JP2017509905A

JP2017509905A - 電気泳動分離の方法

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Inventors: ラーソン，シェル
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Abstract

ゲル部材、および分離する試料液を受けるための１つ以上の試料ウェルを有する、分離ゲル装置を用いる電気泳動分離の方法であって、試料ウェルは、ゲル部材と流体接触し、分離する試料液を１つ以上の試料ウェルに加えるステップと、電気泳動分離プロセスを進めるために、ゲル部材に電場を印加するステップであって、試料成分は、分離するために、（複数の）試料ウェル内の試料液から、ゲル部材へと取り出される、電場を印加するステップと、除去基準が満たされたときに、試料成分の分離ゲルへのローディングを中断するステップとを含む方法。【選択図】図１２ｂ

Description

本発明は、ウェル浄化装置に関し、より詳細には、取り扱い性を改善した電気泳動分離の方法およびウェル浄化ユニットに関する。

電気泳動は、分析に一般的に用いられる方法であり、荷電分子および粒子が、２つの電極間で電場をかけられた、通常はゲルである分離媒体内を移動する。タンパク質の分離は、等電点（ｐＩ）、分子の重さ、電荷、またはこれらの要素の組み合わせによってもよい。

分離ゲルは、通常は支持体に置かれ、ゲルの２つの対向する端部は、溶液または硬質な形態で、電極バッファに接触する。電極は、電極バッファを含む容器に挿入することができる。バッファ溶液は、ｐＨその他のパラメータを一定に保つために、電解質媒体、およびイオン用のリザーバの両方を形成する。分離後は、分子は異なる方法で、例えば視覚的には、ゲルの染色によって、もしくは染色されたゲルまたはラベラー試料をレーザースキャナ等でスキャンまたは画像化する等の光学手段によって、検出され識別される。

ゲル電気泳動は、タンパク質、ペプチド、核酸等の生体分子を分離する目的で、今日では日常的に用いられている。試料は、様々なスクリーニング、識別（細胞シグナル伝達、発現および精製）、または臨床試験で取り扱われる。タンパク質試料は、例えばヒト、哺乳動物の組織、細胞溶解物、もしくは細菌、昆虫、または酵母の細胞系から派生したものであってもよい。様々な種類の分子の電気泳動条件は異なっており、多くの事例に適合させなければならない。したがって、試料の種類ごとにゲルおよびバッファ溶液の両方を選択しなければならないことが多い。

蛍光色素を用いたタンパク質の標識化は、タンパク質を追跡および定量化するために選択される方法となっている。蛍光標識化は、感度が良く、直線的検出範囲が広くなる。また、タンパク質染色方法の簡便な代替手段を提供し、放射性標識化よりも安全な選択肢である。

色素および標識化条件の選択は、用途に依存する。免疫学の用途、例えば抗体標識化では、高いシグナル強度を得ること、および色素対タンパク質比がこれに従って最適化されることが重要である。電気泳動では、適切な色素対タンパク質比を用いることも必要であり、この場合、高シグナル強度と鮮明な電気泳動バンドとの両方を得ることが必要である。さらに、等電点電気泳動（ＩＥＦ）では、タンパク質の等電点が変わらないように、電荷が一致する色素を用いる必要がある。電気泳動のための事前標識化はよく知られている（例えば、１９８６年にオックスフォード大学のＣｌａｒｅｎｄｏｎＰｒｅｓｓより出版されたＡｎｔｈｏｎｙＴ．Ａｎｄｒｅｗｓによる『Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ』を参照）。

国際公報第２０１３／１８０６４２号パンフレット

本発明の目的は、電気泳動分離、自動化された電気泳動システム、および試料液除去装置の新しい方法を提供することであり、この方法、システム、および装置により、先行技術の１つ以上の欠点を克服する。これは、独立クレームで定義されるような電気泳動ゲルユニットによって達成される。

