JP2016527199A5 - - Google Patents
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配列表
本明細書にはＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表が含まれており、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。２０１５年９月１６日作成のかかるアスキーファイルのコピーファイル名は８９３５２-８００２.ＷＯ００_ＳＬ.ｔｘｔであり、サイズは１８０,９６４バイトである。
本明細書に開示する実施形態は、一般に、細胞透過性ペプチド複合体を投与することによってさまざまな状態または疾患を治療するための組成物および方法に関し、特に、限定されるわけではないが非限定的に、その形態が、ヒトホメオボックス（ＨＯＸ）遺伝子および細胞透過化特性を備えるホメオドメインを含有する他のヒト遺伝子によりコードされるホメオドメインのアミノ酸配列に由来するペプチドを使用した、融合タンパク質またはタンパク質／核酸複合体であることに関する。より詳細には、諸実施形態は、１以上の機能性もしくは調節性のペプチドまたはタンパク質に連結された、ヒトホメオドメインまたは多様体またはその一部を含む送達系に関する。これらのペプチドにより、組織、細胞および細胞の核への侵入が促進されるため、生物学的に活性な第２の領域、すなわち「カーゴ（積み荷）」を含んだ融合タンパク質または複合体を治療のための作用部位に到達させることができる。
本明細書にはＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表が含まれており、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。２０１５年９月１６日作成のかかるアスキーファイルのコピーファイル名は８９３５２-８００２.ＷＯ００_ＳＬ.ｔｘｔであり、サイズは１８０,９６４バイトである。
本明細書に開示する実施形態は、一般に、細胞透過性ペプチド複合体を投与することによってさまざまな状態または疾患を治療するための組成物および方法に関し、特に、限定されるわけではないが非限定的に、その形態が、ヒトホメオボックス（ＨＯＸ）遺伝子および細胞透過化特性を備えるホメオドメインを含有する他のヒト遺伝子によりコードされるホメオドメインのアミノ酸配列に由来するペプチドを使用した、融合タンパク質またはタンパク質／核酸複合体であることに関する。より詳細には、諸実施形態は、１以上の機能性もしくは調節性のペプチドまたはタンパク質に連結された、ヒトホメオドメインまたは多様体またはその一部を含む送達系に関する。これらのペプチドにより、組織、細胞および細胞の核への侵入が促進されるため、生物学的に活性な第２の領域、すなわち「カーゴ（積み荷）」を含んだ融合タンパク質または複合体を治療のための作用部位に到達させることができる。
遺伝子機能の異常または機能低下による症状を呈する疾患では、遺伝子は、核酸、ペプチドおよびタンパク質などの生物学的活性分子がそれらの細胞内および核内での作用部位に直接送達されることで制御されて、転写、翻訳または転写因子の産生と作用への直接または間接的な干渉を介して遺伝子発現に影響を与えており、また、欠失または欠陥のあるタンパク産物は置換され、上記の生物学的活性分子が生殖細胞系列変異または体細胞変異を有する個体に提供される。遺伝的に欠損のある個体では、こうした生物学的に重要なタンパク質の直接置換は、（ｉ）これらのタンパク質が、通常の機能場所である中枢神経系（ＣＮＳ）などの細胞内部位および組織部位に到達することができないこと、および（ｉｉ）これらのタンパク質の免疫原性が障害となっている。
図１５ａおよび１５ｂは、ＬＰＳ刺激の０、３０および６０分前に２０００マイクログラムのＰＰＬ-００３で前処置してから行ったＬＰＳ投与後２時間のアミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ）の応答を示す。図１５ａにおいてエラーバーは平均標準誤差（ＳＥＭ）を表し、また、図１５ｂにおいて、データポイントは個々のマウスのものであり、水平ラインは中央値である。
タンパク質／核酸複合体を含むさらなる実施形態では、複合体は、第２の領域の一部として、核酸（またはＤＮＡ）結合ドメインをさらに含むことができる。ある実施形態では、核酸結合ドメインを、特異的高親和性、およびタンパク質の構成要素と核酸またはＰＮＡの構成要素との非共有結合的相互作用を仲介するために機能させてよい。
核酸結合ドメインは、ＲＮＡ結合領域またはＤＮＡ結合領域、例えば、転写因子、特に酵母またはヒト転写因子のＤＮＡ結合領域であってよい。例えば、ＧＡＬ４誘導可能ドメインは、ＤＮＡ配列ＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧ（配列番号８２）に対するタンパク質の選択的結合を仲介する（Cavey et al J Mol Biol 209：423、1989）。さらに、ＤＮＡ結合領域はＧＡＬ４アミノ酸２〜１４７個からなる。ＤＮＡ結合領域は、第２のドメイン上で一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡに結合してよい。
開示した、複合体または融合タンパク質の実施形態の他の用途として、抗菌性および抗ウイルス性処置の開発が含まれる。例えば、ＨＯＸ遺伝子由来または他のヒトホメオドメイン由来の細胞透過性ペプチドを使用して、組換え抗体、非人工的に存在する自然免疫エフェクター分子またはＤＮＡ結合分子を感染細胞の細胞質内で輸送することができ、これにより、細菌、寄生虫の破壊、または細菌もしくはウイルスが複製する重要な段階の妨害を行う。
好適なペプチドおよびタンパク質としては、治療および／または診断に応用されるものが含まれ、例えば、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、人工の免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、複合体、酵素、免疫共刺激分子、免疫調節分子、アンチセンスＲＮＡ、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ変異体、毒素、例えば、エンドトキシンＡ、コリシンＡ、ｄ-エンドトキシン、ジフテリア毒素、桿菌アントロクス（anthrox）毒素、コレラ毒素、百日咳毒素、大腸菌の各種毒素、志賀毒素または志賀毒素様毒素、条件付き毒素などの毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質および成長因子、膜タンパク質、血管作動性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、並びに誘導体といった用途が含まれるが、これらに限定されない。このようなコード配列が含まれている場合、これらの配列は、典型的に、好適なプロモーターに機能的に連結されてよく、そのような好適なプロモーターは、リボザイム（複数可）の発現を駆動するプロモーター、または異なるプロモーター（単数または複数）であってよい。
第１の（ＨＯＸまたは他のヒトホメオドメイン）領域および第２の（カーゴ）領域を、切断可能なリンカー領域で連結してよく、このリンカー領域は、その付加により複合体の機能が損なわれない限り、リンカーの目的に好適な任意の領域であってよい。切断可能なリンカー領域は、プロテアーゼで切断可能なリンカーであるが、例えば、低分子で切断可能な他のリンカーを使用してよい。これらのリンカーには、臭化シアンで切断可能なＭｅｔ-Ｘ部位、ヒドロキシルアミンで切断可能なＡｓｎ-Ｇｌｙ、弱酸で切断可能なＡｓｐ-Ｐｒｏ、および特に、ＮＢＳ-スカトールで切断可能なＴｒｐ-Ｘが含まれる。プロテアーゼによる切断部位は、より穏やかな切断条件を必要とし、例えば、第Ｘａ因子、トロンビンおよびコラゲナーゼに見られる。これらのいずれを使用してもよい。正確な配列は当該技術分野で利用可能であり、当業者は問題なく好適な切断部位を選択するであろう。一例として、第Ｘａ因子が標的とする、プロテアーゼによる切断領域はＩ Ｅ Ｇ Ｒ（配列番号８３）である。エンテロキナーゼが標的とする、プロテアーゼによる切断領域はＤ Ｄ Ｄ Ｄ Ｋ（配列番号８４）である。トロンビンが標的とする、プロテアーゼによる切断領域はＬ Ｖ Ｐ Ｒ Ｇ（配列番号８５）である。切断可能なリンカー領域は、細胞内プロテアーゼが標的とするリンカー領域であってよい。リンカーは、機能に必要というわけではないが、第１領域と第２の領域の間にリンカーを含めて、機能を損なうことなく第２の領域を標的に合わせて放出させる、またはリンカーの切断で第２の領域の生物学的活性を高めてよい。
開示の実施形態により、具体的な治療処置用に同定済みの多数のペプチドのうち任意のものを細胞内および核内の作用部位へ効率的に移行させることを含む、高い治療的作用を得ることができ、これにおいて、（ｉ）標的組織はＣＮＳであり、かつ、（ｉｉ）標的組織を問わず、かかる移行により、複合体の暴露および／もしくは有効性を減じる、または有害なもしくは望ましくない臨床的事象を発生させるような、望ましくない免疫応答を生じさせることがない。「第２の領域」の生物学的に活性なペプチドは、ヒトホメオドメイン配列または多様体またはその一部（「第１の領域」）に結合される前は、それらに非人工的には会合していない。
