JP2017221524A - 人工骨材料 - Google Patents
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Abstract
Description
そのため、水酸アパタイトに柔軟性を有する高分子材料を複合化させ、機械的特性を高める手法が注目されている。中でも、ポリ乳酸のような生分解性高分子は、優れた生体適合性を有し、生体内において徐々に無毒な低分子へ分解されることから、水酸アパタイトとの複合化に広く用いられている。
例えば、リパーゼを触媒に用い、気孔率40%の多孔性水酸アパタイト中においてL−ラクチドのin situ重合を行い、ポリ(L−乳酸)/水酸アパタイト複合体を作製したことが報告されている(非特許文献1)。こうして作製された複合体は人工骨材料として注目されている。
そのような問題を解決するため、多水酸化開始剤を用いることで、ポリ(L−乳酸)と水酸アパタイトの界面接着性を向上させたポリ(L−乳酸)/水酸アパタイト複合体の作製が報告されている(非特許文献2)。
すなわち、本発明は、水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物とによりイソシアネートを介して形成された複合体に関する。
また、本発明は、水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物とをイソシアネートを介して結合させることを含む、前記複合体の製造方法にも関する。
さらに、本発明は、前記複合体を含む人工骨材料にも関する。
例えば、本発明の複合体は、下記式:
CP−O−CO−NH−ISO−NH−CO−O−POL
(式中、CPは水酸基含有リン酸カルシウム化合物残基を表し;
ISOはイソシアネート残基を表し;
POLは水酸基含有生分解性高分子残基を表す)
で表され得る。
なお、水酸基含有リン酸カルシウム化合物残基は、水酸基含有リン酸カルシウム化合物においてイソシアネートとのウレタン結合に関与した水酸基を除いた部分構造を意味し、イソシアネート残基は、イソシアネートにおいて水酸基含有リン酸カルシウム化合物及び水酸基含有生分解性高分子とのウレタン結合に関与したイソシアネート基を除いた部分構造を意味し、水酸基含有生分解性高分子残基は、水酸基含有生分解性高分子においてイソシアネートとのウレタン結合に関与した水酸基を除いた部分構造を意味する。
なお、本発明の水酸基含有生分解性高分子は、以下の4つの条件を有するのが好ましい。
(1) 免疫原性、毒性を持たない
(2) 適度な分解速度を有する
(3) 分解して生ずるオリゴマーや低分子が毒性を示さずに代謝・排出される
(4) 加工しやすく適度な力学特性を有する
上記の水酸基の導入により修飾された合成高分子として、例えば、ポリ−ε−カプロラクトン(PCL)などのポリラクトン、ポリジオキサノン、ポリアミノ酸、ポリアンハイドライド、及びポリオルソエステルなどの水酸基を有していない合成高分子であって、合成時に適切な開始剤を使用することにより、水酸基が末端に導入されて修飾されたものが挙げられる。
本発明の非酵素分解型の水酸基含有生分解性高分子として、ポリ乳酸が好ましい。
乳酸は光学異性体であるL体とD体が存在するので、本発明のポリ乳酸も、L体からなるポリ(L−乳酸)、D体からなるポリ(D−乳酸)、L体とD体とからなるポリ(DL−乳酸)が存在する。乳酸が光学活性体であることから、本発明のポリ乳酸において、その分子構造は多様となり得る。さらに、本発明のポリ乳酸は、構成単位に占めるL体とD体の比率により結晶性から非結晶性までの幅広い構造を取り得る。例えば、ポリ(L−乳酸)とポリ(D−乳酸)を混合して得られるステレオコンプレックス型ポリ乳酸、乳酸のD、L連鎖が規則的に配列したヘテロタクト構造を有するポリ乳酸、乳酸のD、L連鎖がブロック状に配置したステレオブロック型ポリ乳酸なども、本発明のポリ乳酸に包含される。
光学異性以外にも、ポリ乳酸の環状モノマーであるラクチドは種々の開始剤又は架橋剤を用いた反応及び様々な環状モノマーとの共重合が可能であるため、本発明のポリ乳酸も多様な分子構造を取ることが可能となり、合成に関しても多くの報告が発表されている。
本発明のポリ乳酸は、結晶性に優れるという点で、L−乳酸、またはD−乳酸を単位としたポリ(L−乳酸)、またはポリ(D−乳酸)が好ましい。
本発明の水酸基含有リン酸カルシウム化合物は、導入する水酸基含有生分解性高分子及び架橋剤と相互作用する点が豊富に存在するという点で、Ca10(PO4)6(OH)2で表され得る水酸アパタイトが好ましい。
