JP2017095465A - 治療薬の標的化送達のためのモジュラー輸送プラットフォーム - Google Patents
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Abstract
【課題】標的細胞の細胞内コンパートメントへ活性物質、診断用物質又は研究用物質を送達するためのモジュラー輸送プラットフォーム（ＭＴＰ）の提供。
【解決手段】下記のモジュールを含むモジュラー輸送プラットフォーム。疎水性ポケットを有する非共有的カップリングの為の第１の異種モジュールで、特定の配列から調節される大腸菌ヘモグロビン−様蛋白質ＨＭＰで、非共有的にカップリングされた環状テトラピロールクロリン又はクロリン誘導体である、第１の異種モジュール；特定の配列から調節され、ＭＴＰの特定の細胞内コンパートメントへの送達を引き起す第２の異種モジュール；特定の配列から調節され、細胞内コンパートメント内にＭＴＰを保持する為に、細胞内コンパートメント内の成分と結合し、排出されるＭＴＰの能力を妨害するため、コンパートメント内で化学修飾を受け、モジューラー輸送プラットフォームの局在化を延長する、第３の異種モジュール
【選択図】なし
【解決手段】下記のモジュールを含むモジュラー輸送プラットフォーム。疎水性ポケットを有する非共有的カップリングの為の第１の異種モジュールで、特定の配列から調節される大腸菌ヘモグロビン−様蛋白質ＨＭＰで、非共有的にカップリングされた環状テトラピロールクロリン又はクロリン誘導体である、第１の異種モジュール；特定の配列から調節され、ＭＴＰの特定の細胞内コンパートメントへの送達を引き起す第２の異種モジュール；特定の配列から調節され、細胞内コンパートメント内にＭＴＰを保持する為に、細胞内コンパートメント内の成分と結合し、排出されるＭＴＰの能力を妨害するため、コンパートメント内で化学修飾を受け、モジューラー輸送プラットフォームの局在化を延長する、第３の異種モジュール
【選択図】なし
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、米国特許出願第13/371,377号、2011年5月23日に出願された米国特許仮出願
第61/489,181号、及び2011年8月30日に出願された米国特許仮出願第61/528,971号の優先
権を主張するものであり、これらの両出願の内容はそれらの全体が引用により本明細書中
に組み込まれている。
本出願は、米国特許出願第13/371,377号、2011年5月23日に出願された米国特許仮出願
第61/489,181号、及び2011年8月30日に出願された米国特許仮出願第61/528,971号の優先
権を主張するものであり、これらの両出願の内容はそれらの全体が引用により本明細書中
に組み込まれている。
(技術分野)
本発明の分野は概して、治療薬の送達を制御するための複数のモジュールを伴うモジュ
ラー輸送プラットフォームを使用することによる、病態を治療するための治療薬の標的化
された送達に関する。本発明の分野はまた、病態を診断するための又は研究目的の個別の
薬剤の標的化された送達に関する。
本発明の分野は概して、治療薬の送達を制御するための複数のモジュールを伴うモジュ
ラー輸送プラットフォームを使用することによる、病態を治療するための治療薬の標的化
された送達に関する。本発明の分野はまた、病態を診断するための又は研究目的の個別の
薬剤の標的化された送達に関する。
(背景)
癌及び他のいくつかの状態の治療における大きな問題点は、病的異常細胞に対する（他
の健常細胞に対してでなく）薬物の特異的標的化の有効性が貧弱であるか又はごくわずか
であるということである。理想を言えば、そのような薬物は、健常細胞への損傷を最小化
するために、短い距離にわたり作用しかつ該薬物に対して最も高い感受性を有する細胞内
コンパートメントを標的とすべきである。多くの医薬品は、細胞表面受容体へ結合し、且
つ受容体が誘導したプロセスによりそれらの作用を明らかにする。しかし、医薬品は、そ
れらの作用の重要な部位である細胞の細胞内コンパートメント内部に直接局在化しないこ
とが多く、このことは薬物の最も強力な作用は実現されないことがあることを意味する。
癌及び他のいくつかの状態の治療における大きな問題点は、病的異常細胞に対する（他
の健常細胞に対してでなく）薬物の特異的標的化の有効性が貧弱であるか又はごくわずか
であるということである。理想を言えば、そのような薬物は、健常細胞への損傷を最小化
するために、短い距離にわたり作用しかつ該薬物に対して最も高い感受性を有する細胞内
コンパートメントを標的とすべきである。多くの医薬品は、細胞表面受容体へ結合し、且
つ受容体が誘導したプロセスによりそれらの作用を明らかにする。しかし、医薬品は、そ
れらの作用の重要な部位である細胞の細胞内コンパートメント内部に直接局在化しないこ
とが多く、このことは薬物の最も強力な作用は実現されないことがあることを意味する。
開発中の細胞内コンパートメントを標的化する一つの方法は、細胞の核の標的化を試み
ている。例えば、Dinara G. Gilyazovaらの文献、[「新規操作されたモジュラー輸送体に
よる癌細胞の標的化(Targeting Cancer Cells by Novel Engineered Modular Transporte
rs)」, Cancer Res. 2006； 66:(21): 10534-10540]は、ErbB1受容体を過剰発現している
癌細胞の（光増感剤の作用が最も顕著である）核へと、光増感剤を標的化するモジュラー
組換え輸送体を記載している。この記載された輸送体は、(a)ErbB1受容体へインターナリ
ゼーション可能なリガンドモジュールとしての上皮細胞増殖因子、(b)SV40ラージT-抗原
の最適化された核局在化配列、(c)エンドソーム分解性モジュールとしてのジフテリア毒
素転座ドメイン、及び(d)担体モジュールとしての大腸菌ヘモグロビン-様タンパク質HMP
：からなる。
ている。例えば、Dinara G. Gilyazovaらの文献、[「新規操作されたモジュラー輸送体に
よる癌細胞の標的化(Targeting Cancer Cells by Novel Engineered Modular Transporte
rs)」, Cancer Res. 2006； 66:(21): 10534-10540]は、ErbB1受容体を過剰発現している
癌細胞の（光増感剤の作用が最も顕著である）核へと、光増感剤を標的化するモジュラー
組換え輸送体を記載している。この記載された輸送体は、(a)ErbB1受容体へインターナリ
ゼーション可能なリガンドモジュールとしての上皮細胞増殖因子、(b)SV40ラージT-抗原
の最適化された核局在化配列、(c)エンドソーム分解性モジュールとしてのジフテリア毒
素転座ドメイン、及び(d)担体モジュールとしての大腸菌ヘモグロビン-様タンパク質HMP
：からなる。
米国特許第6,500,800号[Sobolevら]は、標的細胞に光力学的損傷を引き起こす組成物を
開示している。この組成物は、光増感剤、光増感剤担体成分、標的細胞の認識及び特異的
受容体-媒介性エンドサイトーシスにより標的細胞内部への光増感剤の輸送を可能にする
成分、並びに標的細胞内で光増感剤の効果的な標的化輸送を可能にする成分を含有する。
この組成物を使用し、下記の工程に従い、標的細胞の光力学的損傷を引き起こす：該組成
物を細胞へ添加する工程；標的細胞への光力学的損傷を引き起こすための、上記成分を含
む該組成物と一緒に、該細胞を、正常細胞の生存活性温度で維持する工程；並びに、該細
胞を光に曝露する工程。
開示している。この組成物は、光増感剤、光増感剤担体成分、標的細胞の認識及び特異的
受容体-媒介性エンドサイトーシスにより標的細胞内部への光増感剤の輸送を可能にする
成分、並びに標的細胞内で光増感剤の効果的な標的化輸送を可能にする成分を含有する。
この組成物を使用し、下記の工程に従い、標的細胞の光力学的損傷を引き起こす：該組成
物を細胞へ添加する工程；標的細胞への光力学的損傷を引き起こすための、上記成分を含
む該組成物と一緒に、該細胞を、正常細胞の生存活性温度で維持する工程；並びに、該細
胞を光に曝露する工程。
Deonarainらの米国特許第7,655,753号は、それに合成的に結合された複数の治療的又は
診断的部分を有する、少なくとも1本のα-ヘリックスを含むポリペプチドに関する。これ
らの治療的又は診断的部分は、同じであるか又は異なっていてよく、且つこれらの部分間
の相互作用を最小化するように、該ポリペプチド上に空間的に配向されている。米国特許
第7,655,753号の更なる態様は、該ポリペプチド；該ポリペプチドをコードしているポリ
ヌクレオチド配列；該ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター；及び、該発現ベクター
により形質転換された宿主細胞：を含む医薬組成物に関する。米国特許第7,655,753号は
また、該ポリペプチドの治療的有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む、
治療方法を提供している。
診断的部分を有する、少なくとも1本のα-ヘリックスを含むポリペプチドに関する。これ
らの治療的又は診断的部分は、同じであるか又は異なっていてよく、且つこれらの部分間
の相互作用を最小化するように、該ポリペプチド上に空間的に配向されている。米国特許
第7,655,753号の更なる態様は、該ポリペプチド；該ポリペプチドをコードしているポリ
ヌクレオチド配列；該ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター；及び、該発現ベクター
により形質転換された宿主細胞：を含む医薬組成物に関する。米国特許第7,655,753号は
また、該ポリペプチドの治療的有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む、
治療方法を提供している。
米国特許第7,655,753号は、複数の治療的又は診断的部分が結合したα-ヘリックスポリ
ペプチドを含むシステムを開示していると思われる。このポリペプチドは、マルチ-ヘリ
ックスバンドルの形状で、2本以上のα-ヘリックスポリペプチドを含むことができる。米
国特許第7,655,753号のα-ヘリックスポリペプチドは、本明細書に開示されたMTPとは多
くの点で異なる。例えば米国特許第7,655,753号の構築体は、いくつかの異なるα-ヘリッ
クスポリペプチドの集成を非共有的に必要とするようである。対照的に本明細書に開示さ
れたMTPは、単独のポリペプチドである。更に米国特許第7,655,753号は、ROPタンパク質
の変異体型、すなわちα-ヘリックスの少なくとも1つは作用素因(acting principle)の連
結のために使用されている4つのα-ヘリックスを持つ変種のみを考慮していると思われる
。
ペプチドを含むシステムを開示していると思われる。このポリペプチドは、マルチ-ヘリ
ックスバンドルの形状で、2本以上のα-ヘリックスポリペプチドを含むことができる。米
国特許第7,655,753号のα-ヘリックスポリペプチドは、本明細書に開示されたMTPとは多
くの点で異なる。例えば米国特許第7,655,753号の構築体は、いくつかの異なるα-ヘリッ
クスポリペプチドの集成を非共有的に必要とするようである。対照的に本明細書に開示さ
れたMTPは、単独のポリペプチドである。更に米国特許第7,655,753号は、ROPタンパク質
の変異体型、すなわちα-ヘリックスの少なくとも1つは作用素因(acting principle)の連
結のために使用されている4つのα-ヘリックスを持つ変種のみを考慮していると思われる
。
米国特許第7,655,753号はまた、リンカー部分を介して直接的又は間接的に連結される
標的化タンパク質及びポリペプチドを開示しているようである。リンカー部分は、間接的
連結により、標的化タンパク質を融合タンパク質に結合させる。直接的連結は、ヒドロキ
シ基、カルボキシ基又はアミノ基などの、1つのタンパク質上のいずれか都合の良い官能
基により起こり得る。間接的連結は、連結部分を介して起こるであろう。リンカー部分上
の官能基を使用し、α-ヘリックスと標的化タンパク質の間の共有結合を形成する。
標的化タンパク質及びポリペプチドを開示しているようである。リンカー部分は、間接的
連結により、標的化タンパク質を融合タンパク質に結合させる。直接的連結は、ヒドロキ
シ基、カルボキシ基又はアミノ基などの、1つのタンパク質上のいずれか都合の良い官能
基により起こり得る。間接的連結は、連結部分を介して起こるであろう。リンカー部分上
の官能基を使用し、α-ヘリックスと標的化タンパク質の間の共有結合を形成する。
米国特許第7,655,753号の第9欄の第56〜67行には、「リンカー部分は、二官能性及び多
官能性アルキル、アリール、アラルキル又はペプチド性部分、アルキル、アリール又はア
ラルキルアルデヒドの酸エステル及び無水物、マレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプ
ロピオン酸誘導体及びスクシンイミド誘導体などのスルフヒドリル又はカルボキシル基を
介して化学反応に使用されるか、或いは、臭化シアヌル又は塩化シアヌル、カルボニルジ
イミダゾール、スクシンイミジルエステル又はスルホン酸ハロゲン化物などから誘導体化
され得る。α-ヘリックスと標的化エレメントの間の共有結合の形成に使用されるリンカ
ー部分上の官能基は、例えば、アミノ基、ヒドラジノ基、ヒドロキシル基、チオール基、
マレイミド基、カルボニル基、及びカルボキシル基などの2種以上であってよい。このリ
ンカー部分は、1〜4個のアミノ酸残基の短い配列を含むことができる。」ことが記載され
ている。そのようなリンカー部分は、モジュールと本発明のMTP残余の間のスペーサーの
本発明における使用とは異なる。本発明の一態様において、スペーサー(例えば、可動性
アミノ酸挿入断片)は、受容体へのより高いMTP親和性を実現するために使用される。
官能性アルキル、アリール、アラルキル又はペプチド性部分、アルキル、アリール又はア
ラルキルアルデヒドの酸エステル及び無水物、マレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプ
ロピオン酸誘導体及びスクシンイミド誘導体などのスルフヒドリル又はカルボキシル基を
介して化学反応に使用されるか、或いは、臭化シアヌル又は塩化シアヌル、カルボニルジ
イミダゾール、スクシンイミジルエステル又はスルホン酸ハロゲン化物などから誘導体化
され得る。α-ヘリックスと標的化エレメントの間の共有結合の形成に使用されるリンカ
ー部分上の官能基は、例えば、アミノ基、ヒドラジノ基、ヒドロキシル基、チオール基、
マレイミド基、カルボニル基、及びカルボキシル基などの2種以上であってよい。このリ
ンカー部分は、1〜4個のアミノ酸残基の短い配列を含むことができる。」ことが記載され
ている。そのようなリンカー部分は、モジュールと本発明のMTP残余の間のスペーサーの
本発明における使用とは異なる。本発明の一態様において、スペーサー(例えば、可動性
アミノ酸挿入断片)は、受容体へのより高いMTP親和性を実現するために使用される。
米国特許第7,655,753号のポリペプチドは更に、細胞内標的化ペプチド及び膜活性化ペ
プチドを含む。細胞内標的化ペプチドは、該ポリペプチドの標的化エレメント又はα-ヘ
リックスのいずれか、又は両方に結合することができる。細胞内標的化ペプチドの例は、
核局在化配列(NLS)を含む。追加の配列はまた、インターナリゼーション後、融合タンパ
ク質を含むエンドソームコンパートメントを破壊するよう機能する、膜活性化ペプチドで
あることもできる。これは、そこで治療薬が強力な作用を有することができる細胞の細胞
質ゾルへの、治療薬の放出を促進するであろう。しかし米国特許第7,655,753号は、エン
ドソームコンパートメントの破壊における該ペプチドの作用のpH依存性は明らかにしてい
ない。
プチドを含む。細胞内標的化ペプチドは、該ポリペプチドの標的化エレメント又はα-ヘ
リックスのいずれか、又は両方に結合することができる。細胞内標的化ペプチドの例は、
核局在化配列(NLS)を含む。追加の配列はまた、インターナリゼーション後、融合タンパ
ク質を含むエンドソームコンパートメントを破壊するよう機能する、膜活性化ペプチドで
あることもできる。これは、そこで治療薬が強力な作用を有することができる細胞の細胞
質ゾルへの、治療薬の放出を促進するであろう。しかし米国特許第7,655,753号は、エン
ドソームコンパートメントの破壊における該ペプチドの作用のpH依存性は明らかにしてい
ない。
本明細書に記載のように、本発明のMTPは、特別な条件下でのみ、すなわちわずかに酸
性の環境においてのみ、膜を活性化する特別なモジュールを含み得る。例えばこのモジュ
ールの活性は、pH5.5で最大活性を有することができる。このモジュールのこの作用は、
以下に説明しているように、実験により証明され、且つこれらの条件下で、本出願のMTP
により脂質二重層において細孔形成をもたらすことが示されている。更に、細孔形成に加
え、pH3〜pH6でのエンドソーム／リソソーム活性は、2つのMTPモジュール、すなわちエン
ドソーム分解性モジュールと担体モジュールの組合せ作用の結果であることは理解される
べきである。
性の環境においてのみ、膜を活性化する特別なモジュールを含み得る。例えばこのモジュ
ールの活性は、pH5.5で最大活性を有することができる。このモジュールのこの作用は、
以下に説明しているように、実験により証明され、且つこれらの条件下で、本出願のMTP
により脂質二重層において細孔形成をもたらすことが示されている。更に、細孔形成に加
え、pH3〜pH6でのエンドソーム／リソソーム活性は、2つのMTPモジュール、すなわちエン
ドソーム分解性モジュールと担体モジュールの組合せ作用の結果であることは理解される
べきである。
一態様において、本明細書記載の発明は、後続のエンドソームからのMTP放出のために
、酸性pHで脂質膜中に細孔を形成するために、担体モジュール、HMP、及びエンドソーム
分解性モジュールの組合せ作用を必要としている。同じく本MTPは、特異的細胞内標的化
のためのみではなく、標的細胞の特異的細胞内コンパートメント(すなわち、癌細胞の核)
内の保持のためにも、特別なモジュールを含むことができることも追加されなければなら
ない。
、酸性pHで脂質膜中に細孔を形成するために、担体モジュール、HMP、及びエンドソーム
分解性モジュールの組合せ作用を必要としている。同じく本MTPは、特異的細胞内標的化
のためのみではなく、標的細胞の特異的細胞内コンパートメント(すなわち、癌細胞の核)
内の保持のためにも、特別なモジュールを含むことができることも追加されなければなら
ない。
米国特許第7,655,753号は、ポリペプチドに直接、又はリンカー基により結合されてい
る治療薬又は診断薬も開示している。本明細書に記載のMTPの特徴の一つは、担体モジュ
ールの疎水性ポケットへと非共有的に輸送されるべき薬剤を含むその能力である。以下に
記載のように、これは、(i)直接的に、その後ポケットへ挿入され得るポルフィリン部分
へ、又は(ii)間接的に、すなわちその後ポケットへ挿入され得るポルフィリン誘導体へ連
結されるか：のいずれかで行うことができる。
る治療薬又は診断薬も開示している。本明細書に記載のMTPの特徴の一つは、担体モジュ
ールの疎水性ポケットへと非共有的に輸送されるべき薬剤を含むその能力である。以下に
記載のように、これは、(i)直接的に、その後ポケットへ挿入され得るポルフィリン部分
へ、又は(ii)間接的に、すなわちその後ポケットへ挿入され得るポルフィリン誘導体へ連
結されるか：のいずれかで行うことができる。
別の関連特許は、活性物質の方法に対し、細胞-特異的、コンパートメント-特異的又は
膜-特異的に媒介するためのコンジュゲートに関するBraunらの米国特許第6,821,948号で
ある。このコンジュゲートは、細胞膜への輸送メディエーター、細胞-特異的、コンパー
トメント-特異的又は膜-特異的に対処する(address)タンパク質又はペプチド、並びに輸
送されるべき活性物質：を含む。本明細書記載の発明とは対照的に、米国特許第6,821,94
8号は、薬物の保持機能又は非共有結合を伴うモジュールを開示していない。
膜-特異的に媒介するためのコンジュゲートに関するBraunらの米国特許第6,821,948号で
ある。このコンジュゲートは、細胞膜への輸送メディエーター、細胞-特異的、コンパー
トメント-特異的又は膜-特異的に対処する(address)タンパク質又はペプチド、並びに輸
送されるべき活性物質：を含む。本明細書記載の発明とは対照的に、米国特許第6,821,94
8号は、薬物の保持機能又は非共有結合を伴うモジュールを開示していない。
Gariepyの米国特許第5,674,977号は、標的細胞表面受容体に結合し、標的細胞へ透過し
、且つ所望の作用部位へ診断用プローブ若しくは細胞毒性機能を送達するようにデザイン
することができる、分岐型合成ペプチドコンジュゲートに関する。この発明は、所望の数
の細胞毒性機能、ペプチド-ベースの局在化シグナル又は診断用プローブの体系的組入れ
のために分岐型構造を有する可動性デザインの比較的小型の分子を提供している。Gariep
yは、タンパク質-ベースの治療薬又は診断薬に関連した問題に対処するものとして自身の
発明を説明している。本発明のMTPとは対照的に、Gariepyのシステムは、pH-依存性エン
ドソーム分解機能；保持機能を持つモジュール；又は、薬物の非共有結合：を有さない。
、且つ所望の作用部位へ診断用プローブ若しくは細胞毒性機能を送達するようにデザイン
することができる、分岐型合成ペプチドコンジュゲートに関する。この発明は、所望の数
の細胞毒性機能、ペプチド-ベースの局在化シグナル又は診断用プローブの体系的組入れ
のために分岐型構造を有する可動性デザインの比較的小型の分子を提供している。Gariep
yは、タンパク質-ベースの治療薬又は診断薬に関連した問題に対処するものとして自身の
発明を説明している。本発明のMTPとは対照的に、Gariepyのシステムは、pH-依存性エン
ドソーム分解機能；保持機能を持つモジュール；又は、薬物の非共有結合：を有さない。
Welsらの米国特許第6,498,233号は、例えば遺伝子などの核酸の特異的細胞への標的化
及び該核酸の発現を得ることに適した、毒素、特にジフテリア毒素の転座ドメインを含む
、核酸転移システムに関する。この核酸転移システムは、マルチドメインタンパク質成分
及び核酸成分を含む。Welsはまた、マルチドメインタンパク質、このタンパク質をコード
している核酸、該核酸に適した増幅及び発現システム、並びにそれらの調製方法及び使用
方法にも関する。本明細書記載の発明とは対照的に、Welsは、コンパートメント-特異的
機能、保持機能、又は核酸の輸送機能を開示していない。本明細書記載の本発明の一態様
において、本出願のMTPは、切断型ジフテリア毒素転座ドメインを示しているエンドソー
ム分解性モジュールを有することができる。この切断型(アミノ酸202-384)は、186位及び
201位のシステインに加え、切断可能なアミノ酸ループを内包する、194位のアミノ酸に続
く切断可能なプロテアーゼ部位を破棄するために行われた。
及び該核酸の発現を得ることに適した、毒素、特にジフテリア毒素の転座ドメインを含む
、核酸転移システムに関する。この核酸転移システムは、マルチドメインタンパク質成分
及び核酸成分を含む。Welsはまた、マルチドメインタンパク質、このタンパク質をコード
している核酸、該核酸に適した増幅及び発現システム、並びにそれらの調製方法及び使用
方法にも関する。本明細書記載の発明とは対照的に、Welsは、コンパートメント-特異的
機能、保持機能、又は核酸の輸送機能を開示していない。本明細書記載の本発明の一態様
において、本出願のMTPは、切断型ジフテリア毒素転座ドメインを示しているエンドソー
ム分解性モジュールを有することができる。この切断型(アミノ酸202-384)は、186位及び
201位のシステインに加え、切断可能なアミノ酸ループを内包する、194位のアミノ酸に続
く切断可能なプロテアーゼ部位を破棄するために行われた。
Murphyの米国特許第5,965,406号は、第一の部位、第二の部位、及び第三の部位を含む
ハイブリッドタンパク質をコードしている組換えDNA分子に関する。第一の部位は、該ハ
イブリッドタンパク質の動物細胞への結合を引き起こすのに有効な、細胞結合性ポリペプ
チドリガンドの結合ドメインの一部を含む。第二の部位は、ジフテリア毒素、ボツリヌス
神経毒素、リシン、コレラ毒素、LT毒素、C3毒素、赤痢菌毒素、赤痢菌様毒素、百日咳毒
素及び破傷風毒素からなる群から選択される、天然のタンパク質の転座ドメインの一部を
含み、これは細胞膜を超え細胞の細胞質ゾルへと該第三の部位を移行させる。第三の部位
は、該細胞へ導入されるべきポリペプチド実体を含む。第三の部位は、第二の部位の天然
のタンパク質に対して非天然である。
ハイブリッドタンパク質をコードしている組換えDNA分子に関する。第一の部位は、該ハ
イブリッドタンパク質の動物細胞への結合を引き起こすのに有効な、細胞結合性ポリペプ
チドリガンドの結合ドメインの一部を含む。第二の部位は、ジフテリア毒素、ボツリヌス
神経毒素、リシン、コレラ毒素、LT毒素、C3毒素、赤痢菌毒素、赤痢菌様毒素、百日咳毒
素及び破傷風毒素からなる群から選択される、天然のタンパク質の転座ドメインの一部を
含み、これは細胞膜を超え細胞の細胞質ゾルへと該第三の部位を移行させる。第三の部位
は、該細胞へ導入されるべきポリペプチド実体を含む。第三の部位は、第二の部位の天然
のタンパク質に対して非天然である。
本明細書記載のMTPとは対照的に、米国特許第5,965,406号は、コンパートメント-特異
的機能、保持機能、又は薬物の非共有結合を開示していない。更に本明細書に記載のMTP
は一般に、標的化された核内送達に必要な少なくとも4つのモジュールを有し、且つ特定
の転座ドメイン又は毒素群由来のドメインのみには制限されないであろう。加えて上記の
ように、本出願のMTPは、切断型ジフテリア毒素転座ドメインを表している、エンドソー
ム分解性モジュールを有し得る。
的機能、保持機能、又は薬物の非共有結合を開示していない。更に本明細書に記載のMTP
は一般に、標的化された核内送達に必要な少なくとも4つのモジュールを有し、且つ特定
の転座ドメイン又は毒素群由来のドメインのみには制限されないであろう。加えて上記の
ように、本出願のMTPは、切断型ジフテリア毒素転座ドメインを表している、エンドソー
ム分解性モジュールを有し得る。
Murphyの米国特許第6,022,950号もまた、共有結合により結合されている第一の部位、
第二の部位、及び第三の部位を含むハイブリッド分子を開示している。第一の部位は、該
ハイブリッドタンパク質の動物細胞への結合を引き起こすのに有効な、細胞結合性ポリペ
プチドリガンドの結合ドメインの一部を含む。第二の部位は、天然のタンパク質の転座ド
メインの一部を含み、これは細胞膜を超え細胞の細胞質ゾルへと該第三の部位を移行させ
る。第三の部位は、該細胞へ導入されるべき化学物質を含む。第一の部位と第三の部位は
、該天然のタンパク質に対して非天然であり、且つ更に第二の部位と第三の部位を結合す
る共有結合は、切断可能な結合である。第二の部位が、シュードモナス外毒素転座ドメイ
ンの一部を含む場合、第三の部位はポリペプチドではない。この説明は、MSHは、メラニ
ン細胞に選択的に結合することができ、ハイブリッドとなり、一旦検出可能なラベルによ
り標識されると、これはメラノーマの診断並びに転移性メラノーマ遺伝子座のインビボ及
びインビトロ検出に有用であることを注記している。そのようなハイブリッドは、検出可
能なラベルの代わりに毒素分子の酵素活性のある部位に結合した場合、標的メラノーマ細
胞へ特異的にその毒性活性を送達するために利用することができる。
第二の部位、及び第三の部位を含むハイブリッド分子を開示している。第一の部位は、該
