JP2016537029A - 三次元dna構造におけるヌクレオチド配列の相互作用を分析する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)架橋されたDNAのサンプルを提供するステップ、
(b)該架橋されたDNAを第1の制限酵素で消化するステップ、
(c)架橋されたヌクレオチド配列をライゲートするステップ、
(d)架橋を解消する(reverse)ステップ、
(e)(d)に由来するライゲートされた分子を断片化するステップ、
(f)ステップ(c)において別のヌクレオチド配列にライゲートされたヌクレオチド配列の末端について富化するために、(e)に由来する断片を、第1の制限酵素の切断部位に隣接する配列を表す1つ以上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップ、及び
(g)相互作用に関与するヌクレオチド配列を同定するために、富化された断片のヌクレオチド配列を分析するステップ、
を含む、前記方法を提供する。
(a)サンプルを1つ以上の薬剤と接触させるステップ、及び
(b)本発明の第1の態様の方法を実行するステップであって、ステップ(a)が、サンプルに由来する架橋されたDNAを提供することを含む、ステップ、
を含み、(i)薬剤の存在下でのDNA相互作用と(ii)薬剤の非存在下でのDNA相互作用の間の差異が、DNAの三次元構造をモジュレートする薬剤を示す、方法を提供する。
・全ての制限断片は、5Cとは対照的に、「視点」として機能することができ、全てのそれらの相互作用は、短い若しくは長い距離にわたるものであれ、又は他の染色体に対するものであれ、同定され得る
・ゲノムの区画化は、HiCに必要であった大きな配列決定の労力を必要とすることなく、目的領域において同定され得、そのため、コストを大幅に低減する
・他の技術と比較した場合、遺伝子座のより良いカバレージ及び分解能が得られる。T2Cの分解能は、使用される制限酵素に基づくが、多くの場合、約1〜10Kb(6bp認識制限酵素では平均4〜5kb)である。これは、通常のHiCを用いて得られた通常の40Kbpビンよりも顕著に良好な分解能を提供する。
用語「三次元DNA構造」は、タンパク質分子中のアミノ酸配列の高次構造に類似した、DNA二重らせんが形成する高次構造、例えばループ及び折り畳みを有する、DNAを含む構造を意味する。構造は、DNAのみから成ってもよく、又はそれに加えてタンパク質などの他の分子を含んでもよい。クロマチンは、DNAとタンパク質の間の複合体の一例である。
本発明は、目的領域におけるヌクレオチド配列(複数可)と他のヌクレオチド配列の間の相互作用を分析することを含む。
3D DNA構造は、1つ以上のゲノム遺伝子座からなる又はそれを含む、ゲノムDNAを含み得る。
本発明の方法は以下のステップを含む:
(a)架橋されたDNAのサンプルを提供するステップ、
(b)該架橋されたDNAを第1の制限酵素で消化するステップ、
(c)架橋されたヌクレオチド配列をライゲートするステップ、及び
(d)架橋を解消する(reverse)ステップ。
架橋剤、例えばホルムアルデヒドは、タンパク質を、他の近隣のタンパク質及び核酸に架橋するために使用し得る。したがって、2つ以上のヌクレオチド配列は、これらのヌクレオチド配列(の1つ)に結合したタンパク質を介して架橋され得る。ヌクレオチド配列を直接架橋する架橋剤を含む、ホルムアルデヒド以外の架橋剤もまた、本発明において使用し得る。DNAを架橋する薬剤の例としては、限定されないが、UV光、マイトマイシンC、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、1,3-ブタジエンジエポキシド、シス-ジアミンジクロロ白金(II)及びシクロホスファミドが挙げられる。
架橋されたDNAは、第1の制限酵素で消化される。
次いで、消化ステップの後に、分子内相互作用及び適合性末端を介したDNAの接続を好む希釈条件下でのライゲーションが続く。
本発明の方法はまた、以下を含んでもよい:
(e)ライゲートされたDNAを、例えば第2の制限酵素(例えば4bp認識酵素)若しくは他のヌクレアーゼで、又は機械的せん断によって、断片化するステップ。後者の場合、DNA末端は、アダプター配列の付加を可能にするように、平滑末端化するように修復されてもよい。
ライゲートされたDNA分子は、当技術分野で公知の種々の方法、例えば第2の制限酵素又は他のヌクレアーゼでの消化によって; 放射線若しくは重イオンを用いて; 又は超音波処理若しくはせん断などの機械的手段によって、断片化されてもよい。
アダプターは、配列決定目的のために、すなわち、イルミナ法などの方法のための配列分析を可能にするために、ステップ(e)に由来する断片の末端にライゲートされてもよい。
本方法のステップ(f)において、ヌクレオチド配列断片は、相互作用するヌクレオチド配列を含む断片について富化するために、1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズされる。
好適には、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも15、20、25、30又は40ヌクレオチドの長さである。
(i)配列が反復的であり得る
(ii)第2の認識酵素部位(RE2)が、RE1部位に近すぎる
(iii)2つのRE1部位間にRE2部位がない(非特異的ヌクレアーゼ又は機械的断片化が使用される場合、これは適用されない)。
断片が、「相互作用」を表すものについて富化されると、相互作用に関与するヌクレオチド配列は、配列決定によって特徴付けられ得る。
サンプルは、架橋される又は架橋されることが可能であるDNAを含む任意の物理的実体であってよい。サンプルは、生物学的材料であってもよく、又はそれに由来してもよい。
典型的に、オリゴヌクレオチドプローブのセットは、支持体上に固定されるか、又はビーズなどの固体支持体上に捕捉される。支持体(例えば、固体支持体)は、様々な材料、例えば、ガラス、シリカ、プラスチック、ナイロン又はニトロセルロースで作製され得る。固体支持体に付着された場合、それは好ましくは硬く、平坦な表面を有する。典型的には、支持体は、約1〜10,000,000個の別々の空間的にアドレス可能な領域、又はセルを有する。約10〜1,000,000又は約100〜100,000又は約1000〜100,000個のセルを有する支持体が一般的である。セルの密度は、典型的に、平方センチメートル内に少なくとも約1000、10,000、100,000、又は1,000,000セルである。いくつかの支持体では、全てのセルを、オリゴヌクレオチドプローブのプールされた混合物又はオリゴヌクレオチドプローブのセットが占める。他の支持体では、いくつかのセルを、プローブのプールされた混合物又はオリゴヌクレオチドプローブのセットが占め、他のセルを、少なくとも合成方法により得ることができる純度の程度まで、オリゴヌクレオチドの単一の種類が占める。
溶液中のオリゴヌクレオチドプローブは、固体表面上に捕捉され得る部分を含有してよく、例えば、オリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジンビーズによって捕捉され得るビオチンを含有し得る。溶液中でのハイブリダイゼーションは、より効率的であり得る。
