JP2016521258A - ポリアルキレンオキシド吉草酸ヘモグロビン接合体 - Google Patents

Abstract

本発明は、一般にはスクシンイミジル吉草酸で活性化されたポリエチレングリコールをヘモグロビンの一級アミン及びＮ末端バリンに接合することにより製造された、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）接合されたヘモグロビンに関する。

Description

本発明は、一般に、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）ヘモグロビン接合体に関する。より詳細には、本発明は改善された安定性を有するＰＡＯヘモグロビン接合体、該接合体を含有する医薬組成物、及び該接合体を合成する方法及びこれを使用する方法に関する。

ヘモグロビンに基づく酸素担体（「ＨＢＯＣ」）は、長年に亘って血管収縮に関連付けられており、これはヘムによる一酸化窒素（ＮＯ）の除去に帰せられてきた。安定化されたヘモグロビン（Ｈｂ）のような、酸素療法剤として有用な酸素輸送体（時には「酸素輸送血漿増量剤」と称される）は、一酸化窒素を除去して血管収縮及び高血圧を生じるので、限定された薬効しかもたないことが示されてきた。血管収縮を生じるこれら酸素輸送溶液の性向は、動物及び人間において高血圧として現れる可能性がある。ＨＢＯＣの血管収縮効果の基礎をなす機構は十分には理解されていないが、ヘム鉄が、強力な血管拡張因子である内因性ＮＯと迅速且つ不可逆的に結合し、それによって血管収縮を生じ得ることが示唆されてきた。

修飾された細胞フリーのＨｂを含有する製品は最も有望であったにもかかわらず、今日までの酸素輸送体は、一部はこれら血管収縮効果の故に、酸素療法剤（ＯＴＡ）としては全く成功していなかった。フマル酸ビス−ジブロモサリチル（ααＨｂ）を用いてα鎖の間で架橋されたヒトＨｂが、赤血球代用剤モデルとして合衆国陸軍によって開発されたが、それは肺及び全身の血管抵抗性に重篤な増大を示した後に断念された（Ｈｅｓｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ ７８：３５６Ａ）。この製品の商業化バージョンもまた、期待外れの第ＩＩＩ相臨床試験後に断念された（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．，２０００，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ７９：１−２０）。

ＨｂのＮＯ結合活性を克服する試みにおいて、二つの分子的アプローチが進展された。第一のアプローチでは、低減されたＮＯ結合親和性をもった組換えヘモグロビンを創製する試みにおいては、遠位ヘムポケットの部位特異的突然変異誘発が用いられた（Ｅｉｃｈ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：６９７６-８３）。第二のアプローチでは、化学修飾アプローチが用いられ、ここでは血管空間から間隙空間へのＨｂの血管外遊走を低減し、または可能であれば完全に阻止する試みにおいて、Ｈｂのサイズがオリゴマー化によって高められた（Ｈｅｓｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７４：１７６９−７８；Ｍｕｌｄｏｏｎ，Ｓ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２８：５７９−８３；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｖ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：５６５−７５；Ｆｕｒｃｈｇｏｔｔ，Ｒ．，１９８４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：１７５−９７； 及び Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９：１５５−６２）。

事実、ＮＯについての会合結合率が低減された組換えＨｂが製造されており、これはトップロードラット（ｔｏｐ−ｌｏａｄ ｒａｔ）実験において高血圧性がより少ない（（Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：６７２−６７６ 及び Ｌｅｍｏｎ，Ｄ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４：３７８）。しかし、研究により、ＮＯ結合はＨｂの血管活性のための唯一の説明ではないであろうことが示唆されている。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたもののように一定の大きなＨｂ分子は、それらのＮＯ会合率が重篤な高血圧性ααＨｂのそれと同一であったとしても、実際には血管収縮を伴わないことが分かっている（Ｒｏｈｌｆｓ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１２１２８−１２１３４）。更に、ＰＥＧ−Ｈｂは、出血の前に交換輸液として与えられた時に、出血の結果を防止する上で異常に効果的であることが分かった（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５：９９３−１００３）。

ＰＥＧのＨｂへの接合は、その抗原性を減少させ、またその循環半減期を延長させる。しかし、ＰＥＧ接合反応は、Ｈｂ四量体のαβ二量体サブユニットへの解離をもたらし、４０，０００ダルトン（「Ｄａ」）未満のＨｂモノマー単位のＰＥＧ接合体を受けている交換輸液されたラットにおいて、重篤なヘモグロビン尿症を生じることが報告されている（Ｉｗａｓｈｉｔａ ａｎｄ Ａｊｉｓａｋａ Ｏｒｇａｎ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ：Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄｉｃｉｅｓ Ｍｅｃｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．，Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．１９８１，Ｅｄｓ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ ｐｇｓ ９７−１０１）。α及びε−アミノ基においてＨｂに連結された約１０コピーのＰＥＧ−５，０００鎖を担持した８４，０００ダルトンを超える分子量のポリアルキレンオキシド（「ＰＡＯ」）を接合されたＨｂが、エンゾン社（Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．）により調製された（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６５０，３８８）。この置換の程度は、動物においてヘモグロビン尿症を伴う臨床的に有意な腎毒性を回避するものとして記載された。しかし、この接合反応は不均一な接合集団をもたらし、またカラムクロマトグラフィーにより除去しなければならない他の望ましくない反応体を含んでいた。

ＰＥＧ接合は、典型的には、活性化されたＰＥＧ部分と生体分子表面の官能基との反応を介して行われる。最も普通の官能基は、リジンのアミノ基、ヒスチジン残基のイミダゾール基、及びタンパク質のＮ末端；システイン残基のチオール基；及びセリン、スレオニン及びチロシン残基の水酸基、並びにタンパク質のＣ末端である。ＰＥＧは、通常は水酸基末端を、温和な水性環境でこれら官能基と反応できる反応性部分へと変換することによって活性化される。治療的バイオ医薬の接合のために使用される最も普通のモノ官能性ＰＥＧの一つは、メトキシ−ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ−ＯＨ」）であり、これは唯一の官能基（即ち、ヒドロキシル）を有しており、従って二官能性ＰＥＧに付随する架橋及び凝集の問題を最小化する。しかし、ｍＰＥＧ−ＯＨは、高分子量の二官能性ＰＥＧ（即ち「ＰＥＧジオール」）で汚染されることが多く、これはその製造プロセスに起因して、１０〜１５％に亘り得るものである（Ｄｕｓｔ Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９０，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ２３：３７４２−３７４６）。この二官能性ＰＥＧジオールは、望ましいモノ官能性ＰＥＧのサイズの約２倍である。該汚染の問題は、ＰＥＧの分子量が増大するにつれて更に悪化する。ＦＤＡは製造プロセスにおける高レベルの再現性及び最終薬物製品の品質を要求しているので、ｍＰＥＧ−ＯＨの純度は、ＰＥＧ化されたバイオ治療剤の製造にとって本質的に重要である。

ＨｂのＰＡＯへの接合は、酸素付加状態及び脱酸素状態の両方で行われてきた。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，８４４，３１７は、得られるＰＥＧ−Ｈｂ接合体の酸素親和性を高めるために、接合の前にＨｂを大気と平衡化することによって、酸素付加された状態または「Ｒ」状態においてＨｂを接合させことを記載している。他のものは、酸素親和性を低下させ、構造安定性を増大させて、Ｈｂが化学修飾、ダイアフィルトレーション及び／または滅菌濾過及び低音殺菌の物理的ストレスに耐えることを可能にするために、接合に先立って脱酸素化工程を行うことを記載している（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２３４，９０３）。Ｈｂの分子架橋のためには、α鎖のリジン９９を架橋剤に露出させるために、修飾の前にＨｂを脱酸素化することが必要とされ得ることが示唆されている（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２３４，９０３）。

ＰＥＧとの接合前に２−イミノチオランを用いたＨｂのチオール化速度論が、アカルヤ等によって研究されたＡｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，５０１，４９９）。イミノチオランの濃度を、四量体一つ当たり平均５個の外来性チオールを導入する１０倍から、３０倍に増加させるとＨｂ上の外来性チオールの数が約２倍になることが観察された。しかし、ＰＥＧ接合後に見られるサイズの増大は、チオールの数が倍化するにも拘わらず、ほんの僅かにしか過ぎなかった。これにより、Ｈｂの表面を覆う２０倍モル過剰のマレイミジルＰＥＧ−５０００の存在下での少ない反応性チオールとの接合反応は、より多くの反応性チオールでのＨｂの更なる修飾に抵抗する立体障害をもたらすことが示唆された。結局、修飾Ｈｂの望ましい接合度（即ち、Ｈｂ分子当たり６±１のＰＥＧ）を達成するために、アカルヤ等（Ａｃｈａｒｙａ ｅｔａｌ．）は、８〜１５モル過剰のイミノチオランでＨｂをチオール化し、このチオール化されたＨｂを１６〜３０倍モル過剰のマレイミジルＰＥＧ−５０００と反応させた。しかしながら、大スケールの製造におけるこれら高モル過剰の反応体濃度は、ＨＢＯＣを調整するためのコストを顕著に増大させ、また最終製品の不均一さを増大させる。更に、このような高モル過剰のマレイミジルＰＥＧ−５０００はまた、多数の望ましくない副反応体の産生を伴ってより不均一な製品を生じる。

