JP2016530267A - 癌及びウイルス感染症を治療するための免疫受容体調節 - Google Patents
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Abstract
Description
1つの実施形態では、CD96阻害剤は、抗体又は抗体断片である。
別の特定の実施形態では、CD96阻害剤は抗ウイルス剤である。
第4の態様では、本発明は、第1の態様の方法に従って使用するための、第3の態様によるCD96阻害剤を提供する。
状況が別様に要求しない限り、用語「含む」、又は類似の用語は、非限定的な包含を意味することが意図されており、要素又は特徴を列挙したリストは、記載又は列挙されている要素のみを含むのではなく、列挙又は記載されていない他の要素又は特徴を含む場合がある。
1つの形態では、抗体は、CD96と結合し、CD155に対するCD96の結合を少なくとも部分的に阻止又は阻害する。
「投与する」とは、CD96阻害剤を特定の経路で哺乳動物に導入することを意味する。好適には、治療上有効量のCD96阻害剤が、哺乳動物に投与される。
一般的に、本発明の方法は、CD96媒介性の免疫阻害、抑制、又は末梢寛容を低減又は軽減するのに有用であり得る。好適には、本方法は、CD96媒介性の免疫阻害、抑制、又は末梢寛容の少なくとも部分的阻止に応答する1つ又は複数の疾患又は状態の治療又は予防を容易にする。
ヒト投与を含む哺乳動物投与用の、CD96阻害剤単独の、又は他の治療剤と一緒にしたCD96阻害剤の好適な用量は、当業者であれば、容易に決定することができる。
好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤は、哺乳動物に対する、より好ましくはヒトに対する投与に好適である。
候補分子は、タンパク質(ペプチド、抗体、及び抗体断片を含む)、核酸(リボザイム、RNAi、miRNA、及びsiRNA等の抑制性RNA分子を含むが、それらに限定されない)、脂質、炭水化物、有機小分子、又はこれらの任意の組み合わせ(例えば、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸等)であってもよい。
本方法は、候補分子への応答におけるCD96の1つ又は複数の生物活性の変化を測定又は検出する更なるステップを含んでいてもよい。それらには、CD155結合、細胞内シグナル伝達、サイトカイン及び/若しくはケモカインの産生若しくは分泌、並びに/又はin vivoモデルにおける腫瘍攻撃からの保護が含まれていてもよい。
好ましい実施形態では、候補分子は抗体又は抗体断片である。上述のように、抗体は、ポリクローナルであってもよく又はモノクローナルであってもよく、天然物であってもよく又は組換え体であってもよい。抗体断片には、Fab断片及びFab’2断片、ダイアボディ、並びに単鎖抗体断片(例えば、scV)が含まれるが、それらに限定されない。抗体産生、選択、精製、及び使用に適用可能な周知のプロトコールは、例えば、Coliganら、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley&Sons社、ニューヨーク州、1991〜1994年)の第2章、及びHarlow,E.&Lane,D.、Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor、Cold Spring Harbor Laboratory、1988年に見出すことができる。これら両文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例
実施例1
マウス腫瘍モデルにおけるCD155に対するCD96結合並びにCD96阻害及びノックアウトの効果
材料及び方法
マウス