本発明の１つの利点は、電気泳動分離の結果に質の向上をもたらすことである。

本発明ならびにそのさらなる特徴および利点については、以下の詳細な説明および図面を参照することによって、より完全な理解が得られるであろう。

一実施形態による、電気泳動カセットの概略斜視図である。図１の電気泳動カセットの構成部品を示す。図１の電気泳動カセットの構成部品を示す。図１の電気泳動カセットの別の構成部品を示す。図１の電気泳動カセットの別の構成部品を示す。図１の電気泳動カセットのさらに別の構成部品を示す。図１の電気泳動カセットのさらに別の構成部品を示す。支持フレームの上面にゲル部材が取り付けられている、電気泳動ゲルユニットを示す。これを用いて電気泳動実験を行うために、電気泳動カセットに適合する電気泳動トレイの概略図を示す。図４の電気泳動トレイと共に用いるための、バッファパッドの概略図を示す。図４の電気泳動トレイと共に用いるための、バッファパッドの概略図を示す。電気泳動カセット、および適合する電気泳動装置を用いた電気泳動分離実験の実施に関わる手順を概略的に示す。電気泳動カセット、および適合する電気泳動装置を用いた電気泳動分離実験の実施に関わる手順を概略的に示す。電気泳動カセット、および適合する電気泳動装置を用いた電気泳動分離実験の実施に関わる手順を概略的に示す。電気泳動カセット、および適合する電気泳動装置を用いた電気泳動分離実験の実施に関わる手順を概略的に示す。電気泳動カセット、および適合する電気泳動装置を用いた電気泳動分離実験の実施に関わる手順を概略的に示す。電気泳動カセット、および適合する電気泳動装置を用いた電気泳動分離実験の実施に関わる手順を概略的に示す。本発明の実施形態を概略的に示す。本発明の実施形態を概略的に示す。本発明の実施形態を概略的に示す。本発明の実施形態を概略的に示す。本発明の実施形態を概略的に示す。本発明の実施形態を概略的に示す。本発明の実施形態を概略的に示す。本発明の実施形態を概略的に示す。本発明の実施形態を概略的に示す。本発明の実施形態を概略的に示す。本発明の実施形態を概略的に示す。実験結果を示す。別の実験結果を示す。

本開示の全体を通して、電気泳動ゲルの分離ゾーンは、電気泳動の完了後に分離された試料の種が配置される、ゲルの一部として定義される。

図１は、電気泳動カセット１０の斜視図であり、国際公開第２０１４／００７７２０号パンフレットに詳しく開示されており、これは、参照することによってその全体が本願に組み込まれる。本発明は、カセット１０および関連する特徴を参照しながら以下に開示されるが、本発明は、他の電気泳動カセットまたは装置の使用を含み得ることが理解されるべきである。カセット１０は、カセットハウジング２０、取り外し可能なゲル支持フレーム３０、部分別に除去可能な裏打ちフィルム４０、および除去可能な試料ウェルカバー５０を備える。図１は、組み立てられた状態の電気泳動カセットを示す。

ゲルカセット１０は、電気泳動分離用の平坦なゲル部材３６を成形するためのゲル区画を内部に画定する。

図２ａおよび図２ｂは、カセットのその他の部品が除去されたカセットハウジング２０を示す。図２ｂがカセットハウジング２０を下側から示しているのに対して、図２ａは上面図である。カセットハウジング２０は、通常、上面６５および下面６６を有する薄い上壁６０、ならびに上壁６０の周囲でそこから下方に突出し、底面８０および内壁７５を有する縁７０からなる。上壁６０の下面６６、および縁７０の内壁７５は、ゲル区画をほぼ画定し、これは図１に示され、以下でより詳細に説明されるように、縁７０の底面８０に、支持フレーム３０および除去可能な裏打ちフィルム４０を取り付けることによって、下から閉じることができる。開示されている実施形態では、カセット１０に成形されたゲル部材３６の厚さは、縁の内壁７５の高さとほぼ同じになる。支持フレーム３０および除去可能な裏打ちフィルム４０が、開示されている実施形態にあるように平坦であれば、開示されている実施形態において、上壁６０の厚さは均一であり、ゲル部材３６の厚さも均一になる。ゲルの厚さは、好ましくは、特定のゲルの種類、および用いられるバッファ系に適合され、電気泳動手順に関与する所望の電流にも適合される。

開示されているカセット１０には、分離のために、ゲル部材３６に試料をロードできるようにする１０個の試料ウェル開口１１０が設けられ、各試料ウェル開口１１０は、分離中は１つの電気泳動レーンに対応する。試料ウェル開口１１０の数および形状は、電気泳動カセットの実際の寸法、分離の種類、および電気泳動ゲルの種類等に応じて異なっていてもよい。１つから例えば１００個までの、任意適当な数の試料ウェル開口１１０があってもよい。

図１では、試料ウェル開口１１０は、除去可能な試料ウェルカバー５０で覆われており、これは、図２ｃおよび図２ｄにさらに詳しく開示される。試料ウェルカバー５０は、ウェル開口１１０の上方で嵌合して、成形プロセスおよび貯蔵中はこれを閉じておくように配置される。試料が試料ウェル１１０にロードされる前に、ウェルカバー５０は、試料ウェル１１０を開くために除去される。開示されている実施形態では、ウェルカバー５０は、成形中にゲル溶液が漏れたり、貯蔵中にカセットの中に空気が入ったりするのを避ける目的で、本質的にシール作用をもたらすために、噛み合った状態で試料ウェル開口１１０に嵌合するように形成された、ウェル形成突起５２を有する。一実施形態によれば、ウェル形成突起５２は、除去されたときにゲル部材３６へと延びる試料ウェルを形成するために、上壁６０の下面６６の下方に延びて、ゲル部材３６に入るように設計される。別の実施形態では、ウェル形成突起５２は、ゲル部材３６のほぼ平坦な面を設けるために、上壁６０の下面６６と同一平面になるように設計され、試料ウェルは、試料ウェル開口１１０によって形成される。一実施形態では、試料ウェルカバー５０は、上壁６０の上面６５をシールするように配置されるか、またはその結合体である。