ハイブリッドタンパク質の動物細胞への結合を引き起こすのに有効な、細胞結合性ポリペ
プチドリガンドの結合ドメインの一部を含む。第二の部位は、天然のタンパク質の転座ド
メインの一部を含み、これは細胞膜を超え細胞の細胞質ゾルへと該第三の部位を移行させ
る。第三の部位は、該細胞へ導入されるべき化学物質を含む。第一の部位と第三の部位は
、該天然のタンパク質に対して非天然であり、且つ更に第二の部位と第三の部位を結合す
る共有結合は、切断可能な結合である。第二の部位が、シュードモナス外毒素転座ドメイ
ンの一部を含む場合、第三の部位はポリペプチドではない。この説明は、MSHは、メラニ
ン細胞に選択的に結合することができ、ハイブリッドとなり、一旦検出可能なラベルによ
り標識されると、これはメラノーマの診断並びに転移性メラノーマ遺伝子座のインビボ及
びインビトロ検出に有用であることを注記している。そのようなハイブリッドは、検出可
能なラベルの代わりに毒素分子の酵素活性のある部位に結合した場合、標的メラノーマ細
胞へ特異的にその毒性活性を送達するために利用することができる。
本明細書に記載のMTPとは対照的に、米国特許第6,022,950号は、保持機能、薬物の非共
有結合又は細胞膜を超えた細胞の細胞質ゾルへの転座のための任意のモジュール／機能を
開示していない。
有結合又は細胞膜を超えた細胞の細胞質ゾルへの転座のための任意のモジュール／機能を
開示していない。
(概要)
本発明の重要な態様は、1つの分子内にいくつかの機能性モジュールを含み、且つ標的
細胞へ透過し、モジュラー輸送プラットフォームを標的細胞へ送達し、pH-依存性膜破壊
活性、標的細胞の標的細胞内コンパートメントへの指向された細胞内輸送、及びモジュラ
ー輸送プラットフォーム内の活性物質にカップリングする能力を提供するように構成され
た、モジュラー輸送プラットフォームである。本分子は、モジュラー輸送プラットフォー
ムへの環状テトラピロール部分の非共有的カップリングのためのモジュール；及び、標的
細胞内コンパートメント内にモジュラー輸送プラットフォームを維持するように構成され
たモジュール：を含む。
本発明の重要な態様は、1つの分子内にいくつかの機能性モジュールを含み、且つ標的
細胞へ透過し、モジュラー輸送プラットフォームを標的細胞へ送達し、pH-依存性膜破壊
活性、標的細胞の標的細胞内コンパートメントへの指向された細胞内輸送、及びモジュラ
ー輸送プラットフォーム内の活性物質にカップリングする能力を提供するように構成され
た、モジュラー輸送プラットフォームである。本分子は、モジュラー輸送プラットフォー
ムへの環状テトラピロール部分の非共有的カップリングのためのモジュール；及び、標的
細胞内コンパートメント内にモジュラー輸送プラットフォームを維持するように構成され
たモジュール：を含む。
本モジュラー輸送プラットフォームの実施態様は、下記の特徴の1以上を含んでよい。
例えば、本モジュラー輸送プラットフォームは、下記のモジュールの1以上を含んでよい
：
(1)標的細胞の特異的認識を提供することにより、標的細胞の表面上の特異的受容体を
標的化するための、リガンドモジュール；
(2)標的細胞内でMTPを放出するためにエンドサイトーシス小胞を破壊するための、標的
細胞内のpH-依存性膜破壊活性を提供する、エンドソーム分解性モジュール；
(3)MTPの特定の細胞内コンパートメントへの送達を引き起こす、細胞内輸送モジュール
であって、ここで該細胞内輸送モジュールが、1以上の細胞輸送機構を基に細胞内コンパ
ートメントへMTPを送達するもの；
(4)特定された細胞内巨大分子の認識などの、細胞内認識のためのモジュール；
(5)前述のモジュールを一体化し、且つモジュールを輸送される物質とカップリングさ
せるための、担体モジュール；並びに
(6)MTPにより輸送されるべき物質としての、治療薬、診断薬又は研究用薬剤。
例えば、本モジュラー輸送プラットフォームは、下記のモジュールの1以上を含んでよい
：
(1)標的細胞の特異的認識を提供することにより、標的細胞の表面上の特異的受容体を
標的化するための、リガンドモジュール；
(2)標的細胞内でMTPを放出するためにエンドサイトーシス小胞を破壊するための、標的
細胞内のpH-依存性膜破壊活性を提供する、エンドソーム分解性モジュール；
(3)MTPの特定の細胞内コンパートメントへの送達を引き起こす、細胞内輸送モジュール
であって、ここで該細胞内輸送モジュールが、1以上の細胞輸送機構を基に細胞内コンパ
ートメントへMTPを送達するもの；
(4)特定された細胞内巨大分子の認識などの、細胞内認識のためのモジュール；
(5)前述のモジュールを一体化し、且つモジュールを輸送される物質とカップリングさ
せるための、担体モジュール；並びに
(6)MTPにより輸送されるべき物質としての、治療薬、診断薬又は研究用薬剤。
本MTPは、環状テトラピロール分子の非共有的カップリングのためのモジュールを含ん
でよい。この非共有的カップリングのためのモジュールは、疎水性ポケットを有してよい
。この疎水性ポケットを伴うモジュールは、大腸菌ヘモグロビン-様タンパク質HMPである
。輸送されるべき物質は、疎水性ポケットを介してモジュラー輸送プラットフォームへカ
ップリングされてよい。輸送されるべき物質は、物質の疎水性ポケットへの挿入を介して
モジュラー輸送プラットフォームへカップリングされてよい。輸送されるべき物質は、疎
水性ポケットへ非共有的に挿入されるテトラピロール分子への連結を介して、モジュラー
輸送プラットフォームへカップリングされてよい。これらのテトラピロール分子は、薬物
の非共有結合に使用することができる。輸送されるべき物質は、疎水性ポケットへ挿入さ
れたテトラピロール分子へのカップリングを介して、モジュラー輸送プラットフォームへ
カップリングされてよい。
でよい。この非共有的カップリングのためのモジュールは、疎水性ポケットを有してよい
。この疎水性ポケットを伴うモジュールは、大腸菌ヘモグロビン-様タンパク質HMPである
。輸送されるべき物質は、疎水性ポケットを介してモジュラー輸送プラットフォームへカ
ップリングされてよい。輸送されるべき物質は、物質の疎水性ポケットへの挿入を介して
モジュラー輸送プラットフォームへカップリングされてよい。輸送されるべき物質は、疎
水性ポケットへ非共有的に挿入されるテトラピロール分子への連結を介して、モジュラー
輸送プラットフォームへカップリングされてよい。これらのテトラピロール分子は、薬物
の非共有結合に使用することができる。輸送されるべき物質は、疎水性ポケットへ挿入さ
れたテトラピロール分子へのカップリングを介して、モジュラー輸送プラットフォームへ
カップリングされてよい。
前記輸送されるべき物質は、放射性核種である。
本MTPは、分子全体として細菌により合成されてよい。
本モジュラー輸送プラットフォームは、1又は複数のモジュールの追加のためのドメイ
ンを含み、該ドメインは、キチン-結合ドメイン(CBD)を伴う又は伴わないインテインを含
んでよい。
本MTPは、分子全体として細菌により合成されてよい。
本モジュラー輸送プラットフォームは、1又は複数のモジュールの追加のためのドメイ
ンを含み、該ドメインは、キチン-結合ドメイン(CBD)を伴う又は伴わないインテインを含
んでよい。
本モジュラー輸送プラットフォームは、いくつかの分離された成分として細菌により合
成され、その後これらの成分が統合され、MTPを形成してよい。この分離された成分は、
インテインにより組み合わされてよい。リガンドモジュールは、これらの成分の一つとし
て使用することができる。
成され、その後これらの成分が統合され、MTPを形成してよい。この分離された成分は、
インテインにより組み合わされてよい。リガンドモジュールは、これらの成分の一つとし
て使用することができる。
モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過をもたらすリガンドモジュールは
、細菌により合成されてよい。モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過を実
現するリガンドモジュールは、化学的に合成されてよい。
、細菌により合成されてよい。モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過を実
現するリガンドモジュールは、化学的に合成されてよい。
標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持
機能を伴うモジュールは、細胞内コンパートメント内の特異的構造又は分子と相互作用し
てよい。標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞
内保持機能を伴うモジュールは、細胞核内の特異的構造又は分子と相互作用してよい。標
的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能
を伴うモジュールは、DNAと相互作用してよい。標的細胞の細胞内コンパートメント内の
モジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールは、透明質内の特異
的構造又は分子と相互作用してよい。標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー
輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールは、プロテアソームと相互作用
してよい。
機能を伴うモジュールは、細胞内コンパートメント内の特異的構造又は分子と相互作用し
てよい。標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞
内保持機能を伴うモジュールは、細胞核内の特異的構造又は分子と相互作用してよい。標
的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能
を伴うモジュールは、DNAと相互作用してよい。標的細胞の細胞内コンパートメント内の
モジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールは、透明質内の特異
的構造又は分子と相互作用してよい。標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー
輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールは、プロテアソームと相互作用
してよい。
輸送されるべき作用物質は、モジュラー輸送プラットフォームへ共有的に結合されてよ
い。この輸送されるべき作用物質は、放射性核種又は光増感剤である。
い。この輸送されるべき作用物質は、放射性核種又は光増感剤である。
本発明の更なる態様は、モジュラー輸送プラットフォーム全体が、単独のマルチモジュ
ラー融合タンパク質としてプラスミドによりコードされ得ることであり、ここで該モジュ
ラー輸送プラットフォームは、該モジュラー輸送プラットフォームの選択された標的細胞
への透過、標的細胞内のpH-依存性膜破壊活性、標的細胞内の選択された細胞部位への指
向された細胞内輸送、及び輸送されるべき作用物質の追加をもたらす。この分子は、環状
テトラピロール分子の非共有的カップリングのためのモジュール、及び選択された細胞内
部位内の該モジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールを有する
。本モジュラー輸送プラットフォームは、下記のモジュールを含む：
(1)標的細胞の特異的認識を提供することにより、標的細胞の表面上の特異的受容体を
標的化するための、リガンドモジュール；
(2)標的細胞内でMTPを放出するためにエンドサイトーシス小胞を破壊するための、標的
細胞内のpH-依存性膜破壊活性を提供する、エンドソーム分解性モジュール；
(3)MTPの特定の細胞内コンパートメントへの送達を引き起こす、細胞内輸送モジュール
であって、ここで該細胞内輸送モジュールが、1以上の細胞輸送機構を基に細胞内コンパ
ートメントへMTPを送達するもの；
(4)標的細胞の細胞内コンパートメント内のMTPの保持を確実にするための、細胞内保持
のためのモジュール；
(5)特定された細胞内巨大分子の認識などの、細胞内認識のためのモジュール；
(6)MTPにより輸送されるべき物質としての、治療薬、診断薬又は研究用薬剤；並びに
(7)前述のモジュールを一体化し、且つモジュールを輸送される物質とカップリングさ
せるための、担体モジュール。
ラー融合タンパク質としてプラスミドによりコードされ得ることであり、ここで該モジュ
ラー輸送プラットフォームは、該モジュラー輸送プラットフォームの選択された標的細胞
への透過、標的細胞内のpH-依存性膜破壊活性、標的細胞内の選択された細胞部位への指
向された細胞内輸送、及び輸送されるべき作用物質の追加をもたらす。この分子は、環状
テトラピロール分子の非共有的カップリングのためのモジュール、及び選択された細胞内
部位内の該モジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持機能を伴うモジュールを有する
。本モジュラー輸送プラットフォームは、下記のモジュールを含む：
(1)標的細胞の特異的認識を提供することにより、標的細胞の表面上の特異的受容体を
標的化するための、リガンドモジュール；
(2)標的細胞内でMTPを放出するためにエンドサイトーシス小胞を破壊するための、標的
細胞内のpH-依存性膜破壊活性を提供する、エンドソーム分解性モジュール；
(3)MTPの特定の細胞内コンパートメントへの送達を引き起こす、細胞内輸送モジュール
であって、ここで該細胞内輸送モジュールが、1以上の細胞輸送機構を基に細胞内コンパ
ートメントへMTPを送達するもの；
(4)標的細胞の細胞内コンパートメント内のMTPの保持を確実にするための、細胞内保持
のためのモジュール；
(5)特定された細胞内巨大分子の認識などの、細胞内認識のためのモジュール；
(6)MTPにより輸送されるべき物質としての、治療薬、診断薬又は研究用薬剤；並びに
(7)前述のモジュールを一体化し、且つモジュールを輸送される物質とカップリングさ
せるための、担体モジュール。
本モジュラー輸送プラットフォームをコードしているプラスミドの実施態様は、下記の
特徴又は先に説明された特徴の1以上を含んでよい。
特徴又は先に説明された特徴の1以上を含んでよい。
別の一般的態様において、輸送されるべき治療薬、診断薬又は研究用薬剤をモジュラー
輸送プラットフォームに送達する方法が提供される。本モジュラー輸送プラットフォーム
は：
該モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過；
該モジュラー輸送プラットフォームを放出するための標的細胞内のpH-依存性膜破壊活
性；
標的化された細胞内コンパートメントへの指向された細胞内輸送；
環状テトラピロール分子の非共有的カップリングのためのモジュールへの輸送されるべ
き物質の追加：を達成する1つの分子内の機能性モジュール；並びに
標的細胞の細胞内コンパートメント内の該モジュラー輸送プラットフォームの保持の機
能を伴うモジュール：を含む。本方法は、モジュラー輸送プラットフォームに結合された
輸送されるべき物質を伴うモジュラー輸送プラットフォームの全身注入を含む。
輸送プラットフォームに送達する方法が提供される。本モジュラー輸送プラットフォーム
は：
該モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過；
該モジュラー輸送プラットフォームを放出するための標的細胞内のpH-依存性膜破壊活
性；
標的化された細胞内コンパートメントへの指向された細胞内輸送；
環状テトラピロール分子の非共有的カップリングのためのモジュールへの輸送されるべ
き物質の追加：を達成する1つの分子内の機能性モジュール；並びに
標的細胞の細胞内コンパートメント内の該モジュラー輸送プラットフォームの保持の機
能を伴うモジュール：を含む。本方法は、モジュラー輸送プラットフォームに結合された
輸送されるべき物質を伴うモジュラー輸送プラットフォームの全身注入を含む。
別の一般的態様において、前述のMTPなどの、モジュラー輸送プラットフォームを乾燥
、貯蔵及び再構成する方法が提供される。本方法は、凍結乾燥後に機能性モジュラー輸送
プラットフォームを得るために緩衝液を使用することを含む。
、貯蔵及び再構成する方法が提供される。本方法は、凍結乾燥後に機能性モジュラー輸送
プラットフォームを得るために緩衝液を使用することを含む。
本発明の様々な実施態様の詳細は、添付図面及び下記の説明により示される。本発明の
他の特徴及び利点は、説明、図面及び請求項から明らかであろう。
他の特徴及び利点は、説明、図面及び請求項から明らかであろう。
(図面の説明)
図1は、MTP翻訳後処置の、そのリガンドモジュールの細胞受容体への親和性に対する効果を示すグラフである。
図2A及び2Bは、インテイン及びCBD(キチン-結合ドメイン)-コード領域を有するMTP-コードしているプラスミドの構築、キチン上のアフィニティクロマトグラフィーによる“ブランク”MTPの精製(工程1、キチンとの結合、及び工程2、スルフヒドリル-含有化合物による“ブランク”又はリガンド非結合のMTPの放出)、並びにリガンド非結合MTPのポリペプチドリガンドへのリガンド負荷工程(N-末端システインを伴うリガンドの“ブランク”MTPへの特異的共有結合)を例示する概略図である。
図3は、アポプチン(apoptin)断片を含むMTP、DTox-HMP-apo-EGF、及びそれを欠くMTP、DTox-HMP-NLS-EGFのゲル-シフトアッセイである。DS-DNA(190bp)は、20mM HEPES緩衝液(pH7.4)、10mM NaCl、1mM EDTA中で、MTPと共に、室温で30分間インキュベーションし；ゲル-シフトアッセイは、2％アガロースゲルにおいて、臭化エチジウム染色により実行した。
図4は、下記表に示した結合親和定数で、表面プラズモン共鳴法を用いアッセイした場合の、プラスミドDNAの、DTox-HMP-apo-EGF(左側グラフ)及びDTox-HMP-NLS-EGF(右側グラフ)との相互作用を示すグラフである。
図5は、異なるpH条件でのMTPの溶解度を示すグラフである。
図6は、EGF-含有MTPをコードしているプラスミドの集成プロセスを示す図である。
図7A-Cは、MTPへのCo-クロリン複合体のクロリン誘導体アジドポリエチレングリコール誘導体(図7A)の挿入を図示し、図7Bは、異なるMRT濃度での複合体のソーレー帯からの非線形回帰によりMTP-Co-Chl-PEG-N3スペクトルから算出したMTP濃度に対する、誘導体Co-Chl-PEG-N3画分の吸収スペクトル(ソーレー帯中の溶液の光学密度−0.24)を例示している。図7Cは、MTPに対するCo-Ch1-PEG-N3の結合のMTP濃度依存性を例示している。
図8は、血漿中のMTP-ポルフィリン複合体の安定性を示す。
図9は、B16-F1メラノーマ-有するC57Black/6Jマウスにおける、125I-標識されたDTox-HMP-NLS-αMSHの静脈内注射後の、125Iの腫瘍-対-組織比を示すグラフの対であり、Aは、注射後の時間依存性(11μg MTP)を示し、且つBは、投与量依存性(注射後3時間)を示す。
図10は、マウスにおける、DTox-HMP-NLS-αMSH及びDTox-HMP-NLS-EGF MTPの静脈内注射の3時間後の、腫瘍及び隣接組織のインビボにおける免疫蛍光／顕微鏡イメージングによる局在化の結果を示す一連のパネルである。
図11は、DTox-HMP-NLS-αMSH MTPにコンジュゲートされたバクテリオクロリンp及び遊離バクテリオクロリンpによる光力学療法の有効性比較を報告している。
図12は、遊離クロリンe6と比較した、A431ヒト類表皮癌成長を阻害し、且つ担腫瘍Balb/c ByJIco-nu/nuマウスの生存を増強するための、DTox-HMP-NLS-EGF MTPにコンジュゲートされたクロリンe6を使用する光力学療法の結果を報告している。
(詳細な説明)
過去の研究が、標的細胞上の特異的インターナリゼーション可能な受容体へ治療薬を送
達することができ、受容体-媒介性エンドサイトーシスを介して細胞へインターナリゼー
ションされることができ、エンドソームから逃れることができ、且つ細胞内の特異的細胞
小器官又は細胞内コンパートメントへ標的化することができる輸送体を作製することは可
能であることを示している。しかし、どのようにして治療薬を簡単に且つ効率的に該輸送
体へカップリングするか、及びどのようにして治療薬が標的化された細胞小器官内に保持
されることを確実にするかという問題点が依然存在する。本発明者らは、本発明が、これ
らの両方の要求を効率的且つ効果的に達成する最初のものであると考える。具体的には、
本発明者らは、特異的細胞への、すなわち標的細胞への、及び任意に細胞内の特異的細胞
小器官への、治療薬の送達に広範に適用される新規プラットフォームである、モジュラー
輸送プラットフォーム(MTP)を開発した。概して本MTPは、一緒にMTPを標的化された細胞
の特定のコンパートメントへ標的化し、且つ治療薬をそれらのコンパートメントに到達さ
せる、いくつかの機能性モジュールからなる。本MTPは、下記のモジュール又は成分の1つ
以上を含む：(1)細胞の表面上の特異的受容体を標的化し、これにより標的細胞の特異的
認識を提供する、リガンドモジュール；(2)該細胞内のMTPを放出するために、エンドサイ
トーシス小胞を破壊する、エンドソーム分解性モジュール；(3)細胞輸送機構に頼り、特
定の細胞内コンパートメントへのMTPの送達を引き起こす、細胞内輸送モジュール；(4)標
的細胞の特異的細胞内コンパートメント内のMTPの保持を確実にするが、非-標的細胞にお
いてではそうではない、細胞内保持のためのモジュール；(5)特定された細胞内巨大分子
の認識などの、細胞内認識のためのモジュール；(6)前述のモジュールを一体化し、且つ
該モジュールを輸送される物質とカップリングさせると同時に、他のMTPモジュールの最
適な空間分布を提供するための、担体モジュール；並びに、(7)治療薬、診断薬又は研究
用薬剤。
過去の研究が、標的細胞上の特異的インターナリゼーション可能な受容体へ治療薬を送
達することができ、受容体-媒介性エンドサイトーシスを介して細胞へインターナリゼー
ションされることができ、エンドソームから逃れることができ、且つ細胞内の特異的細胞
小器官又は細胞内コンパートメントへ標的化することができる輸送体を作製することは可
能であることを示している。しかし、どのようにして治療薬を簡単に且つ効率的に該輸送
体へカップリングするか、及びどのようにして治療薬が標的化された細胞小器官内に保持
されることを確実にするかという問題点が依然存在する。本発明者らは、本発明が、これ
らの両方の要求を効率的且つ効果的に達成する最初のものであると考える。具体的には、
本発明者らは、特異的細胞への、すなわち標的細胞への、及び任意に細胞内の特異的細胞
小器官への、治療薬の送達に広範に適用される新規プラットフォームである、モジュラー
輸送プラットフォーム(MTP)を開発した。概して本MTPは、一緒にMTPを標的化された細胞
の特定のコンパートメントへ標的化し、且つ治療薬をそれらのコンパートメントに到達さ
せる、いくつかの機能性モジュールからなる。本MTPは、下記のモジュール又は成分の1つ
以上を含む：(1)細胞の表面上の特異的受容体を標的化し、これにより標的細胞の特異的
認識を提供する、リガンドモジュール；(2)該細胞内のMTPを放出するために、エンドサイ
トーシス小胞を破壊する、エンドソーム分解性モジュール；(3)細胞輸送機構に頼り、特
定の細胞内コンパートメントへのMTPの送達を引き起こす、細胞内輸送モジュール；(4)標
的細胞の特異的細胞内コンパートメント内のMTPの保持を確実にするが、非-標的細胞にお
いてではそうではない、細胞内保持のためのモジュール；(5)特定された細胞内巨大分子
の認識などの、細胞内認識のためのモジュール；(6)前述のモジュールを一体化し、且つ
該モジュールを輸送される物質とカップリングさせると同時に、他のMTPモジュールの最
適な空間分布を提供するための、担体モジュール；並びに、(7)治療薬、診断薬又は研究
用薬剤。
例えば、送達されるべき治療薬が、非常に強力であるか又は毒性がある場合、該強力な
／毒性のある治療薬は、望ましい標的細胞上でのみ発現される受容体を標的化すること、
これにより他の標的化されない細胞に対する副次的損傷を回避することにより、主に又は
もっぱら標的細胞へ送達されるので、本MTPアプローチは、患者にとって非常に有益であ
る。同様に、標的細胞が、他の細胞においてはわずかにのみ発現される特定の受容体を過
剰発現する場合、MTPのそれらの受容体への送達は、治療薬を主に標的細胞へ送達し、特
定の受容体を有する他の標的化されない細胞に対しては最小の副次的損傷を伴うであろう
。その結果理解することができるように、MTPアプローチが機能する特異性は、MTPが親和
性を持つ受容体が標的細胞上で過剰に発現される場合に、大きく増強されるであろう。
／毒性のある治療薬は、望ましい標的細胞上でのみ発現される受容体を標的化すること、
これにより他の標的化されない細胞に対する副次的損傷を回避することにより、主に又は
もっぱら標的細胞へ送達されるので、本MTPアプローチは、患者にとって非常に有益であ
る。同様に、標的細胞が、他の細胞においてはわずかにのみ発現される特定の受容体を過
剰発現する場合、MTPのそれらの受容体への送達は、治療薬を主に標的細胞へ送達し、特
定の受容体を有する他の標的化されない細胞に対しては最小の副次的損傷を伴うであろう
。その結果理解することができるように、MTPアプローチが機能する特異性は、MTPが親和
性を持つ受容体が標的細胞上で過剰に発現される場合に、大きく増強されるであろう。
本MTPは、抗体、ナノ粒子、リポソームなどの既知の薬物送達ビヒクルからMTPをはっき
り区別する独自の特性を有する。下記のリストは本MTPのいくつかの特性を提供し、その1
つ以上が本発明のMTPに存在し得る：1)MTPへ共有的又は非共有的のいずれかで連結される
ことができる広範なスペクトルの物質の送達；2)低い毒性(マウスにおいて示された)；3)
低い免疫原性(マウスにおける遅延型過敏テストによる)；4)医薬品のインビトロ有効性の
、有意な、20〜3,000倍以上の増強；5)インビボにおける(マウスにおいて示された)医薬
品の治療有効性の有意な増強；6)高レベルのMTPの細菌による産出(総可溶性タンパク質の
30％まで)；7)簡単な精製；8)標的細胞型を変更する必要がある場合の、MTPモジュールの
取り換えの可能性；9)生分解性；10)安価な製造；11)MTPを凍結乾燥し、これを室温で維
持し、且つ活性を失うことなくこれを再構成する可能性；並びに、12)長い貯蔵寿命。
り区別する独自の特性を有する。下記のリストは本MTPのいくつかの特性を提供し、その1
つ以上が本発明のMTPに存在し得る：1)MTPへ共有的又は非共有的のいずれかで連結される
ことができる広範なスペクトルの物質の送達；2)低い毒性(マウスにおいて示された)；3)
低い免疫原性(マウスにおける遅延型過敏テストによる)；4)医薬品のインビトロ有効性の
、有意な、20〜3,000倍以上の増強；5)インビボにおける(マウスにおいて示された)医薬
品の治療有効性の有意な増強；6)高レベルのMTPの細菌による産出(総可溶性タンパク質の
30％まで)；7)簡単な精製；8)標的細胞型を変更する必要がある場合の、MTPモジュールの
取り換えの可能性；9)生分解性；10)安価な製造；11)MTPを凍結乾燥し、これを室温で維
持し、且つ活性を失うことなくこれを再構成する可能性；並びに、12)長い貯蔵寿命。
本MTPはまた、2種以上のポリペプチドよりもむしろ、単独のポリペプチドで製造される
という特徴を含む。このことは、2種以上のポリペプチドを含む製品に対し下記の利点を
提供する。第一に、共有結合は、非共有結合よりもより安定しているので[例えば、J.M.
