JP2017079719A - Production method and production device of cell assembly structure - Google Patents

Production method and production device of cell assembly structure Download PDF

Info

Publication number
JP2017079719A
JP2017079719A JP2016176819A JP2016176819A JP2017079719A JP 2017079719 A JP2017079719 A JP 2017079719A JP 2016176819 A JP2016176819 A JP 2016176819A JP 2016176819 A JP2016176819 A JP 2016176819A JP 2017079719 A JP2017079719 A JP 2017079719A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell
cell aggregate
pins
pin
aggregate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2016176819A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP6882658B2 (en
Inventor
健二 米田
Kenji Yoneda
健二 米田
一朗 越田
Ichiro Koshida
一朗 越田
彬良 畑中
Akira Hatanaka
彬良 畑中
寛之 永井
Hiroyuki Nagai
寛之 永井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shibuya Corp
Original Assignee
Shibuya Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shibuya Kogyo Co Ltd filed Critical Shibuya Kogyo Co Ltd
Priority to EP16195338.5A priority Critical patent/EP3162890A1/en
Priority to TW105134729A priority patent/TW201730332A/en
Priority to KR1020160141972A priority patent/KR20170051331A/en
Priority to US15/337,785 priority patent/US20170121674A1/en
Publication of JP2017079719A publication Critical patent/JP2017079719A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP6882658B2 publication Critical patent/JP6882658B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles
    • C12M33/06—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles for multiple inoculation or multiple collection of samples
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

SOLUTION: There is provided a production method of a cell assembly structure for arranging plural cell aggregation lumps 2 in a culture vessel 3 which stores a culture liquid, for producing a cell assembly structure (adhesion pad 4) in which the plural cell aggregation lumps 2 are cultured and mutually fused. Plural pins 16 are erected in the culture vessel 3, spaces between the plural pins 16, 16 serve as storage parts H, the cell aggregation lumps 2 are stored with the plural pins 16, and the cell aggregation lumps 2 are cultured in a stored state in the plural adjacent storage parts H.EFFECT: As an effect, a desired shape and a dimension can be achieved, and the cell assembly structure can be obtained without applying a damage to cells.SELECTED DRAWING: Figure 4

Description

本発明は細胞の集合構造体の作製方法および作製装置に関し、詳しくは培養液を収容した培養容器の内部に複数の細胞凝集塊を配置し、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製方法および作製装置に関する。   The present invention relates to a method and apparatus for producing a cell aggregate structure, and more specifically, a plurality of cell aggregates are arranged inside a culture vessel containing a culture solution, and the plurality of cell aggregates are cultured and fused together. The present invention relates to a method and apparatus for manufacturing a cell aggregate structure.

損傷を受けた生体機能を幹細胞などを用いて復元させる再生医療においては、細胞を高密度に培養した細胞シートが使用されている。この細胞シートは極めて薄いため、何枚かの細胞シートを重ね合わせる積層化培養細胞シートの製造方法が知られている（特許文献１）。
また一方においては、予め細胞を略球状に培養した細胞凝集塊（スフェロイド）を相互に接触した状態に並べて浮遊培養を行い、細胞凝集塊同士が融合した５０〜３００μｍの厚みを有するシート状細胞凝集塊の作製方法が知られている（特許文献２）。
さらには、細胞凝集塊を任意の空間に配置するための方法として、糸状体または針状体からなる支持体に細胞凝集塊を貫通させる細胞の立体構造体の作製方法が知られている（特許文献３）。 In regenerative medicine in which damaged biological functions are restored using stem cells or the like, cell sheets in which cells are cultured at high density are used. Since this cell sheet is extremely thin, a method for producing a laminated cultured cell sheet in which several cell sheets are superposed is known (Patent Document 1).
On the other hand, cell aggregates (spheroids) in which cells are cultured in a substantially spherical shape in advance are arranged in contact with each other and suspended in culture, and the cell aggregates having a thickness of 50 to 300 μm are formed by fusing the cell aggregates together. A lump production method is known (Patent Document 2).
Furthermore, as a method for arranging the cell aggregate in an arbitrary space, a method for producing a three-dimensional structure of a cell in which the cell aggregate is penetrated through a support composed of a filamentous body or a needle-shaped body is known (patent) Reference 3).

特許第４９２１３５３号公報Japanese Patent No. 4931353 特許第５５２３８３０号公報Japanese Patent No. 5523830 特許第４５１７１２５号公報Japanese Patent No. 4517125

しかしながら、特許文献１のように細胞シートを積層化する場合、細胞シートは極めて薄いことから、取り扱いが難しく自動化することが困難であった。
また、特許文献２のように細胞凝集塊を浮遊培養してシート状細胞凝集塊を得ようとした場合、整列させた細胞凝集塊に粗密が生じて細胞凝集塊同士が不規則に融合するため、得られるシート状細胞凝集塊の形状が定まらず、厚さも不均一になるという問題があった。
さらに、特許文献３のように糸状体または針状体からなる支持体に細胞凝集塊を貫通させる場合には、細胞にダメージを与えるおそれがあった。
このような問題に鑑み、本発明は所要の形状および寸法を得ることができ、かつ細胞にダメージを与えることのない細胞の集合構造体の作製方法および作製装置を提供するものである。 However, when the cell sheets are laminated as in Patent Document 1, the cell sheets are extremely thin, so that they are difficult to handle and difficult to automate.
In addition, when a cell aggregate is suspended and cultured to obtain a sheet-like cell aggregate as in Patent Document 2, the aligned cell aggregates become dense and the cell aggregates are fused irregularly. However, there is a problem that the shape of the obtained sheet-like cell aggregate is not determined and the thickness is not uniform.
Furthermore, when the cell aggregate is penetrated through a support made of a filamentous body or a needle-like body as in Patent Document 3, there is a risk of damaging the cells.
In view of such problems, the present invention provides a method and apparatus for producing a cell aggregate structure that can obtain a required shape and size and that does not damage cells.

すなわち請求項１の発明にかかる細胞の集合構造体の作製方法は、培養液を収容した培養容器の内部に複数の細胞凝集塊を配置し、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製方法において、
上記培養容器の内部に複数のピンを立設し、当該複数のピンとピンとの間を収容部として複数のピンにより上記細胞凝集塊を収容するよう構成し、
複数の隣接する収容部に細胞凝集塊を収容した状態で培養することを特徴としている。 That is, in the method for producing a cell aggregate structure according to the invention of claim 1, a plurality of cell aggregates are arranged inside a culture vessel containing a culture solution, and the plurality of cell aggregates are cultured and fused to each other. In a method for producing a cell aggregate structure,
A plurality of pins are erected inside the culture vessel, and the cell aggregates are accommodated by a plurality of pins as an accommodating portion between the plurality of pins.
It is characterized by culturing in a state in which the cell aggregates are accommodated in a plurality of adjacent accommodating portions.

また請求項７の発明にかかる細胞の集合構造体の作製装置は、培養液を収容した培養容器の内部に複数の細胞凝集塊を配置し、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製装置において、
上記培養容器の内部に、複数のピンを立設した収容手段を設け、
さらに上記収容手段における複数のピンとピンとの間に上記細胞凝集塊を供給する供給手段を備え、
上記複数のピンとピンとの間を細胞凝集塊の収容部として、上記供給手段は複数の隣接する収容部に細胞凝集塊を収容することを特徴としている。 According to a seventh aspect of the present invention, there is provided an apparatus for producing a cell aggregate structure, in which a plurality of cell aggregates are arranged inside a culture vessel containing a culture solution, and the plurality of cell aggregates are cultured and fused together. In an apparatus for producing a cell aggregate structure,
Inside the culture vessel, provided with a storage means standing a plurality of pins,
Furthermore, comprising a supply means for supplying the cell aggregate between a plurality of pins in the housing means,
The supply means stores the cell aggregates in a plurality of adjacent storage units, with the plurality of pins between the pins serving as a cell aggregate storage unit.

上記請求項１および請求項７の発明によれば、複数のピンとピンとの間を収容部として、複数の隣接する収容部に細胞凝集塊を収容させるため、各細胞凝集塊は当該収容部で培養されることにより相互に融合し、所要の形状および寸法の細胞の集合構造体を作製することができる。また細胞凝集塊にピンを貫通させる必要がないため、細胞へのダメージも抑えることができる。   According to the first and seventh aspects of the present invention, a cell aggregate is accommodated in a plurality of adjacent accommodating portions with a space between the plurality of pins and the pins, and each cell aggregate is cultured in the accommodating portion. By doing so, it is possible to produce an aggregate structure of cells having a required shape and size by fusing each other. Moreover, since it is not necessary to penetrate a pin into the cell aggregate, damage to cells can be suppressed.

細胞の集合構造体の製造装置が設けられるアイソレータとインキュベータの正面図Front view of an isolator and an incubator provided with an apparatus for manufacturing a cell aggregate structure 細胞の集合構造体の製造装置の構成図Configuration diagram of cell assembly structure manufacturing equipment 収容容器および吸引ノズルについての断面図Cross-sectional view of the storage container and suction nozzle 培養容器の断面図Cross section of culture vessel 培養容器に収容される細胞凝集塊についての平面図Plan view of cell aggregates contained in culture vessel 培養液供給手段についての側面図Side view of culture fluid supply means 第２実施例における培養容器内での細胞の集合構造体の取り扱いを説明する図The figure explaining the handling of the assembly structure of the cell in the culture container in 2nd Example 第３実施例における培養容器内での細胞の集合構造体の取り扱いを説明する図The figure explaining the handling of the assembly structure of the cell in the culture container in 3rd Example 第４実施例における第１、第２ピン群を構成するピンの配置を説明する図The figure explaining arrangement | positioning of the pin which comprises the 1st, 2nd pin group in 4th Example 第４実施例における培養容器内での細胞の集合構造体の取り扱いを説明する図The figure explaining the handling of the assembly structure of the cell in the culture container in 4th Example 第４実施例における第１、第２ピン群についての他の構成を説明する図The figure explaining the other structure about the 1st, 2nd pin group in 4th Example 第４実施例における第１、第２ピン群についての他の構成を説明する図The figure explaining the other structure about the 1st, 2nd pin group in 4th Example 第５実施例における培養容器内での細胞の集合構造体の取り扱いを説明する図The figure explaining the handling of the assembly structure of the cell in the culture container in 5th Example 第５実施例に追加可能な工程を説明する図The figure explaining the process which can be added to 5th Example 第６実施例における培養容器内での細胞の集合構造体の取り扱いを説明する図The figure explaining the handling of the assembly structure of the cell in the culture container in 6th Example 第６実施例において培養容器内での細胞凝集塊の配置を説明する図The figure explaining arrangement | positioning of the cell clump in a culture container in 6th Example 培養容器内での細胞凝集塊を保持する他の方法を説明する図The figure explaining the other method of hold | maintaining the cell clump in a culture container

以下、図示実施例について説明すると、図１〜図６は第１実施例にかかる細胞の集合構造体の作製装置１を説明するものであって、複数の細胞凝集塊２（スフェロイド：図３参照）を培養容器３の内部で配置し、上記細胞凝集塊２が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体としての癒合パッド４（図４参照）を作製するものとなっている。
上記細胞凝集塊２は、例えば特許第４５１７１２５号に開示される方法で作製することができる。すなわち、内面が非接着性の容器に細胞を播種して培養すると、細胞は足場を求めて互いに接着し合うことで凝集して細胞凝集塊２が形成され、これらがさらに融合することで外径寸法が５００μｍ程度の略球状の細胞凝集塊２が形成される。
より効率的には、ウエルプレートの非接着性のウエル（略半球状の収容部）で培養することにより容易に細胞凝集塊２を得ることができる。なお、細胞凝集塊２の作製方法はこれに限らず、旋回している培養液中に細胞懸濁液を入れる旋回培養法、試験管に細胞懸濁液を入れて遠心分離器で沈殿させる方法、あるいはアルギン酸ビーズを用いて培養する方法など公知の様々な方法で作製することができる。
このように、細胞凝集塊２とは、細胞同士が集合し凝集化した１００〜５００μｍ程度の外径寸法を有した略球状の細胞集合体を指し、これらの細胞凝集塊２を平面的または立体的に接触または接近させて配置すると、各細胞凝集塊２の細胞が増殖して隣接する細胞凝集塊２と融合し、平面的または立体的な細胞の集合構造体が得られるようになっている。
本実施例で作製する癒合パッド４は、軟骨等に癒合させるために用いることができ、複数の細胞凝集塊２を平面的に配置して融合させたものとなっている。厚さは用いる細胞凝集塊２の寸法に応じて１００〜５００μｍ程度のものを作製することが可能で、平面的なサイズは整列させる細胞凝集塊２の個数によって調節可能となっている。
このように作製される上記癒合パッド４は、細胞懸濁液を平面的に培養することで細胞単体をシート状に培養して得られる細胞シートとは異なるものである。 Hereinafter, the illustrated embodiment will be described. FIG. 1 to FIG. 6 illustrate a cell aggregate structure manufacturing apparatus 1 according to the first embodiment, and a plurality of cell aggregates 2 (spheroid: see FIG. 3). ) Is placed inside the culture vessel 3, and the cell aggregate 2 is cultured to produce a fusion pad 4 (see FIG. 4) as an aggregate structure of cells fused together.
The cell aggregate 2 can be produced by, for example, a method disclosed in Japanese Patent No. 4517125. That is, when cells are seeded and cultured in a container whose inner surface is non-adhesive, the cells aggregate to form a cell aggregate 2 by adhering to each other in search of a scaffold, and these further fuse to form an outer diameter. A substantially spherical cell aggregate 2 having a dimension of about 500 μm is formed.
More efficiently, the cell aggregate 2 can be easily obtained by culturing in a non-adhesive well (substantially hemispherical accommodating portion) of the well plate. The method for producing the cell agglomerate 2 is not limited to this, and a swirl culture method in which the cell suspension is put in the swirling culture solution, or a method in which the cell suspension is put in a test tube and precipitated with a centrifuge Alternatively, it can be prepared by various known methods such as a culture method using alginate beads.
Thus, the cell aggregate 2 refers to a substantially spherical cell aggregate having an outer diameter of about 100 to 500 μm in which cells are aggregated and aggregated, and these cell aggregates 2 are planar or three-dimensional. If the cells are placed in contact or close to each other, the cells of each cell aggregate 2 proliferate and fuse with the adjacent cell aggregate 2 to obtain a planar or three-dimensional aggregate structure of cells. .
The fusion pad 4 produced in the present embodiment can be used for fusion with cartilage or the like, and is formed by arranging a plurality of cell aggregates 2 in a plane and fusing them. The thickness can be made about 100 to 500 μm depending on the size of the cell aggregate 2 to be used, and the planar size can be adjusted by the number of cell aggregates 2 to be aligned.
The fusion pad 4 thus produced is different from a cell sheet obtained by culturing a cell suspension in a planar form by culturing a cell suspension in a planar manner.

