JP2017503494A - 昆虫の一過性受容体電位v(trpv)チャネルの調節因子を決定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、2013年12月23日に出願された米国仮特許出願第61/920,201号の合衆国法典第35巻第119条(e)による出願日の利益を主張する。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、参照により全体として本明細書に組み込まれる。このASCIIコピーは、2014年12月18日に作製され、13783-119_SL.txtと名称が付けられ、大きさは633,858バイトである。
I.一般的考察
一過性受容体電位(TRP)チャネルは、細胞の恒常性の調節に関与する大規模かつ重要なクラスのチャネルを構成する。本発明は、少なくとも1つのTRPファミリーメンバー、すなわち、昆虫におけるTRPVチャネルを調節する方法及び組成物を提供する。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の方法、装置及び材料は、本開示の主題の実施又は試験において使用可能であるが、代表的な方法、デバイス、及び材料をここに記載する。
本発明者らは、昆虫TRPVチャネルが、昆虫の摂食行動をブロックし、したがって、殺虫剤として有用である化合物を同定するために使用され得ることを発見した。このように、一実施形態において、本発明は、候補化合物が昆虫TRPVチャネルの調節因子であるか否かを決定するための方法に関する。本方法は、昆虫TRPVチャネルを発現する第1の細胞を用意し、第1の細胞を候補化合物と接触させ、及び昆虫TRPVチャネルの調節についてアッセイすることを含み、ここで、昆虫TRPVチャネルの調節は、昆虫TRPVチャネルの調節因子として候補化合物を特定する。TRPVチャネルの調節は、当業者に周知である従来のインビトロ法及びインビボ法を用いてアッセイされてもよい。例えば、特定の実施形態において、アッセイするステップは、(1)候補化合物に応答して第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を検出するステップ、又は(2)候補化合物に応答して第1の細胞における膜電位を検出するステップ、(3)候補化合物の不存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を比較するステップ、(4)候補化合物の不存在下での第1の細胞における膜電位と、候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位を比較するステップ、(5)候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、TPRVチャネルの調節を示さないカルシウムイオン動員の参照レベルを比較するステップ、及び/又は(6)候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位と、TPRVチャネルの調節を示さない膜電位の参照レベルを比較するステップを含んでもよい。例えば、カルシウムフラックスは、Ca2+の取り込みの評価により、又はFura-2などの蛍光色素若しくはGFPなどの蛍光タンパク質を用いて測定することができる。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されているスクリーニングアッセイにより選択された化合物を提供する。本明細書に記載されているスクリーニングアッセイにより選択された化合物の類似体、誘導体、異性体、及び医薬として許容される塩並びに選択された化合物を含む製剤はまた、本明細書に含まれることを理解するべきである。
特定の実施形態において、本発明は、昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子を含む発現ベクターに関する。
アデノビリオンは、本発明のアデノウイルス発現ベクターを含み、以下の方法を用いて産生することができる。
本発明はまた、本明細書に記載されている発現ベクター又はシステムを含む細胞に関する。
I.試験化合物
ルテニウムレッドをCalbiochemから購入した。ピメトロジンとGSK10116790AをSigma(St. Lois、MO)から購入し、ピリフルキナゾンをChemService Inc.、(West Chester、 PA)、ピリフルキナゾン代謝物BをWako Pure Chemical Industries, LTD (Richmond、VA)から購入した。
本発明の構築物を生成するために、ショウジョウバエNanchungタンパク質(NCBI NM_001274904.1、配列番号2)及びInactiveタンパク質(NCBI NM_132125.1、配列番号28)をコードする相補性DNA(cDNA)をLife Technologies(Grand Island、NY)により合成し、NanchungとInactiveの両方のC末端でFLAG抗体タグ(DYKDDDDK、配列番号107)をコードする配列を加えた。