さらに、さまざまな実施形態では、複合体または融合タンパク質は、やはりカーゴペプチドを含む第３の領域を含んでよい。図３ａおよび３ｂは、アミノ酸６０個のヒトホメオドメイン（「第１の領域」、ここでは短縮して表示）を含む別の実施形態、および、融合タンパク質または複合体に、それらが作用する細胞部位を標的にさせ得るさらなるカーゴタンパク質を示す。図３ａにおいて、左にあるヒトＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメイン（１）は、そのＣ末端（４）で、関心対象である生物学的に活性なカーゴペプチド（「第２の領域」）（２）のＮ末端（５）に連結しており、一方、関心対象である第３のカーゴペプチド（「第３の領域」）（７）は、そのＮ末端（８）で「第２の領域」（２）のＣ末端（６）に連結している。この第３の領域は、融合タンパク質全体にペプチド結合を介して連結または融合した状態のままであるか、または、標的とした組織内の特定部位への取り込みもしくは結合終了後に除去するよう設計してよい。
図３ｂは別の実施形態を示しており、右にあるヒトＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメイン（１）は、そのＮ末端（３）で第２の領域（２）のＣ末端（６）に連結しており、一方、第３の領域のカーゴペプチド（７）は、第２の領域（２）のＮ末端（５）で連結している。連結は、単純なペプチド結合（１３）または当技術分野で公知のリンカー配列（１２）、またはこれらの組み合わせであってよいが、その際、リンカー配列の付加により複合体の機能が損なわれないことが条件となる。第２のカーゴペプチド（「第３の領域」）（７）は、複合体または融合タンパク質に、それが作用する細胞部位を標的にさせ得る。実施例２を参照のこと。
別の実施形態は、複合体または融合タンパク質の調製方法であり、
（ｉ）プロモーターに機能的に連結され、融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターにより形質転換した宿主細胞を培養し、これにおいて、
（ａ）第１の領域は、ＨＯＸペプチドまたは他のヒトホメオドメインペプチドを含み、
（ｂ）前記第１の領域に非人工的には会合していない第２の領域は、前記宿主細胞内の発現ベクターから前記融合タンパク質を発現させる条件下で、ペプチドまたはタンパク質を含むこと、および
（ｉｉ）前記融合タンパク質を回収し、かかる回収方法は、アミノ酸尾部または別のリガンドを前記複合体に融合させることを含み、ここで、尾部は、少なくとも１つの基質に結合することができるが別の基質には結合せず、また、前記複合体を少なくとも１つの基質に尾部を介して結合させ宿主細胞の構成要素がこの基質に結合しないようにすること、および、前記複合体を別の基質と接触させ、その別の基質に前記複合体は結合しないが残りの宿主細胞の構成要素は結合するようにすることを含む、複合体または融合タンパク質の調製方法である。
（ｉ）プロモーターに機能的に連結され、融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターにより形質転換した宿主細胞を培養し、これにおいて、
（ａ）第１の領域は、ＨＯＸペプチドまたは他のヒトホメオドメインペプチドを含み、
（ｂ）前記第１の領域に非人工的には会合していない第２の領域は、前記宿主細胞内の発現ベクターから前記融合タンパク質を発現させる条件下で、ペプチドまたはタンパク質を含むこと、および
（ｉｉ）前記融合タンパク質を回収し、かかる回収方法は、アミノ酸尾部または別のリガンドを前記複合体に融合させることを含み、ここで、尾部は、少なくとも１つの基質に結合することができるが別の基質には結合せず、また、前記複合体を少なくとも１つの基質に尾部を介して結合させ宿主細胞の構成要素がこの基質に結合しないようにすること、および、前記複合体を別の基質と接触させ、その別の基質に前記複合体は結合しないが残りの宿主細胞の構成要素は結合するようにすることを含む、複合体または融合タンパク質の調製方法である。
アフィニティー精製過程に含まれる別の実施形態では、複合体または融合タンパク質に結合している尾部またはリガンドの使用が実施形態に含まれ、これにより、陽性および陰性いずれの精製工程も可能である。
第１および第２の領域の結合配列すべてに、精製を行いやすくするために、さらなるアミノ酸配列をアミノ末端またはカルボキシ末端いずれにでも加えることができる。このような配列は、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号１０２）、ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号１０３）、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号８０）、ＨＨＨＨＨＨＧＳ（配列番号１０４）などで、後者はＧＳリンカーを利用している。図４および５を参照のこと）、および他に当業者に公知の同様のタグを含んでよい。さらに、ビオチン受容タンパク質（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号１０５）などのリガンドを活性ＢｉｒＡタンパク質とともに使用してよい。Ｎ末端を開始するメチオニンを含む配列については、Ｎ末端精製ドメインを付加した場合は、メチオニンは、ヒトホメオドメインペプチドの第１の領域のＮ末端にくるのではなく精製ドメインのＮ末端にくることになる。いずれのタグについても、当技術分野で公知のペプチドリンカーを使用し精製後に特異的プロテアーゼで除去してよい。
ある実施形態では、複合体または融合タンパク質は、ヒトホメオドメインまたは多様体またはその一部に連結している、機能酵素である生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質を含む。
他の実施形態は、同定されている状態または疾患を治療するためのあらゆる製剤を含む。
配列番号２１および配列番号２２の上流の作製.標的タンパク質の発現を制御でき、ＴＥＶで切断可能なＮ末端のＨｉｓタグが付いた、ホメオボックス候補の２タンパク質ＰＰＬ-００２（配列番号２１、表３）とＰＰＬ-００３（配列番号２２、表３）の細菌発現構成体を、Ｔ７ベクター系において作製した。Ｔ７発現系は、動物での効力試験のための材料作製に好適であるが、他の発現ベクター／発現系も企図され、分子生物学／生物工学技術分野の当業者には公知である。
合成により作製し、コドンを最適化した遺伝子配列をベクターにクローニングし、カナマイシン選択法で選択したタンパク質の誘導発現を行った。ホメオボックスタンパク質ＰＰＬ-００２（例えば、プラスミドｐＪ４１１：１２９９２５）およびＰＰＬ-００３（例えば、ｐＪ４１１：１２９９２６）のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を、それぞれ、図６および図７に示す。発現したタンパク質の各々は、ＳＡＡの転移配列の付いた６ＨＩＳリーダー配列（配列番号８０）、およびそれに続くＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）（配列番号８１）を含有し、適切なＮ末端を有するＰＰＬ-００２またはＰＰＬ-００３配列を与える。
ＤＨ５αへの形質転換の際、各構成体につき６クローンを、挿入部の存在について制限酵素消化により試験した。合成したＤＮＡ配列の配列決定を確認のため行った。各タンパク質について発現が検証・確認された構成体を使用して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている菌株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（www.lifetechnologies.com/us/en/home/brands/invitrogen）を形質転換し、発現が最良のクローンそれぞれについてＰＤグリセロール細胞ストックを調製した。
発現最適化の予備試験をフラスコ振盪培養で実施した。小規模培養槽への移動時、細胞増殖のさらなる最適化を実施した。初期の酸素供給およびｐＨ設定値約７.１が最適であった。導入温度を約１８℃で最適化した。
本明細書に開示する組成物の実施形態は、薬理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含んでよい。「薬理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」という用語は、それ自体は治療剤ではないが、治療剤を被検体に送達するための担体またはビヒクルとして使用される物質、または、医薬組成物への添加によりその組成物の取扱いもしくは保管特性が改善されるかまたは組成物の単位用量の形成が可能もしくは容易になる物質であり、忍容できない毒性または組成物の他成分との相互作用を生じることのないあらゆる物質をいう。
配列番号２１および２２それぞれのサイズにより、融合タンパク質全体の人工的合成が可能である。配列番号２１および２２、または多様体またはそれらの一部の組換え合成により作製する場合は、Ｎ末端のメチオニンを含んでよい。リンカーは、機能には必要ではないが、複合体の機能を損なわない限り、別の実施形態における第１および第２の領域間にリンカーを含めてよい。その末端には、この複合体の実施形態を得るために当技術分野で公知の任意のリンカー（例えば、表２を参照のこと）を使用してよく、リンカー配列がこれら第１および第２の領域をつなぐ程度まで、配列番号２１および２２は、少なくとも一部、改変されることが考えられる。