開示されている実施形態によれば、取り外し可能なゲル支持フレーム３０は、縁７０の底面８０に取り外し可能に取り付けられ、次に、部分別に除去可能な裏打ちフィルム４０が、ゲル支持フレーム３０の底面に取り付け／積層される。ゲル支持フレーム３０および裏打ちフィルム４０は、電気泳動区画を閉じる下壁、ならびに成形および貯蔵用の過剰充填チャンバ１００を共に設ける。図２ｅに示されているように、ゲル支持フレーム３０の開示されている実施形態は、２つのバッファスリット１５０ａおよび１５０ｂ、ならびに分離ゾーンウィンドウ１６０を有し、そのそれぞれが、図２ｆに示されている裏打ちフィルム４０の除去可能部分２１０ａ〜２１０ｃのそれぞれによって下から覆われる。適切な材料の組み合わせ、および接着技術を選択することによって、裏打ちフィルム４０は、例えば、作業者が各剥離タブ２１１ａ〜２１１ｃを掴んで引っ張ることによって各部分２１０ａ〜２１０ｃを除去することができるように、ゲル支持フレーム３０の底面に積層することができる。以下でより詳細に説明されるように、電気泳動実験を行う目的で、裏打ちフィルム４０の部分２１０ａおよび２１０ｂは、電気泳動装置のバッファパッドにゲルを接触させておくために除去される。電気泳動の実行に続いて、転写／ブロッティングおよびプロービングのための、ゲル部材３６の分離ゾーンへのアクセスを提供するために、部分２１０ｂは、分離ゾーンウィンドウ１６０を介してゲルを露出させるために除去される。

電気泳動の実行後の手順で、ゲル部材３６の取り扱い性を大幅に改善するために、ゲル支持フレーム３０は、カセット１０から除去された後に、ゲル部材３６に取り付けられたままにしておくように設計される。支持フレーム３０は、ゲルの形状を保つため、かつゲル部材に覆われていないアクセス可能な把持部を設けてゲル部材３６の取り扱いを容易にするために、適切な剛性を有する材料で形成される。裏打ちフィルム４０の部分２１０ｃの除去後に、ゲル部材３６の分離ゾーンの下面は、分離ゾーンウィンドウ１６０を介してアクセス可能になる。

支持フレーム３０は、支持フレーム３０の位置合わせ用の位置基準を画定する、所定の位置合わせ構造を有する、位置合わせタグ１８０をさらに備える。開示されている実施形態では、２つの位置合わせ穴１９０ａおよび１９０ｂの形状の位置合わせ構造は、電気泳動装置等において、カセット１０および／または支持フレーム３０の、２本のピンを備える等の相補的な位置合わせ構造に対する適切な位置合わせを確実にするために配置される。また、支持フレーム３０は、カセット１０から除去された後でもゲル部材３６の固有性を安全な方法で読み取れるようにする、識別コード２００等を適宜備える。識別コード２００は、バーコードのような機械読み取り可能なコード、マトリックスコード等であってもよく、使用者および／または機器に関連情報を提供する。

図３は、例えば、カセットハウジング２０から取り外された、上面にゲル部材３６が取り付けられた支持フレーム３０によって形成される、電気泳動ゲルユニット３５を示す。このようにして形成されたゲル部材３６は、上述したように、上面および下面、ならびに試料分離ゾーンを有するほぼ平坦な部材である。支持フレーム３０は、ゲル部材３６の形状を保つため、かつ取り扱いを容易にするために配置されると同時に、分離ゾーンにほぼ対応する、ゲル部材の上面および下面の両方の部分にアクセスできるように形成される。以下に示すように、いずれかの面にある、ゲル部材３６のアクセス可能な部分は、分離ゾーンよりも大きくてもよいが、分離した試料をゲル部材３６から、例えば免疫ブロットによってブロット膜へ適切に転写できるように、いずれかの面にあるアクセス可能な部分は、これより小さいものであってはならない。

