとソフトウェアコンポーネントとの両方を含む。以下に、これらの個々のコンポーネントのそれぞれの例の概要を示す。

種々の実施形態は、幾つかの種々のイメージャ及びシステムの構成を含む。これらの実施形態の１つ又は複数による種々のイメージャは、本明細書においては試作機とみなされる。それというのも、それらのイメージャは、まず構想の立証のために開発されたものであり、後述する画像処理アルゴリズムを調整するための初期データを取得するために開発されたものだからである。様々なイメージャの重要な焦点合わせ領域の幾つかは、光学縦列及びプレートハンドリングシステムを含み、ここで、より重要な一般的態様の一つは、全自動イメージャである。本発明の好ましい実施形態と整合した自動イメージャの一般的なシステム要件には、限定されるものではないが、（１）１時間当たり最高１００枚のプレートが処理されること、（２）アッセイプレートが７０度の角度で傾くこと、（３）標準的なプレートスタッカに組み込まれること、（４）正確な動態分析のための全プレートイメージング、（５）即座の分析及び力価測定のためのリアルタイム画像処理、並びに（６）小さい設置面積、すなわち該イメージャは標準的な実験台にぴったりはまることが含まれる。

幾つかの試作機のイメージャは、様々な実施形態に従って開発された。これらの試作機の幾つかを以下に概説する。

図２Ａ〜図２Ｃに示される試作機１のイメージャは、ＳＡ−ＨＡＩのために過去に開発されたイメージャと似ているが、様々な重要な変更点を伴う。特に、このイメージャは、焦点合わせのためにＺ軸ステージに取り付けられた１．３メガピクセルのカメラに対してプレートを位置決めするためのＸ−Ｙ軸ステージを含むものであった。また、該イメージャには、０度から７０度まで自動的に傾けることを可能にするために回転ステージが追加された。図２Ａは、０度に傾いたイメージャを図示しており、図２Ｂは、４５度に傾いたイメージャを図示しており、そして図２Ｃは、７０度に傾いたイメージャを図示している。このイメージャは、好ましくはオートメーションラインにも組み込まれ、ロボットアームによってアクセス可能である。

試作機１のイメージャは、ＨＡＩプレートのイメージングの場合に２つの問題点を有した。第一に、カメラは、単一のウェルのイメージングだけしか可能でなく、９６ウェルプレート全体をイメージングするために約１．５分間かかった。ＲＢＣパターンの展開の素早い動態のため、この比較的遅いイメージングは、画像から力価を測定するためには理想的とは思えなかった。第二に、ＨＡＩプレートは、落射照明の構成で照明されることにより、プレートの底からの反射によるかなりのグレアが生じるため、画像分析を困難にした。

図３及び図４を参照して、試作機２のイメージャは、イメージング光学系を改善するとともに、全プレートイメージングを実施することによって、試作機１の欠点を改善している。試作機２のイメージャは、単独のスナップショットでプレート全体をイメージングする一方でディストーションを最小限にすることを試みるために高ｆ値のレンズを使用する。そのカメラは、画像処理のためにより高い解像度を提供するために少なくとも５メガピクセルのＣＭＯＳセンサである。プレートは、反射を避けるためにＬＥＤバックライトを介して落射照明ではなく透過照明の構成で照明される。該イメージャは、プレートをスライド集成装置に固定することによって手動で装填され、次に該集成装置は７０度のイメージング面へと回転する。動態のイメージングは、ＰＣで動作する特注の画像取得ソフトウェアで同時に行われる。

図３に図示されるように、試作機２のイメージャ３００はフレーム３０１を含み、そのフレームにイメージング集成装置３０２及びスライド集成装置３０３が取り付けられている。スライド集成装置３０３は、９６ウェルプレートを保持するためのプレートホルダ３０４を含む。イメージャ３００は、磁気ロック３０５及びバックライト３０６を備える。オン−オフスイッチ３０７は、イメージャ３００の電源をオンオフするために設けられる。該イメージャは、バックライト３０６に対してスライド位置を維持するために集成装置ガイド３０８を備える。該イメージャ３００はまた、イメージング集成装置３０２の角度を調節するために角度調整機構３０９を備える。図４を参照して、イメージャ３００のイメージング集成装置３０２は、高解像度イメージングＣＣＤ３１０と、１６ｍｍのＨＲレンズ３１１と、反射ミラー３１２とを含む。光学通路に関する傾斜調整装置３１３も備えている。該イメージング集成装置３０２は、シャドーイング及びプレートの媒体に付随するレンズ効果を減らすために可変軸イメージングを提供する。

図５に示されている試作機３ ５００に関して、試作機２のイメージング光学系は、画質を改善するために、大判テレセントリックレンズ及び５メガピクセルのＣＣＤセンサに置き換えられた。例えば、図６は、エッジ周りの小型レンズによるディストーション及びシャドーイングを図示しており、それにより上から下まで台形効果が起こる。図７を参照すると、テレセントリックレンズの追加が、ディストーション及びシャドーイングを減らし、プレート全体にわたって比率が維持されたことが示されている。ＨＡＩデータは、種々のインフルエンザのタイプ及びサブタイプを包含する４種のインフルエンザ抗原の手動及び自動の両方の読取り法／アルゴリズムを使用して生成され、それらの結果は一致を示した。