野生型C57BL/6マウスは、Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research又はARC Animal Resource Centreから購入した。C57BL/6 CD96−/−マウスは、ワシントン大学医学部(セントルイス、ミズーリ州、米国)のMarco Colonna博士及びSusan Gilfillan博士により、以下のようにして作り出された。開始部位を含むCD96のエキソン1及び2を、loxP部位に挟まれたMC1−neor遺伝子と置換するように設計された標的構築体を、E14.1(129P2/OlaHsd)胚性幹細胞にエレクトロポレーションした(図S1)。標的化対立遺伝子を運搬するキメラを2つのクローンから取得し、その後C57BL/6胚盤胞に注射した。標的化対立遺伝子を保持するマウスを、CMVプロモーター支配下でCreトランスジーンを発現するC57BL/6マウスと交配して、MC1−neor遺伝子を欠失させた(Schwenkら、1995年)。CD96欠失は、C57BL/6バックグランドに戻し交配し、各生成において10センチモルガン間隙で、多型マイクロサテライトマーカーをゲノムワイドスクリーニングすることにより促進させた。CD96+/−>99%のC57BL/6マウスを互いに交配させて、CD96−/−マウスを作出した。DNAM−1−/−マウスは、既に記載されている。DNAM−1−/−CD96−/−は、CD96−/−をDNAM−1−/−マウスと互いに交配させることにより生成した。マウスを飼育して、6〜14週齢で使用した。実験は全て、動物倫理委員会の承認を受けた。
B16F10、RM−1、3LL、AT3、MC38、及びYAC−1細胞系を、5%CO2中37℃にて、完全RPMI培地(Gibco社、Invitrogen社)で、すなわち10%FCS(Thermo Scientific社)、L−グルタミン(Gibco社)、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、HEPES(Gibco社)、及びペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco社)を添加したRPMI培地で増殖させた。細胞毒性アッセイ及びIL−12/IL−18滴定実験の場合、一次NK細胞を脾臓から回収し、マウスNK細胞単離キット(Miltenyi Biotec社)及びAutoMACS(Miltenyi Biotec社)を使用して選別し、その後、10%FCS、L−グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、非必須アミノ酸(Gibco社)、ピルビン酸ナトリウム(Gibco社)、HEPES(Gibco社)、β−2−メルカプトエタノール(Calbiochem社)、及び1000IU/mlの組換えヒトIL−2(Chiron Corporation社)を添加したRPMI培地で5日間培養した。細胞は全て5%CO2中37℃でインキュベートした。
PBSに懸濁したLPS(大腸菌0127由来:B8、Sigma社)を、記載されている用量でマウスに腹腔内注射した。生存曲線を得るために、マウスの敗血症の症状を毎時チェックした。これらのマウスの血清を、サイトカイン分析用に、後眼窩出血又は心臓出血により種々の時点で採取した。また、種々の時点で脾臓を採取して、受容体及びリガンド発現、並びにNK細胞の細胞内IFN−γ発現を分析した。
マウスB16F10又はB16−OVA黒色腫、RM−1前立腺癌、3LL肺癌、MC38−OVAdim結腸腺癌、又はAT3−OVAdim乳癌を、WT、DNAM−1−/−、CD96−/−、又はDNAM−1−/−CD96−/−マウスに、表示されている用量で皮下又は静脈内注射し、固形腫瘍増殖又は転移をそれぞれモニタリングした。図凡例に示されるように処置を行った。固形腫瘍増殖をモニタリングするために、触知可能な腫瘍の長さ及び幅をカリパスで計測することにより、成長した腫瘍の面積を計算し、時間に対してプロットした。転移形成をモニタリングするために、細胞を注射した14日後に肺を回収し、ブアン固定液中に置き、解剖顕微鏡を使用して転移を計数した。
WT、DNAM−1−/−、CD96−/−、及びDNAM−1−/−CD96−/−マウスの右側腹に、種々の用量のMCA(5〜400μg、例えば、100μgのMCA)を皮下注射し、線維肉腫形成を経時的にモニタリングした。加えて、幾つかのマウスを対照抗体で処置し、抗asialoGM1(Wako Chemicals社;−1日目、0日目、及びその後は8週目まで毎週、100μgをi.p.注射した)での処置によりNK細胞を欠乏させ、IFN−γ(H22、−1日目、0日目、及びその後は8週目まで毎週、250μgをi.p.注射した)、CD155、DNAM−1、又はCD96を無効化した。