図４は、これを用いて電気泳動実験を行うために、電気泳動カセット１０に適合する電気泳動トレイ３００の概略図を示す。図４では、トレイ３００が、別の機構として開示されるが、これは都合よく電気泳動装置の一体部分にすることができ、かついくつかの構成部品からなっているか、または２つ以上の電気泳動実験を並行して行うための２つ以上のカセット位置を有していてもよい。トレイ３００は、電気泳動中に、電気泳動カセット１０の少なくとも分離ゾーンを支持するためのカセット支持面３１０を有する。カセット支持面３１０は、一対のバッファパッドホルダ３２０ａおよび３２０ｂのそれぞれで挟まれ、そのそれぞれが、電気泳動カセット１０の背面で、バッファパッド３２２をバッファ結合部分に対する噛み合い位置に保持するように配置される。一実施形態によれば、トレイ３００は、電気泳動カセット１０の背面の部分に伝熱接触することによって、電気泳動中に電気泳動カセット１０の温度を制御するためにカセット支持面３１０に結合された、伝熱ユニット（図示せず）を備える。開示されている実施形態では、トレイ３００は、２つの個別の凹所として形成された２つのバッファパッドホルダ３２０ａおよび３２０ｂと、トレイ上でカセット１０の適切な向きを確保するために、支持フレーム３０の位置合わせタグ１８０と相補的に形成された位置合わせ構造３３０とを有する、平坦な上面を備える。開示されている実施形態では、位置合わせ構造３３０は、細長いピン３４０ａ、円形のピン３４０ｂ、および任意選択の壁部材３４５からなる。断面形状の異なるピン３４０ａおよび３４０ｂを作ることによって、位置合わせ構造が非対称になり、位置合わせタグ１８０およびカセット１０が、確実に適切な向きになる。カセット１０がトレイ３００に適切に配置されると、支持フレーム３０のバッファスリット１５０ａおよび１５０ｂが、（裏打ちフィルム４０の個別の除去可能部分２１０ａおよび２１０ｂが除去されて）バッファスリット１５０ａおよび１５０ｂを介して露出されたゲルと、図５ａおよび図５ｂに概略的に示されているバッファパッド３２２との間の噛み合い接触を可能にするために、それぞれのバッファコンパートメント３２０ａおよび３２０ｂに配置され、バッファパッド３２２は、図６ａ、図６ｂ、および図６ｃに示されているように、それぞれのバッファパッドホルダ３２０ａおよび３２０ｂに置かれる。

一実施形態によれば、図５ａおよび図５ｂに概略的に開示されているバッファパッド３２２は、バッファストリップ３２４、および電極装置３２５を収容するカップ３２３を備える。図５ｂは、図５ａの断面図である。カップは、電極装置３２５を電気泳動装置の電源に接続するための、外部電気コネクタ３２６をさらに備える。したがって、トレイ３００は、相補的な電気コネクタ（図示せず）を備える。カップ３２３は、バッファパッドホルダ３２０ａおよび３２０ｂに嵌合するように形成され、その結果、バッファストリップ３２４の上部は、トレイ３００に置かれたカセットのゲルに接触させておくことができる。バッファストリップ３２４は、例えば、国際公開第８７／００４９４８号パンフレットに開示されている種類のゲル材に組み込まれるバッファ物質からなっていてもよい。バッファストリップ３２４をカップ３２３に置くことによって、複数回の電気泳動の実施の合間にバッファ媒体を変更することが、例えばゲルストリップを直接バッファ凹所に置く場合に比べて非常に容易になる。図５ｂに開示されているように、ゲルストリップ３２４は、カセット１０内のゲルに接触するのを容易にするための凸部を伴って形成されてもよい。

図６ｂおよび図６ｃは、トレイ３００、およびバッファパッド３２２が内部に置かれた、バッファパッドホルダ３２０ａの概略側面図を示し、電気泳動カセット１０は、トレイ３００に連結するために、所定の位置でトレイ３００のカセット支持面３１０の少し上方に持ち上げられている。電気泳動の背面で、バッファパッドとバッファ結合部との間に適切な噛み合い接触を確保するために、バッファパッドとバッファ結合部との噛み合いは、ある程度付勢されてもよい。これは、例えば水がパッドからゲルに物質移動できることによって、バッファパッド３２２が収縮するいくつかのゲル／パッドの組成については、特に重要な場合がある。ゲルに対してバッファパッド３２２を付勢することによって、このような状況を達成することができる。バッファパッド３２２のゲル構成要素に適切な材料特性を選択することによって、これは、付勢された噛み合いを少なくとも部分的にもたらし得る、適切な弾性材からなることができる。一実施形態では、付勢された噛み合いは、その形状によってある程度の圧縮が可能な、特定の形状のバッファストリップを設けることによって達成することができる。図６ｂおよび図６ｃで開示されている実施形態では、バッファストリップの材料特性とこの形状とを組み合わせて、図６ｃに開示されているような付勢された噛み合いをもたらすために、ばね部品３２７がバッファパッドホルダ３２０ａに導入されている。

図７〜図９は、電気泳動カセット１０、および適合する電気泳動装置３５０を用いた、電気泳動分離実験の実施に含まれる手順を概略的に示す。いくつかの手順の個別の順番は、異なる場合がある。