先の試作機のそれぞれに基づいて、好ましい一実施形態は、ＨＩＶＥ Ｔ６７０又は単にＨＩＶＥである。「ＨＩＶＥ」は、高スループットイメージング及び視覚化装置（High-Throughput Imaging and Visualization Equipment）を表し、「Ｔ６７０」は、６枚のプレートを同時に７０度に傾けることができることを指す。図８を参照して、ＨＩＶＥ８００は、ＨＡＩプレートの全自動の高スループットの動態イメージングが可能な装置である。ＨＩＶＥは、高解像度で低ディストーションのテレセントリックイメージングと、任意の所望の角度への傾斜を含む全自動のプレートハンドリングとを兼ね備えている。ＲＢＣの展開及びイメージングは、好ましくは、実質的に０度及び／又は７０度に近い傾斜角で行われる。さらに、ＨＩＶＥは、多くの種々のタイプの業界標準の自動プレートハンドラ、例えばロボットアーム、スタッカ及びクレーンと適合可能である。

次に、システムハードウェアの光学系を論ずることとする。より具体的には、図９Ａを参照すると、ＨＩＶＥイメージャ８００は、ＨＡＩプレートを、好ましくは５メガピクセル又は１１メガピクセルの解像度を有する高解像度ＣＣＤカメラ８０１を使用してイメージングする。そのカメラは、テレセントリックレンズ８０２に取り付けられており、該レンズは、最小の視差誤差及びプレート全体を包囲するのに十分な視野を有する低ディストーション画像を提供する。１つ又は複数の実施形態によれば、プレートは、該プレートを傾けつつ、例えば７０度傾けて、高均一のＬＥＤバックライト８０３によって透過照明しつつ裏からイメージングされる。調節可能な反射ミラー８０４は、光学通路を折りたたむことによって全設置面積を減少させるためにレンズとＨＡＩプレートとの間に配置される。

プレートハンドリングに関して、ＨＩＶＥは、モータ８０９によって制御される個別にアドレス可能な６つの回転ステージ８０６を備えており、該回転ステージは、電動回転式コンベア８０８に取り付けられた傾斜式プレートホルダ８０５を有し、その回転式コンベアは、プレートを装填／取り出し位置からイメージング位置まで往復循環する。スリップリング８０７は、回転式コンベア８０８とＨＩＶＥの静止した基部との間の電気的接続を提供する。図９Ａに示される実施形態によれば、ＨＩＶＥ８００は、高解像度の、例えば５メガピクセルのＣＣＤカメラ８０１を備え、該カメラは、特注のプレートホルダ８０５の上部に取り付けられており、かつテレセントリックレンズ８０２を備えている。全ての動作及びカメラ操作は、後に更に詳述されるグラフィカルユーザーインターフェース又はＧＵＩの画像取得ソフトウェアコンポーネントを介して制御される。ＨＩＶＥは、最高６枚のプレートを同時に処理し、かつ自動イメージャに関するスループットは、１時間当たり約１００枚のプレートであるか、又は例えばBioTek社製のＢｉｏＳｔａｃｋ（商標）ＮＥＯマイクロプレートハンドラと接続した場合に単独の無人運転で５０枚のプレートであり、こうして約１２０秒の典型的なプレート展開時間及び約３０秒のイメージング時間枠が見積もられる。

図９Ｂを参照すると、ＨＩＶＥデュアルモードイメージャ９００は、傾斜させずに（すなわち実質的に０度で）プレートをイメージングするために、第二の光学縦列９０１を追加することでＨＩＶＥ Ｔ６７０の能力を拡張している。その光学系は、７０度のイメージング位置の前に回転式コンベアの回転位置にて０度で全プレートイメージングするために高解像度ＣＣＤカメラ９０２及びテレセントリックレンズ９０３を含む。プレートの下にある第二のＬＥＤバックライトは、７０度のイメージングと同様に透過照明を提供する。カメラ９０２及びテレセントリックレンズ９０３は、０度のイメージング位置より上で垂直方向に、又は光学通路を折りたたむために反射ミラーを追加することでイメージング面に対して直角に取り付けられてもよい。ＨＩＶＥデュアルモードイメージャ９００は、最高３００枚のプレートを１時間当たりに水平（０度）イメージング方式で処理するか、又は例えばBioTek社製のＢｉｏＳｔａｃｋ（商標）ＮＥＯマイクロプレートハンドラと接続した場合に単独の無人運転で５０枚のプレートを処理する。傾いたイメージング方式についてのスループットは、ＨＩＶＥ Ｔ６７０についてのスループットと同一である、すなわち通常のアッセイ条件下で１時間あたり１００枚のプレートである。ＨＩＶＥ ＤＭのための用途には、一般的に傾けずに読み取られるＨＡＩアッセイ、例えばモルモット又はヒトのＯ型のＲＢＣを使用するＨＡＩアッセイだけでなく、表面支援ＨＡＩ（ＳＡ−ＨＡＩ）も含まれる。ＨＩＶＥ ＤＭは、目視読取りを使用して評価される様々なウェル形式（限定されるものではないが、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェル及び３４５６ウェル）のＳＢＳタイタープレートで行われるプラークアッセイ及びその他のアッセイをイメージングするために使用することもできる。好ましい一実施形態においては、０度のイメージング光学縦列は、考えられる広い範囲のアッセイタイプに対応するために７０度の光学縦列よりも高解像度の、例えば１１メガピクセルのＣＣＤカメラを有する。本発明の装置及び方法で使用することができる赤血球（ＲＢＣ）の出所は細胞の起源によって限定されるものではないと理解されるべきである。例えば、ヒト、ネコ、イヌ、マウス、ラット、モルモット、ウマ、ヒツジ、ブタ等を含む哺乳類種由来のＲＢＣを使用してよい。同様に、シチメンチョウ、ニワトリ等を含む鳥類種由来の細胞を使用してよい。本発明の装置及び方法で使用されるＲＢＣに相当する血液のアイソタイプも限定されない。例えば、ヒトのＡ型、Ｂ型、ＡＢ型及びＯ型由来のＲＢＣを使用してよい。