本実施例の細胞の集合構造体の作製装置１は、図１に示す内部が無菌状態に維持されたアイソレータ５と、当該アイソレータ５に接続可能に設けられたインキュベータ６との内部に設けられている。また、アイソレータ５には、搬入物を除染するためのパスボックス５ａが設けられている。
図２は上記アイソレータ５の内部に設けられた構成を示し、細胞凝集塊２を収容する収容容器７を支持する収容容器支持部８と、癒合パッド４の培養される培養容器３を支持する培養容器支持部９と、上記細胞凝集塊２を保持する複数の吸引ノズル１０と、上記吸引ノズル１０を上記収容容器７および培養容器３に対して相対的に移動させるノズル移動手段１１とを備えている。
一方、図６は上記インキュベータ６の内部に設けられた構成を示し、培養容器３の細胞凝集塊２もしくは癒合パッド４に培養液を供給する培養液供給手段１２を備えている。
なお、以下の説明において、図２における図示左右方向をＸ方向、前後方向をＹ方向、上下方向をＺ方向とし、図５では図示左右方向をＸ方向、上下方向をＹ方向とする。 The cell assembly structure manufacturing apparatus 1 of the present embodiment is provided inside an isolator 5 in which the interior shown in FIG. 1 is maintained in a sterile state and an incubator 6 provided so as to be connectable to the isolator 5. Yes. In addition, the isolator 5 is provided with a pass box 5a for decontaminating the incoming material.
FIG. 2 shows a configuration provided inside the isolator 5, and a container supporting unit 8 that supports the container 7 that stores the cell aggregate 2 and a culture that supports the culture container 3 in which the fusion pad 4 is cultured. A container support 9; a plurality of suction nozzles 10 for holding the cell agglomerates 2; and nozzle moving means 11 for moving the suction nozzles 10 relative to the storage container 7 and the culture container 3. Yes.
On the other hand, FIG. 6 shows a configuration provided inside the incubator 6 and includes a culture solution supply means 12 for supplying a culture solution to the cell aggregate 2 or the fusion pad 4 of the culture vessel 3.
In the following description, the horizontal direction shown in FIG. 2 is the X direction, the front-rear direction is the Y direction, the vertical direction is the Z direction, and in FIG. 5, the horizontal direction is the X direction and the vertical direction is the Y direction.

上記アイソレータ５は内部が無菌環境に維持され、また無菌エア供給手段によって上方から下方へと向かう無菌エアによる一方向流が形成されるようになっている。
またアイソレータ５の正面には作業者が装着可能なグローブ５ｂが設けられており、各種の作業を行うことが可能となっている。なお、アイソレータ５の内部にロボットや所要の構成を有した移送手段を設けて、これらの作業を自動的に行うようにすることもできる。
次に、上記インキュベータ６は、内部が無菌環境に維持されるとともに、癒合パッド４の培養に適した所定の温度および湿度に維持され、細胞凝集塊２が融合して癒合パッド４へと形成される間、上記インキュベータ６を上記アイソレータ５より分離して、当該アイソレータ５より離れた場所に載置することが可能となっている。
そのため、上記アイソレータ５とインキュベータ６とは接続手段１３によって接続されており、例えば特許第４６５６４８５号公報に記載されるような、インキュベータ６とアイソレータ５とを無菌状態を維持したまま接離させる接続手段を使用することができる。 The interior of the isolator 5 is maintained in a sterile environment, and a one-way flow is generated by aseptic air from above to below by the sterile air supply means.
In addition, a glove 5b that can be worn by an operator is provided in front of the isolator 5, so that various operations can be performed. It is also possible to provide a robot or a transfer means having a required configuration inside the isolator 5 so that these operations are automatically performed.
Next, the inside of the incubator 6 is maintained in a sterile environment and is maintained at a predetermined temperature and humidity suitable for culturing the fusion pad 4, and the cell aggregate 2 is fused to form the fusion pad 4. During this time, the incubator 6 can be separated from the isolator 5 and placed at a location away from the isolator 5.
For this reason, the isolator 5 and the incubator 6 are connected by the connecting means 13, and for example, as described in Japanese Patent No. 4656485, a connecting means for contacting and separating the incubator 6 and the isolator 5 while maintaining sterility. Can be used.

図３は上記収容容器７の断面図を示し、上述したウエルプレートを使用することができる。収容容器７は平面視において縦横に複数の収容凹部７ａを備え、各収容凹部７ａの内部には培養液とともに略球状の細胞凝集塊２が一個ずつ収容されている。
上記収容容器７の収容凹部７ａは、平面視におけるＸ方向およびＹ方向にそれぞれ所定個数ずつ整列しており、本実施例では培養容器３において作製する癒合パッド４を構成する細胞凝集塊２のＸ方向およびＹ方向の個数と同数、すなわちＸ方向に５個、Ｙ方向に５個それぞれ設けられている。 FIG. 3 shows a cross-sectional view of the container 7, and the well plate described above can be used. The storage container 7 includes a plurality of storage recesses 7a vertically and horizontally in a plan view, and each of the storage recesses 7a stores a substantially spherical cell aggregate 2 together with a culture solution one by one.
The storage recesses 7a of the storage container 7 are arranged in a predetermined number in the X direction and the Y direction in plan view. In this embodiment, the X of the cell aggregate 2 constituting the fusion pad 4 produced in the culture container 3 is used. The number is the same as the number in the direction and the Y direction, that is, five in the X direction and five in the Y direction.

上記収容容器７を支持する収容容器支持部８は、位置決め片８ｂによってその上面で上記収容容器７を位置決めするとともに、上記ノズル移動手段１１を構成するＹ方向テーブル８ａによって構成されている。
後述するように、本実施例の吸引ノズル１０はＸ方向に５個設けられ、またＸ方向およびＺ方向にのみ移動可能となっていることから、上記Ｙ方向テーブル８ａが収容容器７をＹ方向に移動させることで、吸引ノズル１０と収容容器７とをＸＹＺの各方向で相対的に移動させることができる。
具体的に説明すると、最初に上記Ｙ方向テーブル８ａが収容容器７の１列目の収容凹部７ａを吸引ノズル１０の下方に位置させて、当該一列目の収容凹部７ａから吸引ノズル１０が細胞凝集塊２を吸着保持すると、Ｙ方向テーブル８ａが１列分だけＹ方向に収容容器７を移動させて、２列目の収容凹部７ａを吸引ノズル１０の下方に位置させるようになっている。 The storage container support portion 8 that supports the storage container 7 is configured by a Y-direction table 8a that constitutes the nozzle moving means 11 while positioning the storage container 7 on its upper surface by a positioning piece 8b.
As will be described later, five suction nozzles 10 of the present embodiment are provided in the X direction, and are movable only in the X direction and the Z direction. Therefore, the Y direction table 8a moves the container 7 in the Y direction. The suction nozzle 10 and the container 7 can be relatively moved in each direction of XYZ.
Specifically, the Y-direction table 8a first positions the first row of storage recesses 7a of the storage container 7 below the suction nozzle 10, and the suction nozzle 10 aggregates cells from the first row of storage recesses 7a. When the lump 2 is sucked and held, the Y-direction table 8a moves the storage container 7 in the Y direction by one row, and the second row of storage recesses 7a is positioned below the suction nozzle 10.

図４に示すように、培養容器３は有底箱状を有しており、内部には所定の深さで培養液が収容されるとともに、底面に設置された底面プレート１４と、当該底面プレート１４に設置された台座１５および当該台座１５に立設された複数のピン１６から構成される収容手段と、上記ピン１６に沿って上下に移動する下方支持部材としての支持プレート１７とが設けられている。
上記底面プレート１４は培養容器３の底面と略同形を有しており、底面プレート１４が培養容器３の内部で移動しないように位置決めされている。また上記台座１５は直方体形状を有しており、底面プレート１４の上面に形成された凹部１４ａに嵌合して位置決めされるようになっている。 As shown in FIG. 4, the culture vessel 3 has a bottomed box shape, in which a culture solution is accommodated at a predetermined depth, and a bottom plate 14 installed on the bottom surface, and the bottom plate 14 and a receiving means composed of a plurality of pins 16 erected on the pedestal 15 and a support plate 17 as a lower support member that moves up and down along the pins 16 are provided. ing.
The bottom plate 14 has substantially the same shape as the bottom surface of the culture vessel 3 and is positioned so that the bottom plate 14 does not move inside the culture vessel 3. The pedestal 15 has a rectangular parallelepiped shape, and is positioned by being fitted into a recess 14 a formed on the upper surface of the bottom plate 14.

上記ピン１６は上記台座１５の上面に形成された設置面１５ａにそれぞれＺ方向を向くように規則的に立設されている。
図５は上記台座１５に設けられたピン１６と、当該ピン１６によって保持される細胞凝集塊２についての平面図を示し、本実施例ではＸ方向およびＹ方向にそれぞれ５個の細胞凝集塊２を相互に接触した状態で平面的に整列させるようになっている。
上記ピン１６は、各細胞凝集塊２の周囲に位置するように設けられており、本実施例では４本のピン１６によって細胞凝集塊２を収容する収容部Ｈを構成している。より具体的には、平面視において４本のピン１６が四隅に位置する略正方形の区画を上記収容部Ｈとしている。
本実施例では、上記収容部Ｈを構成する４本のピン１６のうち、各対角位置の２本のピン１６の間隔は、収容する細胞凝集塊２の直径よりも短くなるように配置されている。換言すると、細胞凝集塊２を作製する際に、各対角位置の２本のピン１６の間隔よりも直径が大きくなるようにしている。
このように構成された収容部Ｈに細胞凝集塊２を収容すると、複数のピン１６とピン１６との間で細胞凝集塊２を挟持することができ、図４（ａ）のように細胞凝集塊２を上記ピン１６の先端と根元との間の上下中間部分に位置させることが可能となる。
換言すると、上記収容部Ｈを上記複数のピン１６を立設した設置面１５ａから離隔した位置に設定することができ、当該収容部Ｈに保持された細胞凝集塊２と設置面１５ａとの間に、培養液が流通可能な隙間ｇを形成することができる。
またピン１６の直径にもよるが、各対角位置の２本のピン１６の間隔を細胞凝集塊２の直径よりも短くすることで、各収容部Ｈの細胞凝集塊２同士を相互に接触させた状態で培養することができるようになっている。 The pins 16 are regularly erected on an installation surface 15 a formed on the upper surface of the pedestal 15 so as to face the Z direction.
FIG. 5 shows a plan view of the pin 16 provided on the pedestal 15 and the cell aggregate 2 held by the pin 16, and in this embodiment, five cell aggregates 2 in the X direction and Y direction, respectively. Are arranged in a plane in contact with each other.
The said pin 16 is provided so that it may be located around each cell aggregate 2 and the accommodating part H which accommodates the cell aggregate 2 is comprised by the four pins 16 in a present Example. More specifically, a substantially square section where the four pins 16 are located at the four corners in plan view is defined as the housing portion H.
In the present embodiment, among the four pins 16 constituting the accommodating portion H, the interval between the two pins 16 at each diagonal position is arranged to be shorter than the diameter of the cell aggregate 2 to be accommodated. ing. In other words, when the cell aggregate 2 is produced, the diameter is made larger than the interval between the two pins 16 at each diagonal position.
When the cell aggregate 2 is housed in the housing portion H configured as described above, the cell aggregate 2 can be sandwiched between the plurality of pins 16 and the pins 16, and the cell aggregate 2 as shown in FIG. The lump 2 can be positioned at the upper and lower intermediate portion between the tip and the root of the pin 16.
In other words, the storage portion H can be set at a position separated from the installation surface 15a where the plurality of pins 16 are erected, and between the cell aggregate 2 held in the storage portion H and the installation surface 15a. In addition, a gap g through which the culture solution can be circulated can be formed.
Further, although depending on the diameter of the pins 16, the cell aggregates 2 in each housing portion H are brought into contact with each other by making the interval between the two pins 16 at each diagonal position shorter than the diameter of the cell aggregate 2. It can be cultured in a state of being allowed to stand.