なおさらなる実施形態では、精製を行いやすくするために、さらなるアミノ酸配列（「尾部」）をアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれにでも付加することができる。このような配列に、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号１０２）、ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号１０３）、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号８０）、および当業者に公知の他の同様のタグを含めてよい。このようなタグにリンカーを含めてもよいし、含めなくてもよい。さらに、ビオチン受容タンパク質（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）などのリガンド（配列番号１０５）を活性ＢｉｒＡタンパク質とともに使用してよい。Ｎ末端を開始するメチオニンを含む配列については、Ｎ末端精製ドメインを付加した場合は、メチオニンは、ヒトホメオドメインペプチドの第１の領域のＮ末端にくるのではなく精製ドメインのＮ末端にくることになる。図５は、ＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメインがＮＢＤカーゴペプチドに結合し、それがさらにＧＳリンカー一によりＨｉｓタグに結合している実施形態を示す。
さまざまな実施形態では、配列番号２１および２２またはその一部は、炎症性疾患治療の全身送達または局所送達用に製剤化され得る。局所送達の実施形態には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）用の吸入液体または乾燥粉末製剤、結腸および／または直腸のインメント（inment）の付いた潰瘍性大腸炎またはクローン病（炎症性腸疾患）用の結腸浣腸製剤、ドライアイ（乾性ケラトコンジュンティヴィティス（keratoconjuntivitis））、ぶどう膜炎および強膜炎などの炎症性眼疾患用の点眼製剤、並びに乾癬および円形脱毛症などの炎症性および自己免疫性皮膚疾患用の外用軟膏およびクリーム製剤などの例が含まれる。全身投与用製剤には、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬等のような慢性炎症性疾患の治療、並びに、急性心筋梗塞（冠動脈血栓症）および脳卒中の予防、脳卒中および心筋梗塞（梗塞サイズ縮小および機能回復）並びに臓器移植患者（臓器機能の回復）における虚血再灌流傷害の予防のための、炎症性アテローム性プラークの不安定性のような急性炎症性状態の治療を目的とした、静脈内、皮下および筋肉内注射製剤および持続的放出のための注射可能インプラント製剤を含む。ＮＦ-?Ｂ炎症経路活性化が、例えば、結腸癌、肺癌および一部の皮膚癌において文献で広く報告されているように、特定の癌の病因および進行に関与している場合、全身投与には癌治療が含まれる。
別の実施形態では、ｐ２００ペプチドは、配列番号３〜１９のいずれに結合してもよい。
なおさらなる実施形態では、精製を行いやすくするために、さらなるアミノ酸配列をアミノ末端またはカルボキシ末端いずれにでも加えることができる。このような配列は、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号１０２）、ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号１０３）、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号８０）、および当業者に公知の他の同様のタグを含んでよい。このようなタグにリンカーを含めてもよいし、含めなくてもよい。さらに、ビオチン受容タンパク質（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号１０５）などのリガンドを活性ＢｉｒＡタンパク質とともに使用してよい。Ｎ末端を開始するメチオニンを含む配列については、Ｎ末端精製ドメインを付加した場合は、メチオニンは、ヒトＨＯＸ Ｃ１２またはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメインのＮ末端にくるのではなく精製ドメインのＮ末端にくることになる。
ＰＣ１ ＣＴＴ ｐ２００ペプチドを第２の領域に有する、６０アミノ酸ヒトＨＯＸ Ｃ１２もしくはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメインまたは多様体またはその一部を含む、融合タンパク質の実施形態は、静脈内、皮下、筋肉内および注射可能な持続放出用インプラント製剤などの全身投与用製剤に含められことになる。また、これらの製剤を、糸球体でろ過されネフロンに入った後、尿細管細胞により再吸収させるか、または血液を介して腎嚢胞細胞を標的にすることができるバソプレシン２受容体（Ｖ２Ｒ、下記を参照のこと）のような特異的受容体を介して標的にするような、特異構造を含むよう製剤化してもよい。このような構造を表す第３の領域は、例えば、図３を参照のこと。留意されるとおり、融合タンパク質の生物学的活性は、ｃｙｓｔ様構造の形成が阻害されているＰＫＤ変異のある腎尿細管細胞培養のインビトロで、また、嚢胞形成および腎肥大の進行が阻害されているＰＫＤげっ歯類モデルにおいても示すことができる（Ｌａｌら、２００８年）。融合タンパク質の実施形態（配列番号２４もしくは２５、もしくはその一部であって開始因子メチオニンを含まないもの、または、別のＰＣ１ ＣＴＴ ｐ２００ペプチド含有複合体実施形態）が嚢胞形成に及ぼす効果を、これらの尿細管細胞培養のインビトロで、また、ＰＫＤ動物モデル（例えば、ＰＫＤ１トランスジェニックマウス（Ｐｋｄ２Ｗ５２５／-））においても評価していく。このＰＫＤ-１トランスジェニックマウスモデルでは、腎の拡大阻害（すなわち、腎肥大阻害）について超音波測定を行う。ＰＣ１ ＣＴＴ ｐ２００ペプチドを第２の領域に含む、融合タンパク質および／または複合体の開示実施形態のうち１以上の医薬製剤を使用するＰＫＤ患者において、総腎容積および嚢胞の大きさと数の増減をＭＲＩで評価する。
腎嚢胞を標的にする：ＰＫＤにおける嚢胞の一部または大部分は腎の集合管に最初に発生すると考えられている。集合管細胞はバソプレシン２受容体（Ｖ２Ｒ）を発現する。いくつかの実施形態にペプチドＶ２Ｒ拮抗因子を連結して含めるか、またはペプチドＶ２Ｒ拮抗因子を融合タンパク質のさらなるセグメントとして付加することにより、ヒトＨＯＸ Ｃ１２またはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメインペプチドまたは多様体またはその一部を第１の領域に有し、ｐ２００またはｐ２１を第２の領域に有する融合タンパク質および複合体実施形態に、集合管を起源とする腎嚢胞を標的にさせることが可能であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーの付加により複合体の機能が損なわれることがなければ、除去可能なリンカーを使用してよい。非競合的ペプチドＶ２Ｒ拮抗因子の一例が、Rihakova, et al. "VRQ397 (CRAVKY): a novel noncompetitive V2 receptor antagonist" Am. J. Physiol. Integr. Comp. Physiol. 297:R1009-R1018, 2009 ("CRAVKY" disclosed as SEQ ID NO: 29）により報告された。露出されたヒトホメオドメイン領域が一旦細胞の細胞質まで侵入を促進した後は連結解除または溶解するよう設計されたリンカーを有する、ヒトＨＯＸ Ｃ１２もしくはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメイン-ｐ２００および／またはヒトＨＯＸ Ｃ１２もしくはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメイン-ｐ２１の融合（複合体）タンパク質の実施形態のＮ末端またはＣ末端に、非競合的ペプチドＶ２Ｒ拮抗因子であるＶＲＱ３９７（ＣＲＡＶＫＹ）（表３に示す配列番号２９）を付加する試験を行い、有効性（腎の大きさの変化など）並びに作用部位への送達効率を得るための必要用量について評価を行いたいと考えている。さらに、ペプチドＶ２Ｒ拮抗因子が異なる機序を介して融合タンパク質または複合体の実施形態の有効性に影響を与えるのかどうかについて調べていく。
配列番号２９（表３）：ペプチドＶ２Ｒ ６アミノ酸拮抗因子：ＣＲＡＶＫＹ。
さまざまな実施形態では、ＰＫＤ治療たのめに標的としたペプチドは、以下のいずれでもよい：ＣＲＡＶＫＹ-（リンカー）-ｐ２００-ヒトホメオドメイン（配列番号２９として開示した"ＣＲＡＶＫＹ"）；ＣＲＡＶＫＹ-（リンカー）-ｐ２１-ヒトホメオドメイン（配列番号２９として開示した"ＣＲＡＶＫＹ"）；ヒトホメオドメイン-ｐ２００-（リンカー）-ＣＲＡＶＫＹ（配列番号２９として開示した"ＣＲＡＶＫＹ"）；ヒトホメオドメイン-ｐ２１-（リンカー）-ＣＲＡＶＫＹ（配列番号２９として開示した"ＣＲＡＶＫＹ"）。このうち、最初の２つの実施例ではＣＲＡＶＫＹ配列（配列番号２９）はタンパク質のＮ末端にあり、残りの２つの実施例ではタンパク質のＣ末端にある。