本発明の水酸基含有リン酸カルシウム化合物は、骨親和性の高さ、細胞の浸潤しやすさ、骨伝導能の高さからバイオマテリアルとして利用され得る。例えば、水酸基含有リン酸カルシウム化合物を人工骨材料として骨欠損部に埋入すると、その表面を新生骨が覆い、破骨細胞による吸収と骨芽細胞による再生が繰り返され、長い時間をかけて自家骨に完全に置換される。そのため、水酸基含有リン酸カルシウム化合物は、再手術による取り出しが不要な人工骨材料として有用である。
歯や骨の主成分はCaやPであるが、そのほかにも様々なイオンが含まれており、炭酸イオンやマグネシウム、ナトリウムなどが挙げられる。そのため、本発明の水酸基含有リン酸カルシウム化合物のCa2+、PO4 3-、及びOH-サイトには、これらの微量な元素が置換していてもよい。したがって、本発明の水酸基含有リン酸カルシウム化合物は、下記式:
[(Ca)10-lMl][(PO4)6-mZm][(OH)2-nXn]
(式中、
lは0〜9のいずれかの整数を表し;
mは0〜5のいずれからの整数を表し;
nは0又は1、好ましくは0を表し;
Mは、それぞれ独立して、例えば、Na、Mg、Ba、K、Zn、又はAlを表し;
Zは、それぞれ独立して、例えば、SO4又はCO3を表し;
Xは、それぞれ独立して、例えば、F又はClを表す)
でも表され得る。
繊維状の水酸基含有リン酸カルシウム化合物は、公知の方法で製造することができ、例えば、繊維状の水酸アパタイトは、pHを塩基性条件下に置き、硝酸カルシウムとリン酸水素二アンモニウムをCa/P比が1.67になるように水溶液を作製し、80℃で24時間、90℃で72時間加熱し、結晶を成長させる均一沈殿法によって得ることができる。これはX線の回折によりc軸方向に結晶の繊維が伸長した形状であることは認められている。
多孔体の水酸基含有リン酸カルシウム化合物も、公知の方法で製造することができ、例えば、繊維状の水酸基含有リン酸カルシウム化合物を加圧成形するなどして製造することができる。
本発明では、水酸基含有リン酸カルシウム化合物の多孔体が、その孔の中で本発明の水酸基含有生分解性高分子とイソシアネートを介して結合していることで、優れた生体適合性と機械的特性を有する人工骨材料を提供し得る点で、好ましい。
好ましくは、沸点、融点が適切で、取扱いが容易であるという点から、1,4−フェニレンジイソシアネート及びポリメリックメチレンジフェニルジイソシアネートが挙げられ、特にポリメリックメチレンジフェニルジイソシアネートが挙げられる。
例えば、以下のA法又はB法で、本発明の複合体を製造することができる。
すなわち、A法は、
(工程1)イソシアネートのイソシアネート基と水酸基含有生分解性高分子の水酸基とをウレタン結合させることによりイソシアネートと水酸基含有生分解性高分子との複合体(イソシアネート−水酸基含有生分解性高分子複合体)を得る工程;及び
(工程2)工程1で得られた複合体のイソシアネート部分のイソシアネート基と水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とをウレタン結合させる工程
を含む、本発明の複合体の製造方法である。
B法は、
(工程1)イソシアネートのイソシアネート基と水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とをウレタン結合させることによりイソシアネートと水酸基含有リン酸カルシウム化合物との複合体(イソシアネート−水酸基含有リン酸カルシウム化合物複合体)を得る工程;
(工程2)工程1で得られた複合体のイソシアネート部分のイソシアネート基と水酸基含有生分解性高分子の水酸基とをウレタン結合させる工程
を含む、本発明の複合体の製造方法である。
例えば、以下のC法又はD法で、本発明の複合体を製造することができる。
すなわち、C法は、
(工程1)イソシアネートのイソシアネート基とポリオール型生分解性オリゴマーの水酸基とをウレタン結合させて、オリゴマー部分を鎖長伸長させることによりイソシアネート−水酸基含有生分解性高分子複合体を得る工程;
(工程2)工程1で得られた複合体のイソシアネート部分のイソシアネート基と水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とをウレタン結合させる工程
を含む、本発明の複合体の製造方法である。
D法は、
(工程1)イソシアネートのイソシアネート基と水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とをウレタン結合させることによりイソシアネート−水酸基含有リン酸カルシウム化合物複合体を得る工程;及び
(工程2)工程1で得られた複合体のイソシアネート部分のイソシアネート基とポリオール型生分解性オリゴマーの水酸基とをウレタン結合させて鎖長伸長させる工程
を含む、本発明の複合体の製造方法である。