以前の研究において、表面を修飾されたヘモグロビンの分子サイズは腎臓によるクリアランスを回避し、また望ましい循環半減期を達成するために十分に大きくなければならないことが観察された。ブルーメンスタイン、Ｊ等（Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．）は、これは８４，０００ダルトン（「Ｄａ」）以上の分子量で達成できると決定した（“Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｅｘｐａｎｄｅｒｓ，”Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐａｇｅｓ ２０５−２１２（１９７８））。その研究において、著者等は、可変分子量のデキストランをＨｂに接合した。彼等は、Ｈｂ（６４，０００Ｄａの分子量をもつ）及びデキストラン（２０，０００Ｄａの分子量を有する）の接合体は、「循環系からゆっくりと除去され、また腎臓からは殆ど除去されなかった」と報告した。更に、分子量を８４，０００Ｄａ超に増大させても、これらのクリアランス曲線は有意に変化されないことが観察された。分子内架橋は、四量体ヘモグロビン単位のサブユニットを化学的に結合させて、腎臓により早期に排泄される二量体の形成を防止する。（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２９６，４６５参照）

ポリアルキレンオキシドをヘモグロビンに結合するためには、先ず、ポリマーの末端基を「活性化」（即ち、反応性官能基に変換する）して、「活性化されたポリアルキレンオキシド」を形成しなければならない。過去においては、ＰＥＧ−ＯＨを用いてＰＥＧ−ハロゲン化物、メチルスルホン酸エステル、パラトルエンスルホン酸エステルが調製され、次いで水性アンモニア（ホフマン反応）、アジ化ナトリウムまたはカリウムフタルイミド（ガブリエル試薬）を用いた求核置換反応を行うことによりＰＥＧアミンに変換された。ＰＥＧ−ハロゲン化物とアンモニアとの反応は、直接的にはＰＥＧ−アミン（「ＰＥＧ−ＮＨ_２」）を形成し（Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９８３，１９：１１７７−１１８３参照）、次いで、これは幾つかの生物学的に活性な化合物上に存在する−ＣＯＯＨ基への接合のために用いることができるであろう。

より最近では、ＰＥＧ−ＮＨ_２は中間体として用いられており、−ＣＯＯＨ以外の基を結合するために官能化することができる。例えば、ＰＥＧ−ＮＨ_２はマレイミドのようなスルフヒドリル−活性化基を含むように修飾することができる。Ｕ．Ｓ．ｐａｔ．６，８２８，４０１に開示された反応においては、ｍＰＥＧマレイミド（即ち、マレイミドが付加されたメトキシ−ＰＥＧまたはｍＰＥＧ）が、ジクロロメタン（有機溶媒）中において、ｍＰＥＧ−ＯＨを塩化ｐ−トルエンスルホニル（トシル化剤）及びトリエチレンアミン（「ＴＥＡ」、塩基触媒）と反応されて、ｍＰＥＧ−トシレートを生成させることにより調製される。次いで、この化合物は２８％水性アンモニアと反応され、次いで、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド（「ＤＭＡＣ」）及びＮ−シクロヘキシルピロリドン（「ＣＨＰ」）の有機溶媒混合物中で無水マレイン酸と反応されて、マレアミン酸化合物（ｍａｌｅａｍｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）が製造される。この化合物は、次いでジクロロメタン及びジメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」）の有機溶媒混合物中において、ジエチルアニリン（「ＤＥＡ」）またはジイソプロピルエチルアミン（「ＤＩＥＡ」）のような塩基触媒の存在下に、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニルと反応されて、ｍＰＥＧ−マレイミドが製造される。しかしながら、この活性化されたＰＥＧを得るための多重工程且つ多重試薬の方法は、厄介で且つ時間を要する。

ここでは、スクシンイミジル−吉草酸で活性化されたＰＥＧ（ＳＶＡ−ＰＥＧ）を用いてＰＥＧ−ヘモグロビン接合体を調製する方法が開示され、該ＳＶＡ−ＰＥＧは、特定の条件下でヘモグロビンのアミン基に結合して、安定で均一なＰＥＧ−ヘモグロビン接合体を形成する。

本発明の一つの態様は、３７℃及びｐＨ７．４で測定したときに約２〜約３０ｍｍＨｇに亘るＰ５０を有するＰＡＯヘモグロビン接合体に向けられている。該ＰＡＯは、ヘモグロビン分子上のアミノ酸側鎖のアミノ反応性部分を介して共有結合される。該アミノ反応性部分は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−によってＰＡＯに連結され、ここでのｐは１〜約２０の整数である。該ヘモグロビンは、任意に分子内架橋される。

本発明のもう一つの態様は、下記の構造を有するＰＡＯヘモグロビン接合体に向けられている：

ここで、Ｈｂはヘモグロビンであり、Ｌはリンカーの−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−であり、Ｎはヘモグロビンのアミノ基であり、Ｘは末端基であり、ｍはヘモグロビンに接合された活性化型ＰＥＧポリマーの平均数であり、ｎは約２，０００〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧにおけるオキシエチレン単位の平均数であり、ｐは１〜２０の整数である。

本発明の更にもう一つの態様は、ヘモグロビンを少なくとも一つのＰＡＯポリマーと反応させることを含んでなる方法により調製された、ＰＡＯヘモグロビン接合体に向けられている。該ＰＡＯポリマーは次の構造を有する：

ここで、Ｒはアミノ反応性部分であり、Ｌはリンカーの−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−であり、Ｘは末端基であり、ｎは約２，０００〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧにおけるオキシエチレン単位の平均数であり、ｐは１〜２０の整数である。

本発明の更にもう一つの態様は、上記ヘモグロビン接合体の何れかと、医薬的に許容可能な担体を含有してなる医薬組成物に向けられている。該組成物は、急性肝不全、β地中海貧血症、火傷、慢性重症四肢虚血（ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、二酸化炭素またはシアン化物中毒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、鬱血性心不全、低酸素症、マラリア、臓器虚血、抹消血管疾患、ポルフィリン症、妊娠における子癇前症、敗血症、鎌形赤血球病、網膜症、眼内症状、精巣捻転症、外傷、ショック、外傷性脳障害、潰瘍、血管痙攣、またはこれらの組合せの治療用であることができる。この組成物はまた、血管形成術に対する補助療法として、形成外科のための補助療法として、または補助人工心臓を移植する際の補助療法として；血液代用剤、心保護剤、冷凍保存剤、血液透析補助剤、腫瘍治療剤、臓器保存剤、性能強化剤、手術補助剤、または創傷治癒剤として；撮像において；肺機能を改善するため；またはそれらの組合せにおいて使用するためのものであることができる。該組成物はまた、血液喪失の獣医学的治療であって、該血液喪失が傷害、溶血性貧血、感染性貧血、細菌感染、第ＩＶ因子断片化、脾機能亢進及び脾腫大、家禽における出血性症候群、再生不良性貧血、形成不全性貧血、突発性免疫性溶血症状、鉄欠乏症、同種免疫溶血性貧血、微小血管性溶血性貧血、寄生、もしくは外科麻酔に誘導された脳損傷、またはそれらの組合せについての治療のためであることもできる。

本発明の更にもう一つの態様は、斯かるヘモグロビン接合体または医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含んでなる治療方法に向けられている。該方法は、上記で述べた何れか１以上の状態の治療のためのものである。

本発明のもう一つの態様は、酸素、一酸化窒素、一酸化炭素またはそれらの混合物を組織に送達し、微小血管系において亜硝酸塩を一酸化窒素（ＮＯ）に還元する方法に向けられている。該方法は、上記で述べたヘモグロビン接合体または医薬組成物の何れかを、それを必要としている被験者に投与することを含んでなるものである。投与に続いて、ヘモグロビン中における非リガンド結合のヘムが、微小血管系において亜硝酸塩を一酸化窒素に変換する。

本発明の更にもう一つの態様は、ヘモグロビン接合体を調製する方法であって、ヘモグロビンを下記の構造を有するＰＡＯポリマーと反応させることを含んでなる方法に向けられている：

ここで、Ｒはアミノ反応性部分であり、Ｌはリンカーの−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−であり、Ｘは末端基であり、ｎは約２，０００〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧにおけるオキシエチレン単位の平均数であり、ｐは１〜２０の整数である。