上記底面プレート１４には、上記台座１５を挟んで対向した位置に設けられるとともに、Ｚ方向に向けて立設されて上記支持プレート１７を上下に貫通する２本の棒状のガイド部材１８が設けられ、上記支持プレート１７には上記ピン１６が貫通する貫通孔１７ａが穿設されている。
上記構成により、上記支持プレート１７は上記ピン１６およびガイド部材１８に沿ってＺ方向に昇降可能に設けられるとともに、通常は自重により上記台座１５の設置面１５ａに載置される下降位置に位置している。
図４（ａ）に示す支持プレート１７が下降位置に位置した際、上記ピン１６の上下中間部分に保持された細胞凝集塊２と上記台座１５の設置面１５ａとの間には、培養液が流通可能な隙間ｇが形成されるようになっている。
一方、図４（ｂ）に示すように、支持プレート１７を上昇させると、支持プレート１７は上記ピン１６とピン１６との間に保持された細胞凝集塊２を下方から支持することができ、上記支持プレート１７が上昇位置まで位置することで、細胞凝集塊２が培養された癒合パッド４を上記ピン１６間から取り出すことができるようになっている。
上記支持プレート１７の上昇は、グローブ５ｂを装着した作業者によって行える他、ロボット等によって行うことも可能である。その際、図示しないが上記支持プレート１７の上面に上記培養液の液面より上方に突出する把持部材を設けることで、培養液に触れずに支持プレート１７を上昇させることが可能となる。 The bottom plate 14 is provided with two rod-shaped guide members 18 which are provided at positions opposed to each other with the pedestal 15 interposed therebetween and which are erected in the Z direction and penetrate the support plate 17 up and down. The support plate 17 has a through hole 17a through which the pin 16 passes.
With the above configuration, the support plate 17 is provided so as to be movable up and down in the Z direction along the pin 16 and the guide member 18, and is normally positioned at a lowered position where the support plate 17 is placed on the installation surface 15 a of the pedestal 15 by its own weight. ing.
When the support plate 17 shown in FIG. 4 (a) is positioned at the lowered position, the culture solution is interposed between the cell aggregate 2 held on the upper and lower intermediate portions of the pin 16 and the installation surface 15a of the pedestal 15. The gap | interval g which can be distribute | circulated is formed.
On the other hand, as shown in FIG. 4B, when the support plate 17 is raised, the support plate 17 can support the cell aggregate 2 held between the pins 16 and 16 from below, By positioning the support plate 17 to the raised position, the fusion pad 4 on which the cell aggregate 2 is cultured can be taken out from between the pins 16.
The support plate 17 can be raised by an operator wearing the globe 5b, or by a robot or the like. At this time, although not shown, by providing a grip member protruding above the surface of the culture solution on the upper surface of the support plate 17, the support plate 17 can be raised without touching the culture solution.

図２に示すように、培養容器支持部９は上記ノズル移動手段１１を構成するＹ方向テーブル９ａによって構成され、上記収容容器支持部８を構成するＹ方向テーブル８ａと同様、吸引ノズル１０に吸着保持された細胞凝集塊２が上記ピン１６によって構成された収容部Ｈに供給されるたびに、培養容器３ごとピン１６間に設定された収容部Ｈを上記Ｙ方向に一列ずつ移動させるものとなっている。   As shown in FIG. 2, the culture vessel support 9 is constituted by a Y-direction table 9 a that constitutes the nozzle moving means 11, and is adsorbed by the suction nozzle 10 in the same manner as the Y-direction table 8 a that constitutes the storage vessel support 8. Each time the retained cell aggregate 2 is supplied to the accommodating portion H constituted by the pins 16, the accommodating portions H set between the pins 16 together with the culture vessel 3 are moved one row at a time in the Y direction. It has become.

次に、上記吸引ノズル１０について説明すると、図３に示すように図示しない負圧発生手段に接続された本体部１０ａと、当該本体部１０ａの下端部に設けられた管状の吸着部１０ｂとを備えている。
上記吸着部１０ｂの内径は上記細胞凝集塊２より小径となっており、上記収容容器７の収容凹部７ａにおいて吸着部１０ｂの先端に細胞凝集塊２を吸着保持した際に、細胞凝集塊２が当該吸着部１０ｂの内部に吸い込まれないようになっている。
また培養容器３においては、上記吸着部１０ｂの中心位置をピン１６とピン１６との間に形成した収容部Ｈの略中央に位置させ、かつ細胞凝集塊２を上記ピン１６の上下中間位置に位置した状態で上記負圧発生手段による負圧を解消する。
なお細胞凝集塊２を吸着保持する吸引ノズル１０に代えて、グリッパなどによって細胞凝集塊２を保持する等の構成を有したものを用いて細胞凝集塊２を保持するようにしてもよい。 Next, the suction nozzle 10 will be described. As shown in FIG. 3, a main body portion 10a connected to a negative pressure generating means (not shown) and a tubular suction portion 10b provided at the lower end portion of the main body portion 10a. I have.
The inner diameter of the adsorbing portion 10b is smaller than that of the cell aggregate 2 and when the cell aggregate 2 is adsorbed and held at the tip of the adsorbing portion 10b in the accommodating recess 7a of the accommodating container 7, the cell aggregate 2 The suction portion 10b is not sucked into the interior.
In the culture vessel 3, the center position of the adsorbing portion 10 b is positioned at the approximate center of the accommodating portion H formed between the pins 16 and 16, and the cell aggregate 2 is positioned at the upper and lower intermediate positions of the pins 16. The negative pressure by the negative pressure generating means is eliminated in the positioned state.
Instead of the suction nozzle 10 for adsorbing and holding the cell aggregate 2, the cell aggregate 2 may be held using a structure having a configuration such as holding the cell aggregate 2 with a gripper or the like.

また上記吸引ノズル１０を移動させるノズル移動手段１１は、上記収容容器支持部８および培養容器支持部９にかけてＸ方向に設けられたＸ方向レール２１と、当該Ｘ方向レール２１に沿って吸引ノズル１０をＸ方向に移動させるＸ方向移動手段２２と、当該Ｘ方向移動手段２２に設けられてＺ方向に吸引ノズル１０を昇降させるＺ方向移動手段２３と、上記収容容器支持部８および培養容器支持部９における上記Ｙ方向テーブル８ａ、９ａとによって構成されている。そして、これら吸引ノズル１０とノズル移動手段１１とにより細胞凝集塊２の供給手段が構成されている。
なお、ノズル移動手段１１としては、Ｙ方向テーブル８ａ、９ａに代えて、上記Ｘ方向レール２１をＹ方向に移動させる構成を有したものであってもよい。このような構成とすることで、上記吸引ノズル１０や後述するカメラ２５をＸ−Ｙ方向に移動させることができる。 Further, the nozzle moving means 11 for moving the suction nozzle 10 includes an X-direction rail 21 provided in the X direction over the storage container support 8 and the culture container support 9, and the suction nozzle 10 along the X-direction rail 21. X-direction moving means 22 for moving the suction nozzle 10 in the X-direction, Z-direction moving means 23 provided in the X-direction moving means 22 for raising and lowering the suction nozzle 10 in the Z-direction, the storage container support 8 and the culture container support 9 and the Y direction tables 8a and 9a. The suction nozzle 10 and the nozzle moving means 11 constitute a supply means for the cell aggregate 2.
The nozzle moving means 11 may be configured to move the X-direction rail 21 in the Y direction instead of the Y-direction tables 8a and 9a. By setting it as such a structure, the said suction nozzle 10 and the camera 25 mentioned later can be moved to a XY direction.

また本実施例の吸引ノズル１０はＸ方向に５個整列して設けられ、これら吸引ノズル１０は間隔変更手段２４によってＸ方向にその間隔が変更されるようになっている。
具体的には、上記吸引ノズル１０が収容容器支持部８の上方に位置した際には、間隔変更手段２４は上記収容容器７におけるＸ方向に整列した収容凹部７ａと同じ間隔に上記吸引ノズル１０の間隔を変更する。
一方、吸引ノズル１０が培養容器支持部９の上方に位置した際には、間隔変更手段２４は上記培養容器３の内部のピン１６とピン１６との間に形成された収容部Ｈにおける、Ｘ方向の間隔と同じ間隔に吸引ノズル１０の間隔を変更する。
なお、吸引ノズル１０についてはＹ方向に複数列設けることも可能であり、また収容容器支持部８の収容凹部７ａの間隔と、上記ピン１６とピン１６との間に形成された収容部Ｈの間隔とが同じ場合には、上記間隔変更手段２４を省略することができる。
また例えば上記収容部Ｈの間隔が狭い場合には、上記吸引ノズル１０によって一つおきの収容部Ｈに細胞凝集塊２を保持させることも可能であり、その場合、最初に奇数番目の収容部Ｈに細胞凝集塊２を保持させ、その後偶数番目の収容部Ｈに細胞凝集塊２を保持させるようにすればよい。
なお、吸引ノズル１０は少なくとも１本備えられていれば良く、また、細胞凝集塊２の供給手段としては、本実施例のように細胞凝集塊２を移載する構成の他、多数の細胞凝集塊２を収容した容器から１個ずつ繰り出すような構成であっても良い。 Further, five suction nozzles 10 according to the present embodiment are arranged in the X direction, and the intervals of these suction nozzles 10 are changed in the X direction by the interval changing means 24.
Specifically, when the suction nozzle 10 is positioned above the storage container support 8, the interval changing means 24 is arranged at the same interval as the storage recesses 7 a aligned in the X direction in the storage container 7. Change the interval.
On the other hand, when the suction nozzle 10 is positioned above the culture vessel support 9, the interval changing means 24 is X in the housing portion H formed between the pins 16 inside the culture vessel 3. The interval of the suction nozzle 10 is changed to the same interval as the direction interval.
The suction nozzles 10 can be provided in a plurality of rows in the Y direction, and the space between the housing recesses 7 a of the housing container support 8 and the housing portion H formed between the pins 16 and 16 can be provided. When the interval is the same, the interval changing means 24 can be omitted.
In addition, for example, when the interval between the accommodating portions H is narrow, it is possible to hold the cell aggregate 2 in every other accommodating portion H by the suction nozzle 10, and in that case, the odd-numbered accommodating portions are firstly provided. The cell aggregate 2 may be held in H, and then the cell aggregate 2 may be held in the even-numbered accommodating portion H.
In addition, it is sufficient that at least one suction nozzle 10 is provided, and as a means for supplying the cell aggregate 2, in addition to the configuration for transferring the cell aggregate 2 as in this embodiment, a number of cell aggregates are provided. The configuration may be such that one by one is delivered from the container containing the lump 2.

また上記Ｘ方向レール２１にはＸ方向に移動するカメラ２５が設けられており、上記カメラ２５は上記吸引ノズル１０によって細胞凝集塊２が収容部Ｈに保持されると、培養容器支持部９の上方まで移動して培養容器３内の収容部Ｈを撮影するようになっている。
撮影された画像により、上記全ての収容部Ｈに細胞凝集塊２が保持されているか否かが確認され、必要に応じて細胞凝集塊２の保持されていない収容部Ｈに対して細胞凝集塊２を供給するよう、指示することができる。
またカメラ２５は、上記ノズル移動手段１１が吸引ノズル１０を培養容器支持部９の上方に位置させる際には、吸引ノズル１０との接触を避けるために培養容器支持部９の上方から退避するようになっている。 The X-direction rail 21 is provided with a camera 25 that moves in the X-direction. When the cell aggregate 2 is held in the storage portion H by the suction nozzle 10, the camera 25 moves to the culture vessel support portion 9. It moves to the upper side, and the accommodation part H in the culture container 3 is image | photographed.
It is confirmed from the photographed image whether or not the cell aggregate 2 is held in all the accommodating portions H, and if necessary, the cell aggregate is compared with the accommodating portion H where the cell aggregate 2 is not held. 2 can be instructed to supply.
Further, when the nozzle moving means 11 positions the suction nozzle 10 above the culture vessel support 9, the camera 25 is retracted from above the culture vessel support 9 in order to avoid contact with the suction nozzle 10. It has become.

図６はインキュベータ６の内部に設けられた、培養途中の癒合パッド４に培養液を供給する培養液供給手段１２を示し、インキュベータ６の内部に複数の培養容器３を収容する場合には、各培養容器３のそれぞれについて上記培養液供給手段１２を設けることができる。
上記培養液供給手段１２は、両端が上記培養容器３の上方から培養液の液面に挿入された配管３１と、当該配管３１に設けられて培養液を送液する送液ポンプ３２とから構成されている。
上記配管３１の一端は上記培養容器３における培養液の液面近傍、すなわち上記ピン１６の間に保持された細胞凝集塊２の上方に位置するようになっており、他端は上記培養容器３における上記細胞凝集塊２と上記台座１５の設置面１５ａとの間に形成された隙間ｇに位置している。
そして上記送液ポンプ３２は、配管３１の一端より培養容器３における上方側から培養液を吸引するとともに、当該培養液を他端より上記隙間ｇへと流入させ、培養容器３内において培養液を循環させるようになっている。
このような構成により、上記培養液供給手段１２が供給した培養液は、下方に上記隙間ｇが形成された癒合パッド４の下面側に供給され、癒合パッド４の下面側にも培養液が十分に行き渡り、培養を良好に行うことができる。
なお、送液ポンプ３２の送液方向を逆にして、上記隙間ｇに位置する上記配管３１の他端から培養液を吸引するようにしてもよく、その場合には癒合パッド４の周囲から下面側に培養液が流入する流れが形成されるため、上記隙間ｇに培養液の供給が行われることとなる。
また、これら培養液の供給動作の前処理として、必要に応じて培養液の栄養分の補給や、酸素や炭酸ガスの供給、およびｐＨの調整を行うようにしてもよい。 FIG. 6 shows a culture solution supply means 12 for supplying a culture solution to the fusion pad 4 in the middle of culture provided inside the incubator 6. When a plurality of culture vessels 3 are accommodated in the incubator 6, The culture solution supply means 12 can be provided for each of the culture vessels 3.
The culture medium supply means 12 includes a pipe 31 having both ends inserted into the culture liquid level from above the culture vessel 3 and a liquid feed pump 32 provided in the pipe 31 for feeding the culture liquid. Has been.
One end of the pipe 31 is positioned in the vicinity of the liquid level of the culture solution in the culture vessel 3, that is, above the cell aggregate 2 held between the pins 16, and the other end is located in the culture vessel 3. Is located in a gap g formed between the cell aggregate 2 and the installation surface 15a of the pedestal 15.
The liquid feed pump 32 sucks the culture solution from the upper side of the culture vessel 3 from one end of the pipe 31 and flows the culture solution into the gap g from the other end. It is designed to circulate.
With such a configuration, the culture solution supplied by the culture solution supply means 12 is supplied to the lower surface side of the fusion pad 4 in which the gap g is formed below, and there is sufficient culture solution on the lower surface side of the fusion pad 4. The culture can be performed well.
The liquid feeding direction of the liquid feeding pump 32 may be reversed, and the culture solution may be sucked from the other end of the pipe 31 located in the gap g. Since a flow into which the culture solution flows is formed on the side, the culture solution is supplied to the gap g.
In addition, as a pretreatment for the supply operation of these culture solutions, supplementation of nutrients of the culture solution, supply of oxygen or carbon dioxide, and pH adjustment may be performed as necessary.