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で使用する場合、「核酸の鎖が塩基対を通して相補鎖と結合するプロセス」を含む。
T2Cは、公知の長距離の相互作用を同定する
この方法を試験し、これを他の方法と比較するために、本発明者らは、まず、染色体長距離相互作用についてコヒージョン(cohesion)及びCTCFの役割を研究するために以前使用され、Hi-C及び4Cデータが比較のために既に利用可能である、ヒト第11番染色体上のIGF/H19領域を選択した(図2)。
T2Cは、異なる生物学的材料に基づいて、異なる相互作用ネットワークを同定する
異なる遺伝子発現状態を、異なるクロマチン相互作用を有する異なる生物学的組織において検出できるどうかを試験するために、T2Cを、マウス胎児肝臓に由来するin vivoマウス初代赤血球細胞及びE12.5マウスに由来する脳細胞に適用した。よく研究されたβ-グロビン遺伝子座を、この遺伝子の周囲約2MBの領域における例として使用した。β-グロビンが、胎児脳細胞と比較して、初代赤血球細胞においてより高度に発現されることは十分に確立され、この細胞型においてこの遺伝子の周囲、及びこの遺伝子とその遺伝子座制御領域(LCR)の間に、より高密度の数の相互作用が予想される。β-グロビン領域を、6bp酵素としてHindIIIで消化し、799個のオリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子座におけるHindIII断片(724個の断片、その多くは反復的である)の末端をカバーするように設計し、架橋後にDpnIIで再消化した。
遺伝子の調節におけるクロマチン相互作用の役割の重要性は十分に確立されている。しかし、相互作用及びゲノムの区画化についての情報を提供するための、迅速、簡便且つ手頃な価格の技術の必要性が高まっている。T2Cは、これらのニーズを満たす。全ての制限断片は、「視点」として機能することができ、全てのそれらの相互作用は、短くても若しくは長くても又は他の染色体に対するものであっても(ここには示さず)、同定できる。したがって、複数の3C-seq、4C又は5Cの実験を行う必要はない。さらに、コストを大幅に増加させる、HiCについて必要であった大きな配列決定労力を必要とすることなく、T2Cを用いて、ゲノムの区画化を目的領域において同定することができる。
クロマチン単離及びライブラリー調製
マウス胎児肝臓E12.5由来のマウス初代赤血球細胞、マウス胎児脳細胞及びヒト胸部内皮細胞株(human breast endothel cell line、HB2)からの核を、単離し、架橋した。クロマチンを、6-カッター(マウス細胞についてHindIII及びHB2細胞についてBglII)で消化し、ライゲートし、脱架橋した。得られたライブラリーから、50μgのDNAを頻度の高い4-カッター(マウス細胞についてDpnII又はNlaIII、HB2細胞についてNlaIII)で消化した。これらのステップは全て、以前に記載された3C-seqプロトコールに従って行った(Stadhouders, R. et al. Nat Protoc 8, 509-524 (2013))。
得られたアダプター修飾DNAライブラリーを、NimbleGenハイブリダイゼーションシステム上でNimbleGen配列捕捉アレイプロトコール(NimbleGen Sequence Capture array protocol)(www.nimblegen.com/seqcapez)に従ってカスタムメイドNimbleGen配列捕捉2.1M捕捉アレイ(NimbleGen Sequence Capture 2.1M capture array)上で42℃で64時間ハイブリダイズさせた。捕捉されたDNA断片を、ハイブリダイズさせたアレイから溶出し、MinEluteカラム(Qiagen)を用いて精製する。捕捉されたDNA断片を、以下のようにPhusionポリメラーゼを用いたPCRによって増幅する: 98℃で30秒、24サイクルの(98℃で10秒、60℃で30秒、72℃で30秒)、72℃で5分最終伸長。PCR産物を、AMPure XPビーズを用いて精製し、30μlの再懸濁緩衝液中に溶出する。1μlを、DNA 1000アッセイを用いたAgilent Technologies 2100 Bioanalyzer上にロードし、ライブラリー濃度を決定し、質を確認する。
クラスター生成は、イルミナクラスター試薬調製プロトコール(Illumina Cluster Reagents preparation protocol)(www.illumina.com)に従って行われる。簡単に述べると、1μlの10nM TruSeq DNAライブラリーストックをNaOHで変性させ、9〜10pMに希釈し、フローセル上にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズされた断片を、イルミナペアエンド配列決定(Illumina Paired-end Sequencing)ユーザーガイドプロトコールに従って、順次増幅し、直鎖化し、末端ブロックする。配列決定プライマーのハイブリダイゼーションの後、合成による配列決定(sequencing-by-synthesis)を、製造業者のプロトコールに従って、101サイクルプロトコールを用いてHiSeq 2000シーケンサーを用いて行う。配列決定された断片を、HiSeq 2000を用いてNaOHで変性させ、インデックス・プライマーを断片にハイブリダイズさせた。インデックスを、7サイクルプロトコールで配列決定した。断片を、NaOHで変性し、順次増幅し、直鎖化し、末端ブロックする。配列決定プライマーのハイブリダイゼーションの後、3回目の読み取りの合成による配列決定(sequencing-by-synthesis)を、101サイクルプロトコールを用いてHiSeq 2000シーケンサーを用いて行う。
ゲノムの3D構造の決定
ゲノムの動的三次元クロマチン構造、及びその機能に対する明らかな共進化的関連-遺伝情報の保存及び発現-は、約130年の集中的な研究の後、依然として、我々の時代の中心的課題の1つである。この実施例では、マウス及びヒトのゲノムの詳細な3D構造が、全ての物理的ゲノム相互作用の新規な優れた選択的ハイスループット高分解能染色体相互作用捕捉(HRHTiCIC2)、スケーリング(scaling)分析、及びポリマーシミュレーションを組み合わせる既に目に見える手段によって、数塩基対〜メガ塩基対レベルで初めて直接決定され得る: 明らかに存在し、且つ異なって凝縮されるクロマチン繊維は、リンカーによって接続された約500〜1500kbpの明確なループ凝集体/ロゼット(サブ染色体ドメイン(sub-chromosomal domain))を形成する約30〜150kbpのループに折り畳まれる。複雑な(らせん状の)ループ及びループ-ループ構造が存在し、相互作用は、異なる細胞型又は機能的状態の間でほんのわずかではあるが有意な程度に変化する。さらに、スケーリング分析は、DNA配列とゲノム構造の間の緊密な進化の絡み合いを示して証明する。その結果、これは最終的に、ゲノムの詳細な構造的「配列決定」、及びしたがって、「ゲノム不確定性原理」の限界における真のシステムゲノミクスへの道を開き、これら全ては、ゲノム理解、並びに診断及び治療のR&Dのために根本的に重要である。
