JP2017009381A - 癌の検査方法、癌細胞増殖阻害剤、抗癌剤及び抗癌剤のスクリーニング方法 - Google Patents
癌の検査方法、癌細胞増殖阻害剤、抗癌剤及び抗癌剤のスクリーニング方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】本発明では、新規な、癌細胞に特異的に発現する標的分子をスクリーニングし、該標的分子を指標とする癌の検査方法、該標的分子の発現を抑制する癌細胞増殖阻害剤、該標的分子の機能及び／又は発現の阻害を指標とした抗癌剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。【解決手段】RAB39A及び／又はCPVLを検出する癌の検査方法、RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制する癌細胞増殖阻害剤、該抑制剤を含む抗癌剤、並びに、RAB39A及び／又はCPVLの機能及び／又は発現の阻害を指標とした抗癌剤のスクリーニング方法を完成した。【選択図】 なし
Description
本発明は、癌の検査方法、癌細胞増殖阻害剤、抗癌剤及び抗癌剤のスクリーニング方法に関する。より詳しくは、RAB39A及び／又はCPVLを検出する癌の検査方法、RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制する癌細胞増殖阻害剤、該抑制剤を含む抗癌剤、並びに、RAB39A及び／又はCPVLの機能及び／又は発現の阻害を指標とした抗癌剤のスクリーニング方法に関する。
（現状の抗癌剤の問題点）
現状の抗癌剤治療は、癌細胞特異性が低く、癌に致死的効果をもたらす場合は、正常細胞系列にも障害を示し、生体副作用の強い場合が多い。一方で、ハーセプチンやイレッサ等の分子標的薬の多くは生体副作用に乏しいものの治療対象とする癌種に対する汎用性は低い。
よって、癌に対する分子標的治療に関しては、より多くの癌で適用可能で且つ治療効果の高い、しかも、副作用の極めて乏しい新規標的を同定し、新規治療方法を創出することが必要である。これにより、癌細胞に特異的な殺細胞効果をもたらす標的分子を同定することは、新世代の抗癌剤開発には必須である。
現状の抗癌剤治療は、癌細胞特異性が低く、癌に致死的効果をもたらす場合は、正常細胞系列にも障害を示し、生体副作用の強い場合が多い。一方で、ハーセプチンやイレッサ等の分子標的薬の多くは生体副作用に乏しいものの治療対象とする癌種に対する汎用性は低い。
よって、癌に対する分子標的治療に関しては、より多くの癌で適用可能で且つ治療効果の高い、しかも、副作用の極めて乏しい新規標的を同定し、新規治療方法を創出することが必要である。これにより、癌細胞に特異的な殺細胞効果をもたらす標的分子を同定することは、新世代の抗癌剤開発には必須である。
（先行文献）
本発明の先行文献として、以下を挙げることができる。
特許文献１は、「CPVLを含むマーカー遺伝子を使用して、急性骨髄性白血病患者の抗癌剤治療反応性を予測する方法」を開示している。
特許文献２は、「CPVLを含むマーカー遺伝子を使用して、急性骨髄性白血病患者の抗癌剤治療反応性を予測する方法」を開示している。
しかし、特許文献１及び２は、「CPVLを検出することにより癌の有無を検出できること及びCPVLの発現を阻害することにより癌細胞の増殖を抑えること」を開示又は示唆をしていない。
本発明の先行文献として、以下を挙げることができる。
特許文献１は、「CPVLを含むマーカー遺伝子を使用して、急性骨髄性白血病患者の抗癌剤治療反応性を予測する方法」を開示している。
特許文献２は、「CPVLを含むマーカー遺伝子を使用して、急性骨髄性白血病患者の抗癌剤治療反応性を予測する方法」を開示している。
しかし、特許文献１及び２は、「CPVLを検出することにより癌の有無を検出できること及びCPVLの発現を阻害することにより癌細胞の増殖を抑えること」を開示又は示唆をしていない。
以上により、癌細胞に特異的に発現する新規な標的分子をスクリーニングし、該標的分子を指標とする癌の検査方法、該標的分子の発現を抑制する癌細胞増殖阻害剤の開発が望まれている。
上記要望により、本発明では、新規な、癌細胞に特異的に発現する標的分子をスクリーニングし、該標的分子を指標とする癌の検査方法、該標的分子の発現を抑制する癌細胞増殖阻害剤、該標的分子の機能及び／又は発現の阻害を指標とした抗癌剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、癌細胞系列と正常細胞系列を用いた主成分分析を行い、さらに、正常細胞系列での遺伝子発現は実質的になく、かつ酸性培養環境、中性培養環境に関係なく癌細胞系列で高発現を維持するRAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210を含む複数の標的分子を特定した。さらに、癌細胞中のRAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制することにより、癌細胞増殖が抑制できることを見出した。
これにより、RAB39A及び／又はCPVLを検出する癌の検査方法、RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制する癌細胞増殖阻害剤、該抑制剤を含む抗癌剤、並びに、RAB39A及び／又はCPVLの機能及び／又は発現の阻害を指標とした抗癌剤のスクリーニング方法を完成した。
これにより、RAB39A及び／又はCPVLを検出する癌の検査方法、RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制する癌細胞増殖阻害剤、該抑制剤を含む抗癌剤、並びに、RAB39A及び／又はCPVLの機能及び／又は発現の阻害を指標とした抗癌剤のスクリーニング方法を完成した。
すなわち本発明は、以下からなる。
１．被験者由来の試料からRAB39A及び／又はCPVLを検出することを特徴とする癌の検査方法。
２．前記患者の癌は、副腎腫瘍、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、子宮体癌、食道癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、白血病、精巣腫瘍、膵癌、前立腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌から選ばれる１以上である前項１に記載の癌の検査方法。