なお、本発明の生分解性オリゴマーは、その鎖長伸長したものが、以下の4つの条件を有するのが好ましい。
(1) 免疫原性、毒性を持たない
(2) 適度な分解速度を有する
(3) 分解して生ずるオリゴマーや低分子が毒性を示さずに代謝・排出される
(4) 加工しやすく適度な力学特性を有する
上記の水酸基の導入により修飾されたオリゴマーとして、例えば、ε−カプロラクトンオリゴマーなどのラクトンオリゴマー、ジオキサノンオリゴマー、アミノ酸オリゴマー、及びオルソエステルオリゴマーなどの水酸基を有していないオリゴマーであって、合成時に適切な開始剤を使用することにより、水酸基が末端に導入されて修飾されたものが挙げられる。
このような生分解性オリゴマーとしてオリゴ乳酸が好ましい。
(1) 試薬
使用した試薬を以下に示す。
・硝酸カルシウム四水和物 Ca(NO3)2・4H2O (和光純薬工業株式会社 特級)
・リン酸水素二アンモニウム (NH4)2HPO4 (和光純薬工業株式会社 特級)
・尿素 (NH2)2CO (和光純薬工業株式会社 特級)
・硝酸 HNO3(和光純薬工業株式会社 特級)
※上記の試薬は精製せず、そのまま用いた。
・エタノール C2H5OH (日本アルコール販売株式会社)
※上記の試薬は常圧蒸留により精製して使用した(b.p.:78℃)。
合成は、既報(Aizawa, M.; Howell, F, S.; Itatani, K.; Yokogawa, Y.; Nishizawa, K.; Toriyama, M.; Kameyama, T. J. Ceram. Soc. Jpn. 2000, 108, 249;Aizawa, M.; Poter, A, E.; Best, S, M.; Bonfield, W. Biomaterials 2000, 26, 3427)を参考に行った。硝酸カルシウム四水和物39.44 g(0.1670 mol/L)、尿素30.02 g(0.4998 mol/L)をそれぞれ量り取り、ビーカーで精製水に溶解した(溶液1)。リン酸水素二アンモニウム13.20 g(0.09995 mol/L)をビーカーで精製水に溶解したものに、硝酸9 mLを加えて攪拌した(溶液2)。溶液1及び2を1Lの精製水で希釈した。中央に還流冷却管、片側に温度計を取り付けた三つ口セパラブルフラスコ内に試料溶液を入れ、セパラブルフラスコをテフロン(商標)テープで固定し、アルミブロック中で合成を行った。80℃で24時間加熱し、続いて90℃で72時間加熱することによりリン酸オクタカルシウム(OCP)含有f-HApを合成した。合成終了後、セパラブルフラスコ内の側面に付着した硬い粒子を除去して繊維状の柔らかいf-HApをビーカーに移し、精製水400cm3で2回、エタノール400 mLで2回穏やかに攪拌して洗浄し、吸引ろ過により回収した。
前記製造例1で得たf-HApを細かく裂いて、その1.2 gを量りとり、成形器に入れた。これを15-20MPaで一軸加圧成形し、円板状成形体(直径約20 mm、厚さ約2.0 mm)を作製した。作製した成形体を、光洋サーモシステム社製1700℃ボックス炉KBF314Nを用いて1200℃で5時間焼成し、p-HApを得た。焼成したp-HApは放冷し、室温まで冷却した。焼成条件を以下に示した。
[焼成条件]
焼成温度:1200℃
焼成時間:5時間
昇温、降温速度:10 ℃/min
(1) 試薬
使用した試薬を以下に示す。
・ジ(2-エチルヘキサン酸)スズ(II) (Stannous octoate, Sn(Oct)2;Alfa Aesar technical grade)
※市販品をそのまま用いた。
・トルエン (和光純薬工業株式会社 特級)
※溶媒精製装置 (ミツワ理化学工業株式会社、Glass Contour)で精製したものをアルゴン置換したのちに使用した。
(上記式中、nはそれぞれ独立に約2〜約150である)
上で得られたHD-OLLAの同定・評価を以下のとおり行った。
(ア) 1H NMR測定
HD-OLLA-1の1H NMR測定の結果を図1及び2に示した。HD-OLLAの(a)-(e)に起因するピークを観察した。積分比の実測値は理論値と一致した。図1より、4.35 ppmに末端OH基に隣接するメチン基に起因するピークを観察した。図2においてピーク(c)は1,6-ヘキサンジオールで観察された3.75 ppm付近(データは示さない)から4.13 ppm付近にシフトしたことから、1,6-ヘキサンジオールはオリゴ乳酸と結合していることがわかった。
(式中の(a)-(e)はそれぞれ1H NMRスペクトル中のピークに対応し;nはそれぞれ独立に約2〜約150である)
