JP2017511695A

JP2017511695A - ガンを処置するための方法及び医薬組成物

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Publication number: JP2017511695A
Application number: JP2016552561A
Authority: JP
Inventors: ポジェ，ジャン−リュック; ブルッゾーニ−ジョバネッリ，エリベルト; ジャゴ−ラクシエール，レオナール
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Universite Paris Diderot Paris 7
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Universite Paris Diderot Paris 7
Priority date: 2014-02-17
Filing date: 2015-02-17
Publication date: 2017-04-27
Anticipated expiration: 2035-02-17
Also published as: EP3107932A1; US10358469B2; CA2938470C; AU2015216917B2; JP6695276B2; WO2015121496A1; ES2773964T3; US20170058010A1; CA2938470A1; AU2015216917A1; EP3107932B1

Abstract

本発明は、ガンを処置するための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、ポリペプチドであって、ｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又はｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又はｉｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又はｉｖ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなるポリペプチドに関する。

Description

発明の分野：
本発明は、ガンを処置するための方法及び医薬組成物に関する。

発明の背景：
ガン細胞内のいくつかの経路をターゲティングするガン処置が最近開発されている。しかしながら、いくつかの種類のガンは、異なる既知若しくは未知の経路障害を示すか、又は処置耐性を生じる。したがって、これらのガン処置は、これらの種類のガン細胞では細胞死を引き起こさず、様々な種類のガンの処置に有効ではないので、限定的である。

したがって、有効かつ効率的なガン処置及び様々な種類のガンのターゲティングに適切な新たなアプローチ及び薬物を開発する必要がある。このように、ガン細胞の膜分解を介してガンにおける細胞死を誘導する新たな治療化合物の特性評価が非常に望ましい場合があることが示唆されている。

ＡＡＣ−１１は、Ａｐｉ５又はＦＩＦ（Morris et al., 2006; Van den Berghe et al., 2000）とも称される抗アポトーシスタンパク質（抗アポトーシスクローン１１）（Tewari et al., 1997）である。ＡＡＣ−１１は核タンパク質であり、その発現は、成長因子の欠乏後にアポトーシスを抑制することが実証されている（Kim et al., 2000; Tewari et al., 1997）。ＡＡＣ−１１の抗アポトーシス作用は、転写因子Ｅ２Ｆ１誘導性のアポトーシスの抑制によると思われる（Morris et al., 2006）。ＡＡＣ−１１遺伝子は、複数のガン細胞株だけではなく、いくつかの転移性リンパ節組織及びＢ細胞慢性リンパ性白血病で高発現していることが示されている（Clegg et al., 2003; Kim et al., 2000; Krejci et al., 2007; Morris et al., 2006; Sasaki et al., 2001; Tewari et al., 1997; Van den Berghe et al., 2000）。ＡＡＣ−１１の発現は、非小細胞肺ガンを有する小患者群における転帰不良をもたらすと思われるのに対して、その欠乏は、低血清ストレス条件下で腫瘍細胞致死的であると思われる（Krejci et al., 2007; Sasaki et al., 2001）。興味深いことに、ＡＡＣ−１１の過剰発現は、子宮頸ガン細胞の成長及び浸潤の両方を促進することが報告されている（Kim et al., 2000）。総合すると、これらの観察結果は、ＡＡＣ−１１が推定転移性ガン遺伝子であることを暗示している。

当技術分野では、ガンにおけるＡＡＣ−１１−ＬＺ由来ペプチドの効果、ガン細胞の膜分解を介した迅速な細胞死の誘導、並びにガンの治療及び転移性ガンの転移の予防におけるＡＡＣ−１１−ＬＺ由来ペプチドの使用は開示されていない。

本発明は、ガンを処置するための方法及び医薬組成物に関する。

発明の詳細な説明：
本発明者らは、ＡＡＣ−１１タンパク質由来のいくつかのペプチドが、マイクロモル範囲で、複数のガン細胞における重要な細胞機能を選択的に破壊することを実証した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、前記ペプチドが、ガン細胞の原形質膜を特異的にターゲティングすることを見出した。いかなる理論にも縛られないが、前記ペプチドはおそらく、ガン細胞膜中に存在する特定のパートナーに結合する。この結合は、他の膜活性ペプチドについて記載されているように、それが孔形成を受け得る膜内に前記ペプチドが残存することを可能にし得る。本発明者らはまた、低血清条件下で、前記ペプチドが、ガン細胞の膜分解を介して迅速な細胞死を誘導することを実証する。最後に、本発明者らは、前記ペプチドが、細胞の遊走及び浸潤を阻害することを実証する。マウス腫瘍モデルを使用したin vivo研究は、これらのペプチドが、ヒト非小細胞肺ガンＡ５４９皮下異種移植片を担持するヌードマウス、及び患者生検由来の皮下トリプルネガティブ乳房腫瘍異種移植片を担持するヌードマウスにおける腫瘍成長を阻害することを示している。急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）マウスモデルでは、前記ペプチドは、マウスの生存に対して顕著な効果を示した。ＡＡＣ−１１ペプチド誘導性の細胞死は、腫瘍サプレッサーｐ５３の状態と無関係であるので、このような戦略は、幅広い治療活性を有し得る。したがって、本明細書では、本発明者らは、細胞の遊走及び浸潤を障害する新規抗ガンペプチドであって、腫瘍細胞死を特異的に誘導し、有望な治療可能性を提供する新規抗ガンペプチドを報告する。

ＡＡＣ−１１−ＬＺ由来ペプチド
本発明は、単離された、合成又はリコンビナントＡＡＣ−１１ロイシンジッパー（ＬＺ）由来ペプチド（「ＡＡＣ−１１−ＬＺ−由来ペプチド」）を提供する。

本明細書で使用される「ＡＡＣ−１１」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ａｐｉ５又はＦＩＦとしても公知の抗アポトーシスクローン１１タンパク質を指す。ＡＡＣ−１１の例示的なヒトポリペプチド配列は、配列番号：１として記載されているアクセッションナンバーＱ９ＢＺＺ５でＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託されている。
ＡＡＣ−１１Ｑ９ＢＺＺ５の配列番号：１

本発明は、ポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなり、
配列番号：１のアミノ酸配列からならず、配列番号：１の３６３位のアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列からならないポリペプチドに関する。

特定の実施態様では、前記ポリペプチドは、
ｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８８位のイソロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８８位のイソロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８８位のイソロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８８位のイソロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、
前記ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列からならず、配列番号：１の３６３位のアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列からならない。

特定の実施態様では、前記ポリペプチドは、
ｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、
前記ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列からならず、配列番号：１の３６３位のアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列からならない。

特定の実施態様では、前記ポリペプチドは、
ｉ）配列番号：１の３７９位のチロシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７９位のチロシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７９位のチロシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７９位のチロシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、
前記ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列からならず、配列番号：１の３６３位のアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列からならない。

特定の実施態様では、前記ポリペプチドは、
ｉ）配列番号：１の３７８位のグルタミン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７８位のグルタミン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７８位のグルタミン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７８位のグルタミン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、
前記ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列からならず、配列番号：１の３６３位のアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列からならない。

特定の実施態様では、前記ポリペプチドは、
ｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、
前記ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列からならず、配列番号：１の３６３位のアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列からならない。

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、
ｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９７位のグリシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９７位のグリシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９７位のグリシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９７位のグリシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、
前記ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列からならず、配列番号：１の３６３位のアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列からならない。

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、
ｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、
前記ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列からならず、配列番号：１の３６３位のアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列からならない。

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、
ｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、
前記ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列からならず、配列番号：１の３６３位のアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列からならない。

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、
ｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、
前記ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列からならず、配列番号：１の３６３位のアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列からならない。

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、
ｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、
前記ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列からならず、配列番号：１の３６３位のアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列からならない。

本発明によれば、第２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有することを意味する。アミノ酸配列同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰ（Karlin and Altschul, 1990）などの適切な配列アラインメントアルゴリズム及びデフォルトパラメータを使用して決定される。

「レトロインベルソアミノ酸配列」という用語は、アミノ酸配列の方向が逆転しており、各アミノ酸残基のキラリティーが反転している異性体アミノ酸配列に関する。本発明のレトロインベルソアミノ酸配列は、親アミノ酸配列−配列のものと逆の順序でアセンブルされたＤ−アミノ酸から構成され得る。

いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドは、５個、６個、７個、８個、９個；１０個；１１個；１２個；１３個；１４個；１５個；１６個；１７個；１８個；１９個；２０個；２１個；２２個；２３個；２４個；２５個；２６個；２７個；２８個；２９個；３０個；３１個；３２個；３３個；３４個；３５個；３６個；３７個；３８個；３９個；４０個；４１個；４２個；４３個；４４個；４５個；４６個；４７個；４８個；４９個；５０個；５１個；５２個；５３個；５４個；５５個；５６個；５７個；５８個；５９個；６０個；６１個；６２個；６３個；６４個；６５個；６６個；６７個；６８個；６９個；７０個；７１個；７２個；７３個；７４個；７５個；７６個；７７個；７８個；７９個；８０個；８１個；８２個；８３個；８４個；８５個；８６個；８７個；８８個；８９個；９０個；９１個；９２個；９３個；９４個；９５個；９６個；９７個；９８個；９９個；又は１００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドは、５０個未満のアミノ酸を含む。いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドは、３０個未満のアミノ酸を含む。いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドは、２５個未満のアミノ酸を含む。いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドは、２０個未満のアミノ酸を含む。いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドは、１５個未満のアミノ酸を含む。

本発明の融合タンパク質
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの異種ポリペプチドに融合されている本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。

「融合タンパク質」という用語は、少なくとも１つの異種ポリペプチドに直接的に又はスペーサーを介して融合されている本発明のポリペプチドを指す。

本発明によれば、融合タンパク質は、そのＣ末端で異種ポリペプチドのＮ末端に、又はそのＮ末端で異種ポリペプチドのＣ末端に直接的に又はスペーサーを介して融合されている本発明のポリペプチドを含む。

本明細書で使用される「直接的に」という用語は、ポリペプチドの末端（Ｎ又はＣ末端）の（最初又は最後の）アミノ酸が、異種ポリペプチドの末端（Ｎ又はＣ末端）の（最初又は最後の）アミノ酸に融合されていることを意味する。

換言すれば、この実施態様では、前記ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸は、前記異種ポリペプチドのＮ末端の最初のアミノ酸に共有結合によって直接的に連結されているか、又は前記ポリペプチドのＮ末端の最初のアミノ酸は、前記異種ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸に共有結合によって直接的に連結されている。

本明細書で使用される「スペーサー」という用語は、本発明のポリペプチドを異種ポリペプチドに連結する少なくとも１つのアミノ酸の配列を指す。このようなスペーサーは、立体障害を防止するために有用であり得る。

いくつかの実施態様では、異種ポリペプチドは、細胞透過性ペプチド、転写トランス活性化因子（ＴＡＴ）細胞透過性配列、細胞透過ペプチド又は膜透過性配列である。

「細胞透過性ペプチド」という用語は当技術分野で周知であり、細胞透過配列又は膜透過性配列、例えばペネトラチン、ＴＡＴミトコンドリア透過性配列及び化合物（Bechara and Sagan, 2013; Jones and Sayers, 2012; Khafagy el and Morishita, 2012; Malhi and Murthy, 2012）を指す。

特定の実施態様では、異種ポリペプチドは、ショウジョウバエアンテナペディア／ペネトラチン（Ａｎｔｐ）タンパク質のホメオドメイン（アミノ酸４３〜５８；配列番号：２）又は転写トランス活性化因子（ＴＡＴ）細胞透過性配列（配列番号：１２）のいずれかに由来する内在化配列である。

特定の実施態様では、１個、２個又は３個のグリシン残基配列が、ＴＡＴ細胞透過性配列（配列番号：１２）のＣ末端に付加される。

いくつかの実施態様では、本発明の融合タンパク質は、配列番号：４、配列番号：６；配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０；配列番号：１１；配列番号：１３；配列番号：１４；配列番号：１６；及び配列番号：１７からなる群より選択される配列を含むか、又はこれからなる。

