JP2017111100A - 癌におけるリン酸化rbタンパク質を指標としたイリノテカン感受性予測法 - Google Patents
癌におけるリン酸化rbタンパク質を指標としたイリノテカン感受性予測法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明において、RBタンパク質のリン酸化を検出するために用いることができる抗体としては、RBタンパク質のSer780および/またはSer807/811のリン酸化を検出するリン酸化部位特異的抗RB抗体又はその断片などを用いることができる。また、BCRPを検出することができる抗体としては、BCRP特異的抗体又はその断片などを用いることができる。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又は結合特異性を有する抗体断片や、ファージ抗体などを用いることもできる。特異性を向上させるよう、抗体をコードする遺伝子を改変したものから得られるものも利用することができる。
患者の大腸における癌組織を含む領域から、書面によるインフォームド・コンセントを得た後、医師などの有資格者による作業により摘出し提供された摘出標本試料を用いて、ウエスタンブロット法、免疫組織化学染色、免疫蛍光法、イムノアッセイ、ELISAまたは質量分析などにより、リン酸化RBタンパク質の量を測定する。免疫組織化学染色に処する場合には、適宜、ホルマリン固定処理などの固定処理を施した後、任意にパラフィンに包埋し、切片を調製し、公知の手法を用いて、染色処理工程を実施する。染色の手順については、実施例の材料と方法の項において説明するように行ってもよい。さらに、適宜ヘマトキシリンによる対比染色などを行い、染色部位の同定を確実にする。
〔1.細胞の入手〕
HCT116細胞、SW480細胞およびSW620細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC,米国)から入手した。CCK-81細胞、CoCM-1細胞およびSW837細胞を、ヒューマンサイエンス研究資源バンク(HSRRB,日本)から入手した。LIM1215細胞を、ユーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャー(ECACC,英国)から入手した。Caco-2細胞を、理化学研究所バイオリソースセンター(RIKEN BRC,日本)から入手した。
〔2.細胞培養〕
上記の各細胞は、10% FBS、4 mM グルタミン、50 U/mL ペニシリン及び100μg/mL ストレプトマイシンを添加したDMEM培地を用い、37℃、5% CO2の飽和水蒸気圧にて培養した。
SN-38(シグマ,ミズーリ州,米国)は、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して分注した後、使用時まで-20℃にて保管した。
細胞生存率は、Cell Counting Kit-8(株式会社同仁化学研究所、日本)を用い、同キットに添付の説明書に従って測定を行って決定し、さらに、IC50値を算出した。
所定の各濃度に調整したSN38をDMEM培地に添加し、各細胞を72時間培養した。その後、キット添付溶液WST-8を上記DMEM培地に添加し、さらに4時間培養した。マルチウェルプレートリーダー(DSファーマバイオメディカル、日本)を用い、波長450 nmにて測定した。細胞数をViaCount Assay(Guava Technologies, カリフォルニア州,米国)によるメーカー指定の手順にて計測し、各細胞株の細胞倍化時間を算出した。
細胞を緩衝液(50 mM Tris-HCl,1% SDS,1 mM DTT,2 μg/mL ロイペプチン,2 μg/mL アプロチニン、0.5 mM フェニルメチルスルフォニルフルオライド及びホスファタ‐ゼ阻害剤カクテル(ナカライテスク,日本)に溶解し、溶解液を得た。該溶解液を超音波処理し、さらに15000-rpm,4℃の条件にて遠心分離し、上清を採取した。
マウス抗ヒトRB抗体(BDバイオサイエンス,カリフォルニア州,米国)、マウス抗ヒトリン酸化RB(Ser780)抗体(カルビオケム,カリフォルニア州,米国)、マウス抗ヒトCDK6抗体(Cell Signaling Technology, Inc.,マサチューセッツ州,米国)、ウサギ抗ヒトリン酸化RB(Ser780)抗体(Cell Signaling Technology, Inc.,マサチューセッツ州,米国)、ウサギ抗ヒトリン酸化RB(Ser807/811)抗体(Cell Signaling Technology, Inc.,マサチューセッツ州,米国)、ウサギ抗ヒトCDK2抗体(サンタクルーズバイオテクノロジー,カリフォルニア州,米国)、ウサギ抗ヒトCDK4抗体(サンタクルーズバイオテクノロジー,カリフォルニア州,米国)、ウサギ抗ヒトトポイソメラーゼI抗体(Abcam,ケンブリッジ,英国)、マウス抗ヒトBCRP抗体(Abcam,ケンブリッジ,英国)、および、マウス抗ヒトGAPDH抗体(HyTest,トゥルク,フィンランド)。
低分子干渉RNA(siRNA)は、Ambion(カリフォルニア州,米国)から、CDK2用(UAAGUACGAACAGGGACUCca)、CDK4用(UGUGGGUUAAAAGUCAGCAtt)、CDK6用(UUCUACGAAACAUUUCUGCaa)及びSilencer Select Negative Control #2 siRNAを入手した。50 nMの各siRNAを、Lipofectamine RNAiMAX試薬(インビトロジェン,カリフォルニア州,米国)を用いて細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトしてから24時間経過後、培養液を5 nM SN38添加DMEM、0.1% DMSO添加DMEMまたはDMEMのみとして更に72時間インキュベーションした。その後、細胞を回収し細胞周期を確認するとともに、ウエスタンブロット法にて解析を行った。
各種の細胞をSN38に所定の各濃度で72時間曝露した後、細胞を回収した。回収した細胞は、0.1% トライトン-X100で透過処理し、核をヨウ化プロピジウム(PI)にて染色した。DNA量はFACSCalibur(ベクトン−ディッキンソン,ニュージャージー州,米国)にて測定され、ModFit LT(Verity Software House,メイン州,米国)により解析された。