他の目的及び特徴は、部分的には以下で明らかになるであろうし、また一部は以下で指摘されるであろう。

図１は、吉草酸メトキシＰＥＧスクシンイミジル（ｍＰＥＧ−ＳＶＡ）を出発材料として用いて、アミンＰＥＧ化ヘモグロビンを調製する例示的方法のフローチャートを描いており、ここでのＲ_１、Ｒ_２及びＲ_３はヘモグロビン主鎖の一部分である。 図２は、（１）炭酸ｐ−ニトロフェニル−ＰＥＧ（ＮＰＣ−ＰＥＧ）、（２）炭酸スクシンイミジル−ＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ）、（３）マレイミド−ＰＥＧ（Ｍａｌ−ＰＥＧ）、及び（４）吉草酸スクシンイミジル−ＰＥＧ（ＳＶＡ−ＰＥＧ）についての化学構造及び結合長を描いており、ここでの矢印は、活性基からＰＥＧ骨格への距離を示している。 図３は、Ｍａｌ−ＰＥＧ（上段）、ＳＶＡ−ＰＥＧ（中段）及びＳＣ−ＰＥＧ（下段）について、ヘモグロビンとの連結系とＰＥＧ骨格との間の距離を描いている。 図４は、ＭＰ４（赤）及びストローマフリーヘモグロビン（ＳＦＨ）（緑）と比較したときの、非解離条件下でのＳＶＡ−ＰＥＧ−Ｈｂ（青）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＬＣ）を描いている。 図５は、４０℃で１月までの加速保存条件下でのＭＰ４ＣＯ（上段）と比較したときの、高塩濃度の解離条件下（０．９Ｍ ＭｇＣｌ_２）でのＳＶＡ−ＰＥＧ−Ｈｂ（ＳＰ４ＣＯ、下段）のサイズ排除クロマトグラム（ＬＣ）である。 図６は、３２℃で９日間の加速保存条件下でのＮＰＣ−ＰＥＧ−Ｈｂ（ＮＰ４ＣＯ、上段）と比較したときの、高塩濃度の解離条件下におけるＳＶＡ−ＰＥＧ−Ｈｂ（ＳＰ４ＣＯ、下段）のＬＣである。

図面の全体を通して、対応する参照文字は対応する部分を示している。

本発明のポリアルキレンオキシドヘモグロビン接合体、及びその医薬組成物は、解離条件下でＬＣにより観察される高分子量成分の形成に対する、またはヘモグロビンからのＰＡＯの分離に対する長期及び短期の保存安定性に関して、既知の酸素付加型または非酸素付加型のヘモグロビン治療剤に比較して向上した安定性を示す。それらはまた、既知の酸素付加型または非酸素付加型のヘモグロビン治療剤よりも均一性が高い。これらの接合体はまた、既知のヘモグロビン治療剤を製造するために必要な反応時間と比較して短い反応時間で、温和な条件下において簡単な一段階反応で製造することができる。

如何なる特定の理論にも拘束されるものではないが、ヘモグロビンとＰＡＯの間の吉草酸リンカーは向上した安定性を生じると思われる。吉草酸リンカーの結果として、ＰＡＯとヘモグロビン分子への連結系との間の距離は、炭酸ｐ−ニトロフェニル−ＰＥＧ（ＮＰＣ−ＰＥＧ）、炭酸スクシンイミジル−ＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ）、及びマレイミド−ＰＥＧ（ＭａｌＰＥＧ）のような他の通常のリンカーのそれよりも大きい。このヘモグロビン連結系からＰＡＯまでの約８．８Åのより大きな距離が、ＰＡＯ−ヘモグロビン結合を安定化させるように思える。

本発明は、３７℃且つｐＨ７．４で測定したときに、約２〜約３０ｍｍＨｇに亘るＰ５０をもったＰＡＯヘモグロビン接合体に向けられている。該ＰＡＯは、アミン反応性部分を介して、ヘモグロビン分子上のアミノ酸側鎖に共有結合される。該アミノ反応性部分は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−によってＰＡＯに連結され、ここでのｐは１〜約２０、好ましくは１〜約１２、より好ましくは１〜約８、２〜約６の整数であり、最も好ましくは、ｐは４である。

ヘモグロビンは、任意に分子内架橋される。より詳細に言えば、該ヘモグロビンは、当該技術において既知の慣用方法により、β，β−分子内架橋またはα，α−分子内架橋されることができる。

ヘモグロビンがβ，β−分子内架橋されるとき、ＰＡＯヘモグロビン接合体のＰ５０は、好ましくは約２〜１５ｍｍＨｇ、より好ましくは約２〜１０ｍｍＨｇ、最も好ましくは約７ｍｍＨｇである。

ヘモグロビンがα，α−分子内架橋されるとき、ＰＡＯヘモグロビン接合体のＰ５０は、好ましくは約２０〜３０ｍｍＨｇである。

より詳細には、当該ＰＡＯヘモグロビン接合体は下記の構造を有する：

ここで、Ｈｂはヘモグロビンであり、Ｎはヘモグロビンのアミノ基であり、Ｌはリンカーの−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−であり、Ｘは末端基であり、ｍはヘモグロビンに接合された活性化型ＰＥＧポリマーの平均数であり、ｎは約２，０００〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧにおけるオキシエチレン単位の平均数であり、ｐは１〜２０の整数である。好ましくは、前記平均分子量は約３，０００〜約１０，０００ダルトン、より好ましくは約４，０００〜約６，０００ダルトン、最も好ましくは約５，０００ダルトンである。好ましくは、ｍ、即ち、ヘモグロビンに接合された活性化型ＰＥＧポリマーの数は、ヘモグロビン四量体当たり平均で約６〜約１０の範囲であり、好ましくは約７または８である。前記リンカー−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−におけるエチレン単位の数ｐは、好ましくは１〜約１２の整数、より好ましくは１〜約８、２〜約６、最も好ましくは、ｐは４である。好ましいＰＡＯヘモグロビン接合体は下記の構造を有し：

ここで、Ｈｂ、Ｎ、Ｘ、ｍ、及びｎは上記で定義した通りである。

本発明のＰＡＯヘモグロビン接合体は、ヘモグロビンを少なくとも一つのＰＡＯポリマーと反応させることを含んでなる方法によって調製することができる。該ＰＡＯポリマーは下記の構造を有する：

ここで、Ｒはアミノ反応性部分であり、Ｌはリンカーの−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−であり、Ｘは末端基であり、ｎは約２，０００〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧにおけるオキシエチレン単位の平均数であり、ｐは１〜２０の整数である。好ましくは前記返金分子量は約３，０００〜約１０，０００ダルトンであり、より好ましくは約４，０００〜約６，０００ダルトンであり、最も好ましくは約５，０００ダルトンである。リンカーの−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−におけるエチレン単位の数ｐは、好ましくは１〜約１２の整数であり、より好ましくは１〜約８、２〜約６、最も好ましくは、ｐは４である。好ましいＰＡＯポリマーは下記の構造を有する：

ここで、Ｒ、Ｘ、及びｎは上記で定義した通りである。

Ｘは、ＰＡＯの末端基であり、ヒドロキシ、ベンジロキシのようなアリーロキシ、またはＣ_１〜Ｃ_２０アルコキシ、より好ましくはＣ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基、更により好ましくはメトキシまたはエトキシのようなＣ_１〜Ｃ_５アルコキシ基である。好ましくは、Ｘはメトキシである。

Ｒは、スクシンイミジルまたはｐ−ニトロフェニルのような、ヘモグロビンのアミノ残基と反応する何れかのアミノ反応性部分であることができる。好ましくは、Ｒはスクシンイミジルである。

種々のＨｂが、本発明と共に利用されてよい。このＨｂは、ヒト、ウシ、ブタ、またはウマのヘモグロビンのように、動物供給源から入手してよい。ヒトＨｂが好ましい。Ｈｂは天然起源から得ることができ、または組換え体（例えば、既知の組換え技術により製造されたもの）であることができる。

本発明のヘモグロビンは、約２〜約２０ｍｍＨｇ、好ましくは約２〜約１０ｍｍＨｇに亘り、更に好ましくは７ｍｍＨｇの高い酸素親和性を有することができる。

ヘモグロビンは、二量体への解離を防止して腎臓によるクリアランスを回避し、循環半減期を延長するために、分子内架橋されることができる。Ｈｂを分子内架橋するために、種々の方法が当該技術において知られている。化学的架橋剤には、グルタルアルデヒド（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，００５，４１４）、ポリアルデヒド（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８５７，６３６）、ジアスピリン（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，５２９，７１９）、ピリドキシル−５´−ホスフェート（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，５２９，７１９）、トリメソイルトリス（メチルホスフェート）（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２５０，６６５）、ジアルキン（アジドリンカーを有するヘモグロビンとの反応について：例えば、Ｆｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００９，７３１５−７３１７；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０，４６：７５５７−７５５９参照）が含まれ、またヘモグロビンは組換えにより架橋することができる。