例えば、ＣＲＡＶＫＹペプチド（配列番号２９）連結の有無による、ｐ２１ペプチドおよびｐ２００ペプチドを含む実施形態の相対活性を、上記のようにＰＫＤ嚢胞細胞培養でインビトロ評価することができる。ただし、これらの細胞は、細胞表面にＶ２Ｒを発現するようにも操作された細胞である。例えば、上記のような、記載されたさまざまなＣＲＡＶＫＹ含有融合タンパク質（配列番号２９として開示した"ＣＲＡＶＫＹ"）または複合体の実施形態に対するインビトロでの用量反応は、細胞培養のインビトロ表現型をｃｙｓｔ様から管様に変化させる能力を、ＣＲＡＶＫＹ（配列番号２９）のない、同一の融合タンパク質または複合体の実施形態と比較して行うことができる。さらに、これらの構成体を、腎の肥大を低減させる相対的な能力について上記のＰＫＤマウスモデルで試験することもできる。
（１）ヒトＨＯＸ Ｃ１２もしくはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメイン-ｐ２１の融合タンパク質製剤もしくは複合体製剤の実施形態および／またはヒトＨＯＸ Ｃ１２もしくはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメイン-ｐ２００の融合タンパク質製剤または複合体製剤の実施形態のＰＫＤ嚢胞細胞培養における有効性が認められる場合、および（２）上記のＰＤＫ-１トランスジェニックマウスモデルにおいて、ＣＲＡＶＫＹペプチド（配列番号２９）を使用して標的とさせた場合に、より大きな効力（すなわち、用量-反応曲線の左への移動）が認められる場合は、配列番号２４、２５、２７および／もしくは２８（または多様体またはその一部）、または対応するそれらの複合体ではなく、配列番号２９を含む上記の配列実施形態の少なくとも１つについて、ＰＤＫ-１トランスジェニックマウスモデル並びに罹患者で試験を行う。腎肥大速度は、公知の方法で評価される。
配列番号１〜１９の任意の配列、または多様体またはそれらの一部を含み（１）ｐ２００ペプチドまたは（２）ｐ２１ペプチドに結合している実施形態など、別の実施形態には、当技術分野で公知の任意のリンカーを実施形態の機能を損なうことなく１以上含んでいるさまざまな融合タンパク質または複合体が含まれ、これらにさらにＣＲＡＶＫＹペプチド（配列番号２９）を含めてよい。
実施例３
リソソーム蓄積症の細胞透過性ペプチド酵素補充療法
細胞透過性ペプチドは抗体などの大きな「カーゴ（積み荷）」ペプチドまたはタンパク質が細胞に侵入できるようにすことができるという強力な証拠がある。ＨＯＸ由来ペプチド、または開示に類似する、他のヒトホメオドメインの細胞透過性ペプチドを含む複合体もしくは融合タンパク質の実施形態は、大きい分子が細胞膜を通過して細胞内の作用部位へ入るのを助ける（chaperone）ことができる。これらの実施形態は、他の場合には抗原性となるカーゴペプチドおよびタンパク質の免疫原性も低下させるため、こうしたペプチドおよびタンパク質が血液脳関門を通過してＣＮＳへ入ることができる。したがって、開示した実施形態およびそれらの修正形態形態は、複合体または融合タンパク質の第１の領域がアミノ酸６０個のヒトホメオドメインまたは多様体またはその一部であり、第２の領域が活性酵素である実施形態も含む。これらの化合物により、リソソーム蓄積症などの先天性酵素欠損の患者の酵素機能が回復されるであろう。ここに、リソソーム蓄積症および関連「カーゴ（積み荷）」構造の３実施例を含めるが（（１）ゴーシェ病のための、例えば、配列番号３０に示すグルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）、（２）ハーラー症候群のための、例えば、配列番号４５に示すアルファ-Ｌ-イズロニダーゼ；および（３）ハンター症候群のための、例えば、配列番号４８に示すイズロン酸-２-スルファターゼ）、他のリソソーム蓄積症において欠如しているまたは欠陥のある酵素を積んだ他の「カーゴ（積み荷）」を有するヒトホメオドメイン融合タンパク質または複合体に対しても同一の原則が適用される。
リソソーム蓄積症の細胞透過性ペプチド酵素補充療法
細胞透過性ペプチドは抗体などの大きな「カーゴ（積み荷）」ペプチドまたはタンパク質が細胞に侵入できるようにすことができるという強力な証拠がある。ＨＯＸ由来ペプチド、または開示に類似する、他のヒトホメオドメインの細胞透過性ペプチドを含む複合体もしくは融合タンパク質の実施形態は、大きい分子が細胞膜を通過して細胞内の作用部位へ入るのを助ける（chaperone）ことができる。これらの実施形態は、他の場合には抗原性となるカーゴペプチドおよびタンパク質の免疫原性も低下させるため、こうしたペプチドおよびタンパク質が血液脳関門を通過してＣＮＳへ入ることができる。したがって、開示した実施形態およびそれらの修正形態形態は、複合体または融合タンパク質の第１の領域がアミノ酸６０個のヒトホメオドメインまたは多様体またはその一部であり、第２の領域が活性酵素である実施形態も含む。これらの化合物により、リソソーム蓄積症などの先天性酵素欠損の患者の酵素機能が回復されるであろう。ここに、リソソーム蓄積症および関連「カーゴ（積み荷）」構造の３実施例を含めるが（（１）ゴーシェ病のための、例えば、配列番号３０に示すグルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）、（２）ハーラー症候群のための、例えば、配列番号４５に示すアルファ-Ｌ-イズロニダーゼ；および（３）ハンター症候群のための、例えば、配列番号４８に示すイズロン酸-２-スルファターゼ）、他のリソソーム蓄積症において欠如しているまたは欠陥のある酵素を積んだ他の「カーゴ（積み荷）」を有するヒトホメオドメイン融合タンパク質または複合体に対しても同一の原則が適用される。
タンパク質のグリコシル化も最終構造において改変され得る。幾つかのグリコシル化部位でマンノースが露出されると、例えば、配列番号３１および／もしくは３２または多様体またはそれらの一部を含む実施形態がリソソームをより優れて標的にすることができる。
なおさらなる実施形態では、精製を行いやすくするために、さらなるアミノ酸配列をアミノ末端またはカルボキシ末端いずれにでも加えることができる。このような配列は、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号１０２）、ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号１０３）、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号８０）、および当業者に公知の他の同様のタグを含んでよい。このようなタグにリンカーを含めてもよいし、含めなくてもよい。さらに、ビオチン受容タンパク質（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号１０５）などのリガンドを活性ＢｉｒＡタンパク質とともに使用してよい。Ｎ末端を開始するメチオニンを含む配列については、Ｎ末端精製ドメインを付加した場合は、メチオニンは、ヒトホメオドメインまたはＨＯＸペプチド第１の領域のＮ末端にくるのではなく精製ドメインのＮ末端にくることになる。
ヒトホメオドメインまたは多様体またはその一部、および、例えば、第２の領域のＧＣａｓｅ配列を含む複合体または融合タンパク質の実施形態は、静脈内、皮下、筋肉内投与および注射が可能な持続的放出用インプラント製剤などの全身投与用製剤中に含まれることになる。ヒトの変異型がマウスＧＣａｓｅ配列に組み込まれているゴーシェ病マウスモデルでは、これらの融合タンパク質は、さまざまな組織における基質の蓄積を予防し、ゴーシェ病の神経学的症状を予防する。
６０アミノ酸ヒトＨＯＸ Ｃ１２もしくはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメイン（または多様体またはその一部）の複合体または融合タンパク質の実施形態の免疫原性を、当技術分野で周知のリンパ球増殖アッセイを用いて調べていく。例えば、６０アミノ酸ヒトホメオドメインまたは多様体またはその一部が、他の場合には免疫原となるタンパク質の免疫原性を取り除く一般的能力を検討するため、破傷風トキソイドに免疫のある被検者から単離されたヒト単核球を、約１μＭ〜約１１５μＭの範囲のさまざまな判定対象濃度のヒトホメオドメイン（または多様体またはその一部）ペプチド-破傷風トキソイド複合体または破傷風トキソイドとともにインビトロで３日間インキュベートする。その後、培養リンパ球による３Ｈ-チミジン取り込み量を測定する。
リンカーは機能に必要というわけではないが、機能を損なわせなければさまざまな実施形態において、例えば、配列番号１と３３の間、または配列番号２と３３の間、または多様体またはそれらの一部にリンカーを含めてよい。当技術分野で公知の任意のリンカーを使用してよいが、その付加により複合体の機能が損なわれないことが条件となる。例えば、配列番号３４および／もしくは３５または多様体またはそれらの一部などの実施形態は、リンカー配列で第１と第２の領域がつながる程度に、少なくとも一部、改変されることが考えられる。
