JP2017515799A - Lactobacillus plantarum Inducia strain DSM 21379 as an antimicrobial agent against cholesterol lowering agents and Clostridium difficile - Google Patents
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Abstract
本発明は、コレステロール低下剤、抗微生物剤、および抗酸化剤として、並びに、被験者の生まれつきの防御機能を強化するために使用される、微生物株、ラクトバチルス・プランタルムInducia DSM21379に関するものである。L.プランタルムInduciaは、血中のLDL−コレステロールレベルを低下させるために、コレステロール代謝障害および継続的な心臓血管疾患の予防するために使用される。L.プランタルムInduciaは、生まれつきの防御機能および細胞の免疫性を強化し、並びに、酸化低密度リポタンパク質(ox−LDL)のレベルを低下させることによるヒトの体の抗酸化活性を抗酸化剤として、同時に強化する。この株は、クロストリジウム・ディフィシレ胞子の発芽を予防すること、およびクロストリジウム・ディフィシレ栄養細胞の増殖を抑制することにより、クロストリジウム・ディフィシレ関連下痢症(CDAD)のリスクを減少させるための抗微生物剤としても使用される。L.プランタルムInduciaを含む組成物は、血中のコレステロール、およびox−LDLレベルを減少させ、生まれつきの防御機能および、CDADのリスク低減を強化する。この組成物は、キシリトールをさらに含むことができる。The present invention relates to a microbial strain, Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, used as a cholesterol-lowering agent, an antimicrobial agent, and an antioxidant, and to enhance the natural defense function of a subject. L. Plantarum Inducia is used to prevent cholesterol metabolism disorders and ongoing cardiovascular disease to reduce LDL-cholesterol levels in the blood. L. Plantarum Inducia enhances the innate defense function and cellular immunity, as well as the antioxidant activity of the human body by reducing the level of oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) as an antioxidant Strengthen. This strain can also be used as an antimicrobial agent to reduce the risk of Clostridium difficile-associated diarrhea (CDAD) by preventing the germination of Clostridium difficile spores and inhibiting the growth of Clostridium difficile vegetative cells. used. L. A composition comprising Plantarum Inducia reduces cholesterol and ox-LDL levels in the blood, enhancing the innate defense function and reducing the risk of CDAD. The composition can further comprise xylitol.
Description
本発明は、生物工学の分野において様々な用途を有するラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)Inducia(DSM21379)株に関する微生物学および栄養学の分野に関する。 The present invention relates to the fields of microbiology and nutrition relating to the Lactobacillus plantarum Inducia (DSM 21379) strain having various uses in the field of biotechnology.
(LDL−コレステロール)
心臓血管疾患(CVD)を引き起こす要因の1つは、異常に高いコレステロールレベルである。近年、高コレステロールの有害物質としての見解が、その粒子、特に低密度リポタンパク質コレステロール(LDL−c)およびアポリポタンパク質B(アポB)の異常性に戻りつつある。LDL−cは、総コレステロールの60〜70%を占める。LDL−c粒子は、コレステロール、トリグリセリド、脂溶性ビタミンおよび抗酸化剤を運ぶ。LDL−コレステロールは、アテローム性動脈硬化症の予防および心臓血管の健康状態の維持のための重要なモジュレーターである。酸化低密度リポタンパク質(Ox−LDL)は、LDL粒子に特異的な酸化ストレスのマーカーである。Ox−LDLは、冠動脈心疾患に関する生化学的なリスクマーカーの1つとみなすことができる。したがって、LDL−cは、冠動脈心疾患の発生と進行を独立して引き起こすLDL−cの能力を実証する多数の臨床試験の結果に従って確立された心臓血管系のリスクマーカーとして、広く認識されている(例えば、非特許文献1を参照、2014年3月14日検索)。
(LDL-cholesterol)
One factor that causes cardiovascular disease (CVD) is abnormally high cholesterol levels. In recent years, the view of high cholesterol as a hazardous substance is returning to the anomaly of its particles, particularly low density lipoprotein cholesterol (LDL-c) and apolipoprotein B (apo B). LDL-c accounts for 60-70% of total cholesterol. LDL-c particles carry cholesterol, triglycerides, fat-soluble vitamins and antioxidants. LDL-cholesterol is an important modulator for prevention of atherosclerosis and maintenance of cardiovascular health. Oxidized low density lipoprotein (Ox-LDL) is a marker of oxidative stress specific to LDL particles. Ox-LDL can be considered as one of the biochemical risk markers for coronary heart disease. Thus, LDL-c is widely recognized as a cardiovascular risk marker established according to the results of numerous clinical trials that demonstrate the ability of LDL-c to independently induce the development and progression of coronary heart disease (For example, refer nonpatent literature 1, March 14, 2014 search).
プロバイオティクスの胆汁酸塩ヒドロラーゼ(BSH)活性は、コレステロール低下作用の主要なメカニズムの1つとみなされてきた(例えば、非特許文献2、非特許文献3、非特許文献4を参照。)。BSH(EC3.5.1.24;コリルグリシンヒドロラーゼ)は、アミノ酸残基および遊離胆汁酸へのグリシンおよび/またはタウリン抱合型胆汁酸塩の加水分解を触媒する酵素である。乳酸菌におけるBSH活性は、天然の生息環境と強く相関しており、主として乳酸杆菌属種などの消化管に関連する種で観察される。しかしながら、株間で多様なバリエーションが存在する。 The bile salt hydrolase (BSH) activity of probiotics has been regarded as one of the main mechanisms of cholesterol lowering action (see, for example, Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3, and Non-Patent Document 4). BSH (EC 3.5.1.24; cholylglycine hydrolase) is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of glycine and / or taurine-conjugated bile salts to amino acid residues and free bile acids. BSH activity in lactic acid bacteria is strongly correlated with the natural habitat, and is mainly observed in species related to the digestive tract such as Lactobacillus species. However, there are various variations between strains.
宿主消化管の粘膜上皮細胞と微生物叢との密接な関係は、健康状態にとって最大の重要性を有する。消化管(GIT)に固有の微生物叢のなかでも乳酸菌は、食品由来のコレステロールを消化する(例えば、非特許文献5を参照。)。Cune Castellana、2009年の特許(例えば、特許文献1を参照;AB Probiotics S.A.)において、単一でのまたは組成物中のラクトバチルス・プランタルム株CECT7528、CECT7526およびCECT7529は、インビトロとインビボの両方でコレステロールを減少させる能力を示した。これらの株は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ(BHS)活性を有し、さらに病原性株(サルモネラ腸炎菌(Salmonella enterica Enteritidis)、ネズミチフス菌(Salmonella enterica Typhimurium)、偽結核菌(Yersinia pseudotuberculosis)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・ラムノサス(Clostridium ramnosus)、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis))の成長を阻害するためにアンタゴニスト活性も有し、プロバイオティクス細菌として使用することができる。 The close relationship between the host gastrointestinal mucosal epithelial cells and the microbiota is of greatest importance for health. Among the microflora unique to the gastrointestinal tract (GIT), lactic acid bacteria digest food-derived cholesterol (see, for example, Non-Patent Document 5). In Cune Castellana, 2009 patents (see, for example, US Pat. No. 6,057,031; AB Probiotics SA), Lactobacillus plantarum strains CECT7528, CECT7526 and CECT7529, either alone or in composition, are Both showed the ability to reduce cholesterol. These strains have bile salt hydrolase (BHS) activity and are also pathogenic strains (Salmonella enterica Enteritidis), Salmonella enterica Typhimurium, Yersinia sp. It also has antagonist activity to inhibit the growth of Clostridium perfringens, Clostridium ramnosus, Enterococcus faecalis) and can be used as a probiotic bacterium.
Pereiraら(例えば、非特許文献6を参照。)は、L.ファーメンタム(L.fermentum)のコレステロールを減少させるといわれている特性に関与する主要なメカニズムとして、短鎖脂肪酸濃度、具体的にはプロピオネートおよび/または胆汁酸塩脱抱合のモル比の役割を実証した。 Pereira et al. (See, for example, Non-Patent Document 6). Demonstrating the role of short chain fatty acid concentrations, specifically the molar ratio of propionate and / or bile salt deconjugation, as a major mechanism involved in the properties of L. fermentum that are said to reduce cholesterol did.
しかしながら、血清コレステロールのレベル(およびコレステロールの割合)への乳酸杆菌属種の株の作用は株特異的であり、特定の株の由来および特性に依存する(例えば、非特許文献7を参照。)。 However, the effect of strains of Lactobacillus species on serum cholesterol levels (and cholesterol percentage) is strain-specific and depends on the origin and characteristics of the particular strain (see, for example, Non-Patent Document 7). .
(プロバイオティクス)
プロバイオティクスは、適切な量で与えられる場合にヒトの健康状態への利益が実証された生存可能な微生物の食物成分である(食物中のプロバイオティクス評価に関するガイドライン起草のFAO/WHO合同作業部会、非特許文献8を参照、2014年3月14日検索)。
(Probiotics)
Probiotics are viable microbial food ingredients that have been shown to benefit human health when given in appropriate amounts (a joint FAO / WHO drafting guideline for the assessment of probiotics in food (See Section, Non-Patent Document 8, March 14, 2014 search).
より狭い定義では、プロバイオティクスは、腸の微生物バランスを改善することにより宿主に有利に影響を与える生きた微生物として受け入れられている。現在では、プロバイオティクス製品は、健康状態を改善するために、宿主の生理学的な活性をサポートすること、または疾患のリスクを低下させることのいずれかによって、数々の宿主の機能(抗感染性の、形態学的な、免疫学的な、代謝の機能)を標的とする株特異的な調製物である。一般的に、同じ種の異なる株のプロバイオティクスの可能性は、異なるプロバイオティクス作用を有する可能性があることが認められてきた(例えば、非特許文献9、非特許文献10を参照。)。 In a narrower definition, probiotics are accepted as living microorganisms that favorably affect the host by improving the gut microbial balance. At present, probiotic products provide numerous host functions (anti-infective properties) by either supporting the physiological activity of the host or reducing the risk of disease to improve health. Strain-specific preparations targeting morphological, immunological and metabolic functions). In general, it has been recognized that the probiotic potential of different strains of the same species may have different probiotic effects (see, for example, Non-Patent Document 9 and Non-Patent Document 10). ).