HD-OLLA-1のFT-IR測定の結果を図3に示した。帰属は表2に示した。3,020-2,920 cm-1にC-H伸縮振動、1,740 cm-1にC=O伸縮振動、1,450及び1,360 cm-1にC-H変角振動、1,180-1,050 cm-1にC-O伸縮振動に起因するピークを観察した。これより、HD-OLLAの合成を確認した。
HD-OLLA-1〜5のGPC測定の結果を表3に示す。重量平均モル質量(Mw)が5,000 gmol-1程度、分散度(Mw / Mn)が1.12-1.17となり、分子量の制御が可能であった。なお、Mnは数平均分子量を表す。
図4にHD-OLLA-1のTG-DTA測定の結果を示す。HD-OLLA-1の熱分解温度は222℃であった。
HD-OLLA-1のDSC測定の結果を図5に示した。HD-OLLA-1の結晶化エンタルピーは-35.5mJmg-1、融解エンタルピーは14.2 mJmg-1であり、結晶化度は20.9%であった。
Xc:結晶化度(%)
ΔHc:結晶化エンタルピー (J g-1)
ΔHm:融解エンタルピー (J g-1)
ΔHm(100%):完全結晶融解エンタルピー
CPLLA: 複合体中のPLLA導入率 (%)
これより、ΔHmの理論値であるポリ(L−乳酸)(PLLA)のΔHm(100%)は、既報(Kobayashi, A.; Uyama, H.; Ohmae, M. Bull. Chem. Soc. Jpn. 2001, 74, 613)により93 mJ mg-1 である。これを用いて結晶化度を算出した。
(1) 試薬
使用した試薬を以下に示す。
・1,4-フェニレンジイソシアネート (東京化成工業株式会社)
※市販品をそのまま用いた。
・ポリメリックメチレン ジフェニルジイソシアネート (Ardrich)
※市販品をそのまま用いた(Mw=1,000、Mw/Mn=1.55)。
(上記式中、nはそれぞれ独立に約2〜約150であり、mはそれぞれ独立に約5〜約15であり、合成条件によっては、100程度まで可能である)
(上記式中、nはそれぞれ独立に約2〜約150であり、mはそれぞれ独立に約5〜約15であり、合成条件によっては、100程度まで可能である)
上で得られたPDI-PLLA又はPDI-PLLAの同定・評価を以下のとおり行った。
(ア) 1H NMR測定
PDI-PLLA-2の1H NMRの結果を図6及び7に示す。HD-OLLA由来の(a)-(c)のピークが観察された。既報(Balaji, S.; Sharad, P. Adv. Mat. Lett. 2012, 3, 161-171)より、芳香環と結合したウレタン結合のN-Hに起因するピークは6.7-6.8 ppm付近に観察されることが報告されている。図7においてPDI-PLLA-2のウレタン結合に起因するピーク(d)が観察されたことからPDI-PLLAの合成を確認した。
(式中の(a)〜(d)はそれぞれ1H NMRのスペクトル中のピークに対応し、nはそれぞれ独立に約2〜約150であり、mはそれぞれ独立に約5〜約15であり、合成条件によっては、100程度まで可能である)
(式中の(a)〜(e)はそれぞれ1H NMRのスペクトル中のピークに対応し、nはそれぞれ独立に約2〜約150であり、mはそれぞれ独立に約5〜約15であり、合成条件によっては、100程度まで可能である)
PDI-PLLA-2及び比較としたその合成に使用したHD-OLLAのFT-IR測定の結果を図10に、帰属は表5に示した。帰属は既報(Irusta, L.; Iruin, J. Vib. Spectroc. 2005, 39, 144-150)を参考に行った。PDI-PLLA-2のウレタン結合に起因するN-H伸縮振動のピークを3,400-3,300 cm-1に、N-H変角振動のピークを1,530 cm-1付近に観察した。HD-OLLAに起因するC-H伸縮振動のピークを3,000-2,960 cm-1に、C=O伸縮振動のピークを1,750 cm-1に、C-H変角振動のピークを1,450及び1,360 cm-1に、C-O伸縮振動のピークを1,180-1,080 cm-1に観察した。これより、PDIによるHD-OLLAの鎖長伸長を確認した。
PDI-PLLA-1及び-2ならびにPMDI-PLLA-1及び2のGPC測定の結果を表7に示す。いずれのサンプルにおいても、合成に用いたHD-OLLAの分子量よりも大きい分子量となっていたため、HD-OLLAの鎖長伸長が確認された。PDIを用いて合成したサンプルはPMDIを用いたサンプルと比較して分子量が大きい傾向にあった。
図12にPDI-PLLA-2のTG-DTA測定の結果を示す。PDI-PLLA-2の熱分解温度は241℃であり、HD-OLLAと比較して上昇した。
また、図13にPMDI-PLLA-2のTG-DTA測定の結果を示す。PMDI-PLLA-2の熱分解温度は251℃であり、HD-OLLAと比較して上昇した。