３．RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制可能なRNAを含む、癌細胞増殖阻害剤。
４．前記RNAは、以下の塩基配列を標的配列とする前項３に記載の癌細胞増殖阻害剤。
（１）配列番号１に記載の塩基配列
（２）配列番号２に記載の塩基配列
（３）配列番号３に記載の塩基配列
（４）配列番号４に記載の塩基配列
（５）配列番号５に記載の塩基配列
（６）配列番号６に記載の塩基配列
（７）配列番号７に記載の塩基配列
（８）配列番号８に記載の塩基配列
５．前項４に記載の癌細胞増殖阻害剤を含む抗癌剤。
６．以下の工程を含む抗癌剤のスクリーニング方法、
（１）候補化合物を、RAB39A及び／又はCPVLと接触させる工程、
（２）前記候補化合物が、RAB39A及び／又はCPVLの機能及び／又は発現を阻害するかどうかを判定する工程、
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法。
７．以下のいずれか１以上の抗体を含む癌の検査キット。
（１）抗RAB39A抗体
（２）抗CPVL抗体
１．被験者由来の試料からRAB39A及び／又はCPVLを検出することを特徴とする癌の検査方法。
２．前記患者の癌は、副腎腫瘍、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、子宮体癌、食道癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、白血病、精巣腫瘍、膵癌、前立腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌から選ばれる１以上である前項１に記載の癌の検査方法。
３．RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制可能なRNAを含む、癌細胞増殖阻害剤。
４．前記RNAは、以下の塩基配列を標的配列とする前項３に記載の癌細胞増殖阻害剤。
（１）配列番号１に記載の塩基配列
（２）配列番号２に記載の塩基配列
（３）配列番号３に記載の塩基配列
（４）配列番号４に記載の塩基配列
（５）配列番号５に記載の塩基配列
（６）配列番号６に記載の塩基配列
（７）配列番号７に記載の塩基配列
（８）配列番号８に記載の塩基配列
５．前項４に記載の癌細胞増殖阻害剤を含む抗癌剤。
６．以下の工程を含む抗癌剤のスクリーニング方法、
（１）候補化合物を、RAB39A及び／又はCPVLと接触させる工程、
（２）前記候補化合物が、RAB39A及び／又はCPVLの機能及び／又は発現を阻害するかどうかを判定する工程、
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法。
７．以下のいずれか１以上の抗体を含む癌の検査キット。
（１）抗RAB39A抗体
（２）抗CPVL抗体
本発明では、新規な癌の検査方法、癌細胞増殖阻害剤、該抑制剤を含む抗癌剤、並びに、抗癌剤のスクリーニング方法を提供することができる。
以下、本発明のRAB39A及び／又はCPVLを検出する癌の検査方法、RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制する癌細胞増殖阻害剤、該抑制剤を含む抗癌剤、並びに、RAB39A及び／又はCPVLの機能及び／又は発現の阻害を指標とした抗癌剤のスクリーニング方法について詳細に説明するが、下記の記載により本発明の範囲を限定されるものではない。
（RAB39A）
RAB39A（Ensembl: ENSG00000179331）は、RAS familyのメンバーであり、小胞輸送、リソソームとファゴソームの融合等に関与していることが知られている。
RAB39A（Ensembl: ENSG00000179331）は、RAS familyのメンバーであり、小胞輸送、リソソームとファゴソームの融合等に関与していることが知られている。
（CPVL）
CPVL（carboxypeptidase, vitellogenic-like：卵黄形成カルボキシペプチダーゼ様タンパク質、Ensembl: ENSG00000106066）は、タンパク質又はペプチドのカルボキシ末端の単一アミノ酸を切断するカルボキシペプチダーゼであり、かつセリンカルボキシペプチダーゼと相同性が高い。
CPVL（carboxypeptidase, vitellogenic-like：卵黄形成カルボキシペプチダーゼ様タンパク質、Ensembl: ENSG00000106066）は、タンパク質又はペプチドのカルボキシ末端の単一アミノ酸を切断するカルボキシペプチダーゼであり、かつセリンカルボキシペプチダーゼと相同性が高い。
（LHX2）
LHX2（LIM homeobox 2、Ensembl: ENSG00000106689）は、アルファ糖タンパク質遺伝子のプロモータを刺激する等の転写活性化因子として知られている。
LHX2（LIM homeobox 2、Ensembl: ENSG00000106689）は、アルファ糖タンパク質遺伝子のプロモータを刺激する等の転写活性化因子として知られている。
（NUP210）
NUP210（Nucleoporin 210kDa、Ensembl: ENSG00000132182）は、ARFタンパク質シグナル伝達の調節に関与していることが知られている。
NUP210（Nucleoporin 210kDa、Ensembl: ENSG00000132182）は、ARFタンパク質シグナル伝達の調節に関与していることが知られている。
（被験者）
本発明における被験者は、いずれの段階（早期、進行、末期）のすべての癌（又は癌の可能性）の患者（哺乳動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ、より好ましくはヒト）を対象としているが、下記の実施例３により、少なくとも下記の癌を対象とする。
副腎腫瘍、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、子宮体癌、食道癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、白血病、精巣腫瘍、膵癌、前立腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌。