Ｂ，β−ＤＢＢＦで架橋されたＨｂは、以前に文献（Ｗａｌｄｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９７９：Ｖｏｌ １８（２０）：４２６５−７０）に記載されたように、赤血球濃厚液パックから調製されたストロマフリーのヘモグロビンと、フマル酸ビス（３，５−ジブロモサリチル）（ＤＢＢＦ）との反応によって調製できる。例えば、ホウ酸緩衝液（ｐＨ〜８．５）中の酸素付加されたＳＦＨを、約２〜８℃において約１６時間、２倍モル過剰のＤＢＢＦと反応させることができる。

本発明のヘモグロビンを接合することにおいて使用するためのポリエチレンオキシドには、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、及びポリエチレン／ポリプロピレンオキシド共重合体が含まれるが、これらに限定されない。ＰＡＯは、約２，０００〜約２０，０００、好ましくは約３，０００〜約１０，０００、より好ましくは４，０００から約６，０００、最も好ましくは約５，０００の分子量を有している。Ｈｂの表面を修飾するために現在用いられる最も普通のＰＡＯは、ＰＥＧであり、これはその医薬的許容度及び商業的入手可能性のためである。ＰＥＧは、Ｈｂに接合されるＰＥＧの数及びサイズに基づいて望ましい分子量を達成するために、分子内のエチレンオキシドの反復サブユニット（即ち、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−）の数に基づいて種々の分子量で入手可能である。

ＰＡＯポリマーの一方または両方の末端基は、反応性官能基に変換される（「活性化される」）。例えば、ＰＥＧ−ＯＨはＰＥＧ−ハロゲン化物、メシレート、またはトシレートを調製するために使用されてきており、次いで、これは水性アンモニア（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７−１１８３）、アジ化ナトリウム、またはカリウムフタル酸イミドとの求核置換反応を行うことにより、ＰＥＧ−アミン（「ＰＥＧ−ＮＨ_２」）に変換される。次いで、この活性化されたＰＥＧは、ＰＥＧアミン基（−「ＮＨ_２」）とヘムタンパク質のカルボキシ基（「−ＣＯＯＨ」）との反応を介して、ヘムタンパク質に接合させることができる。

官能基を含んだ多くの分子が商業的に入手可能であり、他の分子の付加によるタンパク質の修飾を可能にしている。ポリエチレングリコールのようなこれらの分子は、通常はそれらの末端において、そこに一以上の官能基を付加することによって活性化される。ここで用いるように、ＰＡＯは、それをスクシンイミジル基または「スクシンイミド」を含むように修飾することによって活性化される。スクシンイミドは、式Ｃ_４Ｈ_５ＮＯ_２を有する環状イミドであり、これはタンパク質配列内のリジン及び末端バリン中の遊離アミンに対して反応性である。これに比較して、マレイミドは式Ｈ_２Ｃ_２（ＣＯ）_２ＮＨの環状不飽和イミドであり、これはシステイン残基中の遊離スルフヒドリルに対して反応性であり、また程度は小さいが、リジン及びヒスチッジン残基中の遊離アミンとも反応することができる。マレイミドはスルフヒドリル基と直接反応して共有結合を形成するのに対して、スクシンイミドは、吉草酸の活性なエステルから安定な脱離基を形成する。

活性化されたＰＡＯは、アミン反応部分をＰＡＯに連結するスペーサを含んでいる。このスペーサは、好ましくは二価の吉草酸イオンである。このような活性化されたＰＡＯは商業的に入手可能であり、例えば、吉草酸メトキシポリ（エチレングリコール）スクシンイミジル（ｍＰＥＧ−ＳＶＡ）が含まれる（（Ｌａｙｓａｎ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．，Ａｒａｂ，ＡＬ）。このような官能性ＰＥＧは、既知の方法を使用して、ヘモグロビンのリジン残基または末端バリン残基のような表面アミノ酸ン側鎖に接合されることができる。

ＰＡＯへの接合のために、アミン反応性化学を使用して修飾され得るヒトＨｂのアミノ酸残基側鎖の非限定的な例は、下記の表１に提示されている。
表１-アミン反応性化学及び修飾可能部位

ＰＡＯ−Ｈｂの分子量は、接合反応によって調節できる。接合プロセスのための反応体の分子量を増大させると、一般に、Ｈｂに結合されるＰＥＧ分子の数は増大する。好ましくは、Ｈｂに対して約８倍〜約２０倍モル過剰の活性化されたＰＡＯが、この接合反応に用いられる。より好ましくは、Ｈｂに対して１０倍モル過剰の、ｍＰＥＧ−ＳＶＡのような活性化されたＰＡＯが用いられる。

ヘモグロビンは、Ｈｂ−ＰＡＯ接合体の酸素親和性を増大させるために、ヘモグロビンがその酸素付加された状態にあるときに活性化されたポリアルキレンオキシドと接合される。

ヘモグロビンはまた、酸素付加された状態で接合されたものに比較して酸素親和性を低くするように、それが脱酸素化状態にあるときに、活性化されたポリアルキレンオキシドと接合されることができる。

ＳＶＡ−ＰＥＧ化されたヘモグロビンは、１段階のｍＰＥＧ−ＳＶＡ接合反応を使用して、比較的短い反応時間で調製することができる。一実施形態において、出発材料のｍＰＥＧ−ＳＶＡ及びヘモグロビンは、約５〜約１５℃の温度において、約７〜約８．５のｐＨで約１〜約２時間反応される。ＰＡＯポリマーは、ヘモグロビン濃度に対して約８倍〜約２０倍モル過剰、好ましくは１０倍モル過剰の濃度で存在する。

ｍＰＥＧ−Ｍａｌを用いたヘモグロビンのＰＥＧ化に比較したとき、次の利点が達成される：１）ｍＰＥＧ−Ｍａｌを用いたヘモグロビンの反応部位の数を増やすのに、別途のチオール化反応の必要性がない：２）得られた接合体はより均一であり、これはアミド結合がより安定であり、及び／または残りのイミノチオラン由来の不純物がないことから生じると思われる；３）この反応はより効率的であり、従って反応時間を低減する；４）ヘモグロビン中の本来のβ９３システイン部分が保存され、これはヘムの安定性を高める；５）吉草酸リンケージはより安定であり、これはスクシンイミド基とＰＥＧポリマーの間の距離が３．５オングストロームから８．８オングストロームに増大することから生じると思われる。

本発明のヘモグロビン接合体は、酸素付加形態または脱酸素化形態であることができ、ＣＯまたはＮＯにリガンド結合することができ、またはこれら四つの形態の２以上を含む混合物であることができる。ＨｂＯ_２は、非酸素付加型ヘモグロビンを、空気、純粋なＯ_２ガス、またはＯ_２／窒素ガス混合物と平衡化させることによって調製される。

脱酸素化は、当該技術で知られた何れかの方法により行うことができる。一つの単純な方法は、ヘモグロビン溶液を窒素、アルゴンまたはヘリウムのような不活性ガスに露出させることである。脱酸素化が比較的均一であることを保証するために、このプロセスにおいてＨｂ溶液が循環される。脱酸素化が望ましいレベルを達成することのモニタリングは、Ｃｏ−オキシメータ６８２（インスツルメント・ラボラトリーズ社）を使用することによって行われてよい。もし、部分的な再酸素付加が望ましいならば、脱酸素化されたＨｂを酸素、または空気のような酸素を含むガス混合物に露出させればよい。

分子状酸素を別のガスで置き換えるガス交換は、ポリプロピレンまたは酢酸セルロース膜のようなガス透過性膜を介して達成されてよい。例えば、公開されたＵ．Ｓ．特許出願Ｎｏ．２００６／０２３４９１５を参照されたい。これらの膜を利用した商業的に入手可能なガス交換装置には、ヘキスト−セラネーゼ社（ダラス、ＴＸ）から提供されるセルガード（商標：Ｃｅｌｇａｒｄ）ポリプロピレン微細孔中空ファイバー装置、またはアメリカン・ラボラトリーズ社（イーストライム、ＣＴ）から提供されるセルファーム（商標；Ｃｅｌｌ−Ｐｈａｒｍ）中空ファイバー酸素付加器が含まれる。ヘキスト−セラネーゼ社のセルガード（商標：Ｃｅｌｇａｒｄ）装置においては、システムを５〜２０ｐｓｉの窒素でパージしながら、酸素付加されたＨｂが１０〜１００ｍＬ／分／ｆｔ^２でポリプロピレン微細孔中空フィルターを通される。該Ｈｂは、デオキシＨｂの望ましいパーセンテージを達成するために、一般には約５〜３０分間循環される。脱酸素化されたＨｂを製造するためのもう一つの方法は、Ｈｂ溶液を、アスコルビン酸ナトリウム、ナトリウムジチオレート、及び亜硫酸水素ナトリウムのような化学的還元剤に露出させることを含んでいる。Ｈｂは、還元剤の濃度、反応時間及び温度を調節することによって、部分的に脱酸素化される。或いは、Ｈｂを実質的に脱酸素化するように、還元剤を使用してよい。例えば、Ｈｂは、抗酸化剤を添加する前に約１時間、１００ｍＭ濃度の亜硫酸水素ナトリウムに露出させることができる。

