JP2017517269A - アミロイドベータ発現構築物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
アルツハイマー病は、神経原線維変化およびアミロイドベータペプチドを含有する斑によって特徴付けられる神経変性疾患である。アルツハイマー病の患者は、進行性痴呆および人格障害を示す。アミロイド前駆体タンパク質(APP)のタンパク質分解切断は、38〜49個のアミノ酸の範囲に及ぶ(例えば、38〜43個のアミノ酸)長さを有するアミロイドベータペプチドの生成をもたらす。アミロイドベータ1〜42のペプチドは、特に自己凝集化する傾向があり、アルツハイマー病の発症に強く結びついている。
本発明は、少なくとも一部は、シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質とを含有するポリペプチドをコードする酵母発現構築物が、酵母細胞中で発現されるとき、著しい毒性をもたらし得るとの発見に基づいている。本発明は、少なくとも一部は、選択されたシグナル配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質とを含有するポリペプチドをコードする哺乳動物発現構築物が、哺乳動物細胞中で発現されるとき、著しい毒性をもたらし得るとの発見に基ついている。この発見は、アミロイドベータ誘導性毒性を調節する化合物または遺伝因子を特定するためにアミロイドベータ発現細胞を用いる、スクリーニングアッセイの実行を可能にする。このようなスクリーニングによって特定された化合物は、アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療または予防に使用することができる。
本明細書に記載される発現構築物およびアミロイドベータ発現細胞は、アミロイドベータ誘導性毒性を調節する化合物または遺伝因子を特定するために使用することができる。このようなスクリーニングによって特定された化合物は、アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療または予防に使用することができる。
アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する候補化合物およびアミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定するための組成物および方法が、本明細書に記載される。本明細書に記載される組成物および方法で使用される酵母発現構築物は、シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質(すなわち、ヒトアミロイドベータペプチド)とを含有する。本明細書に記載される組成物および方法で使用される哺乳動物発現構築物は、選択されたシグナル配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質とを含有する。
他の実施形態では、ヒトアミロイドベータのアミノ酸1〜48は、本明細書に記載されるアミロイドベータペプチドの骨格鎖として用いられる。ヒトアミロイドベータのアミノ酸1〜48は、以下の通りである。
他の実施形態では、ヒトアミロイドベータのアミノ酸1〜49は、本明細書に記載されるアミロイドベータペプチドの骨格鎖として用いられる。ヒトアミロイドベータのアミノ酸1〜49は、以下の通りである。
本明細書に記載される組成物および方法で使用することができる酵母としては、サッカロミセス・セレヴィシエ、サッカロミセス・ウバエ、サッカロミセス・クルイベリ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、クルイベロミセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ、ピチア・パストリス、ピチア・メタノリカ、ピチア・クルイベリ、ヤロウイア・リポリティカ、カンジダ菌種、カンジダ・ウティリス、カンジダ・カカオイ、ジオトリチュム菌種、またはジオトリチュム・フェルメンタンスが含まれるが、これらに限定されない。本明細書の論議のほとんどは、異常に切断されたタンパク質を異所性発現するサッカロミセス・セレヴィシエに関するが、これは、単に例示的な目的にすぎない。他の酵母株が、S.セレヴィシエに代わることができる。
アミロイドベータ核酸は、プラスミド、線状核酸分子、人工染色体、およびウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない核酸ベクターを用いて、哺乳動物細胞中にトランスフェクトすることができる。ベクターは、本明細書に記載されるアミロイドベータ核酸のいずれかを導入遺伝子として含有することができる。
本明細書に記載される方法のいずれかを用いて、スクリーニングされ、または特定される化合物は、様々な化学的部類を含むことができるが、通常は、50〜2,500ダルトンの範囲の分子量を有する小分子である。これらの化合物は、タンパク質との構造的相互作用(例えば、水素結合)に必要な官能基を含むことができ、通常、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含み、化学官能基の少なくとも2つを含むことが好ましい。これらの化合物は、多くの場合、上記官能基の1つ以上で置換された、循環式炭素または複素環式構造および/もしくは芳香族またはポリ芳香族構造(例えば、プリンコア)を含む。
