JP2017148039A - 薬物スクリーニングおよび有効性アッセイ - Google Patents

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Abstract

【課題】生物活性腎細胞集団であって、Ｂ１細胞集団が欠乏している腎細胞集団、特に尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団、腎細胞コンストラクト、および生物活性腎細胞集団を使用して試験薬剤の腎臓毒性のレベルをスクリーニングする方法の提供。【解決手段】試験薬剤の腎臓毒性のレベルを決定する方法であって、ａ）複数の濃度の試験薬剤を、尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団を含み、Ｂ１細胞集団が欠乏している、不均一腎細胞集団と共に培養することと、ｂ）前記試験薬剤の毒性のレベルを決定することであって、少なくとも１つの毒性指標の存在は、前記試験薬剤の腎臓毒性のレベルを示す、決定することとを含む方法。【選択図】なし

Description

本発明は、健常個人と比較して不活性または望ましくない細胞成分が欠落した生物活性腎細胞集団または分画を使用して、試験薬剤をスクリーニングする方法に関する。
創薬および薬物開発は、実験細胞および動物モデルにおける薬理学的効果の実証から始まり、患者における薬物の安全性および効用の試験に終わる、厳しい試験プロセスからなる。前臨床開発における多数の薬物候補は、試験系における許容されないレベルの毒性に起因して、この段階から進むことができない。
薬物候補を評価する際に、複数の薬理学的パラメータが考慮される。ヒト（および毒物学的評価において使用される動物）における薬物の吸収、分布、代謝および排泄プロファイル（「ＡＤＭＥ」）ならびにその代謝物を知ることは、集団内の個人間の効果の差を理解し、用量測定を最適化するために重要である。吸収およびバイオアベイラビリティは、全身循環または局所的作用部位に分布する生物学的に活性な材料の量の標準的な目安である。薬物作用の期間は、多くの場合、薬物代謝酵素による化学修飾が関与する代謝、または結合および体内の生物学的に活性な部位からの輸送が関与する排泄により、身体が活性分子をどれ程迅速に排除するかに依存する。したがって、典型的な前臨床試験は、上皮膜（例えば胃腸粘膜）を通した浸透の監視、薬物代謝の試験、血漿タンパク質結合の特定、および組織、特に腎臓および肝臓等の薬品を排除する器官内外への輸送の評価を含む。
薬物の不適格性は、膨大な時間および経費がつぎ込まれた後に初めて特定され得るため、薬物候補の高い減少率は、製薬業界における主な経済的障害である。これらの不適格性は、１つには、効果的な前臨床モデルおよび分析系がないことに起因し得る。したがって、当該技術分野において、薬物候補の薬理学的および毒物学的特性を効果的に評価することができるｉｎ ｖｉｔｒｏヒト系を開発することが極めて必要とされている。改善されたｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系によって、薬物開発プロセスは、薬物が臨床に到達する前に信頼性をもってｉｎ ｖｉｖｏ反応を予測し、時間、経費および患者の健康に対する大きなリスクを低減することができる。
一態様において、本発明は、試験薬剤の腎臓毒性のレベルを決定する方法であって、ａ）複数の濃度の試験薬剤を、尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団を含む不均一腎細胞集団と共に培養することであって、不均一腎細胞集団は、Ｂ１細胞集団が欠乏している、培養することと、ｂ）前記試験薬剤の毒性のレベルを決定することであって、少なくとも１つの毒性指標の存在は、前記試験薬剤の腎臓毒性のレベルを示す、決定することとを含む方法を提供する。
一実施形態において、不均一腎細胞集団は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、糸球体細胞および血管細胞のうちの１つ以上を含むＢ４細胞集団をさらに含む。別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ３細胞集団をさらに含む。さらに別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ５細胞集団をさらに含む。
ある特定の実施形態において、細胞集団は、スフェロイドとして培養される。ある特定の他の実施形態において、不均一腎細胞集団は、マトリックス上で培養される。一実施形態において、マトリックスは、三次元（３−Ｄ）マトリックスである。
いくつかの実施形態において、毒性指標は、減少したＧＧＴ発現である。他の実施形態において、毒性指標は、対照と比較したアクアポリン１発現の変化である。ある特定の他の実施形態において、毒性指標は、対照と比較したアクアポリン２発現の変化である。さらなる実施形態において、毒性指標は、ＬＤＨである。
別の実施形態において、毒性指標は、対照と比較した細胞集団の表現型の変化である。
ある特定の実施形態において、試験薬剤の腎臓毒性のレベルの決定は、試験薬剤のＴＣ５０および／またはＩＣ５０を計算することを含む。
別の態様において、本発明は、試験薬剤の代謝を決定するための方法であって、ａ）試験薬剤および酵素を、尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団を含む不均一腎細胞集団と共にインキュベートすることであって、不均一腎細胞集団は、Ｂ１細胞集団が欠乏している、インキュベートすることと、ｂ）試験薬剤の１つ以上の代謝物を検出することとを含む方法を提供する。
一実施形態において、不均一腎細胞集団は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、糸球体細胞および血管細胞のうちの１つ以上を含むＢ４細胞集団をさらに含む。別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ３細胞集団をさらに含む。さらに別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ５細胞集団をさらに含む。
ある特定の実施形態において、細胞集団は、スフェロイドとして培養される。ある特定の他の実施形態において、不均一腎細胞集団は、マトリックス上で培養される。一実施形態において、マトリックスは、三次元（３−Ｄ）マトリックスである。
さらに別の態様において、本発明は、腎臓障害を有するヒト対象における治療用途に好適な試験薬剤を特定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、ａ）試験薬剤を、増殖マーカーおよびＭ２表現型の発現からなる群から選択される表現型を特徴とするＢ２細胞集団を含む不均一腎細胞集団と接触させることであって、Ｂ２細胞集団は、尿細管細胞の濃縮集団を含む、接触させることと、ｂ）試験薬剤が、非接触対照細胞集団に比べて、不均一腎細胞集団の増殖マーカーおよび／またはＭ２表現型の発現を調節するかどうかを決定することとを含む方法を提供する。
一実施形態において、不均一腎細胞集団は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、糸球体細胞および血管細胞のうちの１つ以上を含むＢ４細胞集団をさらに含む。別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ３細胞集団をさらに含む。さらに別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ５細胞集団をさらに含む。
ある特定の実施形態において、細胞集団は、スフェロイドとして培養される。ある特定の他の実施形態において、不均一腎細胞集団は、マトリックス上で培養される。一実施形態において、マトリックスは、三次元（３Ｄ）マトリックスである。
別の態様において、本発明は、尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団を含む不均一腎細胞集団を含むオルガノイドであって、不均一腎細胞集団は、Ｂ１細胞集団が欠乏している、オルガノイドを提供する。
さらに別の態様において、本発明は、尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団を含む不均一腎細胞集団を含むオルガノイドを形成する方法であって、不均一腎細胞集団は、Ｂ１細胞集団が欠乏しており、方法は、不均一腎細胞集団を、ｉ）２Ｄ培養；ｉｉ）３Ｄ培養：ＣＯＬ（Ｉ）ゲル；ｉｉｉ）３Ｄ培養：Ｍａｔｒｉｇｅｌ；ｉｖ）３Ｄ培養：スピナーに続くＣＯＬ（Ｉ）／Ｍａｔｒｉｇｅｌ；およびｖ）３Ｄ培養：ＣＯＬ（ＩＶ）ゲルからなる群から選択される培養系中で培養することを含む方法を提供する。
さらに別の実施形態において、本発明は、尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団を含む不均一細胞集団の再生能を決定する方法であって、不均一腎細胞集団は、Ｂ１細胞集団が欠乏しており、方法は、ａ）不均一腎細胞集団を培養することと、ｂ）不均一細胞集団の再生能を決定することであって、尿細管および／またはオルガノイドの形成は、再生能を示す、決定することとを含む方法を提供する。
複数層ステップ勾配技術（Ａ−左側のパネル）または単層混合勾配技術（Ｂ−右側のパネル）を使用した、新しく分離した腎臓組織からのｅｐｏ産生細胞分画の濃縮を示す図である。これらの方法は両方とも、１．０２５ｇ／ｍＬから１．０３５ｇ／ｍＬの間で見られる、ｅｐｏバンドからの非ｅｐｏ産生細胞成分（主に尿細管細胞）の部分的欠乏をもたらす。 別個に採取され、同一ステップ勾配に対して並べて適用された、「通常酸素」（２１％酸素）および「低酸素」（２％酸素）げっ歯類培養物のステップ勾配を示す図である。 別個に採取され、同一ステップ勾配に対して並べて適用された、「通常酸素」（２１％酸素）および「低酸素」（２％酸素）イヌ培養物のステップ勾配を示す図である。 ＨＫ１７およびＨＫ１９試料の組織病理学的特徴を示す図である。 対象領域（ＲＯＩ）を確定するヒトＮＫＡ細胞における、アルブミン輸送のハイコンテント分析（ＨＣＡ）を示す図である。 非ＣＫＤおよびＣＫＤ腎臓から得られたＮＫＡ細胞におけるアルブミン輸送の定量的比較を示す図である。 尿細管濃縮Ｂ２および尿細管細胞欠乏Ｂ４副分画の間のマーカー発現の比較分析を示す図である。 種にわたる選択された腎細胞（ＳＲＣ）の表現型特性決定を示す図である。 尿細管濃縮Ｂ２および尿細管細胞欠乏Ｂ４副分画の間のアルブミン輸送の比較機能分析を示す図である。 処理中に細胞を低酸素に暴露する手順を示す図である。 ２％酸素への暴露後に、以下が観察されたことを示す図である：密度勾配にわたる細胞の分布を改変し、全体的な勾配後の収量を改善する。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの尿細管単層の修復を観察するために開発されたアッセイを示す図である。 定量的画像分析（ＢＤ Ｐａｔｈｗａｙ ８５５ ＢｉｏＩｍａｇｅｒ）の結果を示す図である。 尿細管上皮単層の修復により優れるように２％酸素で誘導された細胞を示す図である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの尿細管単層の修復を観察するために開発されたアッセイを示す図である。 ２％酸素での細胞の誘導が、非誘導（２１％酸素）と比較して移動および創傷修復を向上させたことを示す図である。 移動時間に対する移動した細胞の％をプロットしたグラフである。 図１３Ａは、尿細管細胞によりオステオポンチンが分泌され、損傷に応じて上方制御されることを示す図である（オステオポンチン免疫細胞化学：Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色（青）、オステオポンチン（赤）、１０×）。オステオポンチンは、免疫蛍光（図１３Ａ）およびＥＬＩＳＡ（図１３Ｂ）により示されるように、確立尿細管細胞単層において、損傷により上方制御される。 細胞の移動反応が、オステオポンチンにより一部媒介されることを示す図である（緑＝移動した細胞（５×））。 オステオポンチンに対する中和抗体（ＮＡｂ）が、腎細胞移動反応を５０％低減させることを示すグラフである。 細胞の低酸素誘導が、組織リモデリング遺伝子の発現を調節することを示すグラフである。 腎臓再生をもたらす細胞の生物活性の低酸素増強の推定される機序を示す図である。 低結合プレートを有する軌道ローテータを示す図である。 ヒト細胞を有するスピナーフラスコを示す図である。 スフェロイドを示す図である。 ＮＫＣＣ２（緑）；核（青）を示す図である。 ＧＧＴ−１（緑）；核（青）を示す図である。 アクアポリン１（緑）；核（青）を示す図である。 ロイシンアミノペプチダーゼ３（赤）；核（青）を示す図である。 有機イオン輸送体１（ＯＡＴ１）（赤）；核（青）を示す図である。 キュビリン（赤）；核（青）を示す図である。 ４８時間の暴露後のスフェロイド培養物における生存能力に対するシスプラチンの効果を示す図である。 ３Ｄ尿細管オルガノイド培養物に対する４８時間のシスプラチン暴露後のＧＧＴ−１活性の定量を示すグラフである。 アムホテリシンＢを用いた片対数用量反応曲線からのＴＣ５０を示すグラフである。 アムホテリシンＢへの７２時間の暴露後の、形態および生存能力の変化を示す図である。 アムホテリシンＢへの７２時間の暴露後のＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅによる未処理対照からのパーセント変化を示すグラフである。 ２週間ＨＫ培養物からの２Ｄ管形成を示す図である。 １８日目の２Ｄ培養物を示す図である。 １８日目の２Ｄ基本培養物を示す図である。 １４日目の２Ｄ基本培養物を示す図である。 腎尿細管マーカーを有する２Ｄ培養尿細管構造の特性決定を示す図である。 ５日目のＣＯＬ（Ｉ）ゲルにおける３Ｄ管形成を示す図である。 ７日目の３Ｄ ＣＯＬ（Ｉ）ゲル培養物を示す図である。 １１日目の３Ｄ ＣＯＬ（Ｉ）ゲル培養物を示す図である。 ＣＯＬ（Ｉ）ゲル培養物における２週間目の３Ｄ管形成を示す図である。 ＣＯＬ（Ｉ）ゲル培養物における２週間目の３Ｄ管形成を示す図である。 ２週間目のＣＯＬ（Ｉ）ゲル培養物におけるヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を示す図である。 ４日間のスピナー培養、２日間のＭａｔｒｉｇｅｌを示す図である。 ４日間のスピナー培養、３日間のＭａｔｒｉｇｅｌを示す図である。 ４日間のスピナー培養、７日間のＭａｔｒｉｇｅｌを示す図である。 低結合プレート４日間、７日間のＭａｔｒｉｇｅｌを示す図である。
本発明は、本明細書に記載のように、生物活性腎細胞（ＢＲＣ）の均一混合物または分画、それらを単離および培養する方法、ならびにＢＲＣを使用した試験薬剤のスクリーニングの方法に関する。本発明はまた、生物活性腎細胞の不均一混合物または分画を含む、および／またはそれらから形成されたオルガノイド、それを形成および培養する方法、ならびに生物活性腎細胞の不均一混合物または分画の生物活性能または有効性を決定する方法に関する。生物活性腎細胞は、尿細管およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生腎細胞を含む単離腎細胞であってもよい。ＢＲＣ細胞集団は、濃縮尿細管およびＥＰＯ産生細胞集団を含んでもよい。ＢＲＣは、健常個人からの腎細胞分画から得られてもよく、またはそれ自体が該腎細胞分画であってもよい。さらに、本発明は、健常個人の対応する腎細胞分画と比較して、ある特定の細胞成分が欠落し得る非健常個人から得られるが、まだ治療特性を保持する腎細胞分画を提供する。本発明はまた、健常個人と比較して、細胞成分が欠落する治療活性細胞集団を提供するが、この細胞集団は、一実施形態において、様々な疾患状態の自己細胞源から単離および増殖されてもよい。
定義
別段に定義されていない限り、本明細書で使用されている技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｒ Ｌａｎｚａ、Ｒ ＬａｎｇｅｒおよびＪ Ｖａｃａｎｔｉ編集），２００７は、本出願において使用される用語の多くの一般的な指針を当業者に提供する。当業者には、本発明の実践に使用され得る、本明細書に記載の方法および材料と類似した、または等価の多くの方法および材料が認識される。実際に、本発明は、記載される方法および材料に決して限定されない。
「細胞集団」という用語は、本明細書において使用される場合、好適な組織源から、通常は哺乳動物から直接単離することにより得られる複数の細胞を指す。単離細胞集団は、その後ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されてもよい。当業者には、本発明との使用のために細胞集団を単離および培養するための様々な方法、ならびに本発明における使用に好適な細胞集団内の様々な数の細胞が認識される。細胞集団は、腎臓から得られた非分画不均一細胞集団であってもよい。例えば、不均一細胞集団は、腎臓生検から、または全腎臓組織から単離されてもよい。代替的に、不均一細胞集団は、腎臓生検または全腎臓組織から確立された哺乳動物細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養から得られてもよい。非分画不均一細胞集団はまた、非濃縮細胞集団と呼ぶこともできる。
「自然腎」という用語は、生きた対象の腎臓を意味するものとする。対象は、健常または非健常であってもよい。非健常対象は、腎臓疾患を有し得る。
「再生効果」という用語は、自然腎に利益を与える効果を意味するものとする。この効果は、限定されないが、自然腎への損傷の程度の低減、または自然腎機能の改善、その修復もしくは安定化を含む。腎損傷は、線維症、炎症、糸球体肥大等の形態であってもよく、対象における腎臓疾患に関連する。
「再生能」または「潜在的再生生物活性」という用語は、本明細書に記載の生物活性細胞調製物および／または混合体の、再生効果を提供する可能性を指す。
「混合体」という用語は、本明細書において使用される場合、非分画不均一細胞集団から得られた２つ以上の単離された濃縮細胞集団の組み合わせを指す。ある特定の実施形態によれば、本発明の細胞集団は、腎細胞集団である。
「濃縮」細胞集団または調製物は、出発集団における特定の細胞型よりも高いパーセンテージの当該細胞型を含有する、出発腎細胞集団（例えば、非分画不均一細胞集団）から得られた細胞集団を指す。例えば、出発腎細胞集団は、第１、第２、第３、第４、第５等の対象細胞集団が濃縮されてもよい。本明細書において使用される場合、「細胞集団」、「細胞調製物」および「細胞表現型」という用語は、同義的に使用される。
一態様において、「濃縮」細胞集団という用語は、本明細書において使用される場合、出発集団におけるＥＰＯを産生可能な細胞のパーセンテージよりも高いパーセンテージのＥＰＯを産生可能な細胞を含有する、出発腎細胞集団（例えば、腎臓生検からの細胞懸濁液または培養哺乳動物腎臓細胞）から得られた細胞集団を指す。例えば、「Ｂ４」という用語は、出発集団と比較してより高いパーセンテージのＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含有する、出発腎細胞集団から得られた細胞集団である。本発明の細胞集団は、１つ以上の細胞型が濃縮されてもよく、１つ以上の他の細胞型が欠乏していてもよい。例えば、濃縮ＥＰＯ産生細胞集団は、非濃縮細胞集団、すなわちそこから濃縮細胞集団が得られる出発細胞集団における間質線維芽細胞および尿細管細胞に比べて、間質線維芽細胞が濃縮されてもよく、尿細管細胞および集合管上皮細胞が欠乏していてもよい。ＥＰＯ濃縮または「Ｂ４」集団に言及する全ての実施形態において、濃縮細胞集団は、内因性天然ＥＰＯ遺伝子からの酸素調整可能ＥＰＯ発現により示されるように、酸素が制御された様式においてＥＰＯを産生し得る細胞を含有する細胞の不均一集団である。
別の態様において、出発集団内の特定の細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞のパーセンテージより高いパーセンテージの当該細胞型を含有する濃縮細胞集団はまた、健常個人または対象から得られた出発腎細胞集団と比較して、１つ以上の特定の細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞が欠落または不足していてもよい。例えば、「Ｂ４’」、または「Ｂ４プライム」という用語は、一態様において、健常個人と比較して、出発検体の疾患状態に依存して、１つ以上の細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞が欠落または不足した出発腎細胞集団から得られた細胞集団である。一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、慢性腎臓疾患を有する対象から得られる。一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を有する対象から得られる。別の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、自己免疫性糸球体腎炎を有する対象から得られる。別の態様において、Ｂ４’は、後に１つ以上の細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞が欠乏または不足する、全ての細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞を含む出発細胞集団から得られた細胞集団である。さらに別の態様において、Ｂ４’は、１つ以上の特定の細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞が後に濃縮される、全ての細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞を含む出発細胞集団から得られた細胞集団である。例えば、一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、血管細胞が濃縮されているが、糸球体および／または内分泌細胞が欠乏していてもよい。別の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、糸球体細胞が濃縮されているが、血管および／または内分泌細胞が欠乏していてもよい。別の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、内分泌細胞が濃縮されているが、血管および／または糸球体細胞が欠乏していてもよい。別の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、血管および内分泌細胞が濃縮されているが、糸球体細胞が欠乏していてもよい。好ましい実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、単独で、または別の濃縮細胞集団、例えば、Ｂ２および／もしくはＢ３と混合されて、治療特性を保持する。Ｂ４’細胞集団は、例えば、本明細書において、実施例、例えば実施例７〜９において説明される。
別の態様において、濃縮細胞集団はまた、出発集団内のいくつかのＥＰＯ産生細胞を有する１つ以上の血管、糸球体および近位尿細管マーカーを発現する細胞のパーセンテージより高いパーセンテージの、いくつかのＥＰＯ産生細胞を有する１つ以上の血管、糸球体および近位尿細管マーカーを発現する細胞を含有する、上述のように出発腎細胞集団から得られた細胞集団を指してもよい。例えば、「Ｂ３」という用語は、出発集団と比較してより高いパーセンテージの近位尿細管細胞、ならびに血管および糸球体細胞を含有する、出発腎細胞集団から得られた細胞集団を指す。一実施形態において、Ｂ３細胞集団は、出発集団と比較してより高いパーセンテージの近位尿細管細胞を含有するが、Ｂ２細胞集団と比較してより低いパーセンテージの近位尿細管細胞を含有する。別の実施形態において、Ｂ３細胞集団は、出発集団と比較してより高いパーセンテージの、いくつかのＥＰＯ産生細胞を有する血管および糸球体細胞マーカーを含有するが、Ｂ４細胞集団と比較してより低いパーセンテージの、いくつかのＥＰＯ産生細胞を有する血管および糸球体細胞マーカーを含有する。
別の態様において、濃縮細胞集団はまた、出発集団内の１つ以上の尿細管細胞マーカーを発現する細胞のパーセンテージよりも高いパーセンテージの、１つ以上の尿細管細胞マーカーを発現する細胞を含有する、上述のように出発腎細胞集団から得られた細胞集団を指してもよい。例えば、「Ｂ２」という用語は、出発集団と比較してより高いパーセンテージの尿細管細胞を含有する、出発腎細胞集団から得られた細胞集団を指す。さらに、１つ以上の尿細管細胞マーカーを発現する細胞が濃縮された細胞集団（または「Ｂ２」）は、集合管系からのいくつかの上皮細胞を含有してもよい。１つ以上の尿細管細胞マーカーを発現する細胞が濃縮された細胞集団（または「Ｂ２」）は、ＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞、および血管細胞が比較的欠乏しているが、濃縮集団は、出発集団と比較して、より低いパーセンテージのこれらの細胞（ＥＰＯ産生、糸球体、および血管細胞）を含有し得る。一般に、不均一細胞集団は、欠乏した細胞集団が、欠乏前の不均一細胞集団に含有される細胞型（複数を含む）の割合に比べて、より低い割合の細胞型（複数を含む）を含有するように、１つ以上の細胞型が欠乏している。欠乏し得る細胞型は、腎細胞の任意の型である。例えば、ある特定の実施形態において、欠乏し得る細胞型は、「Ｂ１」と呼ばれる、約１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度を有する大きな粒度の集合管および尿細管系を有する細胞を含む。ある特定の他の実施形態において、欠乏して得る細胞型は、「Ｂ５」と呼ばれる、約１．０９５ｇ／ｍｌを超える密度を有する低い粒度および生存能力の残屑および小細胞を含む。いくつかの実施形態において、尿細管細胞が濃縮された細胞集団は、「Ｂ１」、「Ｂ５」、酸素調整可能ＥＰＯ発現細胞、糸球体細胞、および血管細胞の全てが比較的欠乏している。
「低酸素」培養条件という用語は、本明細書において使用される場合、細胞が大気酸素レベル（約２１％）において培養される標準的培養条件に比べて、細胞が培養系において利用可能な酸素レベルの低減に供される培養条件を指す。非低酸素条件は、本明細書において、通常または通常酸素培養条件と呼ばれる。
「酸素調整可能」という用語は、本明細書において使用される場合、細胞に利用可能な酸素の量に基づき遺伝子発現を（上方または下方）調節する細胞の能力を指す。「低酸素誘導」は、酸素圧の低減に応じた遺伝子発現の上方制御を指す（事前誘導または出発酸素圧とは無関係）。