BMDCを、以前の記載ように作製した。簡潔に述べると、本発明者らは、マウスの大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を回収し、10%FCS、L−グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、β−2−メルカプトエタノール、及び250ng/mlのGM−CSF(eBioscience社)を添加したDMEM中で6日間培養した。WT又はCD96−/−NK細胞を脾臓から回収し、NK1.1(PK136)抗体及びTCRβ(H57−597)抗体及びCD3(17A2)抗体での染色により、高純度にFACS選別した。NK細胞は、アッセイ当日に回収した。アッセイのセットアップは、5×104個のBMDMを、96ウェルU底プレートに播種した。その後、NK細胞を、様々な用量設定で(2:1、1:1、0.5:1、及び0.25:1)BMDMに添加した。アッセイには、BMDMのみ及びNKのみが対照として常に含まれていた。細胞を全て播種したら、各ウェルを適量の培地で満たして、ウェル間の容積を等しくした。その後、ウェルに100ng/mlのLPSを添加し、2時間後、5mMの精製ATP(Sigma社)を添加して30分間おいた。これは、5%CO2中37℃で実施した。また、アッセイには、LPSのみ及びATPのみが対照として含まれていた。ATPの30分後に、上清を回収し、分析まで−20℃で保存した。
標準的51Cr細胞毒性アッセイを使用して、WT細胞及びCD96−/−NK細胞の標的を死滅させる能力を分析した。簡潔に述べると、100μCiの51Crで標識した20,000個の標的を、V底プレートに添加し、その後、NK細胞を、規定のエフェクター対標的比で標的に添加した。5%CO2中37℃で4時間後に上清を回収し、51Crのレベルをガンマカウンター(Wallac Wizard社)で計数した。比死滅率は、以下の式を使用して決定した:(試料Cr放出−自然Cr放出)/(総Cr放出−自然Cr放出)×100。
IL−18を除いて、血清又は上清におけるサイトカイン検出は全て、サイトメトリービーズアレイ(CBA)技術(BD Biosciences社)を使用することにより達成した。データ取得は、CantoII又はLSRIIフローサイトメトリーアナライザー(BD Biosciences社)を使用して実施した。分析は、FCAPアレイソフトウェアを使用して実施した。IL−18は、製造業者(MRL社)の説明書に従ってELISAにより検出した。細胞内サイトカインを検出する場合、単離リンパ球を肝臓から取得し、表面マーカーを染色し、固定し、透過処理し(BD Biosciences社)、抗IFN−γ抗体(XMG1.2)で染色した。
免疫細胞恒常性及びCD96/CD155発現の分析:種々の器官(リンパ節、肺、脾臓、骨髄、及び肝臓)を、赤血球細胞溶解物を含む単一リンパ球懸濁液に加工した。1×106〜5×106個の細胞を、特異的抗体を使用する前に、まず2.4G2と共にインキュベーションして、非特異的Fc抗体の結合を阻止した。NK細胞恒常性及びIFN−γ産生を分析するために、以下の抗体を使用した:抗マウスNK1.1、抗マウスTCRβ、抗マウスCD27(LG.7F9)、抗マウスCD11b(M1/70)、及び抗マウスIFN−γ。T細胞の場合:抗マウスTCRβ、抗マウスCD8(53−6.7)、及び抗マウスCD4(RM4−5)。B細胞の場合:抗マウスB220(RA3−6B2)、抗CD19(1D3)。NK T細胞の場合:α−ガラクトシルセラミドを負荷したマウスCD1d四量体(メルボルン大学のDale Godfrey教授の厚意により提供)、抗マウスTCRβ又は抗マウスCD3、抗マウスCD4、及び抗マウスNK1.1。マクロファージの場合:抗マウスF4/80(BM8)及び抗マウスCD11b。好中球の場合:抗マウスLy6G(1A8)及び抗マウスCD11b。従来型DCの場合:抗マウスMHCII(M5/114.15.2)及び抗マウスCD11c(N418)。γδT細胞の場合:抗マウスγδTCR(GL3)及び抗マウスCD3。CD96及びCD155発現を分析するために、目的の特定の細胞タイプを、抗マウスCD96(3.3.3)又は抗マウスCD155(4.24.3)と共に上記の抗体カクテルを使用して選別した。データ取得は、LSRII又はCantoIIフローサイトメトリーアナライザー(BD Biosciences社)を使用して実施した。分析は、Flowjo(Treestar社)を使用して達成した。