配列読み取りの高い数にもかかわらず、そして非若しくは自己ライゲートした断片のエントリーを示し、したがって、捕捉オリゴが存在し、働いたことを実証する大部分の対角線エレメントにもかかわらず、異なる実験の全ての相互作用マトリックスが、再現可能であり、再現可能に多かれ少なかれ空である(empty)、すなわち、顕著な均一なノイズ又はバックグラウンドは存在しない。「空であること(emptiness)」はまた、明確に構造化され、偶然のものではなく、細部の極めて高度まで反復して同じに見える、すなわち、相互作用は統計学的に突然出現しているのではなく、より顕著な相互作用に近い場所で統計的にクラスター化されてもいない。したがって、確かに>104細胞が手順を生き残り、ノイズが原理的に手順のどの段階でも現れ得ることからの情報を考慮し、さらには例えば相互作用に対する通常の分散型ノイズシグナルの起こりそうもなく高度に偏った歪みを仮定すると、ノイズに対するシグナルの比は、>105〜106である必要がある。
最小のゲノムスケールにおいて、より大きなゲノム分離と比較して、ゲノム分離<5〜10kbp(すなわち<25〜50ヌクレオソーム)についての対角線に並行なバンドにおける密度のより高い相互作用パターンが明らかに存在する。このパターンは、局所的断片分解能とは無関係に変化し(それにもかかわらず、考慮される必要がある)、間にある相互作用しない「ギャップ」との明らかな相互作用からなり、増加したゲノム分離に対して減少する、均一な、例えばガウス(Gaussian)様の相互作用「スミア(smear)」とは対照的である。したがって、結果として、目視検査は、このスケール-DNA/ヌクレオソームのスケール-で、安定で、規定された相互作用が存在することを既に直接的に示し、したがって、これらの相互作用は空間的近接の結果であるため、ヌクレオソームの不規則であるがそれにもかかわらず局所的に規定された構造への凝縮が存在することを示し、すなわち、繊維の概念が適用され、これは、一般的な用語で、そのバリエーションに起因して、平均密度等を有する「疑似繊維(quasi-fiber)」と呼ぶことができる。明らかに、らせん状クロマチン繊維モデルによって提案されるように、構造的にどこでも全く同じで均一な繊維は、対照的に、均一なバンド状のサブパターンにつながり、ヌクレオソームの常に動的なランダムウォークはまた、ゲノム分離に応じたレイリー分布(Reighley distributed)相互作用減少を有する均一な相互作用パターンをもたらす。したがって、目視検査によって、クロマチン「疑似繊維」の存在、その局所的相互作用、及びしたがってT2C手順境界(procedural boundary)全体にわたって自然に平均化された凝縮構造を直接的に読み出すことができる。
最大のスケールにおいて、シャープな境界及び他のドメインとの相互作用を有する、数百から約1〜1.5Mbpの範囲での四角様ドメインの出現がまた、いくつかの顕著な一般的特徴を伴ってすぐに目に見える(マウスの場合と比較してヒトではより顕著であるが)。まず、それらのサブ構造を無視する瞬間についてのドメイン内の相互作用頻度は、一般に平均的な均一な高さを有し、サブドメイン間の相互作用を規定する別の均一な高さへと端において落ちる。したがって、増加するゲノム分離、及び他のドメインとの明確ではっきりした相互作用を伴うしばしば考えられる一般的な連続的相互作用減少とは対照的に、相互作用の階段様の挙動がある。第二に、対角線の近くではまた、クロマチン疑似繊維は活動し始め、さらに、リンカーは構造的観点では非常に柔軟であるため、ドメイン間の相互作用は特に強く複雑であるが、ドメインの境界には、明らかな遷移(transition)又はリンカー領域がある。したがって、これらの結果は、再び、構造的に安定なサブ染色体単位の存在を証明し、これは、歴史的概要に記載されているように、比較的安定であり、それらの境界において特によく互いに相互作用する。さらに、既にこのレベルにおいて、ドメイン内の平均的に均一な相互作用及び端での急激な低下は、リンカーによって接続されたドメインのループ-凝集体及びさらにはロゼット様構造に向けて既に非常に明確に示す。1つの大きなループ、ランダムウォーク、又はフラクタル小球(fractal globule)様折り畳みは、全て、ここで見られた鋭い端及び規定の挙動を導かないためである。
中間のスケール、及びしたがってサブ染色体ドメインレベルでは、相互作用パターンは、交差した直鎖状又は格子様パターンで配置される、相互作用間の再び明確に区別できるギャップによって特徴付けられる。興味深いことに、直鎖状パターンはサブ染色体ドメインの外側に続き、次のサブ染色体ドメインから生じる直鎖状パターンとそこで「交差」する。さらに、ドメインの外側の一般的な、より低い一般的相互作用頻度レベル、及びそこで見られるあまり複雑でない相互作用パターンは、直鎖状パターンに従ってドメインに戻ることを可能にし、これは、外側のはるかにより簡単で/明確なパターンが、ドメイン内にも明らかに存在するが、さらなる相互作用によってそこで富化されより複雑であることを明らかにする。そのような線に従い対角線に戻り、次の関連する相互作用に垂直方向に従ってこれを開始視点と受け取ることがここでできる(外側からドメインへ水平方向に従うことが再びできる)。次いで、対角線上の相互作用点を再び水平方向に見つけ出す。これを繰り返すことは、対角線上の第2の相互作用点を与え、ここで、ほとんどの場合、この第2の相互作用はまた、第1の及びしたがって開始点と相互作用することを証明することができる。したがって、手動で、相互作用の格子を構築することができる。これは、垂直方向及び水平方向に相互作用を投影することによって向上させることができ、これは、染色体配列に沿ってピーク様パターンをもたらし、このピークは、交差した直鎖状パターンと一致する。これは、マウスの場合と比較して、ヒトにおいてより顕著である。数万塩基対のスケールでの相互作用は、特にクロマチンループ化とみなされ、また、そのようにみなすことのみができるため、これは、そのループ塩基が相互作用よって可視化されるいくつかの連続するループが、一致するループ塩基、すなわち、コアを有するループ凝集体、及びしたがって、多かれ少なかれ明確なコアを有するループのロゼットも有することを意味する。相互作用と格子様パターンとの間のギャップはまた、ランダム-ウォークジャイアントループ、染色糸様、又はフラクタル小球パターンのような他の折り畳みが、それらは全て、明確なドメイン境界を持たず、区別できるドメイン境界を明らかに持たない、均一な相互作用パターンをもたらすため、その起源であり得ないことを示す。これはまた、多数のヌクレオソーム構造が予測する、疑似クロマチン繊維への非凝縮に当てはまり、これは、巨大で、非常に動的な相互作用の可能性をもたらす。注目すべきことに、異なるスケールでのデータ構造はまた、全てのスケールにおいて相互作用が実際にクロスリンクし、異なる、根底にある架橋可能薬剤に依存し得るという仮定がまた正しいこと、及びしたがって特定のDNA位置又はタンパク質などの間の架橋がこのようなパターンを作製するという仮定がほとんどあり得ないことをを証明する。