「生体材料」という用語は、本明細書において使用される場合、生体組織への導入に好適な天然または合成生体適合性材料を指す。天然生体材料は、生体系により形成される材料である。合成生体材料は、生体系により形成されない材料である。本明細書において開示される生体材料は、天然および合成生体適合性材料の組み合わせであってもよい。本明細書において使用される場合、生体材料は、例えば、ポリマーマトリックスおよび骨格を含む。当業者には、生体材料（複数を含む）が、様々な形態で、例えばヒドロゲル懸濁液、多孔質フォームとして構成されてもよく、また１種以上の天然または合成生体適合性材料を含んでもよいことが理解される。
「コンストラクト」という用語は、１つ以上の合成または自然発生生体適合性材料で作製された骨格またはマトリックスの表面の上または中に堆積された１つ以上の細胞集団を指す。１つ以上の細胞集団は、１つ以上の合成または自然発生生体適合性ポリマー、タンパク質、またはペプチドで作製された生体材料でコーティングされる、その上に堆積される、その中に埋め込まれる、それに取り付けられる、それに播種される、またはその中に捕捉されてもよい。１つ以上の細胞集団は、生体材料または骨格またはマトリックスとｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで組み合わされてもよい。一般に、骨格／生体材料を形成するために使用される１つ以上の生体適合性材料は、その上に堆積された細胞集団の少なくとも１つの多細胞三次元組織化の形成を誘導、促進または許容するように選択される。また、コンストラクトを生成するために使用される１つ以上の生体材料は、コンストラクトもしくはコンストラクトの細胞成分の分散および／もしくは内因性宿主組織との統合を誘導、促進、もしくは許容するように、または、コンストラクトもしくはコンストラクトの細胞成分の生存、生着、耐性、もしくは機能的性能を誘導、促進、もしくは許容するように選択され得る。
「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、一般に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、または糖脂質系分子マーカーを指し、培養細胞集団におけるその発現または存在は、標準的方法（または本明細書に開示される方法）により検出することができ、特定の細胞型である培養細胞集団内の１つ以上の細胞と一致する。マーカーは、細胞、または染色体上の識別可能な物理的場所、例えば遺伝子、制限エンドヌクレアーゼ認識部位もしくは天然細胞により発現されるポリペプチドをコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）により発現されるポリペプチドであってもよい。マーカーは、「遺伝子発現マーカー」と呼ばれる遺伝子の発現領域、またはコード化機能が知られていないＤＮＡのいくつかの断片であってもよい。バイオマーカーは、細胞から得られる、例えば分泌される生成物であってもよい。
同義的に使用される用語「差次的に発現した遺伝子」、「差次的遺伝子発現」およびそれらの同義語は、その発現が、第２の細胞または細胞集団における発現に比べて、第１の細胞または細胞集団においてより高い、またはより低いレベルに活性化される遺伝子を指す。この用語はまた、その発現が、培養中の第１または第２の細胞の継代中に、経時的に異なる段階でより高いまたはより低いレベルに活性化される遺伝子を含む。また、差次的に発現した遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化または阻害されてもよく、または、異なるポリペプチド生成物をもたらすために代替的なスプライシングに供されてもよい。そのような差は、ｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌、またはポリペプチドの他の分配等の変化により明確化され得る。差次的遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子もしくはその遺伝子産物の間の発現の比較、２つ以上の遺伝子もしくはその遺伝子産物の間の発現の比の比較、またはさらに、第１の細胞と第２の細胞との間で異なる、同じ遺伝子の異なって処理された２つの産物の比較を含んでもよい。差次的発現は、例えば第１の細胞および第２の細胞のうちの遺伝子またはその発現産物における時間的または細胞発現パターンの、定量的および定性的な差の両方を含む。本発明の目的において、「差次的遺伝子発現」は、第１の細胞および第２の細胞において所与の遺伝子の発現の間の差がある場合に存在するとみなされる。マーカーの差次的発現は、細胞集団、混合体、またはコンストラクトの投与後の患者からの細胞（第２の細胞）における発現に対して、投与前の患者からの細胞（第１の細胞）内であってもよい。
「阻害」、「下方制御」、「低発現」および「低減」という用語は、同義的に使用され、遺伝子の発現、あるいはＲＮＡ分子または１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードする等価のＲＮＡ分子のレベル、あるいは１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、例えば１つ以上の陽性および／または陰性対照等の１つ以上の対照に比べて低減されていることを意味する。低発現は、細胞集団、混合体、またはコンストラクトの投与後の患者からの細胞に対して、投与前の患者からの細胞内であってもよい。
「上方制御」または「過剰発現」という用語は、遺伝子の発現、あるいはＲＮＡ分子または１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードする等価のＲＮＡ分子のレベル、あるいは１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、例えば１つ以上の陽性および／または陰性対照等の１つ以上の対照に比べて上昇していることを意味する。過剰発現は、細胞集団、混合体、またはコンストラクトの投与前の患者からの細胞に対して、投与後の患者からの細胞内であってもよい。
「対象」という用語は、腎臓疾患、貧血、またはＥＰＯ不足の１つ以上の兆候、症状または他の指標を経験している、または経験した、治療対象となり得る患者を含む、任意の１人のヒト対象を意味するものとする。そのような対象は、限定されないが、新たに診断された、もしくは以前に診断されたが現在は反復もしくは再発を経験している、または、原因とは関係なく腎臓疾患、貧血、もしくはＥＰＯ不足のリスクを有する対象を含む。対象は、腎臓疾患、貧血、もしくはＥＰＯ不足の治療を以前に受けていてもよく、またはそのような治療を受けていなくてもよい。
「患者」という用語は、治療が望まれる任意の１匹の動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園用動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、およびヒト以外の霊長類）を指す。最も好ましくは、本明細書における患者は、ヒトである。
「試料」または「患者試料」または「生体試料」は、一般に、対象または患者、体液、身体組織、細胞株、組織培養物、または他の源から得られた任意の生体試料を意味するものとする。この用語は、例えば腎臓生検等の組織生検を含む。この用語は、例えば培養哺乳動物腎細胞等の培養細胞を含む。哺乳動物から組織生検および培養細胞を得るための方法は、当該技術分野において周知である。「試料」という用語が単独で使用される場合でも、「試料」が「生体試料」または「患者試料」であることを意味し、すなわち、これらの用語は同義的に使用される。
「試験試料」という用語は、本発明の方法により処置された対象からの試料を指す。試験試料は、限定されないが、血液、精液、血清、尿、骨髄、粘膜、組織等を含む、哺乳動物対象における様々な源に由来し得る。
「対照」または「対照試料」という用語は、陰性または陽性の結果が予想され、試験試料における結果の相互関係を示すのに役立つ、陰性または陽性対照を指す。本発明に好適な対照は、限定されないが、正常な赤血球恒常性に特徴的な指標を示すことが知られている試料、貧血に特徴的な指標を示すことが知られている試料、貧血でないことが知られている対象から得られた試料、および貧血であることが知られている対象から得られた試料を含む。本発明の方法における使用に好適な追加的な対照は、限定されないが、赤血球産生を調節することが知られている薬理学的薬剤（例えば、組み換えＥＰＯまたはＥＰＯ類似体）で処置されている対象から得られた試料を含む。さらに、対照は、本発明の方法により処置される前の対象から得られた試料であってもよい。さらなる好適な対照は、任意の種類または段階の腎臓疾患を有することが知られている対象から得られた試験試料、および任意の種類または段階の腎臓疾患を有さないことが知られている対象からの試料であってもよい。対照は、正常な健常対応対照であってもよい。当業者には、本発明における使用に好適な他の対照が認識される。
本明細書において使用される場合、「毒性」という用語は、望ましくない、または過度に増大した薬理学的効果を含む、試験薬剤または他の製剤と組み合わせて使用された試験薬剤により引き起こされる、ヒト細胞または組織に対する任意の望ましくない効果として定義される。これに関連して使用される類似の用語は、「有害反応」である。
製薬分野において、「効用」という用語は、単一の薬物−受容体複合体から生じる組織内での反応の強さを説明することができる。本開示に関連して、「効用」はまた、細胞または組織の表現型を改善する薬物または試験薬剤により惹起される反応として定義され得る。
「試験薬剤」または「試験化合物」は、対象における疾患を診断、治癒、軽減、治療もしくは予防する能力に関して評価される、または対象の身体の構造または機能を改変することを意図する任意の物質である。一実施形態における試験薬剤は、食品医薬品化粧品法、セクション３２１（ｇ）（１）において用語が定義されるような「薬物」であってもよい。試験薬剤は、化学化合物、生物学的作用物質、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、多糖類、補助物質、診断薬および免疫調節剤を含むが、それらに限定されない。
「薬物動態」は、薬物に対する身体の作用を指す。薬物動態学的プロセスは、薬物の吸収、分布、代謝、および排出を含むが、これらに限定されない。
「薬力学」は、身体に対する薬物の作用を指す。ある特定のクラスの薬物は、身体に同様の効果を示すため、薬力学的特性は、薬物または薬剤が分類される群を決定する。
「第Ｉ相代謝」は、ヒドロキシル、アミノ、またはスルフヒドリル基を含むがこれらに限定されない官能基を導入または脱マスキングすることにより、通常は親薬物、薬剤または化合物を変換する生化学反応を指す。第Ｉ相代謝の産物は、多くの場合不活性であるが、いくつかの場合において、活性が改質されるだけであるか、またはさらに親薬物よりも高い。
「第ＩＩ相代謝」は、複合化に好適な官能基を含有する親薬物またはその第Ｉ相代謝物に、極性分子を結合または複合化させる生化学反応を包含する。第ＩＩ相代謝反応は、エネルギーを必要とする。第ＩＩ相代謝は、第Ｉ相反応の前、またはその非存在下で生じ得る。
「有効性」という用語は、治療薬剤、例えば、細胞ベースの治療の生物学的活性の目安を指す。一実施形態において、有効性アッセイは、製造プロセスの検証として、治療反応の元となる作用機序を反映する定量的評価基準である。他の実施形態において、有効性アッセイは、製造または生成物の性質自体への変更を評価するために使用されてもよい。
「スフェロイド」という用語は、単層としての成長ではなく、３Ｄ成長を可能にするように培養された細胞の凝集体または集合体を指す。「スフェロイド」という用語は、凝集体が幾何学的な球であることを暗示するものではないことが留意される。凝集体は、明確な形態をもって高度に組織化されていてもよく、または、組織化されていない塊であってもよく、凝集体は、単一の細胞型または２つ以上の細胞型を含んでもよい。細胞は、１次分離株、または永久細胞株、またはその２つの組み合わせであってもよい。この定義に含まれるのは、オルガノイドおよび器官型培養物である。
「オルガノイド」という用語は、本明細書において使用される場合、天然器官に存在する細胞自己組織化、構造およびシグナル伝達相互作用の側面を再現する細胞の不均一３Ｄ凝集を指す。「オルガノイド」という用語は、浮遊細胞培養から形成されたスフェロイドまたは細胞培養物を含む。
細胞集団
腎臓疾患の治療における使用のための、すなわち、腎機能の安定化および／または改善および／または再生を提供する、特定の生物活性成分もしくは細胞型が濃縮された、および／または特定の不活性もしくは望ましくない成分もしくは細胞型が欠乏した腎細胞の単離された不均質集団、およびそれらの混合体は、以前に、２００９年１１月１２日出願の米国特許出願公開第１２／６１７，７２１号において記載されている。本発明は、健常個人と比較して細胞成分が欠落しているが、まだ治療特性を保持する、すなわち、腎機能の安定化および／または改善および／または再生を提供する単離腎細胞分画を使用して、試験薬剤をスクリーニングする方法を提供する。本明細書に記載の細胞集団、細胞分画、および／または細胞の混合体は、健常個体、腎臓疾患を有する個体、または本明細書に記載のような対象から得られてもよい。
生物活性細胞集団
本発明は、出発集団よりも優れた治療および再生結果を提供する、生物活性成分が濃縮され、不活性または望ましくない成分が欠乏した腎細胞の不均一集団のある特定の副分画を使用して、試験薬剤をスクリーニングする方法を企図する。本発明は、さらに、生物活性成分が濃縮され、不活性または望ましくない成分が欠乏した腎細胞の不均一集団のある特定の副分画を含むオルガノイドをさらに企図する。例えば、不活性または望ましくない成分、例えば、Ｂ１およびＢ５が欠乏した、本発明の生物活性成分、例えば、Ｂ２、Ｂ４、およびＢ３は、単独に、または混合されて、薬物スクリーニングにおける予想外の改善を提供する。不活性または望ましくない成分、例えば、Ｂ１およびＢ５が欠乏した、本発明の生物活性成分、例えば、Ｂ２、Ｂ４、およびＢ３を含む、および／またはそれらから形成されるオルガノイドは、単独に、または混合されて、生物活性成分のｉｎ ｖｉｖｏでの可能性のある再生生物活性（すなわち有効性）を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性アッセイにおいて驚異的に有用である。
一態様において、本発明は、１つ以上の細胞型、例えば、血管、内分泌、または内皮細胞が欠乏または不足した特定の副分画Ｂ４を使用して、試験薬剤をスクリーニングする方法を提供し、すなわち、Ｂ４’は、単独で、または他の生物活性副分画、例えば、Ｂ２および／もしくはＢ３と混合された場合に、治療特性、例えば、腎機能の安定化および／または改善および／または再生を保持する。好ましい実施形態において、生物活性細胞集団は、Ｂ２である。ある特定の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、Ｂ４またはＢ４’と混合される。他の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、Ｂ３と混合される。他の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、Ｂ３およびＢ４の両方、またはＢ３および／もしくはＢ４の特定の細胞成分と混合される。
Ｂ２細胞集団は、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバーＲＡＳ腫瘍遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリー９（ナトリウム／水素交換体）、メンバー４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ３ファミリー、メンバーＢ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＡ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）、ならびに集合管マーカーアクアポリン−４（Ａｑｐ４）のうちの１つ以上からなる群から選択される尿細管細胞マーカーの発現を特徴とする。Ｂ２は、Ｂ３および／またはＢ４よりも大きく、より粒状であり、したがって、約１．０４５ｇ／ｍｌから約１．０６３ｇ／ｍｌの間（げっ歯類）、約１．０４５ｇ／ｍｌから１．０５２ｇ／ｍｌの間（ヒト）、および約１．０４５ｇ／ｍｌから約１．０５８ｇ／ｍｌの間（イヌ）の浮遊密度を有する。
Ｂ３細胞集団は、いくつかのＥＰＯ産生細胞を有する血管、糸球体および近位尿細管マーカーの発現を特徴とし、Ｂ２およびＢ４と比較して中間のサイズおよび粒度であり、したがって、約１．０６３ｇ／ｍｌから約１．０７３ｇ／ｍｌの間（げっ歯類）、約１．０５２ｇ／ｍｌから約１．０６３ｇ／ｍｌの間（ヒト）、および約１．０５８ｇ／ｍｌから約１．０６３ｇ／ｍｌの間（イヌ）の浮遊密度を有する。Ｂ３は、アクアポリン７（Ａｑｐ７）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子２（Ｆｘｙｄ２）、溶質輸送体ファミリー１７（リン酸ナトリウム）、メンバー３（Ｓｌｃ１７ａ３）、溶質輸送体ファミリー３、メンバー１（Ｓｌｃ３ａ１）、クローディン２（Ｃｌｄｎ２）、ナプシンＡアスパラギン酸ペプチダーゼ（Ｎａｐｓａ）、溶質輸送体ファミリー２（促進されたグルコース輸送体）、メンバー２（Ｓｌｃ２ａ２）、アラニル（膜）アミノペプチダーゼ（Ａｎｐｅｐ）、膜貫通タンパク質２７（Ｔｍｅｍ２７）、アシル−ＣｏＡシンセターゼ中間鎖ファミリーメンバー２（Ａｃｓｍ２）、グルタチオンペルオキシダーゼ３（Ｇｐｘ３）、フルクトース−１，６−ビホスファターゼ１（Ｆｂｐ１）、およびアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ２（Ａｇｘｔ２）のうちの１つ以上からなる群から選択される。Ｂ３はまた、血管発現マーカーである血小板内皮細胞接着分子（Ｐｅｃａｍ）および糸球体発現マーカーであるポドシン（Ｐｏｄｎ）を特徴とする。
Ｂ４細胞集団は、ＰＥＣＡＭ、ＶＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、ＣＤ３１、ＣＤ１４６のうちの１つ以上を含有する血管マーカーセット、ポドシン（Ｐｏｄｎ）およびネフリン（Ｎｅｐｈ）のうちの１つ以上を含有する糸球体マーカーセット、ならびに非分画（ＵＮＦＸ）、Ｂ２およびＢ３と比較して酸素調整可能なＥＰＯ濃縮集団を特徴とする。Ｂ４はまた、以下のマーカーのうちの１つ以上の発現を特徴とする：ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（Ｃｘｃｒ４）、エンドセリン受容体Ｂ型（Ｅｄｎｒｂ）、コラーゲン、Ｖ型、アルファ２（Ｃｏｌ５ａ２）、カドヘリン５（Ｃｄｈ５）、プラスミノーゲン活性化因子、組織（Ｐｌａｔ）、アンジオポイエチン２（Ａｎｇｐｔ２）、キナーゼ挿入ドメインタンパク質受容体（Ｋｄｒ）、分泌タンパク質、酸性、高システイン（オステオネクチン）（Ｓｐａｒｃ）、セルグリシン（Ｓｒｇｎ）、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤３（Ｔｉｍｐ３）、ウィルムス腫瘍１（Ｗｔ１）、ウィングレス型ＭＭＴＶ統合部位ファミリー、メンバー４（Ｗｎｔ４）、Ｇタンパク質シグナル伝達の制御因子４（Ｒｇｓ４）、血小板内皮細胞接着分子（Ｐｅｃａｍ）、およびエリスロポエチン（Ｅｐｏ）。Ｂ４はまた、約１．０７３ｇ／ｍｌから約１．０９１ｇ／ｍｌの間（げっ歯類）、約１．０６３ｇ／ｍｌから約１．０９１ｇ／ｍＬの間（ヒトおよびイヌ）の浮遊密度を有する、Ｂ２またはＢ３と比較してより小さい、より粒状でない細胞を特徴とする。
Ｂ４’細胞集団は、１．０６３ｇ／ｍＬから１．０９１ｇ／ｍＬの間の浮遊密度を有し、以下のマーカーのうちの１つ以上を発現するものとして定義される：ＰＥＣＡＭ、ｖＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、ポドシン、ネフリン、ＥＰＯ、ＣＫ７、ＣＫ８／１８／１９。一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、ＰＥＣＡＭ、ｖＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、ＣＤ３１、ＣＤ１４６のうちの１つ以上を含有する血管マーカーセットの発現を特徴とする。別の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、内分泌マーカーＥＰＯの発現を特徴とする。一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、ポドシン（Ｐｏｄｎ）およびネフリン（Ｎｅｐｈ）のうちの１つ以上を含有する糸球体マーカーセットの発現を特徴とする。ある特定の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、ＰＥＣＡＭ、ｖＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａのうちの１つ以上を含有する血管マーカーセットの発現、および内分泌マーカーＥＰＯの発現を特徴とする。別の実施形態において、Ｂ４’はまた、約１．０７３ｇ／ｍｌから約１．０９１ｇ／ｍｌの間（げっ歯類）、約１．０６３ｇ／ｍｌから約１．０９１ｇ／ｍＬの間（ヒトおよびイヌ）の浮遊密度を有する、Ｂ２またはＢ３と比較してより小さい、より粒状でない細胞を特徴とする。
一態様において、本発明は、１．０６３ｇ／ｍＬから１．０９１ｇ／ｍＬの間の密度を有するエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、血管細胞、および糸球体細胞のうちの少なくとも１つを含む、ヒト腎細胞の単離された濃縮Ｂ４’集団を使用して、試験薬剤をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。ある特定の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。いくつかの実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、酸素調整可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現が可能である。
一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、１．０４５ｇ／ｍＬから１．０５２ｇ／ｍＬの間の密度を有する尿細管細胞を含むＢ２細胞集団を含まない。別の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団を含まない。さらに別の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、１．０９１ｇ／ｍｌを超える密度を有する低い粒度および生存能力の小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない。
一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、１．０４５ｇ／ｍＬから１．０５２ｇ／ｍＬの間の密度を有する尿細管細胞を含むＢ２細胞集団；１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団；ならびに１．０９１ｇ／ｍｌを超える密度を有する低い粒度および生存能力の残屑および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない。いくつかの実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、腎臓疾患を有する対象から得られてもよい。
一態様において、本発明は、１．０４５ｇ／ｍＬから１．０５２ｇ／ｍＬの間の密度を有する尿細管細胞の単離された濃縮集団を含む第１の細胞集団Ｂ２と、約１．０６３ｇ／ｍＬから１．０９１ｇ／ｍＬの間の密度を有する、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞および血管細胞を含むが糸球体細胞が欠乏した第２の細胞集団Ｂ４’とを含む、ヒト腎細胞の混合体を使用して、試験薬剤をスクリーニングする方法を提供し、混合体は、１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍｌを超える密度を有する低い粒度および生存能力の残屑および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない。ある特定の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。ある特定の実施形態において、Ｂ２は、集合管上皮細胞をさらに含む。一実施形態において、細胞の混合体は、受容体媒介アルブミン取り込みが可能である。別の実施形態において、細胞の混合体は、酸素調整可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現が可能である。一実施形態において、混合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ およびｉｎ ｖｉｖｏの両方でヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種を産生および／またはその産生を刺激することができる、ＨＡＳ−２発現細胞を含有する。全ての実施形態において、第１および第２の細胞集団は、腎臓組織または培養腎臓細胞から得られてもよい。
別の態様において、本発明は、細胞分画または濃縮細胞集団（例えば、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４（またはＢ４’）、およびＢ５）の組み合わせを含む不均一腎細胞集団を使用して、試験薬剤をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態において、組み合わせは、約１．０４５ｇ／ｍｌから約１．０９１ｇ／ｍｌの間の浮遊密度を有する。他の一実施形態において、組み合わせは、約１．０４５ｇ／ｍｌ未満から約１．０９９ｇ／ｍｌまたは約１．１００ｇ／ｍｌの間の浮遊密度を有する。別の実施形態において、組み合わせは、密度勾配による分離、例えば遠心分離により決定される浮遊密度を有する。さらに別の実施形態において、細胞分画の組み合わせは、Ｂ１および／またはＢ５が欠乏したＢ２、Ｂ３、およびＢ４（またはＢ４’）を含有する。いくつかの実施形態において、細胞分画の組み合わせは、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４（またはＢ４’）およびＢ５を含有するが、Ｂ１が欠乏している。Ｂ１および／またはＢ５が欠乏したら、組み合わせはその後、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４（またはＢ４’）細胞分画の組み合わせを使用した薬物スクリーニングアッセイの準備の前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されてもよい。