・バッファパッド３２２が、トレイ３００のバッファパッドホルダ３２０ａおよび３２０ｂに置かれる。（図６ａ）
・裏打ちフィルム４０の除去可能部分２１０ａおよび２１０ｂが、剥離タブ２１１ａおよび２１１ｂをそれぞれ引っ張ることによってカセット１０から除去され、支持フレーム３０のバッファスリット１５０ａおよび１５０ｂをそれぞれ介して、ゲル部材３６が露出する（図７）。

・試料ウェルカバー５０が、試料ウェル１１０を露出させるために除去される（図７）。

・カセット１０が、相補的な位置合わせ構造３３０に配置された、支持フレーム３０の位置合わせタグ１８０を用いてトレイ３００に配置され、その結果、トレイ３００で、カセット１０の適切な向きが確保される（図８）。

・試料が、ピペット３６０等によって、試料ウェル１１０の中にロードされる（図９）。

・電気泳動装置３５０を用いて、電気泳動プロセスが行われる（図９）。

図９では、概略的に開示されている電気泳動装置３５０は、電気泳動トレイ３００を保持するトレイローディング機構３７０を備える。一実施形態によれば、電気泳動装置３５０は、装置内で直接、分離の結果を画像化するための蛍光画像化ユニット（図示せず）を備える。このような方法で、電気泳動カセット１０は、分離後に別の画像化ユニットに移動させる必要がない。上述したように、開示されているカセットは、適切な材料の選択、およびカセットの部品によって放射される蛍光や画像の歪み等の望ましくない光学効果を回避する設計によって、画像化用に設計することができる。カセット１０、およびトレイに凹設されたバッファパッド３２２を有する、電気泳動トレイ３００の開示されている実施形態の１つの利点は、電気泳動の構成が薄型になることによって、画像化ユニットをゲルの近くで動作させることができ、感度および解像度が増し、光学効果のマイナスの影響が回避されることである。開示されている実施形態では、電気泳動トレイ３００は、その上に配置されたゲルカセット１０と共に、ほぼ水平な位置で示されている。しかしながら、電気泳動トレイ３００ならびにゲルカセット１０は、垂直または逆さま等、他の向きで使用するために配置されてもよいことに留意すべきである。

電気泳動分離プロセスでは、事前標識された試料が用いられるときは、標識される試料の標識化プロセスを確実に効率の良いものにするために、多くの場合、Ｃｙ色素等の大量の標識化合物を用いることが望ましい。本発明者は、分離する試料成分の前に移動することのない、過剰な標識がわずか１パーセント以下であっても、過剰な標識は、試料成分が分離された「バンド」として存在している、分離ゾーンを変色させることを観察した。特に、小さいタンパク質等の、サイズの小さい試料成分の少量の試料を処理しているときに、過剰な標識は、ゲル部材の分離ゾーンの一部でこのような試料からのシグナルを隠す場合があり、視覚的な印象が非常に乏しくなる。また、試料の容量が大きくなると、この問題が大きくなる場合がある。さらに、試料の容量が大きい場合、全ての試料成分を試料液からゲル部材へと移動させるために必要な時間枠が延長されるために、試料成分に関連するバンドが広がることもさらに留意されてきた。これは、染色後の試料でも観察されている。

本発明は、試料成分がゲル部材に「ロードされた」段階で電気泳動分離する従来の方法に対し、分離ゲルへの試料成分のローディングを中止する追加のステップを提供することにより、これらの問題に対する解決策を提供し、これにより、過剰な標識が、後の段階でゲル部材にロードされることが防止される。特定の分離パラメータに応じて、所定の時間後にウェルに残っている溶液を除去することにより、分離ゾーンの過剰な標識に関する問題が、ほぼ排除されることが実証されている。さらに、電気泳動分離における妨害物として現れる場合がある「フレーム（ｆｌａｍｅ）」、フック（ｈｏｏｋ）、横すじ（ｓｔｒｅａｋｉｎｇ）のような他の妨害物も、この浄化方法によって大幅に低減される。小さいタンパク質等の、サイズの小さい少量の試料成分の検出を可能にすること以外に、この浄化により、過剰な標識による弊害を受けることなく、より大きい試料容量を適用することも可能になり、これは、試料のタンパク質濃度が低いときに一般的に用いられる方法である。

本発明は、電気泳動分離に関連して用いられ得る、蛍光標識、放射性標識等のほぼあらゆる種類の標識に用いることができ、かつ電気泳動分離技術を用いて分離され得る、あらゆる種類の試料に用いることができる。蛍光標識は、フルオロフォアの化学的に反応性の誘導体を用いて達成される。一般的な反応基は、以下のものを含んでいる。

・ＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣ（フルオレセインおよびローダミンの誘導体）等のイソチオシアネート誘導体。これは、目的の化合物と色素との間にチオウレイド結合を形成する１級アミンに対して反応性である。