最も広く適用されているプロバイオティクスは、ビフィドバクテリウム属および乳酸杆菌属種に属する。プロバイオティクスは、一般的に、発酵食物、例えばヨーグルト、ケフィア、チーズまたは栄養補助食品の一部として消費される。結腸の微生物叢は、十分安定化されており、粘膜の微生物叢のために容易に変化しない。しかしながら、十分な量(少なくとも109CFUの1日用量)で与えられれば、プロバイオティクス介入の作用を示す可能性がある。 The most widely applied probiotics belong to the species Bifidobacterium and Lactobacillus. Probiotics are generally consumed as part of fermented foods such as yogurt, kefir, cheese or dietary supplements. The colonic microflora is well stabilized and does not change easily due to the mucosal microflora. However, if given in a sufficient amount (a daily dose of at least 10 9 CFU), it may show the effect of probiotic intervention.
プロバイオティクスを用いた治療コンセプトは、潜在的な病原体および毒素を低減させるかまたは取り除くこと、栄養素、抗酸化剤、成長因子を放出すること、消化管の運動を刺激すること、および先天および適応免疫を調節することである。 Treatment concepts with probiotics reduce or eliminate potential pathogens and toxins, release nutrients, antioxidants, growth factors, stimulate gastrointestinal motility, and innate and adaptive It is to regulate immunity.
ラクトバチルス・プランタルムは、自然界では発酵した植物性材料、乳製品および肉製品から、さらにはヒトGITにおいても広く分布している(例えば、非特許文献11を参照。)。 Lactobacillus plantarum is widely distributed from naturally fermented plant materials, dairy products and meat products, and also in human GIT (see, for example, Non-Patent Document 11).
L.プランタルム種の株がプロバイオティクス食物または補助食品として利用可能であり(L.プランタルム299v、DSM9843、Probi AB、Sweden)、これらは、多菌種混合(multispecies)のプロバイオティクス補助食品VSL#3(VSL Pharmaceuticals,Inc.USA)に属する。 L. Plantarm strains are available as probiotic foods or supplements (L. plantarum 299v, DSM9843, Probi AB, Sweden), which are multispecies probiotic supplements VSL # 3 (VSL Pharmaceuticals, Inc. USA).
ラクトバチルス・プランタルムInducia(DSM21379)株は、抗微生物性ペプチドであるプランタリシンの分泌、サイトカインIL−6の誘導、プトレシンの産生を介して消化管粘膜の天然の細胞の免疫性およびバリア機能を強化し、腸におけるリンパ組織の量を増加させるプロバイオティクスとして開示されている(Mikelsaarら、特許文献2を参照、2009、Bio−Competence Centre of Healthy Dairy Products)。 Lactobacillus plantarum Inducia (DSM 21379) strain enhances natural cell immunity and barrier function of gastrointestinal mucosa through secretion of plantaricin, an antimicrobial peptide, induction of cytokine IL-6, production of putrescine However, it has been disclosed as probiotics that increase the amount of lymphoid tissue in the intestine (see Mikesaar et al., Patent Document 2, 2009, Bio-Competence Center of Health Dairy Products).
(消化管の微生物生態の乱れ)
感染および炎症性合併症を処置するための広域スペクトル抗微生物性調製物の適用は、GI微生物叢間で深刻な不均衡を引き起こす可能性があることは周知である。
(クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)の感染)
1970年代に、クロストリジウム・ディフィシレは、抗生物質関連下痢症の原因因子として同定された。嫌気性の胞子形成性腸内病原体であるクロストリジウム・ディフィシレは、病院および老人ホームで蔓延している(例えば、非特許文献12を参照。)。外来源のC.ディフィシレ感染は、C.ディフィシレの胞子の形態での感染がきっかけとなる。C.ディフィシレは、胞子ではなく栄養細胞によって産生される分泌毒素の作用を介して疾患を誘発する。内生胞子産生は、クロストリジウム・ディフィシレ感染の蔓延にとって不可欠である。これらの胞子は、疾患を引き起こすためには、発芽して栄養細胞成長に戻らなければならない(例えば、非特許文献13を参照。)。
(Disturbance of microbial ecology of the digestive tract)
It is well known that the application of broad spectrum antimicrobial preparations to treat infections and inflammatory complications can cause serious imbalances among the GI microflora.
(Infection with Clostridium difficile)
In the 1970s, Clostridium difficile was identified as a causative factor for antibiotic-related diarrhea. Clostridium difficile, an anaerobic spore-forming enteric pathogen, is prevalent in hospitals and nursing homes (see, for example, Non-Patent Document 12). C. of exogenous sources Difficile infection is Infection in the form of a difficile spore is triggered. C. Difficile induces disease through the action of secreted toxins produced by vegetative cells rather than spores. Endogenous spore production is essential for the spread of Clostridium difficile infection. These spores must germinate and return to vegetative cell growth in order to cause disease (see, for example, Non-Patent Document 13).
C.ディフィシレに感染した患者の4分の1(25%)において、偽膜性腸炎(PMC)などの重篤な後遺症が発症する。クロストリジウム・ディフィシレ関連下痢症(CDAD)は、死亡率を増加させ、入院を長引かせ、全体の医療費を劇的に増加させる。これまでの処置ガイドラインは、中程度および重度の偽膜性腸炎の場合、バンコマイシンの使用に重点を置いている(例えば、非特許文献14を参照、2014年3月14日検索)。 C. Severe sequelae such as pseudomembranous enteritis (PMC) develop in a quarter (25%) of patients infected with difficile. Clostridium difficile associated diarrhea (CDAD) increases mortality, prolongs hospitalization, and dramatically increases overall health care costs. Previous treatment guidelines have focused on the use of vancomycin in the case of moderate and severe pseudomembranous enterocolitis (see, for example, Non-Patent Document 14, March 14, 2014).
クロストリジウム・ディフィシレ感染は、患者の約20%において再発し、それに続く再発は40%から60%に増加する(例えば、非特許文献15を参照。)。抗微生物処置は、多様な微生物の複雑なバランスを崩壊させ、C.ディフィシレ定着および内因性由来の疾患の病因の主要な要因である。再発性C.ディフィシレ感染(CDI)を有する患者は、対照と比較して著しく減少した細菌多様性を有する(例えば、非特許文献16を参照。)。微生物多様性の維持および回復は、新規の戦略の代表といえる。この疾患の予防および処置の正念場は、プロバイオティクス投与を含む様々なレジメンでの抗生物質療法の間およびその後に腸の微生物叢の変更を元に戻す可能性を見出すことである。ほとんどのプロバイオティクスは、一時的に消化管に定着し、殺菌性の酸およびペプチドを産生して、栄養素および上皮への付着に関する競合により微生物間の「競合」を促進する。これらの作用は、C.ディフィシレについての環境の好ましさを低下させるようである。以前の研究は、CDI予防のためのプロバイオティクスは、L.acidophilusおよびL.カゼイ(L.casei)、S.ブラウディ(S.boulardii)、またはL.ラムノサス(L.rhamnosus)の組合せを含むことを示唆している。加えて、109CFU/日より多くの投薬が、それより低い用量よりも有効である。 Clostridium difficile infection recurs in approximately 20% of patients, with subsequent recurrence increasing from 40% to 60% (see, eg, Non-Patent Document 15). Antimicrobial treatment disrupts the complex balance of diverse microorganisms, and C.I. It is a major factor in the pathogenesis of difficile colonization and endogenous-derived diseases. Recurrent C.I. Patients with difficile infection (CDI) have significantly reduced bacterial diversity compared to controls (see, eg, Non-Patent Document 16). The maintenance and restoration of microbial diversity is representative of a new strategy. The critical moment for the prevention and treatment of this disease is to find the possibility of reverting gut microbiota changes during and after antibiotic therapy with various regimens including probiotic administration. Most probiotics temporarily settle in the gastrointestinal tract and produce bactericidal acids and peptides that promote “competition” between microorganisms through competition for attachment to nutrients and epithelium. These effects are observed in C.I. It seems to reduce the preference of the environment for difficile. Previous studies have shown that probiotics for CDI prevention are acidophilus and L. L. casei, S. et al. S. bouulardi, or L. It is suggested to include a combination of L. rhamnosus. In addition, more than 10 9 CFU / day dosing is more effective than lower doses.
プロバイオティクス株の抗微生物活性は、C.ディフィシレとの競合に関して示唆されたメカニズムの1つである。乳酸菌は、局所的な消化管環境のpHを下げ、加えてC.ディフィシレの付着を予防する短鎖脂肪酸を産生する(例えば、非特許文献17を参照。)。次に、プロバイオティクスによる腸のバリア保護の可能性は、結腸上皮細胞へのC.ディフィシレの毒素AおよびBの結合を妨害することによる消化管の透過性の安定化、および消化管上皮上での偽膜の発生の阻害をもたらし得る。 The antimicrobial activity of probiotic strains is C.I. This is one of the suggested mechanisms for competition with difficile. Lactic acid bacteria lower the pH of the local gastrointestinal environment and in addition C.I. Produces short-chain fatty acids that prevent adherence of difficile (see, for example, Non-Patent Document 17). Secondly, the possibility of protecting the intestinal barrier by probiotics has been demonstrated by C.I. It may result in stabilization of gastrointestinal permeability by interfering with the binding of difficile toxins A and B, and inhibition of pseudomembrane development on the gastrointestinal epithelium.
しかしながら、全てのプロバイオティクスが上述した作用機序を生じる能力を有するとは限らない。 However, not all probiotics have the ability to produce the mechanism of action described above.
乳酸杆菌の株特異性は、C.ディフィシレ感染またはC.ディフィシレ毒素結合の予防において見込みのあるプロバイオティクスを探すときに考慮する重要な要因である(例えば、非特許文献18を参照。)。 The strain specificity of lactobacilli is C.I. Difficile infection or C.I. It is an important factor to consider when looking for probiotics that are promising in the prevention of difficile toxin binding (see, eg, Non-Patent Document 18).