Goddard、J.H. Hotchkissの文献、「生体活性化合物の結合のためのポリマー表面修飾(Po
lymer surface modification for the attachment of bioactive compounds)、Prog. Pol
ym. Sci. 2007, 32: 698-725参照]、MTPは、2種以上のポリペプチドを含む非共有的複合
体よりも、より広範な条件下で安定しているはずである。第二に、MTPは一工程で合成さ
れるので、その製造は常に、2種以上のポリペプチドを含有する複合体の製造よりも、2倍
以上単純である。しかし別の実施において、本MTPは、複数のポリペプチドで製造され得
ることは理解されなければならない。
という特徴を含む。このことは、2種以上のポリペプチドを含む製品に対し下記の利点を
提供する。第一に、共有結合は、非共有結合よりもより安定しているので[例えば、J.M.
Goddard、J.H. Hotchkissの文献、「生体活性化合物の結合のためのポリマー表面修飾(Po
lymer surface modification for the attachment of bioactive compounds)、Prog. Pol
ym. Sci. 2007, 32: 698-725参照]、MTPは、2種以上のポリペプチドを含む非共有的複合
体よりも、より広範な条件下で安定しているはずである。第二に、MTPは一工程で合成さ
れるので、その製造は常に、2種以上のポリペプチドを含有する複合体の製造よりも、2倍
以上単純である。しかし別の実施において、本MTPは、複数のポリペプチドで製造され得
ることは理解されなければならない。
概して、本MTPが治療薬、診断薬又は研究用薬剤の標的化された細胞内送達を提供する
ことができることを確実にするために、本MTPは少なくとも4つのモジュールを有するであ
ろう。
ことができることを確実にするために、本MTPは少なくとも4つのモジュールを有するであ
ろう。
本明細書において使用されるモジュラー輸送プラットフォーム(MTP)は、医薬品及び他
の物質(以後「物質」)の標的細胞への送達、及び一旦標的細胞内へ送達されたら−予め決
定された／所定の細胞内コンパートメントへの送達に関してマルチレベルの特異性を伴う
モジュラー組成物である。本MTPは、分子内“認識”プロセスに加え、受容体-媒介性エン
ドサイトーシス、核細胞質間輸送、及び他のもの、例えばミトコンドリア、ゴルジ装置、
ペルオキシソームなどへの輸送などの、細胞内輸送プロセスを活用する。
の物質(以後「物質」)の標的細胞への送達、及び一旦標的細胞内へ送達されたら−予め決
定された／所定の細胞内コンパートメントへの送達に関してマルチレベルの特異性を伴う
モジュラー組成物である。本MTPは、分子内“認識”プロセスに加え、受容体-媒介性エン
ドサイトーシス、核細胞質間輸送、及び他のもの、例えばミトコンドリア、ゴルジ装置、
ペルオキシソームなどへの輸送などの、細胞内輸送プロセスを活用する。
本明細書に存在し得るデータベース、ウェブページ、記事、書籍などに関する何らかの
言及は、本発明に関連した様々な態様に関する裏付けを提供するために使用される。本参
照の全内容又は関連のある特定の節は、単に紙面のために、本出願内に文章としては明確
に含まれないので、本発明者らは、これらの文書、データベース及びウェブページからの
関連のある一節を引用による組込みに頼る。従って本発明者らはこれにより、本明細書に
言及された全てのデータベース、ウェブページ、記事、書籍などは、それらが言及した開
示についての引用により、それらの全体が本出願中に組み込まれていることを明らかにす
る。
言及は、本発明に関連した様々な態様に関する裏付けを提供するために使用される。本参
照の全内容又は関連のある特定の節は、単に紙面のために、本出願内に文章としては明確
に含まれないので、本発明者らは、これらの文書、データベース及びウェブページからの
関連のある一節を引用による組込みに頼る。従って本発明者らはこれにより、本明細書に
言及された全てのデータベース、ウェブページ、記事、書籍などは、それらが言及した開
示についての引用により、それらの全体が本出願中に組み込まれていることを明らかにす
る。
概して、MTPをデザインするプロセスは、下記工程に従う：
(1. 標的化されるべき病変の選択)
MTPのデザインは、どの治療が、標的細胞の規定された細胞内コンパートメントへの治
療用物質の標的化された送達から恩恵を受けるかを決定することを基礎としている。例え
ば、治療が標的細胞の規定された細胞内コンパートメントへの標的化された送達において
恩恵を示さない場合、本MTPは、より複雑でない送達システムと比べ、ほとんど利点を供
しない。本MTPは、標的細胞上に過剰発現された受容体が、該標的細胞に対し特異的であ
る場合に有利であろう。従って本MTPは、頭頚部癌、食道癌、膠芽細胞腫、膀胱癌などの
、腫瘍学的適用において使用することができる(受容体のより完全な列記に関しては、下
記の「遺伝子が腫瘍形成に関連する変異を含む表面細胞受容体のリスト」を参照されたい
)。本MTPはまた、いくつかの可能性のある医学的適用を挙げると、例えばアテローム動脈
硬化性プラークのアブレーションなどの、心臓病；ウイルス性疾患(例えば、宿主細胞の
排泄、例えばHIV治療のためのビリオン合成の阻害など)；婦人科(例えば、子宮内膜症)に
適用することができる。当業者は、特定の細胞に関与する状態の文献の報告を基に、どの
状態がMTPの適用による治療に適しているかを決定することができる。検索に適したデー
タベースは、www.medscape.com、www.pubmed.gov、及び当業者に公知の他の検索可能な医
学データベースを含む。例えば、標的とする状態が狼瘡である場合、研究者は、www.pubm
ed.govにアクセスし、且つ「狼瘡の標的細胞」などの用語を用い、Medlineデータベース
を検索することができる。研究者は、scholar.google.comなどの公知の検索エンジンを用
い、インターネットを検索することもできる。これらの検索の結果により、研究者は、狼
瘡に相関していることがわかっている細胞を報告している雑誌記事を読むことができる。
(1. 標的化されるべき病変の選択)
MTPのデザインは、どの治療が、標的細胞の規定された細胞内コンパートメントへの治
療用物質の標的化された送達から恩恵を受けるかを決定することを基礎としている。例え
ば、治療が標的細胞の規定された細胞内コンパートメントへの標的化された送達において
恩恵を示さない場合、本MTPは、より複雑でない送達システムと比べ、ほとんど利点を供
しない。本MTPは、標的細胞上に過剰発現された受容体が、該標的細胞に対し特異的であ
る場合に有利であろう。従って本MTPは、頭頚部癌、食道癌、膠芽細胞腫、膀胱癌などの
、腫瘍学的適用において使用することができる(受容体のより完全な列記に関しては、下
記の「遺伝子が腫瘍形成に関連する変異を含む表面細胞受容体のリスト」を参照されたい
)。本MTPはまた、いくつかの可能性のある医学的適用を挙げると、例えばアテローム動脈
硬化性プラークのアブレーションなどの、心臓病；ウイルス性疾患(例えば、宿主細胞の
排泄、例えばHIV治療のためのビリオン合成の阻害など)；婦人科(例えば、子宮内膜症)に
適用することができる。当業者は、特定の細胞に関与する状態の文献の報告を基に、どの
状態がMTPの適用による治療に適しているかを決定することができる。検索に適したデー
タベースは、www.medscape.com、www.pubmed.gov、及び当業者に公知の他の検索可能な医
学データベースを含む。例えば、標的とする状態が狼瘡である場合、研究者は、www.pubm
ed.govにアクセスし、且つ「狼瘡の標的細胞」などの用語を用い、Medlineデータベース
を検索することができる。研究者は、scholar.google.comなどの公知の検索エンジンを用
い、インターネットを検索することもできる。これらの検索の結果により、研究者は、狼
瘡に相関していることがわかっている細胞を報告している雑誌記事を読むことができる。
別の実施態様において、本MTPは、メラノコルチン受容体-1(例えばメラノーマ)、ソマ
トスタチン受容体(例えば髄芽腫)、IL3受容体(例えば急性骨髄性白血病)；Her2/neu及びH
er3に対するインターナリゼーション可能な抗体を保有するMTP(例えば乳癌)：などの、受
容体に特異的なリガンドモジュールを含むことができる。従って、これらの病変は標的化
され得るインターナリゼーション可能な受容体を有するので、これらの病変は、本明細書
に記載のMTPシステムを用い治療することができる。先に列記した受容体は、網羅的且つ
インターナリゼーション可能な受容体ではなく、且つ概してMTPによる標的化に適してい
るものであることは理解されるべきである。
トスタチン受容体(例えば髄芽腫)、IL3受容体(例えば急性骨髄性白血病)；Her2/neu及びH
er3に対するインターナリゼーション可能な抗体を保有するMTP(例えば乳癌)：などの、受
容体に特異的なリガンドモジュールを含むことができる。従って、これらの病変は標的化
され得るインターナリゼーション可能な受容体を有するので、これらの病変は、本明細書
に記載のMTPシステムを用い治療することができる。先に列記した受容体は、網羅的且つ
インターナリゼーション可能な受容体ではなく、且つ概してMTPによる標的化に適してい
るものであることは理解されるべきである。
(2. インターナリゼーション可能な受容体の同定)
本プロセスの第二の工程は、受容体-媒介性エンドサイトーシスを受け得るインターナ
リゼーション可能な受容体の選択に関与する。以下により詳細に説明するように、本MTP
は、効果がある細胞内においてインターナリゼーションされなければならない。MTPのイ
ンターナリゼーションは、MTPのインターナリゼーション可能な受容体への結合により達
成される。一旦インターナリゼーション可能な受容体へ結合されると、MTPを含むエンド
ソームが形成され、これは受容体-媒介性エンドサイトーシスを介して該細胞の内側にMTP
を運搬する。特定の受容体は、インターナリゼーションされるか又は封鎖されるが、他の
ものはされない。当業者は、文献検索を行うことにより、どの受容体がインターナリゼー
ションされ、且つどの受容体がされないかを区別することができる。例えば、当業者が狼
瘡治療のための標的細胞を見つけようとする場合、研究者は、これらの細胞に関連した受
容体について、及びどの細胞がインターナリゼーションされるかについて、同様に文献検
索を実行するであろう。このことを理解し、インターナリゼーション可能な受容体が選択
されるべきである。
本プロセスの第二の工程は、受容体-媒介性エンドサイトーシスを受け得るインターナ
リゼーション可能な受容体の選択に関与する。以下により詳細に説明するように、本MTP
は、効果がある細胞内においてインターナリゼーションされなければならない。MTPのイ
ンターナリゼーションは、MTPのインターナリゼーション可能な受容体への結合により達
成される。一旦インターナリゼーション可能な受容体へ結合されると、MTPを含むエンド
ソームが形成され、これは受容体-媒介性エンドサイトーシスを介して該細胞の内側にMTP
を運搬する。特定の受容体は、インターナリゼーションされるか又は封鎖されるが、他の
ものはされない。当業者は、文献検索を行うことにより、どの受容体がインターナリゼー
ションされ、且つどの受容体がされないかを区別することができる。例えば、当業者が狼
瘡治療のための標的細胞を見つけようとする場合、研究者は、これらの細胞に関連した受
容体について、及びどの細胞がインターナリゼーションされるかについて、同様に文献検
索を実行するであろう。このことを理解し、インターナリゼーション可能な受容体が選択
されるべきである。
例えば、癌及び関連する腫瘍のみを考えてみても、現在、その発現が腫瘍形成時に劇的
に増加し得る多くの受容体がわかっている。下記のリストは、これらの公知の受容体の一
部を提供する。
に増加し得る多くの受容体がわかっている。下記のリストは、これらの公知の受容体の一
部を提供する。
遺伝子が腫瘍形成に関連する変異を含む表面細胞受容体のリスト*
* Sanger(The Wellcome Trust Sanger Institute、ケンブリッジ、英国)により収集され
且つ最新されたデータを基にする
(www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/)
** 標準の国際タンパク質識別子(Swissprot/Refseq)
且つ最新されたデータを基にする
(www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/)
** 標準の国際タンパク質識別子(Swissprot/Refseq)
対応するタンパク質生成物の発現の増加が、上記遺伝子の大部分について認められた：
EGFR[Bacusらの文献、1990；Gillaspyらの文献、1992；Rikimaruらの文献、1992；Ching
らの文献、1993；Untawaleらの文献、1993；Hoi らの文献、1995；Chenらの文献、1999；
Huang及びHarariの文献、1999；Azemarらの文献、2000；Charoenratらの文献、2000；Nou
riらの文献、2000；Charoenratらの文献、2001；Halatschらの文献、2001；Udartらの文
献、2001；Onoらの文献、2002；Earp, IIIらの文献、2003；Ford及びGrandisの文献、200
3；Jungbluthらの文献、2003；Kanematsuらの文献、2003；Ritter及びArteagaの文献、20
03]、ErbB2、例えば総説[Cirisano及びKarlanの文献、1996；Kumar及びYarmand-Bagheri
の文献、2001；Wangらの文献、2001]、線維芽細胞増殖因子受容体[Jacquemierらの文献、
1994；McLeskeyらの文献、1994；Morrisonらの文献、1994；Giriらの文献、1999；Pollet
tらの文献、2002]、肝細胞増殖因子受容体/met-プロト癌遺伝子[Liuらの文献、1998；Por
teらの文献、1998]、神経増殖因子受容体[Walchらの文献、1999]、トランスフェリン受容
体[Hogemann-Savellanoらの文献、2003]。
EGFR[Bacusらの文献、1990；Gillaspyらの文献、1992；Rikimaruらの文献、1992；Ching
らの文献、1993；Untawaleらの文献、1993；Hoi らの文献、1995；Chenらの文献、1999；
Huang及びHarariの文献、1999；Azemarらの文献、2000；Charoenratらの文献、2000；Nou
riらの文献、2000；Charoenratらの文献、2001；Halatschらの文献、2001；Udartらの文
献、2001；Onoらの文献、2002；Earp, IIIらの文献、2003；Ford及びGrandisの文献、200
3；Jungbluthらの文献、2003；Kanematsuらの文献、2003；Ritter及びArteagaの文献、20
03]、ErbB2、例えば総説[Cirisano及びKarlanの文献、1996；Kumar及びYarmand-Bagheri
の文献、2001；Wangらの文献、2001]、線維芽細胞増殖因子受容体[Jacquemierらの文献、
1994；McLeskeyらの文献、1994；Morrisonらの文献、1994；Giriらの文献、1999；Pollet
tらの文献、2002]、肝細胞増殖因子受容体/met-プロト癌遺伝子[Liuらの文献、1998；Por
teらの文献、1998]、神経増殖因子受容体[Walchらの文献、1999]、トランスフェリン受容
体[Hogemann-Savellanoらの文献、2003]。
増殖因子受容体の発現の上昇は、増大した浸潤能及び転移能を伴う疾患進行の好ましく
ない予想と相関することが非常に多い[Chrysogelosらの文献、1994；Itoらの文献、1997
；Xuらの文献、1997；Ciardiello及びTortoraの文献、1998；Dunnらの文献、1998；Hsieh
らの文献、1998；Kwong及びHungの文献、1998；Charoenratらの文献、2000；Chenらの文
献、2001；Hernanらの文献、2003；Khalilらの文献、2003；Baxevanisらの文献、2004]。
ない予想と相関することが非常に多い[Chrysogelosらの文献、1994；Itoらの文献、1997
；Xuらの文献、1997；Ciardiello及びTortoraの文献、1998；Dunnらの文献、1998；Hsieh
らの文献、1998；Kwong及びHungの文献、1998；Charoenratらの文献、2000；Chenらの文
献、2001；Hernanらの文献、2003；Khalilらの文献、2003；Baxevanisらの文献、2004]。
変異が癌それ自身と因果関係がある表面タンパク質とは異なり、多くの他の表面タンパ
ク質は、形成異常が起こる場合の生化学的プロセスにおける細胞内変化のために、正常細
胞と比べ過剰発現されている腫瘍細胞上に存在する。これらは下記のものである：インス
リン受容体−肝癌、乳癌[Frittittaらの文献、1997；Pandiniらの文献、1999；Finlayson
らの文献、2003；Scharf及びBraulkeの文献、2003；Alexiaらの文献、2004]、インスリン
様増殖因子1−様々な癌腫及び骨肉腫、甲状腺腫瘍[Weinerの文献、1995；Xieらの文献、1
999；Pandiniらの文献、1999；Yu及びRohanの文献、2000；Khandwalaらの文献、2000；Ve
llaらの文献、2001；Oubanらの文献、2003；Sekharamらの文献、2003；Gydeeらの文献、2
004；Gharibらの文献、2004]、ソマトスタチン−神経内分泌腫瘍[de Jongらの文献、2002
；Kwekkeboom及びKrenningの文献、2002；de Herderらの文献、2004]、α-メラニン細胞
刺激ホルモン−メラノーマ[Jiang らの文献、1996；Funasakaらの文献、1999；Loirらの
文献、1999；Wikbergらの文献、2000]、低密度リポタンパク質−リンパ腫、癌腫[Vitols
らの文献、1996；Tatidisらの文献、2002]、マクロファージ刺激タンパク質(マクロファ
ージ分布因子)−乳癌[Maggioraらの文献、1998；Peaceらの文献、2001]、葉酸(folate)−
脳及び卵巣の腫瘍[Weitmanらの文献、1992；Mantovaniらの文献、1994]、及び当業者に公
知の他のもの。
ク質は、形成異常が起こる場合の生化学的プロセスにおける細胞内変化のために、正常細
胞と比べ過剰発現されている腫瘍細胞上に存在する。これらは下記のものである：インス
リン受容体−肝癌、乳癌[Frittittaらの文献、1997；Pandiniらの文献、1999；Finlayson
らの文献、2003；Scharf及びBraulkeの文献、2003；Alexiaらの文献、2004]、インスリン
様増殖因子1−様々な癌腫及び骨肉腫、甲状腺腫瘍[Weinerの文献、1995；Xieらの文献、1
999；Pandiniらの文献、1999；Yu及びRohanの文献、2000；Khandwalaらの文献、2000；Ve
llaらの文献、2001；Oubanらの文献、2003；Sekharamらの文献、2003；Gydeeらの文献、2
004；Gharibらの文献、2004]、ソマトスタチン−神経内分泌腫瘍[de Jongらの文献、2002
；Kwekkeboom及びKrenningの文献、2002；de Herderらの文献、2004]、α-メラニン細胞
刺激ホルモン−メラノーマ[Jiang らの文献、1996；Funasakaらの文献、1999；Loirらの
文献、1999；Wikbergらの文献、2000]、低密度リポタンパク質−リンパ腫、癌腫[Vitols
らの文献、1996；Tatidisらの文献、2002]、マクロファージ刺激タンパク質(マクロファ
ージ分布因子)−乳癌[Maggioraらの文献、1998；Peaceらの文献、2001]、葉酸(folate)−
脳及び卵巣の腫瘍[Weitmanらの文献、1992；Mantovaniらの文献、1994]、及び当業者に公
知の他のもの。
腫瘍における上昇したタンパク質発現は、必ずしも遺伝子増幅に関連付けられないこと
も言及する価値がある。多くの例が存在する：遺伝子増幅を伴わない癌遺伝子の発現の増
加[Chaffanetらの文献、1992；Kolibaba及びDrukerの文献、1997a；Perezらの文献、2002
；Nakamuraらの文献、2003；Muellerらの文献、2004；Kerstingらの文献、2004；Mrhalov
aらの文献、2005；Saxbyらの文献、2005]、及び発現レベルの上昇を伴わない遺伝子コピ
ー数の増加[Dawkinsらの文献、1993；Kolibaba及びDrukerの文献、1997b；Durbecqらの文
献、2004]。
も言及する価値がある。多くの例が存在する：遺伝子増幅を伴わない癌遺伝子の発現の増
加[Chaffanetらの文献、1992；Kolibaba及びDrukerの文献、1997a；Perezらの文献、2002
；Nakamuraらの文献、2003；Muellerらの文献、2004；Kerstingらの文献、2004；Mrhalov
aらの文献、2005；Saxbyらの文献、2005]、及び発現レベルの上昇を伴わない遺伝子コピ
ー数の増加[Dawkinsらの文献、1993；Kolibaba及びDrukerの文献、1997b；Durbecqらの文
献、2004]。
先に言及された文献は、標的化に適した選択された受容体を表すものとして、本明細書
中に組み込まれている：
中に組み込まれている：
前記リストは、腫瘍を標的とするリガンドを詳述しているが、類似のリストが使用可能
であるか、又は一般に心臓血管系、神経科学、炎症、呼吸器病態、HIV、感染症などの他
の治療分野に関する文献から集めることができる。
であるか、又は一般に心臓血管系、神経科学、炎症、呼吸器病態、HIV、感染症などの他
の治療分野に関する文献から集めることができる。
(3. リガンドモジュールの選択)
選択された過剰発現している受容体／表面タンパク質標的により、リガンドモジュール
を選択することができる。このリガンドモジュールは、MTPにおいて2つの機能を有する：
1)標的細胞の特異的認識、及び2)選択的受容体-媒介性エンドサイトーシスを介した標的
細胞への透過。このリガンドモジュールは、選択された過剰発現している受容体への、利
用可能な広範なリガンドから選択することができる。当業者は、例えば該受容体に対し親
和性を有することが分かっているリガンドの文献検索により選択された受容体を基に好適
なリガンドを容易に選択することができる。例えば、リガンドのリストを提供する1つの
オンラインデータベースは、9436種のリガンドのリスト(2011年6月8日時点で)を提供する
欧州バイオインフォマティクス研究(www.ebi.ac.uk)において見られる。このリガンドリ
ストの内容は、好適なリガンドを提供する際のその使用に関して、引用により本明細書中
に組み込まれている。このリストは、欧州タンパク質構造データバンク(PDB)において、
タンパク質又はDNA/RNAに結合した完全体の分子の構造全てを与えるものとされている。
このリストにより、当業者は、関心対象の受容体を検索し、且つその受容体と結合するの
に好適なリガンドを見出すことができる。リガンド分子のリストの具体的なインターネッ
トアドレスは、下記で認められる：
www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/vctr/ligands_search.pl?template=tmp
lt33
選択された過剰発現している受容体／表面タンパク質標的により、リガンドモジュール
を選択することができる。このリガンドモジュールは、MTPにおいて2つの機能を有する：
1)標的細胞の特異的認識、及び2)選択的受容体-媒介性エンドサイトーシスを介した標的
細胞への透過。このリガンドモジュールは、選択された過剰発現している受容体への、利
用可能な広範なリガンドから選択することができる。当業者は、例えば該受容体に対し親
和性を有することが分かっているリガンドの文献検索により選択された受容体を基に好適
なリガンドを容易に選択することができる。例えば、リガンドのリストを提供する1つの
オンラインデータベースは、9436種のリガンドのリスト(2011年6月8日時点で)を提供する
欧州バイオインフォマティクス研究(www.ebi.ac.uk)において見られる。このリガンドリ
ストの内容は、好適なリガンドを提供する際のその使用に関して、引用により本明細書中
に組み込まれている。このリストは、欧州タンパク質構造データバンク(PDB)において、
タンパク質又はDNA/RNAに結合した完全体の分子の構造全てを与えるものとされている。
このリストにより、当業者は、関心対象の受容体を検索し、且つその受容体と結合するの
に好適なリガンドを見出すことができる。リガンド分子のリストの具体的なインターネッ
トアドレスは、下記で認められる：
www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/vctr/ligands_search.pl?template=tmp
lt33
受容体が、好適なリガンドリストが容易に入手できない新たに発見された受容体である
場合、研究者は、該受容体に親和性のある好適なリガンドを実験的に決定することができ
る。リガンドモジュールの選択においては、多くの要因が考慮されなければならない。第
一に、リガンドは、受容体に最適な親和性を有さなければならない。例えばリガンドは、
特定の受容体に対して又は非常に限定された数の受容体に対して選択されなければならな
い。MTPの一つの目的は、MTPの特異的細胞への標的化であるので、リガンド選択性は、そ
の製品の有効性及び安全性に恩恵をもたらす。リガンドが、特定の受容体に対し非常に選
択性であるように選択することができる場合、これは非標的細胞上の受容体に結合するリ
ガンド及びMTPにより引き起こされる副作用のリスクを低下するであろう。選択的リガン
ドの必要性のより具体的な例として、遺伝子治療におけるRNA又はDNAの送達が考えられる
。リガンドが十分に選択性でない場合、MTPは、標的化されてはならない細胞へ送達され
るであろう。RNA又はDNAが、遺伝子治療により損傷を受けるであろう細胞型に送達される
場合、患者は、壊滅的な結果を被るであろう。
場合、研究者は、該受容体に親和性のある好適なリガンドを実験的に決定することができ
る。リガンドモジュールの選択においては、多くの要因が考慮されなければならない。第
一に、リガンドは、受容体に最適な親和性を有さなければならない。例えばリガンドは、
特定の受容体に対して又は非常に限定された数の受容体に対して選択されなければならな
い。MTPの一つの目的は、MTPの特異的細胞への標的化であるので、リガンド選択性は、そ
の製品の有効性及び安全性に恩恵をもたらす。リガンドが、特定の受容体に対し非常に選
択性であるように選択することができる場合、これは非標的細胞上の受容体に結合するリ
ガンド及びMTPにより引き起こされる副作用のリスクを低下するであろう。選択的リガン
ドの必要性のより具体的な例として、遺伝子治療におけるRNA又はDNAの送達が考えられる
。リガンドが十分に選択性でない場合、MTPは、標的化されてはならない細胞へ送達され
るであろう。RNA又はDNAが、遺伝子治療により損傷を受けるであろう細胞型に送達される
場合、患者は、壊滅的な結果を被るであろう。
第二に、リガンドは、受容体へのその親和性を大きく変更することなく修飾を許可する
ことが可能でなければならない。リガンドは、例えばMTPへの組込み時に修飾されてよく
、これによりその親和性に潜在的に影響を及ぼす。
ことが可能でなければならない。リガンドは、例えばMTPへの組込み時に修飾されてよく
、これによりその親和性に潜在的に影響を及ぼす。
同じくこの工程の一部は、リガンドモジュールとMTP部分の残余部分との間にスペーサ
ーを含むかどうかの分析である。この分析は、選択された過剰発現された受容体、そのリ
ガンド、及びMTP部分内のリガンドの位置の特性を知ることを基にしている。例えば、メ
ラノコルチン受容体の活性部位は、それらの構造内の深部であり[Prusis, P.、Schioth H
.B.、Muceniece R.、Herzyk P.、Afshar M.、Hubbard R.E.、Wikberg J.E.S.の文献、「
ヒトメラノコルチン1受容体の三次元構造のモデル化、自動方法の使用、及び剛性の環状
メラノサイト刺激ホルモンコアペプチドとのドッキング(Modeling of the three-dimensi
onal structure of the human melanocortin 1 receptor, using an automated method a
nd docking of a rigid cyclic melanocyte-stimulating hormone core peptide)」、J.
