JP2017012157A - 食品及び飼料調製のための高温耐性プロバイオティクス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】65℃超で生存可能であり、好気性及び嫌気性条件下で生育可能であり、50℃及びそれ超の温度で生育及び増殖が可能であり、1から6.2のpH範囲で生存可能であるペディオコッカスアシディラクティシ株、並びに、高温、低pH値並び好気性及び嫌気性条件に耐性があるペディオコッカスアシディラクティシを選抜するステップを有する、ペディオコッカスアシディラクティシ株を生産する方法。
【選択図】図1
Description
MRS寒天培地の調製
必要な濃度となるように個々の培地成分を脱イオン水に加えて1リットルとしてMRS寒天ブロス及びプレートを調製した。次に、pHは、必要に応じて水酸化ナトリウム又は塩酸を用いて、必要に応じて6.2に調節した(Media composition 2008)。
サンプルの希釈及び塗布は、特定のサンプルに存在する菌数を決定して、特に重要である個々のコロニーを単離する方法である。この研究のために、ペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)株IMPAの商業的に入手可能な形態であるMitogrowTMの0.5g粉末パケットをサンプルとして、5mlの1Xリン酸緩衝食塩(PBS)溶液に溶かした。次に、最高15分間の定期的なボルテックス撹拌によって溶液を完全に混合した。このサンプルから、10μlのサンプルを取得して、エッペンドルフチューブ中の990μlのPBS溶液にて希釈した。これは、サンプルの10-2倍希釈物である。10-2倍希釈物から、10μlのサンプルを取得して、再度、990μlのPBS溶液にて希釈して、10-4倍希釈物を与えた。この手順を繰り返して、希釈液として10μlを10-4倍希釈物から取得することによって、10-6倍希釈物を得た。10-6倍希釈物から、100μlのサンプルを取得して、900μlのPBS溶液に希釈して10-7倍希釈物を得た。最後に、希釈物チューブから、別の100μlのサンプルを取得して、900μlのPBS溶液にて希釈して10-8倍希釈物を得た。
B=N/D
B=コロニー数
N=プレートでカウントしたコロニー数
D=希釈倍率(1、10又は100)
上記技術手法の後、個々のコロニーを単離した。無菌爪楊枝を使用して単一コロニーを取得して、15mLのファルコンチューブ中の5mlのMRS寒天ブロスに導入した。種培養の量と温度耐性株を単離する可能性を高めるように、いくつかの個々のコロニーを同じように別々のチューブに導入した。これらのチューブを65℃の温水バスインキュベーターで24-48時間インキュベートした。24-48時間のインキュベーション時間は、単一コロニー由来のペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)が生存していることの確証を得るために用いた。これは、子孫が前世代よりも熱に耐性となり、65℃に耐性であるだけでなく、さらに高い温度にも耐性である株を得る可能性を高めるような方法で生存細菌を増やす方法でもある。
研究の目的は、高温及び低pHレベルを生存可能な株を単離することとした。これを考慮して、温度耐性選抜によって得られたペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)株を、pH選抜のための種培養として使用した。一旦、耐熱性の選抜が、非常に高い温度(例えば85℃)で生存できた所望の株の形で成し遂げられると、希釈及び平板播種技術を通じて得たペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)の単一コロニーに、1.0から6.2にわたる種々のpHレベルのMRSブロスに培養物を播種することによるpH耐性試験を行った。
種々の温度で生存したペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)(特に85℃及びpH1.5で生存したIMHP)の選抜株を、必要に応じて追実験のために保存した。従って、これは、生育可能な菌体を保存する方法を確立するのに必要であった。広く使用されている技術の1つは、急速凍結法であり、生育培地及び安定保護剤(例えばグリセリン)の混合物中に生育可能な細胞を懸濁した後に、-70℃で保存する方法である。任意の保護なしに菌を直接凍らせることは、機械的及び生理的状態に起因して、凍結及びその後の解凍工程の間に生存率の減少が引き起こされ得ることが観察されている(Morrison 1979)。従って、グリセリンを保護剤として凍結工程中に使用した。
プロバイオティクスの生産には、ある種の技術(例えば従来型のバッチ発酵手順、連続培養及び固定化細胞システム技術)が関係する(Heller 2001)。ペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)は、酸素存在下でも無酸素状態でも生存可能な条件的嫌気性生物である(Facklam and Elliot 1995)。しかしながら、生産目的に関していえば、好気性及び嫌気性条件下で培養収率が高い株を同定することは理想的である。最も適した生育条件を決定するために、ペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)と親株との生育特性の相違を比較する必要がある。理由は、理想的な株は、以前の温度及びpH選抜技術から取得されたためである。85℃及びpH1.5で生存可能な、耐性選抜法後に得た株をMRS寒天プレートで培養し、単一コロニーを、MRS寒天ブロスを含む25mlチューブに導入した。