本発明における被験者は、いずれの段階（早期、進行、末期）のすべての癌（又は癌の可能性）の患者（哺乳動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ、より好ましくはヒト）を対象としているが、下記の実施例３により、少なくとも下記の癌を対象とする。
副腎腫瘍、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、子宮体癌、食道癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、白血病、精巣腫瘍、膵癌、前立腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌。
（試料）
本発明における試料は、被験者から採取され、かつ、RAB39A及び／又はCPVLが存在していれば特に限定されないが、血液、リンパ液、髄液、骨髄液、唾液、尿、関節液、胸水、腹水、涙液、眼房水、硝子体液、鼻腔液、母乳、精液、前立腺液、膣液、膵液、胆汁、汗、膿、気管支洗浄液、生検サンプル（胃粘膜、大腸粘膜、気管支粘膜、皮膚、筋肉、腫瘍、リンパ節、子宮粘膜）、解剖検体（病理組織、法医学的組織）等を例示することができ、好ましくは、腫瘍組織の生検サンプルである。
本発明における試料は、被験者から採取され、かつ、RAB39A及び／又はCPVLが存在していれば特に限定されないが、血液、リンパ液、髄液、骨髄液、唾液、尿、関節液、胸水、腹水、涙液、眼房水、硝子体液、鼻腔液、母乳、精液、前立腺液、膣液、膵液、胆汁、汗、膿、気管支洗浄液、生検サンプル（胃粘膜、大腸粘膜、気管支粘膜、皮膚、筋肉、腫瘍、リンパ節、子宮粘膜）、解剖検体（病理組織、法医学的組織）等を例示することができ、好ましくは、腫瘍組織の生検サンプルである。
（癌の検査方法）
本発明の癌の検査方法は、被験者由来の試料中のRAB39A及び／又はCPVLを検出することができれば、いかなる方法でも良い。
RAB39A及び／又はCPVLのmRNAを測定する場合には、例えば、RT-PCR、競合的RT-PCR、リアルタイムRT-PCR、RNase保護分析法、ノ−ザンブロットティング及びDNAチップからなる群から選択されるいずれか一つを使用することができるが、特に限定されない。
また、RAB39A及び／又はCPVLの発現タンパク質の発現量を測定する場合には、該タンパク質に特異的に結合する抗体又はリガンドを用いて検出する方法等が挙げられるが、特に限定されない。RAB39A及びCPVLに対する抗体は、市販されている抗体を使用することができる。
さらに、本発明の癌の検査方法において「指標（Cut off（カットオフ）値）」を設定しても良い。指標とは、癌患者と健常者を区別するための試料中のRAB39A及び／又はCPVLの発現量を意味する。例えば、被験者の試料中のRAB39A及び／又はCPVLの発現量が、予め設定した試料中の発現量以上の場合には、癌が発症している、癌が進行している、重篤な癌である、及び／又は今後の癌の発症の可能性が高いと判定することができる。
指標値の設定方法としては、例えば、健常者由来のRAB39A及び／又はCPVLの発現量の平均値から算出する。通常、予め決定した健常者由来のRAB39A及び／又はCPVLの発現量の平均値の標準偏差の90％以下、好ましくは80%以下、より好ましくは70％以下、さらに好ましくは60％以下、最も好ましくは50％以下の範囲の発現量を指標とする。
本発明の癌の検査方法は、被験者由来の試料中のRAB39A及び／又はCPVLを検出することができれば、いかなる方法でも良い。
RAB39A及び／又はCPVLのmRNAを測定する場合には、例えば、RT-PCR、競合的RT-PCR、リアルタイムRT-PCR、RNase保護分析法、ノ−ザンブロットティング及びDNAチップからなる群から選択されるいずれか一つを使用することができるが、特に限定されない。
また、RAB39A及び／又はCPVLの発現タンパク質の発現量を測定する場合には、該タンパク質に特異的に結合する抗体又はリガンドを用いて検出する方法等が挙げられるが、特に限定されない。RAB39A及びCPVLに対する抗体は、市販されている抗体を使用することができる。
さらに、本発明の癌の検査方法において「指標（Cut off（カットオフ）値）」を設定しても良い。指標とは、癌患者と健常者を区別するための試料中のRAB39A及び／又はCPVLの発現量を意味する。例えば、被験者の試料中のRAB39A及び／又はCPVLの発現量が、予め設定した試料中の発現量以上の場合には、癌が発症している、癌が進行している、重篤な癌である、及び／又は今後の癌の発症の可能性が高いと判定することができる。
指標値の設定方法としては、例えば、健常者由来のRAB39A及び／又はCPVLの発現量の平均値から算出する。通常、予め決定した健常者由来のRAB39A及び／又はCPVLの発現量の平均値の標準偏差の90％以下、好ましくは80%以下、より好ましくは70％以下、さらに好ましくは60％以下、最も好ましくは50％以下の範囲の発現量を指標とする。
（抗癌剤のスクリーニング方法）
本発明の抗癌剤のスクリーニング方法は、少なくとも以下の工程を含む。
（１）候補化合物を、RAB39A及び／又はCPVLと接触させる工程。
（２）前記候補化合物が、RAB39A及び／又はCPVLの機能及び／又は発現を阻害するかどうかを判定する工程。
本発明の抗癌剤のスクリーニング方法は、少なくとも以下の工程を含む。
（１）候補化合物を、RAB39A及び／又はCPVLと接触させる工程。
（２）前記候補化合物が、RAB39A及び／又はCPVLの機能及び／又は発現を阻害するかどうかを判定する工程。
（候補化合物）
本発明で用いる候補化合物としては、任意の物質を使用することができ、天然由来の化合物も含む。候補化合物の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、候補化合物は、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー又はコンビナトリアルライブラリーでもよい。候補化合物は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
