JP2016536006A - 細胞表面抗原に対する結合作用物質を生成するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年9月23日出願の米国仮特許出願第61/881,203号に基づく優先権を主張し、その内容は、参照することによりその全体が本明細書中に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、用語「核酸提示ライブラリー」は、例えば、米国特許第7,195,880号、同第6,951,725号、同第7,078,197号、同第7,022,479号、同第6,518,018号、同第7,125,669号、同第6,846,655号、同第6,281,344号、同第6,207,446号、同第6,214,553号、同第6,258,558号、同第6,261,804号、同第6,429,300号、同第6,489,116号、同第,6,436,665号、同第6,537,749号、同第6,602,685号、同第6,623,926号、同第6,416,950号、同第6,660,473号、同第6,312,927号、同第5,922,545号、同第6,348,315号、国際公開第WO2012125733号、および国際公開第WO2010/011944号に記載されるものを限定されることなく含む、任意の当業者に認識されるインビトロ無細胞表現型−遺伝子型関連ディスプレイを指し、これらは全て、参照することによりそれらの全体が組み込まれる。
特定の態様において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別する方法を提供する。
特定の態様において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別する方法を提供する。
特定の態様において、本発明の方法は、核酸提示ライブラリーを用いる。一態様において、本発明は、キメラVドメイン(例えば、VHまたはVLドメイン)の多様な核酸提示ライブラリーを提供し、ライブラリーの各メンバーが、第1の抗体からのFR1〜FR3領域配列および第2の抗体からのCDR3−FR4領域配列を含む。典型的なライブラリーは、例えば、本明細書の実施例2で開示される。本明細書で開示されるライブラリーは、本明細書で開示されるいずれの方法で使用するのにも好適である。
特定の態様において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別する方法を提供する。本方法は概して、(a)結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーを、第1の細胞型の外部表面上に提示される細胞表面抗原と接触させることと、(b)このライブラリーから、第1の細胞型の外部表面上の細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも1つのライブラリーメンバーを単離することと、を含む。特定の実施形態において、抗原に特異的に結合しない結合ポリペプチドのライブラリーを事前に排除するために、ステップ(a)の前に、結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーは、外部表面上に提示される抗原を提示しない第2の細胞型と接触させられる。
特定の態様において、本発明の方法は、抗原の未変性配座を維持し得、結合ポリペプチド(例えば、VHまたはVLドメイン)および抗原の複合体の回収を可能にし得る界面活性剤を使用する細胞からの抗原(例えば、細胞表面抗原、例えば、GPCR)の可溶化を伴う。これらの方法は、細胞表面抗原(例えば、GPCR)の未変性立体構造に結合する結合ポリペプチド(例えば、VHドメイン)を選択する上で特に有用である。
特定の態様において、本発明の方法は、所望の細胞表面抗原に特異的に結合し、抗原と共に内部移行化される結合ポリペプチドの選択を伴う。このような方法は、細胞中にペイロード(例えば、ケモトシキン)を送達し得る結合ポリペプチドを生成する上で特に有用である。
特定の態様において、本発明の方法は、対照結合作用物質(例えば、抗体)によって認識されるものとは異なるエピトープにて抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドの選択を伴う。このような方法は、新規の機能特性を有する結合ポリペプチドを生成する上で特に有用である。
特定の態様において、本発明の方法は、所望の活性化状態の抗原(例えば、細胞表面抗原)に特異的に結合する結合ポリペプチドの選択を伴う。このような方法は、標的抗原をアロステリック調節する(例えば、阻害する)結合ポリペプチドを生成する上で特に有用である。