PDI-PLLA-2のDSC測定を行い、測定結果を図14に示した。この測定結果より、製造例3の項目(3)(オ)の場合と同様に、PDI-PLLA-2の結晶化度(Xc)を式(1)より求めた。結晶化度と合わせて融点(Tm)及びガラス転移温度(Tg)をまとめたものを表8に示した。
(1) 試薬
使用した試薬を以下に示す。
・Tetrahydrofran Super dehydrated (THF 超脱水) (和光純薬工業株式会社、有機合成用)
※市販品をそのまま使用した。
製造例2で得たp-HAp内にイソシアネートを導入した。イソシアネートは吸湿性が高いため、グローブボックス内で50mLのナス形フラスコ内にイソシアネートを超脱水THFに溶解させたものを入れ、得られたイソシアネート溶液中にp-HApを浸漬した。そのナス型フラスコを真空ライン内で液体窒素を用いて凍結し、10-2 Torrまで真空引きを行った。その後、フラスコ内のイソシアネート溶液を融解した。この操作を3回繰り返すことにより、p-HAp内にイソシアネート溶液を導入した。その後、減圧乾燥することで、表10に示すとおりのPDI-HAp-1〜3及びPMDI-HAp-1〜3を作製した。仕込み比は表10に示した。
(1) 作製
製造例3の方法に従って得た、Mwが4900〜5400で、Mw/Mnが1.10〜1.19の範囲のHD-OLLAを、製造例5で得たPDI-HAp-1〜3及びPMDI-HAp-1〜3内に導入し、加熱処理を行うことで、1,4-フェニレンジイソシアネート−ポリ(L−乳酸)/水酸アパタイト(PDI-PLLA/HAp)複合体及びポリメリックメチレン ジフェニルジイソシアネート−ポリ(L−乳酸)/水酸アパタイト(PMDI-PLLA/HAp)複合体を作製した。すなわち、真空ラインを用いて50mLナスフラスコ内で上記HD-OLLAを上記イソシアネート−水酸アパタイト複合体内に導入した。ナスフラスコを真空ライン内で液体窒素を用いて凍結させた後、10-4 Torrまで真空引きを行った。その後、ナスフラスコ内のHD-OLLAを溶融させた。この操作を3回繰り返すことにより、各イソシアネート−水酸アパタイト複合体内にHD-OLLAを導入し、窒素雰囲気下、180℃で10分間塊状重合することにより表11に示すとおりPDI-PLLA/HAp-1〜3及びPMDI-PLLA/HAp-1〜3の複合体を作製した。仕込み比及び反応条件は表11に示した。
上で得られたPMDI-PLLA/HAp複合体の同定・評価を以下のとおり行った。
(ア) 1H NMR測定
図16にはPMDI-PLLA/HAp-2中のPMDI-PLLAの1H NMRの測定結果、図17にはその拡大した結果を示す。製造例4の結果から、PMDIとHD-OLLAが反応し、ウレタン結合を形成すると6.8ppm付近にウレタン結合のプロトンに起因するピークが観察される。図17より、PMDI-PLLA/HAp-2中のPMDI-PLLAにおいても、ウレタン結合のプロトンに起因するピークが観察されたため、複合体におけるPMDI-PLLAの合成が確認された。
PMDI-PLLA/HAp-2のFT-IR測定(ATR法)の結果を図18に、帰属は表12に示した。PMDI-PLLA/HAp-2及び比較としたHD-OLLA-1のFT-IR測定の結果を図19に、その拡大図を図20に示した。PMDI-PLLAのウレタン結合に起因するN-H伸縮振動のピークを3,400-3,300 cm-1に、N-H変角振動のピークを1,530 cm-1付近に観察した。HD-OLLAに起因するC-H伸縮振動のピークを3,000-2,960 cm-1に、C=O伸縮振動のピークを1,750 cm-1に、C-H変角振動のピークを1,450及び1,360 cm-1に、C-O伸縮振動のピークを1,180-1,080 cm-1に観察した。これより、PMDIによるHD-OLLAの鎖長伸長を確認した。
なお、ATR法では、サンプルを乳鉢ですり潰したものを測定試料として用いた。
SEM台にカーボン両面テープを貼り、サンプルを貼り付け固定した。JEOL JEC-3000FC AUTO FINE COATERを用いてPt蒸着を行い観察試料とした。装置には走査型電子顕微鏡(SEM) (日立製作所 S-4500)を用いた。
[測定条件]
加速電圧 : 1.0-2.0 kV
測定倍率 : 200, 400, 1000倍
W.D. : 5 cm
プローブ電流 : high
コンデンサレンズ : 1
PMDI-PLLA/HAp-1〜3のPMDI-PLLAのGPC測定の結果を表13に示した。PMDI-PLLA/HAp-1〜3では、いずれの複合体でもHD-OLLAの鎖長伸長が進行しており、PMDI-PLLA/HAp-2において最大の分子量となった。