タグ化されたNanchung、Inactive及びTRPV4発現構築物を含有するpENTCMV1-TetOベクターは、LR Clonase II(Life Technologies、Grand Island、NY)で処理され、残りのアデノウイルスゲノムを含有するpAdREPプラスミド(Welgenによって提供されている)にライゲートされた。
昆虫及びマウスのTRPVチャネル活性における試験化合物の効果は、タグ化されたNan、Iav又はmTRPV4タンパク質を発現するアデノウイルスを用いて形質導入されたハムスターCHO-K1細胞(ATCC番号1 CCL-61)で試験された。細胞あたり指示量のウイルス粒子を用いて細胞を形質導入し、100μlの培地中、40,000細胞/ウェル密度で、ポリ-D-リジン被覆された96ウェルプレート(Greiner Bio-One、Frickenhausen、Germany)上に播種した。細胞を37℃で一晩維持し、続いて、3日間、25℃で維持した。播種後、2日目に培地を交換した。
CA)を用いて測定された。
アデノウイルスを形質導入された細胞を35mmディッシュに播種した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル(Sigma Aldrich)及びTurboDNAse(Ambion)を補足した300μlのNuPAGE LDS試料緩衝液(Life Technologies)に溶解した。NuPaGe 4〜12% Bis-Tris Pre-Castゲルシステム(Life Technologies、Grand Island、NY)を用いて試料を電気泳動し、ニトロセルロースフィルターに移動させた。AcGFP部分(Clontech、Mountain View、CA)に対する抗体を用いてTRPタンパク質を検出し、ブロットをECL試薬(Thermo Scientific)を用いて発色させた。
昆虫TRPVチャネルが、昆虫の摂食ブロッキング化合物の直接的な標的であるという仮説を試験するために、CHO-K1細胞株においてTRPVチャネルタンパク質、Nan及びIavサブユニットを単独で、又は図1に示されるように、AcGFPと、カルボキシ末端上の2つのFLAG抗体エピトープタグを含有する融合タンパク質として組み合わせて発現させた。
Nan及びIavの最適な化学量論を画定するために、Nan:Iavアデノウイルス(1:0、3:1、1:1、1:3、0:1)の比率を4つの異なる感染率、すなわち、細胞あたりのウイルス粒子(VP)レベル(2,000VP/細胞、4,000VP/細胞、8,000VP/細胞、及び16,000VP/細胞)で変化させた。
証拠となるいくつかの系統は、試験化合物が細胞表面上の昆虫TRPVチャネルを活性化することを示す。第一に、ピリフルキナゾンに対する細胞の応答は、細胞外媒体中のCa2+の存在に完全に依存していた(図4A)。
観察された応答の選択性を確認するために、ピメトロジンとピリフルキナゾンの代謝物Bの両方をTRPV4チャネルに対して試験した。このTRPV4は、IavとNanの近縁の哺乳動物のホモログである。TRPV4は、GSK1016790A(Thorneloeら、2008)などのいくつかのアゴニストにより活性化され得る。
より厳密にアッセイの選択性を試験するために、公知の分子標的を含む、表2において提供された19個の薬理活性化合物を試験のために選んだ。
以下、本発明の実施形態を示す。
(1)候補化合物が昆虫の一過性受容体電位V(TRPV)チャネルの調節因子であるか否かを決定するための方法であって、
(a)昆虫TRPVチャネルを発現している第1の細胞を用意するステップ、
(b)第1の細胞を候補化合物と接触させるステップ、及び
(c)昆虫TRPVチャネルの調節についてアッセイするステップであり、ここで、該調節が、昆虫TRPVチャネルの調節因子として候補化合物を特定するステップ
を含む、前記方法。
(2)アッセイするステップが、以下の:
(1)候補化合物に応答して第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を検出するステップ、又は
(2)候補化合物に応答して第1の細胞における膜電位を検出するステップ
のうちの少なくとも1つを含む、(1)に記載の方法。
(3)アッセイをするステップが、以下の:
(1)候補化合物の不存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を比較するステップ、又は
(2)候補化合物の不存在下での第1の細胞における膜電位と、候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位を比較するステップ
のうちの少なくとも1つを含む、(1)に記載の方法。