本発明の方法で用いられるVHおよび/またはVLドメインは、単離する上で使用され得るか、または追加のアミノ酸(例えば、エピトープタグ)および/またはドメインに融合され得る。特定の実施形態において、ライブラリー中の少なくとも1つのVHドメインは、少なくとも1つのCH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、またはそれらの組み合わせに融合される。具体的な実施形態において、ライブラリー中の少なくとも1つのVHドメインは、少なくとも1つのCH1ドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む、少なくとも1つの重鎖定常領域に融合される。特定の実施形態において、ライブラリー中の少なくとも1つのVHドメインは、少なくとも1つの軽鎖定常領域に融合される。
実施例1:生細胞選択および大規模シーケンシング分析を組み込んだ、ヒトVHライブラリーおよびdsDNA提示テクノロジーを使用した標的細胞特異的エピトープの識別。
A.まとめ
ヒト供与体の骨髄、末梢血、および脾細胞から取得された完全なヒト抗体VHライブラリーが作出され、dsDNA提示テクノロジーを使用して、多数の高親和性結合体および複数の標的に対する特異的VH結合体を識別した。標的細胞特異的エピトープを、ヒトVHライブラリーおよびdsDNA提示テクノロジーを使用する生細胞選択および大規模シーケンシング分析によって識別した。並行、差次的選択、および標的細胞選択的選択の戦略を、これらの方法(図4、5、6を参照)において適用した。全ての回に及ぶ全てのプールの大規模シーケンシングからのCDR3頻度の集計は、VHクローンの選択性を予測した。高親和性VHを標的細胞および関連細胞型に選択的に結合すると識別した。
生細胞に結合されたライブラリーメンバーを効果的に回収するために、2つの方法が生み出された。
国際公開第WO2010/011944号に記載されるプロトコル(参照することによりその全体が組み込まれる)に従って、主な未処置の融合ライブラリーを生成した。第1回目の選択で、全ての選択分岐に対して同一の多様性を保因する複数のライブラリー中に、精製された融合ライブラリーを平等に分割した(図5を参照)。
各回の選択の後、結合プールをPCR増幅した。各結合プールのHCDR3を、VH断片のフレームワーク3のC末端およびVH断片のフレームワーク4のN末端をプライミングするオリゴを用いたPCRによって引き上げた。次に、これらの個別の選択回および選択分岐から引き出されたHCDR3断片に、PCRによってイルミナシーケンシングのために使用された特異的DNAバーコードをタグ付けした。タグ付けされたHCDR3を集めて、Hi Seqテクノロジーでの高性能シーケンシングに送った。標的細胞からの4回目の結合プールもまたDNAバーコードをタグ付けされ、完全長のVH配列を得るために、454シーケンシングに提出した。
次に、結合プールおよび合成VHをpET22b発現ベクターにサブクローンした。VHをBL−21大腸菌細胞中で生成し、標準プロトコルを使用してC末端Hisタグを通して精製した。異なる細胞型および結合体のEC50に対するVHの結合および選択性を査定するためにFACS分析を行った。生細胞選択方法によって、高親和性および選択的VH結合体を識別した(図8、9、および10を参照)。
存在するVH未処置のライブラリー(例えば、国際公開第WO2010/011944号で開示されるもの)の多様性を拡大するため、CDR3およびフレームワーク再組換え手法を採用した。端的には、VHフレームワーク3のC末端領域およびフレームワーク4のN末端領域をプライミングするオリゴを使用してPCRを行なった。未処置のVHライブラリー由来のVH群の各々からの全CDR3ループドメインを増幅するために、この戦略を考案した。同一の未処置のライブラリーからの群特異的変性N末端フレームワーク1およびC末端フレームワーク3オリゴでのPCRによってVHフレームワーク1〜3を増幅した。CDR3およびフレームワークを等モル比で混合したT7 UTRおよびフレームワーク4オリゴを使用して重複PCRを行った。再度組換えられたライブラリーを更に修正して、選択のためのdsDNA融合ライブラリーに関して精製タグを保因した。特異的に、未処置のライブラリーからのHCDR3を、フレームワーク3およびフレームワーク4フォワードおよびリバースオリゴを有する各VH群から引き上げ、フレームワーク特異的SSオリゴヌクレオチドを使用して、骨髄B細胞およびPBMCから増幅された未処置のヒトVHドメインのフレームワーク領域1〜3を含むライブラリー中に組み合わせた。5’VH群特異的および3’一般的FR3リバースプライマーを使用して、ヒトVHフレームワーク領域1〜3を増幅し、VH群フレームワーク領域の別個のライブラリーを作り出した。5’T7TMVおよび3’FR4オリゴを使用して、更にPCR増幅をすることにより、VH群フレームワークライブラリー、および同一のライブラリーから引き上げられたHCDR3を組み換えた。このことはまた、インビトロ転写/翻訳について、5’端でT7TMV促進配列を追加した。FR4 Cu3リバースおよびY109プライマーをそれぞれ5’T7TMVプライマーと共に使用したPCRによって、C末端Cμ3配列およびFLAGタグ(翻訳後の精製)もまた追加した。HCDR3組換えVHライブラリーの調製のために使用されたオリゴヌクレオチドの核酸配列は、表1に記載される。