本発明で用いる候補化合物としては、任意の物質を使用することができ、天然由来の化合物も含む。候補化合物の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、候補化合物は、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー又はコンビナトリアルライブラリーでもよい。候補化合物は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
本発明の抗癌剤のスクリーニング方法では、好適には、候補化合物をRAB39A及び／又はCPVL遺伝子含有（発現）細胞と接触させる工程を含む。接触させる方法は限定されない。例えば、培養細胞に候補化合物を添加することができる。インキュベーション時間は限定されない。好適なインキュベーション時間は細胞の種類や環境により異なるが、２４時間〜１週間、好ましくは２４時間〜７２時間、さらに好ましくは、２４時間〜６０時間である。
加えて、RAB39A及び／又はCPVL遺伝子のプロモータを含む発現制御領域にレポーター遺伝子を結合した遺伝子構造体を作製して、レポーター遺伝子の発現量を測定する方法も挙げられる。この方法では、該遺伝子構造体を発現ベクターに導入した後、動物細胞に形質導入して形質転換体を製造する。この形質転換体に候補化合物を接触させた後、レポーター遺伝子の発現量を測定し、候補化合物と接触のない対照群と発現量を比較することができる。レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子等を使用することができるが、これに限定されない。
加えて、RAB39A及び／又はCPVL遺伝子のプロモータを含む発現制御領域にレポーター遺伝子を結合した遺伝子構造体を作製して、レポーター遺伝子の発現量を測定する方法も挙げられる。この方法では、該遺伝子構造体を発現ベクターに導入した後、動物細胞に形質導入して形質転換体を製造する。この形質転換体に候補化合物を接触させた後、レポーター遺伝子の発現量を測定し、候補化合物と接触のない対照群と発現量を比較することができる。レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子等を使用することができるが、これに限定されない。
スクリーニングに用いられる細胞は、限定されるものではない。好適には、哺乳動物由来細胞株を用いることができる。例えば、正常細胞由来細胞株、癌由来細胞株、形質導入された細胞株等が挙げられる。好ましくは、癌由来細胞株又はレポーター遺伝子が導入された細胞株が用いられる。また、ヒト以外の哺乳動物個体に候補化合物を投与して遺伝子の発現量を測定及び比較してもよい。
（癌細胞増殖阻害剤）
本発明の癌細胞増殖阻害剤は、RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の機能及び／又は発現を阻害することができる物質（特に、化合物）を有効成分として含む。
さらに、上記化合物と、自体公知の薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、その他の添加剤、具体的には水、植物油、エタノール又はベンジルアルコールのようなアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアゼテートゼラチン、ラクトース、デンプン等のような炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ワセリン等と混合して、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、注射剤、液剤、懸濁剤等の形態により経口又は非経口的に投与することができる。
なお、本発明の癌細胞増殖阻害剤は、抗癌剤としての用途に限定されない。
本発明の癌細胞増殖阻害剤は、RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の機能及び／又は発現を阻害することができる物質（特に、化合物）を有効成分として含む。
さらに、上記化合物と、自体公知の薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、その他の添加剤、具体的には水、植物油、エタノール又はベンジルアルコールのようなアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアゼテートゼラチン、ラクトース、デンプン等のような炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ワセリン等と混合して、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、注射剤、液剤、懸濁剤等の形態により経口又は非経口的に投与することができる。
なお、本発明の癌細胞増殖阻害剤は、抗癌剤としての用途に限定されない。
（抗癌剤）
本発明の抗癌剤は、上記癌細胞増殖阻害剤、又は、RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の機能及び／又は発現を阻害することができる物質（特に、化合物）を有効成分として含む。さらに、本発明の抗癌剤は、いずれの段階の癌（早期、進行、末期）を対象とするだけでなく、癌予防にも使用することができる。
本発明の抗癌剤の投与量又は摂取量については、本発明の効果が得られるものであれば特に限定されるものではなく、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状及び他の医薬の使用の有無等）、及び担当医師の判断等に応じて適宜選択される。本発明の抗癌剤は、１日１〜数回に分けて投与又は摂取することができ、数日又は数週間に１回の割合で間欠的に投与又は摂取してもよい。
本発明の抗癌剤は、上記癌細胞増殖阻害剤、又は、RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の機能及び／又は発現を阻害することができる物質（特に、化合物）を有効成分として含む。さらに、本発明の抗癌剤は、いずれの段階の癌（早期、進行、末期）を対象とするだけでなく、癌予防にも使用することができる。