本発明の発明者らは、驚くべきことに、Ｂ１が欠乏したＢ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ５の組み合わせのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養が、Ｂ５の欠乏をもたらすことを発見した。一実施形態において、Ｂ５は、少なくとも１回、２回、３回、４回または５回の継代後に欠乏する。他の一実施形態において、本明細書に記載の条件下で継代されたＢ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ５細胞分画の組み合わせは、継代細胞集団の約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または約０．５％未満のパーセンテージのＢ５を有する継代細胞集団を提供する。
別の実施形態において、Ｂ４’は、細胞分画の組み合わせの一部である。他の一実施形態において、Ｂ５のｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養欠乏は、低酸素条件下である。
一実施形態において、混合体は、ｉｎ ｖｉｖｏ 送達時に再生刺激を提供することができる。他の実施形態において、混合体は、ｉｎ ｖｉｖｏ送達時に、糸球体濾過、尿細管再吸収、尿産生、および／または内分泌機能の低下を低減する、それらを安定化する、または改善することができる。
一態様において、本発明は、１．０６３ｇ／ｍＬから１．０９１ｇ／ｍＬの間の密度を有するエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、血管細胞、および糸球体細胞のうちの少なくとも１つを含む、ヒト腎細胞の単離された濃縮Ｂ４’集団を使用して、試験薬剤をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。ある特定の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。発現されない糸球体マーカーは、ポドシンであってもよい（実施例７を参照されたい）。いくつかの実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、酸素調整可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現が可能である。
一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、１．０４５ｇ／ｍＬから１．０５２ｇ／ｍＬの間の密度を有する尿細管細胞を含むＢ２細胞集団を含まない。別の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団を含まない。さらに別の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、１．０９１ｇ／ｍｌを超える密度を有する低い粒度および生存能力の残屑および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない。
一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、１．０４５ｇ／ｍＬから１．０５２ｇ／ｍＬの間の密度を有する尿細管細胞を含むＢ２細胞集団；１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団；ならびに１．０９１ｇ／ｍｌを超える密度を有する低い粒度および生存能力の残屑および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない。
いくつかの実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、腎臓疾患を有する対象から得られてもよい。一態様において、本発明は、１．０４５ｇ／ｍＬから１．０５２ｇ／ｍＬの間の密度を有する尿細管細胞の単離された濃縮集団を含む第１の細胞集団Ｂ２と、約１．０６３ｇ／ｍＬから１．０９１ｇ／ｍＬの間の密度を有する、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞および血管細胞を含むが糸球体細胞が欠乏した第２の細胞集団Ｂ４’とを含む、ヒト腎細胞の混合体を使用して、試験薬剤をスクリーニングする方法を提供し、混合体は、１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍｌを超える密度を有する低い粒度および生存能力の残屑および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない。ある特定の実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。ある特定の実施形態において、Ｂ２は、集合管上皮細胞をさらに含む。一実施形態において、細胞の混合体は、受容体媒介アルブミン取り込みが可能である。別の実施形態において、細胞の混合体は、酸素調整可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現が可能である。一実施形態において、混合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ およびｉｎ ｖｉｖｏの両方でヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種を産生および／またはその産生を刺激することができる、ＨＡＳ−２発現細胞を含有する。全ての実施形態において、第１および第２の細胞集団は、腎臓組織または培養腎臓細胞から得られてもよい。
一実施形態において、混合体は、ｉｎ ｖｉｖｏ 送達時に再生刺激を提供することができる。他の実施形態において、混合体は、ｉｎ ｖｉｖｏ送達時に、糸球体濾過、尿細管再吸収、尿産生、および／または内分泌機能の低下を低減する、それらを安定化する、または改善することができる。一実施形態において、Ｂ４’細胞集団は、腎臓疾患を有する対象から得られる。
好ましい実施形態において、混合体は、Ｂ３および／またはＢ４と組み合わせたＢ２を含む。別の好ましい実施形態において、混合体は、Ｂ３および／またはＢ４’と組み合わせたＢ２を含む。他の好ましい実施形態において、混合体は、（ｉ）Ｂ３および／もしくはＢ４と組み合わせたＢ２、または（ｉｉ）Ｂ３および／もしくはＢ４’と組み合わせたＢ２からなる、または本質的にそれらからなる。
Ｂ４’細胞集団を含有する混合体は、Ｂ２および／またはＢ３細胞集団を含有し得、これらも非健常対象から得られる。非健常対象は、Ｂ４’分画が得られた同じ対象であってもよい。Ｂ４’細胞集団とは異なり、非健常対象から得られたＢ２およびＢ３細胞集団は、典型的には、健常個体から得られた出発腎細胞集団と比較して、１つ以上の特定の細胞型が不足していない。
ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８に記載のように、Ｂ２およびＢ４細胞調製物は、Ｂ２細胞集団においてより特異的に濃縮されるマーカーであるヒアルロン酸シンターゼ−２（ＨＡＳ−２）の作用により、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、ヒアルロン酸（ＨＡ）のより高分子量の種を発現することができる。５／６ＮｘモデルにおけるＢ２での処置は、ｉｎ ｖｉｖｏで、強い発現ＨＡＳ−２発現、および処理された組織内での高分子量ＨＡの予測された産生と共に、線維症を低減することが示された。とりわけ、未処置とされた５／６Ｎｘモデルは線維症となり、ＨＡＳ−２の検出は限られ、高分子量ＨＡの産生は極僅かであった。理論に束縛されることを望まないが、主にＢ２により（およびある程度はＢ４により）産生されたこのＨＡの抗炎症性高分子量種は、腎線維症の低減および腎臓再生の補助において、細胞調製物と相乗的に作用すると仮定されている。したがって、本発明の方法は、ヒアルロン酸を含む生体材料における本発明の細胞原型の使用を含む。また、移植された細胞による直接的な産生または産生の刺激を介した再生刺激のための生体材料成分の提供が、本発明により企図される。
別の態様において、本発明は、濃縮された部分集団内のＥＰＯ産生細胞の割合が、出発または初期細胞集団内のＥＰＯ産生細胞の割合に比べてより高くなるようにさらに濃縮されたエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生腎細胞の単離された集団を使用して、試験薬剤をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態において、濃縮ＥＰＯ産生細胞分画は、非濃縮初期集団に含有される間質線維芽細胞および尿細管細胞に比べて、より高い割合の間質線維芽細胞およびより低い割合の尿細管細胞を含有する。ある特定の実施形態において、濃縮ＥＰＯ産生細胞分画は、非濃縮初期集団に含有される糸球体細胞、血管細胞および集合管細胞に比べて、より高い割合の糸球体細胞および血管細胞ならびにより低い割合の集合管細胞を含有する。そのような実施形態において、これらの集団は、本明細書において「Ｂ４」細胞集団と呼ばれる。
別の態様において、本発明は、１つ以上の追加の腎細胞集団と混合されたＥＰＯ産生腎細胞集団を使用して、試験薬剤をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態において、ＥＰＯ産生細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞が濃縮された第１の細胞集団、例えばＢ４である。別の実施形態において、ＥＰＯ産生細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞が濃縮されていない第１の細胞集団、例えばＢ２である。別の実施形態において、第１の細胞集団は、第２の腎細胞集団と混合される。いくつかの実施形態において、第２の細胞集団は、尿細管細胞が濃縮され、これは、尿細管細胞表現型の存在により実証され得る。別の実施形態において、尿細管細胞表現型は、１つの尿細管細胞マーカーの存在により標示され得る。別の実施形態において、尿細管細胞表現型は、１つ以上の尿細管細胞マーカーの存在により標示され得る。尿細管細胞マーカーは、限定されないが、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバーＲＡＳ腫瘍遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリー９（ナトリウム／水素交換体）、メンバー４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ３ファミリー、メンバーＢ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＡ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）を含む。別の実施形態において、第１の細胞集団は、限定されないが、間質由来細胞、尿細管細胞、集合管由来細胞、糸球体由来細胞、および／または血液もしくは血管から得られる細胞のいくつかの種類のうちの少なくとも１つと混合される。ＥＰＯ産生腎細胞集団は、Ｂ２および／もしくはＢ３との混合体の形態で、または濃縮細胞集団の形態で、例えばＢ２＋Ｂ３＋Ｂ４／Ｂ４’の形態でＢ４またはＢ４’を含有してもよい。
一態様において、本発明の方法において使用されるＥＰＯ産生腎細胞集団は、ＥＰＯ発現、および培養系の酸素圧の低減がＥＰＯの発現の誘導をもたらすような酸素への生体反応を特徴とする。一実施形態において、ＥＰＯ産生細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞が濃縮されている。一実施形態において、ＥＰＯ発現は、通常大気（約２１％）レベルの利用可能な酸素で培養された細胞集団と比較して、細胞が培養系内の利用可能な酸素レベルの低減に供される条件下で細胞集団が培養される場合に誘導される。一実施形態において、より低い酸素条件で培養されたＥＰＯ産生細胞は、通常酸素条件下で培養されたＥＰＯ産生細胞に比べてより高いレベルのＥＰＯを発現する。一般に、低減されたレベルの利用可能な酸素（低酸素培養条件とも呼ばれる）での細胞培養は、通常大気レベルの利用可能な酸素（通常または通常酸素培養条件とも呼ばれる）での細胞培養に比べて、低減される酸素のレベルが低減されることを意味する。一実施形態において、低酸素細胞培養条件は、約１％未満の酸素、約２％未満の酸素、約３％未満の酸素、約４％未満の酸素、または約５％未満の酸素での細胞培養を含む。別の実施形態において、通常または通常酸素培養条件は、約１０％の酸素、約１２％の酸素、約１３％の酸素、約１４％の酸素、約１５％の酸素、約１６％の酸素、約１７％の酸素、約１８％の酸素、約１９％の酸素、約２０％の酸素、または約２１％の酸素での細胞培養を含む。
他の一実施形態において、約５％未満の利用可能な酸素で細胞を培養し、ＥＰＯ発現レベルを大気（約２１％）酸素で培養された細胞と比較することにより、ＥＰＯの誘導または発現の増加が得られ、観察され得る。別の実施形態において、ＥＰＯの誘導は、細胞の培養物が大気酸素（約２１％）である程度の期間培養される第１の培養段階と、利用可能な酸素レベルが低減され、同じ細胞が約５％未満の利用可能な酸素で培養される第２の培養段階とを含む方法により、ＥＰＯを発現可能な細胞の培養において得られる。別の実施形態において、低酸素条件に応答するＥＰＯ発現は、ＨＩＦ１αにより制御される。当業者には、当該技術分野において知られている他の酸素操作培養条件が、本明細書に記載の細胞に対して使用され得ることが理解される。
一態様において、本発明の方法において使用されるＥＰＯ産生哺乳動物細胞の濃縮集団は、かん流条件に対する生体反応（例えばＥＰＯ発現）を特徴とする。一実施形態において、かん流条件は、一時的、断続的、または連続的流体流動（かん流）を含む。一実施形態において、ＥＰＯ発現は、動的な力が流動を介して細胞に伝達されるような様式で、細胞が培養されている培地が断続的または連続的に循環または撹拌されている場合、機械的に誘導される。一実施形態において、一時的、断続的、または連続的流体流動に供された細胞は、三次元構造が形成するためのフレームワークおよび／または空間を提供する材料の中または上に、そのような三次元構造として存在するような様式で培養される。一実施形態において、細胞は、多孔質ビーズ上で培養され、揺動プラットフォーム、軌道プラットフォーム、またはスピナーフラスコを用いた断続的または連続的流体流動に供される。別の実施形態において、細胞は、三次元骨格上で培養されてデバイス内に設置され、骨格が固定され、流体が骨格を通して、または横切ってある方向に流動する。当業者には、当該技術分野において知られている他のかん流培養条件が、本明細書に記載の細胞に対して使用され得ることが理解される。
不活性細胞集団
本明細書に記載のように、本発明は、１つには、生物活性成分が濃縮され、不活性または望ましくない成分が欠乏した腎細胞の不均一集団のある特定の副分画が、出発集団よりも優れた治療および再生結果を提供し、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏまたは臨床毒性および効用をより正確に予測するための薬物スクリーニングの基盤を提供するという驚くべき発見に基づく。好ましい実施形態において、本発明の細胞集団は、Ｂ１および／またはＢ５細胞集団が欠乏している。例えば、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４’の２つ以上の混合体、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４’の濃縮細胞集団は、Ｂ１および／またはＢ５が欠乏していてもよい。
Ｂ１細胞集団は、集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含み、集団の細胞は、約１．０４５ｇ／ｍ未満の浮遊密度を有する。Ｂ５細胞集団は、約１．０９１ｇ／ｍｌを超える浮遊密度を有する低い粒度および生存能力の残屑および小細胞を含む。
細胞集団を単離および培養する方法
一態様において、本発明は、腎臓組織から単離および／または培養された細胞集団を使用して試験薬剤をスクリーニングする方法を提供する。別の態様において、本発明は、腎臓組織から単離および／または培養された細胞集団を含む、および／またはそれから形成されるオルガノイド、ならびに本発明のオルガノイドを形成する方法および使用する方法を提供する。本明細書において、腎細胞成分、例えば、スクリーニングアッセイにおいて使用される濃縮細胞集団を分離および単離するための方法が提供される。一実施形態において、細胞集団は、新しく分解された、すなわち機械的もしくは酵素的に分解された腎臓組織から、または哺乳動物腎細胞の不均一ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物から単離される。
一態様において、本発明は、Ｂ４’を含むＢ４、ならびにＢ２および／またはＢ３分画の両方における細胞の向上した分布および組成を提供する、密度勾配による分離前に、低酸素培養条件下で培養された腎細胞の不均一混合物を使用して、試験薬剤をスクリーニングする方法を提供する。Ｂ２からのＢ４における酸素依存性細胞の濃縮は、疾患および非疾患腎臓の両方から単離された腎細胞において観察された。理論に束縛されることを望まないが、これは、以下の現象のうちの１つ以上に起因し得る：１）低酸素培養期間中の特定細胞成分の選択的生存、死滅、または増殖；２）低酸素培養に応じた細胞粒度および／またはサイズの改変と、それによりもたらされる密度勾配分離中の浮遊密度およびその後の局所化の改変；ならびに３）低酸素培養期間に応じた細胞遺伝子／タンパク質発現における改変と、その結果として生じる勾配の所与の分画内での細胞の差次的特性。したがって、一実施形態において、尿細管細胞が濃縮された細胞集団、例えばＢ２は、低酸素耐性である。
本発明の細胞集団を分離および単離するための例となる技術は、対象集団内に含有される異なる細胞型の異なる比重に基づく密度勾配による分離を含む。所与の細胞型の比重は、細胞内の粒度、細胞内水分量、および他の因子により影響され得る。一実施形態において、本明細書に記載のような最適勾配条件は、ヒト、イヌおよびげっ歯類を含むがこれらに限定されない複数の種にわたる、本発明の細胞調製物、例えば、Ｂ２およびＢ４’を含むＢ４の単離に使用される。好ましい実施形態において、密度勾配が、腎細胞の不均一集団から得られる、尿細管細胞分画の新規濃縮集団、すなわち、Ｂ２細胞集団を得るために使用される。一実施形態において、密度勾配が、腎細胞の不均一集団から得られる、ＥＰＯ産生細胞分画の新規濃縮集団、すなわち、Ｂ４細胞集団を得るために使用される。他の実施形態において、密度勾配が、腎臓の尿細管細胞、糸球体細胞、および内皮細胞の濃縮部分集団を得るために使用される。一実施形態において、ＥＰＯ産生および尿細管細胞の両方が、赤血球および細胞残屑から分離される。一実施形態において、ＥＰＯ産生、糸球体、および血管細胞が、他の細胞型から、ならびに赤血球および細胞残屑から分離され、一方、尿細管細胞および集合管細胞の部分集合が、他の細胞型から、ならびに赤血球および細胞残屑から同時に分離される。他の一実施形態において、内分泌、糸球体、および／または血管細胞が、他の細胞型から、ならびに赤血球および細胞残屑から分離され、一方、尿細管細胞および集合管細胞の部分集合が、他の細胞型から、ならびに赤血球および細胞残屑から同時に分離される。
一態様において、本発明の方法は、以下に記載のある特定の重要な特性に基づき、水中の６０％非イオン性ヨード化合物イオジキサノールを含むＯＰＴＩＰＲＥＰ（登録商標）（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）密度勾配培地を一部使用することにより生成された細胞集団を使用する。しかしながら、当業者には、本発明の細胞集団を単離するために必要な特性を備える、任意の密度勾配または他の手段、例えば、当該技術分野において知られた細胞表面マーカーを使用した免疫学的分離が、本発明に従い使用されてもよいことが認識される。また、当業者には、密度勾配（サイズおよび粒度）による細胞部分集団の分離に寄与する同じ細胞特性が、フローサイトメトリーにより細胞部分集団を分離するために利用され得る（前方散乱＝フローサイトメトリーによるサイズの反映、側方散乱＝粒度の反映）。重要なことに、密度勾配培地は、特定の対象細胞に対する低い毒性を有するべきである。密度勾配培地は、特定の対象細胞に対する低い毒性を有するべきであるが、本発明は、対象細胞の選択プロセスにおける役割を果たす勾配培地の使用を企図する。理論に束縛されることを望まないが、投入ステップと回収ステップとの間で細胞の相当の損失があり、これは勾配の条件下でのイオジキサノールへの暴露が、ある特定の細胞の排除をもたらすことを示唆するため、イオジキサノールを含む勾配により回収された本発明の細胞集団は、イオジキサノール耐性である。イオジキサノール勾配後に特定のバンドに出現する細胞は、イオジキサノールおよび／または密度勾配暴露のいかなる悪影響に対しても耐性である。したがって、本発明はまた、本発明の細胞集団の単離および／または選択における、軽度から中程度の腎毒素である追加的な造影剤の使用を企図する。さらに、密度勾配培地はまた、ヒト血漿中のタンパク質に結合すべきではなく、または対象細胞の重要な特性に悪影響を及ぼすべきではない。
別の態様において、本発明の方法は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した腎細胞型の濃縮および／または欠乏により生成された細胞集団を使用する。一実施形態において、腎細胞型は、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）または同等物を使用して濃縮および／または欠乏させてもよい。
別の態様において、本発明の方法は、磁気細胞選別を使用した腎細胞型の濃縮および／または欠乏により生成された細胞集団を使用する。一実施形態において、腎細胞型は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）システムまたは同等物を使用して濃縮および／または欠乏させてもよい。
別の態様において、本発明の方法は、腎細胞集団の三次元培養により生成された細胞集団を使用する。一実施形態において、細胞集団は、連続かん流により培養される。一実施形態において、三次元培養および連続かん流により培養された細胞集団は、静的に培養された細胞集団と比較して、より高い細胞性および相互接続性を示す。別の実施形態において、三次元培養および連続かん流により培養された細胞集団は、そのような細胞集団の静的培養物と比較して、ＥＰＯのより高い発現、ならびにｅ−カドヘリン等の腎尿細管関連遺伝子の発現の向上を示す。
さらに別の実施形態において、連続かん流により培養された細胞集団は、静的に培養された細胞集団と比較して、より高いレベルのグルコースおよびグルタミン消費を示す。
本明細書に記載のように（実施例３を含む）、本発明の細胞集団を調製するために、低い、または低酸素条件が方法において使用されてもよい。しかしながら、本発明の方法は、低い酸素条件を設定するステップなしに使用され得る。一実施形態において、通常酸素条件が使用されてもよい。
当業者には、当該技術分野において知られている他の単離および培養方法が、本明細書に記載の細胞に対して使用され得ることが理解される。
生体材料（ポリマーマトリックスまたは骨格）
Ｂｅｒｔｒａｍらの米国特許出願公開第２００７０２７６５０７号に記載のように、ポリマーマトリックスまたは骨格は、任意の数の全体的システム、配置または空間制限を満たすために、任意の数の望ましい構成に成形されてもよい。一実施形態において、本発明のマトリックスまたは骨格は、三次元であってもよく、また器官または組織構造の寸法および形状に適合するように成形されてもよい。例えば、薬物スクリーニングにおける使用のためのポリマー骨格の使用において、三次元（３Ｄ）マトリックスが使用されてもよい。様々な異なる形状の３Ｄ骨格が使用され得る。当然ながら、ポリマーマトリックスは、異なるサイズの患者に適合するように異なるサイズおよび形状に成形されてもよい。ポリマーマトリックスはまた、患者の特別な要求に対応するために、他の様式で成形されてもよい。別の実施形態において、ポリマーマトリックスまたは骨格は、生体適合性の多孔質ポリマー骨格であってもよい。骨格は、開放気泡ポリ乳酸（ＯＰＬＡ（登録商標））、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、フッ素化ポリエチレン、フェノール、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾオキサゾール、ポリカーボネート、ポリシアノアリールエーテル、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、ポリフッ化ビニリデン、再生セルロース、シリコーン、尿素−ホルムアルデヒド、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、シルク、エラスチン、アルギネート、ヒアルロン酸、アガロース、またはそれらのコポリマーもしくは物理的ブレンドを含むがこれらに限定されない、様々な合成または自然発生材料から形成され得る。骨格構成は、液体ヒドロゲル懸濁液から、柔軟性多孔質骨格、硬質形状保持多孔質骨格に至るまで、様々となり得る。
ヒドロゲルは、様々なポリマー材料から形成されてもよく、様々な生物医学的用途において有用である。ヒドロゲルは、物理的に、親水性ポリマーの三次元ネットワークとして説明され得る。ヒドロゲルは、その種類に依存して、様々なパーセンテージの水を含有するが、全体として水中に溶解するわけではない。その高い含水率にもかかわらず、ヒドロゲルは、親水性残基の存在に起因して、大量の液体を追加的に結合することができる。ヒドロゲルは、そのゼラチン状構造を変化させることなく広範囲に膨潤する。ヒドロゲルの基本的な物理的特徴は、使用されるポリマーの特性および製品の追加の特別装備に従って、特定的に変更され得る。