さらに、単純なパターンは、クロマチンの凝縮密度のバリエーション、及び、ループ内で様々な形態のさらなる相互作用が生じるという事実に起因して、より複雑である: 大きなスケールでは、単純ループ又は超らせん様パターンさえありそうに思われるが、一方、低いスケールでは、主要なループ塩基相互作用の周りのパターンは、ロゼットコアの構造、及び局所的クロマチン凝縮、及びそこでの両者の絡み合いを示す。最高分解能での実験は、一般的には、より詳細にクロマチン繊維コンホメーションを調べるためになされ、したがって、あまり深くない配列決定を伴ったが、これらのデータの全体的な評価は、実際に、ループ凝集体/ロゼットに、及び特別な相互作用パターンを導く、ループ内及びループ外部の詳細なコア構造に起因し得る、いくつかのこのような構造を見出す結果となった。ドメインとそれらのパターンとの間の相互作用は、したがって、2つの起源に帰することができる: 一方では、その後のドメインのループ凝集体/ロゼットコアは、比較的低い数のループ及びしたがって密度に起因することができ、ループダイナミクスは非常に容易に相互作用する。他方では、細胞集団において、凝縮度が当然非常に高い有糸分裂染色体もある。したがって、パターンは、細胞周期を通して構造及びそのダイナミクスの両方を一貫して説明し、再び、これは、凝縮したクロマチン繊維でのみ可能である。そうでなければ、凝集体/ロゼットコア間のコア相互作用は、ポリマー繊維の排除によって遮断されるためである。
制御、又は意図的なシステムの歪みに起因した、一般的に、種、細胞型、領域的、機能的若しくは構造的差異に応じた構造変化を調べるために、ヒトHB2及びTEV/HEV細胞、並びにマウス胎児脳(FB)及び肝臓(FL)細胞において、ヒトIGF/H19 11p 15.5-15.4領域を調査し、マウスβ-グロビン7qE3-F1を調査した。一般的な一般的なドメインは、HB2、TEV、HEV、並びにFB及びFL細胞において、したがって、同じ種の異なる細胞型において明らかに同じであるが、選択した領域に少なくとも起因してヒトとマウスの間では異なる。詳細のより細かい程度では、ヒトHB2細胞は、TEV/HEVシステムと比較して、ドメイン内のより多くの、より密な相互作用パターンを示すようである。FBをFL細胞と比較すると、このような明らかな差を示さない: 以前の実験から予測されるように、追加のループが形成されるβ-グロビン遺伝子座について示され得るように、実際に、差異は、単一又は小グループの相互作用に属することが多い非常に微妙なものである。それにもかかわらず、ここでの小(small)という用語は、相対的なものである。なぜならば、そのような単一のループ形成は、実際にβ-グロビン転写、すなわち全体の経路を活性化し、したがって、細胞の全体の特性が変更され得るからである。さらに、しかし、TEV/HEVシステムにおいてコヒージョン(ゲノム構造において主要な構成的役割を果たすと言われている)を切断することは、また、劇的な変化を導かず、十分実際にはわずかにより多くの均等に広がった相互作用を導き、これは、わずかにより高い柔軟な/動的構造であるが、ゲノムワイド解析において以前考えられていたほど大きくないことを示唆する。したがって、コヒージョンは、単一の、及び間違いなく主要/単一成分原因物質ではあり得ず、代わりに、ゲノム構造に影響を与える/形成する、明らかないくつかの成分の一つであり、ゲノム構造の柔軟性と安定性の間の進化的バランスを示す。その結果、これらのバリエーションは、異なる条件下でのT2C及びその分析の再現性のある質、及び明確な一般的ゲノム構造が存在することを示すだけでなく、全ての細部における局所的に、本質的に、ゲノム不確定性原理の到達レベルが、システムを微調整するために考慮すべき大きなテーマのバリエーションであることを示す。したがって、明らかに、約2Mbpのみの大きなゲノム領域において、慎重に詳細に分析するための、大量の相互作用データが存在する。
予め設定された条件を用いて独立してより明確な方法で全てのスケールでこの挙動を探求し、理解するために、三次元ゲノム構成に関する一般的実験結果、設計及び仮説を評価するために(フィットさせるようにではなく)、最近、ポリマーモデルが開発されている。そこでは、分解能が、伸縮可能な、屈曲可能なポリマーセグメントに基づき、体積排除(volume exclusion)は、約1〜2.5kbpと同等の分解能を持ち、大きなループ(0.5〜5.0Mbp)が柔軟な骨格に似ているリンカーによって連結されているランダム-ウォーク/ジャイアント-ループモデルを特徴とし、及び可変サイズ(60〜250kbp)のリンカーによって連結されたより小さいループ(60〜250kbp)を有するロゼット様凝集体(0.5〜2Mbp)を用いたマルチ-ループサブコンパートメント(MLS)モデルを特徴とする。これらのシミュレーションは増強され、初めて、二次元空間距離及び相互作用マップ(異なる架橋確率及び程度について)が、極めて高い統計的妥当性を用いて計算された。視覚的比較は、全ての上述の効果解釈が、シミュレーションと一致していることをすぐに明らかにし、さらに、相互作用は、ヌクレオソームがここでモデル化されていないことを考慮すると、わずかな詳細においてさえ、全てのモデルパラメーターの関数である: (i)一般的に相互作用の程度は、相互作用及び架橋確率に依存し、(ii)ドメインサイズ、ドメイン分離、及びループの間隔は、それらのサイズに比例し、(iii)ドメイン間の相互作用は、リンカーサイズ、ループのサイズ及び数、すなわちロゼットの密度に依存する。したがって、ロゼットの密度の微妙な組み合わせは、ループサイズ、ループ数、クロマチン繊維持続に起因し、こうして得られた排除効果は、最終的に、高い数が広がることを導き、ロゼットの遮断効果、及びドメイン全体の間の相互作用パターンに対する微妙な影響をもたらす。ドメイン間のリンカー及びドメイン間相互作用に対するその比例性は、本発明者らが凝集体/ロゼット境界におけるループの相互作用の理解及び類似効果を作製するためにここで意図的に示す、非平衡効果と同様に、明らかに目に見える。また、相互作用マトリックスの一般に大きな空虚(emptiness)及び専用の(dedicated)クロマチン繊維の存在に対するリンクは、明らかであり、また、関係が明確にフィット可能ではない複雑すぎるパラメーターセットを含有するためであるが、架橋確率、範囲(radius)及び頻度が、比較的低いと推定され得ることを示す。最高分解能を有する実験は、様々なこのような構造が存在するが、将来、はるかにさらに詳細に調査する必要があることを示すが、モデルはまた、ロゼットのループ塩基における特別な挙動を明らかに示し、これは、現実には、凝縮のバリエーションに起因して、現実にはより複雑であり得る。
統一されたスケール-橋渡し様式で、数塩基対のスケールから、メガ塩基対及びサブドメインレベルを介して、染色体全体及びしたがって核のスケールまで(10-9〜10-5mのスケールに及ぶ)の挙動を調べるために、本発明者らは、スケーリング分析を導入し、その能力を示した: 異なるシミュレートされたモデルによって与えられるゲノム分離に応じた相互作用頻度のスケーリングは、(i)一般的相互作用減少、すなわち、空間的距離増加、(ii)サブ染色体ドメイン様構造、(iii)サブドメインにおける凝集したループ/ロゼット様構造、に起因する、微細構造を有する多重スケーリング挙動を有する、長距離スケーリングを明らかに示す。全てのパラメーターバリエーションは、ここでスケールにおける変更されたスケーリング挙動において再び見出され得る。これは、スケーリングの他の手段と一致している。したがって、例えば、全てのスケールを橋渡しする自己相似フラクタルにおいて見られるような、及び全てのスケールにおいて同じである、統一スケーリングはないが、その偏差は、ドメイン及びループ内の下部構造を示す。