細胞中のアミロイドベータ誘導性毒性またはアミロイドベータ凝集体の形成を予防または抑制することが見出された化合物は、例えば、アルツハイマー病などの神経変性疾患を治療するための対象への投与のために、薬学的組成物として製剤化することができる。
酵母中の接合因子アルファ1遺伝子は、プレプロ−アルファ因子と呼ばれる、165個のアミノ酸の前駆体タンパク質をコードする。プレプロ−アルファ因子は、19個のアミノ酸のシグナルペプチドと、64個のアミノ酸のプロ領域と、アルファ因子配列の4個のタンデムリピートからなり、それぞれは、特徴的なタンパク質分解切断部位を有するスペーサペプチドを前に置く。前駆体タンパク質は、成熟した13個のアミノ酸の長さのペプチドフェロモンであるアルファ因子を生成するために、細胞の分泌経路において、一連の連続的かつ画定された翻訳後酵素的修飾およびタンパク質分解処理ステップを受ける。新生プレプロ−アルファポリペプチドは、ERの内腔中に転位され、ここで、シグナル配列が、シグナルペプチダーゼによって切断され、プロ−アルファ因子を生成する。ER内腔において、N−結合炭水化物が、プロ領域内の3つの特異的グリコシル化部位に添加され、これは、ERからゴルジ体へのプロ−アルファ因子の輸送にとって必要不可欠であるステップである。更なる炭水化物修飾が、最終タンパク質分解処理ステップの前に、ゴルジ体中で起こる。これらの3つのタンパク質分解処理のうちの第1のものは、スペーサリピート
のそれぞれのN末端において、Lys−Arg(KR)残基のカルボキシル側で切断するKEX2エンドペプチダーゼによる。第2のタンパク質分解処理ステップは、二塩基性KR残基が、KEX1カルボキシペプチダーゼB(CoxyPdaseB)により、アルファ因子のC末端から除去されるときに生じる。最後に、スペーサ(EAEA(SEQ ID NO:47)またはEAEAEA(SEQ ID NO:48)またはEADAEA(SEQ ID NO:49))の残りのアミノ酸が、STEB3コード化ジペプチジルアミノペプチダーゼ(DAPダーゼA)によって、アルファ因子のN末端から切断される。成熟したアルファ因子は、次いで、細胞外培地中に分泌される。
)からなる。構築物全体を、pUC57−Kanプラスミド中に合成し、GatewayエントリーベクターpDONR221中にクローニングした。次いで、これらの構築物を、Gateway LRクローニング(Alberti et al.,"A suite of Gateway cloning vectors for high throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae,"Yeast 24−913(2007))によって、pAG425Gal発現ベクター中に導入した。GAL1プロモーターは、ガラクトース誘導性条件下において、Aβ融合導入遺伝子の発現を可能にする。ベクターは、大腸菌(E.coli)中でのベクターの増幅のためのアンピシリン耐性遺伝子と、ロイシンを欠如する培地上での形質転換酵母細胞の選択のためのロイシン栄養要求性マーカー(LEU2)とを有する(図2)。
ヒトAβ配列を、いくつかの真核分泌タンパク質のシグナル配列のC末端で融合させた。シグナル配列は、ヒトインスリン(Ins)、ヒトトリプシン(Tryp)、ヒトアミロイド前駆体タンパク質(APP)、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)、および海洋カイアシ類のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)のメトリディアルシフェラーゼ(mLuc)であった。Aβペプチドを、配列間にいかなるリンカーもなく、これらのシグナルペプチドに融合させた(図5)。細胞質発現については、いかなる分泌シグナルも有さないヒトAβペプチドも、同様な発現ベクター中に構築した(図5中の「シグナル配列無し」と記入)。
ラット胚皮質ニューロンを、Aβを発現させるために用いた。レンチウイルス構築物を生成するために、発現ベクターを、挿入されたインスリンシグナルペプチド−Aβ融合ポリペプチド導入遺伝子の上流のヒトシナプシン1プロモーターで使用した(図9)。コードされた融合ポリペプチドは、ニューロンの分泌経路において処理され、Aβを細胞外環境に放出する。
ラット皮質ニューロンを、ドキシサイクリン誘導性レンチウイルスGFP構築物で感染させた。感染後2日目に、細胞を、ニューロン特異的(シナプシンプロモーター)レンチウイルスAベータ構築物(すなわち、Aβ40、Aβ42、および様々な突然変異)で再度感染させた。二重感染させた細胞を、感染後7日目に、ドキシサイクリンで処理し、GFPを発現させた。初めの感染の21日後に、生ニューロンを、蛍光顕微鏡で可視化し、導入遺伝子から発現されたAβの存在下においてGFPを発現するニューロンを可視化することによって、ニューロン生存に及ぼす異なるAβ変異体の作用および形態を観察した。野生型ヒトAβ42およびAβ42_Arctic(E22G)突然変異は、ニューロン死を引き起こし、神経突起伸長および構造に悪影響を及ぼし、これらは、GFP染色された生ニューロンの顕微鏡観察によって検出された(図11A)。Aβ42_I31EおよびAβ42_Arc/I31E突然変異の両方共に、野生型Aβ42およびAB42_Arctic(E22G)ウイルス構築物と同一の感染多重度(MOI)で感染されたラット皮質ニューロンにおいて、低減された細胞毒性を示し、かつニューロンおよび神経突起の形態的変形を示さなかった。