(4)アッセイをするステップが、以下の:
(1)候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、TPRVチャネルの調節を示さないカルシウムイオン動員の参照レベルを比較するステップ、又は
(2)候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位と、TPRVチャネルの調節を示さない膜電位の参照レベルを比較するステップ
のうちの少なくとも1つを含む、(1)に記載の方法。
(5)候補化合物が、第1の細胞におけるカルシウムイオン動員又は膜電位を、参照レベルと比較して少なくとも20%調節する、(4)に記載の方法。
(6)候補化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性を阻害する調節因子である、(1)〜(5)のいずれか1に記載の方法。
(7)候補化合物が、昆虫TRPVチャネルを活性化する調節因子である、(1)〜(5)のいずれか1に記載の方法。
(8)候補化合物が、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子である、(1)〜(5)のいずれか1に記載の方法。
(9)第1の細胞が、昆虫のNanchungタンパク質とInactiveタンパク質を共発現する、(1)〜(8)のいずれか1に記載の方法。
(10)第1の細胞において共発現されるNanchungタンパク質とInactiveタンパク質の比率が約1:1である、(9)に記載の方法。
(11)候補化合物が、有機小分子、無機小分子、多糖、ペプチド、タンパク質、核酸、生体材料から作製された抽出物、及びこれらの任意の組合せから成る群から選択される、(1)〜(10)のいずれか1に記載の方法。
(12)(a)哺乳動物TRPVチャネルを発現する第2の細胞を用意するステップ、
(b)前記第2の細胞を候補化合物と接触させるステップ、
(c)哺乳動物TRPVチャネルの調節についてアッセイするステップ、
(d)昆虫TRPVチャネルの調節と、哺乳動物TRPVチャネルの調節を比較するステップ
を更に含み、ここで、哺乳動物TRPVチャネルと比較して、昆虫TRPVチャネルの調節の増加は、昆虫TRPVチャネルの選択的調節因子として候補化合物を特定する、(1)〜(11)のいずれか1に記載の方法。
(13)候補化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性を、哺乳動物TRPVチャネルと比較して少なくとも10%調節する、(12)に記載の方法。
(14)昆虫が、農業有害生物/園芸有害生物又は病害媒体物又は寄生虫である、(1)〜(13)のいずれか1に記載の方法。
(15)農業有害生物が、アブラムシ(マメクロアブラムシ、ワタアブラムシ、リンゴアブラムシ、ジャガイモヒゲナガアブラムシ、ダイコンアブラムシ、ジサフィス・プランタギネア、チューリップヒゲナガアブラムシ、チューリップヒゲナガアブラムシ、イバラヒゲナガアブラムシ、モモアカアブラムシ、レタスヒゲナガアブラムシを含む);コナジラミ類(アレウロデス属の種、ベミシア属の種、ジアレウロデス属の種、トリアレウロデス属の種を含む);ウンカ類(ヒメトビウンカ、トビイロウンカ、シファンタ属の種、セジロウンカを含む);ヨコバイ類(アムラスカ属の種、エンポアスカ属の種を含む);カイガラムシ類(アスピディオトゥス属の種、アカホシマルカイガラムシ、ワタフキカイガラムシ、ニセヤノネカイガラムシを含む);コナカイガラムシ類(マコネリコッカス属の種、パラコッカス属の種、プラノコッカス属の種を含む);花粉甲虫(カルポフィルス属の種、メリゲテス属の種を含む);アザミウマ類(カリオトリプス属の種、フランクリニエラ属の種、シルトスリップス属の種、スリップス属の種を含む);及びキジラミ類(バクテリセラ属の種、カコプシラ属の種、ミカンキジラミ、パラトリオザ・コケレリを含む)から成る群から選択される、(14)に記載の方法。
(16)(1)〜(15)のいずれか1に記載の方法によって選択される化合物。
(17)前記化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性を阻害する調節因子である、(15)に記載の化合物。
(18)前記化合物が、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子である、(16)又は(17)に記載の化合物。
(19)(1)〜(15)のいずれか1に記載の方法によって選択される化合物又は(16)〜(18)のいずれか1に記載の化合物を昆虫に適用することを含む昆虫を防除する方法。
(20)前記化合物が、昆虫TRPVチャネルの阻害剤である、(19)に記載の方法。
(21)前記化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性化因子である、(19)に記載の方法。