HB2細胞株及び細胞培養
HB2細胞(1-7HB2、ヒト乳腺管腔上皮細胞株MTSV1-7のクローン誘導体)を、0.2mM L-グルタミン、100単位/ml ペニシリン、100mg/ml ストレプトマイシン、10%FCS、5μg/ml ヒドロキシコルチゾン、及び10μg/ml ヒトインスリンを補充したDMEM中で培養した。以前3C研究において、本発明者らは、核型、及びいくつかの領域のDNAメチル化を確認した。
切断可能なTEV/HRV RAD21-eGFP細胞株システムは、HEK293T細胞株システムであり、これは、切断可能なRAD21-eGFP融合タンパク質、及び内因性RAD21ノックダウンのためのsiRNAをコードするpRTS-1ベクターでトランスフェクトされた。両者は、間にある双方向プロモーターのドキシサイクリン誘導活性化によって、したがって同時に発現される。RAD2-eGFP融合タンパク質について、第1のRAD21-セパレース(separase)切断部位が、PCRベースの突然変異誘発を用いて、ヒトライノウイルスの3Cプロテアーゼ(HRVプロテアーゼ)のもので置き換えられている(第2の切断部位は少ない細胞の細胞障害性を確保するために変化しないままであった)、切断可能RAD21をeGFPの前に挿入した。タバコエッチウイルスプロテアーゼ(TEVプロテアーゼ)はHRV切断部位を認識せず、したがって、コントロールとして作用し得る。内因性RAD21ノックダウン配列は、次の3'UTRに向けたsiRNAを用いてノックダウンを可能にする:
5'-ACUCAGACUUCAGUGUAUA-3'(Scc1-1)、
5'-AGGACAGACUGAUGGGAAA-3'(Scc1-2)。
マウス胎児肝臓及び胎児脳細胞について、1〜2個のトランスジェニックFVB/Nマウスの妊娠12.5日目の約10個の胚を、十分複雑な細胞集団及び最後に配列決定される十分なDNAを有するために、実験で必要とされる約1000万個の細胞のために使用した。マウスを70%EtOHで洗浄し、腹部を開いて、胚を含有する頸部を取り出し、その後、それらを切り離し、卵黄嚢及び胎盤からそれらを取り出した。小さく、未発達の胚を廃棄した。胚を、0.5mlの10%FCS/PBSを有する氷上のペトリ皿中で収集する。次いで、胎児肝臓及び脳を胚から切断し、再び500μlの10%FCS/PBSを含有する氷上のチューブ(1ml)中に収集した。次いで、細胞を、P1000/1mlプラスチックピペットチップを用いて再懸濁し、結合組織を、25□lの2.5%コラゲナーゼストック(0.125%最終濃度)を添加することにより消化し、37℃で約45分間インキュベートした。その後、細胞懸濁液を、室温で12mlの10%FCS/PBSを有するファルコンチューブに移し、その後、再びP1000/1mlプラスチックピペットチップを用いて、6ウェルプレートの内部に配置されたスクレーパーメッシュを通して穏やかにつぶした。メッシュを、室温で2mlの10%FCS/PBSで洗浄し、メッシュから全ての細胞を得た。得られた単一細胞懸濁液を、室温で12mlの10%FCS/PBSの最終体積を有するファルコンチューブに再び回収した。注目すべきことに、本発明者らは、細胞核への損傷を避けるために、細胞のストレスを最小限に維持しようとした。再懸濁、コラゲナーゼ処理後、及び/又は胎児肝臓及び脳材料/細胞のスクレーピング後の両者を、スライドガラス上にスポットし、DAPIでの核の染色(又は最終的には任意の他の免疫蛍光若しくは蛍光in situハブリダイゼーション)あり又はなしで、顕微鏡によって細胞の、及び特に核の完全性を確認した。
ゲノム及び細胞全体の架橋/固定のため、細胞を、最初に計数し、それらの濃度を、室温で12mlの10%FCS/PBS中で1000万個に調整し、15mlポリプロピレンチューブ(細胞培養に使用され、したがって、管壁に過度に細胞を吸収/固定しない、Greiner Bio One)に入れた。次いで、650μlの37%ホルムアルデヒドPBS溶液を、細胞凝集を回避するために穏やかに転がしながら10分間室温で加え、すなわち、ホルムアルデヒドの1.9%の最終濃度を架橋/固定のために使用する。注記: この段階での架橋/固定のためのホルムアルデヒドの濃度は、次のステップのために、及び本発明者らがここで使用したヒト及びマウス細胞の細胞/核完全性に関して理想的である; これは一般的に適用できるかもしれないが、他の濃度及びインキュベーション時間がより良い結果を達成する場合が知られている。このように、チューブを氷上に置き(これからは、本発明者らは、材料のいずれもの損傷を避けるために、DNAの第1制限(下記参照)まで全てを氷上に保持した)、PBS中の1.6mlの冷1M グリシンを、架橋/固定反応を停止するために加えた。その後、細胞を4℃で1300rpmで8分間スピンダウンし、得られたペレットを氷冷PBSで洗浄し、1ml最初に取り、その後、14mlのPBSまで加え、次いで、再び4℃で1300rpmで8分間スピンダウンした。本発明者らは、溶解及び第1制限にすぐに続けることを勧めるが、上清を廃棄した後、ペレットはここで保存のために凍結することもできる。再び細胞を、スライドガラス上にスポットし、DAPIでの核の染色あり/なしで、顕微鏡によって細胞の、特に核の完全性を確認した(注記: 再び最終的には任意の他の免疫蛍光若しくは蛍光in situハブリダイゼーション実験のために細胞をここで使用することもできる)。
細胞の溶解のため、及び細胞核を調製するために、本発明者らは、10mM Tris pH8.0(50μl 1M)、10mM NaCl(10μl 5M)、0.2%NP-40(100μl 10%)、100μlの50×コンプリートprot. Inhib.(50×=1mlのPBS中に1錠)からなる、5mlの新鮮な(完全な活性のため)溶解緩衝液を氷上で(!)常に調製し、5mlまでMilliQで充填した(4.74ml)。架橋/固定の最後のステップで調製されたペレットを、1mlのこの溶解緩衝液中に取り、再懸濁し、別の4mlで合計5mlまで充填し、氷上で10分間インキュベートした。ここで遊離の細胞核を4℃で1800rpmにて5分間スピンダウンし、ペレットを0.5mlの氷冷PBSセーフロックチューブ中に取り、4℃で2600rpmにて1分間遠心した。再びここで、上清を除去及びスナップ凍結後に、-80℃で核を保存することができる。確認のために、本発明者らは常に、核をスライドガラス上にスポットし、顕微鏡及び/又はDAPIでの核の染色によって核の完全性を確認した。
その後、完全に消化された核材料を、50mlファルコンチューブへ移し、6.125mlの1.15×ライゲーション緩衝液(6.125ml: 5421ml MilliQ+704μlライゲーション緩衝液)を添加することによって希釈した。次いで、375μlの20%Triton-X-100(最終濃度1.0%)を加え、手で10分毎に振とうしながら、1時間、37℃の水浴中でインキュベートした。次いで、20μlのリガーゼHC 5U/□l(合計で100U、Roche)を添加し、一晩(約20時間)16℃でインキュベートし、その後、室温でさらに30分間インキュベートした。ライゲートしていないDNA及びライゲートしたDNAを脱架橋するために、30μlの10mg/mlプロテイナーゼKを添加し、一晩(約20時間)水浴中で65℃でインキュベートした。再び、再ライゲーション及び脱架橋の将来のコントロールのために、ここで5μlのアリコートを採取し、-20℃で保存した(いわゆる再ライゲーション/脱架橋コントロール)。