なおさらなる実施形態では、精製を行いやすくするために、さらなるアミノ酸配列をアミノ末端またはカルボキシ末端いずれにでも加えることができる。このような配列は、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号１０２）、ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号１０３）、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号８０）、および当業者に公知の他の同様のタグを含んでよい。このようなタグにリンカーを含めてもよいし、含めなくてもよい。さらに、ビオチン受容タンパク質（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）などのリガンド（配列番号１０２）を活性ＢｉｒＡタンパク質とともに使用してよい。Ｎ末端を開始するメチオニンを含む配列については、Ｎ末端精製ドメインを付加した場合は、メチオニンは、ヒトホメオドメインまたはＨＯＸペプチド第１の領域のＮ末端にくるのではなく精製ドメインのＮ末端にくることになる。
通常は酵素が少ないまたは欠如している細胞内に酵素がうまく機能的移行を果たしたかどうか、例えば、ＨＥＫ２９３細胞内の酵素の移行は、酵素の基質を与えてグアニル酸シクラーゼ活性標準的な方法で測定することにより判定することができる。グアニル酸シクラーゼ活性の上昇を示す証拠が認められた場合、それは、細胞透過化能力を有するヒトＨＯＸ Ｃ１２またはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメインなどの実施形態がヒト細胞に機能酵素を送達することができるという実験的証拠として捉えられるであろう。
例えば、ヒトＨＯＸ Ｃ１２またはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメインとＲｅｔＧＣ-１酵素との融合タンパク質または複合体を含む実施形態をノックアウトマウスモデルで評価する。ＬＣＡ１に最も近い動物モデルは、ＲｅｔＧＣ-１をコードする遺伝子Ｇｕｃｙ２ｅをノックアウトさせたマウスである。このマウスは、錐体光受容体の無反応を示し、ＬＣＡ１表現型を示す。Jacobson et al. "Determining consequences of retinal membrane guanylyl cyclase (RetGC1) deficiency in human Leber congenital amaurosis en route to therapy: residual cone-photoreceptor vision correlates with biochemical properties of the mutants." Human Molecular Genetics 22(1):168-83, 2013。
ヒトホメオドメインとＲｅｔＧＣ-１との複合体または融合タンパク質の実施形態を網膜（球後）注射または点眼剤（すなわち、局所投与）によりノックアウトマウスに投与し、網膜電図（ＥＲＧ）に見る機能回復を視力の戻りとして評価する。結果を、ヒトＨＯＸ Ｃ１２またはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメイン-ＲｅｔＧＣ-１を含まない緩衝液を投与した対照群のものと比較する。ある実施形態では、マウスに、ヒトＨＯＸ Ｃ１２もしくはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメインまたは多様体またはその一部に結合させたＲｅｔＧＣ-１ペプチドを含む製剤、または１つ以上のリンカーを含んだ、融合タンパク質または複合体を含むＲｅｔＧＣ-１の代替実施形態を、マウス２０ｇあたり少なくとも約１μｇ〜少なくとも約５００μｇの用量で、網膜（球後）注射または点眼剤によりタンパク質を投与する。ＥＲＧで見た機能の回復について、未治療の対照群と比較して調べる。
リンカーは機能に必要というわけではないが、機能を損なわせなければさまざまな実施形態において、例えば、配列番号１と３６、３９、または４２との間、または配列番号２と３６、３９、または４２との間、またはその一部にリンカーを含めてよい。当技術分野で公知の任意のリンカーを使用してよいが、その付加により複合体の機能が損なわれないことが条件となる。例えば、表２を参照のこと。配列番号３７、３８、４０、４１、４３および／または４４などの実施形態は、リンカー配列で第１と第２の領域がつながる程度に、少なくとも一部、改変されることが考えられる。
なおさらなる実施形態では、精製を行いやすくするために、さらなるアミノ酸配列をアミノ末端またはカルボキシ末端いずれにでも加えることができる。このような配列は、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号１０２）、ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号１０３）、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号８０）、および当業者に公知の他の同様のタグを含んでよい。さらに、ビオチン受容タンパク質（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号１０５）などのリガンドを活性ＢｉｒＡタンパク質とともに使用してよい。Ｎ末端を開始するメチオニンを含む配列については、Ｎ末端精製ドメインを付加した場合は、メチオニンは、ヒトホメオドメインまたはＨＯＸペプチド第１の領域のＮ末端にくるのではなく精製ドメインのＮ末端にくることになる。ヒトＨＯＸ Ｃ１２またはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメインとジンクフィンガーとの融合タンパク質または複合体の実施形態について、構成体が機能的に移行すること、および変異型ＨＴＴ遺伝子が抑制されることを測定するため、適切な細胞株で試験を行う。マウスＨＴＴ遺伝子の第１エキソンを、１１１ＣＡＧリピート（ＳＴＨｄｈＱ１１１／ＨｄｈＱ１１１またはＳＴＨｄｈＱ７／ＨｄｈＱ１１１）を有するヒトエキソンで置換したＳＴＨｄｈノックイン細胞を使用する。
ある実施形態では、融合タンパク質または複合体を含有する６０アミノ酸ヒトＨＯＸ Ｃ１２もしくはＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメイン（または多様体またはその一部）を用いたジンクフィンガーカーゴタンパク質の移行について、ＳＴＨｄｈノックイン細胞を、最適マイクロモル濃度の判定対象と考えられる約１μＭ〜約１１５μＭで１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、または２４時間などのさまざまな期間インキュベーションした後の培養中のジンクフィンガーカーゴタンパク質の存在を調べる。変異型ＨＴＴ遺伝子の発現を公知の方法により評価し、結果と対照培養と比較する。
Ｒ６／２マウスは、最も広く使用されているＨＤ動物モデルである。このＨＤノックインマウスモデルは、ヒト患者で障害が知られている脳内部位、線条体でヒトＨＴＴ遺伝子を過剰発現する。Ｒ６／２マウスは、ＨＤ患者の徴候および症状に似た運動障害を表現型として示し、例えば、Ｒ６／２マウスは前足の爪で物をとる能力が欠如している。
結核ワクチン抗原８５Ａおよびそのエピトープ.抗原８５複合体は、マイコバクテリアで主に分泌される極めて類似した幾つかのタンパク質をコードする多重遺伝子族である。シグナルペプチドは成熟したＡｇ８５タンパク質で開裂する。Ａｇ８５Ａは、アミノ酸３３８個からなる分子量３５.７ｋＤａ、予測ｐＩ値６.５のペプチドである。細胞外α-抗原とも呼ばれ、細胞壁合成において重要なｍｙｃｏｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ活性を有する。組換え型アデノウイルスベクター、組換え型Ａｇ８５Ａそのものまたは重複１５ｍｅｒペプチドセットを使用してマウスの経鼻および全身免疫化を行った後（単一Ｂａｌｂ／ｃ Ｈ-２Ｄ拘束エピトープ）、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける低分子ペプチドエピトープの免疫原性および防御活性についての解析（Tchilian et. al. Immunization with different formulations of Mycobacterium tuberculosis antigen 85A induces immune responses with different specificity and protective efficacy. Vaccine 31:4624-31, 2013）では、経鼻の免疫化後の結核菌（Ｍｔｂ）投与に対する優れた防御が示された。ＣＤ４ ８５Ａ９９-１１８およびＣＤ８ ８５Ａ７０-７８の応答は防御的であったがＣＤ８ ８５Ａ１４５-１５２に対する応答は防御的ではなかった。
乳児におけるＢＣＧワクチンの有効性を高めるための、アデノウイルスＡｇ８５Ａワクチンを用いたヒトワクチン臨床試験では、わずかな免疫応答しか誘導されず、臨床的有効性はなかった（Tameris et.al. Safety and efficacy of MVA85A, a new tuberculosis vaccine, in infants previously vaccinated with BCG: a randomised, placebo-controlled phase 2b trial. The Lancet 381:1021-1028, 2013）。これは、免疫応答を下方制御するＩＬ-１０応答を誘発することが示されているアデノウイルス成分がもつＴＬＲ２作動特性の抑制作用のため、またはいくつかのＡｇ８５Ａエピトープに対する非防御的応答のためである可能性がある。
結核ワクチン.防御的ヒト結核ワクチンの現在の実施形態は、複合体または複合体混合物を吸入、経鼻または非経口的注射経路で投与するものである。ある実施形態では、吸入経路により肺の局所免疫が提供される。