本発明の様々な例示的実施形態のソフトウェアコンポーネントをここで記載することとする。特に、該ソフトウェアコンポーネントは、画像処理アルゴリズム及びグラフィカルユーザーインターフェースの２つの主要なサブコンポーネントから構成される。該画像処理アルゴリズムは、試料の力価値を自動的に決定し、そして該グラフィカルユーザーインターフェースは、該画像処理アルゴリズムに、イメージング制御、動作制御及びデータ管理制御を組み込む。

画像処理アルゴリズムに関して、ＨＡＩタイタープレートは、全体として、同じ時点での全てのＲＢＣのウェルパターンの状態を捕らえるために、ウェル中に表から裏に向かって見るか又はウェルを通じて裏から表に向かって見るかのいずれかでイメージングされる。さらに、ソフトウェアにより制御して、傾けられたＨＡＩプレートは、しばしば、ＲＢＣの流れの動態を捕らえるために、それらの展開サイクルの間の複数の時点で、例えばプレートを傾けた後９０秒から始め、プレートを傾けた後１２０秒まで１０秒ごとにイメージングされる。該画像処理アルゴリズムは、全プレート画像におけるそれぞれ個々のウェルを認識して評価し、そしてその凝集状態を決定せねばならない。プレートにあるそれぞれのウェルについて凝集状態が決定されたら、相応の試料について力価値が評価される。図１０は、本発明の実施形態による、画像分析アルゴリズムにおける様々なプロセスステップについてのシーケンシャルタイムライン１０００を示す。最初のステップ１００１は、画像をロードして、画像が裏からの画像であったならば画像を反転するステップである。次のステップ１００２は、自動三角測量を用いて、又は記憶された測定値からウェルマスクを定義するステップである。次のステップ１００３は、グローバルなＬ^＊ａ^＊ｂセグメント化を適用するステップである。次のステップ１００４においては、画像分析アルゴリズムはそれぞれのウェルを通して反復し、そしてＲＯＩ、セグメント及び寸法を定義する。次のステップ１００５においては、該アルゴリズムは、測定値に基づきウェルを分類する。該分類には、好ましくは、凝集、凝集無し、力価及び外れ値が含まれる。ステップ１００６では、該画像分析アルゴリズムは、ウェル分類を示すプレート画像オーバーレイを生成し、そして該データを、例えばＳＱＬデータベース中に保存する。

例示的実施形態によるＨＡＩ画像処理に関するより詳細な情報を、図１１のフローチャート１１００に図示する。示されるように、最初のステップ１１０１は、処理用の画像、すなわちプレートを選択するステップである。典型的には、ＨＡＩプレートは、ＲＢＣの流れ動態を捕らえるために、それらの展開サイクルの間の複数の時点で、例えば傾けた後にイメージングされる。分析されるべき画像は、この動態画像のコレクションから、手動か又は最適な読取り時間に最も近くで取得された画像を選択するアルゴリズムを使用するかのいずれかで選択せねばならない。手動での選択は、データベース中の画像のテーブルから対象のプレート画像を強調表示することによって行われる。以下でより詳細に述べられるように、最適時点アルゴリズムは、コントロールウェルパターンを分析し、該パターンを参照パターンと比較する画像処理を使用して最適画像を自動的に決定する。画像が選択されると、その画像はステップ１１０２の画像処理アルゴリズムへとロードされる。この画像は、全プレート画像であるので、次のステップ１１０３は、画像中の処理する必要がある個々のウェルの全てが位置決めされたウェルマスクを定義するステップである。

ウェルの位置を定義するには２つのモード、すなわち、ユーザがウェルの位置を定義する手動モード、及び、例えば三角測量技法を用いたアルゴリズムが使用される更なる自動モードが存在する。手動モードはユーザに依存しており、９６ウェルプレートについて、或る特定のウェル、例えばウェルＡ１、Ａ１２及びＨ１２の重心及び半径は、プレート画像上で丸印をそれらの輪郭に合わせることによってインタラクティブに定義される。次いで、全ての他のウェルの中心は、これらの３つの点から計算される。

ステップ１１０４で、ウェル番号は１にセットされる。ステップ１１０５で、アルゴリズムは、プレート中の９６個のウェルの全てが処理されたかどうかを確かめる。全てのウェルが処理されたら、メソッドは、ステップ１１０６へと続く。処理すべきウェルがまだ存在するのであれば、メソッドは、画像をウェル対象領域（ＲＯＩ：region of interest）に切り取るステップ１１０７へと続く。ステップ１１０８で、Ｌ^＊ａ^＊ｂカラーセグメント化が適用される。ステップ１１０９で、ＲＢＣパターンの幾つかの特徴が測定される。これらの特徴は、好ましくは、凝集状態に応じて様々である。ステップ１１１０で、赤血球凝集パラメーターが計算される。ステップ１１１１で、凝集状態に従ってウェルが分類される。ステップ１１１２で、ウェル番号がインクリメントされた後、メソッドは、ステップ１１０５に戻る。

ステップ１１０６で、メソッドは力価を割り当てるとともに、外れ値を定義する。ステップ１１１３で、メソッドは、ウェル分類を示すプレート画像オーバーレイを生成する。ステップ１１１４で、データは、例えばＳＱＬデータベースに保存される。