サンプルのさらなる処理のために、まず、DNAを、30μlの10mg/ml RNAse(合計300μg)を添加し、30〜45分間37℃でインキュベートすることによって精製し、その後、室温まで短く冷却し、7mlのフェノール−クロロホルムを添加し、激しく振とうした。次いで、サンプルを、15分間4,000rpm(2200xg)で遠心分離し、その後、上相を新しい50mlチューブに入れ、7mlのMilliQ、及び1ml当たり1μlのグリコーゲン、1.5mlの2M酢酸ナトリウムpH5.6を加え、精製を増強するために35mlの100%エタノールを加え、穏やかであるが完全に混合し、その後、1.5〜3時間-80℃に入れた。この後に、15分間4,000rpm(2200xg)の直接遠心分離、上清除去、10mlの70%EtOHの添加、再懸濁、及び15分間4℃での4,000rpm(2200xg)での再びの遠心分離が続いた。上清を除去した後、ペレットを20分間乾燥させ、30分間37℃で150□lの10mM Tris pH7.5に溶解した。再び再ライゲーション及び脱架橋の将来のコントロールのために、ここで5μlのアリコートを採取し、-20℃で保存した(いわゆる第1精製コントロール)。
様々な段階でのDNAの完全性のコントロールのために、次のコントロールを使用した: (i)第1非制限コントロール、(ii)第1制限コントロール、(iii)再ライゲーション/脱架橋コントロール、(iv)第1精製コントロール、及び(v)第2制限/最終精製コントロール。これらのサンプルを、外部制限コントロールとして一緒に制限し、再ライゲートし、精製された対応するプラスミドDNAと共に2%アガロースゲル上でコントロールした。(i)〜(iii)のコントロールについて、アリコートを、少なくとも1時間、65℃で90μlの10mM Tris pH7.5中で10μlのプロテイナーゼK(10mg/ml)と共にインキュベートした。DNAを3μlの10mg/ml RNAseを添加し、30〜45分間37℃でのインキュベーションによって精製し、その後、室温まで短く冷却し、500μlまでMilliQ(約400ml)を添加し、500μlのフェノール−クロロホルムを添加し、激しく振とうした。次いで、コントロールを、15分間13,200rpmで遠心分離し、1ml当たり2μlのグリコーゲン、50μlの2M酢酸ナトリウムpH5.6及び850μlの100%EtOHを加え、穏やかであるが完全に混合し、スナップ凍結し、その後、20分間13,200rpmの直接遠心分離処理を行い、次いで、上清除去、1mlの70 EtOHの添加、4℃での13,200rpmでの遠心分離、新たな上清除去、20分間のペレット乾燥、及び30分間37℃にて20μlの10mM Tris pH7.5中の溶解が続いた。
一般に、DNA T2C断片ライブラリーを、本発明者らからの増強改変を有するIllumina TruSeq DNAプロトコールに従ってイルミナクラスターステーション(Illumina Cluster Station)及びHiSeq 2000シークエンサー上での配列決定分析のために調製した(www.illumina.com、TruSeq DNAサンプル調製LSプロトコール; パート#15026489 Rev. C); (i)DNA断片の精製、(ii)平滑末端状態に達するための末端修復、(iii)キメラを回避するための3'末端アデニル化、(iv)最終的な多重化ステップを含む、配列決定アダプターライゲーション、及び最後の(v)T2C全ゲノム配列決定DNA断片ライブラリーの精製。
高分解能を達成し、ハイスループット多重化配列決定を可能にし、したがって、高度に関連性ある局所的相互作用マッピングを達成するために、すなわち、高品質のT2C2を達成するために、特別な捕捉アレイを、不要なバックグラウンドの配列決定を回避し、目的ゲノム領域について特異的に選択するように、すなわち、第1の制限後の再ライゲートされたDNA片の選択について、すなわち、特異的且つ比較的小さなゲノム領域のみにおける相互作用について直接的に、最適化された領域的DNA配列決定ライブラリーを作製するように、設計した。したがって、NimbleGenとの緊密な協力の下で、本発明者らは、2.1M捕捉アレイ、すなわち、同じ量の異なるオリゴを用いて210万個の異なるゲノム配列を原理的には捕ることが可能な捕捉マイクロアレイ、についてのDNAオリゴを設計した。真の高品質な結果を達成するために、核全ゲノム制限に使用した第1の制限部位のできるだけ近くに、T2Cの1つのみ(!)のオリゴを上流に、1つを下流に配置した。この第1の制限の再ライゲーション後の各側の配列決定に関心があるためである。オリゴを、72±3bpのオリゴ長、全ゲノムにおける固有の出現(ミスマッチは許容されない)を有するゲノム構築(builts)mm9及びHG19を用いて、並びにマイクロアレイ上の最良且つ類似の、すなわち、類似のハイブリダイゼーションの、捕捉に関して、ヒト及びマウスのゲノムの選択された領域について、NimbleGen及び本発明者らが設計した。次いで、オリゴをさらに選択した: 配列決定のために再ライゲートしたDNAライブラリーを短くするための第2の制限酵素を用いる場合、オリゴは第1の制限部位と第2の制限部位の間に位置しなければならなかった。再ライゲートしたDNAを短くするために超音波処理を用いる場合、第1の制限部位の150bp以内のオリゴのみを選択した。第1の制限部位又は第2の制限部位又は両制限部位さえのいずれかを交差した1つだけのオリゴが存在した場合、オリゴの開始又は終了の合計で10%以下での切断のみが許容され、すなわち、オリゴは、特異性及び類似のハイブリダイゼーション効率を保証するために、最小62bpを有するDNA片を確かに捕捉することができた。同じ条件を、第1の制限側について、超音波処理の場合に適用した。その後、本発明者らは、ゲノム上にオリゴをマッピングし、条件が満たされたかどうか、及びオリゴが他のゲノムの特徴に関して適切に配置されたかどうかを手動で制御した。マイクロアレイの製造のために、210万個の可能な異なるオリゴの数Oアレイを、選択されたオリゴの数O選択によって除算し、その後、選択された各オリゴを、NimbleGenによる捕捉マイクロアレイの製造プロセスの間に実際の捕捉アレイ上にNスポット回、スポットした(Nスポット=Abs(Oアレイ/O選択))。したがって、第1の制限酵素及び第2の制限酵素を使用して捕捉(下記参照)のために使用されるオリゴの数を用いて、本発明者らは、マイクロアレイ上にそれぞれ異なるオリゴについて約1010個のオリゴ分子を必ず有することができ、したがって、本発明者らが入力として使用する107個の細胞を用いて、本発明者らは、>105〜106倍、アレイの飽和から離れている。約250倍多くのオリゴ及びカバーされる合計約50倍多くのゲノム領域を用いる超音波処理を使用する実験の場合、捕捉アレイまでの実験手順における損失を考慮すれば、それは依然として>102である。