・ＮＨＳ−フルオレセイン等のスクシンイミジルエステル。これは、アミド結合を形成するアミノ基に対して反応性である。

・フルオレセイン―５−マレイミド等のマレイミド活性化フルオロフォア。これは、容易にスルフヒドリル基と反応する。スルフヒドリル基は、マレイミドの二重結合に加えられる。

・オリゴヌクレオチド合成における、６−ＦＡＭホスホロアミダイト２等の、保護フルオレセインその他のフルオロフォアを含むいくつかのホスホロアミダイト試薬。［２］は、フルオロフォア標識オリゴヌクレオチドの調製を可能にするヒドロキシ基と反応する。

このような任意の反応性色素の別の分子との反応は、フルオロフォアと標識された分子との間に形成される、安定した共有結合になる。

上述したように、電気泳動のための事前標識化はよく知られている（例えば、１９８６年にオックスフォード大学のＣｌａｒｅｎｄｏｎＰｒｅｓｓより出版されたＡｎｔｈｏｎｙＴ．Ａｎｄｒｅｗｓによる『Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ』を参照）。

国際公報第２０１３／１８０６４２号パンフレットまた、タンパク質の標識化の方法およびキットの一例が、国際公開第２０１１／１４９４１５号パンフレットで提供されており、これは、参照することによってその全体が本願に組み込まれる。

図１０ａ〜図１０ｃは、本開示の一実施形態による、分離ゲル装置４０１、および電気泳動分離の方法のステップを概略的に開示している。分離ゲル装置は、ゲル部材３６、および分離する試料液を受けるための１つ以上の試料ウェル４２０を備え、試料ウェル４２０は、ゲル部材３６と流体接触している。開示されている実施形態では、分離ゲル装置４０１は、電気泳動分離を進めるためにゲル部材に電場を印加するための、第１および第２の電極、ならびにバッファ装置４００および４１０のそれぞれをさらに備える。図１０ａ〜図１０ｃ、ならびに図１３〜１５における、電極ならびにバッファ装置４００および４１０は非常に概略的であり、それぞれが電極４０２およびバッファパッド４０３を備えるが、本発明を限定するものとみなされるべきではない。上述したように、分離プロセス中に、電極は、電極間に電場をもたらすための適切な電源に接続される。図面では、印加される電力は単に＋および−記号で示されるが、極性は、分離するゲルおよび試料の種類に従って変化し得ることに留意するべきである。バッファパッド４０３は、上述したような任意適当な種類であってもよく、ゲル部材の上に配置されることが示されているが、端面、底面、またはそれらの任意の組み合わせ等の任意適当な位置に配置されてもよい。さらに、バッファパッドの１つ以上が、バッファ容器に含まれる液体バッファや吸収性材料等に置き換えられてもよい。開示されている実施形態では、試料ウェル４２０が、ゲル部材３６の上に置かれたカップ形状の機構として概略的に開示されているが、これは、例えば図１〜図９に関連して開示されているように、ゲル部材の凹所として等、任意適当な方法で設けられてもよい。

１つの実施形態によれば、電気泳動分離の方法は、以下のステップを含む。

・分離する試料液を１つ以上の試料ウェルに加えるステップ（図１０ｂ）。

・電気泳動分離プロセスを進めるために、ゲル部材に電場を印加するステップであって、試料成分は、分離するために、（複数の）試料ウェル内の試料液から、ゲル部材へと取り出される（図１０ｂ〜図１０ｃ）。

―試料成分の分離は、分離前部４６０および分離末端４７０によって概略的に示されている。

・除去基準が満たされたときに、試料成分の分離ゲルへのローディングを中断するステップ（図１０ｃ）。

―ローディングの中断は、試料液除去装置４３０による残っている試料液の除去によって、概略的に示されている。

図１０ｃに開示されているように、試料成分のローディングの中断は、１つ以上の試料ウェルから残っている試料液を除去することによって達成できるが、これは、試料成分および／または過剰な標識等がゲル部材３６にロードされるのを十分に制限する、任意適当な方法で行われてもよい。残っている試料液の除去は、残っている試料液を吸引することを含み、これは、図１０ｃ、１１、１２ａ、および１２ｂに開示されているような試料吸引装置によって行うことができる。図１１に開示されている実施形態では、各試料ウェルから残っている試料液を吸引するのに用いられるピペットタイプの装置３６０として吸引装置が開示されており、より高度な実施形態では、ピペットはマルチチップタイプであってもよく、２つ以上の試料ウェルから、好ましくは全部で１０個のウェルから同時に、並行して液体を吸引することができる。