以下、上記構成を有する細胞の集合構造体の作製装置１を用いた癒合パッド４の作製方法を説明する。
最初に、上記パスボックス５ａを介して上記細胞凝集塊２が収容された収容容器７や培養容器３を上記アイソレータ５内に搬入したり、培養容器３に所定量の培養液を供給する準備工程を行う。
また培養容器３には上記台座１５および複数のピン１６からなる収容手段が設置され、また上記支持プレート１７は自重により上記台座１５の設置面１５ａに接触した下降位置に位置している。
さらに準備工程において、アイソレータ５の内部に上記収容容器７や培養容器３を複数搬入すれば、複数の培養容器３を用いて複数の癒合パッド４を連続して作成することが可能となる。 Hereinafter, a method for manufacturing the fusion pad 4 using the cell assembly structure manufacturing apparatus 1 having the above-described configuration will be described.
First, a preparation step of carrying the container 7 or the culture container 3 containing the cell aggregate 2 through the pass box 5a into the isolator 5 or supplying a predetermined amount of culture solution to the culture container 3 I do.
The culture vessel 3 is provided with a receiving means including the pedestal 15 and a plurality of pins 16, and the support plate 17 is located at a lowered position in contact with the installation surface 15 a of the pedestal 15 by its own weight.
Further, in the preparation step, if a plurality of the storage containers 7 and the culture containers 3 are carried into the isolator 5, a plurality of fusion pads 4 can be continuously formed using the plurality of culture containers 3.

上記準備工程が完了したら、続いて上記吸引ノズル１０を移動させて、上記培養容器３に細胞凝集塊２を移動させて、上記ピン１６の間に設定された収容部Ｈに細胞凝集塊２を供給する供給工程を行う。
上記ノズル移動手段１１が吸引ノズル１０を移動させ、また間隔変更手段２４が吸引ノズル１０の間隔を変更して、上記収容容器支持部８において収容容器７の収容凹部７ａから細胞凝集塊２を吸着保持する。
続いて、ノズル移動手段１１が吸引ノズル１０を培養容器支持部９へと移動させ、また間隔変更手段２４が上記ピン１６とピン１６との間に形成された収容部Ｈの間隔に合わせて吸引ノズル１０の間隔を変更し、吸引ノズル１０を下降させる。
すると、吸引ノズル１０に保持された各細胞凝集塊２は４本のピン１６の間に形成された収容部Ｈに挿入され、細胞凝集塊２の下方に隙間ｇが形成されるよう、上記ピン１６の上下中間位置に細胞凝集塊２が保持される。
このとき、上記収容部Ｈに収容された細胞凝集塊２は、周囲を囲繞する４本のピン１６によって挟持されることから、図４（ａ）に示すように当該収容部Ｈから浮き上がることが無く細胞凝集塊２の配置状態を維持することができ、かつ細胞凝集塊２と台座１５の設置面１５ａとの間に上記隙間ｇが形成された状態を維持することができる。
このようにして全ての収容部Ｈに細胞凝集塊２が収容されると、その後上記カメラ２５が培養容器支持部９の上方に移動して培養容器３内の細胞凝集塊２を撮影し、細胞凝集塊２が全ての収容部Ｈに収容されているか否かを確認する。 When the preparation step is completed, the suction nozzle 10 is subsequently moved to move the cell aggregate 2 to the culture vessel 3, and the cell aggregate 2 is placed in the accommodating portion H set between the pins 16. A supply process is performed.
The nozzle moving means 11 moves the suction nozzle 10, and the interval changing means 24 changes the interval of the suction nozzle 10 to adsorb the cell aggregate 2 from the accommodation recess 7 a of the accommodation container 7 in the accommodation container support 8. Hold.
Subsequently, the nozzle moving means 11 moves the suction nozzle 10 to the culture vessel support portion 9, and the interval changing means 24 performs suction according to the interval of the accommodating portion H formed between the pins 16 and 16. The interval between the nozzles 10 is changed, and the suction nozzle 10 is lowered.
Then, each cell aggregate 2 held by the suction nozzle 10 is inserted into the accommodating portion H formed between the four pins 16 so that a gap g is formed below the cell aggregate 2. The cell aggregate 2 is held at 16 upper and lower intermediate positions.
At this time, since the cell aggregate 2 accommodated in the accommodation part H is sandwiched by the four pins 16 surrounding the periphery, the cell aggregate 2 may float from the accommodation part H as shown in FIG. The arrangement state of the cell aggregate 2 can be maintained without any change, and the state in which the gap g is formed between the cell aggregate 2 and the installation surface 15a of the base 15 can be maintained.
When the cell aggregates 2 are stored in all the storage parts H in this way, the camera 25 then moves above the culture container support part 9 to photograph the cell aggregates 2 in the culture container 3, and the cells It is confirmed whether or not the aggregate 2 is accommodated in all the accommodating portions H.

このようにして培養容器３内に細胞凝集塊２が配置されると、ロボットもしくは作業者の手作業により、上記培養容器３はインキュベータ６に移送され、当該取り培養容器３内の細胞凝集塊２を培養する培養工程が行われる。
まず上記培養容器３をインキュベータ６に移送したら、作業者は上記培養液供給手段１２の配管３１の両端をそれぞれ培養容器３の内部に設置し、具体的には一端を培養液の液面近く、他端をピン１６の間に保持された細胞凝集塊２の下方の隙間ｇに挿入する。
その後、インキュベータ６を上記アイソレータ５より分離して、アイソレータ５より離隔した位置に載置し、内部を所定の温度、湿度に維持するとともに、所定の炭酸ガスや酸素の濃度を維持する。
培養容器３内において、細胞凝集塊２が培養されると隣接する細胞凝集塊２が相互に融合し、これにより細胞凝集塊２が平面的に配置された形状を維持した細胞の集合構造体としての癒合パッド４を得ることができる。
つまり、細胞凝集塊２を配置した通りに任意の形状の癒合パッド４を作製することが可能であり、また細胞凝集塊２は上記収容部Ｈによって隙間なく配置されているため、上記細胞凝集塊２が融合して平面的に形成された癒合パッド４の厚さは略均一となる。
また各細胞凝集塊２は上記ピン１６によって移動が規制されているため、形成される癒合パッド４の寸法を、はじめに細胞凝集塊２を配置した際の大きさと略同一にすることができる。
これは、細胞凝集塊２が接触している上記ピン１６の周囲に密着するように増殖または移動し、隣接する細胞凝集塊２同士の間に形成される間隙を埋めるためであり、ピン１６を介さず細胞凝集塊２を平面的に配置して培養する場合のように、全体的な寸法はほとんど縮むことがない。 When the cell aggregate 2 is arranged in the culture container 3 in this way, the culture container 3 is transferred to the incubator 6 by a robot or an operator's manual work, and the cell aggregate 2 in the culture container 3 is collected. A culturing step for culturing is performed.
First, when the culture vessel 3 is transferred to the incubator 6, the operator installs both ends of the pipe 31 of the culture solution supply means 12 inside the culture vessel 3, specifically, one end is close to the liquid level of the culture solution, The other end is inserted into the gap g below the cell aggregate 2 held between the pins 16.
Thereafter, the incubator 6 is separated from the isolator 5 and placed at a position separated from the isolator 5 to maintain the inside at a predetermined temperature and humidity, and maintain a predetermined concentration of carbon dioxide and oxygen.
When the cell aggregate 2 is cultured in the culture vessel 3, the adjacent cell aggregates 2 fuse with each other, and as a result, the cell aggregate 2 maintains a shape in which the cell aggregate 2 is arranged in a plane. The fusion pad 4 can be obtained.
That is, the fusion pad 4 having an arbitrary shape can be produced as the cell aggregate 2 is arranged, and the cell aggregate 2 is arranged without a gap by the accommodating portion H. The thickness of the fusion pad 4 formed in a plane by the fusion of 2 becomes substantially uniform.
In addition, since the movement of each cell aggregate 2 is regulated by the pin 16, the size of the formed fusion pad 4 can be made substantially the same as the size when the cell aggregate 2 is first arranged.
This is because the cell aggregate 2 grows or moves so as to be in close contact with the periphery of the pin 16 in contact with the cell aggregate 2 and fills the gap formed between the adjacent cell aggregates 2. As in the case where the cell agglomerates 2 are arranged in a plane and cultured without intervention, the overall dimensions hardly shrink.

上記培養工程の間、インキュベータ６内では所定の間隔で、収容部Ｈに保持された細胞凝集塊２もしくは癒合パッド４に培養液を供給する培養液供給工程が行われる。
上記培養液供給工程として、培養液供給手段１２は培養容器３内で培養液を循環させるようになっており、その際上記細胞凝集塊２の下方には上記隙間ｇが形成されていることから、癒合パッド４と台座１５の設置面１５ａとの間に培養液が供給され、癒合パッド４の裏面側についても効率的に培養することができる。
つまり、細胞凝集塊２を上記設置面１５ａに載置させて癒合パッド４を作製する場合、中央に位置する細胞凝集塊２の下面側には十分に培養液が行き渡らないという問題があったが、細胞凝集塊２を下方に隙間ｇを形成した状態で保持することにより、当該部分に位置する細胞も良好に培養することが可能となった。 During the culturing step, a culture solution supplying step for supplying a culture solution to the cell aggregate 2 or the fusion pad 4 held in the accommodating portion H is performed at a predetermined interval in the incubator 6.
As the culture solution supply step, the culture solution supply means 12 circulates the culture solution in the culture vessel 3, and the gap g is formed below the cell aggregate 2 at that time. The culture solution is supplied between the fusion pad 4 and the installation surface 15a of the pedestal 15, and the back side of the fusion pad 4 can also be efficiently cultured.
That is, when the fusion pad 4 is produced by placing the cell aggregate 2 on the installation surface 15a, there is a problem that the culture solution does not sufficiently spread to the lower surface side of the cell aggregate 2 located in the center. By holding the cell aggregate 2 in a state in which the gap g is formed below, the cells located in the part can be well cultured.

上記培養工程により細胞凝集塊２が培養されて癒合パッド４が作成されると、インキュベータ６をアイソレータ５に接続して、当該癒合パッド４を培養容器３から回収する回収工程を行う。
回収工程では、上記培養容器３を培養容器支持部９に支持させ、その状態で上記培養容器３の内部で上記支持プレート１７をＺ方向に上昇させて上昇位置に位置させる。
支持プレート１７は上昇しながら癒合パッド４の下部に接触し、そのまま癒合パッド４を下方から支持して、ピン１６およびガイド部材１８に沿って上昇させることで、癒合パッド４をピン１６の間から離脱させる。
図４（ｂ）に示すように、支持プレート１７が上昇位置に位置し、癒合パッド４がピン１６の間から離脱したら、当該支持プレート１７上の癒合パッド４を所要の容器に移し替えて回収することができる。
その際、培養工程において癒合パッド４は支持プレート１７に密着していないため、癒合パッド４は支持プレート１７に張り付くことはなく、これを容易に回収することができる。
なお、上記培養工程から回収工程の間に、所定期間ごとにインキュベータ６をアイソレータ５に接続して、培養途中の癒合パッド４の培養状態を検査する検査工程を行うようにしてもよい。 When the cell agglomerate 2 is cultured and the fusion pad 4 is created by the culture step, a recovery step of connecting the incubator 6 to the isolator 5 and collecting the fusion pad 4 from the culture vessel 3 is performed.
In the recovery step, the culture vessel 3 is supported by the culture vessel support 9, and in this state, the support plate 17 is raised in the Z direction and positioned at the raised position.
The support plate 17 is brought into contact with the lower part of the fusion pad 4 while being lifted, and the fusion pad 4 is supported as it is from below, and is lifted along the pin 16 and the guide member 18. Let go.
As shown in FIG. 4B, when the support plate 17 is located at the raised position and the fusion pad 4 is detached from between the pins 16, the fusion pad 4 on the support plate 17 is transferred to a required container and collected. can do.
At that time, since the fusion pad 4 is not in close contact with the support plate 17 in the culturing step, the fusion pad 4 does not stick to the support plate 17 and can be easily recovered.
In addition, between the said culture | cultivation process and collection | recovery processes, you may make it perform the test process which connects the incubator 6 to the isolator 5 for every predetermined period, and test | inspects the culture | cultivation state of the fusion pad 4 in the middle of culture | cultivation.