なお、複合体内のポリマーのPMDI-PLLAの分子量に関しては、複合体の断片をTHFに一晩浸漬しポリマーを溶出させた後に、溶液をサンプレップ (MILLIPORE MillexFH 13, 0.20 μm)をつけたシリンジを用いて濾過し、測定試料として用いた。
表14、図22にPMDI-PLLA/HAp-1〜3のTG-DTA測定の結果を示した。なお、図22にはPMDI-PLLA/HAp-2の結果のみを示した。複合体中のPLLAは500℃以下で全て熱分解するが、HApは残存する。これを利用して、500℃における重量減少率からPMDI-PLLA導入率を算出した。
PMDI-PLLA/HAp-1〜3の熱分解温度(Td)は220℃前後であった。PMDI-PLLAの導入率は10-15%であり、ややばらつきが生じた。これはHD-OLLAの分子量が数千程度であり、溶融しても粘性を有するため、気孔内への導入が難しくなったためである。前述のSEM観察の結果から、p-HAp内がPLLAで充填されている様子を確認できたことから、充填率の減少が複合体に与える影響は小さいと判断した。
図23にPMDI-PLLA/HAp-2のDSC測定の結果を示した。これより、製造例3の場合と同様に、各複合体の結晶化度(Xc)を式(1)より算出した。また、PMDI-PLLA/HAp-1〜3中のPLLAの結晶化度とガラス転移温度(Tg)をまとめたものを表15に示した。
(1) 三点曲げ強度測定
BUEHLER社製 ISOMET(商標)低速切断機を用いて、サンプルを幅2.5 mmに切断し、#600、#1200、#2000の耐水研磨紙(三共理化学株式会社製)で研磨した。その後、エタノールで3分間超音波洗浄を行い、40℃で一晩減圧乾燥した。このサンプルを、A&Dテンシロン万能試験機(RTG-1210)を用いて三点曲げ強度試験を行った。
[測定条件]
クロスヘッドスピード:0.5 mm・min-1
支点間距離:10 mm
ロードセル容量:1 kN
σf:三点曲げ強度(Pa)
P:試験片が破壊するまでの最大荷重(N)
S:三点曲げ支点間距離(m)
B:試験片の厚さ(m)
W:試験片の幅(m)
E:曲げ弾性率(GPa)
ε:歪み
PMDI-PLLA/HAp-2において最大の曲げ強度、曲げ弾性率となり、それぞれ54±0.26 MPa、8.9±0.17 GPaであった。曲げ弾性率をp-HApと同程度に保ちながら、曲げ強度を向上させることが可能であった。
12wellプレートにサンプルを入れ、エチレンオキシドガス(EOG)で滅菌した。測定装置は、全自動酸化エチレンガス滅菌器イオジェルクSA-160 (エルクコーポレーション)を用いた。
[滅菌条件]
コース: B
温度: 40℃
標準トータル時間: 22時間
PBS浸漬後の従来のPLLA/HAp複合体、架橋剤を導入したPMDI-PLLA/HAp-2の三点曲げ強度測定の結果をそれぞれ表17及び18ならびに図25に示す。
図25において従来のPLLA/HAp複合体は、浸漬1日後にp-HApと同程度まで曲げ強度が低下した。一方で、イソシアネートを架橋剤として導入したPMDI-PLLA/HAp-2においてはPBS浸漬後も曲げ強度を維持することが可能であった。
初期強度の差を除くため、図26には初期強度を100%として算出した曲げ強度の保持率を示す。
電子天秤により測定したPBS浸漬前後の各浸漬時間における従来のPLLA/HAp複合体、架橋剤を導入したPMDI-PLLA/HAp-2の重量の測定結果を表19及び20ならびに図27に示す。
従来のPLLA/HAp複合体では、前記の三点曲げ強度試験において観察された機械的強度の低下と同様に、複合体内からのPLLAの流出に伴う重量減少が観察された。一方で、イソシアネートを導入したPMDI-PLLA/HAp-2においては重量減少は観察されなかった。したがって、イソシアネートのPMDIはHApとPLLA界面における架橋剤として機能することが明らかとなった。
複合体中のPLLAがHAp気孔内で分解しているか否かを調べるため、GPC測定による複合体中のPLLAの分子量測定を行った。PMDI-PLLA/HAp-2のPBS各浸漬時間に対するMwを表21、図28に示す。その結果、PMDI-PLLA/HAp-2においては、分子量の低下がほとんど生じておらず、これが機械的強度を保持した要因であると考えられる。
なお、複合体内のポリマーのPLLAの分子量に関しては、複合体の断片をTHFに一晩浸漬しポリマーを溶出させた後に、溶液をサンプレップ (MILLIPORE MillexFH 13, 0.20 μm)をつけたシリンジを用いて濾過し、測定試料として用いた。
(1) 試薬
以下の試薬は精製せず、そのまま用いた。
・新生児C57BL/6 (細胞) マウス頭蓋冠由来の骨芽細胞様樹立株 MC3T3-E1
・Minimum Essential Medium Alpha Medium (α-MEM) (GIBCO)