Mol. Graphics Modelling 15:307-317, 1997；Yang X.、Wang Z.、Dong W.、Ling L.、Ya
ng H.、Chen R.の文献、「ヒトメラノコルチン4受容体の三次元構造のモデル化及びドッ
キング(Modeling and Docking of the Three-Dimensional Structure of the Human Mela
nocortin 4 Receptor)」、J. Protein Chem., 2003, 22:335-344；Lapinsh M.、Veiksina
S.、Uhlen S.、Petrovska R.、Mutule I.、Mutulis F.、Yahorava S.、Prusis P.、Wikb
erg J.E.の文献、「有機化合物のメラノコルチン受容体亜型との相互作用のプロテオケモ
メトリックマッピング(Proteochemometric mapping of the interaction of organic com
pounds with melanocortin receptor subtypes)」、Mol. Pharmacol. 2005；67(1):50-59
]、そのため、受容体活性部位へのその親和性を低下しないために、MTP内でα-メラノサ
イト-刺激ホルモン残基(リガンドモジュール)に対しより多くの空間的自由度を提供する
ことが必要である。受容体の特性を知ることにより、受容体に対するMTPの特異性を増大
するために、スペーサーが使用されなければならないかどうかが決定される。
ーを含むかどうかの分析である。この分析は、選択された過剰発現された受容体、そのリ
ガンド、及びMTP部分内のリガンドの位置の特性を知ることを基にしている。例えば、メ
ラノコルチン受容体の活性部位は、それらの構造内の深部であり[Prusis, P.、Schioth H
.B.、Muceniece R.、Herzyk P.、Afshar M.、Hubbard R.E.、Wikberg J.E.S.の文献、「
ヒトメラノコルチン1受容体の三次元構造のモデル化、自動方法の使用、及び剛性の環状
メラノサイト刺激ホルモンコアペプチドとのドッキング(Modeling of the three-dimensi
onal structure of the human melanocortin 1 receptor, using an automated method a
nd docking of a rigid cyclic melanocyte-stimulating hormone core peptide)」、J.
Mol. Graphics Modelling 15:307-317, 1997；Yang X.、Wang Z.、Dong W.、Ling L.、Ya
ng H.、Chen R.の文献、「ヒトメラノコルチン4受容体の三次元構造のモデル化及びドッ
キング(Modeling and Docking of the Three-Dimensional Structure of the Human Mela
nocortin 4 Receptor)」、J. Protein Chem., 2003, 22:335-344；Lapinsh M.、Veiksina
S.、Uhlen S.、Petrovska R.、Mutule I.、Mutulis F.、Yahorava S.、Prusis P.、Wikb
erg J.E.の文献、「有機化合物のメラノコルチン受容体亜型との相互作用のプロテオケモ
メトリックマッピング(Proteochemometric mapping of the interaction of organic com
pounds with melanocortin receptor subtypes)」、Mol. Pharmacol. 2005；67(1):50-59
]、そのため、受容体活性部位へのその親和性を低下しないために、MTP内でα-メラノサ
イト-刺激ホルモン残基(リガンドモジュール)に対しより多くの空間的自由度を提供する
ことが必要である。受容体の特性を知ることにより、受容体に対するMTPの特異性を増大
するために、スペーサーが使用されなければならないかどうかが決定される。
(4. マルチレベル特異性のための1以上の特定されたモジュールの封入)
次の工程は、標的細胞へのMTPの透過を確実にするためのマルチレベル特異性の他の段
階を標的化するために、MTP部分内の特定されたモジュールを提供するために必要とされ
る分析及びデザインである。そのようなモジュールの一つは、エンドソーム分解性モジュ
ールである。エンドソーム分解性モジュールは、本明細書において、小胞内のMTP分解前
の適切な期間内でエンドサイトーシス小胞を「破壊する」モジュールとして定義されてい
る。MTPは、受容体-媒介性エンドサイトーシスの結果として、小胞内にある。エンドソー
ム分解性モジュールのデザインにおいて、ポリペプチド又はその断片は、エンドソームの
pHで、ポリペプチド／タンパク質又はその一部が細胞膜を通り透過することを可能にする
公知のポリペプチド／タンパク質のスペクトルから選択される。ポリペプチド又はその断
片は、pH7〜7.4(通常細胞外のpH)で不活性であるが、それよりも低いより酸性のpH(典型
的エンドサイトーシス小胞のpH)では活性化するという特性を有さなければならない。よ
り低いpHで、該ポリペプチドは、小胞への開口部の形成を生じる高次構造の変化を有する
。膜中の開口部の形成は、小胞の不安定性及びその最終的な破壊を引き起こし、これによ
りMTPを細胞内部へ放出する。
次の工程は、標的細胞へのMTPの透過を確実にするためのマルチレベル特異性の他の段
階を標的化するために、MTP部分内の特定されたモジュールを提供するために必要とされ
る分析及びデザインである。そのようなモジュールの一つは、エンドソーム分解性モジュ
ールである。エンドソーム分解性モジュールは、本明細書において、小胞内のMTP分解前
の適切な期間内でエンドサイトーシス小胞を「破壊する」モジュールとして定義されてい
る。MTPは、受容体-媒介性エンドサイトーシスの結果として、小胞内にある。エンドソー
ム分解性モジュールのデザインにおいて、ポリペプチド又はその断片は、エンドソームの
pHで、ポリペプチド／タンパク質又はその一部が細胞膜を通り透過することを可能にする
公知のポリペプチド／タンパク質のスペクトルから選択される。ポリペプチド又はその断
片は、pH7〜7.4(通常細胞外のpH)で不活性であるが、それよりも低いより酸性のpH(典型
的エンドサイトーシス小胞のpH)では活性化するという特性を有さなければならない。よ
り低いpHで、該ポリペプチドは、小胞への開口部の形成を生じる高次構造の変化を有する
。膜中の開口部の形成は、小胞の不安定性及びその最終的な破壊を引き起こし、これによ
りMTPを細胞内部へ放出する。
従って概して、タンパク質、ポリペプチド又はそれらの断片は、MTPが細胞へ放出され
るように、小胞の膜壁を崩壊することが可能である特性を有さなければならない。好まし
くは、タンパク質、ポリペプチド又は断片は、エンドソームの内部の流体のより低いpH特
徴での高次構造の変化によりこの機能を達成するが、一方それによりMTPが送達される体
液のより高いpH特徴では不活性であろう。そのようなタンパク質は、文献の検索を実行す
ることにより、当業者により容易に決定される。そのようなタンパク質(又はポリペプチ
ド若しくは断片)は、天然物又は人工物であり得る。
るように、小胞の膜壁を崩壊することが可能である特性を有さなければならない。好まし
くは、タンパク質、ポリペプチド又は断片は、エンドソームの内部の流体のより低いpH特
徴での高次構造の変化によりこの機能を達成するが、一方それによりMTPが送達される体
液のより高いpH特徴では不活性であろう。そのようなタンパク質は、文献の検索を実行す
ることにより、当業者により容易に決定される。そのようなタンパク質(又はポリペプチ
ド若しくは断片)は、天然物又は人工物であり得る。
例として、下記の膜-活性ペプチドの配列も、使用することができる：
[Li W, Nicol F、Szoka FC Jr.の文献、「GALA：薬物及び遺伝子送達における適用を持
つデザインされた合成pH-反応性両親媒性ペプチド(GALA: a designed synthetic pH-resp
onsive amphipathic peptide with applications in drug and gene delivery)」、Adv D
rug Deliv Rev. 2004；56(7):967-985]；
[Moore NM、Sheppard CL、Barbour TR、Sakiyama-Elbert SE.の文献、「ポリエチレング
リコール-ベースのビヒクルのインビトロ遺伝子送達に対するエンドソームエスケープペ
プチドの効果(The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery o
f polyethylene glycol-based vehicles)」、J Gene Med. 2008；10(10):1134-1149]；単
純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Hの誘導性(fusogenic)セグメント
[Tu Y、Kim JS.の文献、「陽イオン性リポソームのトランスフェクション効率を増強する
単純ヘルペスウイルス由来の糖タンパク質Hの融合性セグメント(A fusogenic segment of
glycoprotein H from herpes simplex virus enhances transfection efficiency of ca
tionic liposomes)」、J Gene Med. 2008；10(6):646-654]。
つデザインされた合成pH-反応性両親媒性ペプチド(GALA: a designed synthetic pH-resp
onsive amphipathic peptide with applications in drug and gene delivery)」、Adv D
rug Deliv Rev. 2004；56(7):967-985]；
リコール-ベースのビヒクルのインビトロ遺伝子送達に対するエンドソームエスケープペ
プチドの効果(The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery o
f polyethylene glycol-based vehicles)」、J Gene Med. 2008；10(10):1134-1149]；単
純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Hの誘導性(fusogenic)セグメント
単純ヘルペスウイルス由来の糖タンパク質Hの融合性セグメント(A fusogenic segment of
glycoprotein H from herpes simplex virus enhances transfection efficiency of ca
tionic liposomes)」、J Gene Med. 2008；10(6):646-654]。
先に説明されたように、このモジュールは、特別な条件下でのみ、すなわちわずかに酸
性の環境においてのみ、膜を活性化する。例えば、モジュールの活性は、pH5.5で最大活
性を有し得る。このモジュールのこの作用は、これらの条件下で、MTPにより脂質二重層
に細孔形成を生じることが示されている。更に細孔形成に加え、pH3〜pH6でのエンドソー
ム／リソソーム活性は、2種のMTPモジュール、すなわちエンドソーム分解性モジュールと
担体モジュールの組合せ作用の結果であることは理解されなければならない。
性の環境においてのみ、膜を活性化する。例えば、モジュールの活性は、pH5.5で最大活
性を有し得る。このモジュールのこの作用は、これらの条件下で、MTPにより脂質二重層
に細孔形成を生じることが示されている。更に細孔形成に加え、pH3〜pH6でのエンドソー
ム／リソソーム活性は、2種のMTPモジュール、すなわちエンドソーム分解性モジュールと
担体モジュールの組合せ作用の結果であることは理解されなければならない。
第二の特定されたモジュールは、細胞輸送機構による、特異的細胞内コンパートメント
へのMTPの送達を確実にするための、細胞内輸送のために選択される。そのようなコンパ
ートメントの例は、核、核小体、エンドサイトーシス小胞、小胞体、ゴルジ装置、透明質
などを含む。細胞内輸送のためのモジュールのデザインにおいて、アミノ酸配列は、これ
らのポリペプチド／タンパク質の所望の細胞内標的コンパートメントへの細胞内輸送を確
実にするポリペプチド／タンパク質の公知の配列のスペクトルから選択される。選択され
たアミノ酸配列は、標的化された細胞内コンパートメントを基に決定される。先に注記し
たように、そのようなアミノ酸配列は、当該技術分野において公知であり、且つ特定の細
胞内コンパートメントを標的化する任意の配列が適している。この配列は、特異的細胞小
器官を標的化するアミノ酸配列に関する文献を検索することにより認めることができる。
へのMTPの送達を確実にするための、細胞内輸送のために選択される。そのようなコンパ
ートメントの例は、核、核小体、エンドサイトーシス小胞、小胞体、ゴルジ装置、透明質
などを含む。細胞内輸送のためのモジュールのデザインにおいて、アミノ酸配列は、これ
らのポリペプチド／タンパク質の所望の細胞内標的コンパートメントへの細胞内輸送を確
実にするポリペプチド／タンパク質の公知の配列のスペクトルから選択される。選択され
たアミノ酸配列は、標的化された細胞内コンパートメントを基に決定される。先に注記し
たように、そのようなアミノ酸配列は、当該技術分野において公知であり、且つ特定の細
胞内コンパートメントを標的化する任意の配列が適している。この配列は、特異的細胞小
器官を標的化するアミノ酸配列に関する文献を検索することにより認めることができる。
例えば、核が特異的コンパートメントとして選択される場合、好適な配列は、核局在化
シグナルのデータベース(NLSdb、http://rostlab.org/services/nlsdb/)において認める
ことができる。腫瘍細胞-増強された核蓄積のための関心対象の部分は、T108部位での腫
瘍細胞-特異性リン酸化が核外輸送を不活性化するニワトリ貧血ウイルス(CAV)ウイルスタ
ンパク質3(VP3)又はアポプチン(残基74-121)由来の“T-NLS”であり、これは腫瘍細胞に
おけるより高い核蓄積に繋がる[Poon IK、Oro C、Dias MM、Zhang J、Jans DAの文献、「
アポプチン核蓄積は正常細胞において活性があるが腫瘍細胞においては活性がないCRM1-
認識された核外輸送シグナルにより調節される(Apoptin nuclear accumulation is modul
ated by a CRM1-recognized nuclear export signal that is active in normal but not
in tumor cells)」、Cancer Res. 2005； 65(16): 7059-7064；Kuusisto HV、Wagstaff
KM、Alvisi G、Jans DAの文献、「アポプチンC-末端は独自の腫瘍細胞-増強された核標的
化モジュールを示す(The C-terminus of apoptin represents a unique tumor cell-enha
nced nuclear targeting module)」、Int J Cancer. 2008；123(12): 2965-2969]。ある
いは、最適化された又は修飾されたNLSは、シミアンウイルスSV40ラージ腫瘍抗原の最適
化されたNLS(opT-NLS)：
などを使用することができ[Akhlynina TV、Rosenkranz AA、Jans DA、Statsiuk NV、Bala
shova IYu、Toth G、Pavo I、Rubin AB、Sobolev ASの文献、「その光感受活性を増強す
るクロリンe6の核標的化(Nuclear targeting of chlorin e6 enhances its photosensitizing activity)」、J. Biol. Chem. 1997, 272: 20328-20331]、ここでT-抗原アミノ酸111-132の配列は、T124の核輸送阻害サイクリン依存性キナーゼリン酸化部位を不活性化するように、123位及び124位で置換されている(AAにより置換されたST)[Fulcher AJ、Roth DM、Fatima S、Alvisi G、Jans DAの文献、「BRCA-1結合タンパク質BRAP2は核局在化シグナルに隣接するリン酸化に依存したウイルスタンパク質の核内移行の新規の負のレギュレーターである(The BRCA-1 binding protein BRAP2 is a novel, negative regulator of nuclear import of viral proteins, dependent on phosphorylation flanking the nuclear localization signal)」、FASEB J. 2010； 24(5):1454-1466]。
シグナルのデータベース(NLSdb、http://rostlab.org/services/nlsdb/)において認める
ことができる。腫瘍細胞-増強された核蓄積のための関心対象の部分は、T108部位での腫
瘍細胞-特異性リン酸化が核外輸送を不活性化するニワトリ貧血ウイルス(CAV)ウイルスタ
ンパク質3(VP3)又はアポプチン(残基74-121)由来の“T-NLS”であり、これは腫瘍細胞に
おけるより高い核蓄積に繋がる[Poon IK、Oro C、Dias MM、Zhang J、Jans DAの文献、「
アポプチン核蓄積は正常細胞において活性があるが腫瘍細胞においては活性がないCRM1-
認識された核外輸送シグナルにより調節される(Apoptin nuclear accumulation is modul
ated by a CRM1-recognized nuclear export signal that is active in normal but not
in tumor cells)」、Cancer Res. 2005； 65(16): 7059-7064；Kuusisto HV、Wagstaff
KM、Alvisi G、Jans DAの文献、「アポプチンC-末端は独自の腫瘍細胞-増強された核標的
化モジュールを示す(The C-terminus of apoptin represents a unique tumor cell-enha
nced nuclear targeting module)」、Int J Cancer. 2008；123(12): 2965-2969]。ある
いは、最適化された又は修飾されたNLSは、シミアンウイルスSV40ラージ腫瘍抗原の最適
化されたNLS(opT-NLS)：
shova IYu、Toth G、Pavo I、Rubin AB、Sobolev ASの文献、「その光感受活性を増強す
るクロリンe6の核標的化(Nuclear targeting of chlorin e6 enhances its photosensitizing activity)」、J. Biol. Chem. 1997, 272: 20328-20331]、ここでT-抗原アミノ酸111-132の配列は、T124の核輸送阻害サイクリン依存性キナーゼリン酸化部位を不活性化するように、123位及び124位で置換されている(AAにより置換されたST)[Fulcher AJ、Roth DM、Fatima S、Alvisi G、Jans DAの文献、「BRCA-1結合タンパク質BRAP2は核局在化シグナルに隣接するリン酸化に依存したウイルスタンパク質の核内移行の新規の負のレギュレーターである(The BRCA-1 binding protein BRAP2 is a novel, negative regulator of nuclear import of viral proteins, dependent on phosphorylation flanking the nuclear localization signal)」、FASEB J. 2010； 24(5):1454-1466]。
第三の特定されたモジュールは、MTPによる特異的細胞内巨大分子の特異的認識のため
に選択することができる。標的化され得る細胞内巨大分子の例は、DNA、RNA、タンパク質
、糖質などを含む。細胞内認識のためのモジュールのデザインにおいて、ポリペプチド又
はその断片は、標的細胞の所与のコンパートメント内の特定型の分子への最適な特異的結
合が可能である公知のポリペプチド／タンパク質のスペクトルから選択される。実質的に
、第二の特定されたモジュールは、MTPを特異的細胞小器官へ輸送させ、且つ第三の特定
されたモジュールは、MTPを該細胞小器官へ結合させる。
に選択することができる。標的化され得る細胞内巨大分子の例は、DNA、RNA、タンパク質
、糖質などを含む。細胞内認識のためのモジュールのデザインにおいて、ポリペプチド又
はその断片は、標的細胞の所与のコンパートメント内の特定型の分子への最適な特異的結
合が可能である公知のポリペプチド／タンパク質のスペクトルから選択される。実質的に
、第二の特定されたモジュールは、MTPを特異的細胞小器官へ輸送させ、且つ第三の特定
されたモジュールは、MTPを該細胞小器官へ結合させる。
例えば、オンラインデータベースFootprintDBは、DNA-結合するポリペプチドモチーフ
のリストを提供し、これはEstacion Experimental de Aula Dei(EEAD) (floresta.eead.c
sic.es/footprintdb/?documentation)において認められ、4760種のアミノ酸モチーフを提
供している(2011年6月17日時点で)。別のタンパク質と相互作用する、抗体ではないタン
パク質は、ウェブ-ベースの「タンパク質相互作用ネットワーク解析プラットフォーム(PI
NA)」において認めることができ、これは6種のデータベースのタンパク質−タンパク質相
互作用データを統合し、且つネットワークの構築、フィルタリング、解析及び可視化のツ
ールを提供している。そのインターネット上のアドレスは、csbi.ltdk.helsinki.fi/pina
/home.doである。糖質部分と特異的に相互作用するタンパク質は、インド科学大学(IISc)
のバイオンフォマティクスセンターのレクチンデータベース、LectinDB (proline.physic
s.iisc.ernet.in/home/Software_and_Databases#Lectin_Database)において認めることが
できる。多くの細胞内分子は、ナノボディ、単一特異性又は二重特異性ダイアボディなど
を含む様々な形態でMTPに含まれ得る抗体の使用により、標的化することができる。
のリストを提供し、これはEstacion Experimental de Aula Dei(EEAD) (floresta.eead.c
sic.es/footprintdb/?documentation)において認められ、4760種のアミノ酸モチーフを提
供している(2011年6月17日時点で)。別のタンパク質と相互作用する、抗体ではないタン
パク質は、ウェブ-ベースの「タンパク質相互作用ネットワーク解析プラットフォーム(PI
NA)」において認めることができ、これは6種のデータベースのタンパク質−タンパク質相
互作用データを統合し、且つネットワークの構築、フィルタリング、解析及び可視化のツ
ールを提供している。そのインターネット上のアドレスは、csbi.ltdk.helsinki.fi/pina
/home.doである。糖質部分と特異的に相互作用するタンパク質は、インド科学大学(IISc)
のバイオンフォマティクスセンターのレクチンデータベース、LectinDB (proline.physic
s.iisc.ernet.in/home/Software_and_Databases#Lectin_Database)において認めることが
できる。多くの細胞内分子は、ナノボディ、単一特異性又は二重特異性ダイアボディなど
を含む様々な形態でMTPに含まれ得る抗体の使用により、標的化することができる。
第四の特定されたモジュールは、非-標的細胞内ではない、標的の所望のコンパートメ
ント内での、MTPの保持、すなわち延長された局在化のために選択される。例えば、癌細
胞の最も脆弱なコンパートメント(これは通常細胞核である)内のMTPのより長い保持は、
非-癌細胞と比べた場合、MTPにより運搬された抗癌剤の選択性及び有効性の両方を増強す
ることができる。多くの癌細胞中の前述のCAV VP3(アポプチン)の特異的リン酸化は、そ
の細胞核を離れる能力の喪失を生じ；このことは、正常細胞とは対照的な、癌細胞核内の
その保持に繋がる(Alvisi G.、Poon I.K.H.、Jans D.A.の文献、「腫瘍特異的核標的化：
抗癌剤療法に有望か？(Tumor-specific nuclear targeting: Promises for anti-cancer
therapy?)」、Drug Resistance Updates, 2006, 9: 40-50)。
ント内での、MTPの保持、すなわち延長された局在化のために選択される。例えば、癌細
胞の最も脆弱なコンパートメント(これは通常細胞核である)内のMTPのより長い保持は、
非-癌細胞と比べた場合、MTPにより運搬された抗癌剤の選択性及び有効性の両方を増強す
ることができる。多くの癌細胞中の前述のCAV VP3(アポプチン)の特異的リン酸化は、そ
の細胞核を離れる能力の喪失を生じ；このことは、正常細胞とは対照的な、癌細胞核内の
その保持に繋がる(Alvisi G.、Poon I.K.H.、Jans D.A.の文献、「腫瘍特異的核標的化：
抗癌剤療法に有望か？(Tumor-specific nuclear targeting: Promises for anti-cancer
therapy?)」、Drug Resistance Updates, 2006, 9: 40-50)。
別の好適な例は、プロテアソーム阻害を提供するアミノ酸配列である。そのようなアミ
ノ酸配列の2つの例は、以下に提示した、PI31及びPR39である：
PI31タンパク質配列：
[McCutchen-Maloney SL、Matsuda K、Shimbara N、Binns DD、Tanaka K、Slaughter CA、
DeMartino GNの文献、「プロテアソームのプロリンリッチインヒビターであるPI31のcDNA
クローニング、発現及び機能の特徴(cDNA cloning, expression, and functional charac
terization of PI31, a proline-rich inhibitor of the proteasome)」、J Biol Chem.