T2C全ゲノムDNA断片配列決定ライブラリーから下位選択された領域的T2C DNA断片配列決定ライブラリーを作製するために、配列決定アダプターのライゲーション後のプールされたDNAライブラリーを、(www.nimblegen.com/seqcapez、NimbleGenアレイユーザーズガイド、配列捕捉アレイデリバリー(Sequence Capture Array Delivery)バージョン3.2)からの増強改変を有するNimbleGenアレイ捕捉プロトコール及びハイブリダイゼーションシステムを用いた、上述の新たに且つ特異的に開発された捕捉マイクロアレイを使用した下位選択に供した。全手順は、(i)マイクロアレイハイブリダイゼーション、(ii)洗浄、その後の(iii)捕捉された領域的DNAライブラリーのマイクロアレイからの溶出からなった。
まず、ペアエンド配列決定のために、T2C領域的DNA断片配列決定ライブラリーを、最初に、98℃で30秒、12サイクルの(98℃で10秒、60℃で30秒、72℃で30秒)、72℃で5分間の最終伸長を使用するPhusionポリメラーゼを用いたPCRにより、配列決定のために富化した。各1μgのT2C領域的DNA断片ライブラリーについて、5μlのPCRプライマーカクテル及び25μlのPCRマスターミックスをPCRプレートに添加した。精製のために、AMPure XPビーズ(Beckman Coulter)を、1.0μlのDNA当たり1.8μlのAMPure XPビーズを添加することによって使用した。これを5分間室温でインキュベートし、磁気スタンド上に置き、5分間室温でインキュベートし、上清をビーズを乱さずに廃棄した。ビーズを新たに調製した70%エタノールで2回洗浄し、ビーズを乾燥させるために5分間37℃に置いた。次いで、ビーズを30μlの再懸濁緩衝液に再懸濁し、5分間室温でインキュベートし、5分間磁気スタンド上に置き、最後に50μlの上清を新しいチューブに移した。精製された消化されたDNAの質を決定するために、1μlを、DNA 1000アッセイを用いてAgilent Technologies 2100バイオアナライザー上に最終的にロードした。
生配列読み取りを、配列決定方向における第1の制限酵素認識配列の存在について確認した。最初の酵素認識部位の後の配列を除去した。オーバーハング後の認識部位の塩基がはっきりしていなかった場合、読み取りを、オーバーハングの末端後の全ての塩基を除去することにより、トリミングした。次いで、これらのトリミングされた配列を、全ヒトゲノムNCBI36/hg18アセンブリーに対して、及びマウスNCBI37/mm9アセンブリーに対してBurrows-Wheelerアライメント(BWA)ツールを使用してアラインさせた。したがって、以下のデフォルトパラメータセットを(括弧[]内のパラメーターの値を用いて)使用した:
Claims (43)
- 三次元DNA構造における1つ以上の目的領域に由来する1つ以上のヌクレオチド配列の、他のヌクレオチド配列との相互作用を分析する方法であって、
(a)架橋されたDNAのサンプルを提供するステップ、
(b)該架橋されたDNAを第1の制限酵素で消化するステップ、
(c)架橋されたヌクレオチド配列をライゲートするステップ、
(d)架橋を解消する(reverse)ステップ、
(e)(d)に由来するライゲートされた分子を断片化するステップ、
(f)ステップ(c)において別のヌクレオチド配列にライゲートされたヌクレオチド配列の末端について富化するために、(e)に由来する断片を、第1の制限酵素の切断部位に隣接する配列を表す1つ以上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップ、及び
(g)相互作用に関与するヌクレオチド配列を同定するために、富化された断片のヌクレオチド配列を分析するステップ、
を含む、方法。 - 三次元クロマチン構造における1つ以上の目的ゲノム領域に由来する1つ以上のヌクレオチド配列の、他のヌクレオチド配列との相互作用を分析するための、請求項1に記載の方法。
- 第1の制限酵素が、6〜8bpの認識部位を認識する制限酵素である、請求項1又は2に記載の方法。
- 第1の制限酵素が、BglII、HindIII、EcoRI、BamHI、SpeI、PstI及びNdeIからなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(e)において、ライゲートされた分子が、第2の制限酵素による消化によって断片化される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の制限酵素が、4又は5bpのヌクレオチド配列認識部位を認識する、請求項5に記載の方法。
- 第2の制限酵素が、TspEI、MaeII、AluI、NlaIII、HpaII、FnuDII、MaeI、DpnI、MboI、HhaI、HaeIII、RsaI、TaqI、CviRI、MseI、Sth132I、AciI、DpnII、Sau3AI及びMnlIからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- ステップ(e)において、ライゲートされた分子が、機械的手段によって断片化される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)において、ライゲートされた分子が、せん断によって断片化される、請求項8に記載の方法。
- ステップ(e)において、ライゲートされた分子が、2bp酵素を認識する制限酵素若しくは制限酵素の組み合わせを使用して、又は一般的ヌクレアーゼによる限定的消化を使用して断片化される、請求項1〜74のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)において、ライゲートされた分子が、放射線又は重イオンを用いて断片化される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)の後、断片化された分子のDNA末端が、修復される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)の後、アダプターが、配列決定目的のためにライゲートされる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- アダプターが、アドレス配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 多重化の場合に異なるサンプルの識別を可能にするために、異なるサンプルにおいて複数のアドレス配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドが使用される、請求項14に記載の方法。
- ステップ(f)において、1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブが、マイクロアレイ上にスポットされるか若しくはビーズ上に捕捉されるか、又は溶液中に存在し、後にビーズ上に捕捉される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブが、第1の制限酵素の制限部位に隣接する配列を認識する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブが、第1の制限酵素の制限部位の100bp以内の配列を認識する、請求項17に記載の方法。