自動的ウェル定義アルゴリズムは、同じ原理を利用するが、重心の検出のためには画像分析を使用する。ウェル定義アルゴリズムに関する更なる詳細を以下に示す。ウェルの位置が決定された後で、次のステップは、ウェルのＲＢＣパターンのそれぞれを繰り返し処理して、それらの凝集状態を決定するステップである。本発明の実施形態によるウェルパターンを処理する一般的なステップは、（１）画像を、ＲＢＣパターンを含む対象の領域に切り取るステップ、（２）ＲＧＢ画像を、例えばＣＩＥＬＡＢによって定義されるＬ^＊ａ^＊ｂ^＊（Ｌａｂ）色空間（ここで、次元Ｌは、明度を示し、かつａ及びｂは、非線形圧縮されたＣＩＥ ＸＹＺ色空間座標を基礎とする補色次元を表す）に変換して、ＲＢＣパターンを画像残部からセグメント化する事前に定義されたゲートを適用するステップ、並びに（３）凝集状態に応じて様々なＲＢＣパターンの幾つかの特徴を測定するステップである。これらの特徴は、画像モーメントから導かれ、ＲＢＣの流れの長さＬ、最下部のピクセルの位置Ｂ及びＹ軸における加重重心Ｙを含む。これらの測定値が取得された後に、赤血球凝集パラメーターは、方程式１：
ＨＡ_Ｐ＝Ｌ×Ｂ×Ｙ （方程式１）
に従って計算される。

次いで、赤血球凝集パラメーター（ＨＡ_Ｐ）を使用して、詳細に後述されるように、ウェルを凝集又は凝集無しとして分類する。凝集状態がプレートのそれぞれのウェルについて決定された後に、力価値は、それぞれの試料希釈列について、凝集されていない最高希釈率の逆数として割り当てられる。試料希釈列が、例えばピペット操作の誤りのため、不連続の凝集状態又は無効なコントロールウェルのような外れ値を示すのであれば、それらの試料は、アルゴリズムによってフラグが立てられ、力価値は割り当てられない。力価の割り当て及び外れ値の検出に引き続き、擬似カラーのプレート画像オーバーレイを適用して、該アルゴリズムによって決定されたウェル分類が描画される。次いで、全ての計算値は、将来的な検索のために１つ又は複数のリレーショナルデータベースプログラムによって認識することができるフォーマットで記憶装置に記憶される。

上述のＬ^＊ａ^＊ｂ^＊色空間におけるＲＢＣパターンのセグメント化に関して、ＲＢＣパターンをプレート画像から分離するためにカラーセグメント化が使用される。オリジナルのＲＧＢ画像は、まずはＬ^＊ａ^＊ｂ^＊色空間に変換され、次に事前に定義された「ゲート」と比較される。このカラーゲートは、多数の、例えば何千ものウェルから複合Ｌ^＊ａ^＊ｂ^＊色空間ゲートを生成し、ＲＢＣに対応するピクセルの位置を記録することによって、手動で定義される。図１２は、本発明の１つ又は複数の実施形態による例示的なＬ^＊ａ^＊ｂ^＊色空間マップを図示している。そのゲートが定義されていれば、ＲＢＣパターンのセグメント化は、該ゲート内に含まれないピクセルを破棄することによって実現される。

最適時点アルゴリズム
最適時点アルゴリズムの目標は、プレートの展開の間に取得される動態画像のコレクションから最適なプレート画像を決定することである。少なくとも１つの実施形態によれば、ＲＢＣコントロールパターンがウェルの下部に流れて、例えば図１３に示されるように「フット」として形成された時点として定義される最適読取り時間にわたって分析者がＲＢＣコントロールウェルを観察することをまねることによってこれが実現される。

少なくとも１つの実施形態による例示的な時点アルゴリズムのプロセス１４００を、図１４に図示する。示されるように、該アルゴリズムは、選択されたプレートについての動態画像のコレクションを通じて繰り返し、ＲＢＣコントロールウェルだけを処理することで、それぞれのＲＢＣコントロールについて、ＲＢＣ流れの長さＬ、最下部のピクセルの位置Ｂ、ウェルの面積Ａ、周囲長Ｐ、等価直径Ｄ、Ｙ軸における加重重心Ｙ、及び真円度Ｃが決定される。次いで、これらのパラメーターのそれぞれについて測定された値は、最適値として手動で選択された多くの、例えば何千ものＲＢＣコントロールウェルから導かれた平均である参照パラメーターに正規化される。この特定の正規化スキームの基本原理は、測定されたパラメーターが参照パラメーターに近づくにつれ、正規化されたパラメーターの値、又はより具体的にはそれらの比率が、単位的に、すなわち１に近づくということである。

ＲＢＣコントロールウェルについての正規化されたパラメーターの全てが１に最も近い場合に、そのウェルにおけるパターンは、参照に最も近い、従って最適読取り時間に最も近いと決定される。全ての正規化パラメーターの値は、最適時点でほぼ等しい、例えばそれらが１に近づくので、それらの値の標準偏差は、所定のＲＢＣパターンが最適にどれほど近いかという単独の数的指標を与える。一般的に、或るプレート内の複数のＲＢＣコントロールウェルは、通常の実験のばらつきのため僅かに異なる速度で展開することとなる。例えば、図１７及び図１８は、同じプレートの８つのＲＢＣコントロールウェルについての最適読取り時間及び標準偏差のそれぞれのばらつきを示している。特定の実施形態においては、最適読取り時間は、プレートを０度から７０度まで傾けた後の約１００秒〜約１２５秒である。プレートの全体の状態を評価するために、全ての標準偏差値の平均が考慮される。ＲＢＣコントロールウェルの正規化されたパラメーターの最も低い平均標準偏差を有する画像は、したがって最適時点に最も近い。ＲＢＣコントロールウェルについての、時間プロットに対する典型的な平均標準偏差が、図１５に示される。

イメージング時点に応じた正規化パラメーターの挙動を、図１６Ａ〜図１６Ｃにおいて、３つのそれぞれの異なる事例について、すなわち凝集無し（図１６Ａ）、凝集の始まり（図１６Ｂ）及び凝集（図１６Ｃ）について示す。図１６Ａに示されるように、正規化されたパラメーターは、１００秒のイメージング時点で凝集していない事例の場合に１の値にぴったり収束する。これは、参照との近接によるものである。正規化されたパラメーターの収束は、図１６Ｂに示される凝集が起こり始めている場合については大きさがより小さく、図１６Ｃにおいて凝集していない事例の場合には収束は認められない。図１９Ａ及び図１９Ｂは、他のパラメーター、例えばＨＡパラメーター（上記方程式１によって計算される）及び平均標準偏差が、時間及び凝集状態に応じてどれ程変動するかを示している。