別の実施態様では、異種ポリペプチドは、ガン治療用ポリペプチドである。

「ガン治療用ポリペプチド」という用語は、抗ガン活性（例えば、増殖阻害、成長阻害、アポトーシス誘導、転移阻害、接着阻害、血管新生阻害）を有する任意のポリペプチドを指す。当技術分野では、いくつかのこのようなポリペプチドが公知である（例えば、(Boohaker et al., 2012; Choi et al., 2011; Janin, 2003; Li et al., 2013; Sliwkowski and Mellman, 2013)を参照のこと）。

いくつかの実施態様では、異種ポリペプチドは、腫瘍ターゲティング剤である。

腫瘍ターゲティング剤としては、限定されないが、フィブロネクチンのＥＤＢドメインに対する抗体、血管内皮成長因子レセプター２に結合する抗体若しくは薬剤、線維芽細胞成長因子レセプター−１に結合する抗体若しくは分子、ＣＤ３１と相互作用する抗体若しくは薬剤、腫瘍リンパ内皮（ポドプラニン、Ｌｙｖｅ−１）と相互作用する抗体若しくは薬剤、又はαＶβ３インテグリンに結合する抗体若しくは薬剤（例えば、ＲＧＤペプチド）、又は腫瘍膜結合及び細胞内ターゲットと相互作用する抗体若しくは薬剤が挙げられる。

ポリペプチド及び融合タンパク質の生産
本発明のポリペプチド又は融合タンパク質は、それ自体が当技術分野で公知の任意の技術、例えば限定されないが、任意の化学的、生物学的、遺伝子的又は酵素的な技術単独で、又はこれを組み合わせて生産され得る。

所望の配列のアミノ酸配列を理解することにより、当業者であれば、標準的なアミノ酸配列生産技術によって、前記ポリペプチド又は融合タンパク質を容易に生産され得る。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは、市販のペプチド合成装置（Applied Biosystems, Foster City, Californiaによって作製されたものなど）を使用して、製造業者の説明書にしたがって合成され得る。

あるいは、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質は、当技術分野で現在周知のリコンビナントＤＮＡ技術によって合成され得る。例えば、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、所望のポリペプチドを発現する適切な真核生物宿主又は原核生物宿主にこのようなベクターを導入した後に、これらのフラグメントをＤＮＡ発現産物として得ることができ、その後、周知の技術を使用して、前記宿主からそれらを単離することができる。

本発明のポリペプチド又は融合タンパク質は、単離された（例えば、精製された）形態で使用され得るか、又は膜若しくは脂質小胞（例えば、リポソーム）などのベクターに含められ得る。

特定の実施態様では、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質は、それらの治療有効性を改善するために改変され得ることが企図される。治療化合物のこのような改変は、毒性を減少させ、循環時間を増加させ、又は生体内分布を改変するために使用され得る。例えば、潜在的に重要な治療化合物の毒性は、生体内分布を改変する様々な薬剤担体ビヒクルと組み合わせることによって有意に減少され得る。

薬物のバイアビリティを改善するための戦略は、水溶性ポリマーの利用である。様々な水溶性ポリマーが、生体内分布を改変し、細胞取込みの様式を改善し、生理学的障壁の透過性を変化させ；体内からのクリアランス速度を改変することを示されている。ターゲティング効果又は徐放効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖上のペンダント基として薬物部分を含有する水溶性ポリマーが合成されている。

例えば、ペグ化は、様々なポリペプチドを改変するための十分に確立及び検証されたアプローチである（Chapman, 2002）。利点としては、とりわけ：（ａ）ポリマーが見かけの分子サイズを糸球体ろ過限界以上に増加させる結果としての腎クリアランスの回避による、及び／又は細胞クリアランス機構の回避によるin vivo循環半減期の顕著な改善；（ｂ）ＰＥＧが結合している分子の抗原性及び免疫原性の低下；（ｃ）薬物動態の改善；（ｄ）共役タンパク質のタンパク分解耐性の増強（Cunningham-Rundles et.al., 1992）；並びに（ｅ）ＰＥＧ化ポリペプチドの熱安定性及び機械的安定性の改善が挙げられる。

したがって、有利には、本発明のポリペプチドは、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基と共有結合され得る。当業者であれば、所望の投与量、循環時間、タンパク分解に対する耐性、免疫原性などの異なる要因を検討することによって、ペグ化ポリペプチドを治療的に使用する方法に基づいて、ＰＥＧの適切な分子量を選択し得る。

一実施態様では、本発明のＰＥＧは、ヒドロキシ又はメトキシを有する一方の末端で終了する（すなわち、Ｘは、Ｈ又はＣＨ_３である）（「メトキシＰＥＧ」）。加えて、このようなＰＥＧは、互いに連結している１つ以上のＰＥＧ側鎖からなり得る。複数のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、分岐状ＰＥＧと称される。分岐状ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリオール及びソルビトールを含む様々なポリオールにポリエチレンオキシドを付加することによって調製され得る。例えば、４つのアームの分岐状ＰＥＧは、ペンタエリスリオール及びエチレンオキシドから調製され得る。ＰＥＧの一形態としては、リジンの第一級アミノ基を介して連結された２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）が挙げられる（Monfardini et al., 1995）。

ＰＥＧ基をポリペプチドに共有結合させるためには、ポリマー分子のヒドロキシル末端基は、活性化形態で（すなわち、反応性官能基（これらの例としては、第一級アミノ基、ヒドラジド（ＨＺ）、チオール、スクシナート（ＳＵＣ）、スクシンイミジルスクシナート（ＳＳ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）、スクシンイミジルプロピオナート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチラート（ＳＣＭ）、ベンゾトリアゾールカルボナート（ＢＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、アルデヒド、ニトロフェニルカルボナート（ＮＰＣ）及びトレシラート（ＴＲＥＳ）が挙げられる）と共に）提供されなければならない。適切な活性化ポリマー分子は、例えば、Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USAから、又はPolyMASC Pharmaceuticals plc, UKから市販されている。あるいは、ポリマー分子は、例えば、国際公開公報第９０／１３５４０号に開示されている当技術分野で公知の従来の方法によって活性化され得る。本発明に使用するための活性化直鎖状又は分岐状ポリマー分子の具体例は、Shearwater Polymers, Inc. 1997 and 2000 Catalogs (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives（これは、参照により本明細書に組み入れられる））に記載されている。活性化ＰＥＧポリマーの具体例としては、以下の直鎖状ＰＥＧ：ＮＨＳ−ＰＥＧ（例えば、ＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＢＡ−ＰＥＧ、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＳＡ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、ＳＧ−ＰＥＧ及びＳＣＭ−ＰＥＧ）及びＮＯＲ−ＰＥＧ、ＢＴＣ−ＰＥＧ、ＥＰＯＸ−ＰＥＧ、ＮＣＯ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、ＣＤＩ−ＰＥＧ、ＡＬＤ−ＰＥＧ、ＴＲＥＳ−ＰＥＧ、ＶＳ−ＰＥＧ、ＩＯＤＯ−ＰＥＧ及びＭＡＬ−ＰＥＧ、並びに分岐状ＰＥＧ、例えばＰＥＧ２−ＮＨＳが挙げられる。

前記ポリペプチド又は融合タンパク質と活性化ポリマー分子とのコンジュゲーションは、任意の従来の方法を使用することによって行われる。従来の方法は、当業者に公知である。当業者であれば、使用すべき活性化方法及び／又はコンジュゲーション化学は、ポリペプチドの結合基及びＰＥＧ分子の官能基（例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン又はハロアセタートである）に依存することを認識するであろう。

一実施態様では、ポリペプチドは、アミノ酸Ｄ及びＥ（ＣＯＯＨに対して）、Ｔ、Ｙ及びＳ（ＯＨに対して）、Ｋ（ＮＨ_２に対して）、Ｃ（少なくとも１つのシステインが保存される場合にはＳＨに対して）又は／並びにＱ及びＮ（アミド官能基に対して）において、ＰＥＧとコンジュゲーションされる。

一実施態様では、さらなるＰＥＧ化部位は、１つ以上のリジン残基を導入することによる部位特異的変異誘発によって導入され得る。例えば、１つ以上のアルギニン残基が、リジン残基に突然変異され得る。別の実施態様では、さらなるＰＥＧ化部位は、本発明のポリペプチドのアミノ酸を改変することによって化学的に導入される。

一実施態様では、ＰＥＧは、リンカーを介して前記ポリペプチド又は融合タンパク質にコンジュゲーションされる。適切なリンカーは、当業者に周知である。好ましい例は、シアヌル酸塩化物である（(Abuchowski et al., 1977)；米国特許第４，１７９，３３７号）。

本発明のペグ化ポリペプチドを精製するために、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ゲルろ過）及びイオン交換クロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の従来の分離及び精製技術が使用され得る。生成物はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離され得る。

一実施態様では、本発明によって提供されるペグ化ポリペプチドは、非改変ポリペプチドのものよりも少なくとも５０％、７５％、１００％、１５０％又は２００％長いin vivo血清半減期を有する。

核酸、ベクター及びリコンビナント宿主細胞
本発明のさらなる目的は、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸配列に関する。

本明細書で使用されるＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質又は酵素などの発現産物を「コードする」配列は、発現されると、そのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質又は酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列である（すなわち、前記ヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質又は酵素のアミノ酸配列をコードする）。タンパク質のコード配列は、開始コドン（通常は、ＡＴＧ）及び停止コドンを含み得る。

これらの核酸配列は、当業者に周知の従来の方法によって得られ得る。

典型的には、前記核酸は、適切なベクター、例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウイルスベクターに含め得るＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。

したがって、本発明のさらなる目的は、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸分子が、転写（特に、プロモーター、エンハンサー及び場合によりターミネーター）及び場合により翻訳をコントロールするために適切な要素に結合されているベクター又は発現カセット、及び本発明の核酸分子が挿入されているリコンビナントベクターに関する。これらのリコンビナントベクターは、例えば、クローニングベクター又は発現ベクターであり得る。

本明細書で使用される「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入して宿主をトランスフォーメーションし、導入配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進し得るビヒクルを意味する。

動物細胞のための任意の発現ベクターが使用され得る。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Miyaji et al., 1990）、ｐＡＧＥ１０３（Mizukami and Itoh, 1987）、ｐＨＳＧ２７４（Brady et al., 1984）、ｐＫＣＲ（O’Hare et al., 1981）、ｐＳＧ１ｂｅｔａｄ２−４（Miyaji et al., 1990）などが挙げられる。

プラスミドの他の例としては、複製起点を含む複製プラスミド、又は統合プラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが挙げられる。

ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びＡＡＶベクターが挙げられる。このようなリコンビナントウイルスは、当技術分野で公知の技術によって、例えばパッケージング細胞のトランスフェクションによって、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスによる一過性トランスフェクションによって生産され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損リコンビナントウイルスを生産するための詳細なプロトコールは、例えば、国際公開公報第９５／１４７８５号、国際公開公報第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号及び国際公開公報第９４／１９４７８号に見られ得る。

動物細胞のための発現ベクターに使用されるプロモーター及びエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー（Mizukami and Itoh, 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー（Kuwana et al., 1987）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason et al., 1985）及びエンハンサー（Gillies et al., 1983）などが挙げられる。

本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチド若しくは融合タンパク質をコードする核酸分子又は本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。特に、本発明の主題は、少なくとも１つの本発明の核酸分子又はベクターで遺伝的にトランスフォーメーションされた原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞である。

「トランスフォーメーション」という用語は、宿主細胞が導入遺伝子又は配列を発現して所望の物質（典型的には、導入遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素）を産生するように、「外来」（すなわち、外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡを宿主細胞に導入することを意味する。

特定の実施態様では、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質を発現及び生産するために、原核細胞、特にE. coli細胞が選択される。実際、本発明によれば、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）に有利であろう真核生物環境において、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質を生産する必要はない。さらに、タンパク質を大量に生産するために、原核細胞は利点を有する。真核生物環境が必要である場合、酵母（例えば、saccharomyces株）は、大量のタンパク質の生産を可能にするので、特に適切であり得る。そうでなければ、本発明の融合タンパク質の正しい翻訳後修飾に対するプロセシング能力により、ＣＨＯ、ＢＨＫ−２１、ＣＯＳ−７、Ｃ１２７、ＰＥＲ．Ｃ６、ＹＢ２／０又はＨＥＫ２９３などの典型的な真核細胞株が使用され得る。