- ステップ(f)において、ヌクレオチド配列断片が、複数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブのセットにハイブリダイズされ、この複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、目的ゲノム領域に由来するヌクレオチド配列上の第1の制限酵素の消化部位に隣接する配列にハイブリダイズする、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブのセットが、第1の制限酵素を用いて目的ゲノム領域を処理することによって得ることができる実質的に全ての制限断片に特異的なプローブを含む、請求項19に記載の方法。
- ステップ(g)が、富化されたヌクレオチド配列断片のハイスループット配列決定を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)の後に、バイオインフォマティクス分析、及び相互作用の可視化が続く、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 目的ゲノム領域が、目的の遺伝子座を含む、請求項2に記載の方法。
- 目的領域が、1〜10MBである、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 三次元構造における特定の遺伝的要素の、他のヌクレオチド配列との相互作用を分析する方法であって、請求項1〜24のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップを含み、遺伝的要素との相互作用に関与するヌクレオチド配列を同定するために、ステップ(g)において、特定の遺伝的要素を含む富化されたヌクレオチド配列断片の配列のみが分析される、方法。
- 遺伝的要素が、転写因子の結合部位又はインシュレーター(insulator)若しくはバリヤー(barrier)要素を含む、請求項25に記載の方法。
- 遺伝的要素が、目的領域中にある、請求項25又は26に記載の方法。
- 遺伝子の発現状態を決定する方法であって、請求項1〜24のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップ、及び遺伝子を含む目的領域における相互作用の数、種類又は密度を分析するステップを含む、方法。
- 2つのサンプル間の遺伝子の活性を比較する方法であって、両サンプルについて請求項1〜24のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップ、及び目的領域における相互作用の数、種類又は密度を比較するステップを含む、方法。
- サンプルが、同じ被験体からの異なる組織に由来する; 異なる時点にわたる単一の被験体に由来する; 異なる被験体からの同等の組織に由来する、請求項29に記載の方法。
- 特定の疾患状態を示す1つ以上のDNA-DNA相互作用を同定する方法であって、請求項1〜24のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップを含み、ステップ(a)において、架橋されたDNAのサンプルが罹患細胞及び非罹患細胞から提供され、罹患細胞及び非罹患細胞に由来するDNA配列間の三次元クロマチン構造におけるヌクレオチド配列の相互作用間の差異は、DNA-DNA相互作用又はDNA-DNA相互作用のパターンが特定の疾患状態を示すものであることを示す、方法。
- DNA-DNA相互作用の変化によって引き起こされるか又はそれに関連する、疾患又は症候群の診断又は予後診断の方法であって、請求項1〜24のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップを含み、ステップ(a)は、被験体に由来する架橋されたDNAのサンプルを提供するステップを含み、ステップ(f)は、DNA配列間の相互作用を、影響を受けていない対照のものと比較するステップを含み、対照と被験体の間の差異が、被験体が疾患若しくは症候群に罹患していることを示すか、又は被験体が疾患若しくは症候群に罹患するであろうことを示す、方法。
- 疾患が、遺伝子疾患である、請求項32に記載の方法。
- 疾患が、ガンである、請求項32又は33に記載の方法。
- DNAの三次元構造をモジュレートする1つ以上の薬剤を同定するためのアッセイ方法であって、
(a)サンプルを1つ以上の薬剤と接触させるステップ、及び
(b)請求項1〜24のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップであって、ステップ(a)が、サンプルに由来する架橋されたDNAを提供することを含む、ステップ、
を含み、(i)薬剤の存在下でのDNA相互作用と(ii)薬剤の非存在下でのDNA相互作用の間の差異が、DNAの三次元構造をモジュレートする薬剤を示す、方法。 - 本明細書に実質的に記載され、実施例又は図面のいずれかに関連する、方法又はアッセイ。
- 目視検査により10kbpより小さい分解能でゲノムの3D構造を同定するための、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 目視検査により10kbpより小さい分解能でクロマチン繊維コンホメーションを同定及び決定するための、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 目視検査により10kbpより小さい分解能で染色体のサブ染色体ドメイン構造を同定するための、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 目視検査により10kbpより小さい分解能で染色体のサブ染色体ドメイン構造を同定するための、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 目視検査により10kbpより小さい分解能で染色体のループ凝集体/ロゼット構造を同定するための、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- モンテ-カルロ(Monte-Carlo)及びブラウン動力学(Brownian-Dynamics)シミュレーションと比較した場合、10kbpより小さい分解能で染色体のループ凝集体/ロゼット構造を同定するための、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 相互作用間の遺伝的距離に応じて、及びモンテ-カルロ及びブラウン動力学シミュレーションからのスケーリング挙動、及びDNA自体における長距離相関のスケーリングと比較して、相互作用の頻度のスケーリング挙動から、10kbpより小さい分解能で染色体のループ凝集体/ロゼット構造を同定するための、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
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