別の培養サンプルを、親型のペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)から取得して、MRS寒天プレートでインキュベートし、上述の通り、25mlMRSチューブに播種した。別々の2つのチューブを、好気性及び嫌気性テストのためにセットアップした。温度が45℃で、エアレーションを誘導するために振盪速度を250rpmにセットした環境振盪機中にて好気性チューブを24時間インキュベートした。一方、1mlのミネラルオイルを嫌気性チューブ中のブロス上に加えて、それらの口をテープで封止して、酸素暴露又は空気交換による任意の不都合を回避するようにした。それらを、エアレーションを回避するように静止位置で45℃の標準的なインキュベーターで24時間インキュベートした。標準的なペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)の生育特性は、MitogrowTMサンプル由来の菌を使用したのと同じ手順で決定した。これは、野生株と温度及びpH耐性株との間の比較手段とコントロールの両方の働きをする。0.5gのMitogrowTM粉末を、5mlの1XPBS溶液に溶かして、連続的に希釈し、MRS寒天プレートに塗布して、45℃で24時間インキュベートした。次に、単一コロニーを、上述した好気性及び嫌気性条件と同じ処置を施した。
2つの250mlのフラスコのセットに、実験前に作成し殺菌した50mlのMRSブロスを入れた。これらのフラスコに、-70℃で保存されていた100μlのIMHP一次種を、播種材料として加えた。次に、多量のペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)の培養で最大限増殖できるように、フラスコを45℃で24時間インキュベートした。この多量のサンプルから、10mlのサンプルを抽出して、2つの別々の15mlファルコンチューブに入れた。そして、10mlのサンプルを含むチューブを、2500rpmで15分間遠心した。遠心後、ペレットがチューブの底に形成される一方で上清が上部に残る。上清を廃棄して、ペレットが濃縮されるようにこの手順を繰り返す。次に、各チューブ由来のペレットを2mlのMRSブロスに再懸濁して、100μlのサンプルを、MRS寒天プレート上に塗布して、45℃で24時間インキュベートする。これは、最初の播種材料を基準とし、温度選抜を受けるペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)の生存率を決定するのに役立つ。ペレットを有するチューブを、85℃で24時間、徹底的に混合してインキュベートした。インキュベーション期間後、サンプルを、希釈平板播種技術を通じて10-4希釈物として、45℃で24時間、MRSプレート上に塗布した。
85℃及びpH 1.5の培養条件で生存可能な選抜されたペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici) IMHP株を同定する確証方法として、16sリボソームDNAタイピングを実行した。いくつかの株を、以下の通りにPCRタイピングプロセスで使用した。
無菌爪楊枝を用いてMRS寒天プレートに得られた十分に単離されたコロニーに触れて、この爪楊枝の汚染された末端をPCR混合物に浸漬する。
「Ready-to-go」PCRチューブをGE Healthcare Life Sciencesから取得した。これは、ヌクレオチド、緩衝液成分、Mg+2及びTaqポリメラーゼを予め分配された混合物を含んでいる。水中に360及び822プライマーを含む24μ1の「master mix」を各チューブに加えた。次に、爪楊枝をこれらのチューブに浸漬する。これらは、PCR反応の開始が早まることを回避するように氷上に置く。チューブをボルテックスして試薬を混合し、数秒間遠心してチューブの底部に全ての成分を降下させる。この後、水性溶液を覆うには十分な数滴のミネラルオイルをチューブ加え、次に、チューブをサーマルサイクラーに置いた。サイクルプログラムは、以下の通り、94℃で7分、次に、94℃で45秒、55℃で30秒、60秒で72℃を35サイクル、最後に72℃で10秒、そして、4℃に保持した。
40mMのトリス、20mMの酢酸及び1mMのEDTAをpH8.4で980mlとなるように脱イオン水を加え、20mlの50X TAB緩衝液を加えることで1X緩衝溶液を作成した。45mlの1X TAE緩衝液を250mlボトルに加えて、1.5%アガロースゲルとなるようにアガロースを加えた。この溶液をマイクロ波にて加熱してアガロースを溶解し、次に、室温で5分間冷却し、そして、ゲルを装置に注入した。5μlのPCR反応物、4μlの1X TAE緩衝液及び1μlの10X添加液を混合することによってサンプルを作成した。各サンプルの全10μlを別々のウェルに添加し、また、100bpのラダーマーカーを端のウェルに10μl添加した。追跡用色素がゲルの4分の3に達するまで、サンプルを100Vで電気泳動した。次に、ゲルを取り除いて臭化エチジウム中で15分間染色して、紫外線(UV)光の下でバンドを観察した。
配列決定の前に、二つの酵素、すなわちエキソヌクレアーゼI及びアルカリ性ホスファターゼでPCRサンプルを処理することによって過剰なプライマーをサンプルから除去した。これらの酵素は、残留する一本鎖プライマーを消化するが、二本鎖PCR産物は、かかる消化に対して耐性がある。10μlのPCR産物を予め標識したチューブに移して、4μlのExo I/AP混合物を加えた。次に、チューブを、プライマー及びdNTPの消化のために37℃で15分間インキュベートし、そして、酵素を失活させるために80℃で15分間インキュベートした。次に、得られた精製PCR産物の配列決定のためにサンプルを移した。
この手順において使用する様々な株の16SリボソームDNA配列と大容量リボソームデータベースとの比較を実行して最も密接に関連した生物を決定した。