酵母細胞中のポリ−Aβ(Aβ40またはAβ42_1X/4X/6X/8X)発現構築物と同様に(実施例1を参照)、ポリ−Aβ毒性モデルを、哺乳動物細胞において開発した。N末端シグナルペプチドに結合された、染色体に組み込まれたテトラサイクリン(ドキシサイクリン)誘導性ポリ−Aβ導入遺伝子(Aβ42−4X、Aβ42−6X、Aβ40−4X、Aβ40−6X、およびAβ42−Arctic−4X)を有する安定な細胞系を生成した(図13A〜13B)。これらの発現構築物は、pLix402レンチウイルスプラスミドを用いて生成した(図12)。ポリ−Aβ構築物を、LIPOFECTAMINE(登録商標)2000(Invitrogen)トランスフェクション試薬を用いて、レンチウイルスパッケージングプラスミドpsPAXおよびウイルスエンベロープ発現プラスミドmMD2.Gと共に、293T細胞中に個々にトランスフェクトし、ポリ−Aβ導入遺伝子を含有するレンチウイルスを生成した。トランスフェクション後2日目および3日目に、ウイルスをトランスフェクトされた293T細胞の上清から採集し、その後、LENTI−X(商標)Maxi精製キット(Clontech)を用いて、製造元の説明書に従って精製し、濃縮した。
ラット胚皮質ニューロンを、レンチウイルスポリ−Aβ発現構築物で感染させ、ポリ−Aβ毒性をモデル化した。実施例5に記載したテトラサイクリン(ドキシサイクリン)誘導性ポリ−Aβ(Aβ42−4X、Aβ42−6X、Aβ40−4X、Aβ40−6X、およびAβ42−Arctic−4X)ウイルス構築物を用いて、ラット皮質ニューロン中でポリ−Aβ構築物を発現させた。各発現構築物において、ポリ−Aβコード配列を、N末端インスリンシグナルペプチドに連結させる。ポリ−Aβ発現プラスミドを、レンチウイルス粒子中にパッケージ化し、これは、実施例3に記載されるように、293T細胞によって生成された。
293T細胞中の細胞毒性モデルを用いて、Aβ媒介毒性を軽減するための小分子化合物の効果を試験した。Aβ42またはAβ40発現構築物を、一過的にトランスフェクトし、トランスフェクション後12時間に、小分子を異なる用量で添加した。トランスフェクション後96時間に、細胞毒性を、TOXLIGHT(商標)バイオアッセイキット(Lonza)によって、損傷細胞から放出されたアデニル酸キナーゼにより、異なる化合物投与量において測定した。毒性軽減の化合物媒介効果の一例は、クリオキノール(CQ)によるものであって、これは、Aβ媒介毒性を2〜5μMの濃度で救済した(図15)。同様なアッセイを、テトラサイクリン(ドキシサイクリン)誘導性ポリ−Aβ発現構築物を担持するウイルス感染された安定な293T細胞を用いても実施し、ポリ−Aβ発現構築物によって引き起こされた細胞毒性を救済する化合物を特定した。
ガラクトース誘導性GAL1プロモーターの制御下において、ポリ−Aβ発現構築物を用いて、Aβ43を、タンデムポリペプチド(6〜8個のアミノ酸リンカーによって連結された4つのタンデムAβペプチド)として、酵母S.セレヴィシエ中で発現させた。分泌経路における導入遺伝子の直接発現のために、Aβポリペプチドコード配列は、N末端において、接合因子αプレ−プロシグナル配列に連結される(図16A)。
Aβ43ペプチドを哺乳動物細胞中で発現させるために、インスリンシグナルペプチドをAβ43ペプチドコード配列のN末端に融合させることによって、発現構築物を生成した(図17Aおよび17B)。
本発明が、その詳細な説明と共に説明されてきたが、前述の説明は例示することを意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。群の1つ以上の構成員間に「または」を含む請求項または説明は、別段の意図が示されるか、または文脈上明らかでない限り、群構成員の1つ、2つ以上、または全てが、所定の生成物またはプロセスにおいて存在し、使用され、ないしは別の方法で関連するならば、条件を満たすものとみなされることが理解されるべきである。本発明は、群の1つの構成員が、厳密に所定の生成物またはプロセスにおいて存在し、使用され、ないしは別の方法で関連する実施形態を含む。本発明は、グループ構成員の2つ以上、または全てが、所定の生成物またはプロセスにおいて存在し、使用され、ないしは別の方法で関連する実施形態も含む。更に、別途明記しない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、1つ以上の列挙された請求項からの1つ以上の制限、要素、条項、記述用語等が、同一の基本請求項(または、関連する、任意の他の請求項)に従属する別の特許請求の範囲に導入される全ての実施形態を包含し、このような実施形態は、追加項目を構成することも、または出願時の内容を超えることはないことが理解されるべきである。要素がリストとして提示される場合、要素の各部分群もまた開示され、いかなる1つ以上の要素(複数可)も群から除外されることも可能であり、このような部分群または得られたリストは、本明細書に明示的に開示され、追加項目を構成することも、または出願時の内容を超えることはないことが理解されるべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が、特定の要素、特徴等を含むものとみなされる場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴等からなるか、または本質的になることを理解されたい。本発明の任意の実施形態は、追加項目を構成することなく、または出願時の内容を超えることなく、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることも理解されたい。本発明の他の態様、利点、および変更は、以下に記載される特許請求の範囲内にある。