脾臓に由来する未感作NK細胞及びマクロファージを、上述のように調製及び染色した。その後、これらの細胞を、Aria II FACSソーター(BD Biosciences社)を使用して、高純度に選別した。
統計分析は、Graphpad Prismソフトウェアを使用して達成した。データは、p値が0.05以下であった場合に、統計的に有意であるとみなした。使用した統計検定は、独立スチューデントt検定、マン−ホイットニーt検定、及びマンテル−コックス生存検定であった。使用した適切な検定は、図凡例に規定されている。
CD96は、CD155との結合においてDNAM−1と競合し(図1)、CD96がCD155と結合すると、NK細胞でのIFNγ産生が下方制御される(図2)。CD96は、MCA処置マウスのNK細胞依存性腫瘍免疫監視を制限し、実験的B16F10肺転移を促進する(図3)。
抗CD96抗体を特定するためのスクリーニングアッセイ
導入
以下のアッセイを使用して、本発明に有用な抗体を特定することができる。第1のアッセイを使用すれば、ヒトCD96とヒトCD155との結合を阻止又は阻害可能なヒト抗体を識別することができるであろう。第2のアッセイを使用すれば、特定した抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を引き起こすか否かを試験することができる。その後、第3のアッセイを、主要候補に適用することができる。第3のアッセイは、ヒトCD96抗体が、ヒトリンパ球エフェクター機能を調節することができるか否かを決定することを含む。
アッセイ1:CD155に対するCD96の結合
CD96発現細胞(NK細胞等)の細胞表面に対するCD155の結合を防止する候補抗CD96抗体の能力は、以下のように試験されるであろう。ヒトIgG1のC末端Fc領域と融合させた組換えヒトCD155(Sino Biological社から入手可能なCD155−Fc等)を、製造業者の説明書に従ってZenonヒトIgG標識キット(Molecular Probe社)を使用して、Alexa Fluor 647(AF647)等のフルオロフォアで標識する。健常ドナーの末梢血から新たに単離したNK細胞又は他のCD96発現細胞を、様々な濃度の抗CD96又は対照IgGの存在下で、AF647標識CD155−Fcと共にインキュベートする(細胞を回収し、AF647−CD155−Fcの細胞表面結合を、フローサイトメトリーにより試験する)。CD96発現細胞に対するCD155細胞の結合を防止する抗体は、CD96発現細胞に対するCD155−Fcの結合を阻止する能力により特定されるであろう。
抗CD96抗体の存在下での免疫細胞(NK細胞及び/又はT細胞等)の生存率を、以下のように分析する。健常ドナーに由来する末梢血免疫細胞を、フィコール勾配分離により単離する。免疫細胞を、適切な用量のヒトIL−2の存在下で抗CD96mAb濃度を増加させた96ウェルプレートに播種する。CD96発現細胞(NK細胞及び/又はT細胞等)の生存率並びにパーセントを、フローサイトメトリーにより経時的に分析する。このアッセイに好適な市販キットの非限定的な例は、アネキシンVアポトーシス検出キットである。
新しい血液試料を、健常ドナーから収集する。末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll−Paque密度勾配で遠心分離により調製する。高度に純粋なCD3−CD56+NK細胞を、磁気活性化細胞選別によりPBMCから得る。ヒトNK細胞でのIFN−γ産生に影響を及ぼすCD96の能力を分析するために、96ウェルU底プレートを、組換えヒトCD155−Fcキメラ(Sino Biological Inc.社;0.5μg/ウェル)又は無関係のヒトIgG1抗体で、一晩4℃にてコーティングする。その後、新しく精製したヒトNK細胞を、ヒトIL−12及びIL−18を添加した完全RMPI培地に播種して24時間後、IFN−γの細胞内含有量及び上清レベルを、様々な培地で分析する。或いは、ヒトNK細胞を、抗NKG2D、抗NKp46、抗NKp30、又は抗CD16抗体でコーティングしたウェルで24時間刺激して、他のNK細胞受容体と相互作用するCD96シグナル伝達の能力を分析する。試験する抗ヒトCD96抗体又は対照抗体を、上記のサイトカイン又は抗体を添加する前に培養に添加して、これらの試験抗ヒトCD96抗体が、ヒトNK細胞のIFNγ産生を増強する能力を確認する。IFNγ産生が対照よりも統計的に増加した場合を、有意であるとみなす。