2000；275(24):18557-18565、その内容は、PI31タンパク質配列、その調製及び使用の開
示に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている]。
ノ酸配列の2つの例は、以下に提示した、PI31及びPR39である：
PI31タンパク質配列：
DeMartino GNの文献、「プロテアソームのプロリンリッチインヒビターであるPI31のcDNA
クローニング、発現及び機能の特徴(cDNA cloning, expression, and functional charac
terization of PI31, a proline-rich inhibitor of the proteasome)」、J Biol Chem.
2000；275(24):18557-18565、その内容は、PI31タンパク質配列、その調製及び使用の開
示に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている]。
PR39誘導体：
[Anbanandam A、Albarado DC、Tirziu DC、Simons M、Veeraraghavan Sの文献、「プロテ
アソームのプロリン-及びアルギニン-リッチペプチド阻害に関する分子基礎(Molecular b
asis for proline- and arginine-rich peptide inhibition of proteasome)」、J Mol B
iol. 2008；384(1):219-227、その内容は、PR39誘導体、その調製及び使用の開示に関し
てそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている]。このモジュールは、(i)MT
Pのプロテアソーム分解の阻害による送達効率の増強、及び(ii)追加の癌-細胞特異性：に
寄与することができる[Eldridge AG、O'Brien Tの文献、「ユビキチンプロテアソームシ
ステム内の治療的戦略(Therapeutic strategies within the ubiquitin proteasome syst
em)」、Cell Death Differ. 2010, 17:4-13；McConkey DJ、Zhu Kの文献、「癌における
プロテアソームインヒビターの作用及び抵抗性の機序(Mechanisms of proteasome inhibi
tor action and resistance in cancer)」、Drug Resist Updat. 2008, 11:164-179、両
方の内容は、ユビキチンプロテアソームシステムの使用並びに癌におけるプロテアソーム
インヒビターの作用及び抵抗性の開示に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組
み込まれている]。
アソームのプロリン-及びアルギニン-リッチペプチド阻害に関する分子基礎(Molecular b
asis for proline- and arginine-rich peptide inhibition of proteasome)」、J Mol B
iol. 2008；384(1):219-227、その内容は、PR39誘導体、その調製及び使用の開示に関し
てそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている]。このモジュールは、(i)MT
Pのプロテアソーム分解の阻害による送達効率の増強、及び(ii)追加の癌-細胞特異性：に
寄与することができる[Eldridge AG、O'Brien Tの文献、「ユビキチンプロテアソームシ
ステム内の治療的戦略(Therapeutic strategies within the ubiquitin proteasome syst
em)」、Cell Death Differ. 2010, 17:4-13；McConkey DJ、Zhu Kの文献、「癌における
プロテアソームインヒビターの作用及び抵抗性の機序(Mechanisms of proteasome inhibi
tor action and resistance in cancer)」、Drug Resist Updat. 2008, 11:164-179、両
方の内容は、ユビキチンプロテアソームシステムの使用並びに癌におけるプロテアソーム
インヒビターの作用及び抵抗性の開示に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組
み込まれている]。
第五の特定されたモジュールである担体モジュールは、前述のモジュールを一緒にし、
且つそれらを輸送される活性物質へ連結するために選択される。担体モジュールのデザイ
ンにおいて、ポリペプチド又はその断片は、公知のポリペプチド／タンパク質のスペクト
ルから選択される。このポリペプチド／タンパク質は、他のMTPモジュールの最適な空間
分布、その生合成時の可溶性MTPの高い収率、及び／又は輸送されるべき物質の共有結合
若しくは非共有結合を提供するように選択される。最後の機能である非共有結合は、例え
ば、ポルフィリン-様分子に対し疎水性ポケットを有する細菌性ヘモグロビン-様タンパク
質などの、特定の分子に高い親和性を有するモジュール部分内の例えばアミノ酸“ポケッ
ト”の場合に達成することができる。これらの分子は、第五のモジュールのポケットへの
挿入後に、直接、又は輸送されるべき物質の担体／キレーターなどとしてのそれらの化学
修飾後に使用することができる。そのようなポリペプチドは、RCSB PDB(www.pdb.org)を
含む、多くのタンパク質データベースにおいて認めることができる。
且つそれらを輸送される活性物質へ連結するために選択される。担体モジュールのデザイ
ンにおいて、ポリペプチド又はその断片は、公知のポリペプチド／タンパク質のスペクト
ルから選択される。このポリペプチド／タンパク質は、他のMTPモジュールの最適な空間
分布、その生合成時の可溶性MTPの高い収率、及び／又は輸送されるべき物質の共有結合
若しくは非共有結合を提供するように選択される。最後の機能である非共有結合は、例え
ば、ポルフィリン-様分子に対し疎水性ポケットを有する細菌性ヘモグロビン-様タンパク
質などの、特定の分子に高い親和性を有するモジュール部分内の例えばアミノ酸“ポケッ
ト”の場合に達成することができる。これらの分子は、第五のモジュールのポケットへの
挿入後に、直接、又は輸送されるべき物質の担体／キレーターなどとしてのそれらの化学
修飾後に使用することができる。そのようなポリペプチドは、RCSB PDB(www.pdb.org)を
含む、多くのタンパク質データベースにおいて認めることができる。
(5. MTPの特異的ゴールに準じた特異的モジュールの必要性の決定)
MTPの特異的ゴールに準じた特異的モジュールを使用する必要性を決定する一般的スキ
ームは、下記である：
i. 細胞内輸送のための異なる特別なモジュールは、標的化された細胞内コンパートメ
ント(通常、エンドソーム、リソソーム及び透明質ではない)によって選択されるべきであ
る；
ii. エンドソーム／リソソームが標的化された細胞内コンパートメントではない場合
、エンドソーム分解性モジュールがMTP部分に含まれなければならない；
iii. 標的細胞内コンパートメント内の特異的(巨大)分子へのMTPの結合が必要である
場合、細胞内認識のためのモジュールがMTP部分に含まれなければならない；
iv. リガンドモジュールは、標的細胞型により規定され、且つ細胞特異性が必要であ
る場合は不可欠であり；そのような特異性は不要であるか又は広範な細胞型が標的である
場合、所望の細胞型上に最大に表された過剰発現されたインターナリゼーション可能な受
容体へのリガンドを選択しなければならない；
v. 担体モジュールは、ほとんどのMTP適用について望ましい。
MTPの特異的ゴールに準じた特異的モジュールを使用する必要性を決定する一般的スキ
ームは、下記である：
i. 細胞内輸送のための異なる特別なモジュールは、標的化された細胞内コンパートメ
ント(通常、エンドソーム、リソソーム及び透明質ではない)によって選択されるべきであ
る；
ii. エンドソーム／リソソームが標的化された細胞内コンパートメントではない場合
、エンドソーム分解性モジュールがMTP部分に含まれなければならない；
iii. 標的細胞内コンパートメント内の特異的(巨大)分子へのMTPの結合が必要である
場合、細胞内認識のためのモジュールがMTP部分に含まれなければならない；
iv. リガンドモジュールは、標的細胞型により規定され、且つ細胞特異性が必要であ
る場合は不可欠であり；そのような特異性は不要であるか又は広範な細胞型が標的である
場合、所望の細胞型上に最大に表された過剰発現されたインターナリゼーション可能な受
容体へのリガンドを選択しなければならない；
v. 担体モジュールは、ほとんどのMTP適用について望ましい。
(6. 様々なモジュールをMTPへ集成するプロセス)
モジュールをMTPへ集成するプロセスは、作製されるべき各モジュールをコードするた
めにプラスミドを使用する工程に関与している。様々なプラスミドは、当該技術分野にお
いて公知であるように、連続クローニングによりMTP全体をコードしている最終プラスミ
ドへと集成される。この集成の順序は、各モジュール(例えば、前述のリガンドモジュー
ル)の性質又は機能を考慮しなければならない。例えば、α-メラニン細胞-刺激ホルモン
のC-末端の置換／修飾は、その受容体へのその結合親和性を著しく低下するのに対し、そ
のN-末端の修飾は、その活性に影響を及ぼさない[Sahm, U. G.、Olivier, G.W.、Branch,
S. K.、Moss, S. H.、及びPouton, C. W.の文献、「α-MSH末端アミノ酸のメラノーマ細
胞における結合親和性及び生物活性に及ぼす影響(Influence of alpha-MSH terminal ami
no acids on binding affinity and biological activity in melanoma cells)」、Pepti
des, 1994, 15: 441-446]。そのため、α-メラニン細胞-刺激ホルモンをリガンドモジュ
ールとして使用することが必要である場合、このオリゴペプチドは、MTPのC-末端に置か
れなければならない。モジュールの数及びそれらの機能は、先に全般的に説明された送達
の最終ゴールによって変動する。完全サイズの又は完全なMTPは、それに不在のモジュー
ル(例えば不在のリガンドモジュール)が、共有的又は非共有的に結合することができる、
単独の分子として、又はその一部分内(例えばリガンドモジュールを含まない)のいずれか
で生合成により作製することができる。
モジュールをMTPへ集成するプロセスは、作製されるべき各モジュールをコードするた
めにプラスミドを使用する工程に関与している。様々なプラスミドは、当該技術分野にお
いて公知であるように、連続クローニングによりMTP全体をコードしている最終プラスミ
ドへと集成される。この集成の順序は、各モジュール(例えば、前述のリガンドモジュー
ル)の性質又は機能を考慮しなければならない。例えば、α-メラニン細胞-刺激ホルモン
のC-末端の置換／修飾は、その受容体へのその結合親和性を著しく低下するのに対し、そ
のN-末端の修飾は、その活性に影響を及ぼさない[Sahm, U. G.、Olivier, G.W.、Branch,
S. K.、Moss, S. H.、及びPouton, C. W.の文献、「α-MSH末端アミノ酸のメラノーマ細
胞における結合親和性及び生物活性に及ぼす影響(Influence of alpha-MSH terminal ami
no acids on binding affinity and biological activity in melanoma cells)」、Pepti
des, 1994, 15: 441-446]。そのため、α-メラニン細胞-刺激ホルモンをリガンドモジュ
ールとして使用することが必要である場合、このオリゴペプチドは、MTPのC-末端に置か
れなければならない。モジュールの数及びそれらの機能は、先に全般的に説明された送達
の最終ゴールによって変動する。完全サイズの又は完全なMTPは、それに不在のモジュー
ル(例えば不在のリガンドモジュール)が、共有的又は非共有的に結合することができる、
単独の分子として、又はその一部分内(例えばリガンドモジュールを含まない)のいずれか
で生合成により作製することができる。
(7. MTPとMTPにより送達されるべき物質を結合するプロセス)
MTPとMTPにより送達されるべき物質を結合するプロセスは、多くの変動を伴い、共有結
合又は非共有結合によることができる。例えば、輸送されるべき物質は、直接的又はスペ
ーサーを介してのいずれかで、共有的に(例えば、二官能性架橋剤により)MTPへ結合され
てよい。輸送されるべき物質は、非共有的にMTPへ結合されてもよい(例えば、環状テトラ
ピロール分子の一部として又は該物質の環状テトラピロール分子への結合を介して、担体
モジュールの“ポケット”への挿入により)。輸送されるべき物質は、非共有的に結合さ
れたスペーサーへ(例えば担体モジュール中の“ポケット”へと挿入されたスペーサーへ)
、共有的に結合されてよい。輸送されるべき物質は、共有結合されたスペーサーへ(例え
ば二官能性架橋剤により結合されたスペーサーへ)、非共有的に結合されてよい。
MTPとMTPにより送達されるべき物質を結合するプロセスは、多くの変動を伴い、共有結
合又は非共有結合によることができる。例えば、輸送されるべき物質は、直接的又はスペ
ーサーを介してのいずれかで、共有的に(例えば、二官能性架橋剤により)MTPへ結合され
てよい。輸送されるべき物質は、非共有的にMTPへ結合されてもよい(例えば、環状テトラ
ピロール分子の一部として又は該物質の環状テトラピロール分子への結合を介して、担体
モジュールの“ポケット”への挿入により)。輸送されるべき物質は、非共有的に結合さ
れたスペーサーへ(例えば担体モジュール中の“ポケット”へと挿入されたスペーサーへ)
、共有的に結合されてよい。輸送されるべき物質は、共有結合されたスペーサーへ(例え
ば二官能性架橋剤により結合されたスペーサーへ)、非共有的に結合されてよい。
(MTPの治療的、診断的、及び研究的適用)
多くのMTPの治療的、診断的及び研究的適用が存在する。例えばMTPは、いくつか挙げる
と、医薬品、実験生物学、及び獣医学用途において適用することができる。例えば医薬品
において、MTPは、頭頚部癌、食道癌、膠芽細胞腫、膀胱癌などの、腫瘍学的適用で使用
することができる。MTPはまた、いくつか可能性のある医学的適用を挙げると、例えばア
テローム性動脈硬化症のプラークのアブレーションなどの心臓病；ウイルス性疾患(例え
ば、宿主細胞の排泄、例えばHIV治療のためのビリオン合成の阻害)；婦人科(例えば子宮
内膜症)において適用することができる。医学診断において、MTPは、MTPの治療的利用が
可能である同じ疾患に使用することができる。従ってMTPは、診断的及び治療的手段が一
つのプラットフォームで組み合わされているセラノスティック(theranostics)におけるツ
ールとして使用することができる。MTPはまた、特定の細胞型に対し特異性を持つRNA又は
DNAを送達する遺伝子治療手法に使用することができる。先に説明したように、本明細書
に記載したMTPの概念は、特定の受容体に関するリガンドの親和性を基に治療薬を特定の
細胞へより特異的に標的化する手段を提供する。MTPはまた、特異的細胞型内に及び／又
は特異的細胞コンパートメント内に活性物質を配置することが望ましい場合などの、研究
適用において使用することができる。
多くのMTPの治療的、診断的及び研究的適用が存在する。例えばMTPは、いくつか挙げる
と、医薬品、実験生物学、及び獣医学用途において適用することができる。例えば医薬品
において、MTPは、頭頚部癌、食道癌、膠芽細胞腫、膀胱癌などの、腫瘍学的適用で使用
することができる。MTPはまた、いくつか可能性のある医学的適用を挙げると、例えばア
テローム性動脈硬化症のプラークのアブレーションなどの心臓病；ウイルス性疾患(例え
ば、宿主細胞の排泄、例えばHIV治療のためのビリオン合成の阻害)；婦人科(例えば子宮
内膜症)において適用することができる。医学診断において、MTPは、MTPの治療的利用が
可能である同じ疾患に使用することができる。従ってMTPは、診断的及び治療的手段が一
つのプラットフォームで組み合わされているセラノスティック(theranostics)におけるツ
ールとして使用することができる。MTPはまた、特定の細胞型に対し特異性を持つRNA又は
DNAを送達する遺伝子治療手法に使用することができる。先に説明したように、本明細書
に記載したMTPの概念は、特定の受容体に関するリガンドの親和性を基に治療薬を特定の
細胞へより特異的に標的化する手段を提供する。MTPはまた、特異的細胞型内に及び／又
は特異的細胞コンパートメント内に活性物質を配置することが望ましい場合などの、研究
適用において使用することができる。
実験生物学的適用において、研究目的で、様々な生物学的活性物質を特異的細胞内コン
パートメントへ送達するためのビヒクルとして、本適用が可能である。獣医学適用におい
て、本MTPの概念は、例えば腫瘍状態及びその他などの、治療的及び診断的用途に適用す
ることができる。
パートメントへ送達するためのビヒクルとして、本適用が可能である。獣医学適用におい
て、本MTPの概念は、例えば腫瘍状態及びその他などの、治療的及び診断的用途に適用す
ることができる。
表1は、本MTPの主な特徴を、他の薬物送達ビヒクル、すなわち、抗体、リポソーム、及
びナノ粒子と比較している。
びナノ粒子と比較している。
表1：MTPと他の薬物送達ビヒクルの主な特徴の比較
++、特性は存在する；+、特性はビヒクル及び物質の特定の条件／組成下で存在する；±
、認めることは困難である；―、特性は認めることができない
、認めることは困難である；―、特性は認めることができない
(実施例1−EGFRを過剰発現している腫瘍の治療のためのMTPの使用)
下記実施例は、MTPをデザインする前記プロセス実行の一つを提供する。本実施例は、
腫瘍細胞上に上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)の過剰発現を有する、頭頚部癌、多形膠芽腫
腫瘍などに特異的である。従ってこの病変は、本MTP概念を使用する治療に適している。
以下に記載する一般的原理は、本明細書記載のMTP概念を使用する治療に適している他の
病変に適用することができる。
下記実施例は、MTPをデザインする前記プロセス実行の一つを提供する。本実施例は、
腫瘍細胞上に上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)の過剰発現を有する、頭頚部癌、多形膠芽腫
腫瘍などに特異的である。従ってこの病変は、本MTP概念を使用する治療に適している。
以下に記載する一般的原理は、本明細書記載のMTP概念を使用する治療に適している他の
病変に適用することができる。
(1. 標的化される病変の選択)
第一の工程は、標的細胞の規定された細胞内コンパートメントへの治療的物質の標的化
送達から恩恵を受ける治療を決定することに関与している。標的化送達から恩恵があるで
あろう病変は、多形膠芽腫、頭頚部癌、又は重度の脳腫瘍を含む。この実施例においては
、腫瘍の治療に適したリガンドを送達するためのMTPの調製による治療のために、多形膠
芽腫腫瘍が選択される。
第一の工程は、標的細胞の規定された細胞内コンパートメントへの治療的物質の標的化
送達から恩恵を受ける治療を決定することに関与している。標的化送達から恩恵があるで
あろう病変は、多形膠芽腫、頭頚部癌、又は重度の脳腫瘍を含む。この実施例においては
、腫瘍の治療に適したリガンドを送達するためのMTPの調製による治療のために、多形膠
芽腫腫瘍が選択される。
(2. インターナリゼーション可能な受容体の同定)
本プロセスの第二の工程は、所与の病変において標的細胞上で過剰発現されるインター
ナリゼーション可能な受容体を見つけることを基にした、インターナリゼーション可能な
受容体の同定に関与している。文献(例えば、数百以上の刊行物)は、腫瘍細胞において過
剰発現された受容体のリストを含んでいる。例えば上皮細胞増殖因子(EGF)の受容体、又
はEGF受容体(EGFR)、及びその変種EGFRvIIIが、文献において明らかにされている[例えば
、Loew S.らの文献、「多形膠芽腫及び他の悪性新生物における治療的標的としての上皮
細胞増殖因子受容体(The epidermal growth factor receptor as a therapeutic target
in glioblastoma multiforme and other malignant neoplasms)」、Anticancer Agents M
ed. Chem. 2009, 9(6):703-715を参照されたい]。
本プロセスの第二の工程は、所与の病変において標的細胞上で過剰発現されるインター
ナリゼーション可能な受容体を見つけることを基にした、インターナリゼーション可能な
受容体の同定に関与している。文献(例えば、数百以上の刊行物)は、腫瘍細胞において過
剰発現された受容体のリストを含んでいる。例えば上皮細胞増殖因子(EGF)の受容体、又
はEGF受容体(EGFR)、及びその変種EGFRvIIIが、文献において明らかにされている[例えば
、Loew S.らの文献、「多形膠芽腫及び他の悪性新生物における治療的標的としての上皮
細胞増殖因子受容体(The epidermal growth factor receptor as a therapeutic target
in glioblastoma multiforme and other malignant neoplasms)」、Anticancer Agents M
ed. Chem. 2009, 9(6):703-715を参照されたい]。
別の実施態様において、MTPは、下記の受容体のリガンドモジュールを含むことができ
る：メラノコルチン受容体-1(例えば、メラノーマ)、ソマトスタチン受容体(例えば、髄
芽腫)、IL3受容体(例えば、急性骨髄性白血病)；Her2/neu及びHer3(例えば、乳癌)に対す
るインターナリゼーション可能な抗体を運搬するMTP。従って、これらの病変は標的化さ
れ得るインターナリゼーション可能な受容体を有するので、これらの病変は、本明細書に
記載されたMTPシステムを用いて治療することができる。前記受容体リストは、網羅的で
はなく、且つインターナリゼーション可能な受容体は概して、MTPによる標的化に適して
いることは、理解されるべきである。
る：メラノコルチン受容体-1(例えば、メラノーマ)、ソマトスタチン受容体(例えば、髄
芽腫)、IL3受容体(例えば、急性骨髄性白血病)；Her2/neu及びHer3(例えば、乳癌)に対す
るインターナリゼーション可能な抗体を運搬するMTP。従って、これらの病変は標的化さ
れ得るインターナリゼーション可能な受容体を有するので、これらの病変は、本明細書に
記載されたMTPシステムを用いて治療することができる。前記受容体リストは、網羅的で
はなく、且つインターナリゼーション可能な受容体は概して、MTPによる標的化に適して
いることは、理解されるべきである。
(3. リガンドモジュールのデザイン)
第三の工程は、MTPのリガンドモジュールのデザインに関与している。先に説明したよ
うに、リガンドは、過剰発現している受容体に対し最適な親和性を提供し、且つ受容体に
対するその親和性の有意な変化を伴わずに修飾可能であるように選択されなければならな
い。その後、その受容体の知識により、リガンドモジュールとMTP部分の残余部分の間の
スペーサーの挿入があるかどうか分析されなければならない。重要なことは、このプロセ
スにおいて、例えば、リガンドモジュールの代わりに細胞-透過性ペプチドを配置するな
ど、細胞へ非特異的に透過するMTPを作製することが必要であるかどうかが決定されなけ
ればならないことである。そのようなペプチドは、例えばエクスビボ遺伝子治療のため又
は研究目的のため(例えば研究者にとってのツールとしてのMTPなど)に、全ての細胞をMTP
がアクセス可能であるように処理することが必要である場合に含まれることができる。同
様に、選択されたリガンドモジュールの翻訳後処理又は修飾を提供することが必要である
かどうかが決定されなければならない。場合によっては、翻訳後処理は、一部のMTPモジ
ュールの有効性／機能性を増強することができ、例えば、リフォールディングは、いくつ
かのリガンドモジュール(EGFなど)の結合親和性を増強することができる。別の例は、リ
ガンドモジュールの“ブランク”MTPへの翻訳後付加である(下記参照)。
第三の工程は、MTPのリガンドモジュールのデザインに関与している。先に説明したよ
うに、リガンドは、過剰発現している受容体に対し最適な親和性を提供し、且つ受容体に
対するその親和性の有意な変化を伴わずに修飾可能であるように選択されなければならな
い。その後、その受容体の知識により、リガンドモジュールとMTP部分の残余部分の間の
スペーサーの挿入があるかどうか分析されなければならない。重要なことは、このプロセ