GPCRを可溶化しつつ、未変性機能的配座を保護する能力について、種々の界面活性剤を評価した。特異的に、制御VH分子(Myc親和性タグを含む)およびGPCR発現細胞株を使用して、35S標識抗体結合分析を進めた。この分析において、等しい数のGPCR標的発現細胞を、トリトンX100、CHAPS、DDM、またはBrij35界面活性剤で溶解し、続いて、抗Mycタグ抗体で免疫沈降を行い、タンパク質G磁性ビーズにより捕獲した。標的細胞に結合する正制御VHを、インビトロ翻訳反応中、35Sで無線標識化した。この標識VHを、GPCR標的で培養し、上述されるような異なる界面活性剤での細胞溶解後に抗Myc抗体によって捕獲した。シンチレーション計数器を使用して、GPCR標的に結合されるVHの量を定量化した。VH結合活性に基づいて、界面活性剤可溶化によって保護された機能的配座をランク付けした。並行して、ウェスタンブロット法によって、抗Myc抗体で免疫沈降されたGPCRの数量を評価した。正制御VHは、細胞がDDMまたはCHAPSで溶解されるときにGPCRへのより良い活性結合を示した。DDMとCHAPSとの組み合わせは、最大限の機能的GPCR活性および最適なGPCR数を、これらの2つの分析において示し、GCGR(グルカゴン受容体)結合VHドメインの選択において使用するために選択された。
内部移行活性で受容体刺激薬抗体または拮抗薬抗体を識別するための選択方法論が生み出された。端的には、GPCR結合VHを内部移行させるために、(上述されるような)未処置のヒトdsDNA提示VHライブラリーを、50mMのNH4C1の存在下で、生細胞発現GPCR(または他の目的の標的)を使って、37℃で培養した。次に、細胞を緩衝液で洗浄し、低pH酸(例えば、pH2.7の0.1MのHCL)によって、細胞表面VHを剥離した。低pH剥離後、上述されるように、CHAPS/DDMの組み合わせで細胞を溶解し、DNAの沈降を行って、内部移行化dsDNA提示ライブラリーメンバーのコード配列を回収した。代替的に、抗C末端または抗Mycタグ抗体での免疫沈降は、行われ得る。これらの方法はともに、組み合わせることも可能である。例えば、GCGR結合VHの選択において、内部移行化ライブラリーメンバーがDNA沈降によって回収された4回の選別の後、抗Myc抗体での内部移行化ライブラリーメンバーの免疫沈降が適用されて、選択的厳密さが増加した5回目の選択が行われた。これらの実験において、5回の内部移行選択の後、高親和性拮抗薬を識別した。これらのGCGR結合VHは、適用された選択的圧力と調和する内部移行活性を示した。
GPCR標的の標的機能的エピトープおよびアロステリック調節性VHの識別を増進するために、活性化および非活性化標的細胞(例えば、生細胞中の受容体刺激薬活性化または拮抗薬不活性化GPCR)の選択を可能にするために、選択戦略を生み出した。内因性リガンド(またはリガンド類似体)の存在下での選択は、オルソステリック結合部位と区別可能な位置、またはリガンドおよび受容体の両方によって現される新規のエピトープに結合するVHの識別に有利に働く。端的には、受容体刺激薬(リガンド、類似体、または受容体刺激薬抗体)または拮抗薬(阻害物質または中和抗体)の存在下で、GCGR発現細胞は阻止され、(上述されるように)未処置のヒトdsDNA提示VHライブラリーで培養した。例えば、GCGRに対する選択において、グルカゴンの存在下で選択分岐を行った。別のGPCR選択において、リガンド模倣物質および拮抗薬の存在下で、アロステリック調節物質を識別するためにいくつかの選択分岐を行った。所望の活性化状態において、GPCR標的に結合するVHを効果的に捕獲するために、活性化および非活性化標的細胞でのこれらの選択を、本明細書で開示される種々のライブラリー回収方法と組み合わせた。
生細胞選択を使用して、GPCRの特異的機能的エピトープ(または他の目的の標的)を標的とするための方法が生み出された。これらの方法は、GPCRのオルソステリック(受容体刺激薬/拮抗薬)およびアロステリック調節物質の識別を可能にする。例えば、GCGR結合VHの選択において、グルカゴンの存在下で1つの選択分岐を行った。GCGR選択の別の分岐に関して、抗体ライブラリーをGCGR発現標的細胞で培養した後、細胞を洗浄し、4時間グルカゴンで溶出した。次に、本明細書で開示される方法を使用して、リガンド結合ドメインと区別可能なエピトープに結合した残りの結合体を細胞から剥離した。これらの実験から、複数の高親和性VHドメインが、GCGRへのグルカゴン結合およびGCGRによるリガンド誘発cAMP誘発を阻止すると識別された。識別されたVHドメインのうちの1つが、正アロステリック調節物質として機能した。別の標的に関して、拮抗薬抗体を使用して、拮抗薬抗体の存在下で選択された細胞上のエピトープを予備阻止した。この実験は、存在する拮抗薬参照抗体と区別可能なエピトープを認識する複数のVHドメインの識別をもたらした。