本発明の発現ベクターの構築、及び宿主細胞のトランスフォーメーションは、従来の分子生物学技術を使用して行われ得る。本発明のポリペプチド又は融合タンパク質は、例えば、本発明の遺伝的にトランスフォーメーションされた細胞を培養し、前記によって発現されたポリペプチド又は融合タンパク質を培養物から回収することによって得られ得る。次いで、必要であれば、それらは、当業者にそれ自体が公知の従来の手順によって、例えば分別沈殿、特に硫酸アンモニウム沈殿、電気泳動、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなどによって精製され得る。特に、本発明のタンパク質を生産するために、リコンビナントタンパク質を調製及び精製するための従来の方法が使用され得る。

本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質を生産するための方法であって、（ｉ）前記ポリペプチド又は融合物の発現を可能にするために適切な条件下で、本発明のトランスフォーメーション宿主細胞を培養すること、及び（ｉｉ）発現されたポリペプチド又は融合タンパク質を回収することからなる工程を含む方法に関する。

治療方法及び使用
本発明のポリペプチド又は融合タンパク質は、それを必要とする被験体におけるガンを処置する方法に使用され得る。

したがって、本発明のさらなる態様は、医薬として使用するための本発明のポリペプチド又は融合タンパク質に関する。

一実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガンの処置に使用するための本発明のポリペプチド又は融合タンパク質に関する。

本明細書で使用される「被験体」という用語は、齧歯類、ネコ科動物、イヌ科動物及び霊長類などの哺乳動物を表す。好ましくは、本発明の被験体は、ヒトである。好ましくは、本発明の被験体は、ガンに罹患しているか、又はガンに罹患しやすい被験体である。

本明細書で使用される「ガン」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、限定されないが、固形腫瘍及び血液感染性腫瘍を含む。ガンという用語は、皮膚、組織、器官、骨、軟骨、血液及び血管の疾患を含む。「ガン」という用語は、原発性ガン及び転移性ガンの両方をさらに包含する。本発明の方法及び組成物によって処置され得るガンの例としては、限定されないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、胸、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、睾丸、舌又は子宮由来のガン細胞が挙げられる。加えて、ガンは、具体的には、以下の組織型であり得るが、これらに限定されない：悪性新生物；ガン腫；未分化ガン腫；巨細胞ガン及び紡錘形細胞腫瘍；小細胞ガン；乳頭ガン；扁平上皮ガン；リンパ上皮ガン；基底細胞ガン；毛母細胞腫；移行細胞ガン；乳頭状移行細胞ガン；腺ガン；悪性ガストリノーマ；胆管ガン；肝細胞ガン；肝細胞ガンと胆管ガンとの複合ガン；小柱腺ガン；腺様嚢胞ガン；腺腫性ポリープ内腺ガン；家族性大腸ポリポージス腺ガン；固形ガン；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞腺ガン；乳頭腺ガン；嫌色素性細胞ガン；好酸性細胞ガン；好酸性腺腫；好塩基性腺腫；透明細胞腺ガン；顆粒細胞ガン；濾胞状腺ガン；乳頭及び濾胞状腺ガン；非被包性硬化性ガン；副腎皮質細胞ガン；子宮内膜性腫瘍；皮膚付属器腫瘍；アポクリン腺ガン；皮脂腺ガン；耳垢腺ガン；粘液性類表皮ガン；嚢胞腺ガン；乳頭状嚢胞腺ガン；乳頭状漿液性嚢胞腺ガン；ムチン性嚢胞腺ガン；粘液腺ガン；印環細胞ガン；浸潤性導管ガン；髄様ガン；小葉ガン；炎症性ガン；乳房パジェット病；腺房細胞ガン；腺扁平上皮ガン；扁平上皮化生を伴う腺ガン；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質細胞ガン；悪性莢膜細胞腫、；悪性顆粒膜細胞腫；悪性男性胚細胞腫、；セルトリ細胞ガン；悪性ライディッヒ細胞ガン；悪性脂質細胞ガン；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；悪性グロームス腫瘍；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；悪性黒色腫巨細胞色素性母斑；類上皮細胞黒色腫；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質細胞肉腫；混合腫瘍；ミューラー混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；ガン肉腫；悪性間葉細胞腫；悪性ブレンナー腫；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胎生期ガン；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛ガン；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管周囲細胞腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮肉腫；悪性エナメル上皮腫；悪性エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣細胞腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；グリア芽細胞腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽細胞腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；小リンパ球性悪性リンパ腫；びまん性大細胞悪性リンパ腫；濾胞性悪性リンパ腫；菌状息肉腫；他の特異的非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；及び有毛細胞性白血病。

いくつかの実施態様では、ガンは、乳ガン、トリプルネガティブ乳ガン、急性前骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、血液ガン、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｔ急性リンパ芽球性白血病、肺腺ガン、腎ガン、卵巣ガン、結腸ガン、黒色腫、セザリー症候群からなる群より選択される。

一実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガンの処置に使用するためのポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなり、
配列番号：１のアミノ酸配列からならないポリペプチドに関する。

特定の実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガンの処置に使用するためのポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８８位のイソロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８８位のイソロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８８位のイソロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８８位のイソロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなり、
配列番号：１のアミノ酸配列からならないポリペプチドに関する。

特定の実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガンの処置に使用するためのポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなり、
配列番号：１のアミノ酸配列からならないポリペプチドに関する。

特定の実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガンの処置に使用するためのポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：１の３７９位のチロシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７９位のチロシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７９位のチロシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７９位のチロシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなり、
配列番号：１のアミノ酸配列からならないポリペプチドに関する。

特定の実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガンの処置に使用するためのポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：１の３７８位のグルタミン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７８位のグルタミン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７８位のグルタミン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７８位のグルタミン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなり、
配列番号：１のアミノ酸配列からならないポリペプチドに関する。

特定の実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガンの処置に使用するためのポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなり、
配列番号：１のアミノ酸配列からならないポリペプチドに関する。

いくつかの実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガンの処置に使用するためのポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９７位のグリシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９７位のグリシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９７位のグリシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９７位のグリシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなり、
配列番号：１のアミノ酸配列からならないポリペプチドに関する。

いくつかの実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガンの処置に使用するためのポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなり、
配列番号：１のアミノ酸配列からならないポリペプチドに関する。

いくつかの実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガンの処置に使用するためのポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなり、
配列番号：１のアミノ酸配列からならないポリペプチドに関する。

いくつかの実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガンの処置に使用するためのポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなり、
配列番号：１のアミノ酸配列からならないポリペプチドに関する。

いくつかの実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガンの処置に使用するためのポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなり、
配列番号：１のアミノ酸配列からならないポリペプチドに関する。

一実施態様では、本発明は、転移性ガンにおける転移の予防に使用するための本発明のポリペプチド又は融合タンパク質に関する。

一実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガン細胞において膜分解を引き起こす方法に使用するための本発明のポリペプチド又は融合タンパク質に関する。

「膜分解」という用語は、膜分解を引き起こす、ガン細胞の細胞膜における孔形成であって、ガン細胞の内部からの細胞内容物の排出を可能にして、細胞の完全性の障害をもたらすものを指す。膜分解が開始すると、細胞は、最終的には、本発明の方法及び組成物による処置の結果として、壊死又は細胞死を経験する。

一実施態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるガン処置の治療効果を増強するのに使用するための本発明のポリペプチド又は融合タンパク質に関する。

特定の実施態様では、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質は、化学療法剤又は放射線療法剤などの１つ以上の治療活性剤と共に逐次投与又は同時投与され得る。

化学療法薬の例としては、限定されないが、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メトトレキサート、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシウレア、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、白金錯体、例えばシスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルバジン、エピポドフィロトキシン、例えばエトポシド及びテニポシド、カンプトテシン、例えばイリノテカン及びトポテカン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル及びロイコボリンと組み合わせた５−フルオロウラシル、タキサン、例えばドセタキセル及びパクリタキセル、レバミソール、エストラムスチン、ナイトロジェンマスタード、ニトロウレア、例えばカルムスチン及びロムスチン、ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビン、イマチニブメシラート、ヘキサメチルメラミン、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、チルホスフィン、プロテアーゼ阻害剤、ヘルビマイシンＡ阻害剤、ゲニステイン、エルブスタチン並びにラベンダスチンＡが挙げられる。一実施態様では、さらなる治療活性剤は、限定されないが、以下のクラスの薬剤：アルキル化剤、植物アルカロイド、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、葉酸代謝拮抗薬、ピリミジン類似体、プリン類似体、ＤＮＡ代謝拮抗物質、タキサン、ポドフィロトキシン、ホルモン療法剤、レチノイド、光増感剤又は光線力学的治療薬、血管新生阻害剤、有糸分裂阻害剤、イソプレニル化阻害剤、細胞分裂阻害剤、アクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラサイクリン、ＭＤＲ阻害剤及びＣａ^２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤の１つ又はそれらの組み合わせから選択され得る。

さらなる治療活性剤は、限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、成長阻害因子、ホルモン、可溶性レセプター、デコイレセプター、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体、モノボディ、ポリボディから選択され得る。

さらなる治療活性剤は、制吐剤であり得る。適切な制吐剤としては、限定されないが、メトクロプラミド、ドムペリドン、プロクロルペラジン、プロメタジン、クロルプロマジン、トリメトベンズアミド、オンダンセトロン、グラニセトロン、ヒドロキシジン、アセチルロイシン、アリザプリド、アザセトロン、ベンズキナミド、ビエタナウチン、ブロモプリド、ブクリジン、クレボプリド、シクリジン、ジメンヒドリネート、ジフェニドール、ドラセトロン、メクリジン、メタラタール、メトピマジン、ナビロン、ピパマジン、スコポラミン、スルピリド、テトラヒドロカンナビノール、チエチルピラジン、チオプロペラジン及びトロピセトロンが挙げられる。好ましい実施態様では、制吐剤は、グラニセトロン又はオンダンセトロンである。

別の実施態様では、さらなる治療活性剤は、造血コロニー刺激因子であり得る。適切な造血コロニー刺激因子としては、限定されないが、フィルグラスチム、サルグラモスチム、モルグラモスチム及びエポイエチンアルファが挙げられる。

さらに別の実施態様では、他の治療活性剤は、オピオイド鎮痛剤又は非オピオイド鎮痛剤であり得る。適切なオピオイド鎮痛剤としては、限定されないが、モルフィン、ヘロイン、ヒドロモルホン、ヒドロコドン、オキシモルホン、オキシコドン、メトポン、アポモルフィン、ブプレノルフィン、メペリジン、ロペラミド、エトヘプタジン、ベータプロジン、ジフェノキシラート、フェンタニル、スフェンタニル、アルフェンタニル、レミフェンタニル、レボルファノール、デキストロメトルファン、フェナゾン、ペマゾシン、シクラゾシン、メタドン、イソメタドン及びプロポキシフェンが挙げられる。適切な非オピオイド鎮痛剤としては、限定されないが、アスピリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナミン酸、ナブメトン、ナプロキセン、ピロキシカム及びスリンダクが挙げられる。

さらに別の実施態様では、さらなる治療活性剤は、抗不安剤であり得る。適切な抗不安剤としては、限定されないが、ブスピロン及びベンゾジアゼピン、例えばジアゼパム、ロラゼパム、オキサザパム、クロラゼペート、クロナゼパム、クロルジアゼポキシド及びアルプラゾラムが挙げられる。

本明細書で使用される「放射線療法剤」という用語は、限定されないが、当業者に公知の任意の放射線療法剤であって、ガンを処置又は改善するために有効な放射線療法剤を指す。例えば、放射線療法剤は、小線源照射療法又は放射線核種療法で投与される放射線療法剤であり得る。このような方法は、限定されないが、化学療法薬及び／又は別の放射線療法薬などの１つ以上のさらなるガン治療薬の投与を場合によりさらに含み得る。

医薬組成物
本発明の別の目的は、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質又は核酸配列又は発現ベクター又は宿主細胞及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。

典型的には、治療組成物を形成するために、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質又は核酸配列又は発現ベクター又は宿主細胞は、薬学的に許容し得る賦形剤、及び場合により生体分解性ポリマーなどの徐放マトリックスと組み合わされ得る。