図１２ａおよび図１２ｂに開示されている実施形態では、吸引装置は、電気泳動ゲル装置の１つ以上の試料ウェルから残っている試料液を吸引するための１つ以上の吸引タブ４３１を含む、試料液除去装置４３０として開示されている。一実施形態によれば、吸引タブ４３１は、吸収材からなっているが、代替的な実施形態では、細管式等であってもよい。一実施形態では、試料液除去装置４３０は、吸引タブ４３１が形成された、吸収材のシートからなる。図１２ｂに開示されているタイプ等の、複数の試料ウェルを有する電気泳動カセットに対して、試料液除去装置４３０は、適切には、カセット１０のウェルの配列に合わせた吸引タブ４３１を備えている。一実施形態では、濾紙等のシートは、カセット１０のウェルの中に嵌合するコームの形に切断される。

あるいは、残りの試料液を除去するステップは、例えば、図１３に示すような注射器の先端の形状の試料排出装置４４０を介して、残りの試料液を排出することによって行われる。

図１４ａおよび図１４ｂに概略的に示されている一実施形態によれば、試料成分のローディングを中断するステップは、分離末端４７０がゲル部材にロードされたときに、電気的接触の位置を移動させることによって、電場から（複数の）試料ウェルを除外するステップを含む。開示されているように、これは、分離方向に対して試料ウェルの下流に位置する追加の電極およびバッファ装置４５０を設けることによって、かつ試料の全ての関連成分が、追加の電極４５０を通り過ぎたときに、追加の電極装置４５０のスイッチを入れることによって達成することができる。したがって、その後の分離は、追加の電極４５０と第２の電極４１０との間の電場に基づいて行われ、試料ウェルからそれ以上試料成分がロードされることはない。

図１５ａおよび図１５ｂに概略的に示されている一実施形態によれば、試料成分のローディングを中断するステップは、試料シャッターによって、（複数の）試料ウェルを機械的に切り離すステップを含む。

一実施形態によれば、除去基準は、所定の分離時間として選択される。所定の時間は、用いられる特定の電気泳動構成のパラメータの範囲、電力、試料、温度等に大きく依存して選択される。図１〜図９に開示されているようなカセットベースのシステムの場合は、試料成分のローディングを中断する前の分離時間は、１分から数十分、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０分かまたはそれ以上の範囲であってもよいことが判明している。

一実施形態によれば、本発明の方法は、標識された試料の光検出によって、ゲル部材への試料のローディングの進行を監視するステップを含み、除去基準は、光検出に基づいて決定される。この実施形態では、除去基準は、光検出された所定のローディング率として決定することができる。

一実施形態によれば、ローディング率は、以下のステップによって決定される。

・電気泳動分離プロセスの開始時に、試料ウェルの合計標識強度を測定するステップ。

・電気泳動分離プロセス中に、試料ウェルの標識強度を登録するか、または電気泳動分離プロセス中に、（複数の）試料ウェルの試料液からゲル部材へと取り出された試料成分から、標識強度を登録するステップ。

・上述の強度からローディング率を計算するステップ。

別の実施形態によれば、除去基準は、標識された試料の位置、例えば分離前部４６０および末端４７０の光検出に基づいて決定され、試料成分のローディングを中断するステップは、例えば、分離前部４６０が所定の位置に達したとき等に開始されてもよい。

電気泳動分離を行うのに用いるシステムに応じて、電場は、試料のローディングを中断するステップの間は中断することができる。

一実施形態によれば、本発明による電気泳動分離を行う自動化された電気泳動システムが提供され、このシステムは、除去基準が満たされたときに、試料成分の分離ゲルへのローディングを中断するように構成される。これを提供するために、このシステムは、電気泳動プロセスを停止して、残っている試料を試料ウェルから除去することを使用者に促すように構成することができる。

電気泳動は５分後に停止されて、約５秒間、コームがウェルの中に配置され、その後、コームが除去されて電気泳動が再開した。この手順により、ゲルの下側３分の１のＣｙ色素のバックグラウンドについての問題が、タンパク質シグナルを減少させることなく完全に排除される。

図１６は、１６個の試料ウェルの試料を分離させた後の、電気泳動ゲル部材の画像を開示する（各試料ウェルの試料成分は、個別の「レーン」に沿って分離される）。開示されている実験では、電源は１０分後に中断され、電源が再びオンになる前に、残っている試料液をウェル１〜８から除去するために試料液除去装置が用いられ、電気泳動分離が完了した。図１６から、本発明の効果は明白である。