GPCR種相同体の抗GPCR抗体の選択性を増加させるために、これらの関連する相同体を発現する細胞株が、並行して生成されて、(異種間が所望されない場合)対抗選択手段としてか、あるいは標的細胞選択、次いで、選択的クローンを識別するための大規模シーケンシングおよび生物情報学集計と並行して使用されるかのいずれかで、本明細書に記載されるDNA提示選択方法において活用されてもよい。後の動物の有効性および毒性研究に関して、齧歯目または霊長目と交差反応性である抗体を生成するために、初回の選択でヒト標的細胞において選択を行い、次いで、齧歯目標的発現細胞に対する交差選択を行った。代替的に、ヒトおよび齧歯目細胞は、選択の別の回で使用され得る。識別されたVHドメインの多くが、細胞上でのヒト標的および齧歯目標的の両方への結合を示し、動物研究のために代用抗体を生成する必要がなくなる。
大規模シーケンシングテクノロジーは、本明細書に記載されるDNA提示選択方法において広範囲に適用されてきた。特定の実験では、選択方法中に主要な基準が組み込まれ、多くの並行選択が行われた。個々の選択および選択分岐から引き出されたHCDR3断片に、PCRによるイルミナシーケンシングのために使用された特異的DNAバーコードをタグ付けした。タグ付けされたHCDR3を集めて、Hi SeqまたはMy Seqテクノロジーでの高性能シーケンシングに送った。シーケンシング後、DNAバーコードに基づいてこの配列を解いた。各回の選択および選択分岐から引き出された何百万もの配列は、異なる回および異なる選択分岐で存在する特定のCDR3配列の頻度を比較することによって集計され、組み込まれた選択的結合、エピトープの範囲、および機能的プロファイルでの主要な分子の選択を導いた。
Claims (50)
- 細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別する方法であって、
a.外部表面上に細胞表面抗原を提示する第1の細胞型を結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させることと、
b.前記ライブラリーから、前記第1の細胞型の前記外部表面上の前記細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも1つのライブラリーメンバーを単離し、それによって、前記細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別すること
を含む、方法。 - ステップ(a)の前に、前記結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーを、前記外部表面上に提示される前記抗原を提示しない第2の細胞型と接触させる、請求項1に記載の方法。
- 細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別する方法であって、
a.前記外部表面上に細胞表面抗原を提示する第1の細胞型を結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させて、前記ライブラリーから前記第1の細胞型に特異的に結合する少なくとも1つのライブラリーメンバーを単離することと、
b.前記外部表面上に前記細胞表面抗原を提示しない第2の細胞型を前記結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させて、前記ライブラリーから前記第2の細胞型に特異的に結合する少なくとも1つのライブラリーメンバーを単離することと、
c.前記第1の細胞型に特異的に結合するが、前記第2の細胞型には結合しないライブラリーメンバーを選択し、それによって、前記細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別すること
を含む、方法。 - ステップ(a)および(b)が、前記ライブラリーの別個のアリコートを使用して、並行して行われる、請求項3に記載の方法。
- 細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別する方法であって、
a.結合ポリペプチド/抗原複合体の集団が形成されるように、前記外部表面上に前記細胞表面抗原を提示する第1の細胞型を結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させることと、
b.結合ポリペプチド/抗原複合体の前記集団が可溶化されるように、前記第1の細胞型を界面活性剤と接触させることと、
c.結合ポリペプチド/抗原複合体の前記可溶化された集団を単離し、それによって、前記細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別すること
を含む、方法。 - 結合ポリペプチド/抗原複合体の前記可溶化された集団が、前記結合ポリペプチドの一部分に特異的な結合作用物質を使用して単離される、請求項5に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、前記抗原の立体構造を破壊しない、請求項5に記載の方法。