「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与した場合に、有害反応、アレルギー反応又は他の望ましくない反応を引き起こさない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、非毒性の固体、半固体若しくは液体の増量剤、希釈剤、封入材料又は任意の種類の製剤化補助物質を指す。

経口投与、舌下投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与、局所投与又は直腸投与のための本発明の医薬組成物では、活性成分は単独で、又は別の活性成分と組み合わせて、従来の薬学的支持体との混合物として単位投与形態で動物及びヒトに投与され得る。適切な単位投与形態は、経口経路形態、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、粉末、顆粒剤及び経口懸濁剤又は液剤、舌下投与形態及び口腔投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下投与形態、経皮投与形態、局所投与形態、腹腔内投与形態、筋肉内投与形態、静脈内投与形態、真皮下投与形態、経皮投与形態、脊髄内投与形態及び鼻孔内投与形態並びに直腸投与形態を含む。

好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤のための薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、無菌等張食塩水（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌食塩水又は生理食塩水と追加すると注射溶液を構成することができる乾燥、特に、凍結乾燥組成物であり得る。

注射用途に適切な医薬品形態としては、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、前記形態は無菌でなければならず、注射容易性が存在する程度に液状でなければならない。それは、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。

遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製され得る。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製され得る。通常の保存及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。

本発明のポリペプチド又は融合タンパク質は、中性形態又は塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）酸付加塩であって、塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシ基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第２鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。

担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。コーティング剤、例えばレシチンの使用によって、分散液の場合には必要な粒子径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に使用することによってもたらされ得る。

無菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じていくつかの他の上記成分と共に適切な溶媒に組み込み、続いて、ろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌有効成分を、基本的な分散媒と、必要な他の上記成分とを含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分と任意のさらなる所望の成分との粉末を、予め滅菌ろ過したそれらの溶液から生成させる真空乾燥技術及び凍結乾燥技術である。

直接注射のためのより濃縮された又は高濃縮された溶液の調製もまた企図され、この場合、溶媒としてのＤＭＳＯの使用は、極めて迅速な浸透をもたらして、高濃度の活性剤を小さな腫瘍部位に送達すると想定される。

製剤化されると、溶液は、投与製剤に適合する方法によって、治療有効量で投与されるであろう。製剤は、様々な剤形、例えば上記種類の注射溶液で容易に投与されるが、薬物放出カプセル剤なども用いられ得る。

水溶液による非経口投与では、例えば、必要な場合には溶液を適切に緩衝し、十分な生理食塩水又はグルコースで液体希釈剤を最初に等張にすべきである。これら特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与及び腹腔内投与に特に適切である。これとの関連では、当業者であれば、本開示を考慮して、用いられ得る無菌水性媒体を認識しているであろう。投与量のいくらかの変動は、処置される被験体の状態に応じて必ず生じるであろう。いずれにせよ、投与責任者が、個々の被験体の適切な用量を決定するであろう。

本発明のペプチド又は融合タンパク質は、１用量当たり約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０ミリグラム、又は約１〜１０ミリグラム、又はさらには約１０〜１００ミリグラムを含むように治療混合物内に製剤化され得る。複数回投与も実施され得る。

非経口投与、例えば静脈内注射又は筋肉内注射のために製剤化される本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る形態としては、例えば、錠剤又は他の経口投与用固体；リポソーム製剤；徐放カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。