好ましくは、ヒドロゲルは、生物学的に不活性で生理学的に哺乳動物組織と適合性である、ポリマー、生物学的に得られた材料、合成的に得られた材料またはそれらの組み合わせで作製される。ヒドロゲル材料は、好ましくは、炎症反応を誘導しない。ヒドロゲルを形成するための使用され得る他の材料の例は、（ａ）改質アルギネート、（ｂ）一価カチオンへの暴露によりゲル化する多糖類（例えば、ジェランガムおよびカラギーナン）、（ｃ）非常に粘凋性またはチキソトロピー性であり、構造の漸進的変化により経時的にゲルを形成する多糖類（例えば、ヒアルロン酸）、ならびに（ｄ）ポリマーヒドロゲル前駆体（例えば、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーおよびタンパク質）を含む。米国特許第６，２２４，８９３Ｂ１号は、本発明によるヒドロゲルの作製に好適な様々なポリマー、およびそのようなポリマーの化学的特性の詳細な説明を提供している。
骨格または生体材料の特性は、細胞が骨格もしくは生体材料に付着および相互作用することを可能にし得、ならびに／または、細胞が捕捉され得る多孔質空間を提供し得る。一実施形態において、本発明の多孔質骨格または生体材料は、多孔質骨格として構成される生体材料上への（例えば、細胞の付着により）、および／または骨格の細孔内への（例えば、細胞の捕捉により）、１つ以上の細胞集団または細胞混合体の付加または堆積を可能にする。別の実施形態において、骨格または生体材料は、骨格内の細胞：細胞および／または細胞：生体材料相互作用を可能にする、または促進し、本明細書に記載のようなコンストラクトを形成する。
一実施形態において、本発明に従い使用される生体材料は、５．１ｋＤＡから２×１０６ｋＤａ超までの範囲のヒアルロン酸（ＨＡ）分子を含有する、ヒドロゲル形態のＨＡを含む。別の実施形態において、本発明に従い使用される生体材料は、同じく５．１ｋＤＡから２×１０６ｋＤａ超までの範囲のＨＡ分子を含有する、多孔質フォーム形態のヒアルロン酸を含む。さらに別の実施形態において、本発明に従い使用される生体材料は、開放気泡構造および約５０ミクロンから約３００ミクロンの細孔サイズを有するポリ乳酸（ＰＬＡ）系フォームを含む。さらに別の実施形態において、特定の細胞集団、優位にはＢ２であるが、さらにはＢ４は、特に腎臓内移植後に、ヒアルロン酸シンターゼ−２（ＨＡＳ−２）により高分子量ヒアルロン酸を直接提供する、および／またはその合成を刺激する。
当業者には、当該技術分野において知られている他の種類の合成または自然発生材料が、本明細書に記載の骨格を形成するために使用され得ることが理解される。
一態様において、本発明は、上で言及された骨格または生体材料から作製された、本明細書に記載のコンストラクトを提供する。
スクリーニング方法
本発明の細胞は、代謝、毒性および効用を含む、試験薬剤のいくつかのパラメータを試験するのに有用である。本発明の方法は、毒性を評価するために必要な情報を含むそのような情報を得るための、代謝または薬物動態プロファイルが知られていない実験薬物または「試験薬剤」のスクリーニングに使用され得る。毒性は、多くの場合、薬物対薬物の相互作用の結果生じ得る。したがって、本発明の方法は、試験薬剤と、既知の薬物または他の試験薬剤との組み合わせを試験するために使用され得る。
多くの薬物および生体異物（例えば、抗生物質、ｐ−アミノ馬尿酸）は、腎臓内で糸球体濾過により効率的に除去することができない。そのような物質は、近位尿細管の細胞により、血流から、尿細管の内腔内を流動する糸球体濾液中に活発に輸送される。有機アニオン輸送体、有機カチオン輸送体および複数薬物抵抗性遺伝子座によりコードされるｐ−糖タンパク質が、そのような経細胞輸送プロセスにおいて大きな役割を果たす。薬物輸送におけるそれらの機能に起因して、近位尿細管細胞は、腎臓内での毒性薬物作用の主な標的であり、同様に、尿細管の他の細胞型も、濾液内の薬物により影響される可能性がある。したがって、新たに開発された薬物の腎毒性効果および尿細管の細胞に対するその効果を評価することが重要である。
したがって、一態様において、本発明は、試験薬剤または化合物、例えば、新規化学物質（ＮＣＥ）のスクリーニングおよび薬理学的プロファイリングのための方法を提供し、細胞またはオルガノイド反応、例えば生理学的反応、および／または細胞もしくはオルガノイドの活性を調節する。本発明は、さらに、本発明の細胞集団を使用して、１つ以上の試験薬剤の腎臓毒性または腎毒性のレベルを決定するための方法を提供する。別の態様において、本発明は、試験薬剤の存在下での、本発明の培養された細胞集団の表現型の変化を評価するための方法を提供する。
Ａ．機能アッセイ
機能アッセイが、試験化合物の存在下での本発明の細胞集団の細胞の健康および生存能力を決定するために使用され得る。ある特定の実施形態において、細胞の健康および生存能力の指標は、細胞複製、ミトコンドリア機能、エネルギーバランス、膜の完全性および細胞死の指標を含むが、これらに限定されない。他の実施形態において、細胞の健康および生存能力の指標は、さらに、酸化ストレス、代謝活性化、代謝安定性、酵素誘導、酵素阻害、および細胞膜輸送体との相互作用の指標を含む。
１．細胞ベース増殖アッセイ
本発明の細胞集団を使用した細胞ベース増殖アッセイは、試験薬剤の細胞増殖活性に対する効果を決定するために使用され得る。一般に、細胞増殖および細胞生存能力アッセイは、細胞が代謝的に活性である場合に検出可能なシグナルを提供するように設計される。
いくつかの増殖アッセイは、標識化ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の、増殖細胞のＤＮＡへの組み込みに基づく。これらのアッセイにおいて、細胞は、候補化合物および標識化ヌクレオチド、例えば、１４Ｃ−チミジン、３Ｈ−チミジン、または５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）に暴露される。増殖は、細胞により取り込まれた標識化ヌクレオチドの量を測定することにより定量される。放射性標識化ヌクレオチドは、放射線検出法により測定することができ、ＢｒｄＵの組み込みを検出するために、抗体が使用され得る。他のアッセイは、個々の細胞内での化学的前駆体の染料への変換に依存する。いくつかのアッセイは、細胞ミトコンドリアデヒドロゲナーゼによる、テトラゾリウム塩（例えば、メチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＷＳＴ−１）、または３’−｛１−［（フェニルアミノ）−カルボニル］−３，４−テトラゾリウム｝−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼン−スルホン酸水和物（ＸＴＴ））のホルマザンへの変換を測定する。ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性は、増殖細胞において増加し、それによりホルマザン染料の量を増加させる。吸光度により測定されるホルマザン染料の量は、増殖の指標である。さらに他のアッセイは、ＡＴＰ産生の関数として細胞増殖を測定する。例えば、ルシフェラーゼ酵素は、基質ルシフェリンを使用して生物発光反応を触媒する。細胞の試料により生成される生物発光の量は、試料中に存在するＡＴＰの量の目安であり、これは細胞数の指標である。いくつかの細胞増殖アッセイ、例えば軟寒天コロニー形成アッセイは、候補化合物の存在下でいくつかの創始細胞により産生された細胞の数を直接測定する。さらに、試薬およびプロトコルを含む市販のキットが、例えばＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、およびＴｒｅｖｉｇｅｎ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）から入手可能である。
２．細胞移動アッセイ
細胞が化学的刺激に暴露された場合、その挙動は、特に治療候補およびその有効性を開発および評価する場合に重要な考慮点である。治療試験薬剤等の化学的刺激に対する細胞または細胞群の反応を文書化することにより、化学的刺激の有効性をより良く理解することができる。
創傷閉鎖に関連した細胞移動に対する薬物および薬物候補の効果を評価するために、引っ掻きアッセイまたは類似の代替法が一般に使用される。典型的な引っ掻きアッセイにおいて、細胞は、複数ウェルプレート内でコンフルエントとなるように播種される。単一の引っ掻き傷が各ウェルに形成される。次いで、プレートが一定の時間間隔で撮像される。引っ掻き傷の領域における細胞数を定量して、薬理学的薬剤の存在下での創傷閉鎖の特性を評価することができる。試薬およびプロトコルを含む市販のキットが、例えば、Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）から利用可能である。
３．ＧＧＴアッセイ
尿細管細胞マーカーであるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ１）は、グルタチオン（ＧＳＨ）の合成および分解、ならびに薬物および生体異物解毒の経路である、ガンマ−グルタミルサイクルにおいて重要な役割を果たすことが示されている。Ｓｉｅｓｔ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３ （１２）：２５２７−２５３３。典型的なＧＧＴアッセイは、ＧＧＴ１によるニトロアニリン産生を測定するものであり、試験化合物の存在下での本発明の細胞集団の機能的特性を決定するために有用である。ＧＧＴ１を使用した機能的アッセイは、当該技術分野において、例えば、Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０ Ｎｏｖ；２９９（５）：Ｆ１０２６−３９において周知である。
４．アルブミン取り込みアッセイ
アルブミン取り込みの測定は、試験化合物の存在下で本発明の細胞の機能的特性を決定するために使用され得る。アルブミン取り込みアッセイは、文献において、例えばＫｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０ Ｎｏｖ；２９９（５）：Ｆ１０２６−３９において、および以下の実施例１０において記載されている。
５．ＬＡＰアッセイ
他の実施形態において、腎損傷の診断薬としてのバイオマーカーの検出は、ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）の検出を含む。尿細管酵素であるＬＡＰは、損傷した近位および／または遠位尿細管細胞から放出される。
Ｂ．試験薬剤の腎毒性の決定
一実施形態において、本発明は、Ｂ２細胞集団であって、尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団を含む不均一腎細胞集団を、試験化合物と接触させることと、腎毒性の指標のレベルであって、腎毒性を示す指標のレベルを決定することとを含む、試験薬剤または化合物の腎毒性を決定する方法を提供する。
ある特定の実施形態において、細胞集団は、Ｂ２細胞集団を含み、Ｂ２細胞集団は、尿細管細胞の濃縮集団を含み、Ｂ１細胞集団および／またはＢ５細胞集団が欠乏している。
ミトコンドリア機能または細胞エネルギーバランスを改変する化合物は、最終的に細胞死を引き起こす。したがって、ミトコンドリア機能およびエネルギーバランスに対する試験化合物の効果を監視することが重要である。３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８３； Ｈｕｖｅｎｅｅｒｓ−Ｏｏｒｓｐｒｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９７）およびＡｌａｍａｒブルー（ＡＢ）（Ｇｏｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）等のテトラゾリウム染料の、分光測光または蛍光分析により検出可能な発色団への還元は、細胞生存能力の指標として広範囲に使用されている。したがって、一実施形態において、ＭＴＴのレベルが、腎臓毒性のレベルの決定において測定される。
本発明の他の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ腎毒性の指標は、細胞死の目安である。試験化合物の腎毒性効果は、タンパク質合成の阻害、ミトコンドリア傷害、およびＤＮＡ損傷を含むいくつかの可能な機序により生じ得る。これらの細胞傷害は、最終的に、プログラムされた細胞死経路およびアポトーシスの活性化をもたらす。したがって、本発明との使用に好適なｉｎ ｖｉｔｒｏ腎毒性の指標は、アポトーシスの指標である。アポトーシスの指標は、細胞収縮、核凝縮、およびヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化からなる明確な形態学的変化により特性決定され得る。
好ましくは、一実施形態において、腎毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ指標は、アポトーシスの生化学的指標である。例えば、アポトーシスの生化学的指標は、カスパーゼ８活性を監視することができ、これは、ＦａｓおよびＴＮＦＲ１等の内在性膜死受容体を介して受容されたアポトーシス刺激から主に誘導される。
別の実施形態において、ミトコンドリアから開始されたアポトーシスの生化学的指標、例えばカスパーゼ９活性またはシトクロムＣ放出が分析され得る。代替的に、単一経路からのアポトーシスを監視するのではなく、具体的実施形態は、異なるアポトーシス経路の共通のエフェクター、例えばカスパーゼ−３活性を監視する。当該技術分野において、活性化されると、カスパーゼ８および９の両方が、いくつかの基質を切断して染色体ＤＮＡ断片化およびアポトーシスの細胞形態変化特性をもたらす、カスパーゼ３の活性化に至るカスケードに関与することが確立されている。したがって、当業者には、腎毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ指標がカスパーゼ−３活性を監視する場合、事実上、全てのアポトーシス経路が監視されていることが理解される。
一実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ腎毒性の指標は、アポトーシスの形態学的または生化学的指標である。具体的実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ腎毒性の指標は、シトクロムＣオキシダーゼ活性およびカスパーゼ活性等のアポトーシスの生化学的マーカーである。
より具体的な実施形態において、腎毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ指標としての使用のためのカスパーゼ活性は、カスパーゼ−９活性、カスパーゼ−８活性、カスパーゼ−７活性、およびカスパーゼ−３活性からなる群から選択される。別の実施形態において、カスパーゼ−９活性、カスパーゼ−８活性、カスパーゼ−７活性、およびカスパーゼ−３活性からなる群から選択される１つ以上のカスパーゼの活性が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ腎毒性の指標として使用される。さらなるより具体的な実施形態において、腎毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ指標は、カスパーゼ−３活性である。
関連した実施形態において、カスパーゼ活性は、条件的に活性化されたルシフェラーゼ基質を使用して決定され、そこでは、ルシフェラーゼ基質のカスパーゼ切断は、基質をルシフェラーゼに対して利用可能とする。具体的実施形態において、ルシフェラーゼ基質は、カスパーゼ−３活性の測定に特異的である。そのようなアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ社によりＣＡＳＰＡＳＥＧＬＯの名称で提供されており、これは、発光に基づくカスパーゼ活性の監視のための市販のアッセイキットである。
当業者には、当該技術分野において知られている、アポトーシスにおいて活性化される多くの他の酵素が、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ腎毒性アッセイにおける腎毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ指標としての使用に同等に好適であることが理解される。
糖化最終産物の受容体（ＲＡＧＥ）もまた、試験薬剤の毒性の決定に使用され得る。ＲＡＧＥを決定するためのアッセイは、例えば、ＡｂＣＡＭ社（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）からのＲＡＧＥ Ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ−１×９６ Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ（ａｂ１００６３２）およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）からのＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＲＡＧＥ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ等、市販されている。
ＣＹＰ４５０を含む複数の腎臓酵素系による薬物の生体内変換は、毒性代謝物および活性酸素種（ＲＯＳ）の形成をもたらし、したがって、核酸アルキル化または酸化、タンパク質損傷、脂質過酸化、およびＤＮＡ鎖切断による、酸化ストレスおよび結果的な腎損傷の増加をもたらす（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ＢＳ，Ｓｃｈｎｅｌｌｍａｎｎ ＲＧ：Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃ ｃｅｌｌ ｉｎｊｕｒｙ。Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ Ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ Ｔｒａｃｔ，Ｓｃｈｒｉｅｒ ＲＷ編，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，２００１，ｐｐ １０７１−１１３６；Ｋａｌｏｙａｎｉｄｅｓ ＧＪ，Ｂｏｓｍａｎｓ Ｊ−Ｌ，ＤｅＢｒｏｅ ＭＥ：Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ。Ｓｃｈｒｉｅｒ ＲＷ （ｅｄ）：Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ Ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ Ｔｒａｃｔ，Ｓｃｈｒｉｅｒ ＲＷ編，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，２００１，ｐｐ １１３７−１１７４；およびＡｌｅｋｓａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２０：８７２− ８８５，２００５。） 活性酸素種（ＲＯＳ）の産生による組織損傷は、不対電子を有する極めて反応性の化学種が、内因的に、および親化学種の代謝により産生される両方の場合において生じる。生物学的に最も有意なフリーラジカル種は、スーパーオキシドフリーラジカルアニオン（Ｏ’２．−）、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ）、および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。これらのＲＯＳの細胞標的は、タンパク質、リン脂質（極めて反応性のアルデヒド分子）、およびＤＮＡである。これらの相互作用の結果は、膜損傷、酵素機能不全、およびＤＮＡのヒドロキシル化であり、これは突然変異をもたらし得る。また、酸化ストレスは、化学種が直接的な求電子剤であるか、または求電子的物質に代謝される場合に生じ得る。求電子剤は、グルタチオン（ＧＳＨ）およびビタミンＥ等の細胞酸化防止剤を欠乏させることにより間接的に酸化損傷を生成し得る。欠乏すると、細胞は、内因的に産生されたＲＯＳからの酸化損傷を大幅により受けやすくなる。活性酸素種（ＲＯＳ）の産生は、２’−７’ジクロロ−ジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＤＡ）を使用して測定され得る。フルオレセインシグナルは、ＲＯＳの産生に正比例する（Ｆａｂｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｍｒａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００６）。活性酸素種（ＲＯＳ）アッセイは、例えば、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により市販されている。
ＤＮＡの完全性または倍数性を決定するためのアッセイは、当該技術分野において周知である。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ小核アッセイは、切断（染色体異常誘発物質）または異常複製数（異数性誘発物質）を含む、染色体異常を生成する化合物を含む化合物の検出のための変異原性試験系である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ小核アッセイは、以前に詳細に説明されており（Ｍ．Ｆｅｎｅｃｈ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓ （２０００） ４５５（１−２）：８１−９５）、例えばＢＤ社（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）により市販されている。
細胞周期または染色体分析によりＤＮＡ損傷を決定するための一般的方法およびアッセイは、当該技術分野において周知であり、本発明の細胞集団を使用して当業者により容易に適合され得る。（ｔｅ Ｐｏｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２ Ｍａｒ １５；６２（６）：１８７６−８３；Ｇｉｌｂｅｒｔ ａｎｄ Ｈｅｍａｎｎ，Ｃｅｌｌ．２０１０ Ｏｃｔ ２９；１４３（３）：３５５−６６；Ｌｏｐｅｚ ｄｅ Ｍｅｓａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．２０００ Ａｕｇ；１２１（１）：７８−８５；Ｒｉｂａｓ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００３ Ｆｅｂ；１７（２）：２８９−９１；Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｒａｖｉｄ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４ Ｆｅｂ １３；２７９（７）：５３０６−１３；およびＤａｖｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１０ Ａｐｒ ２；１４１（１）：８１−９３。）
糖タンパク質の分解代謝に関与するリソソーム酵素であるＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）の漏洩もまた、腎毒性の指標として使用され得る。ＮＡＧ漏洩を測定するアッセイは、当該技術分野において知られており、例えば、Ｂｉｏ−Ｑｕａｎｔ Ｉｎｃ．からのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）比色分析キット等、市販されている。
毒性の指標として、異常脂質集積である脂肪変性を検出するアッセイもまた、当該技術分野において知られており、例えば、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＃１００１２６４３が市販されている。
様々な異なる分子が、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて腎毒性の指標として使用され得る。具体的実施形態において、腎毒性の指標は、細胞傷害の目安である。関連する実施形態において、腎細胞への損傷は、刷子縁酵素の放出により監視される。他の実施形態において、オステオポンチン、イノシトールポリホスフェート多種キナーゼ、Ｉ−アルギニングリシンアミジノトランスフェラーゼ、プロサポシン、リポカリン、シナプトギリン２、カリクレイン、ＫＩＭ−１、腎損傷分子１（Ｋｉｍ１）、リポカリン２（Ｌｃｎ２）等の遺伝子における腎細胞遺伝子発現の変化が、化合物の腎毒性を示すために使用され得る。発現レベルが化合物の腎毒性を示すために測定され得る他の遺伝子の例は、Ａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．２００４ Ｍａｒｃｈ； １１２（４）：４６５−７９およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．２００８ Ａｐｒ １８；２４６（２−３）：９１−１００に記載されている。遺伝子発現における変化を測定するために様々な方法、例えば、とりわけＤＮＡ スロットブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、オリゴヌクレオチドおよびｃＤＮＡマイクロアレイ、プライマー伸長、Ｓ１ヌクレアーゼアッセイ、ならびにＲＮＡｓｅ保護アッセイを使用することができることが、当業者に理解される。
別の実施形態において、腎毒性の指標は、テストステロン抑制前立腺メッセージ２（ＴＲＰＭ−２）としても知られるクラステリンであり、これは、組織損傷および／またはリモデリングの際に腎臓を含む多くの器官において誘導される遍在性分泌糖タンパク質であり、上皮管の尿細管内腔内に見出されている。Ｊｅｎｎｅ Ｄ Ｅ ＆ Ｔｓｃｈｏｐｐ Ｊ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１５４−１５９ （１９９２）。クラステリンは、別様には腎臓傷害により乱される細胞相互作用を保存し得る。Ｓｉｌｋｅｎｓｅｎ Ｊ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．８（２）：３０２−３０５ （１９９７）。さらに、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、ラット腎臓においてクラステリンｍＲＮＡレベルを増加させる。Ｄａｒｂｙ Ｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．３（４）：２３４−２３９ （１９９５）。