本発明の抗癌剤の投与量又は摂取量については、本発明の効果が得られるものであれば特に限定されるものではなく、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状及び他の医薬の使用の有無等）、及び担当医師の判断等に応じて適宜選択される。本発明の抗癌剤は、１日１〜数回に分けて投与又は摂取することができ、数日又は数週間に１回の割合で間欠的に投与又は摂取してもよい。
（RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制可能なRNA）
本発明のRAB39A 、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制可能なRNA（siRNA、shRNAを含む）は、RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制することにより、癌細胞増殖抑制（特に、癌細胞特異的増殖抑制）効果を有する。なお、「癌細胞特異的増殖抑制」とは、癌細胞増殖は抑制するが、正常細胞の増殖を実質的に（又は、わずかにしか）抑制しないことを意味する。
上記のRNAは、本発明の癌細胞増殖阻害剤又は抗癌剤に含まれる有効成分として例示することができる。
本発明のRAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制可能なRNAを発現するDNAを、患者に投与する場合、特に限定されないが、自体公知のウイルス又は非ウイルスベクターを使用することができる。
本発明のRAB39A 、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制可能なRNA（siRNA、shRNAを含む）は、RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制することにより、癌細胞増殖抑制（特に、癌細胞特異的増殖抑制）効果を有する。なお、「癌細胞特異的増殖抑制」とは、癌細胞増殖は抑制するが、正常細胞の増殖を実質的に（又は、わずかにしか）抑制しないことを意味する。
上記のRNAは、本発明の癌細胞増殖阻害剤又は抗癌剤に含まれる有効成分として例示することができる。
本発明のRAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制可能なRNAを発現するDNAを、患者に投与する場合、特に限定されないが、自体公知のウイルス又は非ウイルスベクターを使用することができる。
（本発明の癌の治療方法）
本発明の癌の治療方法において、投与量、投与回数及び投与間隔は、特に限定されず、予防（特に再発防止）及び／又は臨床的治療の目的、疾患のタイプ、患者の体重、年齢、疾患の重篤さ等の条件に応じて適宜選定される。
本発明の癌の治療方法において、投与量、投与回数及び投与間隔は、特に限定されず、予防（特に再発防止）及び／又は臨床的治療の目的、疾患のタイプ、患者の体重、年齢、疾患の重篤さ等の条件に応じて適宜選定される。
（癌の検査キット）
本発明の癌の検査キットは、RAB39A及び／又はCPVLを被験者から得られた試料中から検出するために必要な構成を含む。
例えば、本発明の癌の検査キットは、下記のようないずれか１以上の抗体を含む。
（１）抗RAB39A抗体
（２）抗CPVL抗体
なお、上記すべての抗体は、自体公知の市販品でもよいが、各抗原を標的として作製したモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体でもよい。
本発明の癌の検査キットは、RAB39A及び／又はCPVLを被験者から得られた試料中から検出するために必要な構成を含む。
例えば、本発明の癌の検査キットは、下記のようないずれか１以上の抗体を含む。
（１）抗RAB39A抗体
（２）抗CPVL抗体
なお、上記すべての抗体は、自体公知の市販品でもよいが、各抗原を標的として作製したモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体でもよい。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
（癌細胞系列と正常細胞系列の判別）
２万以上の全発現遺伝子を統計学的、数学的に処理し、癌細胞系列又は正常細胞系列の判別のみを指標とする主成分分析を行った。詳細は、以下の通りである。
癌細胞、癌幹細胞のモデルケースとして、ヒト骨肉腫細胞であるMG-63, HOS及びSaos-2とそれらの癌幹細胞 (CSC)を用いた。癌幹細胞dominantで増殖させる培養法は、既知の方法を用いた（Salerno, et al. Int J Oncol 2013）。比較する正常細胞系列にはヒト正常線維芽細胞であるTIG-108, -121の2種、及び、ヒト間葉系幹細胞4種 （Lonza, #PT-2501） を用いた。
其々の細胞をDMEM/10%FBS、中性培養液｛pH7.4, 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)にて調整｝、酸性培養液｛pH6.5, 10mM piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)｝にて24時間、5% CO2環境下で培養後、各total RNAをTRIzolにて回収した。Total RNAより、TruSeqTM RNA sample preparation kit-v2 (Illumina) を用いて、シーケンサー解析用ライブラリーを作成し、次世代シーケンサーGAIIx (Illumina) にてRNA-Seq解析を行った。得られたsequence dataより、Strand NGS v2.1 (Strand) softwareを用いて主成分分析を行った。
２万以上の全発現遺伝子を統計学的、数学的に処理し、癌細胞系列又は正常細胞系列の判別のみを指標とする主成分分析を行った。詳細は、以下の通りである。
癌細胞、癌幹細胞のモデルケースとして、ヒト骨肉腫細胞であるMG-63, HOS及びSaos-2とそれらの癌幹細胞 (CSC)を用いた。癌幹細胞dominantで増殖させる培養法は、既知の方法を用いた（Salerno, et al. Int J Oncol 2013）。比較する正常細胞系列にはヒト正常線維芽細胞であるTIG-108, -121の2種、及び、ヒト間葉系幹細胞4種 （Lonza, #PT-2501） を用いた。
