JP2016533755A - プロピオン酸の産生能を持つ微生物及びそれを含む粗飼料組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の一例では、粗飼料は、通常の配合飼料と混合して給餌するのができる。
1−1.菌株の分離
プロピオン酸の産生能を持つ菌株を分離する為、体重40±5kgの在来黒ヤギ三頭から反芻胃液を採取した。嫌気状態を維持する為に嫌気チャンバー内で行い、HattoriとMatsui(Anaerobe、Vol.14、pp.87−93、(2008))の方法に従った。
1−1で分離した菌株は、MRS培地で培養した後、Wizard Genomic DNA Purification Kits(Promega、USA)を使用し、染色体DNAを抽出した。これを鋳型にして、16S rRNAのコードする遺伝子を増幅する為、プライマー27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)と1492r(GGTTACCTTGTTACGACTT)を用いてPCRを行った。 PCRの条件は、94℃で5分の初期変性、94℃で45秒の変性、65℃で45秒のアニーリング、72℃で1分の伸長となるサイクルの32回反復及び72℃で10分の伸長である。
分離した菌株は、ラクトバチルス・ムコサエS32(T)と96%の類似性を示した。これに基づいて、分離した菌株をラクトバチルス・ムコサエBR−PPと命名し、これを2013年7月26日、韓国の微生物保存センターに寄託して、受託番号 KCCM11440Pをもらった。
1−1と1−2で分離し、同定したラクトバチルス・ムコサエKCCM11440Pのプロピオン酸の産生能を比較する為の対照群を選ぶ為、プロピオン酸の産生能を持つと知られた、セレノモナスボビース(Selenomonas bovis)15154(SB)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)5019(VP)、プロピオニバクテリウムエシディプロピオニシ(Propionobacterium acidipropionici)5020(PAci)と プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)11946(PAcn)をそれぞれKCTC及びKACCから分譲して使用した。
実施例1で分離して同定したラクトバチルス・ムコサエのプロピオン酸の産生能を評価した。MRS培地を含むアガロースで、嫌気状態で48時間培養した。培地をHungateチューブに入れ、pH6.5、O2−free、20%CO2、80%N2ガスで充填後、121℃で15分間高圧滅菌した。プロピオン酸の産生能に及ぼす影響を確認するため、MRS培地を含むアガロースに、それぞれビオチン(0.5mg/L)、乳酸(2%)、ビタミンB12(50μg/L)またはグリセロール(2%)を添加した。プロピオン酸の産生能を評価する為の対照群は、実施例1で選択したプロピオニバクテリウムエシディプロピオニシであった。
下記の表1及び2は、その結果を表す。
反芻胃液及び緩衝液を利用して、インビトロ(in vitro)で反芻胃で発酵効果を評価した。
in vitro試験での試験を行う為、順天大学校の付設農場で飼育中の600±47kg程のホルスタイン牛から、管を用いて胃液を採取した。公試動物である韓牛は、イタリアンライグラス(Italianryegrass)と濃厚飼料{重量基準で、トウモロコシ55%、小麦15%、脱脂米ぬか8%、コーングルテン飼料5%、大豆粕10%、糖蜜0.2%、炭酸カルシウム(limestone)2.0%、塩0.5%、リン酸カルシウム1.3%、ビタミン−ミネラル混合物(ビタミンA 3000IU、ビタミンD 6000IU、ビタミンE 30IU、Cu 25mg、Fe 150mg、Zn 200mg、Mn 100mg、Co 0.5mg及びI 1.5mg)1.0%}を2:8の割合で混合し、体重に対して2%程度を1日2回に分けて給餌した。それから水は自由に取るようにした。飼料給餌の2時間後に、チーズ布(cheese cloth)を利用して、胃液を採取して使用した。緩衝液(Hino et al.、1992)は、K2HPO4 0.45g/L、KH2PO4 0.45g/L、(NH4)2SO4 0.9g/L、CaCl2・2H2O 0.12g/L、MgSO4・7H2O 0.19g/L、トリップティカ剤(Trypticase)1.0g/L、酵母エキス1.0g/L、システイン・HCl 0.6g/L(pH6.9)を含む基本培地(basal media)で製造した。
pHは、インキュベーターから直接測定しないで、常温に安定化した後、M503Pメートル(wrks、Medififield、MA、USA)を使用して測定した。