別の実施形態において、腎毒性の指標は、ヒトにおけるリポカリン２（ＬＣＮ２）または好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）としても知られる、アルファ−２ｕグロブリン関連タンパク質（Ａｌｐｈａ−２ｕ）である。ＮＧＡＬは、好中球の顆粒内に保存され、微小親油性物質に結合し、炎症において役割を担うと考えられている。Ｂｕｎｄｇａａｒｄ Ｊ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２：１４６８−１４７５ （１９９４）；Ｃｏｗｌａｎｄ Ｊ Ｂ ＆ Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ Ｎ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４５：１７−２３ （１９９７）；Ｚｅｒｅｇａ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７９，１６５−１７２ （２０００）。
培養細胞から培地へのα−ＧＳＴ漏洩の測定が、膜の完全性を評価するために使用され得る。このアッセイは、近位尿細管において見られるＧＳＴのアルファ形態に特異的である。ＧＳＴを測定するためのＥＬＩＳＡキットが、例えば、Ｂｉｏｔｒｉｎ Ｉｎｃ．から市販されている。ＧＳＴ漏洩アッセイは、文献、例えばＲｅｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，１５２００−１５２０３、Ｏｂｅｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３１，９４−１０７，１９９５；Ｆｅｉｎｆｅｌｄ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４，５２９−５３２，１９８６において記載されている。膜の完全性を決定するための他のアッセイは、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性、アスパルチルアミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、イソクエン酸脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼを決定するアッセイを含むが、これらに限定されない。
ＤＮＡの完全性（倍数性）もまた、試験薬剤の毒性を決定する上で有用となり得る。ＤＮＡの完全性を決定するためのアッセイは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａ）からのＧＵＡＶＡ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ａｓｓａｙ等、市販されている。
さらに別の実施形態において、腎毒性の指標は、コラーゲンＩＶである。コラーゲンＩＶアッセイは、当業者に周知であり、例えば、Ｎｏｎｙｌ ｅｔ ａｌ．，ＡＪＰＲＰ ２８１：Ｆ４４３−Ｆ４３５，２００１において記載されている。
別の実施形態において、腎毒性の指標は、ＯＣＴ４である。ＯＣＴ４アッセイは、当業者に周知であり、例えば、Ｆｕｃｈｓ ａｎｄ Ｈｅｗｉｔｔ，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．２０１０；３８（６）：９４３−５６およびＧａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．２０１０；３８（６）：９４３−５６において記載されている。
さらに別の実施形態において、腎毒性の指標は、ＲＰＡである。ＲＰＡのアッセイは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３７：６２９−６４３，２００９において記載されている。
別の実施形態において、腎毒性の指標は、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（Ｔｉｍｐ−１）の組織阻害剤である。Ｔｉｍｐ−１アッセイは、当業者に周知であり、例えば、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０３（２），３７１−３８１ （２００８） Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ Ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ Ａ Ｉｎ−Ｖｉｖｏ ａｎｄ Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏにおいて記載されている。
様々な実施形態において、腎毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ指標は、継続的に測定される。腎毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ指標のレベルは、化合物または化合物の混合物が本発明の細胞の培養物に添加された時に監視されてもよい。監視は、定期的に、例えば、化合物または化合物の混合物が本発明の細胞の培養物に添加されてから約１０分後、約３０分後、約１時間後、約２時間後、約５時間後、約１２時間後、約１８時間後、約２４時間後、約３０時間後、約３６時間後、約４８時間後、約５６時間後、約６４時間後、約７２時間後またはそれ以上後に行われてもよい。また、監視は、０時間から約９６時間、０時間から約８４時間、０時間から約７２時間、０時間から約６０時間、０時間から約４８時間、０時間から約３６時間、０時間から約３０時間、または０時間から約２４時間の間の時間で行われてもよい。
具体的実施形態において、本発明の方法は、試験化合物または化合物混合物の用量反応曲線および／またはＴＣ５０を決定することを含む。本明細書において使用される場合、「用量反応曲線」という用語は、分析される化合物または混合物の量と、得られる計測された反応との間の関係を説明するものである。「用量」という用語は、一般に、実験において使用される化合物または混合物の量を示すために使用され、一方、「反応」という用語は、試験されている化合物または化合物混合物の測定可能な効果を指す。用量−反応関係は、対数スケールのＸ軸上に様々な化合物または混合物濃度を、およびＹ軸上に測定可能な反応をプロットすることにより、グラフ上で決定される。本明細書において使用される場合、「ＴＣ５０」という用語は、ベースライン反応からその化合物または化合物混合物の最大反応までの間の半分の反応を誘導する化合物または化合物の混合物の濃度を意味する。
関連する実施形態において、試験化合物の腎毒性は、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより決定された試験化合物のＴＣ５０を、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して決定される１つ以上の既知の腎毒性化合物のＴＣ５０と比較することにより決定される。
他の関連する実施形態において、試験化合物混合物の腎毒性は、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより決定された試験化合物混合物のＴＣ５０を、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して決定される１つ以上の既知の腎毒性化合物または化合物混合物のＴＣ５０と比較することにより決定される。一般に、試験化合物の用量−反応曲線は、様々な濃度の試験化合物、例えば試験化合物の連続希釈物の組を使用して生成される腎毒性の指標のレベルを測定することにより決定される。連続希釈濃度範囲にわたる試験化合物の腎毒性を決定することの目標は、用量反応曲線の確立を提供することである。用量反応曲線のＸ軸は、一般に、対数スケールでの試験化合物の濃度を表し、一方、Ｙ軸は、特定の濃度の試験化合物に対する腎毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ指標の反応を表す。
標準的な用量−反応曲線は、一般に、腎毒性の指標が試験された試験化合物の最低濃度を超えて増加しないベースライン反応；試験化合物の濃度の増加と共に腎毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ指標にさらなる増加が見られない最大反応；腎毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ指標の変化が試験化合物濃度の増加と共に増加する曲線の傾き；および試験化合物の濃度がその所与の化合物の腎毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏ指標における最大反応の半分を生成するＴＣ５０の、４つのパラメータにより定義されることが、当業者に理解される。より簡潔に述べると、ＴＣ５０は、ベースライン反応と最大反応との間の半分の反応を惹起する試験化合物の濃度である。
したがって、ＴＣ５０は、試験化合物の本来備わっているの腎毒性の便利な目安である。さらに、対照腎毒性化合物に対する試験化合物の相対的腎毒性は、試験化合物のＴＣ５０を対照腎毒性化合物と比較することにより決定され得ることが当業者に理解される。したがって、試験化合物のＴＣ５０が対照腎毒性化合物のＴＣ５０より低い場合、試験化合物は比較的高いレベルの腎毒性を有すると言われる。同様に、試験化合物のＴＣ５０が対照腎毒性化合物のＴＣ５０より高い場合、試験化合物は比較的低いレベルの腎毒性を有すると言われる。本発明の方法は、所与の対照腎毒性化合物に対する試験化合物の相対的腎毒性の全ての度合いを決定することができ、またそのような方法は本明細書における例に限定されないことが、当業者に理解される。
他の実施形態において、本発明の方法は、試験薬剤のＩＣ５０を決定することを含む。「ＩＣ５０」という用語は、本明細書において使用される場合、生物活性を５０％阻害する生物学的に活性な部分、例えば、試験薬剤の用量を指すことを意図する。
本方法は、試験化合物の腎毒性の試験を提供する。試験化合物は、宿主への投与後に腎損傷を引き起こす小分子およびペプチドを含む任意の薬学的化合物であってもよいことが、当業者に理解される。そのような薬物は、例として、利尿薬、ＮＳＡＩＤ、ＡＣＥ阻害薬、シクロスポリン、タクロリムス、放射線造影剤、インターロイキン−２、血管拡張剤（ヒドララジン、カルシウムチャネル遮断薬、ミノキシジル、ジアゾキシド）、マイトマイシンＣ、抱合型エストロゲン、キニン、５−フルオロウラシル、チクロピジン、クロピドグレル、インターフェロン、バラシクロビル、ゲムシタビン、ブレオマイシン、ヘパリン、ワルファリン、ストレプトキナーゼ、ネダプラチン、メトキシフルラン、テトラサイクリン、アムホテリシンＢ、セファロリジン、ストレプトゾシン、タクロリムス、カルバマゼピン、ミトラマイシン、キノロン、ホスカメット、ペンタミジン、静脈内ガンマグロブリン、ホスファミド、ゾレドロネート、シドホビル、アデホビル、テノホビル、マンニトール、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、ロバスタチン、エタノール、コデイン、バルビツール酸塩、ジアゼパム、キニン、キニジン、スルホンアミド、ヒドララジン、トリアムテレン、ニトロフラントイン、メフェニロイン、ペニシリン、メチシリンアンピシリン、リファンピン、スルホンアミド、チアジド、シメチジン、フェニロイン、アロプリノール、セファロスポリン、シトシンアラビノシド、フロセミド、インターフェロン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、テリスロマイシン、ロフェコキシブ、パントプラゾール、オメプラゾール、アタザナビル、金、ペニシルアミン、カプトプリル、リチウム、メフェナメート、フェノプロフェン、水銀、インターフェロン、パミドロネート、フェンクロフェナック、トルメチン、フォスカメット、アシクロビル、メトトレキセート、スルファニルアミド、トリアムテレン、インジナビル、フォスカメット、ガンシクロビル、メチセルギド、エルゴタミン、ジヒドロエルゴタミン、メチルドーパ、ピンドロール、ヒドララジン、アテノロール、タキソール、腫瘍壊死因子、クロラムブシル、インターロイキン、ブレオマイシン、エトポシド、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ドキソルビシン、シスプラチン、アミノグリコシド等を含む（一般に、Ｄｅｖａｓｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ （２００６） ２，８０−９１を参照されたい）。
試験される化合物は、自然発生化合物の断片もしくは一部を含んでもよく、または、合理的薬物設計スキームにより以前に知られている化合物から得られてもよい。天然源、例えば動物、細菌、真菌、葉および樹皮を含む植物源から単離された化合物が、可能性のある有用な薬学的化合物の存在のための候補として分析され得ることが提案される。代替的に、毒性に関してスクリーニングされる薬学的化合物は、合成されてもよい（すなわち人工的化合物であってもよい）。
Ｃ．薬物動態
「薬物動態」は、薬物に対する身体の作用を指す。薬物動態学的プロセスは、薬物の吸収、分布、代謝、および排出を含むが、これらに限定されない。取り込み輸送体アッセイは、試験薬剤の薬物動態プロファイルの決定に有用である。例となる輸送体取り込みアッセイは、本発明の細胞集団を使用した以下の輸送体との試験薬剤相互作用の決定を含む。
近位尿細管細胞の側底膜に主に発現される膜貫通タンパク質である有機アニオン輸送体１（ＯＡＴ１）は、後に尿による排泄のために頂端膜を通して出るための、血漿から腎臓の近位尿細管細胞の細胞質への、広範な比較的小さい親水性有機アニオンの取り込みに関与する。Ｅｌ−Ｓｈｅｉｋｈ ＡＡＫ ｅｔ ａｌ．，（２００８） Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５８５； ２４５−２５５。ＯＡＴ１アッセイは、当技術分野において周知であり、例えば、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｖｏｌ １５，Ｎｏ ６，２０１１ ｐｐ．１２８７−１２９８において記載されている。
腎臓の近位尿細管細胞の側底膜上に位置する有機カチオン輸送体１（ＯＣＴ１）は、小さい（親水性）有機カチオンの輸送の促進を媒介する。Ｊｏｎｋｅｒ ＪＷ ａｎｄ Ｓｃｈｉｎｋｅｌ ＡＨ （２００４） Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３０８（１）；２−９；Ｊｏｎｋｅｒ ＪＷ ｅｔ ａｌ，（２００１） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１（１６）；５４７１−５４７７。ｉｎ ｖｉｔｒｏ輸送体ＯＣＴ１アッセイは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（２００５） １（３）：４０９−４２７において記載されている。
多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体スーパーファミリーに属し、腎臓を含む組織内での解毒において役割を担う。Ｉｎｕｉ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．２０００ Ｓｅｐ；５８（３）：９４４−５８。ＭＲＰアッセイは、当該技術分野において周知であり、例えば、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社（Ｃａｒｙ、ＮＣ）からのＡＴＰ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ ｔｏ Ｑｕａｎｔｉｆｙ Ｃｅｌｌ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ＢＭＧ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ ＬＵＭＩｓｔａｒｌａｂｔｅｃｈ、およびＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）等、市販されており、またＷ．Ｌｉ ｅｔ ａｌにより記載されている（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ２０ （２００６） ６６９−６７６）。
本発明の細胞集団を使用したさらなる輸送体取り込みアッセイは、以下の輸送体の相互作用の決定を含む：タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、ＬＡＰ、ＧＧＴ、およびＭＤＲ１との試験薬剤（Ｊ．Ｓａｈｉ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（２００５） １（３）：４０９−４２７）。
Ｄ．細胞培養およびアッセイ形式
上記方法は、本明細書に記載の細胞集団の使用を必要とする。哺乳動物の初代細胞培養および細胞株培養において使用される技術は、当業者に周知である。
一実施形態において、薬剤の腎臓毒性のレベルは、複数の濃度の試験薬剤を、Ｂ２細胞集団を含む不均一腎細胞集団と共に培養することにより決定され、Ｂ２細胞集団は、尿細管細胞の濃縮集団を含む。別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ４細胞集団をさらに含む。さらに別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ３集団をさらに含む。さらに別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ５集団をさらに含む。
ある特定の実施形態において、細胞集団は、Ｂ２細胞集団を含み、Ｂ２細胞集団は、尿細管細胞の濃縮集団を含み、Ｂ１細胞集団および／またはＢ５細胞集団が欠乏している。
本発明の細胞集団に対する様々な試験化合物の効果は、二次元懸濁培養において、または本明細書に記載のような三次元系において決定され得る。本明細書に記載のように、二次元表面（または２Ｄ表面）は、ゲルマトリックス（または３Ｄゲル）内に埋め込まれていない表面を指す。具体的実施形態において、細胞は、複数ウェル（例えば９６ウェル）細胞外基質（ＥＣＭ）被覆プレート内に播種され、培地内で培養される。細胞上清または細胞そのものが、分析のために回収され得る。
ある特定の実施形態において、本発明の細胞は、本明細書においてさらに説明される３Ｄ形式で培養されてもよい。いくつかの実施形態において、「オルガノイド」という用語は、天然腎臓と一致する表現型および／または機能を有する細胞の蓄積を指す。いくつかの実施形態において、オルガノイドは、典型的には所与の組織内にｉｎ ｖｉｖｏで見出される様々な系統の細胞の混合集団を含む。いくつかの実施形態において、本発明のオルガノイドは、任意の手段によりｉｎ ｖｉｔｒｏで形成され、本発明の細胞は凝集体を形成し、これが一方でスフェロイド、オルガノイドまたはそれらの組み合わせを形成し得る。そのような凝集体、スフェロイドまたはオルガノイドは、いくつかの実施形態において、特定の器官と一致する構造をとる。いくつかの実施形態において、そのような凝集体、スフェロイドまたはオルガノイドは、典型的には特定の器官の細胞により発現される表面マーカーを発現する。いくつかの実施形態において、そのような凝集体、スフェロイドまたはオルガノイドは、典型的には特定の器官の細胞により発現される化合物または材料を生成する。例えば、最も一般的に使用される３Ｄ細胞培養系である多細胞スフェロイドは、以前に、薬物スクリーニングツールとして提案されている（Ｓｃｈｕｇｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．９，２７３−２８５ （２００４））。ある特定の実施形態において、本発明の細胞は、天然基質、例えばゼラチン上で培養されてもよい。他の実施形態において、本発明の細胞は、合成基質、例えばＰＧＬＡ上で培養されてもよい。
このように細胞培養物が確立されたら、試験されている様々な濃度の化合物を培地に添加し、細胞を様々な濃度に２４時間暴露して成長させる。２４時間という暴露期間が記載されているが、これは単なる例示的な暴露の時間であり、より長い、またはより短い期間での特定の化合物の試験が、本発明の範囲内に企図されることに留意されたい。したがって、細胞は、６、１２、２４、３６、４８またはそれ以上の時間暴露されてもよいことが企図される。
さらに、細胞は、成長周期の所与の段階で試験化合物に暴露されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、新たな細胞培養が開始されると同時に細胞を化合物と接触させることが望ましくなり得る。代替的に、細胞がコンフルエントな増殖に達したら、または対数増殖期で弧を描くようになったら化合物を添加することが望ましくなり得る。具体的な増殖期細胞の決定は、当業者に周知の方法で達成される。
様々な濃度の所与の試験化合物は、毒性効果が観察されないいくつかの濃度と共に、毒性効果が観察される少なくとも２つ以上のより高い濃度を含めることを目的として選択される。さらなる考慮点は、ｉｎ ｖｉｖｏで達成され得る化合物の濃度でアッセイを行うことである。例えば、０マイクロモルから約３００マイクロモルの範囲内のいくつかの濃度をアッセイすることが、一般にこれらの目標を達成するのに有用である。３００マイクロモルを超える濃度、例えば３５０マイクロモル、４００マイクロモル、４５０マイクロモル、５００マイクロモル、６００マイクロモル、７００マイクロモル、８００マイクロモル、９００マイクロモル、またはさらにミルモル濃度でこれらのアッセイのいくつかを行うことが可能であり、またはさらに望ましい。推定される治療上効果的な濃度の化合物は、試験するべき濃度の上の範囲に関する最初の指針を提供する。
毒性に関し数々の化合物をスクリーニングするためのハイスループットアッセイが、特に企図される。ある特定の実施形態において、ハイスループットスクリーニングは、自動化されてもよい。ハイスループットスクリーニングアッセイにおいて、化合物の群が生物学的標的に暴露される。これらの群は、以前に個々に調製され、それ以降化合物バンク内に保存された化合物の集まりから構築されてもよく、構築は、ランダムであるか、または、そこから類似した構造が形成される類似性プログラムの使用により誘導される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ系における毒性試験を設計および実行するための手順は周知であり、これに関連した多くの文章、例えば、Ｌｏｏｍｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｌｏｏｍｉｓ’ｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６）；Ｅｃｈｏｂｉｃｈｏｎ，Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃｓ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９２）；Ｆｒａｚｉｅｒ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）等において記載されている。典型的には、本明細書に記載の様々なアッセイは、９６ウェルプレート、３８４細胞プレート、または他の任意の好適な細胞培養手段において播種された細胞を使用し得る。次いで、細胞は、濃度範囲にわたり、例えば０〜３００マイクロモルにわたり試験化合物に暴露される。細胞は、これらの濃度で、所与の時間、例えば６および／または２４時間インキュベートされる。インキュベーションの後に、各試験化合物に対してアッセイが行われる。一実施形態において、データの完全な組が類似の培養、時間および取扱い条件下で生成されるように、全てのアッセイが同時に行われる。しかしながら、互いに数日以内にアッセイがバッチで行われてもよい。
オルガノイドおよび有効性アッセイ
本発明は、単独の、または混合された、不活性または望ましくない成分、例えば、Ｂ１およびＢ５が欠乏した、本明細書に記載の生物活性成分、例えば、Ｂ２、Ｂ４、およびＢ３を含む、および／またはそれから形成されたオルガノイドをさらに提供する。一態様において、本発明は、１つ以上の細胞型、例えば、血管、内分泌、または内皮細胞が欠乏または不足した特定の副分画Ｂ４を含む、および／またはそれから形成されたオルガノイドを提供し、すなわち、Ｂ４’は、単独で、または他の生物活性副分画、例えば、Ｂ２および／もしくはＢ３と混合された場合に、治療特性、例えば、腎機能の安定化および／または改善および／または再生を保持する。好ましい実施形態において、生物活性細胞集団は、Ｂ２である。ある特定の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、Ｂ４またはＢ４’と混合される。他の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、Ｂ３と混合される。他の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、Ｂ３およびＢ４の両方、またはＢ３および／もしくはＢ４の特定の細胞成分と混合される。全ての実施形態において、本発明のオルガノイドは、ｅｘ ｖｉｖｏで形成および培養される。
一実施形態において、本発明のオルガノイドは、Ｂ２細胞集団を含む、またはそれから形成され、Ｂ２細胞集団は、尿細管細胞の濃縮集団を含む。別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ４細胞集団をさらに含む。さらに別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ３集団をさらに含む。さらに別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ５集団をさらに含む。
ある特定の実施形態において、細胞集団は、Ｂ２細胞集団を含み、Ｂ２細胞集団は、尿細管細胞の濃縮集団を含み、Ｂ１細胞集団および／またはＢ５細胞集団が欠乏している。
別の態様において、本発明は、単独の、または混合された、不活性または望ましくない成分、例えば、Ｂ１およびＢ５が欠乏した、本発明の生物活性成分、例えば、Ｂ２、Ｂ４、およびＢ３を含む、および／またはそれらから形成されたオルガノイドを形成する方法を提供する。一態様において、本発明は、１つ以上の細胞型、例えば、血管、内分泌、または内皮細胞が欠乏または不足した特定の副分画Ｂ４を含む、および／またはそれから形成されたオルガノイドを提供し、すなわち、Ｂ４’は、単独で、または他の生物活性副分画、例えば、Ｂ２および／もしくはＢ３と混合された場合に、治療特性、例えば、腎機能の安定化および／または改善および／または再生を保持する。好ましい実施形態において、生物活性細胞集団は、Ｂ２である。ある特定の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、Ｂ４またはＢ４’と混合される。他の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、Ｂ３と混合される。他の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、Ｂ３およびＢ４の両方、またはＢ３および／もしくはＢ４の特定の細胞成分と混合される。