Ｈｂは、オキシヘモグロビンを形成するための何れか既知の方法を使用して、単純にはＯ_２をＣＯで置換することにより、ＣＯにリガンド結合させることができる。これは一般に、ヘモグロビンがＯ_２の代わりにＣＯにリガンド結合するに至るように、ＣＯ源をヘモグロビンの溶液に導入することを含んでいる（Ｋ．Ｄ．Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８２：１８３−１８９（２００４））。ヘモグロビンは、酸素に対してよりもＣＯに対してより高い親和性を有しているので、最初にヘモグロビンを脱酸素化する必要はない。従って、ＣＯ−Ｈｂ複合体を形成する最も便利な方法は、ヘモグロビンの溶液に１００％のガス状ＣＯを導入することによるものである。

ＨｂＮＯは、脱酸素化されたヘモグロビンを一酸化窒素ガスと反応させることによって、またはＣＯ−ＨｂをＮＯガスに露出させてＣＯをＮＯと交換させることによって調製することができる。ＨｂＮＯはまた、脱酸素化されたヘモグロビン、ＰＲＯＬＩ・ＮＯＮＯａｔｅ（商標；即ち、１−（ヒドロキシ−ＮＮＯ−アゾキシ）−Ｌ−プロリン・二ナトリウム塩；ケイマン・ケミカル社、アナーバー、ミシガン）のような小さなＮＯ−ドナー分子と反応させることによって製造することもできる。

遊離基ではなくＮＯがグロビン鎖のアミノ酸側鎖基に結合するヘモグロビンは、ここに定義したＮＯ−Ｈｂ複合体ではないことに留意すべきである。何故なら、このような化合物は、酸素の代わりに、リガンドとしての二原子分子（非イオン性）ＮＯをヘムポケットの中に含んでいないからである。例えば、ニトロシルヘモグロビンは、本来のヘモグロビンが、遊離スルフヒドリル基を結合する条件下でＮＯドナーに露出されるときに形成される（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６２７，７３８）。このようなニトロシルヘモグロビンは、それでもなお酸素を担持するが、本発明ＮＯ−Ｈｂ複合体は担持しない。更に、上記で述べたように、修飾されたヘモグロビンがスルフヒドリル部分に向けられた反応により形成されるとき、これらの部分はもはやＮＯ結合のために利用可能ではない。

本発明のＰＡＯ−Ｈｂ接合体は、水性希釈剤のような非経口投与のための医薬的に許容可能な担体中に、ＰＡＯ−Ｈｂを含有する医薬組成物として処方することができる。担体中のＰＡＯ―Ｈｂ接合体の濃度は、適用に応じて変化することができる。好ましくは，ＰＡＯ−Ｈｂ接合体の濃度は、約０．１ｇ／ｄＬ〜約１０ｇ／ｄＬ、より好ましくは約２．０ｇ／ｄＬ〜約８．０ｇ／ｄＬに亘り、最も好ましくは約４．０〜約６．０ｇ／ｄＬに亘る。ヘモグロビンの適切な濃度の選択は、最終ヘモグロビン製品のコロイド浸透圧（膠質）特性に依存する。好ましくは、本発明の組成物は、全血に比較して等張圧、または血漿に比較して高張性である。該ヘモグロビン濃度は、各適応症について望ましい膠質浸透圧を得るために調節することができる。

当該組成物が非経口用として処方されるとき、該溶液は一般に、全血と等張性で、且つ酸素、ＣＯまたはＮＯを可逆性の担持及び送達するヘモグロビンの性質を維持する生理学的適合性の電解質担体を含んでいる。

前記医薬的に許容可能な担体は、水性希釈剤であることができる。該水性希釈剤は、アルブミンのようなタンパク質の水溶液、糖タンパク質の水溶液、多糖類の水溶液、またはそれらの組合せのような、コロイドの水溶液または非酸素担持成分の水溶液を含むことができる。該水性希釈剤は細胞フリーの水溶液を含んでなることができる。

適切な水性希釈剤には、生理的塩水、塩水−グルコース混合物、リンゲル氏溶液、乳酸加リンゲル氏溶液、ロッケ−リンゲル氏溶液、クレブス−リンゲル氏溶液、ハルトマン氏バランス塩水、へパリン加クエン酸ナトリウム−クエン酸−ブドウ糖溶液、酢酸溶液、多電解質溶液（例えば、ディアフィールド、ＩＬのパクスターインターナショナル社から提供される、プラズマライト［商標］またはプラズマライト−Ａ［商標］）、ラクトビオン酸溶液、ポリマー血漿代用剤、例えばポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール−エチレンオキシド−ポリエチレングリコール縮合物、またはそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。

当該組成物は、更に、医薬的に許容可能な充填剤、塩類、及び号体技術において周知の他の材料を含むことができ、その選択は、投与形態、治療される状態、当業者の決定に従って達成されるべき特別な目的、及び斯かる添加剤の特性に依存する。例えば、当該組成物は、生理学的緩衝剤、炭水化物（例えばグルコース、マンニトール、またはソルビトール）、アルコールまたはポリアルコール、医薬的に許容可能な塩（例えば、塩化ナトリウムもしくはカリウム）、表面活性剤（例えばポリソルベート８０）、抗酸化剤、抗菌剤、膠質浸透圧剤（例えばアルブミン、またはポリエチレングリコール）、または還元剤（例えばアスコルビン酸、グルタチオン、またはＮ−アセチルシステイン）を含むことができる。

当該医薬組成物は、少なくとも約２センチポアズ（ｃＰ）の粘度を有する。より詳細には、該粘度は約２〜約５ｃＰ、特に約２．５〜約４．５ｃＰの範囲である。

投与における合併症を回避するために、当該医薬組成物は高純度（即ち、ストロマ、リン脂質及びパイロジェンを含まない）であり、ＬＡＬ（カブトガニ変形細胞溶解物；ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ）試験で測定したときに０．２５ＥＵ／ｍＬ以下のエンドトキシンレベルを有し、また８％未満のメトヘモグロビンを有する。

医薬組成物は、皮下、静脈内、もしくは筋肉内注射のように非経口的に、または大容量非経口的溶液として投与することができる。該組成物はまた、胃管栄養法により投与することもできる。

治療剤としてのヘモグロビン接合体の典型的な投与量は、患者の体重１キログラム当たり、約１〜約１５，０００ミリグラムのヘモグロビンであることができる。例えば、酸素治療剤として使用するとき、投与量は１００〜７５００ｍｇ／ｋｇ患者体重、より好ましくは５００〜５０００ｍｇ／ｋｇ患者体重、最も好ましくは７００〜３０００ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲であろう。こうして、ヒト患者についての典型的な投与量は、１グラム〜１０００グラム超であろう。個々の単位を数多く投与することによって、必要な有効量に到達できるであろから、各投与形態の個々の投与量に含まれる活性成分の単位含量は、それ自身が有効量を構成する必要はないことが理解されるであろう。投与量の選択は、利用される投与形態、治療される状態、及び当業者の決定に従って達成されるべき特定の目的に依存する。

当該ＰＡＯ−Ｈｂ接合体及び医薬的組成物は、酸素、ＣＯ及び／またはＮＯを被験者に送達するために使用することができる。酸素、一酸化窒素、一酸化炭素またはその混合物を組織に送達し、また亜硝酸塩を還元して微細血管構造内で更なる内因性一酸化窒素（ＮＯ）を産生する方法は、前記ヘモグロビン接合体または組成物を、それを必要としている被験者に投与することを含んでおり、ここでの投与に続き、ヘモグロビンは前記微細血管構造中で脱リガンド化されて、亜硝酸を一酸化窒素に変換する。