- 細胞表面抗原に特異的に結合する内部移行結合ポリペプチドを識別する方法であって、
a.前記細胞表面抗原の内部移行を可能にし、かつ内部移行化結合ポリペプチド/抗原複合体の集団が形成されるような条件下で、前記外部表面上に前記細胞表面抗原を提示する第1の細胞型を結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させることと、
b.前記第1の細胞型を洗浄して、前記外部表面に結合されたライブラリーメンバーを除去することと、
c.前記内部移行化結合ポリペプチド/抗原複合体を単離し、それによって、前記細胞表面抗原に特異的に結合する内部移行結合ポリペプチドを識別すること
を含む、方法。 - ステップ(b)において、洗浄工程が、約3未満のpHである溶液を使用して行われる、請求項8に記載の方法。
- ステップ(c)において、内部移行化結合ポリペプチド/抗原複合体が、界面活性剤抽出によって単離される、請求項8に記載の方法。
- 前記内部移行化結合ポリペプチド/抗原複合体が、前記結合ポリペプチドまたは前記抗原の一部分に特異的な結合作用物質を使用して更に単離される、請求項8に記載の方法。
- 前記内部移行化結合ポリペプチドが、前記結合ポリペプチドをコードする核酸の沈降により更に単離される、請求項8に記載の方法。
- 対照結合作用物質によって認識されるものとは異なるエピトープにて抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別する方法であって、
a.前記抗原および対照結合作用物質の複合体が形成されるような条件下で、前記抗原を対照結合作用物質と接触させることと、
b.前記抗原および対照結合作用物質の前記複合体を、少なくとも1つの結合ポリペプチド/抗原複合体が形成されるように、結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させることと、
c.前記ライブラリーから、前記抗原に特異的に結合する少なくとも1つのライブラリーメンバーを単離し、それによって、前記参照抗体によって認識されるものとは異なるエピトープにて前記抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別すること
を含む、方法。 - 前記抗原が、細胞の外部表面上に提示される細胞表面抗原である、請求項13に記載の方法。
- 前記対照結合作用物質が抗体である、請求項13に記載の方法。
- 所望の活性化状態の細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別する方法であって、
a.前記外部表面上に前記細胞表面抗原を提示する第1の細胞型を、
i.前記細胞表面抗原に特異的に結合し、前記細胞表面抗原の前記活性化状態を調節する結合作用物質、および
ii.結合ポリペプチドの多様な核酸提示ライブラリーと接触させることと、
b.前記ライブラリーから、前記第1の細胞型の前記外部表面上の前記細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも1つのライブラリーメンバーを単離し、それによって、前記所望の活性化状態の前記細胞表面抗原に特異的に結合する結合ポリペプチドを識別すること
を含む、方法。 - 前記多様な核酸提示ライブラリーが、Vドメインライブラリーであり、前記ライブラリーの各メンバーが、第1の抗体からのFR1〜FR3領域配列および第2の抗体からのCDR3−FR4領域配列を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FR1〜FR3領域配列が、ヒトの天然の免疫学的レパートリーからのものである、請求項17に記載の方法。
- 前記CDR3−FR4領域配列が、ヒトの天然の免疫学的レパートリーからのものである、請求項17に記載の方法。
- 前記VドメインがVHドメインである、請求項17に記載の方法。
- 前記多様な核酸提示ライブラリーがDNA提示ライブラリーである、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNA提示ライブラリーの各メンバーが、介在するDNAリンカーを通して、結合ポリペプチドをコードするDNAコード配列に連結される前記結合ポリペプチドを含み、前記DNAリンカーが、制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ部位が、前記DNA提示ライブラリーのメンバーのコード配列中に存在しない、請求項22に記載の方法。
- 前記方法が、前記単離されたライブラリーメンバーの前記DNAコード配列と前記連結された結合ポリペプチドとを物理的に分離することを更に含む、請求項22または23に記載の方法。
- 前記単離されたライブラリーメンバーの前記DNAコード配列と前記連結された結合ポリペプチドとが、制限酵素消化によって分離される、請求項24に記載の方法。