さらに、一部の臨床試験は、特定のプロバイオティクスのCDAD予防に関する作用を実証する統計学的な証拠を得ることができなかった。抗生物質への曝露を受けた2941人の高齢の成人を含む、プロバイオティクス(好酸性乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)およびビフィズス菌(Bifidobacterium bifidum)の複数株混合(multistrain)調製物)を受けた者がわかっている大規模な無作為化試験の著者は、CDIに関するリスクの低減を示さなかった(RR0.71;95%CI0.34〜1.47;p=0.35)(例えば、非特許文献19を参照。)。数年にわたりCDIを処置するための様々なプロバイオティクスを用いて試験した後でも、プロバイオティクスの株、用量、および持続時間は、なお議論中である(例えば、非特許文献20を参照。)。 In addition, some clinical trials failed to obtain statistical evidence demonstrating the effect of certain probiotics on CDAD prevention. Those who have received probiotics (multistrain preparations of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum), including 2941 elderly adults exposed to antibiotics Authors of large randomized trials with known risk did not show a reduced risk for CDI (RR 0.71; 95% CI 0.34-1.47; p = 0.35) (eg, non-patented (Ref. 19). Even after testing with various probiotics to treat CDI for several years, probiotic strains, doses, and durations are still under discussion (see, eg, Non-Patent Document 20). ).
(キシリトールの適用)
キシリトールは、5−C糖アルコール、例えばペンチトールであり、植物、菌類および藻類中に見出される。キシリトールは、哺乳動物の炭水化物代謝において重要な中間生成物であり、すなわちヒト血液は、最大8×10-5Mのキシリトールを含有する。
(Application of xylitol)
Xylitol is a 5-C sugar alcohol such as pentitol and is found in plants, fungi and algae. Xylitol is an important intermediate product in mammalian carbohydrate metabolism, ie human blood contains up to 8 × 10 −5 M xylitol.
消費されたキシリトールは、完全には吸収されず、吸収されなかった部分が細菌発酵のための食物繊維として使用されて、エネルギー経路で利用される短い脂肪酸鎖にキシリトールを変換することができる。キシリトールは、大腸における消化管微生物叢の一部の種の成長に影響を与え、固有の微生物叢の成長および活性を刺激する。1グラムのグルコースが3.87kcalを有するのと比較して、1グラムのキシリトールは2.4kcalを有する。キシリトールは、糖尿病や高血糖症を有する個体にとって「安全」であると宣伝されている(例えば、非特許文献21を参照。)。本発明者らの以前のCACO−2細胞株に対する研究において、本発明者らは、1%キシリトールが、C.ディフィシレ参照株VPI10463の栄養細胞の付着を予防し、細胞上で受容体をブロックするようであることを発見した。適用されたハムスターモデルにおいて(例えば、非特許文献22を参照。)、ラクトバチルス・ラムノサスGGを共に含む20%キシリトール溶液1mlは、重度の小腸結腸炎の発症から動物を有意に保護した(例えば、非特許文献22を参照。)。これらのプロバイオティクスであるL.ラムノサスGGと組み合わせたキシリトールを用いた実証研究では、クロストリジウム・ディフィシレの栄養細胞を嫌気性環境の実験室中で前もって培養して、細胞培養またはハムスターへの接種に適用した。 The consumed xylitol is not completely absorbed, and the unabsorbed part can be used as dietary fiber for bacterial fermentation to convert xylitol into short fatty acid chains utilized in the energy pathway. Xylitol affects the growth of some species of gut microbiota in the large intestine and stimulates the growth and activity of the inherent microbiota. One gram of xylitol has 2.4 kcal, compared to 1 gram of glucose having 3.87 kcal. Xylitol is advertised as “safe” for individuals with diabetes and hyperglycemia (see, for example, Non-Patent Document 21). In our previous study on the CACO-2 cell line, we found that 1% xylitol was C.I. It was discovered that vegetative cell attachment of difficile reference strain VPI10463 seems to prevent attachment of the cells on the cells. In an applied hamster model (see, eg, Non-Patent Document 22), 1 ml of a 20% xylitol solution together with Lactobacillus rhamnosus GG significantly protected the animal from the development of severe enterocolitis (eg, (See Non-Patent Document 22.) These probiotics L. In an empirical study using xylitol in combination with rhamnosus GG, Clostridium difficile vegetative cells were pre-cultured in an anaerobic laboratory and applied to cell culture or hamster inoculation.
逆に、実際の臨床の場または老人ホームでは、これらの施設の好気性環境で生存するC.ディフィシレの極めて高い耐性を有する胞子と接触することにより感染が起こる。胞子は宿主の腸の内部で発芽し始める。 Conversely, in an actual clinical setting or nursing home, C. cerevisiae survives in the aerobic environment of these facilities. Infection occurs by contact with the highly resistant spores of difficile. Spores begin to germinate inside the host intestine.
一部の著者は、動物モデルにおいて、糖の一部が、グルコースと同様にC.ディフィシレの毒素AおよびBの発現をブロックすることができると仮定している(例えば、非特許文献23を参照。)。 Some authors have noted that in animal models, some of the sugars are C.I. It is hypothesized that the expression of difficile toxins A and B can be blocked (see, for example, Non-Patent Document 23).
したがって、LDL−コレステロール、特にox−LDLを低下させること、同様にクロストリジウム・ディフィシレ感染のリスクを減少させることにおいて有効なプロバイオティクス株がそれでもなお求められている。 Accordingly, there remains a need for probiotic strains that are effective in reducing LDL-cholesterol, especially ox-LDL, as well as reducing the risk of Clostridium difficile infection.
本発明は、血中のLDL−コレステロールレベルを低下させることによるコレステロール代謝障害および継続的な心臓血管疾患の予防におけるコレステロール低下剤として、同時に、酸化ストレスマーカーである酸化低密度リポタンパク質(ox−LDL)、酸化ストレス度(OSI)および総過酸化物カウント(TPX)のレベルを低下させることによるヒトの体の抗酸化活性の強化において使用するための抗酸化剤として使用するための、2008年4月16日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに登録番号DSM21379で寄託された、L.プランタルムInducia株DSM21379を含む組成物を提供する。 The present invention is an oxidative stress marker, oxidized low density lipoprotein (ox-LDL), as a cholesterol-lowering agent in preventing cholesterol metabolism disorders by lowering blood LDL-cholesterol levels and ongoing cardiovascular disease. ), 2008 4 for use as an antioxidant for use in enhancing the antioxidant activity of the human body by reducing the level of oxidative stress (OSI) and total peroxide count (TPX). L. deposited on the 16th of March in Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH with the registration number DSM21379. A composition comprising Plantarum Inducia strain DSM21379 is provided.
そのため、L.プランタルムInducia DSM21379を含む組成物および食品は、心臓保護的な作用を有する。 Therefore, L. Compositions and foodstuffs containing plantarum Inducia DSM 21379 have a cardioprotective effect.
本発明の別の目的は、クロストリジウム・ディフィシレ胞子の発芽を予防すること、およびクロストリジウム・ディフィシレ栄養細胞の増殖を抑制することによって、内因性および/または外因性由来のクロストリジウム・ディフィシレ関連下痢症(CDAD)のリスクを減少させることにおける、抗微生物剤としてのL.プランタルムInducia株DSM21379を含む組成物を提供することである。L.プランタルムInduciaは、抗生物質処置と同時に使用することができる。 Another object of the present invention is to prevent endogenous and / or exogenous Clostridium difficile-related diarrhea (CDAD) by preventing germination of Clostridium difficile spores and inhibiting the growth of Clostridium difficile vegetative cells. L. as an antimicrobial agent in reducing the risk of It is to provide a composition comprising Plantarum Inducia strain DSM21379. L. Plantarum Inducia can be used concurrently with antibiotic treatment.
クロストリジウム・ディフィシレに耐性を有する組成物は、キシリトールをさらに含んでいてもよい。 The composition having resistance to Clostridium difficile may further contain xylitol.
L.プランタルムInduciaを含む組成物は、食品、食物補助食品、または医薬もしくは動物用製品の生産に使用することができる。食品は、乳製品または肉製品、甘味料などであり得る。乳製品は、発酵乳製品、チーズ、およびヨーグルトなどであり得る。 L. The composition comprising plantarum Inducia can be used for the production of foods, food supplements or pharmaceutical or veterinary products. The food product can be a dairy or meat product, a sweetener, and the like. The dairy product can be a fermented dairy product, cheese, yogurt, and the like.
食物補助食品は、粉末(カプセル、ロゼンジ、錠剤、粉末小袋など)または液体(アンプル)の形態で使用されてもよい。株は、凍結乾燥させた形態で使用される場合もある。 Dietary supplements may be used in the form of powders (capsules, lozenges, tablets, powder sachets, etc.) or liquids (ampoules). The strain may be used in lyophilized form.
L.プランタルムInducia株DSM21379の有効な用量は、1日当たり約1×109CFUから1×1010CFU、好ましくは5×109CFUである。 L. An effective dose of Plantarum Inducia strain DSM21379 is about 1 × 10 9 CFU to 1 × 10 10 CFU, preferably 5 × 10 9 CFU per day.
用語「含む(comprising)」は、本明細書では「含む(including)」ならびに「からなる(consisting)」を包含し、例えばL.プランタルムInduciaを含む(comprising)組成物は、その株のみからなる(consist exclusively)場合もあり、または追加のものを含む(including)場合もある。 The term “comprising” as used herein includes “including” as well as “consisting”, eg A composition that includes plantarum Inducia may consist of the strain alone or may include additional ones.
[実施例]
以下の実施例で本発明をさらに例示するが、これらは本発明の範囲を限定すると解釈されないものとする。
I.血中のLDL−コレステロールを減少させることによるコレステロール低下剤としてのL.プランタルムInducia DSM21379の使用
[Example]
The invention is further illustrated in the following examples, which are not to be construed as limiting the scope of the invention.
I. L. as a cholesterol-lowering agent by reducing LDL-cholesterol in the blood. Use of Plantarum Inducia DSM 21379
(実施例1)
L.プランタルムInducia DSM21379の胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性
以下のインビトロにおける試験の目的は、L.プランタルムInducia DSM21379の胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性の存在を評価することであった。
Example 1
L. Plantarum Inducia DSM 21379 Bile Salt Hydrolase Activity The purpose of the following in vitro tests is It was to evaluate the presence of plantarum Inducia DSM 21379 bile salt hydrolase activity.