スにおいて、例えば、リガンドモジュールの代わりに細胞-透過性ペプチドを配置するな
ど、細胞へ非特異的に透過するMTPを作製することが必要であるかどうかが決定されなけ
ればならないことである。そのようなペプチドは、例えばエクスビボ遺伝子治療のため又
は研究目的のため(例えば研究者にとってのツールとしてのMTPなど)に、全ての細胞をMTP
がアクセス可能であるように処理することが必要である場合に含まれることができる。同
様に、選択されたリガンドモジュールの翻訳後処理又は修飾を提供することが必要である
かどうかが決定されなければならない。場合によっては、翻訳後処理は、一部のMTPモジ
ュールの有効性／機能性を増強することができ、例えば、リフォールディングは、いくつ
かのリガンドモジュール(EGFなど)の結合親和性を増強することができる。別の例は、リ
ガンドモジュールの“ブランク”MTPへの翻訳後付加である(下記参照)。
EGFRの例において、複数の癌細胞型におけるEGFRの過剰発現を考慮する必要がある。具
体的には、EGFRは、膠芽細胞腫細胞においてのみではなく、他の癌細胞型においても過剰
発現されるので、EGFRに対するリガンドを選択し、その変種EGFRIIIに対するリガンドを
選択しないことは妥当である。EGFは、そのN-末端で容易に修飾され得るので、そのため
これは最終の(future)MTPのC-末端に置くことができる。EGFをコードしている遺伝子は、
cDNAライブラリーから入手するか、又は購入することができる。例えばこの遺伝子を入手
するために、先に作製された遺伝子構築体を使用することが可能であり得る。EGFに関し
て、ロシア国特許第93031156号の開示を使用し、この遺伝子構築体が作製した。この例に
おいて、スペーサーである(Gly-Ser)5は、EGFとMTPの残余の間に含まれた。このスペーサ
ーを使用し、MTPモジュールにより空間的自由を提供し、このことは例えば、MTPへのより
高い結合親和性又はMTPと相互作用しなければならない細胞内巨大分子に関するMTPへのよ
り良い接近可能性のいずれかを提供する。
体的には、EGFRは、膠芽細胞腫細胞においてのみではなく、他の癌細胞型においても過剰
発現されるので、EGFRに対するリガンドを選択し、その変種EGFRIIIに対するリガンドを
選択しないことは妥当である。EGFは、そのN-末端で容易に修飾され得るので、そのため
これは最終の(future)MTPのC-末端に置くことができる。EGFをコードしている遺伝子は、
cDNAライブラリーから入手するか、又は購入することができる。例えばこの遺伝子を入手
するために、先に作製された遺伝子構築体を使用することが可能であり得る。EGFに関し
て、ロシア国特許第93031156号の開示を使用し、この遺伝子構築体が作製した。この例に
おいて、スペーサーである(Gly-Ser)5は、EGFとMTPの残余の間に含まれた。このスペーサ
ーを使用し、MTPモジュールにより空間的自由を提供し、このことは例えば、MTPへのより
高い結合親和性又はMTPと相互作用しなければならない細胞内巨大分子に関するMTPへのよ
り良い接近可能性のいずれかを提供する。
(4. マルチレベル特異性の1以上の特定されたモジュールの封入)
次の工程は、標的細胞へのMTPの透過を確実にするためのマルチレベル特異性の他の段
階を標的化するための、MTP部分内の特定されたモジュールを提供するために必要な分析
及びデザインである。先に説明したように、そのようなモジュールの一つは、エンドソー
ム分解性モジュールであり、並びにGALA又はジフテリア毒素転座ドメインなど、反復され
た両親媒性配列であることができる。
次の工程は、標的細胞へのMTPの透過を確実にするためのマルチレベル特異性の他の段
階を標的化するための、MTP部分内の特定されたモジュールを提供するために必要な分析
及びデザインである。先に説明したように、そのようなモジュールの一つは、エンドソー
ム分解性モジュールであり、並びにGALA又はジフテリア毒素転座ドメインなど、反復され
た両親媒性配列であることができる。
細胞内輸送に関して、選択された第二のモジュールは、細胞輸送機構により、特異的細
胞内コンパートメントへのMTPの送達を確実にする。そのようなモジュールの例は、核標
的化部分；SV40ラージT-抗原由来のopT-NLS、又はCAV VP3(アポプチン)T-NLS残基74-121
を含み、ここで追加の特異性レベルは癌細胞内の優先的蓄積により達成され得る。
胞内コンパートメントへのMTPの送達を確実にする。そのようなモジュールの例は、核標
的化部分；SV40ラージT-抗原由来のopT-NLS、又はCAV VP3(アポプチン)T-NLS残基74-121
を含み、ここで追加の特異性レベルは癌細胞内の優先的蓄積により達成され得る。
第四の特定されたモジュールである担体モジュールは、モジュールを輸送される物質と
連結／一緒にするために選択される。そのような担体モジュールの一つは、大腸菌ヘモグ
ロビン-様タンパク質HMPである。担体モジュールとして大腸菌ヘモグロビン-様タンパク
質HMPを含むMTPの価値のある特性は、MTPがエンドソーム分解性モジュールとしてジフテ
リア毒素転座ドメインの断片も含む場合に、明らかにされる。この組合せは、(pH3.5以下
に加えて)pH7.5及びよりアルカリ性の条件において、MTPを高濃度で得る能力を提供する
。MTPと作用する素因のコンジュゲーションの高い収率を提供するためには、水溶液中の
高濃度のMTPが重要である。他方で、HMP及びジフテリア毒素転座ドメインの断片の統合は
、MTPにより良いエンドソーム分解能を提供する。更にHMP及びジフテリア毒素転座ドメイ
ンの断片の統合は、膜溶解作用の範囲を広げる。図5に図示したように、この組合せは、
二つのMTPの高い溶解度の範囲−3.5よりも低いpHに加え7.5より高いpHを提供する。これ
らのpH値の間では、MTPはそれらのエンドソーム分解活性を示し、すなわち、MTPはエンド
ソーム／リソソームのpHで、エンドソームから、その膜の外側を通り、透明質へと取り入
れられるであろう。
連結／一緒にするために選択される。そのような担体モジュールの一つは、大腸菌ヘモグ
ロビン-様タンパク質HMPである。担体モジュールとして大腸菌ヘモグロビン-様タンパク
質HMPを含むMTPの価値のある特性は、MTPがエンドソーム分解性モジュールとしてジフテ
リア毒素転座ドメインの断片も含む場合に、明らかにされる。この組合せは、(pH3.5以下
に加えて)pH7.5及びよりアルカリ性の条件において、MTPを高濃度で得る能力を提供する
。MTPと作用する素因のコンジュゲーションの高い収率を提供するためには、水溶液中の
高濃度のMTPが重要である。他方で、HMP及びジフテリア毒素転座ドメインの断片の統合は
、MTPにより良いエンドソーム分解能を提供する。更にHMP及びジフテリア毒素転座ドメイ
ンの断片の統合は、膜溶解作用の範囲を広げる。図5に図示したように、この組合せは、
二つのMTPの高い溶解度の範囲−3.5よりも低いpHに加え7.5より高いpHを提供する。これ
らのpH値の間では、MTPはそれらのエンドソーム分解活性を示し、すなわち、MTPはエンド
ソーム／リソソームのpHで、エンドソームから、その膜の外側を通り、透明質へと取り入
れられるであろう。
別のHMPの価値のある特性は、高親和性でプロトポルフィリンIXなどのポルフィリンに
結合することができる、疎水性ポケットの存在である。この特性は、「ミックスアンドア
プライ(mix-and-apply)」法を使用し、輸送されるべき物質のMTPへの非共有的結合を可能
にする。例えば、プロトポルフィリンIX又はその類似体／誘導体を、例えば放射性核種の
キレーターとして直接的に、又は例えば放射性核種をキレートするか又は輸送されるべき
物質と反応するかのいずれかが可能である誘導体を得ることを可能にする誘導体化後に間
接的に使用することができる。その後誘導体化されたポルフィリン分子(放射性核種又は
医薬品のいずれかを伴う)を、MTPへ化学量論的量で添加し、医薬品／放射性核種を保有す
る最終のMTPを得ることができる。
結合することができる、疎水性ポケットの存在である。この特性は、「ミックスアンドア
プライ(mix-and-apply)」法を使用し、輸送されるべき物質のMTPへの非共有的結合を可能
にする。例えば、プロトポルフィリンIX又はその類似体／誘導体を、例えば放射性核種の
キレーターとして直接的に、又は例えば放射性核種をキレートするか又は輸送されるべき
物質と反応するかのいずれかが可能である誘導体を得ることを可能にする誘導体化後に間
接的に使用することができる。その後誘導体化されたポルフィリン分子(放射性核種又は
医薬品のいずれかを伴う)を、MTPへ化学量論的量で添加し、医薬品／放射性核種を保有す
る最終のMTPを得ることができる。
細胞内輸送のため(この場合細胞核への輸送のため)のモジュールは、PCRにより作製さ
れる。このリガンドモジュール(EGF)は、クローニングされたEGFを含むプラスミドDNAを
使用するPCRにより作製される。(Gly-Ser)5スペーサーは、オリゴヌクレオチドから合成
により作製される。担体モジュール(HMP、大腸菌由来のヘモグロビン-様タンパク質)は、
鋳型として大腸菌染色体DNAを用いるPCRにより作製される。ジフテリア毒素転座ドメイン
は、毒素ドメイン間の天然のスペーサー(エンドソーム分解性モジュール)と一緒に、鋳型
としてクローニングされたジフテリア毒素遺伝子を含むプラスミドDNAを使用し、PCRによ
り同様に作製される。
れる。このリガンドモジュール(EGF)は、クローニングされたEGFを含むプラスミドDNAを
使用するPCRにより作製される。(Gly-Ser)5スペーサーは、オリゴヌクレオチドから合成
により作製される。担体モジュール(HMP、大腸菌由来のヘモグロビン-様タンパク質)は、
鋳型として大腸菌染色体DNAを用いるPCRにより作製される。ジフテリア毒素転座ドメイン
は、毒素ドメイン間の天然のスペーサー(エンドソーム分解性モジュール)と一緒に、鋳型
としてクローニングされたジフテリア毒素遺伝子を含むプラスミドDNAを使用し、PCRによ
り同様に作製される。
(5. MTPの特異的ゴールに準じた特異的モジュールの決定の必要性)
次にMTPは、特異的モジュールの使用により、治療薬を特異的部位へ送達するように、
デザインされなければならない。この多形神経膠芽腫及び他のEGFRを過剰発現している腫
瘍へ癌治療を提供する例において、最終の細胞内のゴールは、多くの抗癌剤に対し最も感
度のある細胞内コンパートメントの一つである細胞核である。細胞核は、非常に多様なタ
ンパク質と複合した複数の長い線状のDNA分子として組織化された細胞の遺伝物質のほと
んどを含む。従ってエンドソーム分解性モジュールは、α-エミッターなどの作用素因の
作用に不可欠であるが、α-粒子は、無作為に移動し且つ任意の核内巨大分子を実現する
ために十分な範囲を有するので、特別な核内巨大分子を規定する必要はないという理由で
、細胞内認識のためのモジュールは不要である。反対の状況は、例えばオージェ(Auger)
電子-エミッターの事象において起こり、その理由は、オージェ電子は短いレンジを有し
、それらの主な標的は核DNAであり、そのためMTPは細胞内DNA認識のためのモジュールも
有さなければならないからである。
次にMTPは、特異的モジュールの使用により、治療薬を特異的部位へ送達するように、
デザインされなければならない。この多形神経膠芽腫及び他のEGFRを過剰発現している腫
瘍へ癌治療を提供する例において、最終の細胞内のゴールは、多くの抗癌剤に対し最も感
度のある細胞内コンパートメントの一つである細胞核である。細胞核は、非常に多様なタ
ンパク質と複合した複数の長い線状のDNA分子として組織化された細胞の遺伝物質のほと
んどを含む。従ってエンドソーム分解性モジュールは、α-エミッターなどの作用素因の
作用に不可欠であるが、α-粒子は、無作為に移動し且つ任意の核内巨大分子を実現する
ために十分な範囲を有するので、特別な核内巨大分子を規定する必要はないという理由で
、細胞内認識のためのモジュールは不要である。反対の状況は、例えばオージェ(Auger)
電子-エミッターの事象において起こり、その理由は、オージェ電子は短いレンジを有し
、それらの主な標的は核DNAであり、そのためMTPは細胞内DNA認識のためのモジュールも
有さなければならないからである。
(6. MTPへの様々なモジュールの集成プロセス)
MTPへの様々なモジュールの集成プロセスは、作製されるべき各モジュールをコードす
るためにプラスミドを使用する工程に関与している。先に説明したように、様々なプラス
ミドが、当該技術分野において公知のように、連続クローニングにより、MTP全体をコー
ドしている最終のプラスミドに集成される。この具体的実施例において、創薬のためのMT
Pの可動性を最小化するために、対応するペプチドモジュールをコードしている遺伝子モ
ジュールを、下記スキームに従いデザインした：
BamHI部位−モジュール配列−BglII部位−停止コドン−HindIII部位
。この構造は、同じ粘着末端を持つBamHI及びBglII制限部位が側面に位置するという事実
により、各遺伝子モジュールを、ハイブリッド遺伝子に沿って任意の位置に配置すること
ができるので、選択した。これらの構築体は全て、連続クローニングにより構築し、且つ
強力なT5バクテリオファージプロモーターを、細菌におけるタンパク質発現のために使用
した。EGFR-標的化されたMTPであるDTox-HMP-NLS-EGFのためのプラスミド構築を、図6に
詳述し、且つここにまとめている：NLSモジュールは、Deep Ventポリメラーゼ(Promega社
)、プライマー
、及び鋳型としてプラスミドpPR28を使用するPCRにより作製される。EGFモジュールは、
プライマー
及びクローニングされたEGFを含むプラスミドDNAを使用するPCRにより作製される[Lunin,
V.G.、Sergienko, O.V.、Khodun, M.‐V.L.、Bader, L.B.、Karpov, V.A.、及びTikhone
nko, T.I.の特許、「ソマトスタチン配列を伴うキメラタンパク質をコードする組換えプ
ラスミドpC(Sp)nSの作製方法(Method of preparing recombinant plasmids pC(Sp)nS enc
oding chimeric protein with somatostatin sequence)」、1995、ロシア特許第2,031,12
1号]。(Gly-Ser)5スペーサー(sp)は、オリゴヌクレオチドからの合成により作製される。
このオリゴヌクレオチド鎖
は、個別にリン酸化した。HMPモジュールは、Taqポリメラーゼ(Sib酵素)、PCRプライマー
、及び鋳型として大腸菌染色体DNAを使用するPCRにより作製した。毒素全体の残基198-38
4である毒素ドメイン間に天然のスペーサーを持つジフテリア毒素転座ドメイン(DToxモジ
ュール)は、プライマー
及び鋳型としてクローニングされたジフテリア毒素遺伝子を含むプラスミドDNAを使用す
る、Taq PCRにより同様に作製した。
MTPへの様々なモジュールの集成プロセスは、作製されるべき各モジュールをコードす
るためにプラスミドを使用する工程に関与している。先に説明したように、様々なプラス
ミドが、当該技術分野において公知のように、連続クローニングにより、MTP全体をコー
ドしている最終のプラスミドに集成される。この具体的実施例において、創薬のためのMT
Pの可動性を最小化するために、対応するペプチドモジュールをコードしている遺伝子モ
ジュールを、下記スキームに従いデザインした：
BamHI部位−モジュール配列−BglII部位−停止コドン−HindIII部位
。この構造は、同じ粘着末端を持つBamHI及びBglII制限部位が側面に位置するという事実
により、各遺伝子モジュールを、ハイブリッド遺伝子に沿って任意の位置に配置すること
ができるので、選択した。これらの構築体は全て、連続クローニングにより構築し、且つ
強力なT5バクテリオファージプロモーターを、細菌におけるタンパク質発現のために使用
した。EGFR-標的化されたMTPであるDTox-HMP-NLS-EGFのためのプラスミド構築を、図6に
詳述し、且つここにまとめている：NLSモジュールは、Deep Ventポリメラーゼ(Promega社
)、プライマー
プライマー
V.G.、Sergienko, O.V.、Khodun, M.‐V.L.、Bader, L.B.、Karpov, V.A.、及びTikhone
nko, T.I.の特許、「ソマトスタチン配列を伴うキメラタンパク質をコードする組換えプ
ラスミドpC(Sp)nSの作製方法(Method of preparing recombinant plasmids pC(Sp)nS enc
oding chimeric protein with somatostatin sequence)」、1995、ロシア特許第2,031,12
1号]。(Gly-Ser)5スペーサー(sp)は、オリゴヌクレオチドからの合成により作製される。
このオリゴヌクレオチド鎖
4である毒素ドメイン間に天然のスペーサーを持つジフテリア毒素転座ドメイン(DToxモジ
ュール)は、プライマー
る、Taq PCRにより同様に作製した。
このコードしているプラスミドDNAからのMTPの発現は、大腸菌株M15(プラスミドpREP4
を保有する)において、QIAGEN社(ヒルデン、独国)のプロトコールに従い実行した。細胞
は、10mM HEPES‐NaOH (pH7.5)、0.5％ TritonX-100、1mMフッ化フェニルメタンスルホニ
ル、1.5μg/mlアプロチニン、1mg/mlリゾチーム中に溶解し；40kHzで音波処理し；且つ、
17,000rpmで25分間遠心分離した。MTPは、Ni-NTA-アガロース(QIAGEN社)上で、標準手順
に従い精製した。最後にMTPは、150mM NaClを含む10mM Na-リン酸緩衝液(pH8)に対して透
析した。
を保有する)において、QIAGEN社(ヒルデン、独国)のプロトコールに従い実行した。細胞
は、10mM HEPES‐NaOH (pH7.5)、0.5％ TritonX-100、1mMフッ化フェニルメタンスルホニ
ル、1.5μg/mlアプロチニン、1mg/mlリゾチーム中に溶解し；40kHzで音波処理し；且つ、
17,000rpmで25分間遠心分離した。MTPは、Ni-NTA-アガロース(QIAGEN社)上で、標準手順
に従い精製した。最後にMTPは、150mM NaClを含む10mM Na-リン酸緩衝液(pH8)に対して透
析した。
EGFRを過剰発現している腫瘍細胞の核内の核局在化のためのMTPである、HMP-NLS-DTox-
EGF、HMP-NLS-DTox-EGF(スペーサー欠失)、DTox-HMP-apo-EGFを、同じ方式で作製した。
同じ腫瘍細胞型の透明質局在化のためのDTox-HMP-EGF MTPに加え、エンドリソソーム局在
化のためのHMP-EGF MTPも作製した。
EGF、HMP-NLS-DTox-EGF(スペーサー欠失)、DTox-HMP-apo-EGFを、同じ方式で作製した。
同じ腫瘍細胞型の透明質局在化のためのDTox-HMP-EGF MTPに加え、エンドリソソーム局在
化のためのHMP-EGF MTPも作製した。
同様に、メラノーマ治療のためのMTPであるDTox-HMP-NLS-αMSH、神経内分泌腫瘍治療
のためのDTox-HMP-NLS-ソマトスタチン、DTox-HMP-NLS(非特異的“ブランクMTP”)、及び
他のMTPを作製した。
のためのDTox-HMP-NLS-ソマトスタチン、DTox-HMP-NLS(非特異的“ブランクMTP”)、及び
他のMTPを作製した。
(7. MTPとMTPにより送達されるべき物質を結合するプロセス)
MTPとMTPにより送達されるべき物質を結合するプロセスは、例えば直接的に又はスペー
サーによるなど、数多くの変形を伴う共有的又は非共有的結合によることができる。結合
は、使用することが予定されている医薬品又は治療薬によって決まる。例えば光増感剤は
、水溶性カルボジイミドを使用し、結合することができる。次に、結合された医薬品を伴
うMTPは、反応していない医薬品及びMTPから分離されなければならない。
MTPとMTPにより送達されるべき物質を結合するプロセスは、例えば直接的に又はスペー
サーによるなど、数多くの変形を伴う共有的又は非共有的結合によることができる。結合
は、使用することが予定されている医薬品又は治療薬によって決まる。例えば光増感剤は
、水溶性カルボジイミドを使用し、結合することができる。次に、結合された医薬品を伴
うMTPは、反応していない医薬品及びMTPから分離されなければならない。
或いは、輸送されるべき物質は、担体モジュールHMP中の疎水性ポケットの使用により
、MTPへ結合することができる(図7)。図7Aは、そのような物質の一つであるコバルト-クロリンのアジド-PEG-誘導体を明らかにしている。この物質の疎水性ポケットへの挿入は、その吸収スペクトルの変化により、記録することができる(図7B)。非線形回帰(Origin 6ソフトウェア)を使用する異なるMTP濃度でのそのソーレー帯の解析は、ポケットに挿入された誘導体の占有率(share)の用量-依存性の変化を明らかにしている(図7C)。得られた誘導体-MTP複合体は、“クリック-反応”を介し、輸送されるべき物質の結合に使用することができる[例えば、Jewett JC、Bertozzi CRの文献、「化学生物学におけるCu-非含有クリック付加環化反応(Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology)」、Chem Soc Rev. 2010, 39(4): 1272-1279を参照されたい]。これらの複合体は、図8に示されるように、血漿のような生物学的液体中で安定している。
、MTPへ結合することができる(図7)。図7Aは、そのような物質の一つであるコバルト-クロリンのアジド-PEG-誘導体を明らかにしている。この物質の疎水性ポケットへの挿入は、その吸収スペクトルの変化により、記録することができる(図7B)。非線形回帰(Origin 6ソフトウェア)を使用する異なるMTP濃度でのそのソーレー帯の解析は、ポケットに挿入された誘導体の占有率(share)の用量-依存性の変化を明らかにしている(図7C)。得られた誘導体-MTP複合体は、“クリック-反応”を介し、輸送されるべき物質の結合に使用することができる[例えば、Jewett JC、Bertozzi CRの文献、「化学生物学におけるCu-非含有クリック付加環化反応(Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology)」、Chem Soc Rev. 2010, 39(4): 1272-1279を参照されたい]。これらの複合体は、図8に示されるように、血漿のような生物学的液体中で安定している。
(実施例2−特異的細胞受容体に対する親和性増強のための翻訳後修飾の使用)
本EGFRの実施例において、MTPの翻訳後修飾を、ヒトEGF-含有リガンドモジュールのリ
フォールディングにより行った。ヒトEGF-含有リガンドモジュールのリフォールディング
により、MTPのEGFRへの親和性が増大することがわかった。タンパク質リフォールディン
グにおける手順は、下記の通りである：
本EGFRの実施例において、MTPの翻訳後修飾を、ヒトEGF-含有リガンドモジュールのリ
フォールディングにより行った。ヒトEGF-含有リガンドモジュールのリフォールディング
により、MTPのEGFRへの親和性が増大することがわかった。タンパク質リフォールディン
グにおける手順は、下記の通りである：
MTP(10μM)を、150mM NaCl、1mM EDTA、0.5mMフッ化フェニルメチルスルホニル、2mM酸
化型グルタチオン、0.67mM還元型グルタチオンを含む、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8
.0)中で、氷上で20時間インキュベーションした。リフォールディング後、MTPを、150mM
NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液に対し、十分透析した。この処理は、EGFRへのMT
P親和性の2倍以上の増大を生じた。この結果は、図1に示している。図1は、A431ヒト類表
皮癌細胞のEGFR受容体からの、リフォールディングの前(◆)及び後(▲)の、DTox-HMP-NLS
-EGFによる[125I]ヨード-EGF(2nM)の置換を測定することによる、MTP翻訳後処理の、細胞
受容体へのそのリガンドモジュールの親和性に対する効果を示している。この結果は、[1
25I]ヨード-EGFは、親和定数0.15±0.02nM-1で、A431細胞表面受容体へ結合されることを
示している。受容体とのMTP結合に関する親和定数は、リフォールディング前は19±3pM-1
であり、且つリフォールディング後は54±5pM-1であり、すなわち、EGFRに関するMTPの親
和性は、2.8倍以上増大する。
化型グルタチオン、0.67mM還元型グルタチオンを含む、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8