- 前記方法が、無傷の単離されたライブラリーメンバーを前記第1または第2の細胞型から分離することを更に含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離されたライブラリーメンバーが、前記抗原のリガンドでの溶出によって、前記第1または第2の細胞型から分離される、請求項26に記載の方法。
- 前記単離されたライブラリーメンバーが、前記細胞表面抗原の酵素的切断によって前記第1または第2の細胞型から分離される、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞表面抗原が、糖脂質アンカーによって前記細胞表面に結合し、前記単離されたライブラリーメンバーが、前記糖脂質アンカーのホスホリパーゼ切断によって前記第1または第2の細胞型から分離される、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記単離されたライブラリーメンバーの少なくとも一部分の前記DNAコード配列を決定することを更に含む、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNAコード配列が、パイロシーケンシングによって決定される、請求項30に記載の方法。
- 前記抗原が、天然に存在するタンパク質、グリカン、または脂質である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原が、細胞表面タンパク質である、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原が、GPCRまたはイオンチャネルタンパク質である、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原が、GCGR、CXCR4、またはNav1.7タンパク質である、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原が、グリコホスファチジルイノシトール(GPI)アンカータンパク質である、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原が組換え抗原である、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原がキメラ抗原である、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の細胞型が、前記細胞表面抗原を天然に発現する細胞である、請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の細胞型が、前記細胞表面抗原を異種発現するように操作された組換え細胞である、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の細胞型が、正常細胞の疾患関連変異体である、請求項1〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の細胞型が腫瘍細胞である、請求項1〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合ポリペプチドが、抗体またはその断片である、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合ポリペプチドが、抗体VHまたはVLドメインである、請求項1〜43のいずれか一項に記載の方法。
- キメラVドメインの多様な核酸提示ライブラリーであって、前記ライブラリーの各メンバーが、第1の抗体からのFR1〜FR3領域配列および第2の抗体からのCDR3−FR4領域配列を含む、ライブラリー。
- 前記FR1〜FR3領域配列が、天然のヒトの免疫学的レパートリーからのものである、請求項45のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記CDR3−FR4領域配列が、天然のヒトの免疫学的レパートリーからのものである、請求項45のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記VドメインがVHドメインである、請求項45のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーが、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、および18からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを使用して生成される、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法またはライブラリー。
- 配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、および18からなる群から選択される配列を有する、オリゴヌクレオチド。
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