総ガスの発生量は、試料を安定化した後、EA−6(Inc、Sun Bee instrument)圧力センサ測定器を使用した。総ガスの発生量を測定した後、メタンと二酸化炭素の発生量を測定する為、真空管を用いて発生するガスを捕集した。各培養の時間毎に得られた総ガスの発生量に基づき、QrskovとMcDonald(1979)の公式により、ガスの発生量を推定した。
VFA測定は、培養の時間毎に培養物を1000×g、4℃で、10分間遠心分離し、上等液を採取して、0.2μmマイクロフィルターで精製して分析した。METACARB87H(Varian、Germany)カラムの付いたHPLC(Agilent technolgies1200 series)を利用して、35℃で分析した。検出器のUV波長は、210nmと220nmであった。移動相の溶媒は、0.0085N H2SO4であり、流速は0.6ml/ minであった。
アンモニアの濃度測定は、採取した試料を13000rpmで遠心分離し、ChanyとMarbach(Clinical Chemistry、Vol。8、pp。130−132、(1962))の方法で行った。フェノール溶液で試料中のアンモニアを発色し、630nmで吸光度(Spectronics 21D)を測定して表した。
ほとんどの副産物は、主な生産物を生産した後では、一般的に廃棄する。これらの副産物の中で、繊維素の成分の高い醸造副産物とキノコの副産物(キノコの廃培地)を収集して、反芻動物の飼料として使用できるかを評価した。すなわち、これらを発酵飼料に利用して、前述のように、反芻胃液と緩衝液の混合物中でインビトロ(in vitro)で発酵を行った。
ふすまと醸造副産物またはキノコの副産物(廃培地)をそれぞれ1:1の割合で混合し、1%糖蜜を添加した後、ラクトバチルス・ムコサエまたはプロピオニバクテリウムエシディプロピオニシ(陽性対照群)培養液の10%を接種した。すべての試料は、真空包装した後、37℃で72時間培養した。
本研究で得たすべての結果は、ランダムにデザインした一般的な線形モデル(GLM)を用い、分散分析(ANOVA)によって分析した。すべての処理は、DMRT(Duncan’s Multiple Range Test)方法により、3回反復で、処理区間の特異性を確認した。統計的な有意性は、P<0.05で表し、すべての分析は、SAS(Statistical Analysis Systems)バージョン9.1(SAS、2002)で行った。
1−1.菌株の分離
プロピオン酸の産生能を持つ菌株を分離する為、体重40±5kgの在来黒ヤギ三頭から反芻胃液を採取した。嫌気状態を維持する為に嫌気チャンバー内で行い、HattoriとMatsui(Anaerobe、Vol.14、pp.87−93、(2008))の方法に従った。
1−1で分離した菌株は、MRS培地で培養した後、Wizard Genomic DNA Purification Kits(Promega、USA)を使用し、染色体DNAを抽出した。これを鋳型にして、16S rRNAのコードする遺伝子を増幅する為、プライマー27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)と1492r(GGTTACCTTGTTACGACTT)を用いてPCRを行った。PCRの条件は、94℃で5分の初期変性、94℃で45秒の変性、65℃で45秒のアニーリング、72℃で1分の伸長となるサイクルの32回反復及び72℃で10分の伸長である。
1−1と1−2で分離し、同定したラクトバチルス・ムコサエKCCM11440Pのプロピオン酸の産生能を比較する為の対照群を選ぶ為、プロピオン酸の産生能を持つと知られた、セレノモナスボビース(Selenomonas bovis)15154(SB)、ベイロネラ・パルブーラ(Veillonella parvula)5019(VP)、プロピオニバクテリウムエシディプロピオニシ(Propionobacterium acidipropionici)5020(PAci)と プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)11946(PAcn)をそれぞれKCTC及びKACCから分譲して使用した。
実施例1で分離して同定したラクトバチルス・ムコサエのプロピオン酸の産生能を評価した。MRS培地を含むアガロースで、嫌気状態で48時間培養した。培地をHungateチューブに入れ、pH6.5、O2−free、20%CO2、80%N2ガスで充填後、121℃で15分間高圧滅菌した。プロピオン酸の産生能に及ぼす影響を確認するため、MRS培地を含むアガロースに、それぞれビオチン(0.5mg/L)、乳酸(2%)、ビタミンB12(50μg/L)またはグリセロール(2%)を添加した。プロピオン酸の産生能を評価する為の対照群は、実施例1で選択したプロピオニバクテリウムエシディプロピオニシであった。
下記の表1及び2は、その結果を表す。
反芻胃液及び緩衝液を利用して、インビトロ(in vitro)で反芻胃で発酵効果を評価した。