・牛胎児血清(Fetal Bovine Serum, FBS) (GIBCO)
※市販のものを56℃で30分間加熱し、非働化したものを使用した。
・アクチナーゼ(タンパク質分解酵素) (科研製薬株式会社)
・炭酸水素ナトリウム NaHCO3 (和光純薬工業株式会社 和光特級)
・0.25%トリプシン (GIBCO)
・α-MEM(+)
正確に超純水1 Lを計りとり、撹拌しながら、Minimum Essential Medium Alpha Medium (α-MEM)粉末を少しずつ添加し、完全に溶解した。そこに炭酸水素ナトリウムを2.2 g加え、完全に溶解した。その後、クリーンベンチ内において、37 ℃に加温した非動化FBSをα-MEM 500 mLに対して55 mL添加し、その溶液をフィルター滅菌することによってα-MEM(+)を調製した。これを培地として用いた。Lot checkは、得られたα-MEM(+)を、6wellマルチウェルプレートに3箇所、各3 mLずつ添加し、37℃、CO2濃度5%のインキュベーター内で24時間静置した後、OLIMPUS製倒立顕微鏡IX70を用いて細菌の感染がないことを確認した。保存は4℃の冷蔵庫で行った。
・PBS(-)
透析膜(Biotech CE tube 20KD, Spectra/Por)の内側、外側の両面を精製水でよく洗浄し、精製水を加えた1 Lビーカーに浸けてスターラーで2時間攪拌した。
塩化ナトリウム(8.00 g)、塩化カリウム(0.20 g)、リン酸水素二ナトリウム(1.15 g)、リン酸二水素カリウム(0.20 g)をそれぞれ測りとり、精製水1 Lに溶解し、リン酸緩衝溶液(PBS)を作製した。
・アクチナーゼ溶液
クリーンベンチ内で、PBS(-)を50 mL量り取り、それをクリーンベンチの外に出した。攪拌しながら、アクチナーゼを0.05 g添加し、完全に溶解した。得られた溶液はテルモ製シリンジとMILIPORE製滅菌済み0.22 μLサンプレップを用いてフィルター滅菌し、50 mL遠沈管に入れて、4℃で保存した。
[細胞起こし]
50 mLの遠沈管2本に、それぞれα-MEM(+)を10 mL加えた。凍結保存された1.0×106cell mL-1のMC3T3-E1細胞懸濁液を37℃で解凍し、先の遠沈管のうちの1本に1滴ずつ振り混ぜながら加えた。得られた細胞懸濁液を、1000 rpmで5分間遠心分離した。上澄みを除去した後、1 mLのα-MEM(+)を添加し、細胞を懸濁した。これをもう片方の遠沈管に添加し、十分に懸濁させた後、10 mLシャーレに播種し、37℃、CO2濃度5%のインキュベーター内で細胞培養を行った。
[培地交換]
インキュベーターからMC3T3-E1細胞の入ったシャーレを取り出し、クリーンベンチ内において、チップのついたアスピレーターでα-MEM(+)を吸引した。その後、37 ℃に予備加温したα-MEM(+) 10 mLをシャーレ内に添加した。培地交換は1日置きに行い、培地交換の前後には、顕微鏡で細胞の形態を確認した。
[継代]
シャーレ中の細胞が70〜90%コンフルエントの状態となったとき、継代を行った。
まず、α-MEM(+)を吸引し、PBS(-) 10 mLを加えて洗浄した。その後、アクチナーゼ溶液を5 mL添加し、インキュベーター内で5 分間静置した。インキュベーターからシャーレを取り出し、α-MEM(+)を5 mL添加して良く懸濁した後、遠沈管に移して1000 rpmで5 分間遠心分離した。上澄みを除去した後、α-MEM(+)を1 mL加えて、細胞を懸濁させた。血球計数板を用いて細胞数を計測し、細胞溶液を2.0×104 個/mLになるようにα-MEM(+)で希釈して、10 mLシャーレに播種した。
[凍結保存]
継代と同様の操作により、1.0×106 cells/mLの細胞懸濁液を1 mL調製した後、ジメチルスルホキシド(サンプレップにより滅菌したもの)を、懸濁液に10 vol.%となる様に1滴ずつ添加し、分注した。-80℃の冷凍庫で24時間保存した後、液体窒素タンクにて保存した。
24 wellマルチウェルプレートを用いて、サンプル及びコントロールとしたマルチウェル上で、播種5時間における初期付着試験を行った。
24wellマルチウェルプレートに、EOG滅菌を施した各サンプルを置き、α-MEM(+)を1 mLずつ加え、37℃、CO2濃度5%のインキュベーターで24時間置くことにより、各サンプルの表面を洗浄した。
3継代目以降のMC3T3-E1細胞を用いて、継代と同様の操作により、5.0×104 cells/mLの細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を0.4 mL、α-MEM(+)を0.2 mLずつ各サンプルに播種した。このときコントロールとしたマルチウェルプレートには細胞懸濁液0.4 mLを播種した。インキュベーター内でこれらの培養を行った。