本発明のヘモグロビン接合体及びその組成物は、急性肝不全、β地中海貧血症、火傷、慢性重症四肢虚血（ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、二酸化炭素またはシアン化物中毒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（例えば急性悪化）、鬱血性心不全（例えば急性心不全、慢性心不全）、低酸素症（例えば肺水腫、抑圧解除病のためを含む高度の使用）、マラリア（例えば脳マラリア［熱帯熱閉塞事象］）、臓器虚血（急性腸虚血）（念転症）、急性腸虚血（塞栓症）心原性ショック、急性血管性臓器虚血、発作（ＣＡＴ走査前）、発作（ＣＡＴ走査後）、心筋梗塞／重篤な心虚血、抹消血管疾患、ポルフィリン症、妊娠における子癇前症、敗血症、鎌形赤血球病（例えば一過性虚血発作、脾壊死巣分離、肝壊死巣分離、持続勃起症）、網膜症／眼内症状（中心網膜動脈閉塞、中心静脈閉塞）、精巣捻転症、外傷／ショック（例えば外傷性出血性ショック、非外傷性ショック、病院到着前／現場での使用［軍隊／救急］、外傷性脳障害／爆発）、潰瘍、血管痙攣を治療するため；血管形成術に対する補助療法として、形成外科（皮弁）（例えば急性治療または慢性治療）のための補助療法として、または補助人工心臓を移植する際の補助療法として；血液代用剤（急性血液喪失、エホバの証人、血液適合が困難な患者、希少な血液群、再生不良性貧血、鎌形赤血球貧血、周術期管理、急性溶血性貧血（毒素）、または他の難治性貧血）、心保護剤、冷凍保存剤、血液透析補助剤、腫瘍治療剤（例えば放射線治療または化学療法に対する補助療法、固形腫瘍）、臓器保存剤（例えばｅｘ ｖｉｖｏ、ドナーにおいて、レシピエントにおいて）、性能強化剤（例えば市民／競技者、軍人）、手術補助剤（例えば心肺バイパス［プライミング］、心肺バイパス［調節］、肺虚血、術前身体調節、大動脈破裂、胸部大動脈の置換［切開または動脈瘤］）または創傷治癒剤として；撮像（Ｘ線または磁気共鳴撮像（ＭＲＩ））において；肺機能を改善するため（例えば急性肺障害、慢性肺障害、一過性のウイルス性肺炎、新生児呼吸障害症候群）；またはそれらの組合せにおいて使用することができる。このような使用は、当該接合体または組成物を、それを必要としている被験者に投与することを含んでいる。

更に、本発明のヘモグロビン及び組成物は、非外傷性出血性ショック、病院到着前の外傷、外傷性出血性ショック、急性肺損傷、成人呼吸困難症候群、外傷性脳損傷、発作、固形腫瘍癌、臓器退廃（ｅｘ−ｖｉｖｏ）、臓器退廃（レシピエントにおいて）、重篤な敗血症／敗血症ショック、心筋梗塞／心虚血、心原性ショック、急性心不全、肺塞栓症、手術による種々の状態（例えば、血管形成術に対する補助療法、胸部大動脈修復に対する補助療法、心肺バイパスに対する補助療法、心肺バイパスのためのプライミング溶液）またはこれらの組合せを治療するために用いることができる。

本発明のヘモグロビン及び組成物が有用である多くの臨床的環境には、次のものが含まれる。

外傷： 全血の急性喪失は、皮膚及び腸を含む優先度の低い臓器から血液を向けさせながら喪失した血液用量を置換するために、間質空間及び細胞内空間からの体液移動を生じる可能性がある。臓器から血液を駆逐することは、これらの臓器におけるＯ_２レベルを低下させ、ときには排除し、進行的な組織死をもたらす。主要なゴールは、冒された組織に酸素付加することである。この外傷は、病院到達前である可能性があり、または外傷性出血性ショックまたは外傷性脳損傷を生じる可能性がある。

虚血：当該接合体及びその組成物はまた、赤血球または他の多くの酸素治療剤が浸透できない領域へと、酸素、ＣＯ、及び／またはＮＯを送達するために使用することができる。これらの領域には、赤血球細胞流に対する障害物の下流に位置する組織領域、例えば血栓、鎌形赤血球閉塞部、動脈閉塞部、欠陥形成バルーン、外科的器具の下流領域、及び酸素欠乏または低酸素状態に罹患している何れかの組織を含むことができる。例えば発作、出現発作、一過性虚血性発作、心筋スタンニング及び冬眠心筋、急性または不安定の狭心症、出現狭心症、及び梗塞等を含む全てのタイプの組織虚血を治療することができる。特に、虚血をもたらす状態には、急性心不全、心原生ショック、心筋梗塞／心虚血、発作、肺塞栓、非外傷性出血性ショック、または脳血管外傷が含まれる。

血液希釈：この出願において、当該治療剤は、除去された自家血液のＯ_２レベルを元に戻す（または代用する）ために投与される。これは、手術の最中及び手術後の必要な輸血のために、取り出された自家血液の使用を可能にする。術前血液除去を必要とするこのような手術の一つは、心肺バイパス処置であろう。

敗血症／敗血症ショック：敗血症において、幾人かの患者は、大量輸液療法及び血管収縮剤での治療にも拘わらず、高血圧になる可能性がある。この場合、一酸化窒素（ＮＯ）の過剰産生が血圧低下をもたらす。従って、ヘモグロビンは高いアビディティーでＮＯに結合するので、これら患者の治療のための望ましい薬剤である。

低酸素症：患者が、肺炎または膵臓炎によって生じた急性肺障害を有するときは低酸素症が観察され、本発明のヘモグロビンまたは組成物を与え手冒された組織を酸素付加することによって緩和することができる。

癌：固形腫瘍塊の低酸素内部コアにＯ_２を送達することにより、放射線療法及び化学療法に対するその感受性が増大される。腫瘍の微細血管系は他の組織のそれとは異なるので、Ｏ_２レベルを増大することによる鋭敏化は、低酸素コア内でＯ_２が抜き取られることを必要とする。換言すれば、その後の放射線療法及び化学療法に対する腫瘍の最適な鋭敏化を保証するためには、早期のＯ_２の抜き取り、Ｏ_２レベルの増大を防止するためにＰ５０は非常に低くあるべきであろう。

手術：本発明のヘモグロビン及び組成物は、種々の外科処置の際に使用することができる。例えば、それは血管形成術、胸部大動脈修復に対する補助療法として、心肺バイパス処置の際に、または心肺プライミング溶液として使用することができる。

臓器灌流：臓器がｅｘ ｖｉｖｏで、または臓器提供レシピエントにおいて維持されるときには、維持Ｏ_２含量が構造的及び細胞的一体性の保存を補助し、梗塞形成を最小化する。当該ヘモグロビン及び組成物は、このような臓器のための酸素要求性を持続することができる。

当該ヘモグロビン及びその組成物はまた、家畜（例えば家畜及び伴侶動物、イヌ、ネコ、ウマ、トリ、爬虫類）のような非ヒトにも使用できる。本発明は、損傷、溶血性貧血等による失血に罹患している家畜及び野生動物の救急治療に有用性を見出だすことが想定される。獣医学的用途には、傷害、溶血性貧血、感染性貧血、細菌感染、第ＩＶ因子断片化、脾機能亢進及び脾腫大、家禽における出血性症候群、再生不良性貧血、形成不全性貧血、突発性免疫性溶血症状、鉄欠乏症、同種免疫溶血性貧血、微小血管性溶血性貧血、寄生、もしくは外科麻酔に誘導された脳損傷が含まれる。

定義
この開示において「一つの」「不定冠詞（ａまたはａｎ）」の用語が用いられるとき、別途に指示しない限り、それらは「少なくとも一つ」または「１以上」を意味する。

ここで用いる「活性化されたポリアルキレンオキシド」または「活性化されたＰＡＯ」とは、少なくとも一つの官能基を有するＰＡＯ分子を言う。官能基は、ＰＡＯと接合されるべき分子上の遊離アミン、スルフヒドリル基またはカルボキシル基と反応する反応性部分である。例えば、遊離スルフヒドリルと反応する一つのこのような官能基は、マレイミド基である。遊離アミンと反応する官能基は、スクシンイミド基である。

「デオキシヘモグロビン」または「リガンド非結合のヘモグロビン」とは、外因性リガンドがヘムに結合されていない何れかのヘモグロビンを意味する。

「ヘモグロビン」または「Ｈｂ」は、一般的に、酸素を輸送するヘムタンパク質を言う。ヒトにおいて、Ｈｂの各分子は四つのサブユニット、即ち、二つのα鎖サブユニット、及び二つのβ鎖サブユニットを有しており、これらは四量体構造に配置されている。各サブユニットはまた、鉄含有中心である一つのヘム基を含んでおり、これは第二鉄（Ｆｅ^２＋）においてリガンドであるＯ_２、ＮＯまたはＣＯを結合する。従って、各Ｈｂ分子は４以下のリガンド分子を結合することができ、それぞれＨｂＯ_２-、ＨｂＮＯ、またはＨｂＣＯのリガンド結合された化合物を形成する。加えて、当該ヘモグロビンはＯ_２、ＮＯ及びＣＯの混合物でリガンド結合されてよい。

「ヘモグロビンに基づく酸素担体」（ＨＢＯＣ）とは、酸素を輸送するが、一酸化炭素及び一酸化窒素のような他の分子状ガスを搬送するためにも有用であるヘモグロビンを言う。

「高い酸素親和性」とは、ストロマフリーのヘモグロビン（ＳＦＨ）よりも大きい酸素親和性を示すように修飾されているヘモグロビンを言う。従って、「高い酸素親和性」のＨｂは、３７℃及びｐＨ７．４で即手したときに１５ｍｍＨｇのＰ５０を有するＳＦＨよりも低いＰ５０を有する。

「リガンド結合されたヘモグロビン」とは、外因性のリガンドがヘムに結合されているヘモグロビンを意味する。通常の好ましいリガンドには、酸素、一酸化炭素、及び一酸化窒素が含まれる。