図７は第２実施例としての細胞の集合構造体の作製方法を説明する図であり、詳しくは上記第１実施例における上記培養工程の途中に実施する作業であって、培養容器３等には共通のものを使用する。
本実施例にかかる作業は、インキュベータ６において上記培養工程を開始した後、細胞凝集塊２同士が融合した状態となり、培養途中の癒合パッド４が形成されてから行うものとなっている。
この培養途中の癒合パッド４は上記ピン１６が貫通した状態となっており、第１実施例のように回収工程において癒合パッド４をピン１６の間から離脱させた場合には、回収された癒合パッド４には上記ピン１６が貫通した部分に貫通孔４ａが形成されたままとなる。
そこで本実施例では、ある程度細胞凝集塊２が培養されて融合した培養途中の癒合パッド４が得られたら、インキュベータ６をアイソレータ５に接続して培養容器３をアイソレータ５内部の上記培養容器支持部９に載置する。
そして培養容器支持部９では、作業者もしくはロボット等が上記下降位置に位置した支持プレート１７を上昇位置に位置させ、培養途中の癒合パッド４をピン１６の間から離脱させる。
続いて図７（ａ）に示すように、支持プレート１７に載置された状態の癒合パッド４を移動させ、例えば癒合パッド４を構成する細胞凝集塊２の中心位置がピン１６の先端の上方に位置するようにする。
その後、図７（ｂ）のように上記支持プレート１７を再度上昇位置から下降位置に移動させると、支持プレート１７だけが上記ピン１６に沿って下降し、上記培養途中の癒合パッド４は上記ピン１６によって下方から支持されることとなる。
この状態となったら、培養容器３を再びアイソレータ５からインキュベータ６へと移載して培養工程を再開する。これにより上記貫通孔４ａが埋められることとなる。
また、癒合パッド４は上記ピン１６によって下方から支持されるため、当該癒合パッド４の下部には隙間ｇが形成されており、癒合パッド４の下部への培養液の供給が継続して行われるようになっている。 FIG. 7 is a diagram for explaining a method for producing a cell aggregate structure as a second embodiment. Specifically, the operation is performed in the middle of the culturing process in the first embodiment. Use a common one.
The work according to this example is performed after the cell culture agglomerates 2 are fused after the culture process is started in the incubator 6 and the fusion pad 4 is formed during the culture.
The fusion pad 4 in the middle of the culture is in a state where the pin 16 penetrates, and when the fusion pad 4 is separated from between the pins 16 in the collection step as in the first embodiment, the collected fusion is In the pad 4, the through hole 4 a remains formed in the portion where the pin 16 penetrates.
Therefore, in this embodiment, when the cell fusion mass 2 is cultured to some extent and the fusion pad 4 in the middle of the culture is obtained, the incubator 6 is connected to the isolator 5 to connect the culture vessel 3 to the culture vessel support part inside the isolator 5. 9 is placed.
In the culture vessel support unit 9, an operator, a robot, or the like positions the support plate 17 positioned at the lowered position at the raised position, and removes the fusion pad 4 in the middle of culture from between the pins 16.
Subsequently, as shown in FIG. 7A, the fusion pad 4 placed on the support plate 17 is moved, and for example, the center position of the cell aggregate 2 constituting the fusion pad 4 is above the tip of the pin 16. To be located.
Thereafter, when the support plate 17 is moved again from the raised position to the lowered position as shown in FIG. 7B, only the support plate 17 is lowered along the pin 16, and the fusion pad 4 in the middle of the culture is moved to the pin. 16 is supported from below.
In this state, the culture vessel 3 is transferred again from the isolator 5 to the incubator 6 and the culture process is restarted. As a result, the through-hole 4a is filled.
Further, since the fusion pad 4 is supported from below by the pin 16, a gap g is formed in the lower part of the fusion pad 4, and the supply of the culture solution to the lower part of the fusion pad 4 is continuously performed. It is like that.

図８は第３実施例としての細胞の集合構造体の作製方法を説明する図であり、詳しくは上記第２実施例と同様、上記第１実施例における上記培養工程の途中に実施する作業であって、培養容器３等は共通のものを使用する。
本実施例にかかる工程も、上記第２実施例と同様、細胞凝集塊２がある程度融合した培養途中の癒合パッド４が形成されたら行うものとなっている。
上記培養途中の癒合パッド４を収容した培養容器３をインキュベータ６からアイソレータ５へと移載するとともに、アイソレータ５では新たな培養容器３を準備する。この培養容器３は上記台座１５およびピン１６からなる収容手段を備えておらず、また上記支持プレート１７に代えてメッシュ状の支持プレート４１がガイド部材１８によって底面プレート１４に対して上方に離隔した位置に設けられている。
作業者は、インキュベータ６から移送した培養容器３の内部から、上記ピン１６の間に保持された培養途中の癒合パッド４を上記支持プレート１７を用いて取り出し、これを上記新たな培養容器３の支持プレート４１上に移載する。
その後、上記培養途中の癒合パッド４を収容した培養容器３をインキュベータ６へと移載し、培養工程を再開する。
また、図８に示す培養液供給手段１２は、上記癒合パッド４の下方の隙間ｇに位置する配管３１に、複数の噴射孔３１ａを設けたものとなっており、当該複数の噴射孔３１ａから培養液を排出するようになっている。
これにより、癒合パッド４の下面に対して広範囲に培養液の流れを生じさせることができ、癒合パッド４を構成する下面側の細胞により良く培養液を接触させることができる。
なお、本実施例における上記培養液供給手段１２の構成は、上記第１、第２実施例にも適用することが可能である。 FIG. 8 is a diagram for explaining a method for producing a cell aggregate structure as a third embodiment. Specifically, in the same manner as in the second embodiment, the operation is performed in the middle of the culturing process in the first embodiment. Therefore, the culture vessel 3 and the like are common.
The process according to this example is also performed when the fusion pad 4 in the middle of the culture in which the cell aggregates 2 are fused to some extent is formed, as in the second example.
While the culture vessel 3 containing the fusion pad 4 in the middle of the culture is transferred from the incubator 6 to the isolator 5, the isolator 5 prepares a new culture vessel 3. The culture vessel 3 does not include a receiving means including the pedestal 15 and the pins 16, and a mesh-like support plate 41 is separated upward from the bottom plate 14 by the guide member 18 instead of the support plate 17. In the position.
The operator takes out the fusion pad 4 in the middle of the culture held between the pins 16 from the inside of the culture vessel 3 transferred from the incubator 6 using the support plate 17, and removes it from the new culture vessel 3. Transfer onto the support plate 41.
Thereafter, the culture vessel 3 containing the fusion pad 4 in the middle of the culture is transferred to the incubator 6 and the culture process is resumed.
Moreover, the culture solution supply means 12 shown in FIG. 8 is provided with a plurality of injection holes 31a in the piping 31 located in the gap g below the fusion pad 4, and from the plurality of injection holes 31a. The culture solution is discharged.
Thereby, the flow of the culture solution can be generated in a wide range with respect to the lower surface of the fusion pad 4, and the culture solution can be brought into better contact with the cells on the lower surface side constituting the fusion pad 4.
The configuration of the culture solution supply means 12 in the present embodiment can also be applied to the first and second embodiments.

図９〜１２は第４実施例としての細胞の集合構造体の作製方法を説明する図であり、このうち図１０は上記第２、第３実施例と同様、上記第１実施例における上記培養工程の途中に実施する作業と、上記回収作業の際に実施する作業とを示している。
本実施例で使用する培養容器３において、上記台座１５に固定されるピン１６は、癒合パッド４の中央部を保持する第１ピン群（１６ａ）と、癒合パッド４の外周縁部を保持する黒色で示した第２ピン群（１６ｂ）とから構成されている。
具体的には、図９において、上記第２ピン群を構成するピン１６ｂは、最外周およびこれよりも一列内側に配置された額縁状に配置されている。このため、供給工程において培養容器３に細胞凝集塊２を収容すると、その最外周に配置された細胞凝集塊２は上記第２ピン群のピン１６ｂによって囲繞されて、保持されるようになっている。
また図１０に示すように、上記第１ピン群を構成するピン１６ａは上記第２ピン群を構成するピン１６ｂよりも短くなっており、上記細胞凝集塊２を保持する収容部Ｈの高さは上記第１ピン群のピン１６ａの先端部近傍の高さに設定されている。
このような構成により、上記各実施例と同様、上記収容部Ｈに保持された細胞凝集塊２の下方には台座１５との間に隙間ｇを形成することが可能となっている。 9 to 12 are diagrams for explaining a method for producing a cell aggregate structure as a fourth embodiment. Of these, FIG. 10 is similar to the second and third embodiments, and the culture in the first embodiment is described above. The work to be performed in the middle of the process and the work to be performed at the time of the collection work are shown.
In the culture vessel 3 used in the present embodiment, the pin 16 fixed to the pedestal 15 holds the first pin group (16a) that holds the center portion of the fusion pad 4 and the outer peripheral edge portion of the fusion pad 4. The second pin group (16b) shown in black is used.
Specifically, in FIG. 9, the pins 16b constituting the second pin group are arranged in a frame shape arranged on the outermost periphery and on the inner side in one row. For this reason, when the cell aggregate 2 is accommodated in the culture vessel 3 in the supplying step, the cell aggregate 2 arranged on the outermost periphery thereof is surrounded and held by the pin 16b of the second pin group. Yes.
As shown in FIG. 10, the pin 16 a constituting the first pin group is shorter than the pin 16 b constituting the second pin group, and the height of the accommodating portion H that holds the cell aggregate 2. Is set to a height near the tip of the pin 16a of the first pin group.
With such a configuration, a gap g can be formed between the cell aggregate 2 and the pedestal 15 below the cell aggregate 2 held in the housing portion H, as in the above embodiments.

上記培養容器３を用いた細胞の集合構造体の作製方法を説明すると、図１０（ａ）に示すように、供給工程では上記第１実施例と同様、上記第１、第２ピン群のピン１６ａ、１６ｂの収容部Ｈに細胞凝集塊２を保持させる。
その後、上記第２、第３実施例と同様培養工程を行い、その途中で細胞凝集塊２がある程度融合した培養途中の癒合パッド４が形成されると、当該培養途中の癒合パッド４を収容した培養容器３をインキュベータ６からアイソレータ５へと移載する。
そして図１０（ｂ）に示すように、下降位置に位置した支持プレート１７を上昇させて、上記癒合パッド４を第２ピン群のピン１６ｂの先端部近傍の高さまで移動させる。
これにより、上記培養途中の癒合パッド４から上記第１ピン群のピン１６ａが離脱し、当該癒合パッド４は上記第２ピン群のピン１６ｂによって保持されることとなる。 The method for producing a cell aggregate structure using the culture vessel 3 will be described. As shown in FIG. 10A, in the supplying step, the pins of the first and second pin groups are the same as in the first embodiment. The cell aggregate 2 is held in the accommodating portions H of 16a and 16b.
Thereafter, the culture process was performed in the same manner as in the second and third examples. When the fusion pad 4 in the middle of the culture in which the cell aggregate 2 was fused to some extent was formed, the fusion pad 4 in the middle of the culture was accommodated. The culture vessel 3 is transferred from the incubator 6 to the isolator 5.
Then, as shown in FIG. 10B, the support plate 17 located at the lowered position is raised, and the fusion pad 4 is moved to a height near the tip of the pin 16b of the second pin group.
Thereby, the pin 16a of the first pin group is detached from the fusion pad 4 in the middle of the culture, and the fusion pad 4 is held by the pin 16b of the second pin group.

その後、上記第２、第３実施例と同様、培養途中の癒合パッド４は再びアイソレータ５からインキュベータ６へと移載されて培養工程が再開される。
このとき、癒合パッド４の中央部にはそれまで貫通していた第１ピン群のピン１６ａによる貫通孔４ａが形成されていることから、培養工程を再開することにより、上記貫通孔４ａが細胞によって埋められることとなる。
ここで、上記貫通孔４ａが細胞によって埋められる際、細胞同士が相互にひきつけ合って癒合パッド４が中央部に向けて収縮し、湾曲するおそれがある。
しかしながら、本実施例では、癒合パッド４の外周縁部を上記第２ピン群のピン１６ｂによって保持しており、癒合パッド４の中央部の収縮が防止され、湾曲のない厚さが均一な癒合パッド４を得ることができる。 Thereafter, as in the second and third embodiments, the fusion pad 4 in the middle of culture is transferred again from the isolator 5 to the incubator 6 and the culture process is restarted.
At this time, since the through hole 4a is formed by the pin 16a of the first pin group that has penetrated until now in the central portion of the fusion pad 4, the above-mentioned through hole 4a becomes a cell by resuming the culture process. Will be filled.
Here, when the through-hole 4a is filled with cells, the cells are attracted to each other, and the fusion pad 4 may shrink toward the center and bend.
However, in this embodiment, the outer peripheral edge portion of the fusion pad 4 is held by the pin 16b of the second pin group, so that the central portion of the fusion pad 4 is prevented from contracting and the thickness without bending is uniform. The pad 4 can be obtained.

上記培養工程が終了し、上記癒合パッド４の中央部に形成された貫通孔４ａが細胞によって埋められると、上記培養容器３をインキュベータ６からアイソレータ５へと移載し、その後上記回収工程を行う。
この回収工程では、上記支持プレート１７を再び下降位置から上昇位置まで上昇させ、癒合パッド４を上記第２ピン群のピン１６ｂより離脱させる。
このようにして回収された癒合パッド４の外周縁部には、上記第２ピン群のピン１６ｂによる貫通孔４ａが形成されているため、本実施例の回収工程では、図１０（ｃ）に示すように癒合パッド４の外周縁部Ｌを切断して除去し、中央部のみを回収するようになっている。
具体的に癒合パッド４の外周縁部を切断する切断手段としては、例えばアイソレータの内部においてグローブを装着した作業者が用いるメスや、アイソレータの外部に設けたレーザ切断装置を用いることができる。 When the culturing process is completed and the through-hole 4a formed in the central portion of the fusion pad 4 is filled with cells, the culturing vessel 3 is transferred from the incubator 6 to the isolator 5, and then the collecting process is performed. .
In this recovery step, the support plate 17 is raised again from the lowered position to the raised position, and the fusion pad 4 is detached from the pin 16b of the second pin group.
Since the through-hole 4a by the pin 16b of the second pin group is formed in the outer peripheral edge of the fusion pad 4 collected in this way, in the collection process of this embodiment, FIG. As shown, the outer peripheral edge L of the fusion pad 4 is cut and removed, and only the central portion is recovered.
Specifically, as a cutting means for cutting the outer peripheral edge of the fusion pad 4, for example, a knife used by an operator wearing a glove inside the isolator or a laser cutting device provided outside the isolator can be used.