.0)中で、氷上で20時間インキュベーションした。リフォールディング後、MTPを、150mM
NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液に対し、十分透析した。この処理は、EGFRへのMT
P親和性の2倍以上の増大を生じた。この結果は、図1に示している。図1は、A431ヒト類表
皮癌細胞のEGFR受容体からの、リフォールディングの前(◆)及び後(▲)の、DTox-HMP-NLS
-EGFによる[125I]ヨード-EGF(2nM)の置換を測定することによる、MTP翻訳後処理の、細胞
受容体へのそのリガンドモジュールの親和性に対する効果を示している。この結果は、[1
25I]ヨード-EGFは、親和定数0.15±0.02nM-1で、A431細胞表面受容体へ結合されることを
示している。受容体とのMTP結合に関する親和定数は、リフォールディング前は19±3pM-1
であり、且つリフォールディング後は54±5pM-1であり、すなわち、EGFRに関するMTPの親
和性は、2.8倍以上増大する。
(実施例3−細胞内認識のためのモジュール)
選択された第三のモジュールは、細胞内認識のためである。例えば、細胞内認識の標的
は、細胞DNAであってよい。標的細胞DNAへの第三のモジュールの一つの好適な例は、CAV
VP3/アポプチン(74-121)であり、これはDNAを結合することができる。VP3(74-121)の使用
の結果は、図3及び図4に示している。図3は、VP3 74-121を含むMTPであるDTox-HMP-apo-E
GF、及びそのような断片を欠くMTPであるDTox-HMP-NLS-EGFの、ゲル-シフトアッセイの結
果を示している。図4は、SAチップ(BiaCore X社)上の表面プラズモンアッセイ法を用いア
ッセイされた、DTox-HMP-apo-EGF(左側グラフ)及びDTox-HMP-NLS-EGF(右側グラフ)のプラ
スミドDNAとの相互作用を、グラフ表示している。apoは、アポプチン74-121である。
選択された第三のモジュールは、細胞内認識のためである。例えば、細胞内認識の標的
は、細胞DNAであってよい。標的細胞DNAへの第三のモジュールの一つの好適な例は、CAV
VP3/アポプチン(74-121)であり、これはDNAを結合することができる。VP3(74-121)の使用
の結果は、図3及び図4に示している。図3は、VP3 74-121を含むMTPであるDTox-HMP-apo-E
GF、及びそのような断片を欠くMTPであるDTox-HMP-NLS-EGFの、ゲル-シフトアッセイの結
果を示している。図4は、SAチップ(BiaCore X社)上の表面プラズモンアッセイ法を用いア
ッセイされた、DTox-HMP-apo-EGF(左側グラフ)及びDTox-HMP-NLS-EGF(右側グラフ)のプラ
スミドDNAとの相互作用を、グラフ表示している。apoは、アポプチン74-121である。
実験は、BiaCore-X装置(SA-チップ)を使用し実行した。プラスミドDNA(4.7kb)を、ビオ
チン-11-dUTP及び非放射性DNA標識キット、Biotin-Randomprimeの使用により、ビオチニ
ル化した。DNAを、5.5pMプラスミド溶液60μlを30分間かけて注入することにより、セン
サーチップ上に固定した。結合は、固定されたDNAを伴うSAチップへ、規定濃度のMTPを、
150mM NaCl及び1mM EDTAを含む10mM HEPES／MES緩衝液(pH8)中流量10μl/分で注入するこ
とにより測定した。このチップは、8M尿素の1分間の注入により再生した。結合の変数を
、BIACOREシステムにおいてソフトウェア(BIAevaluation 4.1)の速度論データ解析を用い
ることにより、コンピュータ処理した。MTPは、DNAを伴わないSAチップと強力な相互作用
を有し、従って「異種リガンド−並行反応」モデルを使用した。非修飾チップとの会合定
数値(DTox-HMP-apo-EGFについてKa＝2.66×105 M-1、及びDTox-HMP-NLS-EGFについて1.16
×104 M-1、ラングミュア結合)は、別の実験で測定し、且つこのモデルの定数として使用
した。これらの結果は、新規モジュールDTox-HMP-apo-EGFを伴うMTPは、DTox-HMP-NLS-EG
FのMTPよりも、23倍より高いDNA親和性を提供することを示している。
チン-11-dUTP及び非放射性DNA標識キット、Biotin-Randomprimeの使用により、ビオチニ
ル化した。DNAを、5.5pMプラスミド溶液60μlを30分間かけて注入することにより、セン
サーチップ上に固定した。結合は、固定されたDNAを伴うSAチップへ、規定濃度のMTPを、
150mM NaCl及び1mM EDTAを含む10mM HEPES／MES緩衝液(pH8)中流量10μl/分で注入するこ
とにより測定した。このチップは、8M尿素の1分間の注入により再生した。結合の変数を
、BIACOREシステムにおいてソフトウェア(BIAevaluation 4.1)の速度論データ解析を用い
ることにより、コンピュータ処理した。MTPは、DNAを伴わないSAチップと強力な相互作用
を有し、従って「異種リガンド−並行反応」モデルを使用した。非修飾チップとの会合定
数値(DTox-HMP-apo-EGFについてKa＝2.66×105 M-1、及びDTox-HMP-NLS-EGFについて1.16
×104 M-1、ラングミュア結合)は、別の実験で測定し、且つこのモデルの定数として使用
した。これらの結果は、新規モジュールDTox-HMP-apo-EGFを伴うMTPは、DTox-HMP-NLS-EG
FのMTPよりも、23倍より高いDNA親和性を提供することを示している。
(実施例4−MTP作製のためのタンパク質スプライシングの適用)
次に、どの型のリガンドモジュールの結合を選択するかを決定しなければならない。実
施例1において言及したMTPとは別の広範なリガンドプールが存在する。例えば連結は、遺
伝子構築体又はブランクMTP(リガンド非結合のMTP)のC-末端へのタンパク質スプライシン
グを介することができる。図2A-Bに示したように、リガンドモジュールは、C-末端インテ
イン-CBD(キチン-結合ドメイン)モジュールを保有するブランクMTPの使用により、MTPへ
結合することができる[例えば、Elleuche S、Poggeler S.の文献、「分子生物学及びバイ
オテクノロジーにおいて価値のある遺伝子エレメントであるインテイン(Inteins, Valuab
le Genetic Elements in Molecular Biology and Biotechnology)」、Appl Microbiol Bi
otechnol. 2010； 87(2):479-489を参照されたい]。これは、MTP精製、及びMTPへの任意
の追加の又は余計なアミノ酸の付加を伴わずに連結するモジュールの両方のために使用す
ることができる。図2A-Bに示したプロセスは、インテイン及びCBD(キチン-結合ドメイン)
-コード領域を有するMPTコードしているプラスミドの集成を示している。インテイン配列
の給源は、pTXB1プラスミドである。リガンド非結合のMTP配列の給源は、DTox-HMP-NLS(
“ブランク”MTP)をコードしているpR820プラスミドである。インテイン-CBDは、pTXB1プ
ラスミドからのPCR反応、続くBgl II部位及びHind III部位の追加により作製した：Bgl I
I−インテイン-CBP−Hind III。その後この生成物を、pR820プラスミドに挿入した。
次に、どの型のリガンドモジュールの結合を選択するかを決定しなければならない。実
施例1において言及したMTPとは別の広範なリガンドプールが存在する。例えば連結は、遺
伝子構築体又はブランクMTP(リガンド非結合のMTP)のC-末端へのタンパク質スプライシン
グを介することができる。図2A-Bに示したように、リガンドモジュールは、C-末端インテ
イン-CBD(キチン-結合ドメイン)モジュールを保有するブランクMTPの使用により、MTPへ
結合することができる[例えば、Elleuche S、Poggeler S.の文献、「分子生物学及びバイ
オテクノロジーにおいて価値のある遺伝子エレメントであるインテイン(Inteins, Valuab
le Genetic Elements in Molecular Biology and Biotechnology)」、Appl Microbiol Bi
otechnol. 2010； 87(2):479-489を参照されたい]。これは、MTP精製、及びMTPへの任意
の追加の又は余計なアミノ酸の付加を伴わずに連結するモジュールの両方のために使用す
ることができる。図2A-Bに示したプロセスは、インテイン及びCBD(キチン-結合ドメイン)
-コード領域を有するMPTコードしているプラスミドの集成を示している。インテイン配列
の給源は、pTXB1プラスミドである。リガンド非結合のMTP配列の給源は、DTox-HMP-NLS(
“ブランク”MTP)をコードしているpR820プラスミドである。インテイン-CBDは、pTXB1プ
ラスミドからのPCR反応、続くBgl II部位及びHind III部位の追加により作製した：Bgl I
I−インテイン-CBP−Hind III。その後この生成物を、pR820プラスミドに挿入した。
その後この様式で生成された最終プラスミドを、例えばキチンビーズ上で精製し、その
後2-メルカプトエタンスルホン酸により開裂させ、SH-基と容易に反応する生成物を生じ
た。図2Bは、これらの精製プロセス工程を図示している。図2Bに関して、この精製された
リガンド非結合のMTPは、例えば、ダイアボディ又はナノボディ(この種のリガンドを保有
するMTP全体は、大腸菌の細胞質において直接生成されることができない)、非-特異的透
過のための細胞-透過性ペプチド、又は合成アミノ酸誘導体とのペプチドリガンドなどを
含む、N-末端Cysを有するポリペプチドリガンドによりリガンド結合され得る。そのよう
なペプチドを伴うMTP全体の生成は、大腸菌の生成物の高い毒性により複雑となることは
注記されなければならない。
後2-メルカプトエタンスルホン酸により開裂させ、SH-基と容易に反応する生成物を生じ
た。図2Bは、これらの精製プロセス工程を図示している。図2Bに関して、この精製された
リガンド非結合のMTPは、例えば、ダイアボディ又はナノボディ(この種のリガンドを保有
するMTP全体は、大腸菌の細胞質において直接生成されることができない)、非-特異的透
過のための細胞-透過性ペプチド、又は合成アミノ酸誘導体とのペプチドリガンドなどを
含む、N-末端Cysを有するポリペプチドリガンドによりリガンド結合され得る。そのよう
なペプチドを伴うMTP全体の生成は、大腸菌の生成物の高い毒性により複雑となることは
注記されなければならない。
(実施例5−インビボにおける特性及び適用)
前記工程に従い生成されたMTPを、インビボ試験に供した。
(MTP毒性及び免疫原性) C57Black/6Jマウス(n＝3、4週間観察)は、いかなる毒性徴候
も伴わずに、DTox-HMP-NLS-αMSHの最大到達可能静脈注射投与量(7.5mg)に忍容性があり
；より高いMTP投与量は、MTP溶解度の限界のために、評価しなかった。C57Black/6Jマウ
ス(n＝5、2週間観察)及びBalb/c ByJIco-nu/nuマウス(n＝8、4週間観察)も、各々、4×2m
g DTox-HMP-NLS-αMSH及び6×3mg DTox-HMP-NLS-EGFの投与の間に2〜3日の間隔をあけた
反復静脈内注射に忍容性があった。このデータは、MTPは、最大到達可能投与量で単回-注
射として投与された場合、又は反復投与レジメンで投与された場合に、マウスに対し毒性
はないことを示している。
前記工程に従い生成されたMTPを、インビボ試験に供した。
(MTP毒性及び免疫原性) C57Black/6Jマウス(n＝3、4週間観察)は、いかなる毒性徴候
も伴わずに、DTox-HMP-NLS-αMSHの最大到達可能静脈注射投与量(7.5mg)に忍容性があり
；より高いMTP投与量は、MTP溶解度の限界のために、評価しなかった。C57Black/6Jマウ
ス(n＝5、2週間観察)及びBalb/c ByJIco-nu/nuマウス(n＝8、4週間観察)も、各々、4×2m
g DTox-HMP-NLS-αMSH及び6×3mg DTox-HMP-NLS-EGFの投与の間に2〜3日の間隔をあけた
反復静脈内注射に忍容性があった。このデータは、MTPは、最大到達可能投与量で単回-注
射として投与された場合、又は反復投与レジメンで投与された場合に、マウスに対し毒性
はないことを示している。
遅延型過敏症(DTH)反応が、投与されたポリペプチドに対する免疫応答の相関として使
用されることが多い[Kublin JG、Lowitt MH、Hamilton RG、Oliveira GA、Nardin EH、Nu
ssenzweig RSらの文献、「プラスモジウム・ファルシパルム・スポロゾイトに対する合成
マルチ抗原ペプチドワクチン(PfCS-MAP1NYU)により免疫した志願者における遅延型過敏症
(Delayed-type hypersensitivity in volunteers immunized with a synthetic multi-an
tigen peptide vaccine (PfCS-MAP1NYU) against Plasmodium falciparum sporozoites)
」、Vaccine. 2002； 20:1853-1861]。雌のC57Black/6Jマウス(n＝11、20〜25g)に、DTox
-HMP-NLS-αMSH(60μl、フロイントの完全アジュバント(1：1, v/v、Sigma社)と混合した
2mg/mlダルベッコ改変イーグル培地(DMEM))を皮下注射(s.c.)した。5日後、各マウスの1
本の後肢足蹠に、DTox-HMP-NLS-αMSH(40μl、2mg/ml)を注射し；並行肢(collateral foo
t)には、DMEMのみ注射した(実験群)。マウス対照群(n＝8)は、MTP/フロイントのアジュバ
ントを注射しなかった。24時間後に、実験群(mMNT,exp、及び並行肢、mDMEM,exp)及び対
照群(mDMEM,contr)の足蹠における浮腫を測定し[Biondo C、Beninati C、Delfino D、Ogg
ioni M、Mancuso G、Midiri Aらの文献、「防御免疫応答を生じるクリプトコッカスのデ
アセチラーゼの同定及びクローニング(Identification and cloning of a cryptococcal
deacetylase that produces protective immune responses)」、Infection Immunity. 20
02； 70:2383-2391]、下記のように表した：
用されることが多い[Kublin JG、Lowitt MH、Hamilton RG、Oliveira GA、Nardin EH、Nu
ssenzweig RSらの文献、「プラスモジウム・ファルシパルム・スポロゾイトに対する合成
マルチ抗原ペプチドワクチン(PfCS-MAP1NYU)により免疫した志願者における遅延型過敏症
(Delayed-type hypersensitivity in volunteers immunized with a synthetic multi-an
tigen peptide vaccine (PfCS-MAP1NYU) against Plasmodium falciparum sporozoites)
」、Vaccine. 2002； 20:1853-1861]。雌のC57Black/6Jマウス(n＝11、20〜25g)に、DTox
-HMP-NLS-αMSH(60μl、フロイントの完全アジュバント(1：1, v/v、Sigma社)と混合した
2mg/mlダルベッコ改変イーグル培地(DMEM))を皮下注射(s.c.)した。5日後、各マウスの1
本の後肢足蹠に、DTox-HMP-NLS-αMSH(40μl、2mg/ml)を注射し；並行肢(collateral foo
t)には、DMEMのみ注射した(実験群)。マウス対照群(n＝8)は、MTP/フロイントのアジュバ
ントを注射しなかった。24時間後に、実験群(mMNT,exp、及び並行肢、mDMEM,exp)及び対
照群(mDMEM,contr)の足蹠における浮腫を測定し[Biondo C、Beninati C、Delfino D、Ogg
ioni M、Mancuso G、Midiri Aらの文献、「防御免疫応答を生じるクリプトコッカスのデ
アセチラーゼの同定及びクローニング(Identification and cloning of a cryptococcal
deacetylase that produces protective immune responses)」、Infection Immunity. 20
02； 70:2383-2391]、下記のように表した：
MTP投与は、DTox-HMP-NLS-αMSHを注射したC57Black/6Jマウスにおいて、わずかなDTH
を誘導し5.4％、実験群と対照群の間の差異は統計学的に有意ではなかった。概して、約2
0％以上の対照を上回る増加は、免疫原性反応を示すと考えられる[Omata Y、Kamiya H、K
ano R、Kobayashi Y、Maeda R、Saito Aの文献、「感染したBALB/cマウスにおけるネオス
ポラ・カニナム・タキゾイト抽出物により誘導された足蹠反応(Footpad reaction induce
d by Neospora caninum tachyzoite extract in infected BALB/c mice)」、Veterinary
Parasitol. 2006； 139:102-108]。実験群と対照群の間の統計学的有意性の欠如は、この
MTPに関する低い免疫原性の程度を示唆している。
を誘導し5.4％、実験群と対照群の間の差異は統計学的に有意ではなかった。概して、約2
0％以上の対照を上回る増加は、免疫原性反応を示すと考えられる[Omata Y、Kamiya H、K
ano R、Kobayashi Y、Maeda R、Saito Aの文献、「感染したBALB/cマウスにおけるネオス
ポラ・カニナム・タキゾイト抽出物により誘導された足蹠反応(Footpad reaction induce
d by Neospora caninum tachyzoite extract in infected BALB/c mice)」、Veterinary
Parasitol. 2006； 139:102-108]。実験群と対照群の間の統計学的有意性の欠如は、この
MTPに関する低い免疫原性の程度を示唆している。
(インビボ標的化) 次にインビボ標的化を、125I-標識したMTPにより評価した。DTox-H
MP-NLS-αMSHを、N-スクシンイミジル3-[125I]ヨード安息香酸試薬、従来の求電子法と比
べ最大2桁インビボにおける脱ヨード化を減少することが示されている方法[Vaidyanathan
G、Zalutsky MRの文献、「N-スクシンイミジル3-[*I]ヨード安息香酸の調製：タンパク
質の間接的放射性ヨード標識のための試薬(Preparation of N-succinimidyl 3-[*I]iodob
enzoate: an agent for the indirect radioiodination of proteins)」、Nat Protocols
. 2006；1:707-713]を用い、125Iにより標識した。この125I-標識されたDTox-HMP-NLS-α
MSHを、細胞1個につき約10,000個のαMSH受容体を発現しているB16-F1由来のマウスメラ
ノーマ腫瘍を有するC57Black/6Jマウスへ、静脈内注射した[Siegrist W、Solca F、Stutz
S、Giuffre L、Carrel S、Girard Jらの文献、「ヒトメラノーマ細胞上のα-メラニン細
胞-刺激ホルモン受容体の特徴(Characterization of receptors for α-melanocyte-stim
ulating hormone on human melanoma cells)」、Cancer Res. 1989； 49:6352-16358]。
腫瘍における125I活性の皮膚及び筋肉における活性に対する比を、インビボ標的化の評価
のための計量として選択した。その理由は皮膚及び筋肉の組織はメラノーマの近傍にあり
、且つ光力学療法からのそれらの副次的損傷は避けなければならないからである。
MP-NLS-αMSHを、N-スクシンイミジル3-[125I]ヨード安息香酸試薬、従来の求電子法と比
べ最大2桁インビボにおける脱ヨード化を減少することが示されている方法[Vaidyanathan
G、Zalutsky MRの文献、「N-スクシンイミジル3-[*I]ヨード安息香酸の調製：タンパク
質の間接的放射性ヨード標識のための試薬(Preparation of N-succinimidyl 3-[*I]iodob
enzoate: an agent for the indirect radioiodination of proteins)」、Nat Protocols
. 2006；1:707-713]を用い、125Iにより標識した。この125I-標識されたDTox-HMP-NLS-α
MSHを、細胞1個につき約10,000個のαMSH受容体を発現しているB16-F1由来のマウスメラ
ノーマ腫瘍を有するC57Black/6Jマウスへ、静脈内注射した[Siegrist W、Solca F、Stutz
S、Giuffre L、Carrel S、Girard Jらの文献、「ヒトメラノーマ細胞上のα-メラニン細
胞-刺激ホルモン受容体の特徴(Characterization of receptors for α-melanocyte-stim
ulating hormone on human melanoma cells)」、Cancer Res. 1989； 49:6352-16358]。
腫瘍における125I活性の皮膚及び筋肉における活性に対する比を、インビボ標的化の評価
のための計量として選択した。その理由は皮膚及び筋肉の組織はメラノーマの近傍にあり
、且つ光力学療法からのそれらの副次的損傷は避けなければならないからである。
図9に示したように、125I-標識されたDTox-HMP-NLS-αMSH保持の選択性は、一般に時間
と共に、及びMTP≧200μgの投与量と共に、増加する。図9において、Aと記されたグラフ
は、MTP投与量11μgの投薬での、腫瘍対非-腫瘍比に対する時間の効果を示している。Bと
記されたグラフは、注射後3時間での腫瘍対非-腫瘍比に対するMTP投与量の効果を示して
いる。3時間での標的化に関して認められた最適投与量は、腫瘍：皮膚について214μg(9.
8±1.8)及び腫瘍：筋肉について850μg(13.4±1.7)であった。MTPについて決定された腫
瘍：皮膚の最大比は、このマウスメラノーマモデルにおけるフリー光増感剤に関して報告
されたものよりも3〜8倍高いことは注意されなければならない[Woodburn KW、Fan Q、Kes
sel D、Luo Y、Young SWの文献、「B16F10マウスメラノーマのルテチウムテキサフィリン
による光力学療法(Photodynamic therapy of B16F10 murine melanoma with Lutetium Te
xaphyrin)」、J Invest Dermatol. 1998； 110:746-751；Fabris C、Vicente MG、Hao E
、Friso E、Borsetto L、Jori Gらの文献、「メソテトラ(4-ニドカルボラニルフェニル)
ポルフィリン(H2TCP)の腫瘍-局在化及び光感受性特性(Tumour-localizing and photosens
itising properties of mesotetra(4-nidocarboranylphenyl)porphyrin (H2TCP))」、J P
hotochem Photobiol B. 2007； 89:131-138；Jori G、Soncin M、Friso E、Vicente MG、
Hao E、Miotto Gらの文献、「腫瘍のホウ素中性子捕捉療法のための放射能増感剤として
の新規ホウ化-ポルフィリン：インビトロ及びインビボ試験(A novel boronated-porphyri
n as a radio-sensitizing agent for boron neutron capture therapy of tumours: In
vitro and in vivo studies)」、Appl Radiat Isotopes. 2009; 67(7-8 Suppl): S321-S3
24]。
と共に、及びMTP≧200μgの投与量と共に、増加する。図9において、Aと記されたグラフ
は、MTP投与量11μgの投薬での、腫瘍対非-腫瘍比に対する時間の効果を示している。Bと
記されたグラフは、注射後3時間での腫瘍対非-腫瘍比に対するMTP投与量の効果を示して
いる。3時間での標的化に関して認められた最適投与量は、腫瘍：皮膚について214μg(9.