Ｂａｌｂ／ｃマウスでは、複合体または複合体混合物が、第１の領域である、配列番号１〜１９または多様体またはその一部のいずれかに記載の配列を含むが、これらに限定されない、ヒトホメオドメインまたは多様体またはその一部が、かかる第１の領域と非人工的には会合していない第２の領域に結合して構成されているという概念について検討する。ある実施形態では、第２の領域は、Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープ全体に広がる４ペプチドのうち１以上のペプチドである（表３を参照のこと）：
Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープの４ペプチドうちの１ペプチドは配列番号５１：
ＥＴＦＬＴＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮ
であり；
Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープの４ペプチドうちの２ペプチドは配列番号５４：
ＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰ
であり；
Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープの４ペプチドうちの３ペプチドは配列番号５７：
ＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰＴＧＳＡＶ
であり；
Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープの４ペプチドうちの４ペプチドは配列番号６０：
ＲＨＶＫＰＴＧＳＡＶＶＧＬＳＭ
である。さらに他の実施形態では、第２の領域は、これらの４ペプチドのうちの１以上についての変形ペプチドである。これらの複合体の幾つかの配列番号を表３に示す。例えば、ある実施形態では、第１の領域（ＨＯＸ Ｃ１２）および第２の領域の配列番号５１を組み合わせた、Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープの完全アミノ酸配列は配列番号５２：
ＳＲＫＫＲＫＰＹＳＫＬＱＬＡＥＬＥＧＥＦＬＶＮＥＦＩＴＲＱＲＲＲＥＬＳＤＲＬＮＬＳＤＱＱＶＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＫＫＲＬＬＥＴＦＬＴＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮ
である。同様に、別の実施形態では、第１の領域（ＨＯＸ Ｄ１２）および第２の領域の配列番号５１を組み合わせた、Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープの完全アミノ酸配列は配列番号５３：
ＡＲＫＫＲＫＰＹＴＫＱＱＩＡＥＬＥＮＥＦＬＶＮＥＦＩＮＲＱＫＲＫＥＬＳＮＲＬＮＬＳＤＱＱＶＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＫＫＲＶＶＥＴＦＬＴＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮ
である。
Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープの４ペプチドうちの１ペプチドは配列番号５１：
ＥＴＦＬＴＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮ
であり；
Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープの４ペプチドうちの２ペプチドは配列番号５４：
ＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰ
であり；
Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープの４ペプチドうちの３ペプチドは配列番号５７：
ＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰＴＧＳＡＶ
であり；
Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープの４ペプチドうちの４ペプチドは配列番号６０：
ＲＨＶＫＰＴＧＳＡＶＶＧＬＳＭ
である。さらに他の実施形態では、第２の領域は、これらの４ペプチドのうちの１以上についての変形ペプチドである。これらの複合体の幾つかの配列番号を表３に示す。例えば、ある実施形態では、第１の領域（ＨＯＸ Ｃ１２）および第２の領域の配列番号５１を組み合わせた、Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープの完全アミノ酸配列は配列番号５２：
ＳＲＫＫＲＫＰＹＳＫＬＱＬＡＥＬＥＧＥＦＬＶＮＥＦＩＴＲＱＲＲＲＥＬＳＤＲＬＮＬＳＤＱＱＶＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＫＫＲＬＬＥＴＦＬＴＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮ
である。同様に、別の実施形態では、第１の領域（ＨＯＸ Ｄ１２）および第２の領域の配列番号５１を組み合わせた、Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープの完全アミノ酸配列は配列番号５３：
ＡＲＫＫＲＫＰＹＴＫＱＱＩＡＥＬＥＮＥＦＬＶＮＥＦＩＮＲＱＫＲＫＥＬＳＮＲＬＮＬＳＤＱＱＶＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＫＫＲＶＶＥＴＦＬＴＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮ
である。
Ｂａｌｂ／ｃマウスで試験を行うための第２の複合体または複合体混合物は、第１の領域である、配列番号１〜１９のいずれかに記載の配列または多様体またはその一部を有する、ヒトホメオドメインまたは多様体またはその一部を、かかる第１の領域と非人工的には会合していない第２の領域に結合させて構成されている。ある実施形態では、第２の領域は、Ａｇ８５Ａ７０-７８エピトープ全体に広がる３ペプチドのうち１以上のペプチドである（表３を参照のこと）：
Ａｇ８５Ａ７０-７８エピトープの３ペプチドのうちの１ペプチドは配列番号６３：
ＱＳＧＬＳＶＶＭＰＶＧＧＱＳＳ
であり；
Ａｇ８５Ａ７０-７８エピトープの３ペプチドのうちの２ペプチドは配列番号６６：
ＶＶＭＰＶＧＧＱＳＳＦＹＳＤＷ
であり；
Ａｇ８５Ａ７０-７８エピトープの３ペプチドのうちの３ペプチドは配列番号６９：
ＧＧＱＳＳＦＹＳＤＷＹＱＰＡＣ
である。さらに他の実施形態では、第２の領域は、これらの３つのペプチドのうちの１以上についての変形ペプチドである。これらの複合体の幾つかの配列番号も表３に示す。例えば、ある実施形態では、第１の領域（ＨＯＸ Ｃ１２）および第２の領域の配列番号６３を組み合わせた、Ａｇ８５Ａ７０-７８エピトープの完全アミノ酸配列は配列番号６４：
ＳＲＫＫＲＫＰＹＳＫＬＱＬＡＥＬＥＧＥＦＬＶＮＥＦＩＴＲＱＲＲＲＥＬＳＤＲＬＮＬＳＤＱＱＶＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＫＫＲＬＬＱＳＧＬＳＶＶＭＰＶＧＧＱＳＳ
である。同様に、別の実施形態では、第１の領域（ＨＯＸ Ｄ１２）および第２の領域の配列番号６３を組み合わせた、Ａｇ８５Ａ７０-７８エピトープの完全アミノ酸配列は配列番号６５：
ＡＲＫＫＲＫＰＹＴＫＱＱＩＡＥＬＥＮＥＦＬＶＮＥＦＩＮＲＱＫＲＫＥＬＳＮＲＬＮＬＳＤＱＱＶＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＫＫＲＶＶＱＳＧＬＳＶＶＭＰＶＧＧＱＳＳ
である。
Ａｇ８５Ａ７０-７８エピトープの３ペプチドのうちの１ペプチドは配列番号６３：
ＱＳＧＬＳＶＶＭＰＶＧＧＱＳＳ
であり；
Ａｇ８５Ａ７０-７８エピトープの３ペプチドのうちの２ペプチドは配列番号６６：
ＶＶＭＰＶＧＧＱＳＳＦＹＳＤＷ
であり；
Ａｇ８５Ａ７０-７８エピトープの３ペプチドのうちの３ペプチドは配列番号６９：
ＧＧＱＳＳＦＹＳＤＷＹＱＰＡＣ
である。さらに他の実施形態では、第２の領域は、これらの３つのペプチドのうちの１以上についての変形ペプチドである。これらの複合体の幾つかの配列番号も表３に示す。例えば、ある実施形態では、第１の領域（ＨＯＸ Ｃ１２）および第２の領域の配列番号６３を組み合わせた、Ａｇ８５Ａ７０-７８エピトープの完全アミノ酸配列は配列番号６４：
ＳＲＫＫＲＫＰＹＳＫＬＱＬＡＥＬＥＧＥＦＬＶＮＥＦＩＴＲＱＲＲＲＥＬＳＤＲＬＮＬＳＤＱＱＶＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＫＫＲＬＬＱＳＧＬＳＶＶＭＰＶＧＧＱＳＳ
である。同様に、別の実施形態では、第１の領域（ＨＯＸ Ｄ１２）および第２の領域の配列番号６３を組み合わせた、Ａｇ８５Ａ７０-７８エピトープの完全アミノ酸配列は配列番号６５：
ＡＲＫＫＲＫＰＹＴＫＱＱＩＡＥＬＥＮＥＦＬＶＮＥＦＩＮＲＱＫＲＫＥＬＳＮＲＬＮＬＳＤＱＱＶＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＫＫＲＶＶＱＳＧＬＳＶＶＭＰＶＧＧＱＳＳ