in vitro試験での試験を行う為、順天大学校の付設農場で飼育中の600±47kg程のホルスタイン牛から、管を用いて胃液を採取した。公試動物である韓牛は、イタリアンライグラス(Italianryegrass)と濃厚飼料{重量基準で、トウモロコシ55%、小麦15%、脱脂米ぬか8%、コーングルテン飼料5%、大豆粕10%、糖蜜0.2%、炭酸カルシウム(limestone)2.0%、塩0.5%、リン酸カルシウム1.3%、ビタミン−ミネラル混合物(ビタミンA 3000IU、ビタミンD 6000IU、ビタミンE 30IU、Cu 25mg、Fe 150mg、Zn 200mg、Mn 100mg、Co 0.5mg及びI 1.5mg)1.0%}を2:8の割合で混合し、体重に対して2%程度を1日2回に分けて給餌した。それから水は自由に取るようにした。飼料給餌の2時間後に、チーズ布(cheese cloth)を利用して、胃液を採取して使用した。緩衝液(Hino et al.、1992)は、K2HPO4 0.45g/L、KH2PO4 0.45g/L、(NH4)2SO4 0.9g/L、CaCl2・2H2O 0.12g/L、MgSO4・7H2O 0.19g/L、トリップティカ剤(Trypticase)1.0g/L、酵母エキス1.0g/L、システイン・HCl 0.6g/L(pH6.9)を含む基本培地(basal media)で製造した。
pHは、インキュベーターから直接測定しないで、常温に安定化した後、M503Pメートル(wrks、Medififield、MA、USA)を使用して測定した。
総ガスの発生量は、試料を安定化した後、EA−6(Inc、Sun Bee instrument)圧力センサ測定器を使用した。総ガスの発生量を測定した後、メタンと二酸化炭素の発生量を測定する為、真空管を用いて発生するガスを捕集した。各培養の時間毎に得られた総ガスの発生量に基づき、QrskovとMcDonald(1979)の公式により、ガスの発生量を推定した。
VFA測定は、培養の時間毎に培養物を1000×g、4℃で、10分間遠心分離し、上等液を採取して、0.2μmマイクロフィルターで精製して分析した。METACARB87H(Varian、Germany)カラムの付いたHPLC(Agilent technolgies1200 series)を利用して、35℃で分析した。検出器のUV波長は、210nmと220nmであった。移動相の溶媒は、0.0085N H2SO4であり、流速は0.6ml/ minであった。
アンモニアの濃度測定は、採取した試料を13000rpmで遠心分離し、ChanyとMarbach(Clinical Chemistry、Vol。8、pp。130−132、(1962))の方法で行った。フェノール溶液で試料中のアンモニアを発色し、630nmで吸光度(Spectronics 21D)を測定して表した。
ほとんどの副産物は、主な生産物を生産した後では、一般的に廃棄する。これらの副産物の中で、繊維素の成分の高い醸造副産物とキノコの副産物(キノコの廃培地)を収集して、反芻動物の飼料として使用できるかを評価した。すなわち、これらを発酵飼料に利用して、前述のように、反芻胃液と緩衝液の混合物中でインビトロ(in vitro)で発酵を行った。
サイレージは、飼料の質と最大の乾物を提供する。また、飼料中の微生物は、発酵の速度を向上させ、サイレージの結果を増進させる。そのため、プロピオン酸の産生能を持つ微生物を添加して、インビトロで発酵の効果を測定した。
本研究で得たすべての結果は、ランダムにデザインした一般的な線形モデル(GLM)を用い、分散分析(ANOVA)によって分析した。すべての処理は、DMRT(Duncan’s Multiple Range Test)方法により、3回反復で、処理区間の特異性を確認した。統計的な有意性は、P<0.05で表し、すべての分析は、SAS(Statistical Analysis Systems)バージョン9.1(SAS、2002)で行った。
Claims (7)
- プロピオン酸の産生能を持つラクトバチルス・ムコサエ(Lactobacillus mucosae)KCCM11440P。
- ラクトバチルス・ムコサエKCCM11440Pを含む粗飼料組成物。
- 前記の粗飼料組成物は、キノコの廃培地を含むことを特徴とする請求項2に記載の粗飼料組成物。
- 前記の粗飼料組成物は、ビタミンB12及び乳酸塩の中で一つ以上を含むことを特徴とする請求項2に記載の粗飼料組成物。
- 前記の粗飼料組成物は、反芻動物の肥育促進用であることを特徴とする請求項2に記載の粗飼料組成物。
- 反芻動物の肥育方法として、ラクトバチルス・ムコサエKCCM11440Pを含む粗飼料を給餌する段階を含むことを特徴とする方法。
- 前記の粗飼料は、キノコの廃培地を含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。
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