JP2017112849A - 老化マーカー及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(1)Transmembrane glycoprotein NMB(GPNMB)遺伝子又はGPNMBタンパク質からなる老化マーカー、(2)GPNMB遺伝子のcDNAを増幅するためのプライマーセット、GPNMB遺伝子のmRNAに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はGPNMBタンパク質に対する特異的結合物質、を備える老化判定用キット、及び(3)生体試料中の、GPNMB遺伝子又はGPNMBタンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記GPNMB遺伝子又は前記GPNMBタンパク質の発現量が老化の進行度に対応する、老化判定方法。
【選択図】なし
Description
(1)Transmembrane glycoprotein NMB(GPNMB)遺伝子又はGPNMBタンパク質からなる老化マーカー。
(2)GPNMB遺伝子のcDNAを増幅するためのプライマーセット、GPNMB遺伝子のmRNAに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はGPNMBタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、老化判定用キット。
(3)生体試料中の、GPNMB遺伝子又はGPNMBタンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記GPNMB遺伝子又は前記GPNMBタンパク質の発現量が老化の進行度に対応する、老化判定方法。
1実施形態において、本発明は、GPNMB遺伝子又はGPNMBタンパク質からなる老化マーカーを提供する。
1実施形態において、本発明は、GPNMB遺伝子のcDNAを増幅するためのプライマーセット、GPNMB遺伝子のmRNAに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はGPNMBタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、老化判定用キットを提供する。
1実施形態において、本発明は、生体試料中の、GPNMB遺伝子又はGPNMBタンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記GPNMB遺伝子又は前記GPNMBタンパク質の発現量が老化の進行度に対応する、老化判定方法を提供する。
(老化マーカーの探索)
発明者らは、DNAマイクロアレイ解析により、老化を誘導した血管内皮細胞で発現が上昇する遺伝子を探索した。その結果、GPNMB遺伝子を見出した。
(老化細胞ではGPNMBのmRNAの発現量が上昇した)
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を第4継代から第9継代まで培養し、各継代数の細胞におけるGPNMB遺伝子のmRNAの発現をリアルタイムPCRにより定量した。GPNMB遺伝子増幅用プライマーとしては、センスプライマーとして配列番号2に示す塩基配列からなるプライマーを用い、アンチセンスプライマーとして、配列番号3に示す塩基配列からなるプライマーを用いた。
(老化細胞ではGPNMBタンパク質の発現量が上昇した)
第7継代、第11継代及び第12継代のHUVEC細胞におけるGPNMBタンパク質の発現量をウエスタンブロッティングにより測定した。GPNMBタンパク質の検出には、抗GPNMB抗体(型式「Ab98856」、Abcam社)を使用した。
(GPNMB遺伝子のノックダウンにより細胞増殖速度が低下した)
HUVECに、レトロウイルスを用いてGPNMB特異的shRNA(short hairpin RNA)を導入し、GPNMBの発現をノックダウンした細胞を用意した(GPNMB抑制群)。対照として未処理のHUVECを用いた(対照群)。使用したGPNMB特異的shRNAの塩基配列を配列番号4に示す。
(GPNMB遺伝子のノックダウンにより既知老化マーカーの発現量が上昇した)
実験例2と同様にして、実験例4で使用した対照群及びGPNMB抑制群の細胞中のGPNMBタンパク質の発現量をウエスタンブロッティングにより測定した。また、p53、p21及びβアクチンの発現量も測定した。図4は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。レーン1及び2は対照群の結果であり、レーン3及び4はGPNMB抑制群の結果である。
(GPNMB遺伝子のノックダウンにより細胞中の活性酸素種が上昇した)
実験例4で使用した対照群及びGPNMB抑制群の細胞中の活性酸素種(reactive oxygen species、ROS)を検出した。まず、対照群及びGPNMB抑制群の細胞をパラホルムアルデヒド固定した。続いて、ジヒドロエチジウム染色により活性酸素種を検出した。また、同時にDAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)染色により細胞の核を染色した。
(肥満モデルマウスではGPNMB遺伝子の発現量が上昇した)
4週齢から8週間、通常食(CE−2)を与えたマウス(対照群)及び高脂肪食(HFD)を与えたマウス(肥満食群)を用意した。各マウスから動脈組織及び肺内皮細胞を採取し、実験例2と同様にしてリアルタイムPCRを行い、GPNMB遺伝子の発現量を定量した。動脈組織としては下行大動脈を用いた。また、肺内皮細胞としては、肺組織から抗CD31抗体(型式「553369」、BD Biosciences社)及び磁気ビーズを用いて分離したCD31陽性細胞を用いた。
(動脈硬化モデルマウスではGPNMB遺伝子の発現量が上昇した)
22週齢の動脈硬化モデルマウス(ApoEノックアウトマウス)(動脈硬化群)及び通常マウス(対照群)から、動脈、肺内皮細胞及び心臓内皮細胞を採取し、実験例2と同様にしてリアルタイムPCRを行い、GPNMB遺伝子の発現量を定量した。動脈組織としては下行大動脈を用いた。また、肺内皮細胞、心臓内皮細胞としては、それぞれ肺組織並びに心臓組織から、抗CD31抗体(型式「553369」、BD Biosciences社)及び磁気ビーズを用いて分離したCD31陽性細胞を用いた。
(動脈硬化関連疾患の患者の白血球でGPNMB遺伝子の発現量が上昇した)
健常人(n=32)、冠動脈疾患の患者(n=29)及び閉塞性動脈硬化症の患者(n=11)から末梢白血球を採取し、実験例2と同様にしてリアルタイムPCRを行い、GPNMB遺伝子の発現量を定量した。健常人、冠動脈疾患の患者及び閉塞性動脈硬化症の患者の年齢は66.33±12.11(平均値±標準偏差)であった。
Claims (3)
- Transmembrane glycoprotein NMB(GPNMB)遺伝子又はGPNMBタンパク質からなる老化マーカー。
- GPNMB遺伝子のcDNAを増幅するためのプライマーセット、
GPNMB遺伝子のmRNAに特異的にハイブリダイズするプローブ、又は
GPNMBタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、老化判定用キット。 - 生体試料中の、GPNMB遺伝子又はGPNMBタンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記GPNMB遺伝子又は前記GPNMBタンパク質の発現量が老化の進行度に対応する、老化判定方法。
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JP2015248523A JP2017112849A (ja) | 2015-12-21 | 2015-12-21 | 老化マーカー及びその使用 |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN111398456A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-07-10 | 中国科学院昆明动物研究所 | 指征健康老龄关键通路的内源性代谢小分子标志物及应用 |
WO2021020047A1 (ja) | 2019-07-29 | 2021-02-04 | 国立大学法人新潟大学 | 免疫誘導剤及び老化関連疾患の予防又は治療用医薬組成物 |
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2015
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WO2021020047A1 (ja) | 2019-07-29 | 2021-02-04 | 国立大学法人新潟大学 | 免疫誘導剤及び老化関連疾患の予防又は治療用医薬組成物 |
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