Claims (50)
- シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現構築物。
- シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、式[X−Y]nを有するポリペプチドとを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物であって、式中、各Xが独立して不在であるかまたはリンカーであり、各Yが独立してヒトアミロイドベータペプチドであり、かつnが端点を含んで2〜8の整数である、発現構築物。
- 前記シグナル配列が、天然起源の酵母タンパク質のシグナル配列と同一である、請求項1または2に記載の発現構築物。
- 前記シグナル配列が、酵母接合因子アルファシグナル配列である、請求項3に記載の発現構築物。
- 前記シグナル配列が、酵母キラートキシンK1、分泌酸性ホスファターゼ、インベルターゼ(スクラーゼ)、またはPst1のシグナル配列である、請求項3に記載の発現構築物。
- 前記ゴルジ体指向性プロ配列が、酵母接合因子アルファプロ配列である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記ゴルジ体指向性プロ配列が、酵母KEX2、カルボキシペプチダーゼY、Pep4、またはPrb1のプロ配列である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記誘導性プロモーターが、GAL1−10、GAL1、GALL、GALS、GPD、ADH、TEF、CYC1、MRP7、MET25、TET、VP16、またはVP16−ERである、請求項8に記載の発現構築物。
- 各ヒトアミロイドベータタンパク質が、野生型Aβ38、野生型Aβ39、野生型Aβ40、野生型Aβ41、野生型Aβ42、野生型Aβ43、野生型Aβ48、および野生型Aβ49からなる群から独立して選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 各ヒトアミロイドベータタンパク質が、Aβ38、Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42、Aβ43、Aβ48、およびAβ49からなる群から独立して選択され、かつ、A2T、A2V、H6R、D7N、E11K、F20E、A21G、E22G、E22Q、E22K、E22欠失、D23N、I31E、E22G/I31E、A42T、およびA42Vからなる群から選択される突然変異を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記ヒトアミロイドベータタンパク質が野生型Aβ42である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記ポリペプチドが複数のアミロイドベータタンパク質を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記ポリペプチドが少なくとも2つのアミロイドベータタンパク質を含む、請求項12に記載の発現構築物。
- 前記ポリペプチドが少なくとも4つのアミロイドベータタンパク質を含む、請求項13または14に記載の発現構築物。
- 各アミロイドベータタンパク質が、同一のアミノ酸配列を含む、請求項13〜15のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記ポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する少なくとも2つのアミロイドベータタンパク質を含む、請求項13〜15のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、またはSEQ ID NO:101のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の発現構築物。
- エピソームプラスミドまたは組込みプラスミドである、請求項1〜18のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記組込みプラスミドが、pAG303、pAG304、pAG305、pAG306、pRS303、pRS304、pRS305、pRS306、またはこれらの誘導体である、請求項19に記載の発現構築物。
- 酵母細胞中の前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、該細胞の増殖または生存能力の低下がもたらされる、請求項1〜20のいずれか一項に記載の発現構築物を含む酵母細胞。