本発明の別の目的は、１つ以上の化学療法剤又は放射線療法剤を含む本発明の医薬組成物に関する。

以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、細胞死を誘導した。（Ａ）６×１０^３個の密度で、Ｋａｒｐａｓ１１０６、ＳＵ−ＤＨＬ−５、ＳｅＡｘ及びＨＵＴ−７８細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、漸増濃度のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）と共に２４時間処理した。次いで、ＭＴＳ試薬２０μLを各ウェルに追加し、プレートをさらに４時間インキュベーションした。９６ウェルプレートリーダーを使用して、吸光度を４９０nmで測定した。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドが細胞増殖を阻害した程度を、ペプチドを含有しないウェル（ネガティブコントロール）に対する、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドを含有する各ウェルにおける吸光度の割合として計算した。各バーは、少なくとも３回の独立した実験からの平均±ｓ．ｄを表す。（Ｂ）４．５×１０^３個の密度で、示されている細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、様々な濃度（１ウェル当たりの総容量１００μL）のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）を含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。（Ｃ）Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、血清欠乏条件下で細胞死を誘導したが、突然変異体ペプチドＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）Ｌ／Ｇは誘導しなかった。４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、１０μM（１ウェル当たりの総容量１００μL）の示されているペプチドを含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、細胞死を誘導した。（Ａ）６×１０^３個の密度で、Ｋａｒｐａｓ１１０６、ＳＵ−ＤＨＬ−５、ＳｅＡｘ及びＨＵＴ−７８細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、漸増濃度のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）と共に２４時間処理した。次いで、ＭＴＳ試薬２０μLを各ウェルに追加し、プレートをさらに４時間インキュベーションした。９６ウェルプレートリーダーを使用して、吸光度を４９０nmで測定した。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドが細胞増殖を阻害した程度を、ペプチドを含有しないウェル（ネガティブコントロール）に対する、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドを含有する各ウェルにおける吸光度の割合として計算した。各バーは、少なくとも３回の独立した実験からの平均±ｓ．ｄを表す。（Ｂ）４．５×１０^３個の密度で、示されている細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、様々な濃度（１ウェル当たりの総容量１００μL）のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）を含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。（Ｃ）Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、血清欠乏条件下で細胞死を誘導したが、突然変異体ペプチドＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）Ｌ／Ｇは誘導しなかった。４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、１０μM（１ウェル当たりの総容量１００μL）の示されているペプチドを含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、細胞死を誘導した。（Ａ）６×１０^３個の密度で、Ｋａｒｐａｓ１１０６、ＳＵ−ＤＨＬ−５、ＳｅＡｘ及びＨＵＴ−７８細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、漸増濃度のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）と共に２４時間処理した。次いで、ＭＴＳ試薬２０μLを各ウェルに追加し、プレートをさらに４時間インキュベーションした。９６ウェルプレートリーダーを使用して、吸光度を４９０nmで測定した。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドが細胞増殖を阻害した程度を、ペプチドを含有しないウェル（ネガティブコントロール）に対する、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドを含有する各ウェルにおける吸光度の割合として計算した。各バーは、少なくとも３回の独立した実験からの平均±ｓ．ｄを表す。（Ｂ）４．５×１０^３個の密度で、示されている細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、様々な濃度（１ウェル当たりの総容量１００μL）のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）を含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。（Ｃ）Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、血清欠乏条件下で細胞死を誘導したが、突然変異体ペプチドＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）Ｌ／Ｇは誘導しなかった。４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、１０μM（１ウェル当たりの総容量１００μL）の示されているペプチドを含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）、ＲＩ−ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）及びＣｔｅｒ−Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、腫瘍細胞を選択的に殺傷する。（Ａ）４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、血清の非存在下における様々な濃度（１ウェル当たりの総容量１００μL）の示されているペプチドを含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。（Ｂ）４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９又はＨａＣａｔ細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、血清の非存在下における１０μM（１ウェル当たりの総容量１００μL）の示されているペプチドを含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）、ＲＩ−ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）及びＣｔｅｒ−Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、腫瘍細胞を選択的に殺傷する。（Ａ）４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、血清の非存在下における様々な濃度（１ウェル当たりの総容量１００μL）の示されているペプチドを含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。（Ｂ）４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９又はＨａＣａｔ細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、血清の非存在下における１０μM（１ウェル当たりの総容量１００μL）の示されているペプチドを含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド誘導性の細胞死は、カスパーゼ依存性アポトーシスではない。４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞を処理せずに放置し、又は１００μMのＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫで２時間前処理した。細胞から培地を除去し、１００μMのＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫの存在下又は非存在下における様々な濃度（１ウェル当たりの総容量１００μL）のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド又は５０μMのシスプラチンを含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、低血清条件下で壊死性細胞死を誘導した。（Ａ）１０％ＦＢＳの非存在下で培養したＳｅＡｘ又はＨａＣａｔ細胞を処理せずに放置し、又は示されている期間にわたってそれぞれ４μM若しくは１０μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドで処理した。次いで、ＰＩ染色のために、フローサイトメトリーによって、細胞を分析した。結果は、少なくとも３回の独立した実験からの、ＰＩ陽性細胞の平均数±Ｓ．Ｄ．を表す。（Ｂ）４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９又はＨａＣａｔ細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、１０μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド（１ウェル当たりの総容量１００μL）ペプチドを含有する培地と交換し、示されている期間にわたってプレートをインキュベーションした。次いで、培養培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を評価し、少なくとも３回の独立した実験からの、全細胞溶解後に決定したＬＤＨ活性の最大レベル（Ｍａｘ）の割合±Ｓ．Ｄ．として、データを表した。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、低血清条件下で壊死性細胞死を誘導した。（Ａ）１０％ＦＢＳの非存在下で培養したＳｅＡｘ又はＨａＣａｔ細胞を処理せずに放置し、又は示されている期間にわたってそれぞれ４μM若しくは１０μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドで処理した。次いで、ＰＩ染色のために、フローサイトメトリーによって、細胞を分析した。結果は、少なくとも３回の独立した実験からの、ＰＩ陽性細胞の平均数±Ｓ．Ｄ．を表す。（Ｂ）４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９又はＨａＣａｔ細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、１０μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド（１ウェル当たりの総容量１００μL）ペプチドを含有する培地と交換し、示されている期間にわたってプレートをインキュベーションした。次いで、培養培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を評価し、少なくとも３回の独立した実験からの、全細胞溶解後に決定したＬＤＨ活性の最大レベル（Ｍａｘ）の割合±Ｓ．Ｄ．として、データを表した。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１ＬＺペプチドは、細胞死を誘導した。（Ａ）４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、様々な濃度（１ウェル当たりの総容量１００μL）の示されているＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺペプチドを含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。（Ｂ）４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９又はＨａＣａｔ細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、血清の非存在下における１０μM（１ウェル当たりの総容量１００μL）の示されているペプチドを含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１ＬＺペプチドは、細胞死を誘導した。（Ａ）４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、様々な濃度（１ウェル当たりの総容量１００μL）の示されているＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺペプチドを含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。（Ｂ）４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９又はＨａＣａｔ細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、血清の非存在下における１０μM（１ウェル当たりの総容量１００μL）の示されているペプチドを含有する培地と交換し、プレートを２４時間インキュベーションした。次いで、ＭＴＴアッセイを終了し、本明細書に記載されているように、データ分析を実施した。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺペプチドは、低血清条件下で壊死性細胞死を誘導した。（Ａ）１０％ＦＢＳの非存在下で培養したＳｅＡｘを処理せずに放置し、又は様々な時間にわたって４μMの示されているＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺペプチドで処理した。次いで、ＰＩ染色のために、フローサイトメトリーによって、細胞を分析した。結果は、ＰＩ陽性細胞の平均数±Ｓ．Ｄ．を表す。（Ｂ）４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし（１ウェル当たりの総容量１００μL）、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、１０μMの示されているＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺペプチド（１ウェル当たりの総容量１００μL）ペプチドを含有する培地と交換し、示されている期間にわたってプレートをインキュベーションした。次いで、培養培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を評価し、全細胞溶解後に決定したＬＤＨ活性の最大レベル（Ｍａｘ）の割合±Ｓ．Ｄ．として、データを表した。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺペプチドは、低血清条件下で壊死性細胞死を誘導した。（Ａ）１０％ＦＢＳの非存在下で培養したＳｅＡｘを処理せずに放置し、又は様々な時間にわたって４μMの示されているＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺペプチドで処理した。次いで、ＰＩ染色のために、フローサイトメトリーによって、細胞を分析した。結果は、ＰＩ陽性細胞の平均数±Ｓ．Ｄ．を表す。（Ｂ）４．５×１０^３個の密度で、Ａ５４９細胞を９６ウェルプレート（１ウェル当たりの総容量１００μL）にプレーティングし（１ウェル当たりの総容量１００μL）、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ_２）内で、一晩付着させた。細胞から培地を除去し、１０μMの示されているＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺペプチド（１ウェル当たりの総容量１００μL）ペプチドを含有する培地と交換し、示されている期間にわたってプレートをインキュベーションした。次いで、培養培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を評価し、全細胞溶解後に決定したＬＤＨ活性の最大レベル（Ｍａｘ）の割合±Ｓ．Ｄ．として、データを表した。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、細胞の遊走及び浸潤を阻害する。（Ａ）ビヒクル又は２μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド若しくはＡｎｔｐ−ｏｎｌｙペプチドを含む改良ボイデンチャンバー（トランスウェル）プレートの上部ウェルにＤ３Ｈ２ＬＮ細胞を追加し、材料及び方法に記載されているように、トランスウェル遊走アッセイに供した。細胞を１０％ＦＢＳに向かって１２時間遊走させた。３回の独立した各実験のために、トリプリケートウェルを使用した。未処理細胞の遊走（＝１００％）に対して、結果を表す。柱：３回の実験の平均。バー：ｓ．ｅ．スチューデントのｔ検定によって、Ｐ値を決定した（＊Ｐ＜０．０１）。（Ｂ）ビヒクル又は２μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド若しくはＡｎｔｐ−ｏｎｌｙペプチドを含むマトリゲルコーティングボイデンチャンバーにＤ３Ｈ２ＬＮ細胞を播種し、材料及び方法に記載されているように、トランスウェル遊走アッセイに供した。細胞を１０％ＦＢＳに向かって２４時間遊走させた。３回の独立した各実験のために、トリプリケートウェルを使用した。未処理細胞の遊走（＝１００％）に対して、結果を表す。柱：３回の実験の平均。バー：ｓ．ｅ．スチューデントのｔ検定によって、Ｐ値を決定した（＊Ｐ＜０．０１）。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、細胞の遊走及び浸潤を阻害する。（Ａ）ビヒクル又は２μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド若しくはＡｎｔｐ−ｏｎｌｙペプチドを含む改良ボイデンチャンバー（トランスウェル）プレートの上部ウェルにＤ３Ｈ２ＬＮ細胞を追加し、材料及び方法に記載されているように、トランスウェル遊走アッセイに供した。細胞を１０％ＦＢＳに向かって１２時間遊走させた。３回の独立した各実験のために、トリプリケートウェルを使用した。未処理細胞の遊走（＝１００％）に対して、結果を表す。柱：３回の実験の平均。バー：ｓ．ｅ．スチューデントのｔ検定によって、Ｐ値を決定した（＊Ｐ＜０．０１）。（Ｂ）ビヒクル又は２μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド若しくはＡｎｔｐ−ｏｎｌｙペプチドを含むマトリゲルコーティングボイデンチャンバーにＤ３Ｈ２ＬＮ細胞を播種し、材料及び方法に記載されているように、トランスウェル遊走アッセイに供した。細胞を１０％ＦＢＳに向かって２４時間遊走させた。３回の独立した各実験のために、トリプリケートウェルを使用した。未処理細胞の遊走（＝１００％）に対して、結果を表す。柱：３回の実験の平均。バー：ｓ．ｅ．スチューデントのｔ検定によって、Ｐ値を決定した（＊Ｐ＜０．０１）。（Ａ）体重に対するＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド注射の効果。通常の生理食塩溶液又は示されている用量のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドをヌードマウスに４週間にわたって週２回腹腔内注射し（ｎ＝マウス３〜４匹／群）、体重について毎日モニタリングした（平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｂ）Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの全身投与の結果としての、トリプルネガティブ乳ガンのマウスモデルにおける腫瘍成長の減少。実験のために、２つのヒトトリプルネガティブ乳ガン異種移植片（ＰＤＸ０１及びＰＤＸ０２）をヌードマウスに移植した。腫瘍が１５０mm³の平均サイズに達したら、マウスを処置群に分け（ｎ＝６）、ビヒクル又はＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド（２．４mg/kg）を毎日７回注射した。時間の関数として、腫瘍体積をプロットした（平均±ＳＥＭ）。（Ａ）体重に対するＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド注射の効果。通常の生理食塩溶液又は示されている用量のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドをヌードマウスに４週間にわたって週２回腹腔内注射し（ｎ＝マウス３〜４匹／群）、体重について毎日モニタリングした（平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｂ）Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの全身投与の結果としての、トリプルネガティブ乳ガンのマウスモデルにおける腫瘍成長の減少。実験のために、２つのヒトトリプルネガティブ乳ガン異種移植片（ＰＤＸ０１及びＰＤＸ０２）をヌードマウスに移植した。腫瘍が１５０mm³の平均サイズに達したら、マウスを処置群に分け（ｎ＝６）、ビヒクル又はＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド（２．４mg/kg）を毎日７回注射した。時間の関数として、腫瘍体積をプロットした（平均±ＳＥＭ）。白血病マウスのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド処置は、疾患進行を防ぐ。ｈＭＲＰ８−ＰＭＬ／ＲＡＲαトランスジェニックマウスから単離した１０^４個の白血病細胞をマウスに負荷し、１０日間生着させ、次いで、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド（１．８mg/kg）若しくはビヒクル（通常の生理食塩溶液）を７日間連続で毎日腹腔内注射し、又は５mgのＡＴＲＡを含有する２１日放出ペレットを皮下移植した（各処置について、ｎ＝６）。生存について、マウスをモニタリングした。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドは、細胞の遊走及び浸潤を阻害する。（Ａ）ビヒクル又は７．５μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチド又はＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドと共に０．４％ＢＳＡを含有する無血清培地中の改良ボイデンチャンバー（トランスウェル）プレートの上部ウェルにＵ２ＯＳ細胞を追加し、材料及び方法に記載されているように、トランスウェル遊走アッセイに供した。細胞を１０％ＦＢＳに向かって２４時間遊走させた。３回の独立した各実験のために、トリプリケートウェルを使用した。未処理細胞の遊走（＝１００％）に対して、結果を表す。柱：３回の実験の平均。バー：ｓ．ｅ．スチューデントのｔ検定によって、Ｐ値を決定した（＊Ｐ＜０．０１）。（Ｂ）ビヒクル又は７．５□ＭのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチド若しくはＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドと共に０．４％ＢＳＡを含有する無血清培地中のマトリゲルコーティングボイデンチャンバーにＵ２ＯＳ細胞を播種し、材料及び方法に記載されているように、トランスウェル遊走アッセイに供した。細胞を１０％ＦＢＳに向かって４８時間遊走させた。３回の独立した各実験のために、トリプリケートウェルを使用した。未処理細胞の遊走（＝１００％）に対して、結果を表す。柱：３回の実験の平均。バー：ｓ．ｅ．スチューデントのｔ検定によって、Ｐ値を決定した（＊Ｐ＜０．０１）。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドは、細胞の遊走及び浸潤を阻害する。（Ａ）ビヒクル又は７．５μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチド又はＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドと共に０．４％ＢＳＡを含有する無血清培地中の改良ボイデンチャンバー（トランスウェル）プレートの上部ウェルにＵ２ＯＳ細胞を追加し、材料及び方法に記載されているように、トランスウェル遊走アッセイに供した。細胞を１０％ＦＢＳに向かって２４時間遊走させた。３回の独立した各実験のために、トリプリケートウェルを使用した。未処理細胞の遊走（＝１００％）に対して、結果を表す。柱：３回の実験の平均。バー：ｓ．ｅ．スチューデントのｔ検定によって、Ｐ値を決定した（＊Ｐ＜０．０１）。（Ｂ）ビヒクル又は７．５□ＭのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチド若しくはＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドと共に０．４％ＢＳＡを含有する無血清培地中のマトリゲルコーティングボイデンチャンバーにＵ２ＯＳ細胞を播種し、材料及び方法に記載されているように、トランスウェル遊走アッセイに供した。細胞を１０％ＦＢＳに向かって４８時間遊走させた。３回の独立した各実験のために、トリプリケートウェルを使用した。未処理細胞の遊走（＝１００％）に対して、結果を表す。柱：３回の実験の平均。バー：ｓ．ｅ．スチューデントのｔ検定によって、Ｐ値を決定した（＊Ｐ＜０．０１）。（Ａ）体重に対するＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチド注射の効果。通常の生理食塩溶液又は示されている用量のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドをヌードマウスに４週間にわたって週２回腹腔内注射し（ｎ＝マウス３〜４匹／群）、体重について毎日モニタリングした（平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｂ）Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドの全身投与の結果としての、肺腺ガンのマウスモデルにおける腫瘍成長の減少。Ａ５４９細胞を雌性無胸腺ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が１００mm³の平均サイズに達したら、マウスを処置群に分け（ｎ＝６）、ビヒクル、ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチド又はＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチド（５mg/kg）を毎日７回注射した。時間の関数として、腫瘍体積をプロットした（平均±ＳＥＭ）。（Ａ）体重に対するＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチド注射の効果。通常の生理食塩溶液又は示されている用量のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドをヌードマウスに４週間にわたって週２回腹腔内注射し（ｎ＝マウス３〜４匹／群）、体重について毎日モニタリングした（平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｂ）Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドの全身投与の結果としての、肺腺ガンのマウスモデルにおける腫瘍成長の減少。Ａ５４９細胞を雌性無胸腺ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が１００mm³の平均サイズに達したら、マウスを処置群に分け（ｎ＝６）、ビヒクル、ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチド又はＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチド（５mg/kg）を毎日７回注射した。時間の関数として、腫瘍体積をプロットした（平均±ＳＥＭ）。

材料及び方法
細胞培養
ダルベッコ改変イーグル培地（Ａ５４９、Ｈ１２９９、ＭＣＦ−７、Ｓｋｏｖ３、ＣＴ−２６、１２０５、Ｂ１６、Ｕ２ＯＳ、ＷＭ−２６６−４、ＨａＣａｔ、ＮＣＴＣ及びヒト皮膚線維芽細胞）、最小必須培地（Ｄ３Ｈ２ＬＮ）、又は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２００mg/mlペニシリン及び１００mg/ml硫酸ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｋａｒｐａｓ＿１１０６、ＤＨＬ−５、Ｓｅａｘ、ＨｕＴ−７８細胞）（Life Technologies）中で、細胞を培養した。

細胞死の分析
ヨウ化プロピジウム染色及びフローサイトメトリー分析によって、細胞死を評価した。

製造業者の説明書にしたがって比色CellTiter 96（登録商標）AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)を使用して、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって、９６ウェル培養プレートで培養した細胞の生存を評価した。これらのアッセイでは、中間体電子受容体試薬フェナジン硫酸エチル（これは、生細胞に浸透し、細胞質中で又は細胞表面で還元され、ＭＴＳテトラゾリウム化合物を組織培養培地可溶性の着色ホルマザン生成物に変換し得る細胞から脱出し得る）と組み合わせて、ＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩］を使用する。増殖中の（生）細胞の数は、生成されたホルマザン生成物のレベルに正比例する。次いで、簡便な比色アッセイを使用して、色を定量し得る。多層スキャニング分光光度計（ＥＬＩＳＡリーダー）によって、結果を読み取る。

培養上清における乳酸デヒドロゲナーゼ活性の検出。
原形質膜が損傷すると、細胞質の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の細胞培養上清への放出が起こるので、それは、壊死の典型的な特徴と考えられる。培地を９６ウェルプレートから微小遠心チューブに収集し、２００ｇで短時間スピンして、存在し得る細胞残屑を除去した。CytoTox 96（登録商標）アッセイ（Promega）を使用して、ＮＡＤ^＋の存在下で乳酸塩をピルビン酸塩に還元することによって、ＬＤＨ活性を測定した。生じたＮＡＤＨは、テトラゾリウム塩であるＩＮＴを還元して、４９０nmで検出可能な赤色のホルマザン生成物を形成する。形成される色の量は、溶解した細胞の数に比例する。標準９６ウェルプレートリーダーを使用して、可視波長の吸光度データを収集する。製造業者が指示しているように、０．８％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による処理後の最大ＬＤＨ放出に対して、結果を正規化した。