方法。L.プランタルムInducia DSM21379の胆汁酸塩ヒドロラーゼ(BSH)活性の査定は、Cune Castellana、2009(例えば、特許文献1を参照;AB Probiotics S.A.)に従って行われた。 Method. L. The assessment of the bile salt hydrolase (BSH) activity of Plantarum Inducia DSM 21379 was performed according to Cone Castellana, 2009 (see, for example, US Pat.
3種の乳酸杆菌属種株を、微好気性条件、37℃で、MRS寒天上で一晩培養した。インキュベートした後、培養物をMcFarland 3.0に標準化した。単一株培養物をBSH活性に関してアッセイした。4%(w/v)のタウロデオキシコール酸のナトリウム塩(TDCA、Sigma、USA)および0.37g/lのCaCl2が補充されたMRS寒天プレート上で滅菌したペーパーディスクの周りに培養物を含浸させた。プレートを、37℃で72時間、嫌気的にインキュベートし、ディスクの周りの沈殿ゾーンの直径を測定した。次いで、阻害ゾーン直径(IZD、mm)からディスク直径(DD、mm)を引き、この差を2で割ることによって、BSH活性=(IZD−DD)/2という式に従いBSH活性を計算した(表1)。 Three Lactobacillus strains were cultured overnight on MRS agar at 37 ° C. under microaerobic conditions. After incubation, the culture was standardized to McFarland 3.0. Single strain cultures were assayed for BSH activity. Cultures around paper discs sterilized on MRS agar plates supplemented with 4% (w / v) sodium taurodeoxycholic acid (TDCA, Sigma, USA) and 0.37 g / l CaCl 2 Impregnated. The plate was incubated anaerobically at 37 ° C. for 72 hours and the diameter of the precipitation zone around the disc was measured. The BSH activity was then calculated according to the formula BSH activity = (IZD-DD) / 2 by subtracting the disc diameter (DD, mm) from the inhibition zone diameter (IZD, mm) and dividing this difference by 2 (Table 1).
L.プランタルムInducia DSM21379のBSH活性は、参照L.プランタルム株BAA793およびL.ガセリ(L.gasseri)DSM23882よりも高かった(表1)。 L. The BSH activity of Plantarum Inducia DSM 21379 is described in Reference L. Plantar strains BAA793 and L. It was higher than L. gasseri DSM23882 (Table 1).
(実施例2)
L.プランタルムInducia DSM21379のLDL−コレステロールを減少させる能力
ヒトが介入する試験ISRCTN79645828「健康な志願者の血液指標および腸のミクロフローラへのプロバイオティクスヨーグルトの作用」の目的は、その株を含むヨーグルトと共に消費された場合の血中におけるL.プランタルムInducia DSM21379の短期間(3週間)のLDL−コレステロールを減少させる能力を査定することであった。
(Example 2)
L. Plantar Inducia DSM 21379's ability to reduce LDL-cholesterol Human-intervented study ISRCTN 79645828 “The effect of probiotic yogurt on blood index and microflora of healthy volunteers” was consumed with yogurt containing the strain L. in the blood when It was to assess the ability of Plantarum Inducia DSM 21379 to reduce LDL-cholesterol in the short term (3 weeks).
ヨーグルト調製物。補助的なスターターとして(接種用量は牛乳1t当たり1g)L.プランタルムInducia DSM21379(2×1011CFU/g)を使用して調整済みの低温殺菌(+92〜+95℃で5分)牛乳からプロバイオティクスヨーグルトを得た。低温殺菌した牛乳を短時間で+35〜+43℃に冷却し、その後、スターター培養物およびプロバイオティクス株と混合した。牛乳をpH4.2〜4.5に達するまで発酵させ、+23〜+27℃に冷却した。ヨーグルトを5%の糖で加糖し、プラスチックカップに入れ、+2〜+6℃に冷却した。補助的なプロバイオティクスを含まないヨーグルトを対照として利用した。 Yogurt preparation. As an auxiliary starter (inoculation dose is 1 g / t of milk) Probiotic yoghurt was obtained from conditioned pasteurized (+ 92- + 95 ° C. for 5 min) milk using Plantarum Inducia DSM 21379 (2 × 10 11 CFU / g). Pasteurized milk was quickly cooled to +35 to + 43 ° C. and then mixed with starter cultures and probiotic strains. Milk was fermented to reach pH 4.2-4.5 and cooled to + 23- + 27 ° C. Yogurt was sugared with 5% sugar, placed in a plastic cup and cooled to +2 to + 6 ° C. Yogurt without supplemental probiotics was used as a control.
ヒト志願者の試験の設計。二重盲検プラセボ対照(DBPC)交差探索的試験を、ヘルシンキ宣言のガイドラインに従って実行した。試験は、エストニアのタルトゥ大学のヒトへの調査に関する倫理審査委員会(プロトコール番号190T−11、2010)によって承認された。全ての参加者は、登録時に彼らの書面によるインフォームドコンセントに署名し、いつでも研究を辞退する機会が与えられた。健康な成人(n=49)における健康状態のバイオマーカーに対するL.プランタルムInducia DSM21379を含むヨーグルトの作用を調査するために研究を行った。研究前の1ヶ月以内は、参加者は、彼らの通常の食事を継続して、プロバイオティクス製品(例えば食物補助食品、ヨーグルト、チーズ、ケフィアなど)を回避するように求められた。 Human volunteer trial design. A double blind placebo controlled (DBPC) cross-exploratory study was performed according to the guidelines of the Declaration of Helsinki. The study was approved by the Ethics Review Board (Protocol No. 190T-11, 2010) for human research at Tartu University, Estonia. All participants signed their written informed consent at enrollment and were given the opportunity to withdraw from the study at any time. L. for biomarkers of health status in healthy adults (n = 49). A study was conducted to investigate the effects of yogurt including plantarum Inducia DSM 21379. Within one month prior to the study, participants were asked to continue their regular diet and avoid probiotic products (eg food supplements, yogurt, cheese, kefir, etc.).
参加者の2つの群が、同時に、毎日150gの試験ヨーグルト、すなわちL.プランタルムInducia DSM21379(4×107CFU/g)を含むヨーグルトまたは対照ヨーグルトを3週間消費することから始めた。プロバイオティクスL.プランタルムInduciaの1日用量は、6×109CFUであった。2週間のウォッシュアウト期間後、志願者を交差させて、さらに3週間、プロバイオティクスヨーグルトまたは対照ヨーグルトを消費させた。 Two groups of participants simultaneously received 150 g of test yogurt daily, ie L.P. The consumption of yogurt containing plantarum Inducia DSM 21379 (4 × 10 7 CFU / g) or control yogurt was started for 3 weeks. Probiotic L. The daily dose of Plantarum Inducia was 6 × 10 9 CFU. After a 2-week washout period, volunteers were crossed and consumed probiotic yogurt or control yogurt for an additional 3 weeks.
(臨床調査)
対象を臨床的に調査し、一晩断食してあらゆる薬物、タバコ、アルコールおよび茶またはコーヒーを断った後に血漿サンプルを収集した。各参加者を人体測定的な指標に関して評価した。肥満指数(BMI)を、身長の二乗(m2)で割った重量(kg)として計算した。BMIを使用して、健康な志願者における正常な体重の範囲(18.5〜24.9kg/m2)、過体重(≧25.0kg/m2)および肥満(≧30.0kg/m2)に分類した(例えば、非特許文献24を参照。)。
(Clinical investigation)
Subjects were clinically investigated and plasma samples were collected after an overnight fast to refuse any drugs, tobacco, alcohol and tea or coffee. Each participant was evaluated for anthropometric indicators. Body mass index (BMI) was calculated as weight (kg) divided by height squared (m 2 ). Use BMI, the range of normal body weight in healthy volunteers (18.5~24.9kg / m 2), overweight (≧ 25.0kg / m 2) and obese (≧ 30.0kg / m 2 (See, for example, Non-Patent Document 24).
空腹時血液のサンプルを、4回、すなわち加入時、L.プランタルムInducia DSM21379を含む製品または対照製品のいずれかの投与後、ウォッシュアウト期間後、および試験終了時の対照またはプロバイオティクス製品の投与後に収集した。 Samples of fasting blood were taken 4 times, ie at the time of enrollment. Collected after administration of either a product containing Plantarum Inducia DSM 21379 or a control product, after a washout period, and after administration of a control or probiotic product at the end of the study.
血液学的指標:血漿脂質:総コレステロール、LDL−コレステロール(LDL−c)、HDL−コレステロール(HDL−c)およびトリグリセリドを、その地域の臨床実験室(United Laboratories of Tartu University Clinics、Estonia)において認定されたアッセイを使用した標準的な実験方法によって決定した。Nordic Reference Interval Projectによって提唱された慣例的な実験室試験に関するインターバル(例えば、非特許文献25を参照。)を参考として使用した。 Hematological indicators: plasma lipids: total cholesterol, LDL-cholesterol (LDL-c), HDL-cholesterol (HDL-c) and triglycerides certified in the local clinical laboratory (United Laboratories of Clinical Clinics, Estonia) Determined by standard experimental methods using the assay described. The interval for routine laboratory testing proposed by the Nordic Reference Interval Project (see, eg, Non-Patent Document 25) was used as a reference.
(統計的分析)
R2.10.1(例えば、非特許文献26を参照、2014年3月25日検索)およびウィンドウズ用のGraphPad Prismバージョン4.00(GraphPad Software、San Diego、CA)を使用することによって統計的分析を行った。全てのデータを平均および標準偏差(平均±SD)として表した。データ分布に従った対応のあるt検定またはウィルコクソンの順位和検定によりベースラインと介入データとを比較した。
(Statistical analysis)
Statistical analysis by using R2.10.1 (eg, see Non-Patent Document 26, searched March 25, 2014) and GraphPad Prism version 4.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA) Went. All data were expressed as mean and standard deviation (mean ± SD). Baseline and intervention data were compared by paired t test or Wilcoxon rank sum test according to the data distribution.