(22)昆虫が、農業有害生物/園芸有害生物又は病害媒体物又は寄生虫である、(19)〜(21)のいずれか1に記載の方法。
(23)農業有害生物が、アブラムシ(マメクロアブラムシ、ワタアブラムシ、リンゴアブラムシ、ジャガイモヒゲナガアブラムシ、ダイコンアブラムシ、ジサフィス・プランタギネア、チューリップヒゲナガアブラムシ、チューリップヒゲナガアブラムシ、イバラヒゲナガアブラムシ、モモアカアブラムシ、レタスヒゲナガアブラムシを含む);コナジラミ(アレウロデス属の種、ベミシア属の種、ジアレウロデス属の種、トリアレウロデス属の種を含む);ウンカ(ヒメトビウンカ、トビイロウンカ、シファンタ属の種、セジロウンカを含む);ヨコバイ(アムラスカ属の種、エンポアスカ属の種を含む);カイガラムシ(アスピディオトゥス属の種、アカホシマルカイガラムシ、ワタフキカイガラムシ、ニセヤノネカイガラムシを含む);コナカイガラムシ(マコネリコッカス属の種、パラコッカス属の種、プラノコッカス属の種を含む);花粉甲虫(カルポフィルス属の種、メリゲテス属の種を含む);アザミウマ(カリオトリプス属の種、フランクリニエラ属の種、シルトスリップス属の種、スリップス属の種を含む);及びキジラミ(バクテリセラ属の種、カコプシラ属の種、ミカンキジラミ、パラトリオザ・コケレリを含む)から成る群から選択される、(22)に記載の方法。
(24)昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子を含む発現ベクター。
(25)(a)Nanchungタンパク質をコードする第1の核酸分子を含む第1の発現ベクター、及び
(b)Inactiveタンパク質をコードする第2の核酸分子を含む第2の発現ベクター
を含む発現ベクターシステム。
(26)細胞内で共発現されると、昆虫TRPVチャネルが形成される、(25)に記載の発現ベクターシステム。
(27)第1及び第2の発現ベクターが調整可能なプロモーターシステムを更に含む、(25)又は(26)に記載の発現ベクターシステム。
(28)調整可能なプロモーターシステムが、少なくとも1つのTetリプレッサー結合部位を含む、(27)に記載の発現ベクターシステム。
(29)調整可能なプロモーターが、昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーターである、(27)又は(28)に記載の発現ベクターシステム。
(30)プロモーターシステムが、テトラサイクリン又はドキシサイクリンによって調整可能である、(27)〜(29)のいずれか1に記載の発現ベクターシステム。
(31)アデノウイルスのコア起点を更に含む、(24)〜(30)のいずれか1に記載の発現ベクターシステム。
(32)第1の核酸分子が、配列番号3の核酸配列を含む、(25)〜(31)のいずれか1に記載の発現ベクターシステム。
(33)第2の核酸分子が、配列番号28の核酸配列を含む、(25)〜(31)のいずれか1に記載の発現ベクターシステム。
(34)Nanchungタンパク質をコードする第1の核酸分子及びInactiveタンパク質をコードする第2の核酸分子を含む発現ベクター。
(35)細胞内での発現により、昆虫TRPVチャネルが形成される、(34)に記載の発現ベクター。
(36)調整可能なプロモーターシステムを更に含む、(34)又は(35)に記載の発現ベクター。
(37)調整可能なプロモーターシステムが、少なくとも1つのTetリプレッサー結合部位を含む、(36)に記載の発現ベクター。
(38)調整可能なプロモーターが、昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーターである、(36)又は(37)に記載の発現ベクター。
(39)プロモーターシステムが、テトラサイクリン又はドキシサイクリンによって調整可能である、(36)〜(38)のいずれか1に記載の発現ベクター。
(40)アデノウイルスのコア起点を更に含む、(32)〜(39)のいずれか1に記載の発現ベクター。
(41)(a)TRPVチャネルのNanchungタンパク質をコードする配列番号2を有する第1の核酸を含む第1の発現ベクター、
(b)TRPVチャネルのInactiveタンパク質をコードする配列番号28を有する第2の核酸を含む第2の発現ベクター
を含み、ここで、第1及び第2の発現ベクターは、
(c)アデノウイルスのコア起点、
(d)蛍光タンパク質をコードする第3の核酸、
(e)エピトープタグをコードする核酸、
(f)(1)Tetリプレッサー結合部位、
(2)TRPVチャネルのコード領域に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーター
を含む調整可能なプロモーターシステム
を更に含み、ここで、第1及び第2の発現ベクターは、哺乳動物の発現用に最適化されている、発現ベクターシステム。
(42)(a)アデノウイルスのコア起点、
(b)(1)TRPVチャネルのNanchungタンパク質をコードする配列番号2を有する第1の核酸、