自動ウェル定義アルゴリズム
本発明の実施形態による自動ウェル検出アルゴリズムを、図２０に説明する。このアルゴリズムは、例えば９６ウェルプレートについてのウェルＡ１、Ａ１２及びＨ１２の重心及び半径を、画像分析を通じてウェルを含む領域に円のハフ変換を適用することによって繰り返し計算する。次いで判明した重心及び半径を使用して、該プレートの残りのウェルの位置が計算される。

凝集状態分類アルゴリズム
本発明の実施形態によって、凝集状態は、図２１のフローチャート２１００で説明されるアルゴリズムを使用して分類される。図示される実施形態によれば、ウェルは、凝集又は凝集無しのいずれかとして分類される。ＨＡパラメーターを計算した後に、該分類アルゴリズムは、そのＨＡパラメーターがプリセットされた限界に対してどこにあるかを決定する。これらのプリセットされた限界は、数値的結果と多くの試料の手動分析との突き合わせから先験的に決定される。ＨＡパラメーターが下限値より小さければ、そのウェルは凝集として分類される。ＨＡパラメーターが上限より高いと決まれば、そのウェルは凝集無しとして分類される。ＨＡパラメーターの値が下限値と上限値との間に含まれる場合に、その状態の決定のためにウェルパターンに対して追加の分析が行われる。

より具体的には、追加の画像処理を最初に行うことで、ＲＢＣの流れがウェルの壁部に触れるか又は重なるかどうかが決定される。この決定は、例えば図２２に図示されるように、エッジ検出アルゴリズムを使用することによって行われる。その壁部と流れとの重なりが検出されると、そのウェルは、凝集無しとして分類される。それ以外は、ウェルは、凝集として分類される。引き続き、二次中心画像モーメントをプリセットされた閾値と比較することで、ＲＢＣパターンがダイアモンド形状を示すかどうかが決定される。その閾値を超えると、そのウェルは、凝集として分類される。最後に、ＲＢＣパターンのフットの近くのピクセルを調査することで、そのフット強度が十分であるかどうかが決定される。低いフット強度を有するパターンは、凝集として分類される。

グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）
自動イメージング及び分析の、全てではないが多くの態様は、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）によって組み込まれる。本明細書に明白に開示される例示的な実施形態によるＧＵＩは、３つの主要な領域、すなわち画像取得、画像分析及びデータ管理に分けられ、そのそれぞれは、以下で詳細に説明される。

画像取得
１つ又は複数の実施形態によるＧＵＩの画像取得コンポーネントは、ユーザに指定された時点で全プレート画像を取得し、それらの画像をリレーショナルデータベースにそれらのメタデータと一緒に保存する役割を果たす。

実行スケジューラは、画像取得コンポーネントと一緒に動作する。該スケジューラは、展開時間、イメージング時間枠、イメージング間隔及びプレートの数等の所望のプレートイメージングの動態に対するユーザ入力を取得し、所定の数のプレートについてユーザ要求を実現するために最適な動作制御操作を決定する。該スケジューラによって生成されたスケジュールを使用して、画像取得の実行の間に動作ハードウェア及びイメージングハードウェアが制御される。

典型的なタイミング図は、図２４及び図２５に示される。図２４及び図２５に示される図は、６枚のプレート及び３６枚のプレートのそれぞれについて、通常の動態入力パラメーターを考慮している。上述のＨＩＶＥイメージャは、例示的な実施形態による通常の動作条件下で一時間に約１００枚のプレートを処理する。

実行の間に、実行完了パーセンテージ、現在のプレート角度及び展開時間並びに動態イメージング状態等の関連情報が、画像取得インターフェースによって表示される。図２３は、画像取得の間にユーザに表示されるＧＵＩ上の例示的なタブを図示する。この実施形態によれば、イメージングされている現在のプレートの映像データが表示されるため、ユーザは、展開プロセスをリアルタイムにコンピュータモニタで観察することができる。更なる実施形態によれば、プレート画像が取得されると、サムネイル画像も表示される。例えばサムネイル画像をクリックすると、ＧＵＩの映像ウィンドウにより大きい画像がロードされ、特定のプレート情報及び実行情報も表示される。

図２４及び図２５は、本発明の実施形態による、６枚のプレート及び３６枚のプレートのそれぞれの自動イメージングに関する例示的なタイミング図を図示している。

画像分析
この実施形態及び他の実施形態によるＧＵＩの画像分析コンポーネントは、画像処理アルゴリズムを、取得された全プレート画像に適用し、結果の視覚的表示をオーバーレイされたプレートマスクの形で提供する。図２６は、この実施形態による画像分析の間に表示されることとなる例示的なスクリーンショットを示す。示されるように、該プレートマスクは、凝集状態、力価値、外れ値、試料番号、希釈を示し、また抗原及び画像取得時間等のメタデータも含んでいる。手動モードでは、ユーザはプレートを手動で分析し、力価値及び外れ値をマークし、プレートマスクにメモを追加することができる。分析結果は、数値に対するヒートマップとして又は強度マップとして閲覧することもできる。プレート画像のデータベースを、インタラクティブかつフィルタ可能なテーブルを使用してマイニングすることで、ユーザが抗原、分析者、タイムスタンプ及び／又は実験等の幾つかのメタデータカテゴリを基礎として対象のプレート画像に素早くアクセスすることができるようになる。

上述の画像分析の様々な実施形態と一貫して、プレート画像は、幾つかの種々の選択可能な分析モード、すなわち手動分析、自動単一プレート分析、バッチ分析及び全自動分析を使用して分析される。