一実施形態において、本発明のオルガノイドは、Ｂ２細胞集団を含む、および／またはそれから形成され、Ｂ２細胞集団は、尿細管細胞の濃縮集団を含む。別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ４細胞集団をさらに含む。さらに別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ３集団をさらに含む。さらに別の実施形態において、不均一腎細胞集団は、Ｂ５集団をさらに含む。
ある特定の実施形態において、細胞集団は、Ｂ２細胞集団を含み、Ｂ２細胞集団は、尿細管細胞の濃縮集団を含み、Ｂ１細胞集団および／またはＢ５細胞集団が欠乏している。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の生物活性細胞調製物および／または混合体を使用してオルガノイドを形成する方法を提供する。３Ｄ ＣＯＬ（Ｉ）ゲル培養を使用して初代腎細胞集団から尿細管を生成するための一般的方法は、当該技術分野において、例えば、Ｊｏｒａｋｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９ Ｆｅｂ；４７（２）：１２９−３３のように知られている。全ての実施形態において、本発明のオルガノイドは、ｅｘ ｖｉｖｏで形成および培養される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の生物活性細胞集団および／または混合体からのオルガノイドおよび尿細管の形成は、例えば、限定されないが、以下の培養方法または系を使用して誘導され得る：ｉ）２Ｄ培養；ｉｉ）３Ｄ培養：ＣＯＬ（Ｉ）ゲル；ｉｉｉ）３Ｄ培養：Ｍａｔｒｉｇｅｌ；ｉｖ）３Ｄ培養：スピナーに続くＣＯＬ（Ｉ）／Ｍａｔｒｉｇｅｌ；およびｖ）３Ｄ培養：ＣＯＬ（ＩＶ）ゲル。ＮＫＡからのオルガノイドおよび尿細管の形成の具体例は、以下の実施例１８に記載されている。
一実施形態において、本明細書に記載の生物活性細胞調製物および／または混合体から形成されたオルガノイドは、２Ｄ培地において誘導され得る。一実施形態において、本明細書に記載の生物活性細胞調製物および／または混合体は、標準２Ｄプラスチックウェア上に播種される。一実施形態において、細胞は、約５０００細胞／ｃｍ２の密度で播種される。細胞は、適切な培地、例えば腎細胞完全培養培地（ＲＣＧＭ）等に播種されてもよい。一般に、細胞集団は、約３〜４日毎の定期的培地交換を行い、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日またはそれ以上の間、コンフルエンスを超えるまで増殖されてもよい。一実施形態において、細胞は、約７日から約１５日の間で、スフェロイド構造、すなわちオルガノイドおよび尿細管への自発的な自己組織化を示す。
別の実施形態において、本明細書に記載の生物活性細胞集団および／または混合体から形成されたオルガノイドは、３Ｄ培地において誘導され得る。一実施形態において、本明細書に記載の調合された生物活性細胞調製物および／または混合体は、以前に説明されたように、コラーゲン（Ｉ）ゲル、コラーゲン（ＩＶ）ゲル、Ｍａｔｒｉｇｅｌまたはこれらのいずれかの混合物中に組み込まれてもよい（Ｇｕｉｍａｒａｅｓ−Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ０：１−９を参照されたい）。液体ゲルは、中性ｐＨに調整されてもよく、本明細書に記載の生物活性細胞集団および／または混合体は、約５００〜２５００細胞／μｌで混合されてもよい。一実施形態において、約１０００細胞／μｌが混合される。細胞／ゲル混合物は、２４ウェルプレートのウェル、例えば、（約２００μｌ／ウェルから約４００μｌ／ウェル）に等分されてもよく、３７℃で数時間固化されてもよい。次いで、細胞培養培地が添加され、培養物は、定期的な培地交換を行い、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間熟成されてもよい。一実施形態において、尿細管構造のネットワークは、本明細書に記載の生物活性細胞調製物および／または混合体により、ゲルマトリックス全体に格子および環形態として組織化する。
別の実施形態において、オルガノイドは、スピナーフラスコまたは低結合プラスチックウェア内で、本明細書に記載の生物活性細胞調製物および／または混合体の懸濁培養により形成されてもよい。一実施形態において、細胞は、スピナーフラスコ内の培地中で、最長４日間、約８０ｒｐｍで培養されてもよい。次いで、スフェロイドが、例えば、約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレート上でさらに培養されてもよい。一実施形態において、本明細書に記載の生物活性細胞調製物および／または混合体から形成されたスフェロイドは、培養スフェロイドからの尿細管構造のデノボ出芽により示される管形成能を示す。
本明細書に記載の培養された生物活性細胞調製物および／または混合体からの、腎臓オルガノイドおよび尿細管のｉｎ ｖｉｔｒｏ 形成は、本明細書に記載の生物活性細胞調製物および／または混合体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性の指標であることが判明している。したがって、一態様において、本発明は、本明細書に記載の生物活性細胞調製物および／または混合体のｉｎ ｖｉｖｏでの潜在的再生生物活性（すなわち、有効性）を決定または予測するための、オルガノイド／管形成ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性アッセイを提供する。本明細書に記載の生物活性細胞調製物および／または混合体の部位特異的な生着およびデノボ再生、すなわち、オルガノイドの形成および／または管形成および／または糸球体形成は、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性アッセイの使用により決定され得る。一態様において、本発明は、尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団を含む不均一細胞集団の再生能を決定する方法であって、不均一腎細胞集団は、Ｂ１細胞集団が欠乏しており、方法は、ａ）不均一腎細胞集団を培養することと、ｂ）不均一細胞集団の再生能を決定することであって、尿細管および／またはオルガノイドの形成が、再生能を示す、決定することとを含む方法を提供する。一実施形態において、尿細管またはオルガノイド形成は、視野（顕微鏡観察域）当たり、または２Ｄ細胞表面成長の単位面積当たり、または３Ｄ培養の単位体積当たりの尿細管／オルガノイドの総数を決定することにより定量化され得る。例えば、ある特定の実施形態において、顕微鏡視野の写真を撮影してもよく、写真をグリッドパターンに分割してもよく、５０〜１００のグリッド正方形における尿細管またはオルガノイドの数をスコア化してもよい。別の実施形態において、尿細管形成は、格子または尿細管の閉じたネットワークの数、単位面積、体積または顕微鏡視野当たりの尿細管同士の交差点の数を決定することにより定量化されてもよい。さらに別の実施形態において、スフェロイド状オルガノイドの形成は、スフェロイド当たりの尿細管出芽の数または出芽した尿細管から形成された枝の数を決定することにより定量化されてもよい。別の実施形態において、管形成能は、蛍光染料、例えば、尿細管を共焦点顕微鏡により造影できるようにするカルセイン等で尿細管／オルガノイドを染色することにより決定され得る。尿細管、オルガノイド、格子、交差点をソフトウェアによりスコア化できるようにするソフトウェアパッケージは、当該技術分野において知られており、市販されている。
キット
本発明は、さらに、本発明のポリマーマトリックスおよび関連材料、ならびに／または細胞培養物、ならびに／または薬物スクリーニングアッセイ試薬、ならびに取扱説明書を備えるキットを含む。取扱説明書は、例えば、細胞の培養、および細胞を使用して試験薬剤をスクリーニングする方法の説明書を含有してもよい。取扱説明書は、さらに、例えば、細胞の培養、ならびに、本明細書に記載の生物活性細胞調製物および／または混合体のｉｎ ｖｉｖｏでの可能な再生生物活性（すなわち、有効性）を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法の説明書を含有してもよい。
以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。
生体反応性腎細胞の単離および特性決定
成体雄ブタ（イノシシ）における貧血を伴う特発性進行性慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）の症例が、細胞組成物の評価および年齢適合正常ブタ腎臓組織との直接的な比較による特性決定のための、新鮮な疾患腎臓組織を提供した。採取時の腎臓組織の組織学的検査では、重度のびまん性慢性間質線維症および多発性線維症を伴う半月体形成性糸球体腎炎を特徴とする腎臓疾患が確認された。臨床化学では、高窒素血症（血中尿素窒素および血清クレアチニンの上昇）、および軽度の貧血（ヘマトクリットの軽度の低減およびヘモグロビンレベルの低下）が確認された。細胞を単離し、増殖させ、疾患および正常腎臓組織の両方から特性決定した。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図１に示されるように、ゴモリトリクローム染色は、正常腎臓組織と比較して、疾患腎臓組織における線維症を強調する（矢印で示される青色染色）。キュブリン：メガリンを発現し、受容体媒介アルブミン輸送ができる機能的尿細管細胞を、正常および疾患腎臓組織の両方から増殖させた。エリスロポエチン（ＥＰＯ）発現細胞もまた培養物中に存在し、複数の継代および凍結／解凍サイクルを通して維持された。さらに、分子分析により、正常および疾患組織の両方からのＥＰＯ発現細胞が、ＥＰＯ、およびｖＥＧＦを含む他の低酸素制御遺伝子標的のＨＩＦ１a誘発誘導により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで低酸素条件に反応することが確認された。コラゲナーゼ＋ディスパーゼでの酵素分解により、ブタ腎臓組織から細胞を単離し、また、単純な機械的分解および移植片培養を行うことにより、別個の実験において単離した。２回目の継代において、ｅｐｏ発現細胞を含有する移植片から得られた細胞培養物を、大気（２１％）および様々な低酸素（５％未満）培養条件の両方に暴露し、低酸素への暴露がＥＰＯ遺伝子発現の上方制御に至るかどうかを決定した。げっ歯類培養物に関して述べられるように（実施例３を参照されたい）、正常なブタは、ＥＰＯ遺伝子の酸素依存的発現および制御を示した。驚くべきことに、ＣＫＤブタの尿毒症／貧血状態（３４未満のヘマトクリット、９．０超のクレアチニン）にもかかわらず、ＥＰＯ発現細胞は組織から容易に単離および増殖され、ＥＰＯ遺伝子の発現は、ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図２に示されるように、低酸素制御されたままであった。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図３に示されるように、増殖された培養物中の細胞は、尿細管状構造への自己組織化能力を示した。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図４に示されるように、培養物（３回目の継代）中の機能的尿細管細胞の存在は、培養細胞によるＦＩＴＣ複合化アルブミンの受容体媒介取り込みを観察することにより確認された。緑色の点（細い白矢印により指し示される）は、尿細管細胞特異的受容体であるメガリンおよびキュビリンにより媒介される、取り込まれたフルオレセイン複合化アルブミンを表し、機能的尿細管細胞によるタンパク質再吸収を示している。青色染色（太い白矢印により指し示される）は、Ｈｏｅｓｃｈｔ染色核である。総合すると、これらのデータは、機能的尿細管および内分泌細胞が、ＣＫＤにより重度に悪化した腎臓組織であってもブタ腎臓細胞から単離および増殖され得ることを示唆している。さらに、これらの所見は、ＣＫＤの治療のための自己細胞系治療生成物の発展を補助する。
さらに、ＥＰＯ産生細胞は、（実施例１において上述されるように）正常成人ヒト腎臓から酵素的に単離された。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図５に示されるように、単離手順は、初期組織よりも、単離後、より多くの相対ＥＰＯ発現をもたらした。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図６に示されるように、ＥＰＯ遺伝子発現を保持しながらヒトＥＰＯ産生細胞を培養物中で維持することが可能である。ヒト細胞は、単純組織培養物処理プラスチック、またはいくつかの細胞外基質、例えばフルオレセインもしくはコラーゲン等で被覆されたプラスチック上で培養／増殖され、全てＥＰＯ発現を経時的に補助することが判明した。
特定の生物活性腎細胞の単離および濃縮
腎細胞単離：簡潔に述べると、１０個の２週齢雄Ｌｅｗｉｓラット腎臓のバッチを、販売供給業者（Ｈｉｌｌｔｏｐ Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌｓ Ｉｎｃ．）から入手し、約４℃の温度のＶｉａｓｐａｎ保存培地中で一晩で搬送された。本明細書に記載の全てのステップは、無菌性を保持するために、生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）内で行った。腎臓をハンク平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で３回洗浄し、Ｖｉａｓｐａｎ保存培地を洗い流した。３回目の洗浄後、残留した腎臓被膜と共に、残留したいかなる間質組織も除去した。顕微解剖法を使用して、大腎杯もまた除去した。次いで、無菌メスを使用して、腎臓をスラリーとなるまで細かく刻んだ。次いで、スラリーを５０ｍｌの円錐遠心管に移し、秤量した。ＲＮＡのために微量試料を回収し、ＲＮＡｓｅ不含無菌１．５ｍｌ微小遠心管に入れ、液体窒素中で急速冷凍した。凍結したら、分析まで−８０度の冷凍庫に移した。１０個の幼若動物腎臓の組織重量を、約１グラムに統一した。バッチの重量に基づき、組織１グラム当たり２０ｍｌの分解培地を提供するように、分解培地を調節した。この手順のための分解緩衝液は、ＨＢＳＳ中の４単位のディスパーゼ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ社）、５ｍＭ ＣａＣｌ２ （Ｓｉｇｍａ）を含む３００単位／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）を含有した。
適切な体積の予め加温された分解緩衝液を管に入れ、次いでこれを封止して、３７℃のインキュベータ内の振とう機に２０分間設置した。この最初の分解ステップは、多くの赤血球を除去し、残留組織の分解を高める。２０分後、管を除去し、ＢＳＣ内に設置した。組織を管の底部に沈降させ、次いで上清を除去した。次いで、残留組織に新鮮な分解緩衝液を添加し、出発体積と同じにした。再び管を３７℃のインキュベータ内の振とう機にさらに３０分間設置した。
３０分後、７０μｍの細胞濾過器（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社）を通して分解混合物を等体積の中和緩衝液（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）にピッペットで注入し、分解反応を停止させた。次いで、細胞懸濁液を、３００×ｇで５分間の遠心分離により洗浄した。遠心分離後、次いでペレットを２０ｍｌのＫＳＦＭ媒体に再び懸濁させ、トリパンブルー色素排除を使用した細胞計数および生存能力評価用の試料を得た。細胞数を計算したら、ＲＮＡのために１００万個の細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、液体窒素中で急速冷凍した。残りの細胞懸濁液をＫＳＦＭ媒体で５０ｍｌにし、再び３００×ｇで５分間の遠心分離により洗浄した。洗浄後、細胞ペレットをＫＳＦＭ１ｍｌ当たり１５００万細胞の濃度で再懸濁させた。
次いで、５ミリリットルの腎細胞懸濁液を、１５ｍｌの円錐遠心管（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社）内で５ｍｌの３０％（ｗ／ｖ） Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）に添加し、６回転倒混和した。これにより、１５％（ｗ／ｖ）のＯｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）の最終混合物が形成された。転倒混和後、管に１ｍＬのＰＢＳを慎重に積層した。管を８００×ｇで１５分間、ブレーキなしで遠心分離した。遠心分離後、管を取り出すと、混合勾配の上に細胞帯が形成されていた。また、赤血球、死滅した細胞、ならびにいくつかのより粒状でない小細胞、いくつかのｅｐｏ産生細胞、いくつかの尿細管細胞、およびいくつかの内皮細胞を含む生細胞の小集団を含有するペレットも存在した。ピペットを使用して帯を慎重に取り出し、別の１５ｍｌの円錐管に移した。勾配培地を吸引により除去し、１ｍｌのＫＳＦＭへの再懸濁によりペレットを回収した。次いで、帯の細胞およびペレットの細胞を再び合わせ、ＫＳＦＭを使用して、回収された帯体積を少なくとも３回希釈して再懸濁させ、３００×ｇで５分間の遠心分離により洗浄した。洗浄後、細胞を２０ｍｌのＫＳＦＭに再懸濁させ、細胞計数用の試料を回収した。トリパンブルー色素排除を使用して細胞数を計算したら、ＲＮＡ試料のために１００万個の細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、液体窒素中で急速冷凍した。
密度勾配分離を使用した、特定の生物活性腎細胞の生存能力および培養性能を向上させるための培養前「清浄化」：培養用の細胞の清浄な生存集団を得るために、まず細胞懸濁液を「腎細胞単離」において上述したように生成した。随意のステップとして、また初期調製物を清浄化する手段として、無菌等張性懸濁液中に懸濁された合計１億個までの細胞を、６０％（ｗ／ｖ）イオジキサノール原液から室温で調製された等体積の３０％ Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）と１：１で完全に混合し（したがって、１５％ｗ／ｖの最終Ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液を得た）、また６回の転倒混和により完全に混合した。混合後、１ｍｌ ＰＢＳ緩衝液を、混合細胞懸濁液の上に慎重に積層した。次いで、適切なバランスを確認して勾配管を慎重に遠心機に装着した。勾配管を８００×ｇで１５分間、２５℃で、ブレーキなしで遠心分離した。清浄化された細胞集団（生存および機能的な集合管、尿細管、内分泌、糸球体、および血管細胞を含有する）が、１．０２５〜１．０４５ｇ／ｍＬの間の密度に対応して、６％および８％（ｗ／ｖ）のＯｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）の間でセグメント化した。他の細胞および残屑は、管の底部にペレット化した。
腎細胞培養：次いで、組み合わせた細胞帯およびペレットを、組織培養で処理されたトリプルフラスコ（Ｎｕｎｃ Ｔ５００）または相当物内で、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２．５μｇ ＥＧＦ、２５ｍｇ ＢＰＥ、１Ｘ ＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウム培地添加物）および抗生物質／抗真菌薬を含有する、ＤＭＥＭ（高グルコース）／ＫＳＦＭの５０：５０混合物１５０ｍｌ中、１ｃｍ２当たり３０，０００細胞の細胞濃度で播種した。加湿した５％ＣＯ２インキュベータ内で２〜３日間、細胞に２１％大気酸素レベルを提供しながら細胞を培養した。２日後、培地を交換し、ＣＯ２／窒素ガスのマルチガス加湿インキュベータ（三洋電機株式会社）により提供される２％酸素レベル環境に、培養物を２４時間設置した。２４時間のインキュベーション後、細胞を６０ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄し、次いで４０ｍｌの０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社）を使用して除去した。除去してすぐ、細胞懸濁液を同体積の１０％ＦＢＳ含有ＫＳＦＭで中和した。次いで細胞を３００×ｇで１０分間の遠心分離により洗浄した。洗浄後、細胞を２０ｍｌのＫＳＦＭに再懸濁させ、５０ｍｌの円錐管に移し、細胞計数用に試料を回収した。トリパンブルー色素排除を使用して生存細胞数を決定したら、ＲＮＡ試料のために１００万個の細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、液体窒素中で急速冷凍した。細胞を再びＰＢＳ中で洗浄し、３００×ｇで５分間の遠心分離により回収した。洗浄した細胞ペレットを、３７５０万細胞／ｍｌの濃度でＫＳＦＭに再懸濁させた。
密度段階勾配分離を使用した特定の生物活性腎細胞の濃縮：主に尿細管細胞で構成されるが他の細胞型（集合管、糸球体、血管、および内分泌）の小集団も含有する培養した腎細胞を、複数のｗ／ｖ濃度のイオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ社）から調製された密度ステップ勾配を使用して、成分部分集団に分離した。採取および勾配への適用前に、培養物を低酸素環境中に最長２４時間設置した。無菌１５ｍＬの円錐管内で４つの異なる密度の媒体を互いに重ねて積層し、最も高い密度を有する溶液を底部に設置し、最も低い密度の溶液を最上部に積層することにより、段階的勾配を形成した。段階勾配の上に細胞を適用して遠心分離すると、サイズおよび粒度に基づいて複数の帯に集団が分離した。
簡潔に述べると、ＫＦＳＭ媒体を希釈剤として使用して、７、１１、１３、および１６％の密度のＯｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）（６０％ｗ／ｖイオジキサノール）を作製した。例えば、５０ｍｌの７％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）の場合、５．８３ｍｌの６０％（ｗ／ｖ）イオジキサノール原液を、４４．１７ｍｌのＫＳＦＭ媒体に添加し、十分に転倒混和した。無菌毛細管に接続された無菌Ｌ／Ｓ １６ Ｔｙｇｏｎ管を備えた蠕動ポンプ（Ｍａｓｔｅｒ Ｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ）を、毎分２ｍｌの流速に設定し、４つの溶液のそれぞれの２ｍＬを、１６％溶液から開始し、続いて１３％溶液、１１％溶液、および７％溶液の順で、無菌１５ｍＬ円錐管に入れた。最後に、７５００万個の培養げっ歯類腎細胞を含有する２ｍＬの細胞懸濁液を、段階勾配の上に投入した（懸濁液は、「腎細胞培養」において上述されたように生成された）。重要なことに、ポンプを始動して勾配溶液を管に送達する際、流体が４５°の角度の管の側部をゆっくりと流れ落ちるように注意して、確実に勾配の各層の間に適切な界面が形成するようにした。次いで、細胞が投入された段階勾配を、８００×ｇで２０分間、ブレーキなしで遠心分離した。遠心分離後、各界面を乱さないように管を慎重に取り出した。５つの異なる細胞分画が得られた（４つの帯およびペレット）（Ｂ１〜Ｂ４＋ペレット）（図１Ａ、左の円錐管を参照されたい）。無菌の使い捨てバルブピペットまたは５ｍｌピペットを使用して各分画を回収し、表現型および機能により特性決定した（ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の実施例１０を参照されたい）。げっ歯類腎細胞懸濁液が、単離直後に段階勾配分画化に供された場合、尿細管細胞が濃縮された（および集合管からのいくつかの細胞を含有する）分画は、１．０６２〜１．０８８ｇ／ｍＬの間の密度にセグメント化する。一方、密度勾配分離がｅｘ ｖｉｖｏ培養後に行われた場合、尿細管細胞が濃縮された（および集合管からのいくつかの細胞を含有する）分画は、１．０５１〜１．０６２ｇ／ｍＬの間の密度にセグメント化した。同様に、げっ歯類腎細胞懸濁液が単離直後に段階勾配分画化に供された場合、ｅｐｏ産生細胞、糸球体足細胞、および血管細胞が濃縮された分画（「Ｂ４」）は、１．０２５〜１．０３５ｇ／ｍＬの間の密度に分離する。一方、密度勾配分離がｅｘ ｖｉｖｏ培養後に行われた場合、ｅｐｏ産生細胞、糸球体足細胞、および血管細胞が濃縮された分画（「Ｂ４」）は、１．０７３〜１．０９１ｇ／ｍＬの間の密度に分離した。重要なことに、「Ｂ２」および「Ｂ４」分画の両方への細胞の培養後分布は、培養物の低酸素培養環境（低酸素は、採取および段階勾配手順の前の２１％（大気）酸素未満として定義される（帯分布に対する低酸素の効果に関するさらなる詳細は、実施例３に記載されている））への暴露（約１時間の期間から約２４時間の期間）により高められた。
各帯を、３×体積のＫＳＦＭで希釈することにより洗浄し、十分に混合し、３００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットを２ｍｌのＫＳＦＭ中に再懸濁させ、トリパンブルー色素排除および血球計を使用して生存細胞を計数した。ＲＮＡ試料用に１００万個の細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、液体窒素中で急速冷凍した。Ｂ２およびＢ４からの細胞を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社において２段階５／６腎切除手順により生成された尿毒症および貧血メスラットへの移植試験に使用した。エリスロポエチンおよびｖＥＧＦの酸素制御発現、糸球体マーカー（ネフリン、ポドシン）の発現、ならびに血管マーカー（ＰＥＣＡＭ）の発現を含むＢ４の特性が、定量的リアルタイムＰＣＲにより確認された。「Ｂ２」分画の表現型は、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、およびアクアポリン−２の発現により確認された。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図４９ａおよび４９ｂを参照されたい。