なお上記図９を用いて説明したピン１６のうち、上記第２ピン群を構成するピン１６ｂについては図１１に示す構成とすることもできる。
図９において、第２ピン群のピン１６ｂはすべて同じ長さであるが、図１１においては、第２ピン群のピン１６ｂのうち図示黒色で示したピン１６ｂａだけを長くし、それ以外のピン１６ｂｂを上記第１ピン群のピン１６ａと同じ長さとしている。
具体的に説明すると、上記長いピン１６ｂａは最外周に設けられたピン１６ｂの一列内側で略正方形に整列したピン１６ｂのうち、４つの頂点部分と各辺の中央部分とにそれぞれ設けられている。
このように第２ピン群を構成した場合、上記培養工程の途中で第１ピン群のピン１６ａを癒合パッド４から離脱させると、上記第２ピン群のうち短いピン１６ｂｂも癒合パッド４から離脱することとなる。
その場合であっても、上記長いピン１６ｂａが癒合パッド４の外周縁部を保持するため、上記癒合パッド４の中央部で貫通孔４ａが細胞で埋められる際の収縮を防止することができる。なお、上記第２ピン群における長いピン１６ｂａの配置については、癒合パッド４の形状に応じて適宜設定することができる。 Of the pins 16 described with reference to FIG. 9, the pins 16b constituting the second pin group can be configured as shown in FIG.
In FIG. 9, all the pins 16b of the second pin group have the same length, but in FIG. 11, only the pin 16ba shown in black in the drawing among the pins 16b of the second pin group is lengthened, and the other pins 16bb is the same length as the pin 16a of the first pin group.
More specifically, the long pins 16ba are provided at the four apex portions and the central portions of the respective sides of the pins 16b arranged in a substantially square inside one row of the pins 16b provided on the outermost periphery. .
When the second pin group is configured in this manner, when the pin 16a of the first pin group is detached from the fusion pad 4 during the culture process, the short pin 16bb of the second pin group is also detached from the fusion pad 4. Will be.
Even in that case, since the long pin 16ba holds the outer peripheral edge of the fusion pad 4, it is possible to prevent contraction when the through hole 4a is filled with cells at the center of the fusion pad 4. In addition, about arrangement | positioning of the long pin 16ba in the said 2nd pin group, it can set suitably according to the shape of the fusion pad 4. FIG.

さらに、上記第４実施例では図１２に示す構成を有した培養容器３を使用することができる。この構成では、上記第１ピン群を構成するピン１６ａと、第２ピン群を構成するピン１６ｂとは同じ長さに形成されている。
そして上記第１ピン群のピン１６ａと、第２ピン群のピン１６ｂとはそれぞれ第１台座１５ａおよび第２台座１５ｂに設けられており、第２台座１５ｂは第１台座１５ａを囲繞するように設けられている。
そして上記第１ピン群のピン１６ａが設けられた第１台座１５ａは上下に昇降可能に設けられ、当該第１台座１５ａには図示しないが作業者やロボットによって操作可能な把持用の部材が固定されている。
図１２（ａ）に示すように、上記供給工程において上記第１台座１５ａは上昇位置に位置しており、第１ピン群を構成するピン１６ａは第２ピン群を構成するピン１６ｂと同じ高さに保持されている。
このため、各ピン１６の先端部近傍に収容部Ｈを設定することで、保持された細胞凝集塊２と第１、第２台座１５ａ、１５ｂとの間には隙間ｇが形成されるようになっている。
そして培養工程の途中で培養途中の癒合パッド４が得られると、図１２（ｂ）に示すように上記第１台座１５ａを下降させ、これにより第１ピン群のピン１６ａを癒合パッド４から離脱し、培養途中の癒合パッド４は第２ピン群のピン１６ｂによって保持されることとなる。
その後、回収工程において癒合パッド４を回収する際には、上記支持プレート１７を上昇させ、これにより癒合パッド４を第２ピン群のピン１６ｂから離脱させることができる。 Furthermore, in the fourth embodiment, the culture vessel 3 having the configuration shown in FIG. 12 can be used. In this configuration, the pin 16a constituting the first pin group and the pin 16b constituting the second pin group are formed to have the same length.
The pin 16a of the first pin group and the pin 16b of the second pin group are respectively provided on the first base 15a and the second base 15b, and the second base 15b surrounds the first base 15a. Is provided.
The first pedestal 15a provided with the pins 16a of the first pin group is provided so as to be movable up and down, and a gripping member (not shown) operable by an operator or a robot is fixed to the first pedestal 15a. Has been.
As shown in FIG. 12A, in the supplying step, the first pedestal 15a is located at the raised position, and the pins 16a constituting the first pin group are the same height as the pins 16b constituting the second pin group. Is held in.
For this reason, by setting the accommodating portion H in the vicinity of the tip portion of each pin 16, a gap g is formed between the held cell aggregate 2 and the first and second pedestals 15a and 15b. It has become.
When the fusion pad 4 in the middle of the culturing process is obtained, the first pedestal 15a is lowered as shown in FIG. 12 (b), whereby the pins 16a of the first pin group are detached from the fusion pad 4. Then, the fusion pad 4 in the middle of the culture is held by the pin 16b of the second pin group.
Thereafter, when the fusion pad 4 is collected in the collection step, the support plate 17 is raised, whereby the fusion pad 4 can be detached from the pin 16b of the second pin group.

図１３は第５実施例としての細胞の集合構造体の作製方法を説明する図であり、上記第１実施例における上記供給工程に代えて実施し、さらに培養工程に追加して実施するものとなっている。
本実施例は、細胞凝集塊２の直径が収容部Ｈの各対角位置のピン１６の間隔よりも小径であり、当該細胞凝集塊２をピン１６とピン１６との間で保持できない場合に対応するものとなっている。
具体的には、作製される癒合パッド４を薄くするために、極力小さな細胞凝集塊２を用いる場合や、作製された細胞凝集塊２の大きさにばらつきがあり、収容部Ｈから落下する細胞凝集塊２を含んでいる場合が想定される。
そこで本実施例の供給工程では、図１３（ａ）に示すように、上記吸引ノズル１０は細胞凝集塊２を、上記台座１５の設置面１５ａ上に位置させた支持プレート１７の上面に載置するようになっている。
そして、上記細胞凝集塊２が支持プレート１７に載置された状態のままで、当該培養容器３をインキュベータ６に移送して上記培養工程を開始し、図１３（ｂ）に示すように細胞凝集塊２がピン１６間の収容部Ｈで保持可能な大きさとなるまで培養を行う。
このようにして、収容部Ｈで保持可能な十分な大きさの細胞凝集塊２が得られたら、培養容器３をアイソレータ５へと移送し、図１３（ｃ）に示すように培養容器３内の支持プレート１７を上昇させる。
すると、上記培養途中の細胞凝集塊２が支持プレート１７と共にピン１６に沿って上昇され、当該培養途中の細胞凝集塊２が上記ピン１６の上下中間位置に設定した収容部Ｈに保持される。その後上記支持プレート１７を下降させ、下方に退避させる。
これにより、上記第１実施例と同様に、上記複数のピン１６を立設した設置面１５ａから離隔して設定された収容部Ｈに、細胞凝集塊２を保持させることができるため、その後培養工程を再開した場合には、設置面１５ａとの間に形成された隙間ｇに培養液を流通させることによって、培養途中の癒合パッド４の下部に培養液を十分に接触させることが可能となっている。
ここで、上記支持プレート１７の表面を細胞非接着性とすることで、培養途中の癒合パッド４を容易に支持プレート１７から離脱させることができる。ここで、細胞非接着性は、支持プレート１７の表面の性質を撥水性や超親水性とすることで得られ、これら性質を有する公知の材料を採用したり、表面処理やコーティング処理を施すことにより実現できる。また、その他にもＤＬＣ（ダイアモンド ライク カーボン）膜を形成することも可能である。 FIG. 13 is a diagram for explaining a method for producing a cell aggregate structure as a fifth embodiment, which is carried out in place of the supplying step in the first embodiment and further added to the culturing step. It has become.
In the present embodiment, when the diameter of the cell aggregate 2 is smaller than the interval between the pins 16 at the diagonal positions of the accommodating portion H and the cell aggregate 2 cannot be held between the pin 16 and the pin 16. It has become a corresponding one.
Specifically, in order to make the produced fusion pad 4 thin, when the cell aggregate 2 is made as small as possible, the size of the produced cell aggregate 2 varies, and the cells that fall from the storage portion H The case where the aggregate 2 is included is assumed.
Therefore, in the supply process of the present embodiment, as shown in FIG. 13A, the suction nozzle 10 places the cell aggregate 2 on the upper surface of the support plate 17 positioned on the installation surface 15a of the pedestal 15. It is supposed to be.
Then, while the cell aggregate 2 is placed on the support plate 17, the culture vessel 3 is transferred to the incubator 6 to start the culture process, and as shown in FIG. Incubation is performed until the mass 2 has a size that can be held in the accommodating portion H between the pins 16.
In this way, when a sufficiently large cell aggregate 2 that can be held in the accommodating portion H is obtained, the culture vessel 3 is transferred to the isolator 5, and the culture vessel 3 is moved into the culture vessel 3 as shown in FIG. The support plate 17 is raised.
Then, the cell aggregate 2 in the middle of the culture is lifted along the pin 16 together with the support plate 17, and the cell aggregate 2 in the middle of the culture is held in the accommodating portion H set at the upper and lower intermediate position of the pin 16. Thereafter, the support plate 17 is lowered and retracted downward.
Thus, as in the first embodiment, the cell aggregate 2 can be held in the accommodating portion H set apart from the installation surface 15a where the plurality of pins 16 are erected. When the process is resumed, the culture solution can be sufficiently brought into contact with the lower part of the fusion pad 4 during the culture by circulating the culture solution through the gap g formed between the installation surface 15a. ing.
Here, by making the surface of the support plate 17 non-cell-adhesive, the fusion pad 4 in the middle of the culture can be easily detached from the support plate 17. Here, the cell non-adhesiveness is obtained by making the surface properties of the support plate 17 water-repellent or super-hydrophilic, and adopts a known material having these properties, or performs surface treatment or coating treatment. Can be realized. In addition, a DLC (diamond-like carbon) film can be formed.

上記第５実施例にかかる細胞の集合構造体の作製方法については、図１３（ａ）の供給工程と図１３（ｂ）の培養工程との間に、図１４に示すように上記下方支持部材としての支持プレート１７に支持される細胞凝集塊２の上部に、上部当接部材としての当接プレート５１を配置する工程を加えてもよい。
上記当接プレート５１は支持プレート１７と同様の構成を有しており、上記ピン１６およびガイド部材１８に沿ってＺ方向に昇降可能に設けられており、また細胞凝集塊２と接触する裏面側は細胞非接着性となっている。
使用方法を説明すると、図１３（ａ）の供給工程において上記吸引ノズル１０が細胞凝集塊２を支持プレート１７の上面に載置したら、作業者もしくはロボットにより載置された細胞凝集塊２の上部に上記当接プレート５１を載置して、支持プレート１７と当接プレート５１とで挟んだ状態で細胞凝集塊２を支持する。
このように、当接プレート５１を載置することにより、４本のピン１６によって移動しないように保持されていない細胞凝集塊２の浮き上がりを防止することができ、細胞凝集塊２が融合した癒合パッド４の形を整えることができる。
この状態で、培養容器３をインキュベータ６に移送して上記培養工程を開始し、図１３（ｂ）に示すような、細胞凝集塊２がピン１６の間で支持される大きさとなり、かつ隣接する細胞凝集塊２が融合した培養途中の癒合パッド４が得られるまで培養を行う。
このようにして十分な大きさの細胞凝集塊２が得られたら、培養容器３をアイソレータ５へと移送し、図１３（ｃ）に示すように培養容器３内の支持プレート１７を上昇させる。その際、上記当接プレート５１については取り除いてもよいし、そのまま載置しておいてもよい。 As for the method for producing a cell aggregate structure according to the fifth embodiment, the lower support member as shown in FIG. 14 is provided between the supplying step of FIG. 13 (a) and the culturing step of FIG. 13 (b). A step of placing the contact plate 51 as the upper contact member on the upper part of the cell aggregate 2 supported by the support plate 17 may be added.
The contact plate 51 has the same configuration as that of the support plate 17, is provided so as to be movable up and down in the Z direction along the pin 16 and the guide member 18, and is in contact with the cell aggregate 2. Is non-cell-adhesive.
Explaining how to use, when the suction nozzle 10 places the cell aggregate 2 on the upper surface of the support plate 17 in the supply step of FIG. 13A, the upper part of the cell aggregate 2 placed by an operator or a robot. The contact plate 51 is placed on the support plate 17 to support the cell aggregate 2 in a state of being sandwiched between the support plate 17 and the contact plate 51.
As described above, by placing the contact plate 51, the cell aggregate 2 that is not held by the four pins 16 can be prevented from being lifted, and the cell aggregate 2 is fused. The shape of the pad 4 can be adjusted.
In this state, the culture vessel 3 is transferred to the incubator 6 to start the culture process, and the cell aggregate 2 is sized to be supported between the pins 16 as shown in FIG. The culture is continued until the fusion pad 4 in the middle of the culture in which the cell aggregates 2 to be fused are obtained.
When a sufficiently large cell aggregate 2 is obtained in this way, the culture vessel 3 is transferred to the isolator 5, and the support plate 17 in the culture vessel 3 is raised as shown in FIG. 13 (c). At that time, the contact plate 51 may be removed or placed as it is.