「ＭａｌＰＥＧ」とは、マレイミジルポリエチレングリコールを指称するものであり、リンカーを介してポリエチレングリコールに結合されたマレイミジル部分を含んでいる。

「ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ」とは、マレイミジルで活性化されたＰＥＧが接合されているＨｂを言う。接合は、好ましくはＭａｌＰＥＧをＨｂ上のチオール基（及びある程度はアミノ基に）と反応させることにより行われ、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂが形成される。チオール基は、Ｈｂのアミノ酸配列に存在するシステイン残基、例えβＣｙｓ９３における二つの本来的なチオール中に見られ、またチオール基を含むように表面アミノ基を修飾することにより導入することもできる。ＭＰ４（Ｓａｎｇａｒｔ，Ｉｎｃ．社）として知られる例示的なＭａｌＰＥＧ−Ｈｂは、以下の式を有している：

ここで、Ｈｂはヘモグロビンであり；Ｓはヘモグロビン上のチオール基であり；ｎは５，０００ダルトンのポリアルキレンオキシドポリマーにおけるオキシエチレン単位の数であり；ｍはヘモグロビンに接合されたマレイミジル活性化されたポリアルキレンオキシドポリマーの平均数であり、７〜８である。

「メトヘモグロビン」または「ｍｅｔＨｂ」とは、第二鉄状態の鉄を含んだＨｂの酸化型を言う。ＭｅｔＨｂは、酸素またはＣＯの担体としては機能しない。ここで用いる「メトヘモグロビン％」の用語は、全Ｈｂに対する酸化型Ｈｂのパーセンテージを言う。

「メトキシ−ＰＥＧ」または「ｍＰＥＧ−ＯＨ」とは、ヒドロキシ末端の水素がメチル（−ＣＨ_３）基で置換されているＰＥＧを言う。

「修飾型ヘモグロビン」または「修飾型Ｈｂ」とは、分子内架橋及び分子間架橋、重合、接合のような化学反応、及び／または組換え技術により、Ｈｂがもはやその「本来の」状態ではないように変更されているＨｂを言う。ここで用いるとき、「ヘモグロビン」または「Ｈｂ」の用語は、別途指示しない限り、本来の未修飾型Ｈｂ及び修飾型Ｈｂの両方を言う。

「亜硝酸レダクターゼ活性」または「ＮＲＡ」とは、亜硝酸塩を一酸化窒素に還元するヘモグロビンまたはヘモグロビンに基づくタンパク質の能力である。「最大亜硝酸塩レダクターゼ活性」とは、ヘモグロビンまたはヘモグロビンに基づくタンパク質が亜硝酸塩を一酸化窒素に還元できる最大速度である。「初期亜硝酸塩レダクターゼ活性」とは、亜硝酸塩が完全にデオキシ化されたタンパク質に加えられたときに、ヘモグロビンまたはヘモグロビンに基づくタンパク質が亜硝酸塩を一酸化窒素に還元する初期速度である。

「非オキシ型」の用語は、ヘムタンパク質またはヘモグロビンが非リガンド結合型、脱酸素化状態にあること、またはＮＯもしくはＣＯのようなＯ_２以外のガスとリガンド結合されることを意味する。

「酸素親和性」とは、Ｈｂのような酸素担体が分子状酸素を結合するアビディティーを言う。この特徴は酸素平衡曲線によって定義されるが、これはＨｂ分子の酸素の飽和度（Ｙ軸）をこれは酸素分圧（Ｘ軸）に関連付ける。この曲線の位置は「Ｐ_５０」値によって示されるが、これは酸素担体が酸素で半分飽和される酸素の分圧であり、酸素親和性と逆比例する。従って、Ｐ_５０が低いほど酸素親和性は高い。全血（及び全血の成分、例えば赤血球及びＨｂ）の酸素親和性は、当該技術で知られた種々の方法によって測定できる（例えば、Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７，２５２：２３３１−３７参照）。酸素親和性はまた、商業的に入手可能なＨＥＭＯＸ（商標）分析機（ＴＣＳサイエンティフィック・コーポレーション社、Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ、ＰＡ）を使用して決定されてよい（例えば、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ ａｎｄ Ｓｈｒａｇｅｒ ｉｎ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ｅｖｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．）２３２：４６０（１９９４））；及びＶａｎｄｅｇｒｉｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６（１）：１０７−１１６（１９９８）参照）。

ここで用いる「酸素治療剤」の用語は、分子状酸素に結合して、それを必要としている細胞／組織／器官へと輸送することができるヘムタンパク質を言う。ＣＯ−またはＮＯ−リガンド結合したヘムタンパク質の形態で投与されると、ＣＯまたはＮＯがヘム部分から放出されたときに、該ヘム基は分子状酸素に結合してこれを搬送するために自由になる。

「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、一般化学式Ｈ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＨのポリマーを意味し、ここでの「ｎ」は４以上、好ましくは約４５〜約５００、より好ましくは約７０〜約２５０、最も好ましくは約９０〜約１４０、または約１１５である。該ポリマーは置換もしくは非置換であることができ、末端ヒドロキシ基は、メトキシまたはカルボキシのような従来の異なる末端基で置き換えることができる。ＰＥＧは、多くの供給源から商業的に入手可能である（例えば、Ｃａｒｂｏｗａｘ（商標；Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）、Ｐｏｌｙ−Ｇ（登録商標；Ａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、及びＳｏｌｂａｓｅ）。

「ポリエチレングリコールが接合したヘモグロビン」、「ＰＥＧ−Ｈｂ接合体」または「ＰＥＧ−Ｈｂ」とは、少なくとも一つのＰＥＧが共有結合されたＨｂを言う。

「溶液」とは、液体混合物を言い、「水溶液」の用語は、幾らかの水を含み且つ１以上の他の液体物質を含有し得るもので、多成分溶液を形成する溶液を言う。

「ストロマフリーのヘモグロビン」または「ＳＦＨ」とは、赤血球細胞膜が除去されているＨｂを言う。

「表面修飾されたヘモグロビン」とは、化学基、通常はデキストランまたはポリアルキレンオキシドのようなポリマーが結合されているヘモグロビンを言う。「表面修飾された酸素付加したヘモグロビン」の用語は、表面修飾されるときに「Ｒ」状態にあるＨｂを言う。

［末端活性］とは、ヘムタンパク質またはヘモグロビンの反応性基と反応できる部分で官能化されるＰＡＯのパーセンテージの示度である。「１００％末端活性」とは、接合反応に使用されるＰＡＯのモル過剰が、全てのＰＡＯがヘムタンパク質またはヘモグロビンの反応性基と反応できる部分を有することに基づいて表わされることを示している。例えば、もし利用可能なＭａｌ−ＰＥＧが８０％末端活性を有していて、ＰＥＧの８０％がＭａｌで官能化され、Ｍａｌ−ＰＥＧがヘモグロビンに対して２０倍モル過剰で使用されるならば、このモル比は、１００％末端活性に基づき、ヘモグロビンに対して１６倍モル過剰のＭａｌ−ＰＥＧと表わすことができる。

「チオール化」とは、分子上のスルフヒドリル基の数を増大させるプロセスを言う。例えば、タンパク質を２−イミノチオラン（「２−ＩＴ」）と反応させることは、タンパク質の表面上の遊離アミンをスルフヒドリル基に変換する。これらのスルフヒドリル基は、次いでマレイミドのようなチオール反応性部分との反応に利用可能である。

「非リガンド結合型ヘモグロビン」とは、酸素、一酸化炭素または一酸化窒素のような分子状ガスにリガンド結合されない少なくとも一つのヘム部分を含んだ、何れかのヘモグロビンを言う。このように、一つのヘム部分だけでも分子状ガスにリガンド結合されなければ、該ヘモグロビンは「非リガンド結合型」とみなされる。

ここで用いる「ＳＶＡ−ＰＥＧ−Ｈｂ」の用語は、ｍＰＥＧ−ＳＶＡが接合されているＨｂを言う。
本発明を詳細に説明するに当たり、添付の請求項で定義される、本発明の趣旨から逸脱することなく、変形および変更が可能であることが明らかであろう。

本発明を更に例示するために、以下の非限定的な実施例が提供される。
実施例１-ＳＶＡ−ＰＥＧ−Ｈｂの調製

赤血球濃厚液パック（「ＲＢＣ」）が、地域血液バンクであるニューヨーク血液センターまたはアメリカ赤十字のような、商業的供給源から取得された。この材料は、採取時から４５日以内に得られる。全ての単位はウイルス感染についてスクリーニングされ、また使用前に核酸試験を受ける。非白血球除去（Ｎｏｎ−ｌｅｕｋｏｄｅｐｌｅｔｅｄ）のプールされたユニットを、膜濾過により白血球除去（ｌｅｕｋｏｄｅｐｌｅｔｅ）して白血球を除去する。濃厚ＲＢＣを滅菌管にプールし、更に処理するまで２〜１５℃で保存する。その容積を記録し、市販のコオキシメーター（ｃｏ−ｏｘｉｍｅｔｅｒ）、または他の当該技術分野で認められた方法を用いて、Ｈｂ濃度を決定する。