其々の細胞をDMEM/10%FBS、中性培養液｛pH7.4, 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)にて調整｝、酸性培養液｛pH6.5, 10mM piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)｝にて24時間、5% CO2環境下で培養後、各total RNAをTRIzolにて回収した。Total RNAより、TruSeqTM RNA sample preparation kit-v2 (Illumina) を用いて、シーケンサー解析用ライブラリーを作成し、次世代シーケンサーGAIIx (Illumina) にてRNA-Seq解析を行った。得られたsequence dataより、Strand NGS v2.1 (Strand) softwareを用いて主成分分析を行った。
（結果）
主成分分析結果を図１に示す。Component1（X-Axis: 水平軸方向）に関し、正常細胞系列と悪性細胞系列を明確に分別することができた。
さらに、各遺伝子発現の判別主成分への貢献度を、ランク付けすることにより、癌細胞、正常細胞の各系列を判別可能な遺伝子の貢献度ランクリスト（参照：図２）を作成した。該リストの上位100個の中から、正常細胞系列での遺伝子発現はほぼゼロであり、酸性培養環境及び中性培養環境に関わらず、癌細胞系列では高発現を維持するRAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210を含む10個を標的分子候補として選択した（参照：表１及び図２下線）。
主成分分析結果を図１に示す。Component1（X-Axis: 水平軸方向）に関し、正常細胞系列と悪性細胞系列を明確に分別することができた。
さらに、各遺伝子発現の判別主成分への貢献度を、ランク付けすることにより、癌細胞、正常細胞の各系列を判別可能な遺伝子の貢献度ランクリスト（参照：図２）を作成した。該リストの上位100個の中から、正常細胞系列での遺伝子発現はほぼゼロであり、酸性培養環境及び中性培養環境に関わらず、癌細胞系列では高発現を維持するRAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210を含む10個を標的分子候補として選択した（参照：表１及び図２下線）。
（標的分子候補遺伝子発現阻害）
実施例１で選択した１０個の標的分子候補のうち、RAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210を含む８個（上記表１）の各遺伝子発現に対して、lenti-viral shRNAを用いた各標的遺伝子特異的な発現阻害を行い、生存細胞の評価実験を行った。詳細は、以下の通りである。
lenti-viral shRNAによる標的分子候補遺伝子発現阻害の系とWST-8生存細胞評価の系（Cell Counting Kit-8, Dojindo）を組み合わせて、標的分子候補遺伝子発現阻害が細胞の増殖に与える影響を確認した。遺伝子阻害と殺細胞効果のスクリーニングにはヒト骨肉腫細胞（HOS）とヒト子宮頸癌細胞（HeLa）を用いた。正常細胞への毒性評価にはヒト間葉系幹細胞を用いた。
なお、各shRNAの配列は、以下の配列を標的配列とするshRNAを使用した。
○RAB39A：
標的配列１：TTGTAGCATCCTTTGCTGAGG（配列番号１）
標的配列２：TAAGATCGGGTTATTGATCTG（配列番号２）
○CPVL：
標的配列３：AACACTTCTGTATAGGGAGCG（配列番号３）
標的配列４：TAGTGCACTGTATAAATCCCG（配列番号４）
○LHX2：
標的配列５：ATCTTGTTACACGTGGTGCAC（配列番号５）
標的配列６：ATCTTCCAAGTTGTTCCTCGG（配列番号６）
○NUP210：
標的配列７：AAATGAGCTAATGGGCAGAGC（配列番号７）
標的配列８：AAAGAGCACTTCTAACTGCTC（配列番号８）
○PRAME：
標的配列９：AAATCTTCAATAGAGTCCAGC（配列番号９）
標的配列１０：TTAAGGTTGTAAGCTGGGAGC（配列番号１０）
○KCNG3：
標的配列１１：TAGCTTCAATTATCCCGGAGG（配列番号１１）
標的配列１２：AACACAGAGATGTAATACGGC（配列番号１２）
○FXYD6：
標的配列１３：ATTGGCGGTGATGAGGTTCTC（配列番号１３）
標的配列１４：TAGGATAAGGAGGATCCCAAC（配列番号１４）
○SLITRK5：
標的配列１５：TAACTCCAGATATTCGTTCCG（配列番号１５）
標的配列１６：AAGCATTGGGTTCAATGACGC（配列番号１６）
実施例１で選択した１０個の標的分子候補のうち、RAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210を含む８個（上記表１）の各遺伝子発現に対して、lenti-viral shRNAを用いた各標的遺伝子特異的な発現阻害を行い、生存細胞の評価実験を行った。詳細は、以下の通りである。
lenti-viral shRNAによる標的分子候補遺伝子発現阻害の系とWST-8生存細胞評価の系（Cell Counting Kit-8, Dojindo）を組み合わせて、標的分子候補遺伝子発現阻害が細胞の増殖に与える影響を確認した。遺伝子阻害と殺細胞効果のスクリーニングにはヒト骨肉腫細胞（HOS）とヒト子宮頸癌細胞（HeLa）を用いた。正常細胞への毒性評価にはヒト間葉系幹細胞を用いた。
なお、各shRNAの配列は、以下の配列を標的配列とするshRNAを使用した。
○RAB39A：
標的配列１：TTGTAGCATCCTTTGCTGAGG（配列番号１）
標的配列２：TAAGATCGGGTTATTGATCTG（配列番号２）
○CPVL：
標的配列３：AACACTTCTGTATAGGGAGCG（配列番号３）
標的配列４：TAGTGCACTGTATAAATCCCG（配列番号４）
○LHX2：
標的配列５：ATCTTGTTACACGTGGTGCAC（配列番号５）
標的配列６：ATCTTCCAAGTTGTTCCTCGG（配列番号６）
○NUP210：
標的配列７：AAATGAGCTAATGGGCAGAGC（配列番号７）
標的配列８：AAAGAGCACTTCTAACTGCTC（配列番号８）
○PRAME：
標的配列９：AAATCTTCAATAGAGTCCAGC（配列番号９）