(2)TRPVチャネルのInactiveタンパク質をコードする配列番号28を有する第2の核酸
を含む一過性受容体電位V(TRPV)チャネルコード領域、
(c)蛍光タンパク質をコードする第3の核酸、
d)エピトープタグをコードする核酸、
(d)(1)Tetリプレッサー結合部位、
(2)TRPVチャネルのコード領域に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーター
を含む調整可能なプロモーターシステム
を含み、ここで発現ベクターは、哺乳動物の発現用に最適化されている、発現ベクター。
(43)(24)〜(42)のいずれか1に記載の発現ベクターを含む細胞。
(44)Nanchungタンパク質とInactiveタンパク質が細胞において共発現される、(43)に記載の細胞。
(45)通常、Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質を発現しない任意の細胞を含む、(43)又は(44)に記載の細胞。
(46)細胞が、昆虫細胞、カエル(アフリカツメガエル)卵母細胞、マウス細胞、ハムスター細胞又はヒト細胞である、(43)〜(45)のいずれか1に記載の細胞。
(47)細胞が、約1:1の比率でNanchungタンパク質とInactiveタンパク質を共発現する、(43)〜(46)のいずれか1に記載の細胞。
Claims (47)
- 候補化合物が昆虫の一過性受容体電位V(TRPV)チャネルの調節因子であるか否かを決定するための方法であって、
(a)昆虫TRPVチャネルを発現している第1の細胞を用意するステップ、
(b)第1の細胞を候補化合物と接触させるステップ、及び
(c)昆虫TRPVチャネルの調節についてアッセイするステップであり、ここで、該調節が、昆虫TRPVチャネルの調節因子として候補化合物を特定するステップ
を含む、前記方法。 - アッセイするステップが、以下の:
(1)候補化合物に応答して第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を検出するステップ、又は
(2)候補化合物に応答して第1の細胞における膜電位を検出するステップ
のうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。 - アッセイをするステップが、以下の:
(1)候補化合物の不存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を比較するステップ、又は
(2)候補化合物の不存在下での第1の細胞における膜電位と、候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位を比較するステップ
のうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。 - アッセイをするステップが、以下の:
(1)候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、TPRVチャネルの調節を示さないカルシウムイオン動員の参照レベルを比較するステップ、又は
(2)候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位と、TPRVチャネルの調節を示さない膜電位の参照レベルを比較するステップ
のうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。 - 候補化合物が、第1の細胞におけるカルシウムイオン動員又は膜電位を、参照レベルと比較して少なくとも20%調節する、請求項4に記載の方法。
- 候補化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性を阻害する調節因子である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 候補化合物が、昆虫TRPVチャネルを活性化する調節因子である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 候補化合物が、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の細胞が、昆虫のNanchungタンパク質とInactiveタンパク質を共発現する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の細胞において共発現されるNanchungタンパク質とInactiveタンパク質の比率が約1:1である、請求項9に記載の方法。
- 候補化合物が、有機小分子、無機小分子、多糖、ペプチド、タンパク質、核酸、生体材料から作製された抽出物、及びこれらの任意の組合せから成る群から選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- (a)哺乳動物TRPVチャネルを発現する第2の細胞を用意するステップ、