値がp<0.05の場合に差を統計学的に有意とみなした。 Differences were considered statistically significant when the value was p <0.05.
交差試験の健康な志願者の2つの群は、それらの臨床データの点で異なっていなかった(表2)。 The two groups of healthy volunteers in the cross-test were not different in terms of their clinical data (Table 2).
L.プランタルムInducia DSM21379消費後の主要な変化は、LDL−コレステロール粒子の含量で明らかにされた。L.プランタルムInducia DSM21379を含むヨーグルトの消費後に、LDL−コレステロール含量は減少した
(表3)。
L. The major change after consumption of plantarum Inducia DSM 21379 was revealed by the content of LDL-cholesterol particles. L. After consumption of yogurt containing plantarum Inducia DSM 21379, LDL-cholesterol content decreased (Table 3).
したがって、3週間にわたるL.プランタルムInducia DSM21379ヨーグルトの消費は、血中のLDL−コレステロールレベルを9.1%低下させた。 Therefore, L. Consumption of Plantarum Inducia DSM 21379 yogurt reduced the LDL-cholesterol level in the blood by 9.1%.
(実施例3)
酸化ストレスマーカーである酸化低密度リポタンパク質(oxLDL)、酸化ストレス度(OSI)および総過酸化物カウント(TPX)に対する、L.プランタルムInducia DSM21379を含むヨーグルトの作用。
(Example 3)
For oxidative stress markers oxidized low density lipoprotein (oxLDL), degree of oxidative stress (OSI) and total peroxide count (TPX). Effect of yogurt containing plantarum Inducia DSM 21379.
並行群間二重盲検試験ISRCTN26344255中に、軽度の高コレステロール血症(LDL−コレステロールが≧3.0mmol/L)の成人(n=136)が、8週間にわたり毎日150gのプロバイオティクス(L.プランタルムInducia DSM21379の1日用量は5×109CFU)または対照ヨーグルトを消費した。介入の4週間後にプロバイオティクス製品の短期間の作用を測定し、試験の最後に、すなわち介入の8週間後に持続的な作用を測定した。 During a parallel intergroup double-blind study IRCTN 26344255, adults with mild hypercholesterolemia (LDL-cholesterol> 3.0 mmol / L) (n = 136) were treated with 150 g of probiotics (L Plantarum Inducia DSM 21379 daily dose was 5 × 10 9 CFU) or control yogurt was consumed. The short term effect of the probiotic product was measured 4 weeks after the intervention and the sustained effect was measured at the end of the study, ie 8 weeks after the intervention.
試験は、エストニアのタルトゥ大学のヒトへの調査に関する倫理審査委員会(プロトコール番号207/M−11 19.09.2011)によって承認された。 The study was approved by the Ethics Review Board (Protocol No. 207 / M-11 19.09.2011) for human research at the University of Tartu, Estonia.
平均5×109CFUの1日用量でのL.プランタルムInducia DSM21379を含むヨーグルト150gの消費は、第4週から第8週の間(−0.12mmol/L;p=0.04)およびベースラインから第8週までに(−0.09mmol/L;p=0.029)プロバイオティクス群において安定した群内でのLDL−コレステロール低減をもたらした(表4aおよび4b)。 L. at an average daily dose of 5 × 10 9 CFU. Consumption of 150 g yogurt containing plantarum Inducia DSM 21379 was between 4th and 8th week (−0.12 mmol / L; p = 0.04) and from baseline to 8th week (−0.09 mmol / L) P = 0.029) resulted in stable LDL-cholesterol reduction in the probiotic group (Tables 4a and 4b).
ox−LDLは、LDL粒子に特異的な酸化ストレスのマーカーであることから、ox−LDLは、冠動脈心疾患に関する生化学的なリスクマーカーの1つとみなすことができる。L.プランタルムInducia DSM21379を含むヨーグルトの投与は、8週間の介入の間中ずっとプロバイオティクスヨーグルト群において安定した群内でのox−LDLの低減をもたらした(表5aおよび5b)。ベースラインから第8週まで、変化は統計学的に有意であった(−4.10U/L;p=0.003)。プラセボに対しても変化は有意であった(p=0.026)。プラセボ群においてoxLDLへの作用は記録されなかった。 Since ox-LDL is a marker of oxidative stress specific to LDL particles, ox-LDL can be regarded as one of the biochemical risk markers for coronary heart disease. L. Administration of yogurt with plantarum Inducia DSM 21379 resulted in a stable intra-ox reduction of ox-LDL in the probiotic yogurt group throughout the 8-week intervention (Tables 5a and 5b). From baseline to week 8, the change was statistically significant (-4.10 U / L; p = 0.003). The change was also significant for placebo (p = 0.026). No effect on oxLDL was recorded in the placebo group.
L.プランタルムInducia DSM21379を含むプロバイオティクスヨーグルトの投与はまた、プロバイオティクス群においてベースラインから第8週までに酸化ストレス度(OSI)の有意な低減(−5.37;p<0.001)ももたらした(表6aおよび6b)。プラセボに対しても変化は有意であった(p=0.04)。プラセボ群において作用は記録されなかった。 L. Administration of probiotic yogurt containing plantarum Inducia DSM 21379 also resulted in a significant reduction (−5.37; p <0.001) of oxidative stress (OSI) from baseline to week 8 in the probiotic group. (Tables 6a and 6b). The change was also significant for placebo (p = 0.04). No effect was recorded in the placebo group.
研究全体で、プロバイオティクス(すなわちL.プランタルムInduciaを含むプロバイオティクス)群において総過酸化物カウント(TPX)の安定した有意な群間の低減が記録された(表7aおよび7b)。プラセボ群において作用は記録されなかった。総抗酸化能において有意な変化は検出されなかった(表8aおよび8b)。 Throughout the study, a stable significant intergroup reduction in total peroxide count (TPX) was recorded in the probiotics (ie, probiotics containing L. plantarum Inducia) group (Tables 7a and 7b). No effect was recorded in the placebo group. No significant change in total antioxidant capacity was detected (Tables 8a and 8b).
結論。ヒト介入試験によれば、L.プランタルムInducia DSM21379を含む組成物は、血中のLDL−コレステロールの低減を介して心臓保護的な作用を有し、同時に、酸化損傷からヒトの体を保護し、酸化ストレスマーカーであるoxLDL、OSIおよびTPXを低下させることによって抗酸化活性を強化する。
II.C.ディフィシレ胞子の発芽および栄養細胞の増殖を予防することによる抗微生物剤としてのL.プランタルムInducia株DSM21379の使用
Conclusion. According to human intervention studies, L. A composition comprising Plantarum Inducia DSM 21379 has a cardioprotective effect through the reduction of LDL-cholesterol in the blood, while at the same time protecting the human body from oxidative damage and oxLDL, OSI and oxidative stress markers Strengthens antioxidant activity by lowering TPX.
II. C. L. as an antimicrobial agent by preventing germination of difficile spores and proliferation of vegetative cells. Use of Plantarum Inducia strain DSM21379
(実施例4)
インビトロでの嫌気性環境におけるC.ディフィシレ参照株の栄養細胞に対するL.プランタルムInducia DSM21379のアンタゴニスト活性
研究の目的は、嫌気性環境におけるC.ディフィシレ参照株に対するL.プランタルムInducia DSM21379のアンタゴニスト活性を評価することであった。
Example 4
C. in an anaerobic environment in vitro. L. difficile reference strain for vegetative cells Antagonism of Plantarum Inducia DSM 21379 The aim of the study was to investigate C. aeruginosa in anaerobic environment. L. difficile reference strain It was to evaluate the antagonist activity of Plantarum Inducia DSM 21379.
方法。試験された株は、L.プランタルムInducia DSM21379およびC.ディフィシレVPI10463(ATCC43255)、M13042高毒性株であった。 Method. The strains tested are Plantarum Inducia DSM 21379 and C.I. Difficile VPI 10463 (ATCC 43255), M13042 highly toxic strain.
株を固体培地上に植え付け、嫌気性環境中でインキュベートした。生理食塩水中の細菌の懸濁液を、MacFarland標準3に従って(108CFU/mlに)調整した。200mlのBHI培地中の懸濁液(0.2ml)を105CFU/mlの濃度に達するように植え付けた。 Strains were planted on solid media and incubated in an anaerobic environment. A suspension of bacteria in saline was prepared according to MacFarland standard 3 (10 8 CFU / ml). A suspension (0.2 ml) in 200 ml BHI medium was planted to reach a concentration of 10 5 CFU / ml.
様々な時間スケールで、MRSおよびLAB160培地に成長のための細菌のシーディングを行った(0.1ml)。プレートを嫌気性および微好気性条件でインキュベートした。2〜5日後に成長をチェックし、結果をlog10CFU/mlとして表した。 At various time scales, MRS and LAB160 media were seeded with bacteria for growth (0.1 ml). Plates were incubated under anaerobic and microaerobic conditions. Growth was checked after 2-5 days and results were expressed as log 10 CFU / ml.
L.プランタルムInducia DSM21379によるC.ディフィシレ栄養細胞の完全な抑制がBHI培地中の共培養後に見出され、MRSおよびCD LAB180選択培地にさらに植え付けたところ、48時間のインキュベーション後、L.プランタルムInducia DSM21379は、BHI培地中24時間で最大値を示した。48時間後、L.プランタルムInducia DSM21379の成長量は、単一培養物(6.3logCFU/g)またはC.ディフィシレ株と組み合わされた場合(7.3および6.0logCFU/g)で等しく中程度に抑制された(表9)。 L. Plantar Inducia DSM 21379 according to C.I. Complete suppression of difficile vegetative cells was found after co-culture in BHI medium and was further inoculated into MRS and CD LAB180 selective medium. Plantarum Inducia DSM 21379 showed a maximum value in BHI medium at 24 hours. 48 hours later, Plantum Inducia DSM 21379 is grown in a single culture (6.3 log CFU / g) or C.I. When combined with the difficile strain (7.3 and 6.0 log CFU / g), it was equally moderately suppressed (Table 9).