上述した手順から、IMPA培養後に得られた生存可能なペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)のコロニーを有するMRSプレートを、温度耐性選抜実験のためのスターター播種原として使用した。8つのコロニーを、2枚のプレートからランダムに選抜して、5mlのMRSブロスにそれぞれ播種し、65℃で24時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、100μlのサンプルを、MRS寒天プレートに塗布して、更に45℃でインキュベートした。使用した8つのサンプルうち3つは、他と比較して、より多くのコロニーへと増加した。
85℃での生存が可能である温度耐性法によって選抜されたペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)株を、起源の追跡とより良好な理解のために、「IMH」と名前を変えた。IMH株を用いて、高温且つ低pHレベルで生き残ることができる株を選抜した。10μlのIMHサンプルを、pHレベル1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5及び6.2の5mlのMRSブロスに播種した。全てのチューブを、85℃で24時間インキュベートして、平板播種技術を用いて塗布し、生存可能なペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)のコロニーの数を決定した。図1にて証明されている通り、低pHレベルにて顕著な量が生存していた。
ペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)の選抜された株が生存及び複製ができることを確認するために、親株と選抜された株との間の相違を概説するある種の実験を実行する必要がある。最初は、API-50-CHL Bacteria Identification System(Fisher Scientific、ニュージャージー)を用いて選抜された株がペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)であることを確証した。この後、慎重に、親株とIMHPとの間の相違を証明した。
選抜されたペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)のIMHP株の試験的バッチを生育させて、商業化にとって重要である多数生育する株の能力及び安定性を決定した。実験のために、IMHP株を、45℃で24時間、250mlのMRSブロスにおいてインキュベートすることによって生育させた。IMHP、すなわちIMHP-A及びIMHP-Bの二重菌ストックをこの実験に用いた。処理前の初期の播種材料を、MRS寒天プレート上で100μlのIMHP-A及びIMHP-Bを培養することによって決定し、更なる実験のために4 8×105 CFU/mLで標準化した。この決定後、IMHP-A及びIMHP-Bを、85℃で熱処理して、それらの安定性を決定するためにランダムな時間間隔で塗布した。MRSプレートを、45℃で一晩インキュベートした。
菌は、表現型同定法によって同定することができるが、菌の16SリボソームDNA (リボソームDNA)に基づく同定は、有用且つ非常に正確な代替法である。特徴に関する発現の多様性によって修正可能な表現型同定とは異なり、16SrDNA配列決定は、珍しい単離であっても明白なデータを提供する。正確な16srDNA配列の増加及び目標プライマー配列の伸展は、菌の分子的同定の重要性及び有用性を明白に示す(Olive及びBean1999)。
Imagilin Technologyは、非常に多様な温度、浸透圧及び酸素曝露に耐えることができる菌のペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici) NRRL B-50517株で構成された独自に調製された粉末である5051(登録商標)を提供する。丈夫な微生物を植物素材から最初に単離して、そのプロバイオティクスから、様々な環境要因及び熱処理手順下で広範囲にわたる食品で生存する能力が証明された。
Claims (8)
- 65℃超で生存可能であり、好気性及び嫌気性条件下で生育可能であり、1から6.2のpH範囲で生存可能な、ペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)株。
- NRRL B-50517としての農業研究事業団(ARS)特許培養物コレクションに寄託された、請求項1に記載のペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)株。
- 高温、低pH値並び好気性及び嫌気性条件に耐性があるペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)を選抜するステップを有する、請求項1に記載のペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)株を生産する方法。
- 請求項1に記載のペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)株を含む製造製品。
- 消費可能な組成物を含む請求項4に記載の製品。
- 食品添加のためのプロバイオティクス組成物を含む請求項5に記載の製品。
- 飼料又は食品を含む請求項5に記載の製品。
- 請求項1に記載のペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)株を含むプロバイオティクス組成物をヒト又は動物に投与するステップを含む、食事増強法。
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