8±1.8)及び腫瘍：筋肉について850μg(13.4±1.7)であった。MTPについて決定された腫
瘍：皮膚の最大比は、このマウスメラノーマモデルにおけるフリー光増感剤に関して報告
されたものよりも3〜8倍高いことは注意されなければならない[Woodburn KW、Fan Q、Kes
sel D、Luo Y、Young SWの文献、「B16F10マウスメラノーマのルテチウムテキサフィリン
による光力学療法(Photodynamic therapy of B16F10 murine melanoma with Lutetium Te
xaphyrin)」、J Invest Dermatol. 1998； 110:746-751；Fabris C、Vicente MG、Hao E
、Friso E、Borsetto L、Jori Gらの文献、「メソテトラ(4-ニドカルボラニルフェニル)
ポルフィリン(H2TCP)の腫瘍-局在化及び光感受性特性(Tumour-localizing and photosens
itising properties of mesotetra(4-nidocarboranylphenyl)porphyrin (H2TCP))」、J P
hotochem Photobiol B. 2007； 89:131-138；Jori G、Soncin M、Friso E、Vicente MG、
Hao E、Miotto Gらの文献、「腫瘍のホウ素中性子捕捉療法のための放射能増感剤として
の新規ホウ化-ポルフィリン：インビトロ及びインビボ試験(A novel boronated-porphyri
n as a radio-sensitizing agent for boron neutron capture therapy of tumours: In
vitro and in vivo studies)」、Appl Radiat Isotopes. 2009; 67(7-8 Suppl): S321-S3
24]。
(免疫組織化学により評価されたMTPのインビボ標的化) この評価において、免疫蛍光
測定分析を行い、マウスにおける静脈内注射後3時間のMTPの腫瘍及び隣接組織中のインビ
ボ分布並びに細胞内局在を決定した。この評価において、DTox-HMP-NLS-αMSHは、細胞1
個につき約5,000個のαMSH受容体を発現しているクラウドマンS91を有するDBA/2マウスへ
、静脈内注射した[Siegrist W、Solca F、Stutz S、Giuffre L、Carrel S、Girard Jらの
文献、「ヒトメラノーマ細胞上のα-メラニン細胞-刺激ホルモン受容体の特徴(Character
ization of receptors for α-melanocyte-stimulating hormone on human melanoma cel
ls)」、Cancer Res. 1989; 49:6352-16358]。
測定分析を行い、マウスにおける静脈内注射後3時間のMTPの腫瘍及び隣接組織中のインビ
ボ分布並びに細胞内局在を決定した。この評価において、DTox-HMP-NLS-αMSHは、細胞1
個につき約5,000個のαMSH受容体を発現しているクラウドマンS91を有するDBA/2マウスへ
、静脈内注射した[Siegrist W、Solca F、Stutz S、Giuffre L、Carrel S、Girard Jらの
文献、「ヒトメラノーマ細胞上のα-メラニン細胞-刺激ホルモン受容体の特徴(Character
ization of receptors for α-melanocyte-stimulating hormone on human melanoma cel
ls)」、Cancer Res. 1989; 49:6352-16358]。
図10A-Fは、DTox-HMP-NLS-αMSHを受け取るGFP(緑色蛍光タンパク質)で形質転換された
マウスクラウドマンメラノーマS91を有するDBA/2マウスからの10μm組織切片の結果を示
している。図10A-Dは、倍率40×での腫瘍切片及び周辺組織切片の結果を示している。図1
0Aは、MTPについてAlexa Fluor 555染色により染色した組織切片を示し(赤色)；図10Bは
、腫瘍細胞からのGFP蛍光を示し(緑色)；図10Cは、細胞核のDAPI染色を示し(青色)；図10
Dは、図10A-Cの重ね合わせである。図10Eは、DAPI蛍光(青色)及びMTP(赤色)を重ね合わせ
た、倍率63×での腫瘍切片を示している。図10Fは、腫瘍細胞及び隣接皮膚細胞の核及び
細胞質における特異的MTPシグナルを伴う領域の割合(±SEM)を示している。図10Gは、クロリンe6-DTox-HMP-NLS-EGFの静脈内注射後3時間での、ヒトA431類表皮癌を有するBalb/c ByJIco-nu/nuマウスからの2〜3μm腫瘍切片の染色を示し(63×)；DAPI蛍光(青色)及びMTP(赤色)を重ね合わせた。図10D及びEのスケールバーは20μmであり、且つ図10Gのスケールバーは5μmである。腫瘍内のMTPの優先的蓄積は、注射後3時間で認められ、これはトランスフェクションしたメラノーマ細胞のGFP蛍光により周囲の非-腫瘍組織から区別された。
マウスクラウドマンメラノーマS91を有するDBA/2マウスからの10μm組織切片の結果を示
している。図10A-Dは、倍率40×での腫瘍切片及び周辺組織切片の結果を示している。図1
0Aは、MTPについてAlexa Fluor 555染色により染色した組織切片を示し(赤色)；図10Bは
、腫瘍細胞からのGFP蛍光を示し(緑色)；図10Cは、細胞核のDAPI染色を示し(青色)；図10
Dは、図10A-Cの重ね合わせである。図10Eは、DAPI蛍光(青色)及びMTP(赤色)を重ね合わせ
た、倍率63×での腫瘍切片を示している。図10Fは、腫瘍細胞及び隣接皮膚細胞の核及び
細胞質における特異的MTPシグナルを伴う領域の割合(±SEM)を示している。図10Gは、クロリンe6-DTox-HMP-NLS-EGFの静脈内注射後3時間での、ヒトA431類表皮癌を有するBalb/c ByJIco-nu/nuマウスからの2〜3μm腫瘍切片の染色を示し(63×)；DAPI蛍光(青色)及びMTP(赤色)を重ね合わせた。図10D及びEのスケールバーは20μmであり、且つ図10Gのスケールバーは5μmである。腫瘍内のMTPの優先的蓄積は、注射後3時間で認められ、これはトランスフェクションしたメラノーマ細胞のGFP蛍光により周囲の非-腫瘍組織から区別された。
MTPのDAPI染色に対する比較は、メラノーマ細胞におけるMTP蓄積のかなりの割合が、細
胞核において起こることを示唆した(図10C-D)。腫瘍細胞及び近傍の皮膚細胞の核及び細
胞質内でMTPシグナルを示す領域の割合も、評価した。図10E-Fに示されたように、皮膚に
おける40％未満の値と比べ、メラノーマの領域の80％以上及びほぼ100％は、各々、核及
び細胞質内にMTPシグナルを有した。同様の結果が、EGFR-発現しているヒト類表皮癌A431
異種移植片を有するBalb/c ByJIco-nu/nuマウスへの、DTox-HMP-NLS-EGFの静脈内注射後
に得られ−腫瘍細胞におけるMTPの蓄積は、細胞核内の局在化の証拠を伴った(図10G)。こ
れらの実験は、MTPは、インビボにおいて、血液プールから、受容体発現している腫瘍細
胞内のそれらの意図された細胞内標的へ輸送を行うようにデザインすることができること
を確認している。
胞核において起こることを示唆した(図10C-D)。腫瘍細胞及び近傍の皮膚細胞の核及び細
胞質内でMTPシグナルを示す領域の割合も、評価した。図10E-Fに示されたように、皮膚に
おける40％未満の値と比べ、メラノーマの領域の80％以上及びほぼ100％は、各々、核及
び細胞質内にMTPシグナルを有した。同様の結果が、EGFR-発現しているヒト類表皮癌A431
異種移植片を有するBalb/c ByJIco-nu/nuマウスへの、DTox-HMP-NLS-EGFの静脈内注射後
に得られ−腫瘍細胞におけるMTPの蓄積は、細胞核内の局在化の証拠を伴った(図10G)。こ
れらの実験は、MTPは、インビボにおいて、血液プールから、受容体発現している腫瘍細
胞内のそれらの意図された細胞内標的へ輸送を行うようにデザインすることができること
を確認している。
(光力学療法を使用するインビボMTP抗-腫瘍有効性) 効果があるべき細胞核内での局在
化を必要とする薬物の治療有効性を増強するためにMTPの潜在的有用性を評価する目的で
、光力学療法(PDT)試験を、3種の異なるマウス皮下腫瘍モデルにおいて行い、PDTは光増
感剤(PS)注射の3時後に開始した。MTPであるDTox-HMP-NLS-αMSHにコンジュゲートされた
バクテリオクロリンp及び遊離バクテリオクロリンpによる光力学療法の有効性比較を、図
11A-Dにおいて報告した。
化を必要とする薬物の治療有効性を増強するためにMTPの潜在的有用性を評価する目的で
、光力学療法(PDT)試験を、3種の異なるマウス皮下腫瘍モデルにおいて行い、PDTは光増
感剤(PS)注射の3時後に開始した。MTPであるDTox-HMP-NLS-αMSHにコンジュゲートされた
バクテリオクロリンp及び遊離バクテリオクロリンpによる光力学療法の有効性比較を、図
11A-Dにおいて報告した。
第一の実験は、B16-F1メラノーマを伴うC57Black/6Jマウスにおいて行った。図11Aは、
腫瘍成長、平均±SEMを報告し、注射及び照射サイクルは、矢印で示している。平均腫瘍
容積は、群内の全ての動物が生存していた場合、最終日に至るまでに示した。図11Bは、
カプラン-マイヤー生存曲線を提供している。腫瘍成長の89％阻害が、バクテリオクロリ
ンp-DTox-HMP-NLS-αMSHコンジュゲートにより認められたのに対し、遊離バクテリオクロ
リンpによっては有意な効果は認められなかった(図11A)。PS-MTPコンジュゲートを受け取
ったマウスの生存中央値は、対照群17.0±1.5日間及びバクテリオクロリン群20.0±5.5日
間と比べ、32.0±1.3日間であった(図11B)。PS-MTPと2種の対照群の各々との間の生存の
差異は、有意であった(p＜0.01)。
腫瘍成長、平均±SEMを報告し、注射及び照射サイクルは、矢印で示している。平均腫瘍
容積は、群内の全ての動物が生存していた場合、最終日に至るまでに示した。図11Bは、
カプラン-マイヤー生存曲線を提供している。腫瘍成長の89％阻害が、バクテリオクロリ
ンp-DTox-HMP-NLS-αMSHコンジュゲートにより認められたのに対し、遊離バクテリオクロ
リンpによっては有意な効果は認められなかった(図11A)。PS-MTPコンジュゲートを受け取
ったマウスの生存中央値は、対照群17.0±1.5日間及びバクテリオクロリン群20.0±5.5日
間と比べ、32.0±1.3日間であった(図11B)。PS-MTPと2種の対照群の各々との間の生存の
差異は、有意であった(p＜0.01)。
第二の実験は、クラウドマンS91メラノーマを伴うDBA/2マウスを利用した。図11Cは、
腫瘍成長、平均±SEMを報告し、注射及び照射サイクルは、矢印で示している。平均腫瘍
容積は、群内の全ての動物が生存していた場合、最終日に至るまでに示した。図11Dは、
カプラン-マイヤー生存曲線を提供している。対照(遊離PSに対しては93％)と比較して、
腫瘍成長の98％阻害が、バクテリオクロリンp-DTox-HMP-NLS-αMSHコンジュゲートにより
認められた(図11C)。PS-MTPコンジュゲートを受け取ったマウスの生存中央値は、対照群2
1.0±0.7日間及びバクテリオクロリン群31.0±1.3日間と比べ、56.0±18.6日間であった(
図11D)。
腫瘍成長、平均±SEMを報告し、注射及び照射サイクルは、矢印で示している。平均腫瘍
容積は、群内の全ての動物が生存していた場合、最終日に至るまでに示した。図11Dは、
カプラン-マイヤー生存曲線を提供している。対照(遊離PSに対しては93％)と比較して、
腫瘍成長の98％阻害が、バクテリオクロリンp-DTox-HMP-NLS-αMSHコンジュゲートにより
認められた(図11C)。PS-MTPコンジュゲートを受け取ったマウスの生存中央値は、対照群2
1.0±0.7日間及びバクテリオクロリン群31.0±1.3日間と比べ、56.0±18.6日間であった(
図11D)。
第三の実験は、A431ヒト類表皮癌異種移植片を伴うBalb/c ByJIco-nu/nuマウスにおい
て、クロリンe6-DTox-HMP-NLS-EGFにより行った。MTPであるDTox-HMP-NLS-EGFは、遊離クロリンe6と比べ、A431ヒト類表皮癌成長を阻害し、且つ担腫瘍Balb/c ByJIco-nu/nuマウスの生存を増強した。図12Aは、A431腫瘍成長、平均±SEMを報告し、注射及び照射サイクルは、矢印で示している。平均腫瘍容積は、群内の全ての動物が生存していた場合、最終日に至るまでに示した。図12Bは、カプラン-マイヤー生存曲線を提供している。対照(遊離PSに対しては94％)と比較して、腫瘍成長の98％阻害が、クロリンe6-DTox-HMP-NLS-EGFコンジュゲートにより認められた(図12A)。対照群マウスの生存中央値は、20.0±0.4日間であり、全ての動物は22日までに死亡した(図12B)。対照的に、クロリンe6-DTox-HMP-NLS-EGF群においては、クロリンe6群の20％と比べ、92日間の観察期間の最後まで、動物の75％が生存し続けた。
て、クロリンe6-DTox-HMP-NLS-EGFにより行った。MTPであるDTox-HMP-NLS-EGFは、遊離クロリンe6と比べ、A431ヒト類表皮癌成長を阻害し、且つ担腫瘍Balb/c ByJIco-nu/nuマウスの生存を増強した。図12Aは、A431腫瘍成長、平均±SEMを報告し、注射及び照射サイクルは、矢印で示している。平均腫瘍容積は、群内の全ての動物が生存していた場合、最終日に至るまでに示した。図12Bは、カプラン-マイヤー生存曲線を提供している。対照(遊離PSに対しては94％)と比較して、腫瘍成長の98％阻害が、クロリンe6-DTox-HMP-NLS-EGFコンジュゲートにより認められた(図12A)。対照群マウスの生存中央値は、20.0±0.4日間であり、全ての動物は22日までに死亡した(図12B)。対照的に、クロリンe6-DTox-HMP-NLS-EGF群においては、クロリンe6群の20％と比べ、92日間の観察期間の最後まで、動物の75％が生存し続けた。
本発明のいくつか特定の形が、例示されかつ説明されているが、本文及び図面に詳述さ
れた本発明の様々な変更及び組合せを、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限りは、行
うことができることは明らかであろう。例えば、構造の物質、構造の方法、具体的次元(s
pecific dimensions)、形状、利用性又は適用への言及は、いかなる意味においても限定
を意図するものではなく、他の物質及び次元で置き換えることができ、且つ依然本発明の
精神及び範囲内にある。従って添付された請求項を除き、本発明が限定されることを意図
するものではない。
れた本発明の様々な変更及び組合せを、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限りは、行
うことができることは明らかであろう。例えば、構造の物質、構造の方法、具体的次元(s
pecific dimensions)、形状、利用性又は適用への言及は、いかなる意味においても限定
を意図するものではなく、他の物質及び次元で置き換えることができ、且つ依然本発明の
精神及び範囲内にある。従って添付された請求項を除き、本発明が限定されることを意図
するものではない。
例として、下記の膜-活性ペプチドの配列も、使用することができる：
[Li W, Nicol F、Szoka FC Jr.の文献、「GALA：薬物及び遺伝子送達における適用を持つデザインされた合成pH-反応性両親媒性ペプチド(GALA: a designed synthetic pH-responsive amphipathic peptide with applications in drug and gene delivery)」、Adv Drug Deliv Rev. 2004；56(7):967-985]；
[Moore NM、Sheppard CL、Barbour TR、Sakiyama-Elbert SE.の文献、「ポリエチレングリコール-ベースのビヒクルのインビトロ遺伝子送達に対するエンドソームエスケープペプチドの効果(The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles)」、J Gene Med. 2008；10(10):1134-1149]；単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Hの誘導性(fusogenic)セグメント
[Tu Y、Kim JS.の文献、「陽イオン性リポソームのトランスフェクション効率を増強する単純ヘルペスウイルス由来の糖タンパク質Hの融合性セグメント(A fusogenic segment of glycoprotein H from herpes simplex virus enhances transfection efficiency of cationic liposomes)」、J Gene Med. 2008；10(6):646-654]。
例えば、核が特異的コンパートメントとして選択される場合、好適な配列は、核局在化シグナルのデータベース(NLSdb、http://rostlab.org/services/nlsdb/)において認めることができる。腫瘍細胞-増強された核蓄積のための関心対象の部分は、T108部位での腫瘍細胞-特異性リン酸化が核外輸送を不活性化するニワトリ貧血ウイルス(CAV)ウイルスタンパク質3(VP3)又はアポプチン(残基74-121)由来の"T-NLS"であり、これは腫瘍細胞におけるより高い核蓄積に繋がる[Poon IK、Oro C、Dias MM、Zhang J、Jans DAの文献、「アポプチン核蓄積は正常細胞において活性があるが腫瘍細胞においては活性がないCRM1-認識された核外輸送シグナルにより調節される(Apoptin nuclear accumulation is modulated by a CRM1-recognized nuclear export signal that is active in normal but not in tumor cells)」、Cancer Res. 2005； 65(16): 7059-7064；Kuusisto HV、Wagstaff KM、Alvisi G、Jans DAの文献、「アポプチンC-末端は独自の腫瘍細胞-増強された核標的化モジュールを示す(The C-terminus of apoptin represents a unique tumor cell-enhanced nuclear targeting module)」、Int J Cancer. 2008；123(12): 2965-2969]。あるいは、最適化された又は修飾されたNLSは、シミアンウイルスSV40ラージ腫瘍抗原の最適化されたNLS(opT-NLS)：
などを使用することができ[Akhlynina TV、Rosenkranz AA、Jans DA、Statsiuk NV、Balashova IYu、Toth G、Pavo I、Rubin AB、Sobolev ASの文献、「その光感受活性を増強する塩素e6の核標的化(Nuclear targeting of chlorin e6 enhances its photosensitizing activity)」、J. Biol. Chem. 1997, 272: 20328-20331]、ここでT-抗原アミノ酸111-132の配列は、T124の核輸送阻害サイクリン依存性キナーゼリン酸化部位を不活性化するように、123位及び124位で置換されている(AAにより置換されたST)[Fulcher AJ、Roth DM、Fatima S、Alvisi G、Jans DAの文献、「BRCA-1結合タンパク質BRAP2は核局在化シグナルに隣接するリン酸化に依存したウイルスタンパク質の核内移行の新規の負のレギュレーターである(The BRCA-1 binding protein BRAP2 is a novel, negative regulator of nuclear import of viral proteins, dependent on phosphorylation flanking the nuclear localization signal)」、FASEB J. 2010； 24(5):1454-1466]。
別の好適な例は、プロテアソーム阻害を提供するアミノ酸配列である。そのようなアミノ酸配列の2つの例は、以下に提示した、PI31及びPR39である：
PI31タンパク質配列：
[McCutchen-Maloney SL、Matsuda K、Shimbara N、Binns DD、Tanaka K、Slaughter CA、DeMartino GNの文献、「プロテアソームのプロリンリッチインヒビターであるPI31のcDNAクローニング、発現及び機能の特徴(cDNA cloning, expression, and functional characterization of PI31, a proline-rich inhibitor of the proteasome)」、J Biol Chem. 2000；275(24):18557-18565、その内容は、PI31タンパク質配列、その調製及び使用の開示に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている]。
PI31タンパク質配列：
PR39誘導体：
[Anbanandam A、Albarado DC、Tirziu DC、Simons M、Veeraraghavan Sの文献、「プロテアソームのプロリン-及びアルギニン-リッチペプチド阻害に関する分子基礎(Molecular basis for proline- and arginine-rich peptide inhibition of proteasome)」、J Mol Biol. 2008；384(1):219-227、その内容は、PR39誘導体、その調製及び使用の開示に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている]。このモジュールは、(i)MTPのプロテアソーム分解の阻害による送達効率の増強、及び(ii)追加の癌-細胞特異性：に寄与することができる[Eldridge AG、O'Brien Tの文献、「ユビキチンプロテアソームシステム内の治療的戦略(Therapeutic strategies within the ubiquitin proteasome system)」、Cell Death Differ. 2010, 17:4-13；McConkey DJ、Zhu Kの文献、「癌におけるプロテアソームインヒビターの作用及び抵抗性の機序(Mechanisms of proteasome inhibitor action and resistance in cancer)」、Drug Resist Updat. 2008, 11:164-179、両方の内容は、ユビキチンプロテアソームシステムの使用並びに癌におけるプロテアソームインヒビターの作用及び抵抗性の開示に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている]。
(6. MTPへの様々なモジュールの集成プロセス)
MTPへの様々なモジュールの集成プロセスは、作製されるべき各モジュールをコードするためにプラスミドを使用する工程に関与している。先に説明したように、様々なプラスミドが、当該技術分野において公知のように、連続クローニングにより、MTP全体をコードしている最終のプラスミドに集成される。この具体的実施例において、創薬のためのMTPの可動性を最小化するために、対応するペプチドモジュールをコードしている遺伝子モジュールを、下記スキームに従いデザインした：
BamHI部位−モジュール配列−BglII部位−停止コドン−HindIII部位
。この構造は、同じ粘着末端を持つBamHI及びBglII制限部位が側面に位置するという事実により、各遺伝子モジュールを、ハイブリッド遺伝子に沿って任意の位置に配置することができるので、選択した。これらの構築体は全て、連続クローニングにより構築し、且つ強力なT5バクテリオファージプロモーターを、細菌におけるタンパク質発現のために使用した。EGFR-標的化されたMTPであるDTox-HMP-NLS-EGFのためのプラスミド構築を、図6に詳述し、且つここにまとめている：NLSモジュールは、Deep Ventポリメラーゼ(Promega社)、プライマー
、及び鋳型としてプラスミドpPR28を使用するPCRにより作製される。EGFモジュールは、プライマー
及びクローニングされたEGFを含むプラスミドDNAを使用するPCRにより作製される[Lunin, V.G.、Sergienko, O.V.、Khodun, M.‐V.L.、Bader, L.B.、Karpov, V.A.、及びTikhonenko, T.I.の特許、「ソマトスタチン配列を伴うキメラタンパク質をコードする組換えプラスミドpC(Sp)nSの作製方法(Method of preparing recombinant plasmids pC(Sp)nS encoding chimeric protein with somatostatin sequence)」、1995、ロシア特許第2,031,121号]。(Gly-Ser)5スペーサー(sp)は、オリゴヌクレオチドからの合成により作製される。
このオリゴヌクレオチド鎖
は、個別にリン酸化した。HMPモジュールは、Taqポリメラーゼ(Sib酵素)、PCRプライマー
、及び鋳型として大腸菌染色体DNAを使用するPCRにより作製した。毒素全体の残基198-384である毒素ドメイン間に天然のスペーサーを持つジフテリア毒素転座ドメイン(DToxモジュール)は、プライマー
及び鋳型としてクローニングされたジフテリア毒素遺伝子を含むプラスミドDNAを使用する、Taq PCRにより同様に作製した。
MTPへの様々なモジュールの集成プロセスは、作製されるべき各モジュールをコードするためにプラスミドを使用する工程に関与している。先に説明したように、様々なプラスミドが、当該技術分野において公知のように、連続クローニングにより、MTP全体をコードしている最終のプラスミドに集成される。この具体的実施例において、創薬のためのMTPの可動性を最小化するために、対応するペプチドモジュールをコードしている遺伝子モジュールを、下記スキームに従いデザインした：
BamHI部位−モジュール配列−BglII部位−停止コドン−HindIII部位
。この構造は、同じ粘着末端を持つBamHI及びBglII制限部位が側面に位置するという事実により、各遺伝子モジュールを、ハイブリッド遺伝子に沿って任意の位置に配置することができるので、選択した。これらの構築体は全て、連続クローニングにより構築し、且つ強力なT5バクテリオファージプロモーターを、細菌におけるタンパク質発現のために使用した。EGFR-標的化されたMTPであるDTox-HMP-NLS-EGFのためのプラスミド構築を、図6に詳述し、且つここにまとめている：NLSモジュールは、Deep Ventポリメラーゼ(Promega社)、プライマー
このオリゴヌクレオチド鎖
Claims (26)
- 標的細胞へ透過し、モジュラー輸送するプラットフォームを標的細胞へ送達し、pH-依
存性膜破壊活性、標的細胞の標的細胞内コンパートメントへ指向された細胞内輸送、及び
モジュラー輸送プラットフォーム内に活性物質をカップリングする能力を提供するように
特に構成された、1つの分子内にいくつかの機能性モジュールを含む、モジュラー輸送プ
ラットフォームであって、該分子が：
モジュラー輸送プラットフォームへの環状テトラピロール部分の非共有的カップリング
のためのモジュール；及び
標的細胞内コンパートメント内にモジュラー輸送プラットフォームを維持するように構
成されたモジュール：を含む、前記モジュラー輸送プラットフォーム。 - (1)標的細胞の特異的認識を提供することにより、標的細胞の表面上の特異的受容体を
標的とする、リガンドモジュール；
(2)標的細胞内でMTPを放出するためにエンドサイトーシス小胞を破壊するための、標的
細胞内のpH-依存性膜破壊活性を提供するエンドソーム分解性モジュール；
(3)MTPの特定の細胞内コンパートメントへの送達を引き起こす細胞内輸送モジュールで
あって、ここで該細胞内輸送モジュールが、1以上の細胞輸送機構を基に細胞内コンパー
トメントへMTPを送達するもの；
(4)特定の細胞内巨大分子の認識などの、細胞内認識のためのモジュール；
(5)MTPにより輸送されるべき物質である治療薬、診断薬又は研究用薬剤；並びに
(6)該モジュールを一体化し、且つ該モジュールを輸送される物質とカップリングする
ための担体モジュール：
の1以上を更に含む、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。 - 前記非共有的カップリングのためのモジュールが、疎水性ポケットを有する、請求項2
記載のモジュラー輸送プラットフォーム。 - 前記疎水性ポケットを伴うモジュールが、大腸菌ヘモグロビン-様タンパク質HMPである
、請求項2記載のモジュラー輸送プラットフォーム。 - 前記輸送されるべき物質が、前記疎水性ポケットを介して、モジュラー輸送プラットフ
ォームへカップリングされる、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。 - 前記輸送されるべき物質が、該物質の前記疎水性ポケットへの挿入を介して、モジュラ
ー輸送プラットフォームへカップリングされる、請求項5記載のモジュラー輸送プラット
フォーム。 - 前記輸送されるべき物質が、疎水性ポケットへ挿入されるべきテトラピロール分子への
カップリングを介して、モジュラー輸送プラットフォームへカップリングされる、請求項
6記載のモジュラー輸送プラットフォーム。 - 前記輸送されるべき物質が、放射性核種である、請求項1記載のモジュラー輸送プラッ
トフォーム。 - 前記MTPが、分子全体として細菌により合成される、請求項1記載のモジュラー輸送プラ
ットフォーム。 - 前記MTPが、いくつかの分離された成分として細菌により合成され、その後これらの成
分が統合されMTPを形成する、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。 - 前記分離された成分が、インテインにより組み合わされる、請求項10記載のモジュラー
輸送プラットフォーム。 - 前記モジュラー輸送プラットフォームの成分の一つが、請求項9記載の不完全なモジュ
ラー輸送プラットフォームであり、且つ第二成分が、該モジュラー輸送プラットフォーム
の標的細胞への透過を達成する、請求項11記載のモジュラー輸送プラットフォーム。 - 前記モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過を達成するリガンドモジュー
ルが、細菌により合成される、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。 - 前記モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過を達成するリガンドモジュー
ルが、化学的に合成される、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。 - 前記標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内
保持機能を伴うモジュールが、細胞内コンパートメント内の特異的構造(分子)と相互作用
する、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。 - 前記標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内
保持機能を伴うモジュールが、細胞核内の特異的構造(分子)と相互作用する、請求項15記
載のモジュラー輸送プラットフォーム。 - 前記標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内
保持機能を伴うモジュールが、DNAと相互作用する、請求項15記載のモジュラー輸送プラ
ットフォーム。 - 前記標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内
保持機能を伴うモジュールが、透明質内の特異的構造(分子)と相互作用する、請求項15記
載のモジュラー輸送プラットフォーム。 - 前記標的細胞の細胞内コンパートメント内のモジュラー輸送プラットフォームの細胞内
保持機能を伴うモジュールが、プロテアソームと相互作用する、請求項15記載のモジュラ
ー輸送プラットフォーム。 - 前記輸送されるべき作用物質が、モジュラー輸送プラットフォームへ共有的に結合され
ている、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォーム。 - 前記輸送されるべき作用物質が、放射性核種である、請求項20記載のモジュラー輸送プ
ラットフォーム。 - 前記輸送されるべき作用物質が、光増感剤である、請求項20記載のモジュラー輸送プラ
ットフォーム。 - 前記MTPが、前記モジュラー輸送プラットフォームの選択された標的細胞への透過、標
的細胞内のpH-依存性膜破壊活性、標的細胞内の選択された細胞部位への指向された細胞
内輸送、及び輸送されるべき作用物質の付加を達成し、ここで：
該分子が、環状テトラピロール分子の非共有的カップリングのためのモジュールを有し
；並びに
該分子が、選択された細胞内部位内の該モジュラー輸送プラットフォームの細胞内保持
機能を伴うモジュールを有する、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォームを分子
全体としてコードしているプラスミド。 - 輸送されるべき物質として治療薬、診断薬又は研究用薬剤をモジュラー輸送プラットフ
ォームにより送達する方法であって、該モジュラー輸送プラットフォームが：
該モジュラー輸送プラットフォームの標的細胞への透過；
該モジュラー輸送プラットフォームを放出するための標的細胞内のpH-依存性膜破壊活
性；
標的化された細胞内コンパートメントへの指向された細胞内輸送；
環状テトラピロール分子の非共有的カップリングのためのモジュールへの輸送されるべ
き物質の付加：を達成する1つの分子内の機能性モジュール；並びに
標的細胞の細胞内コンパートメント内の該モジュラー輸送プラットフォームの保持の機
能を伴うモジュール：
を含み、該モジュラー輸送プラットフォームに結合された輸送されるべき物質を伴うモジ
ュラー輸送プラットフォームの全身注入を含む、前記方法。 - 請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォームを作製する技術。
- 凍結乾燥後に機能性モジュラー輸送プラットフォームを得るために緩衝液を使用するこ
とを含む、請求項1記載のモジュラー輸送プラットフォームの乾燥、貯蔵及び再構成の方
法。
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| US61/528,971 | 2011-08-30 | ||
| US13/371,377 | 2012-02-10 | ||
| US13/371,377 US9095624B2 (en) | 2011-05-23 | 2012-02-10 | Modular transport platform for targeted delivery of therapeutic agents |
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