手動分析モードでは、ユーザはウェル画像上の力価ポイントを、例えば対象の特定のウェル上で左クリックすることによって手動でマークすることが可能である。外れ値のウェルは、例えばこれらのウェル上で右クリックすることによって指定される。指定又はマークされたウェルは、例えばそれらの外周を取り囲む色つき及び／又は点線の丸印によって区別される。その際に、結果はデータベースに保存され、所望であれば後続のセッションにおいて検索することができる。この実施形態及び他の実施形態による自動単一プレート分析モードは、選択された単一プレートの分析をもたらし、力価値及び凝集状態を返す。バッチ分析モードによれば、定義されたバッチ内に含まれる全てのプレート画像は、連続的に分析される。分析の進捗は、ユーザに、プログレスバー及びそのプレートが残りのプレートと同様に分析されることを示すステータスメッセージによって示される。全自動分析モードは、最適時点アルゴリズムを使用してプレートを処理する。このモードが使用される場合に、処理は、単一プレートからの画像又はプレートの全実行からの画像に対して行うことができる。

更なる実施形態によれば、分析の結果を閲覧するために、幾つかの異なる閲覧モード、すなわちプレートマスク、強度マップ、ヒートマップ及びグラフが、分析タブ（例えば図２６に示される）で実行される。

プレートマスクは、ウェルの凝集状態、力価値、ＲＢＣコントロールの妥当性及び断続的な凝集状態による外れ値を指示する擬似カラーオーバーレイである。該プレートマスクはまた、それぞれのカラムについての希釈倍率と、それぞれの列についての試料番号と、例えば分析者名、プレートタイムスタンプ、使用した抗原及びカスタムノートのための領域を含むメモセクションとをオーバーレイする。強度マップは、全てのウェルからのセグメント化されたＲＢＣパターンの、ピクセル強度に応じて濃淡が付けられた擬似カラー画像である。この画像は、例えばアルゴリズムがこのパターンをどのようにセグメント化しているかを閲覧するために有用であり、かつアルゴリズムが力価値をどのように割り当てているかの見通しをもたらす。ヒートマップは、対応するウェルのＨＡパラメーター値によって定義されるそれぞれのセクションの色による、ＨＡＩプレートの８×１２グリッドの表示である。ヒートマップは、試料の凝集の始まりを可視化するために有用である。それというのも、凝集無しから凝集へと遷移する間に色変化が観察されるからである。最後に、選択されたプレートについてのデータ、すなわちＲＢＣコントロールウェルの標準偏差値、試料の力価値及び用量応答曲線等のデータを表示するために、この実施形態による分析タブにはグラフセクションが含まれる。

データ処理
本発明の実施形態によれば、データ管理ＧＵＩコンポーネントは、画像分析コンポーネントによって生成されたデータのマイニング及びエクスポートのための制御を提供する。図２７は、この実施形態に整合した、ユーザに表示される例示的なデータ分析タブのスクリーンショットである。例えば、示されるインタラクティブかつフィルタ可能なテーブルは、実行→プレート→試料→力価の階層構造内でメタデータに基づきデータサブセットを作成及びエクスポートする能力を提供する。この実施形態及び他の実施形態により提供されるエクスポート制御は、事前に書式付けられた独自のＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ又は幾つかの他のフォーマットのレポートを、リレーショナルデータベースから直接的に生成する。更なる実施形態によれば、データは、独自の書式のｐｄｆレポートでエクスポートされる。

構成
データ分析設定、機器設定及びユーザのロールの構成は、ＧＵＩ内に生成されたタブベースのメニューを通じて操作される。例えば、１つ又は複数の実施形態によれば、上述の画像処理アルゴリズムで使用される全てのパラメーターは、「分析設定」メニューで定義される。ハードウェア設定、例えばステージオフセット、カメラ設定及び通信ポートは、設定メニューの「ハードウェア」タブを介して制御及び定義される。さらに、少なくとも１つの実施形態によれば、ソフトウェアは、３種の異なるユーザのロール、すなわち一般、マネージャ及び管理者をサポートしている。特定のユーザについての、これらの各ロールのそれぞれについてのパーミッション並びに設定は、設定メニューの「ユーザ」タブを介して制御及び定義される。

試験の間に、幾つかの異なるインフルエンザ抗原についての多量の動態画像データは、本明細書に開示される様々な実施形態に従って上述の試作機及びＨＩＶＥイメージャを使用して取得された。このデータを使用することで、開示された画像処理アルゴリズムは進展及び洗練され、更にハードウェアについての機器設計要件が定義された。一致試験は、試作機３及びＨＩＶＥイメージングシステムを使用した実施形態によって、それぞれ資格のある異なる分析者及び異なるロットのシチメンチョウの赤血球による２つの独立したアッセイの実行において実施された。１抗原当たり１試料につき全体で２つの結果が、それぞれの、すなわち手動及び自動の読取り法で生じた。自動化された力価の割り当ては、開示されたアルゴリズムによって、開示された最適時点アルゴリズムにより定義される最適静止画像を使用して定義された。試料パネルは、２０１２年〜２０１３年のインフルエンザワクチンによるワクチン接種前及び接種後からの３０組の血清試料を含む６０個のヒト血清試料からなるものであった。試験された抗原は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ及びエーテル処理されたＢを含んでいた。結果の統計分析は、個々のアッセイの実行の標準的な一致分析及び両方のアッセイの実行の幾何平均力価（ＧＭＴ）、血清陽性率のパーセント、血清変換のパーセント及びＧＭＴ比（ＧＭＴＲ、後／前）を含むヒト用医薬委員会（ＣＨＭＰ）の基準、並びに個々の読取り法を使用する精度の分析を含むものであった。ＲＢＣの流れの手動読取りの現在の方法と、本発明の実施形態によるイメージャを使用した自動分析との間の一致分析は、広範囲のインフルエンザ株に関して優れた一致を示した。図２８及び図２９の表に示されるデータは、試作機３のイメージングシステムを使用した実施形態が使用される場合に、様々なインフルエンザ株についての手動分析と自動分析との間の高いレベルの一致を裏付けている。図３０及び図３１の表に示されるデータは、ＨＩＶＥイメージングシステムを使用した実施形態が使用される場合に、手動分析と自動分析との間の更により高いレベルの一致を裏付けている。本発明の実施形態によるイメージャを使用した手動読取り法と自動読取り法との間の一致は、Ｂ／湖北省伍家崗区（Hubei-Wujiagang）／１５８／２００９（完全体とエーテル処理されたものとの両方）だけでなくＢ／フロリダ（Florida）／０４／２００６を含む他の株についても実証された（データは示さず）。本明細書に開示される様々なアルゴリズムは、株への依存も示さなかった。それというのも、限界、閾値及びカラーゲート等のアルゴリズムパラメータは、それぞれのイメージャで試験された全ての株について固定されているからである。