したがって、段階勾配戦略の使用は、ｅｐｏ産生細胞の稀な集団（Ｂ４）の濃縮だけでなく、機能的尿細管細胞の比較的濃縮された分画（Ｂ２）の生成のための手段も可能にする（ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図５０および５１を参照されたい）。段階勾配戦略はまた、ＥＰＯ産生および尿細管細胞が赤血球、細胞残屑ならびに他の潜在的に望ましくない細胞型、例えば大細胞凝集体およびある特定の種類の免疫細胞から分離されることを可能にする。
段階勾配手順は、細胞成分の良好な分離を提供するために使用される特定の密度に関して調整を必要とし得る。勾配を調整するための好ましい手法は、１）勾配の底部の高密度（例えば１６〜２１％のＯｐｔｉｐｒｅｐ）から、勾配の上部の比較的低密度（例えば５〜１０％）までの連続密度勾配を実行することを含む。連続勾配は、標準的方法（Ａｘｉｓ Ｓｈｉｅｌｄ社）に従い、任意の標準密度勾配溶液（Ｆｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、Ｓｕｃｒｏｓｅ、イオジキサノール）により調製され得る。対象細胞を連続勾配の上に投入し、８００×Ｇで２０分間、ブレーキなしで遠心分離する。同様のサイズおよび粒度の細胞は、勾配中の相対的位置が測定され得るように、およびその位置での溶液の比重もまた測定され得るように、勾配中で一緒に分離する傾向がある。したがって、その後、特定条件下で密度勾配を横断する能力に基づき、特定の細胞集団の単離に重点を置いた明確な段階勾配を得ることができる。そのような最適化は、非健康対健康組織から細胞を単離する際に、または異なる種から特定の細胞を単離する際に使用される必要があり得る。例えば、最適化は、ラットにおいて識別された特定のＢ２およびＢ４部分集団が、他の種からも単離可能であることを確実とするために、イヌおよびヒト腎細胞培養物の両方で行われた。げっ歯類Ｂ２およびＢ４部分集団の単離のための最適な勾配は、７％、１１％、１３％、および１６％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐからなる。イヌＢ２およびＢ４部分集団の単離のための最適な勾配は、７％、１０％、１１％、および１６％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐからなる。ヒトＢ２およびＢ４部分集団の単離のための最適な勾配は、７％、９％、１１％、１６％（ｗ／ｖ）からなる。したがって、培養されたげっ歯類、イヌ、およびヒト腎細胞からのＢ２およびＢ４の局在化のための密度範囲は、表２．１に示される。
Figure 2017148039
勾配前の低酸素培養は、帯分布、組成、および遺伝子発現に影響する
原型Ｂ２およびＢ４の分布および組成に対する酸素条件の効果を決定するために、異なる種からの新規腎細胞調製物を、勾配段階の前に異なる酸素条件に暴露した。げっ歯類新規腎臓増強（ＮＫＡ）細胞調製物（ＲＫ０６９）を、上で説明されたようにラット細胞単離および培養開始の標準的手順を用いて確立した。全てのフラスコを２１％（大気）酸素条件下で２〜３日間培養した。培地を交換し、次いでさらに２４時間、フラスコの半分を２％酸素に設定された酸素制御インキュベータに再配置し、一方残りのフラスコは、２１％酸素条件に維持した。次いで、上記で説明された標準的酵素採取手順を使用して、細胞を各組の条件から採取した。標準的手順に従い段階勾配を調製し、「通常酸素」（２１％酸素）および「低酸素」（２％酸素）培養物を別個に採取し、同一の段階勾配に並べて適用した（図２）。４つの帯およびペレットが両方の条件において生成されたが、勾配全体にわたる細胞の分布は、２１％および２％酸素培養バッチにおいて異なっていた（表１）。具体的には、Ｂ２の収量は、低酸素で増加したが、同時にＢ３においては低下した。さらに、Ｂ４特異的遺伝子（例えばエリスロポエチン）の発現は、低酸素培養細胞から生成された最終的勾配において向上した（ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図７３を参照されたい）。
イヌＮＫＡ細胞調製物（ＤＫ００８）を、上記で説明されたようにイヌ細胞単離および培養の標準的手順（げっ歯類単離および培養手順に類似）を使用して確立した。全てのフラスコを４日間、２１％（大気）酸素条件で培養し、次いで、フラスコの部分集合を低酸素（２％）に２４時間移し、またフラスコの部分集合を２１％に維持した。その後、フラスコの各組を回収し、同一の段階勾配に供した（図３）。ラットの結果（図１）と同様に、低酸素培養イヌ細胞は、大気酸素培養イヌ細胞とは異なって勾配全体に分布した（表３．１）。この場合も、Ｂ２の収量は、Ｂ３への分布の低下と同時に、勾配前の低酸素暴露で増加した。
Figure 2017148039
上記データは、低酸素への勾配前暴露が、Ｂ２の組成、ならびに特定の特別細胞（エリスロポエチン産生細胞、血管細胞、および糸球体細胞）のＢ４への分布を向上させることを示している。したがって、上で説明されたような低酸素培養に続く密度勾配分布は、種にわたって「Ｂ２」および「Ｂ４」細胞集団を生成するための効果的な手法である。
ヒト腎臓からの尿細管／糸球体細胞の単離
全体を通して説明された酵素単離方法により、正常ヒト腎臓組織から尿細管および糸球体細胞を単離および増殖させた。上述の勾配法により、尿細管細胞分画をｅｘ ｖｉｖｏで、および培養後に濃縮した。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図６８に示されるように、表現型属性は、単離および増殖において維持された。また、標識化アルブミンの取り込みにより評価される尿細管細胞機能は、繰り返された継代および低温保存の後でも維持された。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図６９は、尿細管濃縮および尿細管欠乏集団が３Ｄ動的培養において培養された場合、尿細管マーカーであるカドヘリンの発現の顕著な増加が、尿細管濃縮集団において示されたことを示している。これは、細胞が３Ｄ動的環境において培養された場合、尿細管細胞の濃縮が、初期濃縮を超えて維持され得ることを裏付けている。
フローサイトメトリーによるＥＰＯ産生細胞のさらなる分離
上で実施例２において記載した、同じ腎細胞の培養集団を、フローサイトメトリー分析に供し、前方散乱および側方散乱を検査した。より粒状でない小さいＥＰＯ産生細胞集団が認識可能であり（８．１５％）、フローサイトメーターの選別能力を使用した、より粒状でない小細胞集団の正の選択により分離された（ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図７０を参照されたい）。
自己免疫性糸球体腎炎患者試料から単離された腎細胞の非分画混合物の特性決定
腎細胞の非分画混合物を、上述のように自己免疫性糸球体腎炎患者試料から単離した。腎臓組織から単離および増殖された腎細胞の特定の部分集団の公正な遺伝子型組成を決定するために、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑｒｔｐｃｒ）分析（Ｂｒｕｎｓｋｉｌｌ ｅｔ ａｌ．．，上記参照 ２００８）を使用して、細胞副分画間の、差次的な細胞型特異的および経路特異的遺伝子発現パターンを特定した。表６．１に示されるように、ＨＫ２０は、自己免疫性糸球体腎炎患者試料である。表６．２は、ＨＫ２０から生成された細胞が、ｑＲＴＰＣＲにより決定して、糸球体細胞を欠落していることを示す。
巣状分節状糸球体硬化症の症例から単離された治療上関連した腎臓生物活性細胞集団の遺伝子プロファイリング
腎臓組織から単離および増殖された腎細胞の特定の部分集団の公正な遺伝子型組成を決定するために、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑｒｔｐｃｒ）分析（Ｂｒｕｎｓｋｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，上記参照 ２００８）を使用して、細胞副分画間の、差次的な細胞型特異的および経路特異的遺伝子発現パターンを特定した。糸球体の大部分が破壊されている巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の症例から得られたヒト調製ＨＫ０２３を、採取時のＢ４分画中の糸球体細胞の存在について評価した。簡潔に述べると、非分画（ＵＮＦＸ）培養物を生成し（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ ｅｔ ａｌ．，上記参照 ２００８）、標準的生検手順を使用して腎臓から取り出された（４つの）コア生検のそれぞれから独立して維持した。ｅｘ ｖｉｖｏでのＵＮＦＸの（２回の）継代後、細胞を採取し、（実施例８のように）密度勾配法に供して副分画Ｂ４を含む副分画を生成したが、これは、げっ歯類、イヌ、および他のヒト検体において行われた研究に基づいて、内分泌、血管および糸球体細胞が濃縮されていることが知られている。
Figure 2017148039
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ＨＫ０２３のそれぞれの独立したＵＮＦＸ試料から、１．０６３〜１．０９１ｇ／ｍＬの間の浮遊密度を有する細胞の異なる帯として現れるＢ４分画を別個に回収した。ＲＮＡを各試料から単離し、定量的リアルタイムＰＣＲにより、ポドシン（糸球体細胞マーカー）およびＰＥＣＡＭ（内皮細胞マーカー）の発現に関して検査した。重度ＦＳＧＳの症例からの生検生成試料から予期されるように、Ｂ４分画におけるポドシン（＋）糸球体細胞の存在は一貫せず、ポドシンは試料の２／４において検出不可能であった。一方、ＰＥＣＡＭ＋血管細胞は、生検から開始した培養の４／４のＢ４分画において一貫して存在した。したがって、Ｂ４分画は、重度の疾患状態を有するヒト腎臓からであっても、１．０６３〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度範囲で単離することができる。
Figure 2017148039
さらに、表７．２に示されるように、ヒト試料（ＨＫ０１８）は、密度勾配遠心分離後のｑＲＴＰＣＲにより、未検出ポドシン（糸球体マーカー）を示した。
Figure 2017148039
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した生存腎細胞型の濃縮／欠乏
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、単離された１次腎組織から、１つ以上の単離腎細胞を濃縮することができ、および／または１つ以上の特定の腎細胞型を欠乏させることができる。
試薬：７０％エタノール；洗浄緩衝液（ＰＢＳ）；５０：５０腎細胞媒体（５０％ＤＭＥＭ高グルコース）：５０％ケラチノサイト−ＳＦＭ；トリパンブルー０．４％；標的腎細胞集団に対する１次抗体、例えば腎臓内皮細胞に対するＣＤ３１および腎臓糸球体細胞に対するネフリン。適合するアイソタイプ特異的蛍光２次抗体；染色緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％ＢＳＡ）
手順：生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）の清浄化のための標準的手順に従い、１次単離または培養細胞からの腎細胞の単一細胞懸濁液を、Ｔ５００ Ｔ／Ｃ処理フラスコから得て、腎細胞媒体内に再懸濁させることができ、氷上に配置することができる。次いで、トリパンブルー色素排除法を使用して、細胞数および生存能力を決定する。例えば、不均一集団からの糸球体細胞または内皮細胞の腎細胞濃縮／欠乏のために、少なくとも７０％の生存能力を有する１０から５０ｅ６の間の生細胞が得られる。次いで、腎細胞の不均一集団を、標的細胞型に特異的な１次抗体で、１μｇ／０．１ｍｌの出発濃度の染色緩衝液／１×１０６細胞で（必要に応じて滴定）で染色する。標的抗体は、ＣＤ３１ ＰＥ（腎臓内皮細胞に特異的）等のように複合化されてもよく、または、ネフリン（腎臓糸球体細胞に特異的）等のように複合化されていなくてもよい。
次いで、細胞を、氷上で、または４℃で、光から保護して３０分間染色する。３０分のインキュベーション後、細胞を３００×ｇで５分間の遠心分離により洗浄する。次いで、複合化アイソタイプ特異的２次抗体が必要であるかどうかに依存して、ペレットをＰＢＳまたは染色緩衝液に再懸濁させる。細胞が蛍光色素複合化１次抗体で標識化される場合、細胞は、１０ｅ７個の細胞当たり２ｍｌのＰＢＳに再懸濁され、ＦＡＣＳ ａｒｉａまたは同等の細胞選別機へと進む。細胞が蛍光色素複合化抗体で標識化されない場合、細胞は、１μｇ／０．１ｍｌ／１ｅ６細胞の出発濃度のアイソタイプ特異的蛍光色素複合化２次抗体で標識化される。
次いで、細胞を、氷上で、または４℃で、光から保護して３０分間染色する。３０分のインキュベーション後、細胞を３００×ｇで５分間の遠心分離により洗浄する。遠心分離後、ペレットをＰＢＳに５ｅ６／ｍｌ（ＰＢＳ）の濃度で再懸濁させ、次いで１２×７５ｍｍ当たり４ｍｌを無菌管に移す。
製造者の説明（ＢＤ ＦＡＣｓ Ａｒｉａ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ）に従い、生細胞無菌選別のためのＦＡＣｓ Ａｒｉａを準備する。試料管をＦＡＣｓ Ａｒｉａに装填し、取得が開始した後にＰＭＴ電圧を調節する。特定波長を用いた蛍光強度を使用して腎臓特異的細胞型を選択するようにゲートを引く。陰性集団を選択するように別のゲートを引く。陽性標的集団および陰性集団を封入するように所望のゲートを引いたら、製造者の説明を使用して細胞を選別する。
１ｍｌの腎細胞媒体を入れた１つの１５ｍｌの円錐管に陽性標的集団を回収し、別の１５ｍｌの円錐管に陰性集団を回収する。回収後、各管からの試料をフローサイトメトリーにより分析し、純度を決定する。回収された細胞を３００×ｇで５分間の遠心分離により洗浄し、さらなる分析および実験のためにペレットを腎細胞媒体に再懸濁させる。
磁気細胞選別を使用した腎細胞型の濃縮／欠乏
単離された１次腎組織から、１つ以上の単離腎細胞を濃縮することができ、および／または１つ以上の特定の腎細胞型を欠乏させることができる。
試薬：７０％エタノール、洗浄緩衝液（ＰＢＳ）、５０：５０腎細胞媒体（５０％ＤＭＥＭ高グルコース）：５０％ケラチノサイト−ＳＦＭ、トリパンブルー０．４％、流通緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ）、流通緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）、清浄化溶液（７０％ｖ／ｖエタノール）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＦＣＲブロッキング試薬、ＩｇＧアイソタイプ、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）またはネフリン等の標的抗体、または２次抗体に特異的なＭｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズ。
手順：生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）の清浄化のための標準的手順に従い、１次単離または培養からの腎細胞の単一細胞懸濁液を得て、腎細胞媒体に再懸濁させる。トリパンブルー色素排除法を使用して、細胞数および生存能力を決定する。
例えば、不均一集団からの糸球体細胞または内皮細胞の腎細胞濃縮／欠乏のために、少なくとも７０％の生存能力を有する少なくとも１０ｅ６個から４ｅ９個までの生細胞が得られる。
濃縮／欠乏手法のための最善の分離は、対象標的細胞に基づき決定される。例えば、ネフリン抗体を使用した１０％未満の糸球体細胞の標的頻度の濃縮のためには、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ａｕｔｏＭＡＣＳ、または同等の機器プラグラムＰＯＳＳＥＬＤＳ（高感度モードでの二重陽性選択）が使用される。１０％を超える標的頻度の欠乏のためには、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ａｕｔｏＭＡＣＳ、または同等の機器プログラムＤＥＰＬＥＴＥＳ（高感度モードでの欠乏）が使用される。
１μｇ／１０ｅ６細胞／０．１ｍｌ（０．０５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を１５ｍｌの円錐遠心管に入れ、続いて４℃で１５分間インキュベートすることにより、生細胞を標的特異的１次抗体、例えば糸球体細胞の場合ネフリンｒｂポリクローナル抗体で標識化する。
標識化後、１０ｅ７個の細胞当たり１〜２ｍｌの緩衝液を添加し、続いて３００×ｇで５分間遠心分離することにより、細胞を洗浄して未結合１次抗体を除去する。洗浄後、１μｇ／１０ｅ６／０．１ｍｌ（０．０５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）のトリ抗ウサギＰＥ等のアイソタイプ特異的２次抗体を添加し、続いて４℃で１５分間インキュベートする。
インキュベーション後、１０ｅ７個の細胞当たり１〜２ｍｌの緩衝液を添加し、続いて３００×ｇで５分間遠心分離することにより、細胞を洗浄して未結合２次抗体を除去する。上清を除去し、細胞ペレットを１０ｅ７個の全細胞当たり６０μｌの緩衝液に再懸濁させ、続いて１０ｅ７個の全細胞当たり２０μｌのＦＣＲブロッキング試薬を添加し、次いでこれを十分に混合する。
２０μｌのダイレクトＭＡＣＳマイクロビーズ（例えば抗ＰＥマイクロビーズ）を添加し、次いで４℃で１５分間インキュベートする。
インキュベーション後、１０〜２０×標識化体積の緩衝液を添加し、細胞懸濁液を３００×ｇで５分間遠心分離し、細胞ペレットを１０ｅ８個の細胞当たり５００μｌ〜２ｍｌの緩衝液に再懸濁させることにより、細胞を洗浄する。
製造者の説明に従い、ａｕｔｏＭＡＣＳを使用した磁気細胞分離に備えて、ａｕｔｏＭＡＣＳシステムを清浄化し、前処理する。新たな無菌収集管を、出口の下に設置する。ａｕｔｏＭＡＣＳ細胞分離プログラムを選ぶ。選択には、ＰＯＳＳＥＬＤＳプログラムを選ぶ。欠乏には、ＤＥＰＬＥＴＥＳプログラムを選ぶ。
標識化細胞を取り込み口に挿入し、次いでプログラムを始動する。
細胞選択または欠乏の後、試料を回収し、使用するまで氷上に置く。
欠乏または選択された試料の純度を、フローサイトメトリーにより検証する。
治療能を有する細胞が、正常および慢性疾患腎臓組織から単離および増殖され得る
本試験の目的は、ハイコンテント分析（ＨＣＡ）によりヒトＮＫＡ細胞の機能的特性を決定することであった。ハイコンテント画像化（ＨＣＩ）は、複数の試料にわたり２つ以上の蛍光プローブ（多重化）を使用して、複数の細胞内事象の同時画像化を提供する。ハイコンテント分析（ＨＣＡ）は、ハイコンテント画像において撮像された複数の細胞パラメータの同時定量測定を提供する。簡潔に述べると、非分画（ＵＮＦＸ）培養物を生成し（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ ｅｔ ａｌ．，上記参照 ２００８）、標準的生検手順を使用して、進行した慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）に罹患した５つのヒト腎臓、および３つの非ＣＫＤヒト腎臓から取り出されたコア生検から独立して維持した。ｅｘ ｖｉｖｏでのＵＮＦＸの（２回の）継代後、細胞を採取し、（実施例２のように）密度勾配法に供して副分画Ｂ２、Ｂ３、および／またはＢ４を含む副分画を生成した。
表１０．１に要約されるように、非ＣＫＤおよびＣＫＤヒトドナーからヒト腎臓組織を調達した。図４は、ＨＫ１７およびＨＫ１９試料の組織病理学的特徴を示す。Ｅｘ ｖｉｖｏ培養物を、全ての非ＣＫＤ（３／３）およびＣＫＤ（５／５）腎臓から確立した。対象領域ＲＯＩを確定するヒトＮＫＡ細胞におけるアルブミン輸送のハイコンテント分析（ＨＣＡ）を図５に示す（ヒトＮＫＡ細胞におけるアルブミン輸送のＨＣＡ）。非ＣＫＤおよびＣＫＤ腎臓から得られたＮＫＡ細胞におけるアルブミン輸送の定量的比較を、図６に示す。図６に示されるように、アルブミン輸送は、ＣＫＤから得られたＮＫＡ培養物において悪化していない。尿細管濃縮Ｂ２副分画と尿細管細胞欠乏Ｂ４副分画との間のマーカー発現の比較分析を、図７Ａに示す（ＣＫ８／１８／１９）。
増殖培養物中の細胞型の特定もまた、尿細管マーカー：アクアポリン１およびＣＫ８／１８／１９；血管マーカー：ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）；ならびに管マーカー：ＤＢＡの検出により、種にわたって確認された。図７Ｂは、種にわたる選択された腎細胞（ＳＲＣ）の表現型特性決定を示す。
Figure 2017148039
Figure 2017148039
尿細管濃縮Ｂ２副分画と尿細管細胞欠乏Ｂ４副分画との間のアルブミン輸送の比較機能分析を、図８に示す。副分画Ｂ２は、近位尿細管細胞が濃縮され、したがって増加したアルブミン輸送機能を示す。
アルブミン取り込み：２４ウェルのコラーゲンＩＶプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ（商標））内でコンフルエンスまで増殖させた細胞の培養培地を、フェノールレッド不含、血清不含の、１×抗真菌薬／抗生物質および２ｍＭグルタミンを含有する低グルコースＤＭＥＭ（ｐｒ−／ｓ−／ｌｇ ＤＭＥＭ）で１８〜２４時間置き換えた。アッセイの直前に、細胞を洗浄し、ｐｒ−／ｓ−／ｌｇ ＤＭＥＭ＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、および１ｍＭ ＭｇＣｌ２と共に３０分間インキュベートした。細胞を、２５μｇ／ｍＬローダミン複合化ウシアルブミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に３０分間暴露し、氷冷ＰＢＳで洗浄してエンドサイトーシスを停止し、２５μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ核染料を含有する２％パラホルムアルデヒドで即座に固定した。阻害実験のために、１μＭの受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）（Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ ＧＡ）を、アルブミン添加の１０分前に添加した。ＢＤ Ｐａｔｈｗａｙ（商標）８５５ Ｈｉｇｈ−Ｃｏｎｔｅｎｔ ＢｉｏＩｍａｇｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて顕微鏡画像化および分析を行った（Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０ Ｎｏｖ；２９９（５）：Ｆ１０２６−３９．Ｅｐｕｂ Ｓｅｐ ８，２０１０を参照されたい）。
結論として、ＨＣＡは、細胞レベルのデータを提供し、他のアッセイ、すなわち、遺伝子またはタンパク質発現により検出不可能である集団動力学を明確化することができる。アルブミン輸送（ＨＣＡ−ＡＴ）機能を測定するための定量化可能なｅｘ−ｖｉｖｏ ＨＣＡアッセイを使用して、ヒトＮＫＡ原型の成分としてヒト尿細管細胞を特性決定することができる。ＨＣＡ−ＡＴは、細胞機能の比較評価を可能にし、アルブミン輸送成分細胞が、ヒトＣＫＤ腎臓から得られたＮＫＡ培養物において保持されたことを示した。また、ＮＫＡ培養物の特定の副分画Ｂ２およびＢ４が、表現型および機能において異なり、Ｂ２が、向上したアルブミン輸送活性を有する尿細管細胞濃縮分画を表したことが示された。ヒトＣＫＤからのＢ２細胞部分集団は、表現型および機能において、（上で示されたように）ｉｎ ｖｉｖｏでの効用を示したげっ歯類Ｂ２細胞に類似している。
培養ヒト腎細胞の低酸素暴露は、細胞移動および付着のメディエータを誘導し、尿細管細胞単層のｉｎ ｖｉｔｒｏでの修復を促進する
慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）のモデルにおける治療機能を示した腎臓上皮細胞の選択された集団（Ｂ２）の単離および機能における、酸素圧の役割を調査した。本試験は、処理中の低酸素暴露が選択されたヒト選択腎細胞（ＳＲＣ）または生物活性腎細胞（ＢＲＣ）の組成および機能を改変するかどうかを検査するものであった。２％酸素への暴露時、以下が観察された：密度勾配にわたる細胞分布の改変（ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ１０／０５６３２８を参照されたい）、全体的な勾配後の収量の改善、酸素制御遺伝子発現の調節（以前にＫｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．上記参照（２０１０）において報告されている）、エリスロポエチン、ＶＥＧＦ、ＨＩＦ１−アルファおよびＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）の発現の増加。プロセス中の低酸素への暴露は、選択された生物活性腎細胞が損傷した尿細管を修復／再生する能力を向上させる。
図９は、処理中に細胞を低酸素に暴露する手順を示す。図１０は、２％酸素への暴露時に、以下が観察されたことを示す：密度勾配にわたる細胞の分布を改変し、全体的な勾配後の収量を改善する。低酸素暴露（３％未満）は、大気酸素圧（２１％）に比べて、培養されたヒトＣＫＤから得られた腎細胞のイオジキサノールベースの密度勾配からの回復を増加させ（７４％に対して９６％）、選択された細胞（Ｂ２）の高密度（９％超イオジキサノール）分画への相対的分布を増加させた（１１．２％に対して２１．６％）。
競合ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、２４時間低酸素条件に事前暴露されたＢ２細胞が、２１％酸素圧で培養されたＢ２細胞よりも、損傷腎近位尿細管単層培養物の修復に優れ、損傷から２時間以内に５８．６％±３％の修復が生じることを示した。
図１１Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの尿細管単層の修復を観察するために開発されたアッセイを示す。１．細胞を蛍光染料で標識化する（２％酸素、２１％酸素およびＨＫ２尿細管細胞）。２．尿細管細胞単層を確立して損傷させた。３．酸素暴露された標識化細胞を添加する（２％および２１％暴露細胞）。それらを、２０，０００／ｃｍ２で等しく播種する。培養は、血清不含培地中、５％Ｏ２で２４時間行う。４．損傷を修復する細胞を定量化する。図１１Ｂ−定量的画像分析（ＢＤ Ｐａｔｈｗａｙ ８５５ ＢｉｏＩｍａｇｅｒ）−赤丸＝２％Ｏ２で培養された細胞、青丸＝２１％Ｏ２で培養された細胞。図１１Ｃ−２％酸素で誘導された細胞がより急速に（２時間）付着し、中程度の利点を２４時間保持することが観察された。２％酸素で誘導された細胞は、尿細管上皮単層の修復においてより優れていた。