図１７は、異なるコントラストレベルで行った試料の画像モンタージュを示し、右側の画像は、５分後に、残っている試料液をウェルから除去した後の改善された結果を示す。

１０電気泳動カセット（ゲルカセット）
２０カセットハウジング
３０ゲル支持フレーム
３５電気泳動ゲルユニット
３６ゲル部材
４０裏打ちフィルム
５０試料ウェルカバー
５２ウェル形成突起
６０上壁
６５上面
６６下面
７０縁
７５内壁
８０底面
１００過剰充填チャンバ
１１０試料ウェル開口
１５０ａ、１５０ｂバッファスリット
１６０分離ゾーンウィンドウ
１８０位置合わせタグ
１９０ａ、１９０ｂ位置合わせ穴
２００識別コード
２１０ａ、２１０ｂ、２１０ｃ除去可能部分
２１１ａ、２１１ｂ、２１１ｃ剥離タブ
３００電気泳動トレイ
３１０カセット支持面
３２０ａ、３２０ｂバッファパッドホルダ
３２２、４０３バッファパッド
３２３カップ
３２４バッファストリップ
３２５電極装置
３２６外部電気コネクタ
３２７ばね部品
３３０位置合わせ構造
３４０ａ、３４０ｂピン
３４５壁部材
３５０電気泳動装置
３６０ピペット、ピペットタイプの装置
３７０トレイローディング機構
４００バッファ装置
４０１分離ゲル装置
４０２電極
４１０バッファ装置（第２の電極）
４２０試料ウェル
４３０試料液除去装置（吸引装置）
４３１吸引タブ
４４０試料排出装置
４５０追加の電極装置（バッファ装置）
４６０分離前部
４７０分離末端

Claims

ゲル部材（３６）、および分離する試料液を受けるための１つ以上の試料ウェル（４２０）を有する分離ゲル装置（４０１）を用いる、電気泳動分離方法であって、前記試料ウェル（４２０）は、前記ゲル部材（３６）と流体接触し、
分離する試料液を１つ以上の前記試料ウェル（４２０）に加えるステップと、
電気泳動分離プロセスを進めるために、前記ゲル部材（３６）に電場を印加するステップであって、試料成分は、分離のために前記（複数の）試料ウェル（４２０）の前記試料液から前記ゲル部材（３６）の中に取り出される、電場を印加するステップと、
除去基準を満たすときは、前記試料成分の前記分離ゲルへのローディングを中断するステップとを含む、方法。
前記試料成分のローディングを中断するステップが、残っている前記試料液を前記１つ以上の試料ウェル（４２０）から除去するステップを含む、請求項１に記載の方法。
前記残っている試料液を除去する前記ステップが、試料吸引装置（４３０）によって前記残っている試料液を吸引することを含む、請求項２に記載の方法。
前記残っている試料液を除去するステップが、試料排出装置（４４０）を介して前記残っている試料液を排出するステップを含む、請求項２に記載の方法。
前記試料成分のローディングを中断するステップが、電気的接触の位置を移動させることによって、前記電場から前記（複数の）試料ウェル（４２０）を除外することを含む、請求項１に記載の方法。
前記試料成分のローディングを中断するステップが、試料シャッターによって、前記（複数の）試料ウェル（４２０）を機械的に切り離すことを含む、請求項１に記載の方法。
除去基準が、所定の分離時間として選択される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
前記時間が、試料の種類、分離ゲルの種類、印加される電場のうちの１つ以上によって規定される、請求項７に記載の方法。
前記試料成分の少なくとも１つが事前標識されることによって、前記試料が、少なくとも１つの標識を含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
前記標識が、蛍光標識または放射性標識である、請求項９に記載の方法。
前記標識された試料の光検出によって、前記試料のローディングの進行を監視するステップを含み、前記除去基準が、前記光検出に基づいて決定される、請求項９または１０に記載の方法。
前記除去基準が、光学的に検出された所定のローディング率として決定される、請求項１１に記載の方法。
前記ローディング率が、
前記電気泳動分離プロセスの開始時に、前記試料ウェル（４２０）の合計標識強度を測定するステップと、
前記電気泳動分離プロセス中に、前記試料ウェル（４２０）の前記標識強度を登録するステップ、または前記電気泳動分離プロセス中に、前記（複数の）試料ウェル（４２０）の前記試料液から、前記ゲル部材（３６）の中に取り出された前記試料成分から、前記標識強度を登録するステップと、
前記強度から前記ローディング率を計算するステップとによって決定される、請求項１２に記載の方法。
前記除去基準が、前記標識された試料の位置の前記光検出に基づいて決定される、請求項１１に記載の方法。
前記電場が、前記試料のローディングを中断するステップ中は中断される、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
請求項１に記載の方法によって、除去基準が満たされたときに、前記分離ゲルへの前記試料成分のローディングを中断するように構成される、自動化された電気泳動システム。
電気泳動プロセスを停止して、残っている試料を試料ウェル（４２０）から除去することを使用者に促すように構成された、請求項１６に記載の自動化された電気泳動システム。
電気泳動ゲル装置の前記１つ以上の試料ウェル（４２０）から残っている試料液を吸引するための１つ以上の吸引タブ（４３１）を含む、試料液除去装置（４３０）。
前記吸引タブ（４３１）が、吸収材からなる、請求項１８に記載の装置（４３０）。
前記吸収材のシートからなり、前記吸引タブ（４３１）が形成されている、請求項１９に記載の装置（４３０）。