(実施例5)
インビトロにおけるクロストリジウム・ディフィシレ参照および臨床株の栄養細胞に対するラクトバチルス・プランタルムInducia DSM21379の上清の作用
以下のインビトロでの実験の目的は、参照および臨床用C.ディフィシレ株に対するL.プランタルムInducia DSM21379栄養細胞の抗微生物作用を決定することであった。L.プランタルムInducia DSM21379の天然型(酸性)の上清と中和された上清(阻害物質、例えばペプチド)との抑制作用の区別は、2つのメカニズム、すなわち有機酸の影響またはバクテリオシンの存在のいずれかを識別するのに役立つ。
材料(株)(表10)
L.プランタルムInducia DSM21379
クロストリジウム・ディフィシレ参照株VPI10463およびM13042
クロストリジウム・ディフィシレ臨床株(11株)
方法。マイクロタイタープレート(MTP)アッセイによって、参照および臨床C.ディフィシレ株に対するL.プランタルムInducia DSM21379の上清の抗微生物活性を決定した。
(Example 5)
Effect of Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 Supernatant on Clostridium difficile reference and vegetative cells of clinical strains in vitro The purpose of the following in vitro experiments is the reference and clinical C.I. L. difficile strain It was to determine the antimicrobial action of Plantarum Inducia DSM 21379 vegetative cells. L. The distinction between the suppressive action of the plantarum Inducia DSM 21379 natural (acidic) supernatant and neutralized supernatant (inhibitor, eg peptide) is due to two mechanisms: the effect of organic acids or the presence of bacteriocin To help identify.
Materials Co., Ltd. (Table 10)
L. Plantarum Inducia DSM 21379
Clostridium difficile reference strains VPI10463 and M13042
Clostridium difficile clinical strain (11 strains)
Method. By microtiter plate (MTP) assay, reference and clinical C.I. L. difficile strain The antimicrobial activity of the supernatant of plantarum Inducia DSM 21379 was determined.
L.プランタルムInducia DSM21379を、ガラスビーズ上のマイクロチューブ中で、−80℃で維持し、0.15%寒天を含むMRS液体培地中で、短時間で活性化し、微好気性条件(10%CO2)下、37℃で24時間インキュベートした。一晩のL.プランタルムInducia DSM21379培養物を使用して、BHI液体培地に1%v/vで植え付け、微好気性条件中で24時間インキュベートした。L.プランタルムInducia DSM21379の抗微生物活性を検出するために、24時間経過したBHI液体培地培養物から遠心分離によって細胞外の無細胞上清(CFS)を収集した。無細胞上清のpHを測定し、半分に分割した。その半分を酸性のままにし、他方の半分を6NのNaOHでpH6.0に中和し、両方の上清をろ過滅菌した。 L. Plantarum Inducia DSM 21379 was maintained at −80 ° C. in a microtube on glass beads and activated in MRS liquid medium containing 0.15% agar in a short time under microaerobic conditions (10% CO 2 ). The mixture was incubated at 37 ° C. for 24 hours. Overnight L. Plantarum Inducia DSM 21379 cultures were used to inoculate BHI liquid medium at 1% v / v and incubated for 24 hours in microaerobic conditions. L. To detect the antimicrobial activity of Plantarum Inducia DSM 21379, extracellular cell-free supernatant (CFS) was collected by centrifugation from a BHI liquid medium culture after 24 hours. The pH of the cell-free supernatant was measured and divided in half. One half was left acidic, the other half was neutralized with 6N NaOH to pH 6.0, and both supernatants were filter sterilized.
C.ディフィシレ株を、ガラスビーズ上、マイクロチューブ中で、−80℃で維持し、嫌気性環境(嫌気性のグローブボックス、ガスは90%N:5%CO2:5%H2)中で、ウマ血液が補充された難培養嫌気性菌寒天(FAA:Fastidious Anaerobe Agar)で24時間にわたり短時間で活性化した。一晩のC.ディフィシレ培養物を、MacFarland3.0に従った密度を有する懸濁液に使用した。L.プランタルムInducia DSM21379の抗微生物活性を評価するために、20μlのC.ディフィシレ細胞懸濁液を、180μl:(1)BHI液体培地(対照として)、(2)無細胞BHI上清、(3)無細胞で中和されたBHI上清、(4)希釈された無細胞上清(滅菌BHI液体培地で1:1)および(5)希釈され中和された無細胞上清(滅菌BHI液体培地で1:1)に添加した。 C. The difficile strain is maintained on glass beads in a microtube at −80 ° C. in an anaerobic environment (anaerobic glove box, gas is 90% N: 5% CO 2 : 5% H 2 ) It was activated in a short period of time over 24 hours with blood-supplemented anaerobic agar (FAA). Overnight C.I. The difficile culture was used for a suspension having a density according to MacFarland 3.0. L. To evaluate the antimicrobial activity of plantarum Inducia DSM 21379, 20 μl C.I. Difficile cell suspension was prepared in 180 μl: (1) BHI liquid medium (as a control), (2) cell-free BHI supernatant, (3) cell-free neutralized BHI supernatant, (4) diluted none Cell supernatant (1: 1 with sterile BHI liquid medium) and (5) diluted and neutralized cell-free supernatant (1: 1 with sterile BHI liquid medium) were added.
C.ディフィシレの成長(光学密度値における変化)を、MTPリーダーを使用して48時間後にOD620nmで測定し、成長速度を計算した。 C. The growth of difficile (change in optical density value) was measured at OD 620 nm after 48 hours using an MTP reader and the growth rate was calculated.
クラスカル−ウォリスの検定を用いてL.プランタルムInducia DSM21379の抑制活性を試験し、C.ディフィシレ対照の成長密度(OD620nm)を、天然型および中和された上清、ならびに希釈液中でのC.ディフィシレの成長密度のデータと比較した。PAST統計ウェブ提供のプログラムを使用してデータの統計的分析を行った。 L. using the Kruskal-Wallis test. The inhibitory activity of plantarum Inducia DSM 21379 was tested and C.I. The growth density (OD 620 nm ) of the difficile control was determined by comparing the C. difficile control with C. Compared with the data on the growth density of difficile. Statistical analysis of the data was performed using a program provided by the PAST Statistics Web.
臨床株:C.ディフィシレCDE、CDP1−9;参照株:C.ディフィシレVPI10463(ATCC43255)およびC.ディフィシレM13042(リボタイプ027に属するカナダからの流行性株)の栄養細胞。 Clinical strain: C.I. Difficile CDE, CDP1-9; reference strain: C.I. Difficile VPI 10463 (ATCC 43255) and C.I. Vegetative cells of difficile M13042 (a pandemic strain from Canada belonging to ribotype 027).
したがって、L.プランタルムInducia DSM21379株は、天然型の製品における酸産生(pHを減少させる)と、それより程度は低いものの上清の中和後(中和された製品)でも、なお活性ないくつかの抗微生物性タンパク質様の物質の両方のために、C.ディフィシレに対して抗微生物活性を有する(表10)。 Therefore, L. Plantarum Inducia DSM 21379 is a strain of antimicrobials that is still active after acid production in natural products (decreasing pH) and, to a lesser extent, neutralization of the supernatant (neutralized product). For both sex protein-like substances, C.I. Has antimicrobial activity against difficile (Table 10).
(実施例6)
キシリトール含有培地中でのL.プランタルムInducia DSM21379の成長およびpH値の試験
研究の目的は、キシリトールがC.ディフィシレに対するL.プランタルムInducia DSM21379のアンタゴニスト活性に影響を与えるのかどうかを見出すことであった。
(Example 6)
L. in a medium containing xylitol. Plantar Inducia DSM 21379 Growth and pH Value Testing The purpose of the study was that xylitol was C.I. L. for difficile It was to find out whether it would affect the antagonist activity of Plantarum Inducia DSM 21379.
Inducia(105CFU/ml)を、グルコースを5%キシリトールで置き換えたMRS培地中でインキュベートするか、または微好気性および嫌気性環境で糖なしで使用した。乳酸杆菌数を培地1ml当たりのCFUとして記録した。本発明者らは、インビトロで、L.プランタルムInducia DSM21379が微好気性および嫌気性条件中で成長のためにキシリトールを使用するかどうかを2、6、24、および48時間で試験した。 Inducia (10 5 CFU / ml) was incubated in MRS medium with glucose replaced with 5% xylitol or used without sugar in a microaerobic and anaerobic environment. The number of lactobacilli was recorded as CFU per ml of medium. We have described L. in vitro. Whether Plantarum Inducia DSM 21379 uses xylitol for growth in microaerobic and anaerobic conditions was tested at 2, 6, 24, and 48 hours.
24時間で、キシリトール含有またはキシリトール非含有で供給された培地を使用したところ、L.プランタルムInducia DSM21379の成長に差はなく、微好気性環境では24時間で5%キシリトール培地中での成長が最良であったが、嫌気性環境ではグルコース含有培地より2log低かった(表11)。 Using a medium supplied with or without xylitol at 24 hours, L. There was no difference in the growth of Plantarum Inducia DSM 21379, growing best in 5% xylitol medium at 24 hours in the microaerobic environment, but 2 logs lower than the glucose-containing medium in the anaerobic environment (Table 11).
この実験から、L.プランタルムInducia DSM21379は、MRS培地中でキシリトールを効果的に代謝しないことが証明された。5%キシリトール含有改変MRS培地中でのL.プランタルムInducia DSM21379の成長後におけるpH変化を試験した。 From this experiment, L. Plantar Inducia DSM 21379 proved not to metabolize xylitol effectively in MRS medium. L. in a modified MRS medium containing 5% xylitol. The pH change after growth of plantarum Inducia DSM 21379 was tested.
有機酸産生による最も低いpH値は、嫌気性環境でインキュベートしたグルコース含有対照培地中で見られた。キシリトール含有培地において、それでもなお微好気性および嫌気性条件の両方でpH6.2からpH5.0のpH低下が見られたが、それでもなおpH7.5からpH=3.2のグルコース含有対照培地のpHとは実質的に異なっていた(図1)。
L.プランタルムInducia DSM21379の代謝におけるキシリトールの使用
この研究の目的は、微好気性および嫌気性環境におけるL.プランタルムInducia DSM21379によるキシリトールの使用を測定することであった。
The lowest pH value due to organic acid production was seen in glucose-containing control medium incubated in an anaerobic environment. In xylitol-containing media, there was still a pH drop from pH 6.2 to pH 5.0 under both microaerobic and anaerobic conditions, but nevertheless of the glucose-containing control media from pH 7.5 to pH = 3.2. It was substantially different from pH (FIG. 1).