- 前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、前記細胞が生存不能となる、請求項21に記載の酵母細胞。
- 前記発現構築物が、エピソーム性であるか、または前記酵母細胞のゲノムに組み込まれている、請求項21または22に記載の酵母細胞。
- 酵母が、サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ウバエ(Saccharomyces uvae)、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、ピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピチア・クルイベリ(Pichia kluyveri)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、カンジダ(Candida)菌種、カンジダ・ウティリス(Candida utilis)、カンジダ・カカオイ(Candida cacaoi)、ジオトリチュム(Geotrichum)菌種、またはジオトリチュム・フェルメンタンス(Geotrichum fermentans)である、請求項21〜23のいずれか一項に記載の酵母細胞。
- 薬剤排出または細胞透過性に関与するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が破壊されている、請求項21〜24のいずれか一項に記載の酵母細胞。
- 前記少なくとも1つの遺伝子が、PDR1、PDR3、PDR5、SNQ2、またはERG6である、請求項25に記載の酵母細胞。
- シグナル配列とヒトアミロイドベータタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物であって、該シグナル配列がインスリンシグナル配列またはトリプシンシグナル配列である、発現構築物。
- シグナル配列と式[X−Y]nを有するポリペプチドとを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物であって、式中、各Xが独立して不在であるかまたはリンカーであり、各Yが独立してヒトアミロイドベータペプチドであり、かつnが端点を含んで2〜8の整数であり、該シグナル配列がインスリンシグナル配列またはトリプシンシグナル配列である、発現構築物。
- 前記シグナル配列がインスリンシグナル配列である、請求項27または28に記載の発現構築物。
- 前記インスリンシグナル配列がヒトインスリンシグナル配列である、請求項29に記載の発現構築物。
- 前記シグナル配列がトリプシンシグナル配列である、請求項27または28に記載の発現構築物。
- 前記トリプシンシグナル配列がヒトトリプシンシグナル配列である、請求項31に記載の発現構築物。
- 前記ヒトアミロイドベータタンパク質が前記シグナル配列に直接融合されている、請求項27または29〜32のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 各ヒトアミロイドベータタンパク質が、野生型Aβ38、野生型Aβ39、野生型Aβ40、野生型Aβ41、野生型Aβ42、野生型Aβ43、野生型Aβ48、および野生型Aβ49からなる群から独立して選択される、請求項27〜33のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 各ヒトアミロイドベータタンパク質が、Aβ38、Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42、Aβ43、Aβ48、およびAβ49からなる群から独立して選択され、かつ、A2T、A2V、H6R、D7N、E11K、F20E、A21G、E22G、E22Q、E22K、E22欠失、D23N、I31E、E22G/I31E、A42T、およびA42Vからなる群から選択される突然変異を含む、請求項27〜33のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記ヒトアミロイドベータタンパク質が野生型Aβ42である、請求項27〜33のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、またはSEQ ID NO:103のアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の発現構築物。
- 前記発現構築物がプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項27〜37のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記ポリペプチドが複数のアミロイドベータタンパク質を含む、請求項27〜38のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記ポリペプチドが少なくとも2つのアミロイドベータタンパク質を含む、請求項39に記載の発現構築物。
- 前記ポリペプチドが少なくとも4つのアミロイドベータタンパク質を含む、請求項39または40に記載の発現。