さらに上記第５実施例のように、細胞凝集塊２の直径が収容部Ｈの各対角位置のピン１６の間隔よりも小径で、当該細胞凝集塊２をピン１６の上下中間位置で保持することができない場合には、上記第４実施例において、予め所要の高さに設定した収容部Ｈの高さに対応させて、支持プレート１７を位置させるようにしてもよい。
つまり、収容部Ｈの高さに合わせて位置させた支持プレート１７の上面に細胞凝集塊２を載置させ、その状態で各細胞凝集塊２をそれぞれ収容部Ｈで保持可能な大きさまで培養する。これにより各細胞凝集塊２が収容部Ｈに保持された状態となったら、支持プレート１７を下方に退避させて、培養途中の癒合パッド４の下方に上記隙間ｇが形成されるようにする。
その場合も、上記支持プレート１７に載置した細胞凝集塊２の上部に上記当接プレート５１を載置して、支持プレート１７と当接プレート５１とで細胞凝集塊２を挟んで支持することで、細胞凝集塊２の浮き上がりを防止するとともに癒合パッド４の形を整えるようにして培養することができる。 Further, as in the fifth embodiment, the diameter of the cell aggregate 2 is smaller than the interval between the pins 16 at the diagonal positions of the accommodating portion H, and the cell aggregate 2 is held at the upper and lower intermediate positions of the pins 16. If this is not possible, in the fourth embodiment, the support plate 17 may be positioned corresponding to the height of the accommodating portion H set in advance to a required height.
That is, the cell aggregate 2 is placed on the upper surface of the support plate 17 positioned in accordance with the height of the accommodating part H, and each cell aggregate 2 is cultured to a size that can be held in the accommodating part H in that state. . Thus, when each cell aggregate 2 is in a state of being held in the accommodating portion H, the support plate 17 is retracted downward so that the gap g is formed below the fusion pad 4 during the culture.
Also in this case, the contact plate 51 is placed on the cell aggregate 2 placed on the support plate 17, and the cell aggregate 2 is supported by the support plate 17 and the contact plate 51. Thus, the cell aggregate 2 can be cultured while preventing the cell agglomerate 2 from being lifted and adjusting the shape of the fusion pad 4.

図１５、１６は第６実施例にかかる細胞の集合構造体の作製方法を説明する図となっており、上記第１〜第５実施例において作製した細胞の集合構造体としての平面的な癒合パッド４に対し、本実施例ではＺ方向に細胞凝集塊２を整列させた立体的な細胞の集合構造体を作製する方法を説明するものである。
ただし、当該立体的な細胞の集合構造体を作製する場合であっても、上記第１実施例で使用した細胞の集合構造体の作製装置１と同様の構成を有した装置を使用することが可能であり、また略同様の工程を用いて作製することができるため、詳細な説明については省略する。
図１５に示す本実施例で使用する培養容器３において、上記ピン１６の長さは所望される立体的な細胞の集合構造体の高さに応じて設定され、４本のピン１６によって形成された収容部Ｈには細胞凝集塊２をＺ方向に複数保持することが可能となっている。
そして上記供給工程では、上記吸引ノズル１０は予め設定された細胞凝集塊２の立体的な配置に基づいて、上記細胞凝集塊２を上記ピン１６によって形成された収容部Ｈに供給する。
具体的には、最初に培養容器支持部９が培養容器３をＹ方向に順次移動させて、最下段に配置すべき細胞凝集塊２を供給し、その後収容部Ｈに保持させた細胞凝集塊２の上部に順次細胞凝集塊２を供給するようにすればよい。
この時も、上記各実施例と同様、最下段に位置する細胞凝集塊２の下方に隙間ｇを形成するようになっており、これにより立体的な細胞の集合構造体の下面への培養液の供給が行われるようにする。
本実施例では、上記培養容器３の略中央に上記ピン１６を備えた収容手段が位置していることから、上記ピン１６に支持された立体的な細胞の集合構造体の側面部分と培養容器３の側面部分との間にも隙間ｇが形成されるようになっており、細胞の集合構造体の側面部分にも培養液の供給が行われるようになっている。 FIGS. 15 and 16 are diagrams for explaining a method for producing a cell aggregate structure according to the sixth embodiment. Planar union as a cell aggregate structure produced in the first to fifth embodiments is shown in FIGS. In this embodiment, a method for producing a three-dimensional aggregate structure of cells in which cell aggregates 2 are aligned in the Z direction will be described.
However, even in the case of producing the three-dimensional cell assembly structure, it is possible to use an apparatus having the same configuration as the cell assembly structure preparation apparatus 1 used in the first embodiment. The detailed description is omitted because it is possible and can be manufactured using substantially the same process.
In the culture vessel 3 used in the present embodiment shown in FIG. 15, the length of the pin 16 is set according to the desired height of the three-dimensional cell assembly, and is formed by four pins 16. A plurality of cell aggregates 2 can be held in the Z direction in the accommodating portion H.
In the supplying step, the suction nozzle 10 supplies the cell aggregate 2 to the accommodating portion H formed by the pins 16 based on a preset three-dimensional arrangement of the cell aggregate 2.
Specifically, first, the culture vessel support unit 9 sequentially moves the culture vessel 3 in the Y direction to supply the cell aggregate 2 to be arranged at the bottom, and then the cell aggregate held in the storage unit H What is necessary is just to supply the cell aggregate 2 to the upper part of 2 sequentially.
At this time, as in each of the above embodiments, a gap g is formed below the cell aggregate 2 located at the lowermost stage, whereby the culture solution on the lower surface of the three-dimensional cell assembly structure is formed. To be supplied.
In the present embodiment, since the accommodating means having the pin 16 is located at the approximate center of the culture vessel 3, the side surface portion of the three-dimensional cell assembly structure supported by the pin 16 and the culture vessel A gap g is also formed between the three side portions, and the culture solution is also supplied to the side portions of the cell aggregate structure.

また、上記立体的な細胞の集合構造体を作製する場合には、図１６に示すように隣接する収容部Ｈに保持された細胞凝集塊２の高さを、例えば細胞凝集塊２半個分だけずらした高さにすることが考えられる。
既に説明したように、上記ピン１６に支持された細胞凝集塊２を構成する細胞は上記ピン１６の周囲に沿って増殖することから、図１６のように隣接する収容部Ｈの細胞凝集塊２の高さを異ならせることで、効率的に細胞凝集塊２を融合させることが可能となる。
なお、このような立体的な細胞の集合構造体を作製する場合であっても、第２〜第５実施例で行った作業を用いることが可能である。 In the case of producing the above-described three-dimensional aggregate structure of cells, as shown in FIG. 16, the height of the cell aggregate 2 held in the adjacent accommodating portion H is set to, for example, two half of the cell aggregate. It is conceivable that the height is shifted by a small amount.
As already explained, since the cells constituting the cell aggregate 2 supported by the pin 16 grow along the periphery of the pin 16, the cell aggregate 2 in the adjacent accommodating portion H as shown in FIG. It is possible to efficiently fuse the cell aggregate 2 by making the heights of the two different.
Even when such a three-dimensional aggregate structure of cells is produced, the work performed in the second to fifth embodiments can be used.

なお、上記各実施例において、上記細胞凝集塊２を支持するピン１６の配置としては、複数のピン１６によって細胞凝集塊２を支持することが可能であれば、例えば６本のピン１６で各細胞凝集塊２を囲繞するように配置してもよい。
その場合、上記収容部Ｈは千鳥状に配置されることとなり、またこの配置を用いて第６実施例のように立体的な細胞の集合構造体を作製することも可能である。 In each of the above-described embodiments, the pin 16 that supports the cell aggregate 2 may be arranged with, for example, six pins 16 as long as the cell aggregate 2 can be supported by a plurality of pins 16. You may arrange | position so that the cell aggregate 2 may be surrounded.
In this case, the accommodating portions H are arranged in a staggered manner, and a three-dimensional cell assembly structure can be produced using this arrangement as in the sixth embodiment.

さらに上記各実施例において、培養容器３に設けられるピン１６の太さや、ピン１６によって形成される収容部Ｈの大きさ、もしくは使用する細胞凝集塊２の直径に応じて、図１７に示すようにさまざまな態様が考えられる。
図１７（ａ）は、対角位置の２本のピン１６の間隔よりも細胞凝集塊２の直径が小さく、４本のピン１６によって細胞凝集塊２を保持できない場合を示している。
この場合であっても、上記供給工程では上記支持プレート上に細胞凝集塊を載置すればよく、このとき隣接する収容部Ｈの細胞凝集塊２は相互に接触しないが、上記第５実施例に示したように、培養工程において細胞凝集塊２が培養されることで隣接する細胞凝集塊２が融合するため、細胞の集合構造体を得ることができる。
また図１７（ｂ）は、上記ピン１６の直径が上記各実施例で示したピン１６の直径よりも大径であり、対角位置の２本のピン１６の間隔よりも細胞凝集塊２の直径が大きい場合であっても、上記収容部Ｈに保持された隣接する細胞凝集塊２同士が接触しない場合を示している。
このような場合であっても、上記培養工程において細胞凝集塊２が培養されて隣接する細胞凝集塊２が融合するため、細胞の集合構造体を得ることができる。 Further, in each of the above embodiments, as shown in FIG. 17, depending on the thickness of the pin 16 provided in the culture vessel 3, the size of the accommodating portion H formed by the pin 16, or the diameter of the cell aggregate 2 to be used. Various aspects are conceivable.
FIG. 17A shows a case where the diameter of the cell aggregate 2 is smaller than the interval between the two pins 16 at the diagonal positions and the cell aggregate 2 cannot be held by the four pins 16.
Even in this case, in the supplying step, the cell aggregates may be placed on the support plate, and the cell aggregates 2 of the adjacent accommodating portions H are not in contact with each other at this time. As shown in FIG. 2, since the cell aggregate 2 is cultured in the culturing step and the adjacent cell aggregate 2 is fused, a cell aggregate structure can be obtained.
FIG. 17B shows that the diameter of the pin 16 is larger than the diameter of the pin 16 shown in each of the above embodiments, and the cell aggregate 2 is larger than the interval between the two pins 16 at the diagonal positions. Even when the diameter is large, the case where the adjacent cell agglomerates 2 held in the accommodating portion H do not come into contact with each other is shown.
Even in such a case, since the cell aggregate 2 is cultured and the adjacent cell aggregate 2 is fused in the culturing step, an aggregate structure of cells can be obtained.

１ 細胞の集合構造体の作製装置 ２ 細胞凝集塊
３ 培養容器 ４ 癒合パッド（細胞の集合構造体）
１０ 吸引ノズル １２ 培養液供給手段
１６ ピン １７ 支持プレート（下方支持部材）
Ｈ 収容部 ｇ 隙間 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Production apparatus of cell aggregate structure 2 Cell aggregate 3 Culture container 4 Healing pad (cell aggregate structure)
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Suction nozzle 12 Culture solution supply means 16 Pin 17 Support plate (lower support member)
H receiving part g gap

Claims (12)