(b)前記第2の細胞を候補化合物と接触させるステップ、
(c)哺乳動物TRPVチャネルの調節についてアッセイするステップ、
(d)昆虫TRPVチャネルの調節と、哺乳動物TRPVチャネルの調節を比較するステップ
を更に含み、ここで、哺乳動物TRPVチャネルと比較して、昆虫TRPVチャネルの調節の増加は、昆虫TRPVチャネルの選択的調節因子として候補化合物を特定する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。 - 候補化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性を、哺乳動物TRPVチャネルと比較して少なくとも10%調節する、請求項12に記載の方法。
- 昆虫が、農業有害生物/園芸有害生物又は病害媒体物又は寄生虫である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 農業有害生物が、アブラムシ(マメクロアブラムシ、ワタアブラムシ、リンゴアブラムシ、ジャガイモヒゲナガアブラムシ、ダイコンアブラムシ、ジサフィス・プランタギネア、チューリップヒゲナガアブラムシ、チューリップヒゲナガアブラムシ、イバラヒゲナガアブラムシ、モモアカアブラムシ、レタスヒゲナガアブラムシを含む);コナジラミ類(アレウロデス属の種、ベミシア属の種、ジアレウロデス属の種、トリアレウロデス属の種を含む);ウンカ類(ヒメトビウンカ、トビイロウンカ、シファンタ属の種、セジロウンカを含む);ヨコバイ類(アムラスカ属の種、エンポアスカ属の種を含む);カイガラムシ類(アスピディオトゥス属の種、アカホシマルカイガラムシ、ワタフキカイガラムシ、ニセヤノネカイガラムシを含む);コナカイガラムシ類(マコネリコッカス属の種、パラコッカス属の種、プラノコッカス属の種を含む);花粉甲虫(カルポフィルス属の種、メリゲテス属の種を含む);アザミウマ類(カリオトリプス属の種、フランクリニエラ属の種、シルトスリップス属の種、スリップス属の種を含む);及びキジラミ類(バクテリセラ属の種、カコプシラ属の種、ミカンキジラミ、パラトリオザ・コケレリを含む)から成る群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法によって選択される化合物。
- 前記化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性を阻害する調節因子である、請求項15に記載の化合物。
- 前記化合物が、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子である、請求項16又は17に記載の化合物。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法によって選択される化合物又は請求項16〜18のいずれか1項に記載の化合物を昆虫に適用することを含む昆虫を防除する方法。
- 前記化合物が、昆虫TRPVチャネルの阻害剤である、請求項19に記載の方法。
- 前記化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性化因子である、請求項19に記載の方法。
- 昆虫が、農業有害生物/園芸有害生物又は病害媒体物又は寄生虫である、請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 農業有害生物が、アブラムシ(マメクロアブラムシ、ワタアブラムシ、リンゴアブラムシ、ジャガイモヒゲナガアブラムシ、ダイコンアブラムシ、ジサフィス・プランタギネア、チューリップヒゲナガアブラムシ、チューリップヒゲナガアブラムシ、イバラヒゲナガアブラムシ、モモアカアブラムシ、レタスヒゲナガアブラムシを含む);コナジラミ(アレウロデス属の種、ベミシア属の種、ジアレウロデス属の種、トリアレウロデス属の種を含む);ウンカ(ヒメトビウンカ、トビイロウンカ、シファンタ属の種、セジロウンカを含む);ヨコバイ(アムラスカ属の種、エンポアスカ属の種を含む);カイガラムシ(アスピディオトゥス属の種、アカホシマルカイガラムシ、ワタフキカイガラムシ、ニセヤノネカイガラムシを含む);コナカイガラムシ(マコネリコッカス属の種、パラコッカス属の種、プラノコッカス属の種を含む);花粉甲虫(カルポフィルス属の種、メリゲテス属の種を含む);アザミウマ(カリオトリプス属の種、フランクリニエラ属の種、シルトスリップス属の種、スリップス属の種を含む);及びキジラミ(バクテリセラ属の種、カコプシラ属の種、ミカンキジラミ、パラトリオザ・コケレリを含む)から成る群から選択される、請求項22に記載の方法。
- 昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子を含む発現ベクター。
- (a)Nanchungタンパク質をコードする第1の核酸分子を含む第1の発現ベクター、及び