標的配列１０：TTAAGGTTGTAAGCTGGGAGC（配列番号１０）
○KCNG3：
標的配列１１：TAGCTTCAATTATCCCGGAGG（配列番号１１）
標的配列１２：AACACAGAGATGTAATACGGC（配列番号１２）
○FXYD6：
標的配列１３：ATTGGCGGTGATGAGGTTCTC（配列番号１３）
標的配列１４：TAGGATAAGGAGGATCCCAAC（配列番号１４）
○SLITRK5：
標的配列１５：TAACTCCAGATATTCGTTCCG（配列番号１５）
標的配列１６：AAGCATTGGGTTCAATGACGC（配列番号１６）
（結果）
RAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210の発現阻害が、HOS癌細胞に非常に強い殺細胞誘導を起こすことを確認した。全ての対象遺伝子について、２種類以上のｓｈＲＮＡ処理において、発現阻害による効果を確認した。これにより、配列の類似する別の遺伝子が阻害された影響に依る可能性は、除外された。さらに、この癌細胞の殺細胞効果は、中性環境下培養でも酸性環境下培養に関係なく起こることを確認した（参照：図３−４）。なお、HeLa癌細胞でも同様な結果を得た。
一方、PRAME、SLITRK5、KCNG3及びFXYD6の発現阻害では、成長阻害効果は示すものの、十分な殺細胞効果は示さなかった。特に、酸性環境下での癌細胞の成長阻害、殺細胞効果は、乏しくなる傾向を示した（参照：図５−６）。なお、HeLa癌細胞でも同様な結果を得た。しかし、FXYD6、SLITRK5、KCNG3及びPRAMEについても、標的配列を改善することによって、十分な腫瘍阻害効果を示す可能性があり、癌治療標的分子となり得る。
さらに、RAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210の発現阻害は、明らかにヒト間葉系幹細胞（正常細胞系列）の毒性、殺細胞効果を示さず、緩やかな細胞成長を示した（参照：図７）。
以上により、RAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210の発現阻害は、単分子阻害でも、癌細胞に特異的且つ強力な殺細胞効果を示すことを確認した。これにより、RAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210は、新規な癌治療標的分子になる。
RAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210の発現阻害が、HOS癌細胞に非常に強い殺細胞誘導を起こすことを確認した。全ての対象遺伝子について、２種類以上のｓｈＲＮＡ処理において、発現阻害による効果を確認した。これにより、配列の類似する別の遺伝子が阻害された影響に依る可能性は、除外された。さらに、この癌細胞の殺細胞効果は、中性環境下培養でも酸性環境下培養に関係なく起こることを確認した（参照：図３−４）。なお、HeLa癌細胞でも同様な結果を得た。
一方、PRAME、SLITRK5、KCNG3及びFXYD6の発現阻害では、成長阻害効果は示すものの、十分な殺細胞効果は示さなかった。特に、酸性環境下での癌細胞の成長阻害、殺細胞効果は、乏しくなる傾向を示した（参照：図５−６）。なお、HeLa癌細胞でも同様な結果を得た。しかし、FXYD6、SLITRK5、KCNG3及びPRAMEについても、標的配列を改善することによって、十分な腫瘍阻害効果を示す可能性があり、癌治療標的分子となり得る。
さらに、RAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210の発現阻害は、明らかにヒト間葉系幹細胞（正常細胞系列）の毒性、殺細胞効果を示さず、緩やかな細胞成長を示した（参照：図７）。
以上により、RAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210の発現阻害は、単分子阻害でも、癌細胞に特異的且つ強力な殺細胞効果を示すことを確認した。これにより、RAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210は、新規な癌治療標的分子になる。
（標的分子の各癌での発現確認）
標的分子の各組織発現については、TissueScanTM cancer and normal tissue cDNA arrays (OriGene) を用いて、２２種の癌及び正常組織（全381症例）について、遺伝子発現量の比較解析を行った。
標的分子の各組織発現については、TissueScanTM cancer and normal tissue cDNA arrays (OriGene) を用いて、２２種の癌及び正常組織（全381症例）について、遺伝子発現量の比較解析を行った。
（結果）
RAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210の各分子の発現状態を確認したところ、各々の標的分子で発現レベルは異なるものの、多数の癌で発現していることを確認した（参照：図８−１１）。特に、RAB39A及びCPVLは、以下の癌で発現していることを確認した。
副腎腫瘍、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、子宮体癌、食道癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、白血病、精巣腫瘍、膵癌、前立腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌。
すなわち、患者由来の試料よりRAB39A及び／又はCPVLを検出することにより、上記癌の検査を行うことができる。また、腫瘍組織でのRAB39A及び／又はCPVLの発現レベルが高ければ、RAB39A及び／又はCPVLの標的治療対象になる。さらに、RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制させる化合物は、癌細胞増殖阻害剤、さらには抗癌剤になる。
RAB39A、CPVL、LHX2及びNUP210の各分子の発現状態を確認したところ、各々の標的分子で発現レベルは異なるものの、多数の癌で発現していることを確認した（参照：図８−１１）。特に、RAB39A及びCPVLは、以下の癌で発現していることを確認した。