ペプチドの設計及び合成
本発明者らは、ＡＡＣ−１１のロイシンジッパー（ＬＺ）ドメイン（残基３６３〜３９９）を包含するペプチドを設計した。さらに、これが、血清欠乏条件下で依然として腫瘍細胞致死的であるかを決定するために、本発明者らは、ロイシン残基（３７７位、３８４位及び３９１位、ＡＡＣ−１１ナンバリング）をグリシンに突然変異させたペプチドを設計した。Proteogenics Strasbourg-Franceがペプチド（＞９８％純粋）を合成した。本発明者らの以前の論文（Rigou et al., 2009）に記載されているＡＡＣ−１１−ＬＺペプチドと比較して、Ｎ末端アセチル化及びＣ末端アミド化によって、本明細書で使用したペプチドを改変した。これらの化学的改変は、アミノペプチダーゼによる消化に対する安定性を劇的に増強し、細胞の透過性を増加させるので、ペプチド効率（ガン細胞に対する細胞傷害効果）の顕著な増加をもたらすことが見出された。Ｈ２Ｏでペプチドを濃度１mMに希釈し、−７０℃で冷凍保存した。使用したペプチドの配列は、表１に記載されている。

免疫細胞化学
ＰＢＳでカバースリップを洗浄し、３％パラホルムアルデヒドで細胞を７分間固定し、最後に、５０mMのＮＨ_４Ｃｌを含むＰＢＳで５分間にわたって２回洗浄した。０．５％サポニンで細胞を３７℃で１０分間透過処理した。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０，５％サポニン及び３％ＢＳＡ）で５分間にわたって２回洗浄することによって、ブロッキングを行った。ブロッキング緩衝液中で、一次抗体及び二次抗体のインキュベーションを室温で１時間行い、ブロッキング緩衝液を使用して洗浄を実施した。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７と組み合わせて抗ＡＡＣ−１１ポリクローナル抗体（ab65836, Abcam）を使用して、ＡＡＣ−１１を検出した。４’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で核を対比染色した。LSM510ソフトウェアv4.0 (Zeiss)を使用して、Plan Apochromat 63X N.A.1.4油浸対物レンズを備えるZeiss LSM 510 META共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss, Oberkochen, Germany）による共焦点顕微鏡法によって、画像を取得した。

ウエスタンブロッティング
１％ＮＰ−４０、１０μg/mlロイペプチン及びアプロチニン並びに０．１mM ＰＭＳＦを含有する５０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．６、１５０mM ＮａＣｌに細胞を溶解し、１５，０００ｇで１５分間遠心分離することによって清澄化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜（Biorad）に転写した。抗ＡＡＣ−１１抗体（ab65836, Abcam）及びポリクローナル抗チューブリンＡ５４４１抗体（Sigma）を使用して、イムノブロッティングを実施した。増強化学発光検出試薬（Amersham）を使用して、シグナルを検出した。

トランスウェル遊走及び浸潤アッセイ
ゼラチンコーティングポリカーボネート膜フィルタ（直径６．５mm、孔径８μm）を含有する改良ボイデンチャンバー（Corning Costar, Rochester, NY, USA）を使用して、アッセイを実施した。浸潤アッセイでは、マトリゲル（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）２０μl又は５０μlでフィルタの上面をコーティングした。上部チャンバーには、１％ＦＢＳ又は０．４％ＢＳＡを含む培養培地（１．５×１０^５／ml）中に細胞が含まれており、下部チャンバーには、１０％ＦＢＳ（化学誘引物質）を含む培養培地が含まれていた。遊走アッセイでは、細胞を３７℃の５％ＣＯ２中で１２時間若しくは２４時間インキュベーションし、又は浸潤アッセイでは、３７℃の５％ＣＯ２中で４８時間インキュベーションした。遊走も浸潤もしなかった細胞を、綿棒によって膜の上面から擦り取り、底面に残存する残存細胞を、クリスタルバイオレットによる染色後に、光学顕微鏡下において、無作為に選択した５つの視野でカウントした。

動物
全ての手順は、欧州又は国内の規制にしたがっていた。

肺腺ガンモデル。
Ａ５４９細胞（１．２５×１０^６個）を６週齢の雌性ｎｕ／ｎｕマウスに皮下注射した。移植後（ｎ＝５〜６／モデル）、ノギス使用して二次元の腫瘍サイズを測定することによって、腫瘍成長を評価した。式［３．１４×長軸×短軸×短軸］／６（Kjonniksen et al., 1989）を使用して、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が約１００mm³のサイズに達したら、無作為化後に、ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）若しくはＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチド（５mg/kg）又はビヒクル（通常の生理食塩溶液）を７日間連続で毎日腹腔内注射することからなる処置を開始した。マウスを計量し、キャリパーによって腫瘍サイズを測定し、毎日記録した。処置を開始した２８日後に、マウスを屠殺した。腫瘍、腎臓、肺、心臓、肝臓、膵臓及び脾臓を取り出し、固定した。パラフィン包埋切片を調製し、組織学的分析のためにヘマトキシリン及びエオシンで染色した。

トリプルネガティブ乳ガン患者由来の原発腫瘍異種移植片（ＰＤＸ）。
患者から書面によるインフォームドコンセントを得て、手術時に患者から乳ガンのフラグメントを得た。イメージング誘導ヒト腫瘍生検を実施した後、３０〜６０mm³のフラグメントを、キシラジン（xylasin）（１０mg/kg）／ケタミン（１００mg/kg）の麻酔下で６週齢のＮＭＲＩヌードマウス（Centre-Elevage-Janvier, France）に皮下移植した。特定の無菌動物飼育設備（Institut Universitaire d’Hematologie）内でマウスを維持し、飲料水で希釈したエストロゲン（１７mg/mL）を投与した。異種移植片を特性評価し、続いて、マウスごとに皮下移植した。これらの異種移植片の組織学的生物学的プロファイル及び標準的処置に対する応答は、元のガンに近い類似性を示した（Marangoni et al., 2007; Varna et al., 2009）。本発明者らの実験では、２匹のヒトトリプルネガティブ乳ガン（ＨＢＣ）異種移植モデルを使用した（ＰＤＸ０１及びＰＤＸ０２）。ＰＤＸ０１は、化学療法に対して部分応答を示し、ＰＤＸ０２は非応答体であった（Bousquet G. et al.,準備中の原稿）。移植後、（ｎ＝６／モデル）、ノギス使用して二次元の腫瘍サイズを測定することによって、腫瘍成長を評価した。式［３．１４×長軸×短軸×短軸］／６（Kjonniksen et al., 1989）を使用して、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が約１５０mm³のサイズに達したら、無作為化後に、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド（２．４mg/kg）又はビヒクル（通常の生理食塩溶液）を７日間連続で毎日腹腔内注射することからなる処置を開始した。マウスを計量し、キャリパーによって腫瘍サイズを測定し、毎日記録した。処置を開始した１４日後に、マウスを屠殺した。腫瘍、腎臓、肺、心臓、肝臓、膵臓及び脾臓を取り出し、固定した。パラフィン包埋切片を調製し、組織学的分析のためにヘマトキシリン及びエオシンで染色した。

急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）モデル。
本発明者らは、Brown et al. (Brown et al., 1997)に記載されているように、ｈＭＲＰ８−ＰＭＬ／ＲＡＲαトランスジェニックマウス由来の白血病性芽球の同系移植片に基づく確立されたin vivo ＡＰＬモデルを使用する。このモデルは、その生物学的特徴、及び従来の治療薬（例えば、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ））に対するその応答の両方の点においてヒトＡＰＬを模倣し、マウスの１００％がこの疾患で死亡する（Brown et al., 1997; Kogan et al., 2000; Lallemand-Breitenbach et al., 1999）。白血病ｈＭＲＰ８−ＰＭＬ／ＲＡＲαトランスジェニックマウス（Brown et al., 1997）の骨髄、脾臓又はリンパ節から単離した１０４個の白血病細胞を６〜７週齢の同系ＦＶＢ／Ｎマウスの尾静脈に注射した。約８日目における白血球数の上昇及び血小板数の低下の出現によって、白血病の確立を評価した（Brown et al., 1997）。移植の１０日後、白血病細胞を移植したマウスをいずれかの種類の処置に無作為に割り当てた（ｎ＝６）。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド（１．８mg/kg）又はビヒクル（通常の生理食塩溶液）を７日間連続で毎日腹腔内注射した。５mgのＡＴＲＡ（Innovative Research of America）を含有する２１日放出ペレットの皮下移植によって、レチノイン酸を投与した。次いで、生存について、マウスをモニタリングした。

統計分析
データを平均及びＳＤとして表す。独立ｔ検定を使用して、２群間の統計的差異を評価した。３群以上の間の比較では、一元配置分散分析を使用した。＜０．０５のＰ値を統計的に有意であるとみなした。

結果
ＡＡＣ−１１ロイシンジッパーペプチドの設計
本発明者らは、ガン細胞の細胞傷害剤として、ＡＡＣ−１１のＬＺに及ぶ細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を設計した。野生型ペプチド（ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）、表１）は、ＡＡＣ−１１の残基３６３〜３９９の領域が、Ｎ末端又はＣ末端で、ショウジョウバエアンテナペディア／ペネトラチン（Ａｎｔｐ）タンパク質のホメオドメイン（アミノ酸４３〜５８）（それぞれＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）及びＣｔｅｒ−Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド））又は転写トランス活性化因子（ＴＡＴ）細胞透過性配列（ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド）のいずれかに由来する内在化配列に融合されているものから構成されていた。突然変異体ペプチド（Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）Ｌ／Ｇ）は、ＬＺのロイシン３７７、３８４及び３９１がグリシンに突然変異されていることを除いて同一であった。

様々なガン細胞に対する細胞透過Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの細胞傷害効果
本発明者らは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドが、低血清条件（０．５〜５％）下で、異なる組織起源に由来する（Ｐ５３陽性及びＰ５３陰性の両方の）血液腫瘍細胞株及び固形腫瘍細胞株のパネルの細胞死を誘導する能力を評価した。最初に、本発明者らは、漸増濃度のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドに対する血液ガン細胞株（Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫細胞株Ｋａｒｐａｓ１１０６及びＳＵ−ＤＨＬ−５並びにＴ急性リンパ芽球性白血病細胞株ＳｅＡｘ及びＨＵＴ−７８）の感度を評価した。（図１Ａ）に示されているように、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドに曝露すると、全ての細胞株について、細胞生存率の劇的な減少が用量依存的に観察された。次いで、本発明者らは、一連の固形腫瘍細胞株及び正常細胞（ＨａＣａｔ、ＮＣＴＣ及びヒト初代線維芽細胞）に対するＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの細胞傷害効果を研究した。図１Ｂに示されているように、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの濃度が増加するにつれて、ガン細胞株の細胞生存率の顕著な減少が観察された。また、このアッセイでは、Ｐ５３陽性細胞（例えば、肺腺ガンＡ５４９細胞）及びＰ５３ヌル細胞（例えば、肺腺ガンＨ１２９９細胞）の両方を使用したので、この毒性は、ガン細胞株のｐ５３の状態とは無関係であると思われた。興味深いことに、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、試験した正常細胞（ＨａＣａｔ、ＮＣＴＣ及び初代線維芽細胞）では、非常に低い毒性を誘発したが（図１Ｂ）、これは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドが、ガン細胞に対して特異的な毒性を示すことを示している。野生型ペプチドで観察されたものとは対照的に、ペネトラチンペプチドのみ、ペネトラチン結合を有しないＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド、及び突然変異体ペプチドＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）Ｌ／Ｇはいずれも、Ａ５４９細胞の細胞死を誘導しなかった（図１Ｃ）。これは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの細胞傷害効果がアミノ酸配列特異的であり、ペプチド又はリーダー配列の非特異的効果ではないことを示している。注目すべきことに、１０％血清を含有する又は含有しない様々な培地のオスモル濃度は同程度である（血清含有培地の場合には約２８０mOsmolであるのに対して、無血清培地の場合には２７０mOsmolである。データは示さず）ことが見出されたので、観察されたＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの細胞傷害性について、オスモル濃度効果の関与は排除される。これらのデータは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドが、成長因子欠乏条件下において、マイクロモル濃度でガン細胞致死的であることを示唆している。