L. Use of Xylitol in the Metabolism of Plantarum Inducia DSM 21379 The purpose of this study was to investigate L. It was to measure the use of xylitol by Plantarum Industia DSM 21379.
方法:2から120時間にわたる微好気性および嫌気性環境での5%キシリトール含有MRS培地中でのL.プランタルムInducia DSM21379の培養により、二重の実験を行った。マススペクトロメトリーQTRAP3200(Applied Biosystems、USA)を用いてキシリトールを検出した。サンプルを10000gで3分間遠心分離し、100倍に希釈し、50μlを、50μlの内部標準(アセトニトリル中5mMのD4−コハク酸、50μl)と混合した。5μlの希釈液を、50%アセトニトリル/水の溶離剤を使用してマススペクトロメトリーに注入した。多重反応モニタリング(MRM)イオン対151/101(キシリトール)および121/77(内部標準)によって物質を同定した。市販のキシリトール(Sigma−Aldrich、Germany)の濃度が公知の溶液で作製した検量線から濃度を計算した。 Method: L. in MRS medium containing 5% xylitol in a microaerobic and anaerobic environment for 2 to 120 hours. Duplicate experiments were performed with plantarum Inducia DSM 21379 culture. Xylitol was detected using mass spectrometry QTRAP3200 (Applied Biosystems, USA). Samples were centrifuged at 10000 g for 3 minutes, diluted 100-fold, and 50 μl was mixed with 50 μl internal standard (5 mM D4-succinic acid in acetonitrile, 50 μl). 5 μl of the diluent was injected into the mass spectrometer using 50% acetonitrile / water eluent. Substances were identified by multiple reaction monitoring (MRM) ion pairs 151/101 (xylitol) and 121/77 (internal standard). The concentration was calculated from a calibration curve prepared with a solution having a known concentration of commercially available xylitol (Sigma-Aldrich, Germany).
繰り返しの実験によれば、糖含量が基底値±最大0〜0.6mMの変化で維持されたことから、Induciaはキシリトールを極めて低い量で使用した(表12)。 According to repeated experiments, Inducia used xylitol in a very low amount since the sugar content was maintained at a change of basal value ± max 0-0.6 mM (Table 12).
したがって、本発明者らは、マススペクトロメトリー(質量分析法)によって、L.プランタルムInduciaはキシリトールを極めて低い量で代謝することを確認した。
キシリトールおよびアンピシリンを含有する環境におけるC.ディフィシレ参照株の成長
この研究の目的は、シリアンハムスターにおける精巧なC.ディフィシレ感染モデルに類似した消化管の環境をインビトロで模擬することであった。
Therefore, the present inventors have used L.L. Plantarum Inducia has been confirmed to metabolize xylitol in very low amounts.
C. in an environment containing xylitol and ampicillin. Growth of difficile reference strains The purpose of this study was to develop elaborate C. It was to simulate the gastrointestinal environment similar to the difficile infection model in vitro.
インビトロにおけるブレーンハート培地(BHI)中でのL.プランタルムInducia DSM21379およびC.ディフィシレの参照株(VPI10463および強毒性リボタイプ027株M13042)の成長へのキシリトールおよびアンピシリンの影響を試験した。 In vitro in Brainhart medium (BHI). Plantarum Inducia DSM 21379 and C.I. The effect of xylitol and ampicillin on the growth of difficile reference strains (VPI 10463 and highly virulent ribotype 027 strain M13042) was tested.
L.プランタルムInducia DSM21379および2種のC.ディフィシレの参照株は、対照BHI培地で48時間培養した後、CFU数をほぼ2から4log増加させた。C.ディフィシレ株にキシリトールおよびアンピシリンを作用させた後、変化は見られなかった(表13)。 L. Plantarum Inducia DSM 21379 and two C.I. The difficile reference strain increased CFU numbers by approximately 2 to 4 logs after 48 hours in control BHI medium. C. No changes were observed after xylitol and ampicillin were allowed to act on the difficile strain (Table 13).
L.プランタルムInducia DSM21379株の成長が、5%のキシリトールおよび0.75μl/mlのアンピシリン両方のもとで約2log抑制された。したがって、抗生物質アンピシリンおよび最大5%のキシリトールが投与された消化管の微環境において、LプランタルムInduciaの生存が認められた。 L. Plantarum Inducia strain DSM21379 was inhibited by approximately 2 logs under both 5% xylitol and 0.75 μl / ml ampicillin. Thus, survival of L plantarum Inducia was observed in the gastrointestinal microenvironment administered antibiotic ampicillin and up to 5% xylitol.
(実施例7)
キシリトールおよびアンピシリンの異なる濃度での共培養によるL.プランタルムInducia DSM21379およびC.ディフィシレ参照株の成長
この研究の目的は、キシリトールおよびアンピシリンの異なる濃度での共培養によるL.プランタルムInducia DSM21379およびC.ディフィシレ参照株の成長を評価することであった。
(Example 7)
L. by co-culture with different concentrations of xylitol and ampicillin. Plantarum Inducia DSM 21379 and C.I. Growth of the difficile reference strain The purpose of this study was to investigate the growth of L. cerevisiae by co-culture with different concentrations of xylitol and ampicillin. Plantarum Inducia DSM 21379 and C.I. It was to evaluate the growth of the difficile reference strain.
5%キシリトールおよび0.75μl/mlアンピシリンが補充されたBHI培地を、24および48時間にわたる嫌気性環境(ワークステーションConcept 400、UK)中でのL.プランタルムInducia DSM21379およびC.ディフィシレ参照株の共培養に適用した。 BHI medium supplemented with 5% xylitol and 0.75 μl / ml ampicillin was treated with L. in an anaerobic environment (workstation Concept 400, UK) for 24 and 48 hours. Plantarum Inducia DSM 21379 and C.I. Application to co-culture of difficile reference strain.
アンピシリンおよびキシリトール5%含有BHI培地における単一でのL.プランタルムInducia DSM21379、C.ディフィシレVPIおよびM参照株の共培養後の生存率を試験した(1、2a、2b)。その後、L.プランタルムInducia数を決定するためのMRS液体培地での10倍連続希釈液をCO2環境において培養し、C.ディフィシレの場合は嫌気性環境においてLAB160培地で培養した。 Single L. pneumoniae in BHI medium containing 5% ampicillin and xylitol. Plantarum Inducia DSM 21379, C.I. Viability after co-culture of difficile VPI and M reference strain was tested (1, 2a, 2b). Then, L. 10-fold serial dilutions in MRS liquid medium to determine plantarum Inducia number in a CO 2 environment; In the case of difficile, it was cultured in LAB160 medium in an anaerobic environment.
インビトロにおけるキシリトールおよびアンピシリン含有BHI培地中でのL.プランタルムInducia DSM21379(3)およびC.ディフィシレの参照株(4、5)の共培養の間に(ハムスターモデルを模擬)、両方のC.ディフィシレ株の栄養細胞の成長が抑制された。VPI株では完全な抑制を検出することができ、C.ディフィシレ株Mのケースでは5logの実質的な低減(5.0から2.0logCFU/ml)を検出した。 In vitro in BHI medium containing xylitol and ampicillin. Plantarum Inducia DSM 21379 (3) and C.I. During co-culture of the difficile reference strain (4, 5) (simulating a hamster model), Growth of vegetative cells of the difficile strain was suppressed. Complete suppression can be detected in VPI strains, C.I. In the case of difficile strain M, a 5 log substantial reduction (5.0 to 2.0 log CFU / ml) was detected.
したがって、抗生物質処置後の実験用ハムスターモデルの消化管環境を模擬するインビトロでの実験から、L.プランタルムInducia DSM21379を単独で(表5)またはそれとキシリトールとを組み合わせて用いることでC.ディフィシレ成長の完全なまたは高い抑制のいずれかが示された(表14)。 Therefore, from in vitro experiments simulating the gastrointestinal environment of the experimental hamster model after antibiotic treatment, Plantarum Inducia DSM 21379 is used alone (Table 5) or in combination with xylitol. Either complete or high inhibition of difficile growth was shown (Table 14).
(実施例8)
ラクトバチルス・プランタルムInducia DSM21379およびキシリトールの組合せは、クロストリジウム・ディフィシレ参照株VPI胞子の発芽を阻害する。
(Example 8)
The combination of Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 and xylitol inhibits germination of Clostridium difficile reference strain VPI spores.
この実験の目的は、L.プランタルムInducia DSM21379を培地中でプレインキュベートした場合に、クロストリジウム・ディフィシレの発芽を予防するL.プランタルムInducia DSM21379の能力を評価することであった。クロストリジウム・ディフィシレ胞子の発芽へのキシリトールおよびタウロコール酸塩の作用を試験した。タウロコール酸塩は、クロストリジウム・ディフィシレ胞子の発芽を促進する小腸内の天然物質である。 The purpose of this experiment is Prevent germination of Clostridium difficile when plantarum Inducia DSM 21379 is preincubated in culture medium It was to evaluate the ability of Plantarum Inducia DSM 21379. The effects of xylitol and taurocholate on the germination of Clostridium difficile spores were examined. Taurocholate is a natural substance in the small intestine that promotes germination of Clostridium difficile spores.
L.プランタルムInducia DSM21379を、嫌気性条件中、24時間で、様々な薬剤を含有するブレーンハートインフュージョン(BHI)液体培地と共にインキュベートした。L.プランタルムInducia DSM21379のインキュベーション後、クロストリジウム・ディフィシレ胞子を混合物に添加し、BHI液体培地を1:10の比率で濃縮した。 L. Plantarum Inducia DSM 21379 was incubated with Brain Heart Infusion (BHI) liquid medium containing various drugs in anaerobic conditions for 24 hours. L. After incubation of plantarum Inducia DSM 21379, Clostridium difficile spores were added to the mixture and BHI liquid medium was concentrated at a ratio of 1:10.