参考文献
Claims (21)
- 哺乳動物の免疫抑制を低減又は軽減する方法であって、前記哺乳動物の1つ又は複数の細胞におけるCD96活性を少なくとも部分的に阻害又は低減することにより、前記哺乳動物の、免疫抑制を軽減すること、又は、免疫監視を強化又は回復させること、又は、これらの両方を行うステップを含む方法。
- 前記哺乳動物におけるCD96活性を少なくとも部分的に阻害又は低減するステップが、前記哺乳動物のCD96発現細胞を死滅させることを含まないか、又はそれに依存しない、請求項1に記載の方法。
- 前記哺乳動物におけるCD96活性を少なくとも部分的に阻害又は低減するステップが、前記哺乳動物にCD96阻害剤を投与することを含む、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記CD96阻害剤が、CD155へのCD96の結合及びCD96による細胞内シグナル伝達の少なくとも一方を少なくとも部分的に阻止又は阻害する、請求項3に記載の方法。
- 前記CD96阻害剤が、抗CD96抗体又は抗体断片である、請求項4に記載の方法。
- 1つ又は複数の他の治療剤を投与することを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の他の治療剤が、化学療法剤と、PD1及びCTLA4の少なくとも一方と結合する1つ又は複数の抗体又は抗体断片とを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記哺乳動物の1つ又は複数の細胞による、サイトカイン及びケモカインの少なくとも一方の発現、分泌、又はそれらの両方を増加又は増強する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サイトカイン及びケモカインの少なくとも一方が、MIP−1α、MIP−1β、RANTES、TNF−α、及びIFN−γを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記サイトカインがインターフェロンγ(IFN−γ)である、請求項9に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の細胞が、CD4+及びCD8+T細胞、γδT細胞、及びNK T細胞、及びナチュラルキラー(NK)細胞を含むT細胞である、請求項8、請求項9、又は請求項10に記載の方法。
- 前記哺乳動物の癌又は癌転移を治療又は予防する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物のウイルス感染症を治療又は予防する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- CD96阻害剤を、スクリーニング、設計、遺伝子操作、又は他の手段で製造するための方法であって、候補分子が、CD96活性を少なくとも部分的に阻害又は低減することにより、哺乳動物において免疫抑制を軽減すること、又は免疫監視を強化又は回復させること、又はそれらの両方が可能であるか否かを決定するステップを含む方法。
- 前記CD96阻害剤が抗体又は抗体断片である、請求項15に記載の方法。
- 前記CD96阻害剤が抗癌剤である、請求項15又は請求項16に記載の方法。
- 前記CD96阻害剤が抗ウイルス剤である、請求項15、請求項16、又は請求項17に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項15〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項15〜19のいずれか一項に記載の方法により、スクリーニング、設計、遺伝子操作、又は他の手段で製造されたCD96阻害剤。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法により使用するための、請求項20に記載のCD96阻害剤。
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