(b)Inactiveタンパク質をコードする第2の核酸分子を含む第2の発現ベクター
を含む発現ベクターシステム。 - 細胞内で共発現されると、昆虫TRPVチャネルが形成される、請求項25に記載の発現ベクターシステム。
- 第1及び第2の発現ベクターが調整可能なプロモーターシステムを更に含む、請求項25又は26に記載の発現ベクターシステム。
- 調整可能なプロモーターシステムが、少なくとも1つのTetリプレッサー結合部位を含む、請求項27に記載の発現ベクターシステム。
- 調整可能なプロモーターが、昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項27又は28に記載の発現ベクターシステム。
- プロモーターシステムが、テトラサイクリン又はドキシサイクリンによって調整可能である、請求項27〜29のいずれか1項に記載の発現ベクターシステム。
- アデノウイルスのコア起点を更に含む、請求項24〜30のいずれか1項に記載の発現ベクターシステム。
- 第1の核酸分子が、配列番号3の核酸配列を含む、請求項25〜31のいずれか1項に記載の発現ベクターシステム。
- 第2の核酸分子が、配列番号28の核酸配列を含む、請求項25〜31のいずれか1項に記載の発現ベクターシステム。
- Nanchungタンパク質をコードする第1の核酸分子及びInactiveタンパク質をコードする第2の核酸分子を含む発現ベクター。
- 細胞内での発現により、昆虫TRPVチャネルが形成される、請求項34に記載の発現ベクター。
- 調整可能なプロモーターシステムを更に含む、請求項34又は35に記載の発現ベクター。
- 調整可能なプロモーターシステムが、少なくとも1つのTetリプレッサー結合部位を含む、請求項36に記載の発現ベクター。
- 調整可能なプロモーターが、昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項36又は37に記載の発現ベクター。
- プロモーターシステムが、テトラサイクリン又はドキシサイクリンによって調整可能である、請求項36〜38のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- アデノウイルスのコア起点を更に含む、請求項32〜39のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- (a)TRPVチャネルのNanchungタンパク質をコードする配列番号2を有する第1の核酸を含む第1の発現ベクター、
(b)TRPVチャネルのInactiveタンパク質をコードする配列番号28を有する第2の核酸を含む第2の発現ベクター
を含み、ここで、第1及び第2の発現ベクターは、
(c)アデノウイルスのコア起点、
(d)蛍光タンパク質をコードする第3の核酸、
(e)エピトープタグをコードする核酸、
(f)(1)Tetリプレッサー結合部位、
(2)TRPVチャネルのコード領域に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーター
を含む調整可能なプロモーターシステム
を更に含み、ここで、第1及び第2の発現ベクターは、哺乳動物の発現用に最適化されている、発現ベクターシステム。 - (a)アデノウイルスのコア起点、
(b)(1)TRPVチャネルのNanchungタンパク質をコードする配列番号2を有する第1の核酸、
(2)TRPVチャネルのInactiveタンパク質をコードする配列番号28を有する第2の核酸
を含む一過性受容体電位V(TRPV)チャネルコード領域、
(c)蛍光タンパク質をコードする第3の核酸、
d)エピトープタグをコードする核酸、
(d)(1)Tetリプレッサー結合部位、
(2)TRPVチャネルのコード領域に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーター
を含む調整可能なプロモーターシステム
を含み、ここで発現ベクターは、哺乳動物の発現用に最適化されている、発現ベクター。 - 請求項24〜42のいずれか1項に記載の発現ベクターを含む細胞。
- Nanchungタンパク質とInactiveタンパク質が細胞において共発現される、請求項43に記載の細胞。
- 通常、Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質を発現しない任意の細胞を含む、請求項43又は44に記載の細胞。
- 細胞が、昆虫細胞、カエル(アフリカツメガエル)卵母細胞、マウス細胞、ハムスター細胞又はヒト細胞である、請求項43〜45のいずれか1項に記載の細胞。
- 細胞が、約1:1の比率でNanchungタンパク質とInactiveタンパク質を共発現する、請求項43〜46のいずれか1項に記載の細胞。
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