実験および対照混合物を嫌気性条件中で48時間までインキュベートした。24および48時間後、実験開始時にFastiodious嫌気性菌寒天およびヒトRogosa Sharpe寒天に混合物を植え付けた。L.プランタルムInducia DSM21379およびクロストリジウム・ディフィシレの数を計算した。 Experimental and control mixtures were incubated for up to 48 hours in anaerobic conditions. After 24 and 48 hours, the mixture was planted on Fastiodious anaerobic agar and human Rogosa Sharpe agar at the start of the experiment. L. The number of plantarum Inducia DSM 21379 and Clostridium difficile was calculated.
キシリトールまたはキシリトールとタウロデオキシコール酸との組合せを含有する培地中でのL.プランタルムInducia DSM21379のプレインキュベーションは、クロストリジウム・ディフィシレの発芽を阻害する(表15)。L.プランタルムInducia DSM21379は、キシリトールおよび/またはタウロデオキシコール酸の存在により影響を受けなかった。これらの結果は、動物実験の結果を裏付けている。 In a medium containing xylitol or a combination of xylitol and taurodeoxycholic acid. Plantarum Inducia DSM 21379 preincubation inhibits the germination of Clostridium difficile (Table 15). L. Plantarum Inducia DSM 21379 was not affected by the presence of xylitol and / or taurodeoxycholic acid. These results support the results of animal experiments.
(実施例9)
動物実験
この研究の目的は、C.ディフィシレ胞子で攻撃したハムスターの腸管におけるクロストリジウム・ディフィシレ参照株VPI10463によって引き起こされた感染へのL.プランタルムInducia DSM21379の影響を評価することであった。
Example 9
Animal Experiments The purpose of this study is C.I. L. to infection caused by Clostridium difficile reference strain VPI10463 in the intestine of hamsters challenged with difficile spores. It was to evaluate the effects of Plantarum Inducia DSM 21379.
シリアンハムスター(Mesocricetus auratus)は、よく特徴付けられたクロストリジウム・ディフィシレ感染のモデルを提供する。抗生物質で処置されたハムスターの結腸の微生物叢は破壊され、その後C.ディフィシレ胞子に晒されると、動物は48時間未満でC.ディフィシレ関連下痢症(CDAD)を発症させ、死亡率は100%である。 Syrian Hamster (Mesocritus auratus) provides a well-characterized model of Clostridium difficile infection. The microbiota of the hamster colon treated with antibiotics is destroyed and then C.I. When exposed to S. difficile spores, animals will be C.I. It develops difficile-associated diarrhea (CDAD) and the mortality rate is 100%.
本発明者らは、本発明者らのインビトロでの結果に従ってL.プランタルムInducia DSM21379を投与することによって、C.ディフィシレで攻撃したハムスターの死亡率を減少させることができるのかどうかを試験した。まず本発明者らは、アンピシリン(30mg/kg)の投与前に連続して5日間、1mlの20%キシリトール含有/非含有の1010cfu/ml濃度のL.プランタルムInducia DSM21379を胃管栄養によってハムスターに事前に毎日与えた。上述の濃度のL.プランタルムInducia DSM21379の投与を、実験の全ての間継続した。7日目に、ハムスターにC.ディフィシレVPI104631の10〜30個の胞子を感染させた。次の5日間、ハムスターの健康状態を追跡し、CDAD:ウェットテイルを示す症状の場合、C.ディフィシレA/B毒素試験を行った(X/pect Remel試験)。C.ディフィシレVPI株で感染させたハムスターの群を対照群として利用した。 We follow L. in accordance with our in vitro results. By administering Plantarum Inducia DSM 21379, C.I. We tested whether the mortality of hamsters attacked with difficile can be reduced. First, the inventors have determined that L.I. at a concentration of 10 10 cfu / ml with / without 1 ml of 20% xylitol for 5 consecutive days before administration of ampicillin (30 mg / kg). Plantarum Inducia DSM 21379 was given daily to hamsters by gavage. L. at the above concentrations. Administration of plantarum Inducia DSM 21379 was continued during the entire experiment. On the seventh day, C.I. Ten to thirty spores of difficile VPI 104631 were infected. In the next 5 days, the health status of the hamster is followed, and in the case of symptoms showing CDAD: wet tail, C.I. A difficile A / B toxin test was performed (X / pect Remel test). C. A group of hamsters infected with the difficile VPI strain was used as a control group.
したがって、C.ディフィシレ胞子で攻撃する前に、L.プランタルムInducia DSM21379とキシリトール溶液との組合せを事前に与えた場合に、最大の生存が見出された(表16)。この場合、生存したハムスター(7/9)において毒素試験は全て陰性であり、すなわちC.ディフィシレ胞子の発芽が抑制された。キシリトール単独を適用した場合、生存した動物5匹のうち4匹の毒素試験が陰性であり、1匹の生存した動物でのみ毒素試験が陽性であった。 Therefore, C.I. Before attacking with difficile spores, Maximum survival was found when the combination of Plantarum Inducia DSM 21379 and xylitol solution was given in advance (Table 16). In this case, all surviving toxin tests were negative in viable hamsters (7/9), ie C.I. Sprouting of difficile spores was suppressed. When xylitol alone was applied, 4 of 5 surviving animals tested negative for toxins and only 1 surviving animal tested positive for toxins.
したがって、キシリトールとL.プランタルムInducia DSM21379との組合せは、毒素を生産することができるC.ディフィシレの栄養細胞への胞子発芽を抑制することにより機能する。 Thus, xylitol and L. The combination with Plantarum Inducia DSM 21379 is capable of producing toxins. It functions by suppressing spore germination of difficile into vegetative cells.
本発明者らは、Induciaおよびキシリトールが介入した後でもC.ディフィシレの成長が示されるかどうか、さらにC.ディフィシレのAおよびB毒素が見出されるかどうか(表17)を試験した。L.プランタルムInducia DSM21379およびキシリトールの組合せが事前に与えられた生存したハムスターにおいて、C.ディフィシレ栄養細胞は、7ケースのうち6ケースで空腸および回腸に見出されなかった(1ケースにおいてのみC.ディフィシレの成長が見られた)。空腸および回腸において固有の乳酸杆菌と置き換えられた嫌気性菌およびL.プランタルムInducia DSM21379の数が両方とも高かったことから、アンピシリン投与、C.ディフィシレ胞子での攻撃、ならびにL.プランタルムInducia DSM21379およびキシリトールでの処置の使用後に腸の微生物叢が再構築および安定化されたことが示される。 The inventors have described C.I. even after intervention of Inducia and xylitol. Whether C. difficile growth is indicated, and C.I. Whether difficile A and B toxins were found (Table 17) was tested. L. In living hamsters pre-given with the combination of plantarum Inducia DSM 21379 and xylitol, C.I. No difficile vegetative cells were found in the jejunum and ileum in 6 out of 7 cases (only 1 case showed C. difficile growth). Anaerobic bacteria replaced by native lactobacilli in the jejunum and ileum and L. Since both the numbers of plantarum Inducia DSM 21379 were high, ampicillin administration, C.I. Attack with difficile spores, and It is shown that the gut microbiota was reconstituted and stabilized after use of treatment with plantarum Inducia DSM 21379 and xylitol.
ハムスターの生存率は、L.プランタルムInducia DSM21379のために22%高かった(表16)。これは、大腸の腸内容物に毒素が存在していなかったことによっても証明された(表17)。 The survival rate of hamsters is It was 22% higher for Plantarum Inducia DSM 21379 (Table 16). This was also evidenced by the absence of toxins in the intestinal contents of the large intestine (Table 17).
L.プランタルムInducia DSM21379の成長は、空腸において高かった(0〜6.0の範囲、中央値4.0CFUlog10/gであり、回腸では6.0〜7.6、中央値6.7であった)。L.プランタルムInducia DSM21379は、そのSCFAプロファイルによれば見たところその酸産生によって作用していた。
C.ディフィシレに感染したハムスターの形態学的な評価
C.ディフィシレ感染において毒素による臓器損傷は主要な病原性モジュレーターであることから、ハムスターモデルにおいて典型的なCDAD感染をモデル化した。
L. Plantarum Inducia DSM 21379 growth was high in the jejunum (range 0-6.0, median 4.0 CFUlog 10 / g, ileum 6.0-7.6, median 6.7) . L. Plantarum Inducia DSM 21379 was acting by its acid production according to its SCFA profile.
C. Morphological evaluation of hamsters infected with difficile Since organ damage by toxins is a major virulence modulator in difficile infection, a typical CDAD infection was modeled in a hamster model.
本発明者らの研究において、C.ディフィシレVPI10643株は毒素AおよびBの両方を有し、これらは肝臓および小腸にも存在する(図2および3)。 In our study, C.I. S. difficile VPI 10463 has both toxins A and B, which are also present in the liver and small intestine (FIGS. 2 and 3).
C.ディフィシレ感染から生存し、病理解剖中に大規模な粘膜損傷が検査されなかったハムスターにおいて、偽膜および多形核細胞での重度の浸潤は見られなかった(図4a)。 C. In hamsters that survived difficile infection and had not been examined for extensive mucosal damage during pathological dissection, there was no severe infiltration with pseudomembrane and polymorphonuclear cells (FIG. 4a).
死亡する数時間前におけるC.ディフィシレ感染により障害を受けたハムスターの特徴的な形態学的発見は、粘膜における多形核細胞の浸潤による炎症および偽膜の存在であった。 C. a few hours before death. The characteristic morphological findings of hamsters damaged by difficile infection were inflammation due to infiltration of polymorphonuclear cells in the mucosa and the presence of pseudomembrane.
重度の小腸結腸炎は、赤血球および多形核白血球による消化管粘膜、肝臓および脾臓への浸潤を引き起こし、動物は死に至った。臓器では、充血が起こっていた(図5a〜f)。 Severe enterocolitis caused infiltration of the gastrointestinal mucosa, liver and spleen by erythrocytes and polymorphonuclear leukocytes and the animals died. In the organ, hyperemia occurred (Figs. 5a-f).
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