5時間経過後、インキュベーターからウェルプレートを取り出し、α-MEM(+)を除去し、PBS(-) 1 mLで洗浄した。その後、37 ℃に温めておいたトリプシン溶液をコントロールに0.4 mL、サンプルに0.6 mLを加え、インキュベーターで5分間静置し、細胞を浮遊させた。5分後、等量のα-MEM(+)を添加し、十分に懸濁した。その懸濁液をマイクロチューブに移し、さらに、完全に細胞を移すため、ウェル内をα-MEM(+) 0.2 mLで洗浄し、その懸濁液もマイクロチューブに移した。この溶液を、1000 rpm、5分間遠心分離した。上澄みを除去した後、500μL量のα-MEM(+)を加えて細胞懸濁液を調製し、血球計算盤を用いて細胞数を計測した。
N5: 5時間後、基材上に付着している細胞数
N0: 基材上に播種した細胞数
N5 control: 5時間後、対照試料上に付着している細胞数
N0 control: 対照試料上に播種した細胞数
初期付着試験と同様の方法により、5時間、1、3、5、7日目の細胞数を計測することによって、短期細胞増殖曲線を作成した。
初期付着は細胞を播種してから5時間後に材料上に接着している細胞の個数を計数することによって決定した。PMDI-PLLA/HAp-2を用いて骨芽細胞様細胞MC3T3-E1の短期細胞培養試験を行った。実験結果から得られた増殖曲線を図29に、相対初期接着率及び倍加時間の結果を表22に示した。
その結果、PMDI-PLLA/HAp-2に生体適合性が確認できた。また、データには示さなかったが、PMDI-PLLA/HAp-2はp-HApよりも初期接着率が優れていた。
PDIとPMDIを導入したPLLA/HAp複合体の作製も行った。PMDI-PLLA/HAp複合体においてはHD-OLLAの鎖長伸長が認められた。PMDI-HApのFT-IR測定の結果、PMDIはHApとイソシアネート基を介して相互作用することが明らかとなった。PMDI-PLLA/HAp複合体はp-HApと比較し、同程度の弾性率を保ちながら、高い曲げ強度を獲得した。
PMDI-PLLA/HAp複合体のPBS浸漬による接着性試験を行った。架橋剤を導入していない従来のPLLA/HAp複合体と比較して、架橋剤を導入した本発明の複合体では複合体内からのPLLAの流出、それに伴う複合体の機械的強度の低下を抑制することが確認され、PMDIはHApとPLLA界面の架橋剤として機能した。
PMDI-PLLA/HAp複合体のマウス骨芽様細胞MC3T3-E1細胞を用いた生体適合性試験を行った。当該複合体において細胞の成長が観察された。
以上の試験により、PLLAとHAp界面の接着性に優れた複合体が得られたことが示された。
Claims (10)
- 水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物とによりイソシアネートを介して形成された複合体。
- イソシアネートがポリメリックメチレンジフェニルジイソシアネートである、請求項1記載の複合体。
- 水酸基含有生分解性高分子がポリ(L−乳酸)である、請求項1又は2記載の複合体。
- 水酸基含有リン酸カルシウム化合物が水酸アパタイトである、請求項1〜3のいずれか1項記載の複合体。
- 水酸基含有リン酸カルシウム化合物が多孔体である、請求項1〜4のいずれか1項記載の複合体。
- ポリオール残基を含む、請求項1〜5のいずれか1項記載の複合体
- 水酸基含有生分解性高分子と水酸基含有リン酸カルシウム化合物とをイソシアネートを介して結合させる工程を含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の複合体の製造方法。
- (工程1)イソシアネートのイソシアネート基と水酸基含有リン酸カルシウム化合物の水酸基とをウレタン結合させることによりイソシアネート−水酸基含有リン酸カルシウム化合物複合体を得る工程;及び
(工程2)工程1で得られた複合体のイソシアネート部分のイソシアネート基とポリオール型生分解性オリゴマーの水酸基とをウレタン結合させて鎖長伸長させる工程
を含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の複合体の製造方法である。 - 水酸基含有リン酸カルシウム化合物が多孔体である、請求項7又は8記載の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の複合体を含む、人工骨材料。
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