次に、本発明者らは、ＡＡＣ−１１（３６３−３９９）ドメインを転写トランス活性化因子（ＴＡＴ）細胞透過性配列（ＨＩＶＴＡＴタンパク質（アミノ酸４９〜５７）由来の塩基性ペプチド配列）にコンジュゲーションすることによって、ガン細胞毒性に対する前記内在化配列の効果を調査した。ＴＡＴコンジュゲーションは、生物学的に活性なペプチド及びタンパク質のin vitro及びin vivo送達に広く使用されている（Heitz et al., 2009）。得られたＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの取り込みは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドと同程度であった（データは示さず）。次いで、本発明者らは、正常細胞及び腫瘍細胞の両方に対するＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの細胞傷害性をアッセイした。用量反応分析は、低血清条件で培養した場合のＡ５４９ガン細胞の生存率の減少について、ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドが、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドと比較して少なくとも同程度に有効であったことを示している（図２Ａ）。固形腫瘍細胞株Ｈ１２９９、ＭＣＦ７、Ｕ２ＯＳ、Ｄ３Ｈ２ＬＮ、Ｓｋｏｖ３、ＣＴ−２６、１２０５、Ｂ１６、ＷＭ２６６−４並びに血液腫瘍細胞株Ｋａｒｐａｓ＿１１０６、ＤＨＬ−５、Ｓｅａｘ及びＨｕＴ−７８においてＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドを使用したところ、同様の結果が得られた（データは示さず）。興味深いことに、非悪性細胞は、大部分がＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドに対してより耐性であった（図２Ｂ）。これらの結果は、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドで観察されたように、ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドが、腫瘍細胞に対して選択的に毒性であることを示している。最後に、得られたＣｔｅｒ−Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、ガン細胞に対して、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドと同様の細胞傷害を示したが、正常細胞に対しては示さなかったので（図２Ａ及び図２Ｂ）、Ｎ末端とは対照的に、Ｃ末端へのＡｎｔｐ配列の付加は、ＡＡＣ−１１（３６３−３９９）ドメインの細胞傷害特性に影響を及ぼさなかった。Ｃｔｅｒ−Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの取り込みは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドと同程度であった（データは示さず）。したがって、リーダーペプチドとして異なるＣＰＰを使用するＡＡＣ−１１（３６３−３９９）ドメイン含有キメラペプチドは、非悪性細胞に無害である一方で、腫瘍細胞において同程度の毒性を示す。

高親和性かつ卓越した特異性でタンパク質に結合する能力にもかかわらず、治療薬としての用途では、in vivoにおけるタンパク質分解に対するペプチドの感受性が依然として問題であることが多い。ペプチドをプロテアーゼ耐性にする１つの方法は、天然Ｌ型に代えてＤ−アミノ酸を使用することを含む。レトロインベルソペプチドは、親Ｌ−配列のものと逆の順序でアセンブルされたＤ−アミノ酸から構成される。ペプチド構造のこの二重反転は、親Ｌ−ペプチドの全体的な表面トポロジーを維持するので（Chorev and Goodman, 1995）、高度のトポケミカル当量につながるとされており、それと同時に、高いタンパク質分解安定性を提供する（Fischer, 2003）。より優れた安定性により、レトロインベルソペプチドは、効力の増加を示すことが多い。したがって、本発明者らは、ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドのレトロインベルソ型を合成し、得られたＲＩ−ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド及び親Ｌ−異性体を細胞傷害特性について比較した。興味深いことに、用量反応分析により、ＲＩ−ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、低血清条件下でＡ５４９ガン細胞の生存率を減少させる点で、ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドよりも有効であったのに対して（図２Ａ）、試験した非悪性細胞では、細胞傷害がほとんど生じなかったことが示された（図２Ｂ）。固形腫瘍細胞株Ｈ１２９９、ＭＣＦ７、Ｕ２ＯＳ、Ｄ３Ｈ２ＬＮ、Ｓｋｏｖ３、ＣＴ−２６、１２０５、Ｂ１６、ＷＭ２６６−４並びに血液腫瘍細胞株Ｋａｒｐａｓ＿１１０６、ＤＨＬ−５、Ｓｅａｘ及びＨｕＴ−７８においてＲＩ−ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドを使用したところ、同様の結果が得られた（示さず）。したがって、本発明者らの結果は、ＲＩ−ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドが完全な機能を保持しており、親Ｌ−異性体のように、その細胞傷害効果がトランスフォーメーション細胞に選択的であることを示している。

細胞死は、壊死又はアポトーシスのいずれかによって起こり得る。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドが、低血清条件下でカスパーゼ依存性アポトーシスを誘導するかを決定するために、本発明者らは、パンカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの存在下又は非存在下で、Ａｎｔｐ−Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドで処理したＡ５４９細胞の細胞生存率を評価した。図３に見られるように、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド誘導性の細胞傷害をレスキューせず、どういうわけか増加させた（これは、観察された細胞死がカスパーゼ依存性ではないことを示唆している）のに対して、コントロールとして、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、シスプラチン誘導性の細胞死を阻害することができた。ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド及びＲＩ−ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドを用いたところ、同じ結果が観察された（データは示さず）。

タンパク質合成が、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの細胞傷害効果に関与したかを決定するために、本発明者らは、１０μMのタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨｘ）の存在下又は非存在下で、様々な濃度のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドで処理したＡ５４９細胞の細胞生存率を評価した。シクロヘキシミドは、ペプチドのみと比較して、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド誘導性の細胞傷害に影響を及ぼさなかったが（データは示さず）、これは、ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドが、その細胞傷害作用をde novoタンパク質合成に依存しないことを示唆している。ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド及びＲＩ−ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドを用いたところ、同じ結果が観察された（データは示さず）。

膜不透過ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の核標識能力によって実証した場合の、原形質膜の完全性の喪失は、壊死を実証するための簡単なアプローチである。したがって、本発明者らは、異なる時間の曝露後に、ＰＩ取り込みアッセイによって、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドで処理したＳｅＡｘ細胞の壊死性細胞死を評価した。これらの実験条件下では、ＰＩは、インタクトな膜を有する細胞によって排除されるので、ＰＩ陽性は、壊死の指標として用いられ得る。図４Ａに示されているように、ＳｅＡｘ細胞は、４μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドへの曝露後に、極めて迅速に原形質膜の完全性のさらなる喪失を示した。実際、４μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド処理のわずか５分後に、細胞の９０％がＰＩ陽性であったが、これは、膜の完全性の喪失及び漏出を示している。この値は、最大６０分間不変であった。ＤＨＬ−５、ＨｕＴ−７８及びＡ５４９細胞を用いたところ、同様の結果が得られた（データは示さず）。興味深いことに、非悪性細胞ＨａＣａｔをＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドで処理すると、細胞膜の完全性の喪失が大幅に減少した（図４Ａ）。ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド及びＲＩ−ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドを用いたところ、同様の結果が得られた（データは示さず）。したがって、これらの結果は、マイクロモル濃度のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの非常に短時間（分）の曝露が、低血清条件下で培養した場合のガン細胞において、通常は壊死性細胞死によって起こるような原形質膜の完全性の喪失を誘導するが、正常細胞においては誘導しないことを示唆している。

培養培地中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性放出に基づいて、壊死をさらに評価した。ＬＤＨは、壊死に起因する膜の完全性の喪失後に培養培地中に放出される可溶性細胞質酵素である。したがって、細胞培地中のＬＤＨ活性は、細胞膜の完全性の指標として使用され得、細胞壊死の一般的な指標として役立つ。図４Ｂに示されているように、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドに曝露すると、Ａ５４９細胞上清へのＬＤＨ放出が劇的に増加した（これは、膜損傷及び壊死性細胞死を示している）のに対して、未処理細胞又は非悪性ＨａＣａｔ細胞は、わずかなＬＤＨ放出を示した。１０μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド処理のわずか５分後に、Ａ５４９細胞上清において、高（約４０％）レベルのＬＤＨ放出が検出されたので、この効果は極めて迅速であった。０．８％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による処理後の最大ＬＤＨ放出と比較して、８０％のＬＤＨ放出が、１０μMのＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドに１時間曝露した後に観察された。ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド及びＲＩ−ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドを用いたところ、同様の結果が得られた（データは示さず）。総合すると、これらのデータは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドが、膜分解を介して、ガン細胞の極めて高速な壊死を誘導することを示している。

Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの機能をより良く理解するために、及びその細胞傷害表現型の配列決定因子を解明するために、本発明者らは、ペプチドの配列分析を行った。ガン細胞に対するＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの細胞傷害性に必要な最小配列を決定するために、本発明者らは、Ｎ末端ペネトラチンに融合されている一連のＮ末端及び／又はＣ末端切断型変異体を作製した（表１）。ＭＴＴアッセイを使用してＡ５４９細胞において、細胞死に対するこれらの変異体の効果を測定した。このアプローチにより、本発明者らは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）配列が下限サイズを構成するか、又はより短いペプチドがガン細胞死特性を示し得るかを決定することが可能になるはずである。

驚くべきことに、図５Ａに観察されるように、用量反応分析により、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドのＮ末端アミノ酸１〜７（ＡＡＣ−１１ドメイン配列ナンバリング）を切断すると、低血清条件下で培養した場合の親ペプチドと比較して、細胞傷害効力が顕著に増加したことが示された。実際、２μMで使用した場合、得られたＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７１−３９９）及びＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドは、細胞生存率をそれぞれコントロールの３３．２％及び５％に減少させたのに対して、親ペプチドを用いた場合にはコントロールの９７％であった。

Ｃ末端残基の最後の２個の削除（Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７１−３９７）ペプチド）又は８個の削除（Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７１−３９１）ペプチド）は、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７１−３９９）ペプチドと比較して、細胞傷害性が減少したが、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７１−３９７）又はＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７１−３９１）ペプチド変異体は両方とも、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）親ペプチドと比較して有意に高い細胞死を誘発した（図５Ａ）。

非常に興味深いことに、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドの中央ドメインの５個の残基を削除すると、最も高いガン細胞死誘導活性を有する形態が得られた。実際、２μMで使用した場合、得られたＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９ Δ３８５−３９０）は、細胞生存率をそれぞれコントロールの３％に減少させたのに対して、親ペプチドを用いた場合にはコントロールの９７％であった。これは、残基３７７〜３８４がガン細胞毒性に必要であることを示している。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド内の活性配列をさらに絞り込むために、Ｎ末端切断を評価した。親Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの最初の１７個の残基を削除すると、得られたＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３８０−３９９）ペプチドは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドよりも弱いが実質的な細胞死を誘導したので、活性は減少した（図５Ａ）。固形腫瘍細胞株Ｈ１２９９、ＭＣＦ７、Ｕ２ＯＳ、Ｄ３Ｈ２ＬＮ、Ｓｋｏｖ３、ＣＴ−２６、１２０５、Ｂ１６、ＷＭ２６６−４並びに血液腫瘍細胞株Ｋａｒｐａｓ＿１１０６、ＤＨＬ−５、Ｓｅａｘ及びＨｕＴ−７８において切断ペプチドを使用したところ、同様の結果が得られた（示さず）。最後に、悪性細胞と比較して、生産したペプチドは、非悪性細胞ＨａＣａｔにおける細胞傷害を大幅に減少させた（図５Ｂ）。総合すると、これらの結果は、切断ＡＡＣ−１１−ＬＺペプチドが、親ペプチドカウンターパートのように、マイクロモル濃度で選択的なガン細胞死を誘導することを示しており、ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの残基３７７〜３９１（ＡＡＣ−１１特異的配列ナンバリング）がその毒性に必要であり、ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの残基３８０〜３８４（ＡＡＣ−１１特異的配列ナンバリング）が、そのガン細胞毒性のための最小配列を構成することを示唆している。

次に、本発明者らは、切断ＡＡＣ−１１ペプチド媒介性の細胞傷害性が、細胞膜の完全性の喪失、したがって壊死に関係していたかを調べた。ＰＩ排除分析により、４μMの前記切断ペプチドによるＳｅＡｘ細胞の処理は、迅速な原形質膜透過性を誘導したことが示された（図６Ａ）。実際、全ての試験ペプチドに曝露した場合、処理の５分後に、細胞のほぼ９０％がＰＩ陽性であった。また、経時的な分析は、切断ペプチドで処理したＡ５４９細胞が、大量のＬＤＨ放出を示したことを示している（図６Ａ）。やはり、処理のわずか５分後に、前記ペプチドは３０〜５０％のＬＤＨ放出を示したので、この効果は極めて迅速であった図６Ｂ）。総合すると、これらのデータは、前記切断ペプチドがガン細胞の膜分解を誘導して壊死性細胞死をもたらすこと、及び３７７−３９１（特に、３８０−３８４）フラグメントが、全長Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの活性モチーフを構成することを示している。

Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、ガン細胞の遊走及び浸潤を障害する
腫瘍細胞の顕著な特徴は、浸潤性表現型を獲得して原発腫瘍から転移する能力であり、浸潤の阻止は、転移性播種の初期段階を阻害する基本的な戦略である。現在、転移をコントロールする分子経路は比較的良く理解されているが、転移カスケード及び最終的には転移形成の重要な段階を有効に阻害するツールはまだない。以前の報告では、ＡＡＣ−１１の過剰発現は、子宮頸ガン細胞のコロニー形成を増加させることが見出されたので、ＡＡＣ−１１は、細胞遊走をコントロールし得ることが示されている（Kim et al., 2000）。したがって、本発明者らは、トランスウェルボイデンチャンバー遊走アッセイを使用して、高浸潤性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳ガン細胞株由来Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞の遊走に対するＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの影響を評価した。図７Ａに示されているように、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド処理は、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞の遊走を実質的に減少させたのに対して、Ａｎｔｐ−ｏｎｌｙペプチドは、いかなる効果も示さなかった。ＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドを用いたところ、同様の結果が観察された（示さず）。注目すべきことに、使用した濃度では、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）及びＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドはいずれも、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞の増殖を障害しなかったので、遊走の障害が増殖の減少の結果であったという可能性は除外される（示さず）。次に、本発明者らは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドが細胞浸潤を妨害し得るかを評価した。図７Ｂに示されているように、マトリゲル層及び多孔質フィルタからなる連続障壁にもかかわらず、細胞が遊走した「浸潤」アッセイでは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドは、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞の浸潤を防止したのに対して、Ａｎｔｐ−ｏｎｌｙペプチドは、いかなる効果も示さなかった。

Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの全身送達は、トリプルネガティブ乳ガン患者由来異種移植（ＰＤＸ）マウスモデルにおける腫瘍成長を阻害する
次に、本発明者らは、ＰＤＸトリプルネガティブ乳房腫瘍マウスモデルを使用することによって、遠隔固形腫瘍の成長に対するＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの効果を調査した。トリプルネガティブ乳房腫瘍はターゲティング治療の候補ではないため、新たな治療を開発する臨床的必要性があるので、本発明者らのin vivo異種移植研究のモデルとして、トリプルネガティブ乳房腫瘍を選択した。最初に、本発明者らは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド又は通常の生理食塩溶液（用量範囲：０．８〜４．８mgペプチド／kg体重；ｎ＝マウス３〜４匹／群）を４週間にわたって週２回腹腔内注射したヌードマウスにおいて、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの毒性を評価した。実験中に死亡したマウスはおらず、異なる群間で体重に有意差はなかった（図８Ａ）。実験終了時に、ペプチドを注射したマウスの腎臓、肺、心臓、肝臓、膵臓及び脾臓に対する明らかな毒性は観察されなかった（データは示さず）。

次いで、本発明者らは、２つの異なる患者生検に由来する皮下トリプルネガティブ乳房腫瘍異種移植片を担持する２つヌードマウス群（ＰＤＸ０１及びＰＤＸ０２）を使用して、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの腫瘍成長阻害能力を評価した。これらの異種移植片の標準的処置に対する応答は、元のガンに近い類似性を示し、ＰＤＸ０１は低応答体であり、ＰＤＸ０２は非応答体であった（Bousquet G. et al.,準備中の原稿）。図８Ｂに示されているように、両群とも、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドで処置したマウスは、ビヒクルで処置したマウスよりも有意に小さい腫瘍を発症した。実際、ＡＡＣ−１１ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドを投与したマウスは、コントロール処置マウスの腫瘍のものよりも３５％少ない（ＰＤＸ０１）又は５０％少ない（ＰＤＸ０２）最終平均体積を達成した（ｐ＝０．０１）。これらのデータは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドがそれ自体で、既に形成された積極的に増殖している腫瘍の成長を阻害し得ることを実証している。

急性前骨髄球性白血病のＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド処置
これらの結果を拡大するために、本発明者らは、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）のマウスモデルにおけるＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの有効性を試験した。ＰＭＬ／ＲＡＲαトランスジェニックマウス由来の白血病性芽球の同系移植片に基づくこのモデルは、その生物学的特徴、及び従来の治療薬（例えば、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ））に対するその応答の両方の点においてヒトＡＰＬを模倣する（Brown et al., 1997; Kogan et al., 2000; Lallemand-Breitenbach et al., 1999）。コントロールマウスは、短時間内に腫瘍負荷で死亡した（２７日間の平均生存時間）（図９）。予想通り、ＡＴＲＡ処置マウスは、コントロール群と比較して有意に長い生存を有していた（５６日間の平均生存時間）。興味深いことに、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチド処置は、ＡＴＲＡで得られたものよりも良い生存をもたらした（６８．５日間の平均生存時間）。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドを注射した６匹のマウスのうちの４匹は最大６７日間生存し、この群のうちの２匹は最大７６日間生存したのに対して、ＡＴＲＡ群のマウスは１匹のみが最大６７日間生存した。器官及び組織切片検査結果を拡大して、全ての群について、死亡原因がＡＰＬ（Lallemand-Breitenbach et al., 1999）であったことを確認した。これらの観察結果は、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺは（３６３−３９９）ペプチドが強力な抗白血病効果を有しており、寿命の有意な増加をもたらすことを実証している。

Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドは、ガン細胞の遊走及び浸潤を障害する
腫瘍細胞の顕著な特徴は、浸潤性表現型を獲得して原発腫瘍から転移する能力であり、浸潤の阻止は、転移性播種の初期段階を阻害する基本的な戦略である。現在、転移をコントロールする分子経路は比較的良く理解されているが、転移カスケード及び最終的には転移形成の重要な段階を有効に阻害するツールはまだない。以前の報告では、ＡＡＣ−１１の過剰発現は、子宮頸ガン細胞のコロニー形成を増加させることが見出されたので、ＡＡＣ−１１は、細胞遊走をコントロールし得ることが示されている（Kim et al., 2000）。したがって、本発明者らは、トランスウェルボイデンチャンバー遊走アッセイを使用して、高浸潤性骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞の遊走に対するＡｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドの影響を評価した。図１０Ａに示されているように、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチド処理は、Ｕ２ＯＳ細胞の遊走を実質的に減少させたのに対して、ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドは、いかなる効果も示さなかった。Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）又はＴＡＴ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３６３−３９９）ペプチドを用いたところ、同様の結果が観察された。注目すべきことに、使用した濃度では、ペプチドはいずれも、Ｕ２ＯＳ細胞の増殖を障害しなかったので、遊走の障害が増殖の減少の結果であったという可能性は除外される。次に、本発明者らは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドが細胞浸潤を妨害し得るかを評価した。図１０Ｂに示されているように、マトリゲル層及び多孔質フィルタからなる連続障壁にもかかわらず、細胞が遊走した「浸潤」アッセイでは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドは、Ｕ２ＯＳ細胞の浸潤を防止したのに対して、ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドは、いかなる効果も示さなかった。

Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドの全身送達は、Ａ５４９非小細胞肺ガン異種移植マウスモデルにおける腫瘍成長を阻害する
次に、本発明者らは、Ａ５４９非小細胞肺ガン異種移植マウスモデルを使用することによって、遠隔固形腫瘍の成長に対するＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドの効果を調査した。最初に、本発明者らは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチド又は通常の生理食塩溶液（用量範囲：１〜６mgペプチド／kg体重；ｎ＝マウス３〜４匹／群）を４週間にわたって週２回腹腔内注射したヌードマウスにおいて、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドの毒性を評価した。実験中に死亡したマウスはおらず、異なる群間で体重に有意差はなかった（図１１Ａ）。実験終了時に、ペプチドを注射したマウスの腎臓、肺、心臓、肝臓、膵臓及び脾臓に対する明らかな毒性は観察されなかった。

次いで、本発明者らは、Ａ５４９非小細胞肺ガン異種移植モデルを使用して、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドの腫瘍成長阻害能力を評価した。図１１Ｂに示されているように、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドで処置したマウスは、ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９ペプチド又はビヒクルで処置したマウスよりも有意に小さい腫瘍を発症した。実際、ＡＡＣ−１１ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドを投与したマウスは、コントロール処置マウスの腫瘍のものよりも２５％少ない最終平均体積を達成した（ｐ＝０．０１）。これらのデータは、Ａｎｔｐ−ＡＡＣ−１１−ＬＺ（３７７−３９９）ペプチドがそれ自体で、既に形成された積極的に増殖している腫瘍の成長を阻害し得ることを実証している。

参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明に関連する現状技術を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。

Claims

ポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８４位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなり、
配列番号：１のアミノ酸配列からならず、配列番号：１の３６３位のアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列からならない、ポリペプチド。
ｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８８位のイソロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８８位のイソロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８８位のイソロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３８８位のイソロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
ｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
ｉ）配列番号：１の３７９位のチロシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７９位のチロシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７９位のチロシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７９位のチロシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
ｉ）配列番号：１の３７８位のグルタミン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７８位のグルタミン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７８位のグルタミン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７８位のグルタミン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
ｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
ｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９７位のグリシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９７位のグリシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９７位のグリシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９７位のグリシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
ｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９１位のロイシン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
ｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３８０位のフェニルアラニン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
ｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７１位のリジン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
ｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列のレトロインベルソであるアミノ酸配列、又は
ｉｖ）配列番号：１の３７７位のロイシン残基から３９９位のトレオニン残基に及ぶアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するレトロインベルソであるアミノ酸配列
を含むか、又はこれからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
５個、６個、７個、８個、９個；１０個；１１個；１２個；１３個；１４個；１５個；１６個；１７個；１８個；１９個；２０個；２１個；２２個；２３個；２４個；２５個；２６個；２７個；２８個；２９個；３０個；３１個；３２個；３３個；３４個；３５個；３６個；３７個；３８個；３９個；４０個；４１個；４２個；４３個；４４個；４５個；４６個；４７個；４８個；４９個；５０個；５１個；５２個；５３個；５４個；５５個；５６個；５７個；５８個；５９個；６０個；６１個；６２個；６３個；６４個；６５個；６６個；６７個；６８個；６９個；７０個；７１個；７２個；７３個；７４個；７５個；７６個；７７個；７８個；７９個；８０個；８１個；８２個；８３個；８４個；８５個；８６個；８７個；８８個；８９個；９０個；９１個；９２個；９３個；９４個；９５個；９６個；９７個；９８個；９９個；又は１００個のアミノ酸を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
２０個未満のアミノ酸を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
少なくとも１つの異種ポリペプチドに融合されている請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
前記ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸が、前記異種ポリペプチドのＮ末端の最初のアミノ酸に共有結合によって直接的に連結されているか、又は前記ポリペプチドのＮ末端の最初のアミノ酸が、前記異種ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸に共有結合によって直接的に連結されている、請求項１４に記載の融合タンパク質。
異種ポリペプチドが細胞透過性ペプチドである、請求項１４に記載の融合タンパク質。
異種ポリペプチドが、ショウジョウバエアンテナペディア／ペネトラチン（Ａｎｔｐ）タンパク質のホメオドメイン又は転写トランス活性化因子（ＴＡＴ）細胞透過性配列（配列番号：１２）のいずれかに由来する内在化配列である、請求項１４に記載の融合タンパク質。
配列番号：４、配列番号：６；配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０；配列番号：１１；配列番号：１３；及び配列番号：１４；配列番号：１６；及び配列番号：１７からなる群より選択される配列を含むか、又はこれからなる、請求項１４に記載の融合タンパク質。
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸配列。
請求項１９に記載の核酸配列を含む、ベクター。
少なくとも１つの請求項１９に記載の核酸分子又は請求項２０に記載のベクターで遺伝的にトランスフォーメーションされた、原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞。
それを必要とする被験体におけるガンを処置するための方法であって、治療有効量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を該被験体に投与することを含む、方法。
ガンが、乳ガン、トリプルネガティブ乳ガン、急性前骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、血液ガン、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｔ急性リンパ芽球性白血病、肺腺ガン、腎ガン、卵巣ガン、結腸ガン、黒色腫、セザリー症候群からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。