である。
ヒト用ワクチンのある実施形態では、ワクチンは、第１の領域である、配列番号１〜１９または多様体またはその一部のいずれかに記載の配列などを含むが、これらに制限されない、ヒトホメオドメインまたは多様体またはその一部を、かかる第１の領域と非人工的には会合していない第２の領域に結合させて構成され、これにおいて、前記第２の領域が、ある実施形態では、Ａｇ８５Ａ３３８-アミノ酸ペプチド全体、または適切なヒト被検者において免疫応答を引き起こすことが示された、Ａｇ８５Ａの１以上の特異的ＨＬＡ拘束エピトープのようなＡｇ８５ＡのＨＬＡ拘束エピトープである（表３を参照のこと）。Ａｇ８５Ａペプチド、またはそのヒトエピトープを、上記のように第１の領域に連結させてよい。別の実施形態では、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩのゲノタイプが異なる被検者に対し単一ワクチン構成体を提供するため、Ａｇ８５Ａ全体配列は第１の領域に連結している。Ａｇ８５Ａ配列は：
ＭＱＬＶＤＲＶＲＧＡ ＶＴＧＭＳＲＲＬＶＶ ＧＡＶＧＡＡＬＶＳＧ ＬＶＧＡＶＧＧＴＡＴ ＡＧＡＦＳＲＰＧＬＰ ＶＥＹＬＱＶＰＳＰＳ ＭＧＲＤＩＫＶＱＦＱ ＳＧＧＡＮＳＰＡＬＹ ＬＬＤＧＬＲＡＱＤＤ ＦＳＧＷＤＩＮＴＰＡ ＦＥＷＹＤＱＳＧＬＳ ＶＶＭＰＶＧＧＱＳＳ ＦＹＳＤＷＹＱＰＡＣ ＧＫＡＧＣＱＴＹＫＷ ＥＴＦＬＴＳＥＬＰＧ ＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰ ＴＧＳＡＶＶＧＬＳＭ ＡＡＳＳＡＬＴＬＡＩ ＹＨＰＱＱＦＶＹＡＧ ＡＭＳＧＬＬＤＰＳＱ ＡＭＧＰＴＬＩＧＬＡ ＭＧＤＡＧＧＹＫＡＳ ＤＭＷＧＰＫＥＤＰＡ ＷＱＲＮＤＰＬＬＮＶ ＧＫＬＩＡＮＮＴＲＶ ＷＶＹＣＧＮＧＫＰＳ ＤＬＧＧＮＮＬＰＡＫ ＦＬＥＧＦＶＲＴＳＮ ＩＫＦＱＤＡＹＮＡＧ ＧＧＨＮＧＶＦＤＦＰ ＤＳＧＴＨＳＷＥＹＷ ＧＡＱＬＮＡＭＫＰＤ ＬＱＲＡＬＧＡＴＰＮ ＴＧＰＡＰＱＧＡ：
（配列番号１０６）である。
ＭＱＬＶＤＲＶＲＧＡ ＶＴＧＭＳＲＲＬＶＶ ＧＡＶＧＡＡＬＶＳＧ ＬＶＧＡＶＧＧＴＡＴ ＡＧＡＦＳＲＰＧＬＰ ＶＥＹＬＱＶＰＳＰＳ ＭＧＲＤＩＫＶＱＦＱ ＳＧＧＡＮＳＰＡＬＹ ＬＬＤＧＬＲＡＱＤＤ ＦＳＧＷＤＩＮＴＰＡ ＦＥＷＹＤＱＳＧＬＳ ＶＶＭＰＶＧＧＱＳＳ ＦＹＳＤＷＹＱＰＡＣ ＧＫＡＧＣＱＴＹＫＷ ＥＴＦＬＴＳＥＬＰＧ ＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰ ＴＧＳＡＶＶＧＬＳＭ ＡＡＳＳＡＬＴＬＡＩ ＹＨＰＱＱＦＶＹＡＧ ＡＭＳＧＬＬＤＰＳＱ ＡＭＧＰＴＬＩＧＬＡ ＭＧＤＡＧＧＹＫＡＳ ＤＭＷＧＰＫＥＤＰＡ ＷＱＲＮＤＰＬＬＮＶ ＧＫＬＩＡＮＮＴＲＶ ＷＶＹＣＧＮＧＫＰＳ ＤＬＧＧＮＮＬＰＡＫ ＦＬＥＧＦＶＲＴＳＮ ＩＫＦＱＤＡＹＮＡＧ ＧＧＨＮＧＶＦＤＦＰ ＤＳＧＴＨＳＷＥＹＷ ＧＡＱＬＮＡＭＫＰＤ ＬＱＲＡＬＧＡＴＰＮ ＴＧＰＡＰＱＧＡ：
（配列番号１０６）である。
ここで、太字で示した長い配列領域および下線上のフォントはシグナルペプチドであり、成熟したＡｇ８５Ａ配列が作製されると開裂する（残り２９６アミノ酸ペプチド）。フィブロネクチン結合ドメインは太字で示し、その直下に斜体で示し、その下の太字に下線を引いた斜体フォントの３アミノ酸は触媒ドメインにある。
ある実施形態では、第２の領域のＡｇ８５Ａのアミノ酸配列（シグナルペプチドなし）は：
ＡＦＳＲＰＧＬＰ ＶＥＹＬＱＶＰＳＰＳ ＭＧＲＤＩＫＶＱＦＱ ＳＧＧＡＮＳＰＡＬＹ ＬＬＤＧＬＲＡＱＤＤ ＦＳＧＷＤＩＮＴＰＡ ＦＥＷＹＤＱＳＧＬＳ ＶＶＭＰＶＧＧＱＳＳ ＦＹＳＤＷＹＱＰＡＣ ＧＫＡＧＣＱＴＹＫＷ ＥＴＦＬＴＳＥＬＰＧ ＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰ ＴＧＳＡＶＶＧＬＳＭ ＡＡＳＳＡＬＴＬＡＩ ＹＨＰＱＱＦＶＹＡＧ ＡＭＳＧＬＬＤＰＳＱ ＡＭＧＰＴＬＩＧＬＡ ＭＧＤＡＧＧＹＫＡＳ ＤＭＷＧＰＫＥＤＰＡ ＷＱＲＮＤＰＬＬＮＶ ＧＫＬＩＡＮＮＴＲＶ ＷＶＹＣＧＮＧＫＰＳ ＤＬＧＧＮＮＬＰＡＫ ＦＬＥＧＦＶＲＴＳＮ ＩＫＦＱＤＡＹＮＡＧ ＧＧＨＮＧＶＦＤＦＰ ＤＳＧＴＨＳＷＥＹＷ ＧＡＱＬＮＡＭＫＰＤ ＬＱＲＡＬＧＡＴＰＮ ＴＧＰＡＰＱＧＡ
と考えられる。このＡｇ８５Ａカーゴペプチドの配列番号（配列番号７２）を表３に示すが、それとともに、Ａｇ８５Ａカーゴペプチドまたは変形ペプチドが複合体もしくは融合タンパク質の第２の領域を含んでいる、数ある可能な実施形態のうちの２形態、すなわち、第１の領域にＨＯＸ Ｃ１２（配列番号７３）配列またはＨＯＸ Ｄ１２（配列番号７４）配列を含有するものを示す。分子生物学／生物工学技術分野の当業者であれば、表３に示すこれらおよび他のあらゆる配列の多数の変形が本明細書に開示の実施形態の範囲に入ることを理解されるであろう。
ＡＦＳＲＰＧＬＰ ＶＥＹＬＱＶＰＳＰＳ ＭＧＲＤＩＫＶＱＦＱ ＳＧＧＡＮＳＰＡＬＹ ＬＬＤＧＬＲＡＱＤＤ ＦＳＧＷＤＩＮＴＰＡ ＦＥＷＹＤＱＳＧＬＳ ＶＶＭＰＶＧＧＱＳＳ ＦＹＳＤＷＹＱＰＡＣ ＧＫＡＧＣＱＴＹＫＷ ＥＴＦＬＴＳＥＬＰＧ ＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰ ＴＧＳＡＶＶＧＬＳＭ ＡＡＳＳＡＬＴＬＡＩ ＹＨＰＱＱＦＶＹＡＧ ＡＭＳＧＬＬＤＰＳＱ ＡＭＧＰＴＬＩＧＬＡ ＭＧＤＡＧＧＹＫＡＳ ＤＭＷＧＰＫＥＤＰＡ ＷＱＲＮＤＰＬＬＮＶ ＧＫＬＩＡＮＮＴＲＶ ＷＶＹＣＧＮＧＫＰＳ ＤＬＧＧＮＮＬＰＡＫ ＦＬＥＧＦＶＲＴＳＮ ＩＫＦＱＤＡＹＮＡＧ ＧＧＨＮＧＶＦＤＦＰ ＤＳＧＴＨＳＷＥＹＷ ＧＡＱＬＮＡＭＫＰＤ ＬＱＲＡＬＧＡＴＰＮ ＴＧＰＡＰＱＧＡ
と考えられる。このＡｇ８５Ａカーゴペプチドの配列番号（配列番号７２）を表３に示すが、それとともに、Ａｇ８５Ａカーゴペプチドまたは変形ペプチドが複合体もしくは融合タンパク質の第２の領域を含んでいる、数ある可能な実施形態のうちの２形態、すなわち、第１の領域にＨＯＸ Ｃ１２（配列番号７３）配列またはＨＯＸ Ｄ１２（配列番号７４）配列を含有するものを示す。分子生物学／生物工学技術分野の当業者であれば、表３に示すこれらおよび他のあらゆる配列の多数の変形が本明細書に開示の実施形態の範囲に入ることを理解されるであろう。
ワクチンで誘導された免疫応答の測定.アデノウイルスベクターＡｇ８５Ａワクチンに対する免疫応答を第Ｉ相臨床試験で測定するため、特異抗体とのインビトロ全血培養およびＩ型サイトカイン応答の測定を使用し、成功した（Smaill et.al. A Human Type 5 Adenovirus-Based Tuberculosis Vaccine Induces Robust T Cell Responses in Humans Despite Preexisting Anti-Adenovirus Immunity. Sci. Transl. Med. 5, 205: 1-11, 2013）。この手法を使用して、ＣＰＰ系Ａｇ８５Ａエピトープワクチン混合物に対するヒトの免疫応答を測定できる。マウスモデルにおいて、同様の方法を使用することができ、処置後の秘蔵リンパ球培養およびＢａｌｂ／ｃマウスにおけるサイトカイン応答を記載のエピトープを用いて行う。
遺伝子発現への影響：１以上の実施形態では、第２の領域のカーゴはＤＹＲＫ１ｂに結合して遺伝子発現を抑制する。
この遺伝子の過剰発現は、肺癌および膵癌など多くの癌に存在する。発現増加をもたらすＤＹＲＫ１ｂの変異も、ＩＩ型糖尿病、中心性肥満および早期の冠動脈疾患、メタボリック症候群のすべての特徴の家族性遺伝に関連している。この経路が、一般母集団におけるＩＩ型糖尿病および肥満の病因に寄与していると考えられる。そのため、以下に記載するようなＤＹＲＫ１ｂ阻害剤による全身治療は、ＤＹＲＫ１ｂを異常に高発現する癌のほか、ＩＩ型糖尿病およびメタボリック症候群の他の特徴を発症している患者においても有効となるであろう。特に、過剰発現をもたらすＤＹＲＫ１ｂの変異が同定された患者では有効であろう。前述したＲａｓ経路および腫瘍抑制因子の経路の実施例同様、さまざまな実施形態で、第１の領域のホメオドメイン配列は、例えば、ＨＯＸ Ｃ１２（配列番号１）またはＨＯＸ Ｄ１２（配列番号２）であり得る（表３を参照のこと）。ある実施形態では、配列５'-ＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＡＴＧＡＴＣＡＴ-３'（配列番号７９、表４を参照のこと）またはその変形配列はＤＹＲＫ１ｂに結合する。別の実施形態では、配列番号７９の変形配列はＤＹＲＫ１ｂ、またはその機能的変形配列に結合する。
Claims (34)
- ヒトホメオドメイン構造を含み、配列番号１〜１９のいずれか１つのポリペプチド配列またはその多様体を含む第１の領域、および
該第１の領域に非人工的には会合していない、機能性または調節性のポリペプチドもしくはタンパク質または薬理学的に活性な低分子を含む第２の領域、を含む複合体。 - ヒトＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメインまたはＨＯＸ Ｃ１２ホメオドメインの少なくとも１つを含む第１の領域、および
該第１の領域に非人工的には会合していない、機能性または調節性のポリペプチドもしくタンパク質または薬理学的に活性な低分子を含む第２の領域、を含む複合体。 - 前記第２の領域が、ＮＥＭＯ結合ドメイン、ＰＣ１ ＣＴＴ由来の融合タンパク質、先天的な酵素欠損を有する被検者の酵素機能を回復させる酵素、ＲＰＥ６５遺伝子産物、ジンクフィンガーペプチド、Ａｇ８５Ａペプチド、Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープペプチド、またはＡｇ８５Ａ７０-７８エピトープペプチドの少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の複合体。