- 各アミロイドベータタンパク質が、同一のアミノ酸配列を含む、請求項39〜41のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 前記ポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する少なくとも2つのアミロイドベータタンパク質を含む、請求項39〜41のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 哺乳動物細胞中の前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、該細胞の増殖または生存能力の低下がもたらされる、請求項27〜43のいずれか一項に記載の発現構築物を含む哺乳動物細胞。
- 前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、前記細胞が生存不能となる、請求項44に記載の哺乳動物細胞。
- 前記細胞が神経細胞である、請求項44または45に記載の哺乳動物細胞。
- 細胞中で毒性を誘導する方法であって、
請求項21〜26または請求項44〜46のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程と、
該細胞に対して毒性である前記核酸の発現レベルを該細胞中で誘導する工程と、を含む、方法。 - アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する化合物を特定する方法であって、
候補薬剤の存在下で、かつ、該候補薬剤の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するのに十分であるレベルでの前記核酸の発現を可能にする条件下で、請求項21〜26または請求項44〜46のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程と、
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇する場合に、前記候補薬剤が、アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する化合物として特定される、方法。 - アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定する方法であって、
遺伝子を過剰発現するように遺伝子改変されている、請求項21〜26または請求項44〜46のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するのに十分であるレベルでの前記タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記細胞を培養する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の存在下において、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記遺伝子の過剰発現の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
(i)細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して前記遺伝子の過剰発現の存在下で上昇している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーとして特定され、(ii)細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下のものと比較して前記遺伝子の過剰発現の存在下で低下している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子エンハンサーとして特定される、方法。 - アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定する方法であって、
細胞の内因性遺伝子が破壊されている、請求項21〜26または請求項44〜46のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するに十分であるレベルでの前記タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記細胞を培養する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記内因性遺伝子の破壊の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
(i)細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子の破壊の不在下でのものと比較して、前記内因性遺伝子の破壊の存在下で上昇している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子エンハンサーとして特定され、(ii)細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子の破壊の不在下のものと比較して、前記内因性遺伝子の破壊の存在下で低下している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーとして特定される、方法。
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