培養液を収容した培養容器の内部に複数の細胞凝集塊を配置し、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製方法において、
上記培養容器の内部に複数のピンを立設し、当該複数のピンとピンとにより上記細胞凝集塊を収容する収容部を構成し、
複数の隣接する収容部に細胞凝集塊を収容した状態で培養することを特徴とする細胞の集合構造体の作製方法。 In a method for producing a cell aggregate structure, a plurality of cell aggregates are arranged inside a culture vessel containing a culture solution, and a plurality of cell aggregates are cultured to produce a cell aggregate structure fused together ,
A plurality of pins are erected inside the culture container, and the plurality of pins and pins constitute an accommodating portion that accommodates the cell aggregate,
A method for producing a cell aggregate structure, comprising culturing a cell aggregate in a plurality of adjacent storage portions. 対角位置の２本のピンの間隔が細胞凝集塊の直径よりも短くなるように配置することにより、上記収容部で細胞凝集塊を保持可能とするとともに、上記収容部を上記複数のピンを立設した設置面から離隔した位置に設定し、
これにより、上記収容部に保持された細胞凝集塊と上記設置面との間に、培養液が流通可能な隙間が形成されることを特徴とする請求項１に記載の細胞の集合構造体の作製方法。 By arranging so that the interval between the two pins at the diagonal position is shorter than the diameter of the cell aggregate, it is possible to hold the cell aggregate in the storage part, and to attach the plurality of pins to the storage part. Set it away from the standing installation surface,
Thus, a gap through which the culture medium can flow is formed between the cell aggregate held in the housing portion and the installation surface. The cell aggregate structure according to claim 1, Manufacturing method. 上記複数のピンとピンとの間で細胞凝集塊を下方から支持する下方支持部材を備え、
当該下方支持部材で支持した状態で細胞凝集塊を培養し、当該細胞凝集塊が上記収容部で保持可能となったら、当該細胞凝集塊を上記収容部に保持させて上記下方支持部材を退避させることを特徴とする請求項１に記載の細胞の集合構造体の作製方法。 A lower support member for supporting a cell aggregate from below between the plurality of pins;
The cell aggregate is cultured in a state of being supported by the lower support member, and when the cell aggregate can be held in the storage unit, the cell support is held in the storage unit and the lower support member is retracted. The method for producing a cell aggregate structure according to claim 1. 上記ピンを、細胞の集合構造体の中央部を保持する第１ピン群と、上記細胞の集合構造体の外周縁部を保持する第２ピン群とによって構成し、
細胞凝集塊を培養して培養途中の細胞の集合構造体が形成されたら、上記第１ピン群に属するピンを当該細胞の集合構造体より離脱させ、上記第２ピン群に属するピンにより細胞の集合構造体の外周縁部を保持することを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の細胞凝集塊の作製方法。 The pin is constituted by a first pin group that holds the central part of the cell assembly structure and a second pin group that holds the outer peripheral edge part of the cell assembly structure,
When the aggregate structure of cells in the middle of culture is formed by culturing the cell aggregate, the pins belonging to the first pin group are detached from the aggregate structure of the cells, and the cells belonging to the second pin group are separated by the pins belonging to the second pin group. The method for producing a cell aggregate according to any one of claims 1 to 3, wherein an outer peripheral edge of the aggregate structure is held. 上記細胞の集合構造体が得られたら、当該細胞の集合構造体における上記第２ピン群で保持した細胞の集合構造体の外周縁部を切断手段により除去することを特徴とする請求項４に記載の細胞の集合構造体の作製方法。   5. When the cell aggregate structure is obtained, the outer peripheral edge of the cell aggregate structure held by the second pin group in the cell aggregate structure is removed by a cutting means. A method for producing the cell aggregate structure described. 上記細胞凝集塊を上記培養容器の内部に平面的に配置して、複数の細胞凝集塊が融合した癒合パッドを作製することを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の細胞の集合構造体の作製方法。   The cell according to any one of claims 1 to 5, wherein the cell aggregate is planarly arranged inside the culture container to produce a fusion pad in which a plurality of cell aggregates are fused. A method for manufacturing the aggregate structure. 培養液を収容した培養容器の内部に複数の細胞凝集塊を配置し、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製装置において、
上記培養容器の内部に、複数のピンを立設した収容手段を設け、
さらに上記収容手段における複数のピンとピンとの間に上記細胞凝集塊を供給する供給手段を備え、
上記複数のピンとピンとの間を細胞凝集塊の収容部として、上記供給手段は複数の隣接する収容部に細胞凝集塊を収容することを特徴とする細胞の集合構造体の作製装置。 In a cell assembly structure manufacturing apparatus, a plurality of cell aggregates are arranged inside a culture vessel containing a culture solution, and the plurality of cell aggregates are cultured to produce a cell aggregate structure fused together ,
Inside the culture vessel, provided with a storage means standing a plurality of pins,
Furthermore, comprising a supply means for supplying the cell aggregate between a plurality of pins in the housing means,
An apparatus for producing an aggregate structure of cells, characterized in that a cell aggregate lump accommodating portion is provided between the plurality of pins, and the supply means accommodates the cell aggregate lump in a plurality of adjacent accommodating portions. 対角位置の２本のピンの間隔が細胞凝集塊の直径よりも短くなるように配置することにより、上記収容部で細胞凝集塊を保持可能とするとともに、上記収容部を上記収容手段における上記複数のピンを立設した設置面から離隔して設定し、
上記供給手段により当該収容部に細胞凝集塊を保持させることを特徴とする請求項７に記載の細胞の集合構造体の作製装置。 By arranging so that the interval between the two pins in the diagonal position is shorter than the diameter of the cell aggregate, the storage unit can hold the cell aggregate and the storage unit is configured to store the storage unit in the storage unit. Set the pins apart from the standing installation surface,
The apparatus for producing a cell aggregate structure according to claim 7, wherein a cell aggregate is held in the container by the supply unit. 上記複数のピンとピンとの間で細胞凝集塊を下方から支持し、上記ピンに沿って移動可能な下方支持部材を備えたことを特徴とする請求項７または請求項８のいずれかに記載の細胞の集合構造体の作製装置。   The cell according to any one of claims 7 and 8, further comprising a lower support member that supports a cell clump between the plurality of pins from below and is movable along the pins. An apparatus for producing an aggregate structure. 上記下方支持部材に支持される細胞凝集塊の上部に当接する上部当接部材を備え、
上記下方支持部材と上部当接部材とで挟んだ状態で細胞凝集塊を支持することを特徴とする請求項９に記載の細胞の集合構造体の作製装置。 An upper contact member that contacts the upper part of the cell aggregate supported by the lower support member;
The apparatus for producing a cell aggregate structure according to claim 9, wherein the cell aggregate is supported while being sandwiched between the lower support member and the upper contact member. 上記ピンを、上記細胞の集合構造体の中央部を保持する第１ピン群と、上記細胞の集合構造体の外周縁部を保持する第２ピン群とによって構成し、
上記第１ピン群を構成するピンを上記第２ピン群を構成するピンよりも短く形成するとともに、上記細胞凝集塊を保持する収容部を第１ピン群の先端部近傍に設定し、
さらに上記細胞の集合構造体に対して上記第１ピン群および上記第２ピン群を構成するピンが一体的に相対移動可能に設け、
細胞凝集塊が培養されて培養途中の細胞の集合構造体が形成された状態で、上記第１ピン群および上記第２ピン群を構成するピンが移動することにより、上記第１ピン群を構成するピンが細胞の集合構造体より離脱し、上記第２ピン群を構成するピンが細胞の集合構造体を保持することを特徴とする請求項７ないし請求項１０のいずれかに記載の細胞の集合構造体の作製装置。 The pin is constituted by a first pin group that holds the central part of the cell assembly structure and a second pin group that holds an outer peripheral edge part of the cell assembly structure,
The pin constituting the first pin group is formed shorter than the pin constituting the second pin group, and the accommodating portion for holding the cell aggregate is set near the tip of the first pin group,
Further, the pins constituting the first pin group and the second pin group are provided so as to be integrally movable relative to the cell assembly.
The first pin group is configured by moving the pins constituting the first pin group and the second pin group in a state in which the cell aggregate is cultured and the aggregate structure of the cells being cultured is formed. 11. The cell according to any one of claims 7 to 10, wherein a pin to be detached from a cell aggregate structure and the pins constituting the second pin group hold the cell aggregate structure. An apparatus for producing an aggregate structure. 上記ピンを、上記細胞の集合構造体の中央部を保持する第１ピン群と、上記細胞の集合構造体の外周縁部を保持する第２ピン群とによって構成し、
上記第１ピン群を構成するピンと上記第２ピン群を構成するピンとを相対移動可能に設け、
細胞凝集塊が培養されて培養途中の細胞の集合構造体が形成された状態で、上記第１ピン群を構成するピンを移動させて細胞の集合構造体より離脱させ、上記第２ピン群を構成するピンが細胞の集合構造体を保持することを特徴とする請求項７ないし請求項１０のいずれかに記載の細胞の集合構造体の作製装置。 The pin is constituted by a first pin group that holds the central part of the cell assembly structure and a second pin group that holds an outer peripheral edge part of the cell assembly structure,
A pin constituting the first pin group and a pin constituting the second pin group are provided so as to be relatively movable,
In a state where the cell aggregate is cultured and the aggregate structure of cells in the middle of the culture is formed, the pins constituting the first pin group are moved away from the aggregate structure of the cells, and the second pin group is The device for producing a cell aggregate structure according to any one of claims 7 to 10, wherein the pins constituting the cell hold the cell aggregate structure.
JP2016176819A 2015-10-29 2016-09-09 Method and apparatus for preparing a cell aggregate structure Active JP6882658B2 (en)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16195338.5A EP3162890A1 (en) 2015-10-29 2016-10-24 Method and apparatus for producing cell mass structure
TW105134729A TW201730332A (en) 2015-10-29 2016-10-27 Method and apparatus for producing cell mass structure
KR1020160141972A KR20170051331A (en) 2015-10-29 2016-10-28 Method and apparatus for producing cell mass structure
US15/337,785 US20170121674A1 (en) 2015-10-29 2016-10-28 Method and apparatus for producing cell mass structure

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015212911 2015-10-29
JP2015212911 2015-10-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2017079719A true JP2017079719A (en) 2017-05-18
JP6882658B2 JP6882658B2 (en) 2021-06-02

Family

ID=58713646

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016176819A Active JP6882658B2 (en) 2015-10-29 2016-09-09 Method and apparatus for preparing a cell aggregate structure

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP6882658B2 (en)
KR (1) KR20170051331A (en)
TW (1) TW201730332A (en)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6256853B1 (en) * 2016-09-13 2018-01-10 次郎 大野 Method for producing three-dimensional cell structure and support used therefor
WO2018105255A1 (en) * 2016-12-05 2018-06-14 澁谷工業株式会社 Method and apparatus both for producing cell aggregate structure
JP2019071842A (en) * 2017-10-17 2019-05-16 澁谷工業株式会社 Apparatus for producing cell aggregate structure
CN111315864A (en) * 2018-03-19 2020-06-19 细胞网络株式会社 Apparatus, system and method for manufacturing cell structure
CN113574163A (en) * 2019-03-15 2021-10-29 国立大学法人佐贺大学 Culture apparatus for drug development and research
EP3940055A4 (en) * 2019-03-15 2022-12-14 Saga University Method for manufacturing luminal structure

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005312343A (en) * 2004-04-28 2005-11-10 Hitachi Ltd Container for observation and container for culture, and cultured cell
JP2008054566A (en) * 2006-08-30 2008-03-13 Hitachi Ltd Method for culturing chondrocyte cell, base material for culturing chondrocyte cell, material for regeneration of biomedical tissue containing chondrocyte cell and chondrocyte cell
WO2008123614A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-16 Kyushu University, National University Corporation Method for production of three-dimensional structure of cells
JP2009178050A (en) * 2008-01-29 2009-08-13 Koji Okajima Cell sheet having ordered structure and method for producing the same
WO2010150521A1 (en) * 2009-06-23 2010-12-29 株式会社日立製作所 Culture substrate, culture sheet, and cell culture method
WO2013073672A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 国立大学法人佐賀大学 Device for manufacturing supporting body for cell structure manufacture
JP2017063732A (en) * 2015-09-30 2017-04-06 澁谷工業株式会社 Culture apparatus for cell masses
JP2017063731A (en) * 2015-09-30 2017-04-06 澁谷工業株式会社 Apparatus for culturing cell mass sheet
JP2017063730A (en) * 2015-09-30 2017-04-06 澁谷工業株式会社 Apparatus for producing cell mass sheet
JP2017063729A (en) * 2015-09-30 2017-04-06 澁谷工業株式会社 Production method of cell mass sheet, and cell mass sheet

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005312343A (en) * 2004-04-28 2005-11-10 Hitachi Ltd Container for observation and container for culture, and cultured cell
JP2008054566A (en) * 2006-08-30 2008-03-13 Hitachi Ltd Method for culturing chondrocyte cell, base material for culturing chondrocyte cell, material for regeneration of biomedical tissue containing chondrocyte cell and chondrocyte cell
WO2008123614A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-16 Kyushu University, National University Corporation Method for production of three-dimensional structure of cells
JP2009178050A (en) * 2008-01-29 2009-08-13 Koji Okajima Cell sheet having ordered structure and method for producing the same
WO2010150521A1 (en) * 2009-06-23 2010-12-29 株式会社日立製作所 Culture substrate, culture sheet, and cell culture method
WO2013073672A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 国立大学法人佐賀大学 Device for manufacturing supporting body for cell structure manufacture
JP2017063732A (en) * 2015-09-30 2017-04-06 澁谷工業株式会社 Culture apparatus for cell masses
JP2017063731A (en) * 2015-09-30 2017-04-06 澁谷工業株式会社 Apparatus for culturing cell mass sheet
JP2017063730A (en) * 2015-09-30 2017-04-06 澁谷工業株式会社 Apparatus for producing cell mass sheet
JP2017063729A (en) * 2015-09-30 2017-04-06 澁谷工業株式会社 Production method of cell mass sheet, and cell mass sheet

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6256853B1 (en) * 2016-09-13 2018-01-10 次郎 大野 Method for producing three-dimensional cell structure and support used therefor
US10513684B2 (en) 2016-09-13 2019-12-24 Jiro Ono Manufacturing method and device for three-dimensional engineered tissue
WO2018105255A1 (en) * 2016-12-05 2018-06-14 澁谷工業株式会社 Method and apparatus both for producing cell aggregate structure
JP2019071842A (en) * 2017-10-17 2019-05-16 澁谷工業株式会社 Apparatus for producing cell aggregate structure
JP7037038B2 (en) 2017-10-17 2022-03-16 澁谷工業株式会社 Equipment for making a cell aggregate structure
CN111315864A (en) * 2018-03-19 2020-06-19 细胞网络株式会社 Apparatus, system and method for manufacturing cell structure
EP3690020A4 (en) * 2018-03-19 2020-11-04 Tissuebynet Corporation Production device, production system and production method for cell structure
CN113574163A (en) * 2019-03-15 2021-10-29 国立大学法人佐贺大学 Culture apparatus for drug development and research
EP3940055A4 (en) * 2019-03-15 2022-12-14 Saga University Method for manufacturing luminal structure
EP3940054A4 (en) * 2019-03-15 2022-12-14 Saga University Culture apparatus for use in studies on drug development

Also Published As

Publication number Publication date
JP6882658B2 (en) 2021-06-02
TW201730332A (en) 2017-09-01
KR20170051331A (en) 2017-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2017079719A (en) Production method and production device of cell assembly structure
CN104011197B (en) Object sorting unit and object method for separating
JP6593589B2 (en) Cell mass sheet preparation method and cell mass sheet
JP2016093149A (en) Cell culture apparatus, and cell culture method
EP3162890A1 (en) Method and apparatus for producing cell mass structure
KR20140039259A (en) Cell structure production device
JPWO2014196204A1 (en) Culture container and culture method
JPWO2016208526A1 (en) Cell culture method, cell culture jig and cell culture apparatus
CN107320773B (en) Artificial muscle scaffold model and preparation device and method thereof
JP2017063732A (en) Culture apparatus for cell masses
CN102250767B (en) Digitalized automatic production system for mesenchymal stem cells of umbilical cord
TW201718847A (en) Apparatus for producing cell mass sheet and method for producing cell mass sheet
CN105125316B (en) 3D biological printing system based on induced with laser and method
JP7037038B2 (en) Equipment for making a cell aggregate structure
JP6880384B2 (en) Cell mass sheet manufacturing equipment
JP6889363B2 (en) Method and apparatus for preparing a cell aggregate structure
JP6982231B2 (en) Equipment for making a cell aggregate structure
JP6660544B2 (en) Cell clump sheet culture device
JP2024095388A (en) Method and device for producing assembly structure of cells
CN214168001U (en) 3D cell culture device
CN114958725B (en) Three-dimensional cell sphere hanging drop culture and co-culture method based on hydrophilic-hydrophobic array chip
CN102250837B (en) Digital automatic production method for umbilical cord mesenchymal stem cells
CN112535549A (en) Small insect fixing device for microinjection
CN209287380U (en) A kind of percutaneous puncture-inoculation auxiliary device
WO2021201243A1 (en) Method for producing cell-containing extracellular matrix, cell culture method, device for producing cell-containing extracellular matrix and control program

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190830

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20200630

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200707

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200827

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210119

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210310

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210406

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210419

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6882658

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150