- 前記ＮＥＭＯ結合ドメインが、配列番号２０のポリペプチド配列またはその多様体を有する、請求項３に記載の複合体。
- 前記ＰＣ１ ＣＴＴ由来の融合タンパク質が、配列番号２３または２６の少なくとも１つに記載のポリペプチド配列またはその多様体を有する；
前記先天的な酵素欠損を有する被検者の酵素機能を回復させる酵素が、配列番号３０、４５、もしくは４８の少なくとも１つのポリペプチド配列またはその多様体を有する；
前記ＲＰＥ６５遺伝子産物が、少なくとも配列番号３３またはその多様体を含むポリペプチド配列を有する；
前記ジンクフィンガーペプチド配列が、配列番号３６、２９、もしくは４２またはその多様体を少なくとも１つ含む；
前記Ａｇ８５Ａペプチドが、配列番号７２の配列またはその多様体を有する；
前記Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープペプチドが、配列番号５１、５４、５７、もしくは６０またはその多様体を少なくとも１つ含む配列を有する；または
前記Ａｇ８５Ａ７０-７８エピトープペプチドが、配列番号６３、６６、もしくは６９またはその多様体を少なくとも１つ含む配列を有する、請求項３に記載の複合体。 - 前記第２の領域が、前記第１の領域のＣ末端に、または前記第１の領域のＮ末端に結合している、請求項１または２に記載の複合体。
- 融合タンパク質の形態である、請求項１または２に記載の複合体。
- 前記第２の領域が、細胞内標的および／または核内標的と相互作用する、請求項１または２に記載の複合体。
- 前記第２の領域と前記細胞内標的および／または前記核内標的との相互作用が、ＮＦ-κＢ活性化、ぶどう膜炎、多発性嚢胞腎変異を有する尿細管細胞のＰＣ１転写因子活性、ＧＣａｓｅのゴーシェ病変異を有する細胞のグルコセレブロシダーゼ基質、ハーラー症候群またはハンター症候群を有する被検者のグリコサミノグリカン、網膜グアニル酸シクラーゼが欠損している網膜細胞の網膜グアニル酸シクラーゼ基質、ハンチントン舞踏病変異を有する細胞の変異ハンチンチン遺伝子の転写調節、および、感染症に暴露されている被検者の結核を予防する結核ワクチンなどのためのワクチン実施形態において有効な免疫応答を誘発するための、抗原提示細胞の細胞質内への抗原エピトープの送達、の１つ以上に影響を与える、請求項８に記載の複合体。
- 前記第２の領域が、配列番号２３もしくは２６またはその多様体を含むポリペプチド配列を有し、かつ、前記複合体が非競合的Ｖ２受容体拮抗因子をさらに含む、請求項１または２に記載の複合体。
- 前記第１および第２の領域間にリンカー配列をさらに含む、請求項１または２に記載の複合体。
- 前記第１および第２の領域の組み合わせが、配列番号２１、２２、２４、２５、２７、２８、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、並びに５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６７、６８、７０、７１、７３および７４からなる群から選択されるポリペプチド配列またはその多様体を有する、請求項１に記載の複合体。
- 前記配列の開始因子メチオニン残基は、活性剤および／または治療剤として使用する前に除去される、請求項１２に記載の複合体。
- 前記第１および第２の領域の組み合わせが、ヒトホメオドメイン構造および少なくとも１つのＮＥＭＯ結合ドメイン、ＰＣ１ ＣＴＴ由来の融合タンパク質、先天的な酵素欠損を有する被検者の酵素機能を回復させる酵素、ＲＰＥ６５遺伝子産物、ジンクフィンガーペプチド、Ａｇ８５Ａ９９-１１８エピトープペプチド、並びにＡｇ８５Ａ７０-７８エピトープペプチドを含む配列を有する、請求項１に記載の複合体。
- 前記第２の領域が、細胞内標的および／または核内標的と相互作用する、請求項１４に記載の複合体。
- 前記第２の領域と細胞内標的および／または核内標的との相互作用が、ＮＦ-κＢ活性化、ぶどう膜炎、多発性嚢胞腎変異を有する尿細管細胞のＰＣ１転写因子活性、ＧＣａｓｅのゴーシェ病変異を有する細胞のグルコセレブロシダーゼ基質、ハーラー症候群またはハンター症候群を有する被検者のグリコサミノグリカン、網膜グアニル酸シクラーゼが欠損している網膜細胞の網膜グアニル酸シクラーゼ基質、ハンチントン舞踏病変異を有する細胞の変異ハンチンチン遺伝子の転写調節、および、例えば、感染症に暴露されている被検者の結核を予防するための結核ワクチンにおけるように、ワクチン活性成分として有効な免疫応答を誘発するための、抗原提示細胞の細胞質内への抗原エピトープの送達、の１以上に影響を与える、請求項１５に記載の複合体。
- 請求項１または２に記載の複合体を含む、組成物。
- 前記組成物が、吸入可能な組成物、局所用または注射用の点眼製剤他の眼用組成物、浣腸剤、外用組成物、または持続的放出のための注射可能なインプラントを含む注射可能な組成物の形態である、請求項１７に記載の組成物。
- ドライアイまたは他の炎症性眼状態の治療に使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の複合体、または請求項１７もしくは１８に記載の組成物。
- ＨＯＸ Ｄ１２ホメオドメインまたはＨＯＸ Ｃ１２ホメオドメインであるヒトホメオドメイン構造を含む第１の領域、および
該第１の領域に非人工的には会合していない、機能性または調節性の核酸またはペプチド核酸を含む第２の領域、を含む複合体。 - 配列番号１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド配列またはその多様体を有するヒトホメオドメイン構造を含む第１の領域、および
該第１の領域に非人工的には会合していない、機能性または調節性の核酸またはペプチド核酸を含む第２の領域、を含む複合体。 - 前記第２の領域が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、γＰＮＡ、または細胞内での生物学的活性を有する、これらの構成要素の組み合わせを含む、請求項２０または２１に記載の複合体。
- 前記第２の領域が、ｍｉＲＮＡ２１またはＤＹＲＫ１ｂに結合し、および／またはこれらの発現を調節する核酸を含む；配列番号７６、７８、もしくは７９の少なくとも１つに記載のヌクレオチド配列またはその多様体を有する；前記第１の領域のＣ末端に結合している；前記第１の領域のＮ末端に結合している；前記第１の領域にペプチド結合で連結している；前記第１の領域に非ペプチド結合を介して結合している；またはこれらの任意の組合せである、請求項２０または２１に記載の複合体。
- 前記第２の領域が、前記第１の領域のＣ末端に結合している、前記第１の領域のＮ末端に結合している、前記第１の領域にペプチド結合で連結している、前記第１の領域に非ペプチド結合を介して結合している、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記第２の領域が、Ｒａｓ経路に影響を与えるためにｍｉＲＮＡ１３２に結合する、核酸またはＰＮＡ；配列番号７５に記載のｍｉＲＮＡヌクレオチド配列またはその多様体に安定にハイブリダイズする核酸配列もしくはＰＮＡ；配列番号７８に記載のヌクレオチド配列、または、ｍｉＲＮＡ１３２に安定にハイブリダイズする該ヌクレオチド配列の一部もしくはその多様体；腫瘍抑制因子の経路または腫瘍増殖に影響を与えるためにｍｉＲＮＡ２１に結合する核酸配列もしくはＰＮＡ；配列番号７６に記載のヌクレオチド配列またはその多様体からなる群から選択され、または配列番号７７に記載のヌクレオチド配列またはその多様体に安定にハイブリダイズ可能である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記第１の領域のホメオドメイン構造が、配列番号２のポリペプチド配列またはその多様体を有する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記第２の領域が、ＤＹＲＫ１ｂに結合する、請求項２６に記載の複合体。
- 前記第２の領域が、配列番号７９に記載のヌクレオチド配列またはその多様体を有する、請求項２７に記載の複合体。
- 前記第１の領域および前記第２の領域が、「クリックケミストリー」を介して、またはペプチド結合を介して結合している、請求項２０または２１に記載の複合体。
- 癌を治療するための請求項２０または２１記載の複合体の使用。
- 癌を治療するための請求項２８または２９記載の複合体の使用。
- 癌の治療に使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項記載の複合体、または請求項１７もしくは１８記載の組成物。
- ワクチンとして使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項記載の複合体、または請求項１７もしくは１８記載の組成物。
- 中枢神経系疾患の治療に使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項記載の複合体、または請求項１７もしくは１８記載の組成物。
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