画像処理は、定量的な測度を凝集状態に割り当てることによる従来の分析と比較して、ＨＡＩを分析するために拡張された能力を提供する。ＨＡＩ試料希釈列は、これらの数値（ＨＡパラメーター）を使用して用量応答曲線に当てはめることができる。例えば図３２に示されるように、該用量応答曲線は、従来報告された離散した値を本質的に内挿して、連続的な力価値を割り当てることを可能にする。それにより、凝集が始まるときの実際の力価のより大きな精度とより正確な描写とがもたらされる。

得られた曲線は、或る一定量によってアゴニスト活性を阻害するために必要とされるインヒビター又はアンタゴニストと呼ばれる物質の濃度、通常は半値最大阻害濃度又はＩＣ_５０として報告される濃度を測定するために有用な阻害応答曲線と類似している。ＨＡＩの場合には、該ＩＣ_５０値は、ＨＡパラメーターを半分まで下げるのに必要とされる試料の希釈倍率を言う。ＨＡパラメーターは凝集状態と関連しているので、その際に、ＩＣ_５０値は、凝集又は凝集無しの離散した分類ではなく、凝集の度合いに基づき試料を分類するための手段を提供する。例えば図３２における用量応答曲線は、それぞれ異なる血清試料についての希釈列を表している。それぞれの曲線についての相応のＩＣ_５０値は、試料についての従来の離散した力価値と一緒に図３３でプロットされている。注目すべきことは、試料２及び試料３では、従来の力価値は３２０と同じ値を有するが、ＩＣ_５０値が大きく異なることである。これらの試料についての用量応答曲線の間の差異は、図３２で裏付けられている。その図では、試料３についての曲線が、試料２についての曲線と比較して右にずれており、これは、それらの試料が異なる凝集活性を示すことを示唆している。しかしながら、それらの従来の力価値は、離散した値を割り当てるための基準に基づくと同じである。この場合に、該用量応答曲線及びＩＣ_５０値は、試料の凝集状態のより完全な表現をもたらす。

得られた曲線は、或る一定量によってアゴニスト活性を阻害するために必要とされるインヒビター又はアンタゴニストと呼ばれる物質の濃度、通常は半値最大阻害濃度又はＩＣ_５０として報告される濃度を測定するために有用な阻害応答曲線と類似している。ＨＡＩの場合には、該ＩＣ_５０値は、ＨＡパラメーターを半分まで下げるのに必要とされる試料の希釈倍率を言う。ＨＡパラメーターは凝集状態と関連しているので、その際に、ＩＣ_５０値は、凝集又は凝集無しの離散した分類ではなく、凝集の度合いに基づき試料を分類するための手段を提供する。例えば図３２における用量応答曲線は、それぞれ異なる血清試料についての希釈列を表している。それぞれの曲線についての相応のＩＣ_５０値は、試料についての従来の離散した力価値と一緒に図３３でプロットされている。注目すべきことは、試料２及び試料３では、従来の力価値は３２０と同じ値を有するが、ＩＣ_５０値が大きく異なることである。これらの試料についての用量応答曲線の間の差異は、図３２で裏付けられている。その図では、試料３についての曲線が、試料２についての曲線と比較して右にずれており、これは、それらの試料が異なる凝集活性を示すことを示唆している。しかしながら、それらの従来の力価値は、離散した値を割り当てるための基準に基づくと同じである。この場合に、該用量応答曲線及びＩＣ_５０値は、試料の凝集状態のより完全な表現をもたらす。
項１．
抗体の機能的結合活性を測定する方法であって、
凝集素及び前記抗体からなる試料を準備することと、
前記対象物の前記凝集素による凝集を可能にする条件下で対象物を前記試料に添加することと、
前記対象物が添加された前記試料の画像を準備することと、
前記対象物の凝集を決定するために、前記画像をプログラムされた処理装置において処理することと、
を含む、方法。
項２．
前記試料及び前記対象物は、複数のウェルを有する培養プレート内に一緒に配置され、
かつ各ウェルは、それぞれの試料及び或る量の前記対象物を含む、項１に記載の抗体の機能的結合活性を測定する方法。
項３．
前記画像には、ウェル各々についての画像データが含まれる、項２に記載の抗体の機能的結合活性を測定する方法。
項４．
前記培養プレートを或る角度で傾けることと、
前記プレートを光源で照射することと、
を更に含む、項３に記載の抗体の機能的結合活性を測定する方法。
項５．
前記角度は、約０度又は約７０度である、項４に記載の方法。
項６．
それぞれの複数のウェルを各々有する複数のプレートは、独立して、自動的にイメージング及び処理される、項２〜５のいずれか一項に記載の抗体の機能的結合活性を測定する方法。
項７．
６枚までのプレートが同時に傾けられる、項６に記載の方法。
項８．
前記プレートは、裏から表に向かってイメージングされる、項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
項９．
前記対象物を有する前記試料の画像を準備することは、単数又は複数の前記培養プレートを１つのテレセントリックレンズを用いてイメージングすることを含む、項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
項１０．
抗体の結合活性を測定するシステムであって、
カメラとレンズとミラーとを含む光学通路と、
回転テーブルであって、該回転テーブルは複数のプレート保持ステーション及び該回転テーブルを回転させて、該プレート保持ステーションのいずれかを前記光学通路と一直線になるように移動させるように適合されたテーブル用モータを含み、前記プレート保持ステーションは、
試験ウェルのアレイを含むプレートを保持するように適合されているプレートホルダと、
該プレートホルダの傾斜角を調整するように適合されている傾斜モータと、
を含む、回転テーブルと、
前記テーブル用モータ、傾斜モータ及び前記少なくとも１つのプレートの少なくとも１つの画像を取得するためのカメラを制御するように適合されているコントローラと、
を含む、システム。
項１１．
前記プレート保持ステーションは、前記プレートを照明するように適合されているバックライトを更に含む、項１０に記載のシステム。
項１２．
前記プレートホルダは実質的に７０度まで傾けるように、かつ前記プレートホルダが傾けられてからの事前に決められた時間後に前記プレートの画像を取得するように、前記コントローラは、前記傾斜モータを制御する、項１０に記載のシステム。
項１３．
前記システムは、カメラと、レンズと、ミラーとを含む第二の光学通路を更に含み、前記第二の光学通路は、傾けられていないプレートの画像を取得するために配置されている、項１０に記載のシステム。
項１４．
前記カメラは、ＣＣＤカメラである、項１０に記載のシステム。
項１５．
前記ＣＣＤカメラは、少なくとも５メガピクセルのイメージセンサを有する、項１４に記載のシステム。
項１６．
前記レンズは、テレセントリックレンズである、項１０に記載のシステム。
項１７．
前記カメラから取得された画像を受け取り、前記画像を分析することで、プレートの試験ウェルの実質的に全てについての凝集状態を決定するように適合されている演算機を更に含む、項１０に記載のシステム。