副腎腫瘍、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、子宮体癌、食道癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、白血病、精巣腫瘍、膵癌、前立腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌。
すなわち、患者由来の試料よりRAB39A及び／又はCPVLを検出することにより、上記癌の検査を行うことができる。また、腫瘍組織でのRAB39A及び／又はCPVLの発現レベルが高ければ、RAB39A及び／又はCPVLの標的治療対象になる。さらに、RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制させる化合物は、癌細胞増殖阻害剤、さらには抗癌剤になる。
（総論）
以上の実施例により、本発明では、少なくとも副腎腫瘍、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、子宮体癌、食道癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、白血病、精巣腫瘍、膵癌、前立腺癌、胃癌、甲状腺癌、及び／又は膀胱癌に対する癌の検査方法、癌細胞増殖阻害剤、抗癌剤及び抗癌剤のスクリーニング方法を提供することができる。
以上の実施例により、本発明では、少なくとも副腎腫瘍、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、子宮体癌、食道癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、白血病、精巣腫瘍、膵癌、前立腺癌、胃癌、甲状腺癌、及び／又は膀胱癌に対する癌の検査方法、癌細胞増殖阻害剤、抗癌剤及び抗癌剤のスクリーニング方法を提供することができる。
新規な癌の検査方法、癌細胞増殖阻害剤、抗癌剤及び抗癌剤のスクリーニング方法を提供することができる。
Claims (7)
- 被験者由来の試料からRAB39A及び／又はCPVLを検出することを特徴とする癌の検査方法。
- 前記患者の癌は、副腎腫瘍、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、大腸癌、子宮体癌、食道癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、白血病、精巣腫瘍、膵癌、前立腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌から選ばれる１以上である請求項１に記載の癌の検査方法。
- RAB39A、CPVL、LHX2及び／又はNUP210の発現を抑制可能なRNAを含む、癌細胞増殖阻害剤。
- 前記RNAは、以下の塩基配列を標的配列とする請求項３に記載の癌細胞増殖阻害剤。
（１）配列番号１に記載の塩基配列
（２）配列番号２に記載の塩基配列
（３）配列番号３に記載の塩基配列
（４）配列番号４に記載の塩基配列
（５）配列番号５に記載の塩基配列
（６）配列番号６に記載の塩基配列
（７）配列番号７に記載の塩基配列
（８）配列番号８に記載の塩基配列 - 請求項４に記載の癌細胞増殖阻害剤を含む抗癌剤。
- 以下の工程を含む抗癌剤のスクリーニング方法、
（１）候補化合物を、RAB39A及び／又はCPVLと接触させる工程、
（２）前記候補化合物が、RAB39A及び／又はCPVLの機能及び／又は発現を阻害するかどうかを判定する工程、
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法。 - 以下のいずれか１以上の抗体を含む癌の検査キット。
（１）抗RAB39A抗体
（２）抗CPVL抗体
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050048535A1 (en) * | 2003-06-09 | 2005-03-03 | Santin Alessandro D. | Gene expression profiling in primary ovarian serous papillary tumors and normal ovarian epithelium |
| US20070099209A1 (en) * | 2005-06-13 | 2007-05-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing cancer |
| US20140038901A1 (en) * | 2011-04-01 | 2014-02-06 | Cornell University | Circulating exosomes as diagnostic/prognostic indicators and therapeutic targets of melanoma and other cancers |
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|---|
| LUO, H. ET AL.: "Down-Regulated miR-9 and miR-433 in human gastric carcinoma", JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. Vol.28/No.1:82, JPN6019002213, 16 June 2009 (2009-06-16), pages 1 - 9, ISSN: 0004091749 * |
| MORI, Y. ET AL.: "Small GTPase Rab39A interacts with UACA and regulates the retinoic acid-induced neurite morphology o", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 435, JPN6019030718, 23 April 2013 (2013-04-23), pages 113 - 119, ISSN: 0004091750 * |
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