2008年から2013年の間に京都府立医科大学消化器外科で結腸/直腸切除術を受けた臨床病期第IV期の23名の大腸癌患者から、原発腫瘍のサンプルを得た。各サンプルは、24時間のホルマリン固定処理の後、パラフィンに包埋した。
腫瘍組織の、パラフィン包埋切片(厚さ3 mm)を、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法を用いたリン酸化RBタンパク質(Ser780)およびKi-67(MIB-1)検出のため免疫組織化学染色に供した。
データは、3回の測定の平均値±SDとして示す。有意性は、両群間を比較したスチューデントt検定またはマンホイットニーU検定によって評価した。フィッシャーの正確確率検定は、臨床病理学的パラメーターとリン酸化RBタンパク質発現量との相関を調べるために行った。p値が0.05未満または0.01未満であったときに、差が有意であると見なした。
〔1.SN38に対する感受性は、細胞の倍加時間と逆相関している。〕
ヒト大腸癌細胞がTop I (topoisomerase-I) を発現するか否か検討した。その結果、ヒト大腸癌細胞のHCT116細胞、LIM1215細胞、SW480細胞、SW620細胞、CCK-81細胞、CoCM-1細胞、SW837細胞およびCaco-2細胞は、いずれもTop I (topoisomerase-I) を発現していることが明らかとなった(図1)。
そこで、大腸癌細胞におけるTop I発現が、SN38への感受性と相関性を有するか否か検討した。上記8種類のヒト大腸癌細胞を、各濃度のSN38によって処理し、IC50値を算出した。結果を表1に示す。
そこでさらに、上記の各大腸癌細胞株について、倍化時間をそれぞれ測定した。そして、倍化時間とSN38のIC50値との関係をグラフに表した(図2)。
[実施例4]
次に、上記の各大腸癌細胞株において、細胞増殖により転写制御因子E2Fに結合できなくなるリン酸化RBタンパク質を検出するため、ウエスタンブロット解析による試験を行った。
Caco-2細胞は、SN38を輸送するBCRP(乳癌耐性タンパク質, breast cancer resistance protein)を発現していることが知られている。そこで、RBタンパク質におけるSer780およびSer807/811の過剰なリン酸化の有無を確認した上記の各大腸癌細胞株が、BCRPを発現しているか否かについて検討した。
次に、患者検体におけるイリノテカンに対する応答性が、該検体におけるリン酸化RBタンパク質の発現レベルを指標とすることにより、予測出来るか否か検討した。
次に、我々はさまざまな臨床病理学的因子と免疫組織化学染色により決定されたリン酸化RBタンパク質発現レベルとの相関関係を分析した。腫瘍におけるリン酸化RBタンパク質発現レベルを確認した免疫組織化学染色の代表的な結果を図5に示す。
他方、従来、臨床的に腫瘍増殖の診断マーカーとして使われているKi-67(MIB-1)の標識指数(LI)は、治療応答群と治療非応答群の間において統計的有意差を示さないものであったことを、今回初めて見出した(図6及び図7)。
次に、RBタンパク質のリン酸化が、癌におけるイリノテカンの有効性に、確かに重要な役割を果たしていることを確認するために、さらなる検討を加えた。
また、SW620細胞及びSW480細胞において、SN38で72時間処理すると、容量依存的にG2/M期停止が誘導された(図10)。
しかしながら、5 nMのSN38で72時間処理して誘導されたG2/M期停止は、RBタンパク質のリン酸化のレベルを最も顕著に減少させたsiCDK4/6(図9)によって抑制された(図11)。
そこでさらに、CDK4/6活性がSN38への感受性に影響を与えたかどうかについて検討した。
我々は、癌におけるイリノテカンの有効性が、リン酸化RBタンパク質の発現によって合理的に予測できるものであることを、今回初めて示した。
Claims (8)
- 患者の癌組織を含む領域より得られた摘出標本試料と、対照試料とにおけるリン酸化RBタンパク質の量を測定する第一の工程と、摘出標本試料と対照試料とにおいて測定されたリン酸化RBタンパク質の量を比較する第二の工程とを含む、患者の癌におけるイリノテカンに対する応答を予測し、または監視する方法。
- 前記リン酸化RBタンパク質のリン酸化部位が、RBタンパク質のSer780および/またはSer807/811であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記リン酸化RBタンパク質の量が、ウエスタンブロット法、免疫組織化学染色、免疫蛍光法、イムノアッセイ、ELISAまたは質量分析からなる群から選択される測定方法を用いて測定されることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記リン酸化RBタンパク質の量が、リン酸化部位特異的抗Rb抗体又はリン酸化部位特異的抗Rb抗体断片を用いて測定されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リン酸化部位特異的抗RB抗体が、RBタンパク質のSer780および/またはSer807/811のリン酸化を検出するものであることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- さらにBCRP(乳癌耐性タンパク質)の発現を、患者の癌組織を含む領域より得られた摘出標本試料において、ウエスタンブロット法、免疫組織化学染色、免疫蛍光法、イムノアッセイ、ELISAまたは質量分析からなる群から選択される測定方法を用いて測定する工程を含むものであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- リン酸化部位特異的抗RB抗体又はリン酸化部位特異的抗RB抗体断片を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法により、患者の癌におけるイリノテカンに対する応答を予測し、または監視するためのキット。
- 前記リン酸化部位特異的抗RB抗体又はリン酸化部位特異的抗RB抗体断片が、RBタンパク質のSer780および/またはSer807/811のリン酸化を検出するものであることを特徴とする、請求項7に記載のキット。
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