Claims (17)

1. 抗体の機能的結合活性を測定する方法であって、
   凝集素及び前記抗体からなる試料を準備することと、
   前記対象物の前記凝集素による凝集を可能にする条件下で対象物を前記試料に添加することと、
   前記対象物が添加された前記試料の画像を準備することと、
   前記対象物の凝集を決定するために、前記画像をプログラムされた処理装置において処理することと、
   を含む、方法。
2. 前記試料及び前記対象物は、複数のウェルを有する培養プレート内に一緒に配置され、かつ各ウェルは、それぞれの試料及び或る量の前記対象物を含む、請求項１に記載の抗体の機能的結合活性を測定する方法。
3. 前記画像には、ウェル各々についての画像データが含まれる、請求項２に記載の抗体の機能的結合活性を測定する方法。
4. 前記培養プレートを或る角度で傾けることと、
   前記プレートを光源で照射することと、
   を更に含む、請求項３に記載の抗体の機能的結合活性を測定する方法。
5. 前記角度は、約０度又は約７０度である、請求項４に記載の方法。
6. それぞれの複数のウェルを各々有する複数のプレートは、独立して、自動的にイメージング及び処理される、請求項２〜５のいずれか一項に記載の抗体の機能的結合活性を測定する方法。
7. ６枚までのプレートが同時に傾けられる、請求項６に記載の方法。
8. 前記プレートは、裏から表に向かってイメージングされる、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記対象物を有する前記試料の画像を準備することは、単数又は複数の前記培養プレートを１つのテレセントリックレンズを用いてイメージングすることを含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 抗体の結合活性を測定するシステムであって、
    カメラとレンズとミラーとを含む光学通路と、
    回転テーブルであって、該回転テーブルは複数のプレート保持ステーション及び該回転テーブルを回転させて、該プレート保持ステーションのいずれかを前記光学通路と一直線になるように移動させるように適合されたテーブル用モータを含み、前記プレート保持ステーションは、
    試験ウェルのアレイを含むプレートを保持するように適合されているプレートホルダと、
    該プレートホルダの傾斜角を調整するように適合されている傾斜モータと、
    を含む、回転テーブルと、
    前記テーブル用モータ、回転モータ及び前記少なくとも１つのプレートの少なくとも１つの画像を取得するためのカメラを制御するように適合されているコントローラと、
    を含む、システム。
11. 前記プレート保持ステーションは、前記プレートを照明するように適合されているバックライトを更に含む、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記プレートホルダは実質的に７０度まで傾けるように、かつ前記プレートホルダが傾けられてからの事前に決められた時間後に前記プレートの画像を取得するように、前記コントローラは、前記傾斜モータを制御する、請求項１０に記載のシステム。
13. 前記システムは、カメラと、レンズと、ミラーとを含む第二の光学通路を更に含み、前記第二の光学通路は、傾けられていないプレートの画像を取得するために配置されている、請求項１０に記載のシステム。
14. 前記カメラは、ＣＣＤカメラである、請求項１０に記載のシステム。
15. 前記ＣＣＤカメラは、少なくとも５メガピクセルのイメージセンサを有する、請求項１４に記載のシステム。
16. 前記レンズは、テレセントリックレンズである、請求項１０に記載のシステム。
17. 前記カメラから取得された画像を受け取り、前記画像を分析することで、プレートの試験ウェルの実質的に全てについての凝集状態を決定するように適合されている演算機を更に含む、請求項１０に記載のシステム。