図１２Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの尿細管単層の修復を観察するために開発されたアッセイを示す。１．細胞を蛍光染料で標識化した。２．尿細管細胞単層を、８μｍの細孔サイズのトランスウェルインサートの底部に確立し、損傷させた。３．インサートを反転させ、酸素暴露された標識化細胞を添加する（２％および２１％暴露細胞）。それらを、５０，０００／ｃｍ２で等しく播種する。培養は、血清不含培地中、５％Ｏ２で２４時間行う。４．損傷を修復する細胞を定量化する。
図１２Ｂは、２％酸素での細胞の誘導が、非誘導（２１％酸素）と比較して移動および創傷修復を向上させたことを示す。図１２Ｃは、移動時間に対する移動した細胞の％をプロットしたものである。細胞の平均数および細胞の平均パーセンテージを、表１１．１に示す。
また、低酸素は、細胞移動および付着を媒介する遺伝子であるＣＸＣＲ４、ＭＭＰ９、ＩＣＡＭ１、およびジストログリカンのｍＲＮＡ発現を誘導した。ＭＭＰ９の巣状滞留および細胞の原形質膜上のＣｏｎｎｅｘｉｎ ４３凝集体の増加が、免疫細胞化学により確認された。
図１３Ａは、尿細管細胞によりオステオポンチンが分泌され、損傷に応答して上方制御されることを示す（オステオポンチン免疫細胞化学：Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色（青）、オステオポンチン（赤）、１０×）。オステオポンチンは、分泌されたリン酸化糖タンパク質である（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ，１９９９）。オステオポンチンは、尿細管に発現し、接着および移動に関与する。オステオポンチンは、免疫蛍光（図１３Ａ）およびＥＬＩＳＡ（図１３Ｂ）により示されるように、確立尿細管細胞単層において、損傷により上方制御される。
Figure 2017148039
図１４Ａは、細胞の移動反応が、オステオポンチンにより一部媒介されることを示す（緑＝移動した細胞（５×））。図１４Ｂは、オステオポンチンに対する中和抗体（ＮＡｂ）が、腎細胞移動反応を５０％低減することを示す。
図１５は、細胞の低酸素誘導が、組織リモデリング遺伝子の発現を調節することを示す。カベオリン１は、インテグリンシグナル伝達の調節に関与する骨格タンパク質である。ＭＭＰ９は、細胞外基質分解により移動を促進するメタロプロテイナーゼである。ＩＣＡＭ１は、上皮細胞部分に関連する細胞内接着分子である。ＣＸＣＲ４は、細胞移動を媒介するケモカイン表面受容体である。
図１６は、腎臓再生をもたらす細胞の生物活性の低酸素増強の推定される機序を示す。
総合すると、これらの結果は、低酸素暴露が、尿細管損傷のｉｎ ｖｉｔｒｏでの修復の生物活性を示す特定の腎細胞部分集団の単離を促進し、したがって、これらの細胞がｉｎ ｖｉｖｏ送達後に疾患組織に移動および生着する能力を向上させ得る可能性があることを示唆している。ＳＲＣは、腎機能を安定化し、進行性ＣＫＤのげっ歯類モデルにおける生存を高める能力を示した。低酸素レベル（２％Ｏ２）は、以下を提供した：選択された再生細胞の培養後の回収の向上；尿細管損傷に応答する細胞付着および単層修復の向上；ならびに尿細管損傷に応答する細胞移動の刺激。さらに、細胞移動および付着は、１つには、ｉｎ ｖｉｔｒｏのオステオポンチン、低酸素上方制御インテグリン、分泌タンパク質、ならびに組織リモデリング、移動、および細胞間連絡を媒介する細胞接着分子により媒介された。
Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ細胞生存能力アッセイ
細胞生存能力を決定するために、本発明の細胞集団を、２４ウェルまたは９６ウェル形式で、２４〜４８時間培養する。培養物の確立後、細胞をＮＣＥに２４〜９６時間の期間暴露する。Ｐｒｅｓｔｏブルー試薬原液をＫＧＭに１：１０の比で混合し（ＫＧＭ ９部に対してＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ １部）、これを十分に混合することにより、生存能力を評価する。次いで、培地およびＮＣＥを各培養ウェルから除去し、Ｐｒｅｓｔｏブルーを少量培養ウェルに添加し（３００ｕｌ／ウェルｌ／２４ウェルまたは１００ｕｌ／ウェル／９６ウェル）、３７℃で２時間インキュベートする。次いで、培地を除去し、９６ウェルプレートに移し、５３０／５９０で読み出す。
蛍光カスパーゼアッセイ
カスパーゼ活性の定量的ｉｎ ｖｉｔｒｏ測定のために、Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｃａｓｐａｓｅｓ Ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅ社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に従って蛍光カスパーゼアッセイを行う。まず、５０μｌの二重濃縮アポトーシス誘導薬剤を、９６ウェルプレートのウェルにピペットで注入する。次いで、本発明の細胞集団を、５０μｌの細胞培養培地中で、ウェル当たり４×１０４個の細胞で、事前に希釈されたアポトーシス誘導薬剤に２連で播種する。細胞は、ブランク、標準、または陽性対照用に指定されたウェルには播種しない。次いで、１００μｌの細胞培養培地のみをブランク用に指定されたウェルに２連でピペットで注入する。１００μｌの事前に希釈された陽性対照を、陽性対照用に指定されたウェルに２連でピペットで注入する。１００μｌの事前に希釈された標準溶液を、特定濃度の標準用に指定されたウェルに２連でピペットで注入する。次いで、１００μｌの新しく調製された基質希釈標準溶液を、各ウェルに滴下する。９６ウェルプレートを蓋で覆い、３７℃で１時間超インキュベートする。４７０〜５００ｎｍに設定された励起フィルタおよび５００〜５６０ｎｍに設定されたエミッションフィルタを有するプレートリーダーを使用して、カスパーゼ活性を蛍光測定により測定する。
ＧＧＴ機能酵素活性アッセイ
ＧＧＴ（Ｌ−グルタミン酸ガンマ−ｐ−ニトロアナリド塩酸塩）酵素活性を、懸濁液中の細胞に対して、または播種細胞に対して行うことができる。
懸濁液中の細胞の場合、５００，０００個の細胞が回収され、遠心分離され、１００μｌのＫＳＦＭに再懸濁させる。次いで、２０μｌのこれらの細胞を、９６ウェルプレートに２連で移す。２０μｌの陽性対照溶解物を、９６ウェルプレートに２連で加える。１８０μｌのＧＧＴ試薬を、試験試料ウェル、２つのブランク陰性対照ウェル、および２つの陽性対照ウェルに添加する。ＧＧＴプレートを室温で３０分間インキュベートし、次いでプレートリーダで４０５ｎｍで読み出す。
播種細胞の場合、５００，０００個の細胞を５０：５０ＫＧＭ中で２４ウェルプレートの６ウェルに播種し、コンフルエンスまで３日間増殖させる。細胞をＰＢＳで１回洗浄する。０．５ｍｌのｍｌのＧＧＴ試薬を、各試験ウェル、１つのブランク／陰性対照ウェル、および１つの陽性対照ウェルに添加する。１００μｌの陽性対照溶解物を陽性対照ウェルに添加する。ＧＧＴ指定ウェルを、室温で１時間インキュベートする。１時間のインキュベーション後、２００μｌの試薬を、試薬ブランク／陰性対照および陽性対照を含む各ウェルから９６ウェルプレートに２回移し、４０５ｎｍで読み出す。
ＮＣＥで自己生成ヒト腎臓スフェロイド／オルガノイド構造をスクリーニングする方法
本試験において、ＳＲＣを増加容量範囲の周知の腎毒性薬物（例えば、アミノグリコシド、化学療法薬、免疫抑制薬、抗菌薬、および抗レトロウイルス薬）に暴露し、毒性および機能についてスクリーニングした。（表１５．１）本明細書において示されるように、周知の腎毒性化合物は、ヒト組織生理機能をｅｘ ｖｉｖｏでシミュレートする二次元（２Ｄ）および三次元（３Ｄ）ヒト腎細胞コンストラクトを使用して、初代ヒトＳＲＣ機能活性を、用量反応的に再現性をもって確実に阻害した。
Figure 2017148039
上で説明されたようなＮＫＡを生成するための標準的操作手順を使用して、ヒト腎細胞を単離した。細胞を増殖させ、２回の継代により継代培養してから、低酸素条件（２％Ｏ２）に１８時間暴露した。暴露後、細胞を採取し、２段階密度勾配（７％および１６％ｗ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ）に供し、８００×ｇで２０分間、ブレーキなしで遠心分離した。７％と１６％の層の間に形成した得られた帯を回収し、洗浄した（Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４）。細胞を計数し、生存能力を評価した。付着を防止するためにポリ−ＨＥＭＡ被覆されたマルチウェルプレート内で細胞を培養（２０〜３０×１０３細胞／ｃｍ２）することにより、スフェロイドを生成し、インキュベータ内の軌道ローテータに２４時間設置した（図１７）。代替的に、帯化した細胞を７５ｍｌの腎臓成長培地に１ｍｌ当たり１×１０６個の細胞の濃度で再懸濁させ、３７℃／５％ＣＯ２のインキュベータ内の磁気撹拌器（４〜４０ｒｐｍ）上の１２５ｍｌスピナーフラスコ（ＢＤ社）内に入れた（図１８）。２４〜４８時間細胞を自己凝集させてスフェロイドを生成してから、ＮＣＥに暴露した（図１８）。細胞は、スピナーフラスコ内で暴露されてもよく、または、２４〜９６時間の範囲の期間にわたる用量試験（図１９）のために、スフェロイドを維持するより小さいポリ−ＨＥＭＡ被覆マルチウェルプレートに移されてもよい （Ｂｕｚｈｏｒ ＥＴ ＡＬ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ Ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ Ｔｕｂｕｌａｒ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｉｃ Ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｄｎｅｙ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ａ，２０１１）。
表現型変化（表１５．２）、機能、生存能力、アポトーシスを測定するための同様のアッセイを、懸濁液中の細胞に適用することができる。
Figure 2017148039
シスプラチンへの暴露後（４８時間後）のスフェロイド生存能力を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔ（Ｌ３２２４）を使用して評価したが、これを図２６に示す。増加用量のシスプラチンへの暴露後、ＳＲＣ尿細管オルガノイドは、生細胞が存在する場合は緑色を示し、死滅した細胞が存在する場合は赤色を示した。死滅した細胞の数は、シスプラチンの試験濃度が増加するにつれて増加するようであった。図２７は、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）の刷子縁酵素アッセイに基づくｅｘ−ｖｉｖｏ ３Ｄ機能分析を示す。０、１０、１００または２５０マイクロモル（μＭ）での４８時間のシスプラチン暴露後、３Ｄ尿細管オルガノイド培養物は、ＧＧＴ活性において用量依存的減少を示した。したがって、シスプラチンは、ＳＲＣスフェロイド媒介ＧＧＴ−１機能および４８時間の暴露後のスフェロイド細胞生存能力に対して、用量依存的な阻害効果を有することが示された。
アムホテリシンＢ（Ａｍｐ Ｂ）暴露後のＳＲＣに対する形態的および機能的変化
２Ｄ培養ＳＲＣへの形態学的、遺伝子型、表現型および機能的変化を、周知の腎毒素アムホテリシンＢ（Ａｍｐ Ｂ）の増加用量に対する暴露後７２時間まで監視した。ＴＣ５０は、ＳＲＣ／ＮＫＡ ｅｘ ｖｉｖｏ ＧＧＴ活性のＡｍｐ Ｂノックダウンにより推定した。
ＧＧＴ阻害は、以下の表１６．１に示されるようにウェスタンブロットにより検出された。
Figure 2017148039
ＳＲＣ媒介刷子縁系酵素活性、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）に対するＡｍｐ Ｂの阻害効果の片対数プロットは、Ｓ字型曲線を示し、ＩＣ５０は３２．３３μＭであった。ＧＧＴ１に対するアムホテリシンＢの効果を示す片対数用量反応曲線からのＴＣ５０を、図２８に示す。片対数用量反応分析からの結果を、以下の表１６．２に示す。
Figure 2017148039
Ａｍｐ Ｂ ＩＣ５０は、Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅおよびアポトーシスに基づくカスパーゼ検出（上述）を使用した細胞生存能力に強く相関していた。アムホテリシンＢへの７２時間の暴露後の形態的および生存能力の変化は、図２９Ａに示され、またＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅによる未処理対照からのパーセント変化によって図２９Ｂに示される。
確立されたｉｎ ｖｉｖｏ再生特性を有する２Ｄおよび３Ｄ ＳＲＣ培養物の機能的特性は、新規化学物質（ＮＣＥ）の薬物安全性、効用、およびおそらくはさらに薬物動態的結果を確認するための基盤を提供する。したがって、このｅｘ ｖｉｖｏ腎細胞基盤の機能的特性は、信頼性および再現性のある臨床結果の予測に極めて適切である。
治療用途に好適な試験薬剤を特定するためのＩｎ Ｖｉｔｒｏ法
治療用途に好適な試験薬剤の開発は、最終的にｉｎ ｖｉｖｏでの評価を必要とする。しかしながら、そのような試験は、時間および費用を要し得るため、多くの場合、評価される試験薬剤の最初のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングが行われる。効果的なｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングは、ある特定の試験薬剤候補を除外し、最も有望な選択肢のみがｉｎ ｖｉｖｏで試験され得るようにするために、関連反応に対し十分感受性でなければならない。この手法は、ｉｎ ｖｉｖｏ資源のより効率的な使用をもたらし、製品を市場に導入するために必要な費用および時間を削減する可能性がある。
腎臓障害を有するヒト対象における治療用途に好適な試験薬剤を特定するために、２Ｄ培養物、スフェロイドとして調合された、および／または生体材料中に調合された本明細書に記載の細胞集団は、試験薬剤が、非接触対照細胞集団に比べて、細胞集団の増殖マーカーおよび／またはＭ２表現型の発現を調節するかどうかを決定する後続のアッセイに供することができる。
簡潔に述べると、３Ｄ培養物の場合、細胞集団は、ヒドロゲル（３Ｄ）内で培養され、続いて上で説明されたように試験薬剤に暴露され、得られる馴化培地が、栄養作用の指標としてのモデルヒト腎細胞株に対する増殖マーカーに関して、およびリモデリング能の指標としての分化単球におけるＭ２表現型を誘導する能力に関して分析される。
材料および方法：ヒト腎臓から細胞集団を単離し、上で記載された方法に従い培養する。最終的なゲル中で細胞が均一に懸濁するように、２４ウェルのトランスウェルインサート内で細胞集団を生体材料ヒドロゲルと混合する。ヒドロゲルは、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（成長因子低減、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、アルギネート（ＶＬＶＧ、ＦＭＣ ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ社）、コラーゲン（ラット尾部Ｉ型、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＨｙＳｔｅｍ（ＰＥＧＤＡと架橋したチオール修飾ヒアルロン酸、Ｇｌｙｃｏｓａｎ社）、またはＥｘｔｒａｃｅｌ（チオール修飾ゼラチンも含有するＨｙＳｔｅｍ、Ｇｌｙｃｏｓａｎ社）を含んでもよい。次いで、細胞を試験薬剤と接触させ、無血清培地中で２４時間培養し、その後に馴化培地を回収して分析する。
増殖マーカーの評価。不死化ヒト腎細胞を、３Ｄ細胞培養上清で処理する。２４時間または４８時間後、細胞溶解物を調製し、ＰＣＮＡ（増殖マーカー）のレベルに関してウェスタンブロットにより分析する。
Ｍ２表現型の評価。ＴＨＰ−１単球（ＡＴＣＣ）を、ホルボールエステルで処理して分化を誘導する。マクロファージ分化単球を３Ｄ細胞培養からの上清で２４時間処理し、固定し、ＣＤ６８（汎マクロファージ）およびＣＤ１６３（Ｍ２マクロファージ表現型）に対する抗体で染色する。ＤＡＰＩを使用して核を染色する。高倍画像を収集して、全体的なマクロファージ集団におけるＭ２のパーセンテージを決定するために使用する。
結果。試験薬剤が増殖マーカーおよび／または不均一腎細胞集団のＭ２表現型の発現を調節するかどうかを決定する上で、試験薬剤による上記アッセイの結果を非接触細胞集団と共に分析する。
ＮＫＡのオルガノイド／管形成に基づく有効性アッセイ
ＮＫＡのｉｎ ｖｉｖｏでの潜在的再生生物活性（すなわち、有効性）を決定するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのオルガノイド／管形成に基づくアッセイが開発されている。ＮＫＡ部位特異的な生着およびデノボ再生、すなわち、オルガノイドの形成および／または管形成および／または糸球体形成は、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性アッセイの使用により決定され得る。腎臓オルガノイドおよび尿細管の形成は、ＮＫＡ生成物有効性の指標であることが判明している。
材料および方法
ＮＫＡからのオルガノイドおよび尿細管の形成は、以下のように誘導され得る。
１）２Ｄ培養。調合されたＮＫＡを、標準的な２Ｄの６ウェル細胞培養プラスチックウェア上に、ＲＣＧＭ（腎細胞完全成長培地）中５０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。細胞集団を７〜１５日間コンフルエンスを超えるまで増殖させ（３〜４日毎に培地を定期的に交換）、その期間中、細胞はスフェロイド構造（「オルガノイド」と呼ばれる）および尿細管への自発的な自己組織化を示した（図３０〜３３）。これらの構造を、キュブリン、サイトケラチン、ＯＡＴ等の尿細管マーカーの発現に関して特性決定した（図３４）。ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）等の非関連細胞型はそのような構造を形成しない（図３０）ため、そのような構造の形成は腎細胞に特有である。
２）３Ｄ培養。調合されたＮＫＡを、以前に説明されたように、コラーゲン（Ｉ）ゲル、コラーゲン（ＩＶ）ゲル、Ｍａｔｒｉｇｅｌまたはこれらのいずれかの混合物中に組み込んだ（Ｇｕｉｍａｒａｅｓ−Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ０：１−９を参照されたい）。簡潔に述べると、液体ゲルを中性ｐＨとし、ＮＫＡを１０００細胞／μｌ（この濃度は変動し得る）で混合した。細胞／ゲル混合物を、２４ウェルプレートのウェル（２００〜４００μｌ／ウェル）に等分し、３７℃で数時間固化させた。次いで、細胞培養培地を添加し、定期的な培地交換と共に、培養物を４〜１０日間熟成させた。格子および環として組織化した尿細管構造のネットワーク（尿細管は断面で観察される）が、ＮＫＡによりゲルマトリックス全体に形成された（図３５〜３７を参照されたい）。これらの構造の形成は、腎細胞に特有であり、非関連細胞株には見られない（ＨＦＦ、図３５を参照されたい）。これらの尿細管を、図３８〜４０に示されるように、尿細管マーカーの発現に関して特性決定した。
３）スピナー培養。大まかにオルガノイドと呼ばれるスフェロイド構造は、スピナーフラスコまたは低結合プラスチックウェア内での多くの細胞型の懸濁培養により形成され得る。ここでは、３０〜４０ｅ６個の細胞（ＮＫＡおよびＨＦＦ）を、スピナーフラスコ内の４５ｍｌの培地中で最長４日間培養した（８０ｒｐｍ）。次いで、スフェロイドをＭａｔｒｉｇｅｌ被覆プレート上で７〜１０日間さらに培養した。図４１〜４４に示されるように、ＮＫＡから形成されたスフェロイドは、培養されたスフェロイドからの尿細管構造のデノボ出芽により示される管形成能を示す。ＨＦＦから得られたスフェロイドからは、そのような能力は観察されない。したがって、ＮＫＡから得られたスフェロイドは、腎細胞集団に特有の真の器官形成能（有効性）を示す。
要約：総合すると、これらのデータは以下を示す。
１）尿細管およびオルガノイドと呼ばれるスフェロイド構造は、ＮＫＡの２Ｄ培養から自発的に自己集合する。
２）尿細管および管形成能を有するオルガノイドは、ＮＫＡの３Ｄ培養から自発的に自己集合する。
３）そのような器官形成生物活性は、ＮＫＡ等の腎細胞集団（および、例えば乳腺、肺等の発達中に分岐形態形成を示す関連細胞集団）に制限され、ＨＦＦ等の非関連細胞からは観察されず、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでの可能性のある再生生物活性（すなわち、有効性）のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断指標として使用され得る。

Claims (21)

  1. 試験薬剤の腎臓毒性のレベルを決定する方法であって、
    ａ）複数の濃度の試験薬剤を、尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団を含む不均一腎細胞集団と共に培養することであって、前記不均一腎細胞集団は、Ｂ１細胞集団が欠乏している、培養することと、
    ｂ）前記試験薬剤の毒性のレベルを決定することであって、少なくとも１つの毒性指標の存在は、前記試験薬剤の腎臓毒性のレベルを示す、決定することと
    を含む方法。
  2. 前記不均一腎細胞集団は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、糸球体細胞および血管細胞のうちの１つ以上を含むＢ４細胞集団をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記不均一腎細胞集団は、Ｂ３細胞集団をさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記不均一腎細胞集団は、Ｂ５細胞集団をさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記細胞集団は、スフェロイドとして培養される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記不均一腎細胞集団は、マトリックス上で培養される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記マトリックスは、三次元（３Ｄ）マトリックスである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記毒性指標は、減少したＧＧＴ発現である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記毒性指標は、対照と比較したアクアポリン１発現の変化である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記毒性指標は、対照と比較したアクアポリン２発現の変化である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記毒性指標は、ＬＤＨである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記毒性指標は、対照と比較した細胞集団の表現型の変化である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記試験薬剤の腎臓毒性のレベルの決定は、前記試験薬剤のＴＣ５０を計算することを含む、請求項１に記載の方法。
  14. 試験薬剤の代謝を決定するための方法であって、
    ａ）試験薬剤および酵素を、尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団を含む不均一腎細胞集団と共にインキュベートすることであって、前記不均一腎細胞集団は、Ｂ１細胞集団が欠乏している、インキュベートすることと、
    ｂ）前記試験薬剤の１つ以上の代謝物を検出することと
    を含む方法。
  15. 腎臓障害を有するヒト対象における治療用途に好適な試験薬剤を特定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、
    ａ）試験薬剤を、増殖マーカーおよびＭ２表現型の発現からなる群から選択される表現型を特徴とするＢ２細胞集団を含む不均一腎細胞集団と接触させることであって、前記Ｂ２細胞集団は、尿細管細胞の濃縮集団を含む、接触させることと、
    ｂ）試験薬剤が、非接触対照細胞集団に比べて、不均一腎細胞集団の増殖マーカーおよび／またはＭ２表現型の発現を調節するかどうかを決定することと
    を含む方法。
  16. 前記不均一腎細胞集団は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、糸球体細胞および血管細胞のうちの１つ以上を含むＢ４細胞集団をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記不均一腎細胞集団は、マトリックス上で培養される、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 前記マトリックスは、三次元（３Ｄ）マトリックスである、請求項１７に記載の方法。
  19. 尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団を含む不均一腎細胞集団を含むオルガノイドであって、前記不均一腎細胞集団は、Ｂ１細胞集団が欠乏している、オルガノイド。
  20. 尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団を含む不均一腎細胞集団を含むオルガノイドを形成する方法であって、前記不均一腎細胞集団は、Ｂ１細胞集団が欠乏しており、前記方法は、前記不均一腎細胞集団を、ｉ）２Ｄ培養；ｉｉ）３Ｄ培養：ＣＯＬ（Ｉ）ゲル；ｉｉｉ）３Ｄ培養：Ｍａｔｒｉｇｅｌ；ｉｖ）３Ｄ培養：撹拌に続くＣＯＬ（Ｉ）／Ｍａｔｒｉｇｅｌ；およびｖ）３Ｄ培養：ＣＯＬ（ＩＶ）ゲルからなる群から選択される培養系中で培養することを含む方法。
  21. 尿細管細胞の濃縮集団を含むＢ２細胞集団を含む不均一細胞集団の再生能を決定する方法であって、前記不均一腎細胞集団は、Ｂ１細胞集団が欠乏しており、前記方法は、
    ａ）前記不均一腎細胞集団を培養することと、
    ｂ）前記不均一細胞集団の再生能を決定することであって、尿細管および／またはオルガノイドの形成は、再生能を示す、決定することと
    を含む方法。
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