ＲＢＣを、０．４５-μｍの接線流濾過を使用して６容積の０．９％塩化ナトリウムで洗浄し、続いて円濃度を低下させることにより細胞溶解を行う。Ｈｂ抽出は、同じ膜を用いて行う。細胞戦場を分析して、アルブミンについてのスペクトル分析により血漿成分の除去を確認する。該溶解液は、Ｈｂを精製するために、冷却中の０．１６-μｍ膜を通して処理される。この精製されたＨｂは滅菌において採取され、パイロジェンを除去され、次いでウイルスを除去するために限外濾過される。溶媒／洗剤処理、ナノ濾過、及び陰イオンＱ膜精製を含む更なるウイルス低減工程が行われてよい。この方法における全ての工程は、２〜１５℃で行われる。

溶解液からのＨｂは、３０-ｋＤ膜を使用して、乳酸リンゲル液（「ＲＬ」）または燐酸緩衝塩水（「ＰＢＳ」、ｐＨ７．４）の中に交換される。このＨｂは１．１〜１．５ｍＭ（四量体で）に濃縮される。１０〜１２容量のＲＬまたはＰＢＳが、溶媒交換のために使用される。このプロセスは、２〜１５℃において行われる。ＲＬまたはＰＢＳ中で調製されたこの溶液のｐＨは、チオール化の前に８．０に調節される。Ｈｂは、０．４５または０．２-μｍのディスポーザブル濾過カプセルを通して滅菌濾過され、化学修飾反応が行われる前に、４±２℃で保存される。

ＰＥＧ接合：ｍＰＥＧ−ＳＶＡ（Ｌａｙｓａｎ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．，Ａｒａｂ，ＡＬ）が、出発四量体Ｈｂ濃度に対して、１００％末端活性に基づき１０倍モル過剰のｍＰＥＧ−ＳＶＡを用いてＳＦＨに接合された。このＨｂは、Ｈｂを酸素付加するために、最初、空気と平衡化される。ＲＬ（ｐＨ７．０〜８．５）、ＰＢＳまたは何れか同様の緩衝液中の約１ｍＭのＨｂが、同じ緩衝液中の１０ｍＭのｍＰＥＧ−ＳＶＡと合体された。この混合物を、１０±５℃において約２時間連続的に撹拌した。

得られたＰＥＧ−Ｈｂ接合体を、７０-ｋＤ膜（即ち、＜１０透析容量濾過）を通して処理し、未反応の試薬を除去した。このプロセスは、５４０ｎｍ及び２１７ｎｍにおいて、サイズ排除液体クロマトグラフィー（「ＬＣ」）によりモニターされた。濃度は４ｇ／ｄＬＨｂに調節され、またｐＨは６．０〜７．８、または７．０±１．０の範囲に調節された。

ＰＥＧ−Ｈｂ接合体は、０．２-μｍの滅菌ディスポーザブルカプセルを通して滅菌濾過され、４±２℃において、パイロジェン除去された滅菌容器の中に採取された。このＰＥＧ−Ｈｂ接合体をＲＬ中で４．４ｇ／ｄＬに希釈し、またｐＨを７．４±０．２に調節し、次いで滅菌濾過し（０．２μｍ）、一定分量でエンドトキシンを含まない滅菌容器中に収容した。

最終のＰＥＧ化ヘモグロビン接合体（「ＳＶＡ−ＰＥＧ−Ｈｂ」または「ＳＰ４」）は、表１に示した性質を有していた。
表１：ＰＥＧ−ββ−Ｈｂの性質

ＳＶＡ−ＰＥＧ−Ｈｂの構造は、標準の方法を介して更に確認された。
実施例２-ＳＶＡ−ＰＥＧ−Ｈｂの安定性試験

実施例１のＳＶＡ−ＰＥＧ−Ｈｂを、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ（ＭＰ４として既知）及びＳＦＨに比較したものとして、非解離のサイズ排除クロマトグラフィー（ＬＣ）を介して分析した。これらの結果、図４に描かれている。この図は、ＳＶＡ−ＰＥＧ−ＨｂがＭＰ４よりも更に均一な製品であることを示唆している。

図５は、４０℃で１月以下での加速保存条件下でのＣＯにリガンド結合されたＭＰ４の形態（ＭＰ４ＣＯ、上段）に比較したときの、ＣＯにリガンド結合されたＳＶＡ−ＰＥＧ−Ｈｂ（ＳＰ４ＣＯ、下段）の高塩濃度解離条件（０．９ＭのＭｇＣｌ_２）下でのＬＣ分析である。このクロマトグラムは、このような加速安定性試験において、ＳＰ４ＣＯが、ＭＰ４ＣＯの場合よりも大きな安定性を保持したことを示している。

図６は、３２℃で９日間の加速保存条件下においてＣＯにリガンド結合されたＮＰＣ−ＰＥＧ−Ｈｂ（ＮＰ４ＣＯ、上段）に比較したときの、ＣＯにリガンド結合されたＳＶＡ−ＰＥＧ−Ｈｂ（ＳＰ４ＣＯ、下段）の高塩濃度解離条件（０．９ＭのＭｇＣｌ_２）下でのＬＣ分析である。このクロマトグラムは、このような加速安定性試験において、ＳＰ４ＣＯが、ＮＰ４ＣＯの場合よりも大きな安定性を保持したことを示している。左方シフトするピークを示しているこのクロマトグラムは、高塩の独活の乖離条件下でのＬＣによって、ＳＰ４ＣＯに比較し、ＮＰ４ＣＯに観察されたより高分子量の成分の形成を示している。

本発明またはその好ましい実施形態の要素を導入するときに、冠詞である不定冠詞（「ａ」）、不定冠詞（「ａｎ」）、定冠詞（「ｔｈｅ」）及び前記の語（「ｓａｉｄ」）は、一以上の要素が存在することを意味するものである。「含んでなる」「包含する」及び「有する」の用語は包括的であることを意図しており、また列記された要素以外の追加の要素が存在してよいことを意味する。

上記の観点から、本発明の幾つかの目的が達成され、また他の有利な結果が達成されたこと分かるであろう。

上記の組成物及び方法において、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更がなさ得るであろうから、上記説明に含まれた全ての事項及び添付の図面に示された全ての事項は例示的なものであり、限定的なものではないと解釈されるべきであることが意図されている。

Claims (94)

1. ３７℃且つｐＨ７．４で測定したときに約２〜約３０ｍｍＨｇに亘るＰ５０を有する、ポリアルキレン（ＰＡＯ）ヘモグロビン接合体であって、該ＰＡＯは、ヘモグロビン分子上のアミノ酸側鎖のアミノ反応性部分を介して共有結合され、該アミノ反応性部分は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−によってＰＡＯに連結され、ここでのｐは１〜約２０の整数であり、該ヘモグロビンは、任意に分子内架橋される前記ポリアルキレン（ＰＡＯ）ヘモグロビン接合体。
2. 下記の構造を有するＰＡＯヘモグロビン接合体：
   

   

   ここで、
   Ｈｂはヘモグロビンであり、
   Ｎはヘモグロビンのアミノ基であり、
   Ｌはリンカーの−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−であり、
   Ｘは末端基であり、
   ｍはヘモグロビンに接合された活性化型ＰＥＧポリマーの平均数であり、
   ｎは約２，０００〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧにおけるオキシエチレン単位の平均数であり、
   ｐは１〜２０の整数である。
3. ヘモグロビンを少なくとも一つのＰＡＯポリマーと反応させることを含んでなる方法により調製された、ＰＡＯヘモグロビン接合体であって、該ＰＡＯポリマーは次の構造を有する前記接合体：
   

   

   ここで、Ｒは前記アミノ反応性部分であり、Ｌはリンカーの−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−であり、Ｘは末端基であり、ｎは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧにおけるオキシエチレン単位の平均数であり、ｐは１〜２０の整数である。
4. 請求項１〜３の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記Ｐ５０は約２〜２０ｍｍＨｇである前記接合体。
5. 請求項１〜４の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記アミノ反応性部分は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−によって前記ＰＡＯに連結され、ここでのｐは１〜約１２の整数である前記接合体。
6. 請求項１〜４の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記アミノ反応性部分は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−によって前記ＰＡＯに連結され、ここでのｐは１〜約８の整数である前記接合体。
7. 請求項６に記載のヘモグロビン接合体であって、前記アミノ反応性部分は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−によって前記ＰＡＯに連結され、ここでのｐは２〜６の整数である前記接合体。
8. 請求項６に記載のヘモグロビン接合体であって、前記アミノ反応性部分は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−によって前記ＰＡＯに連結され、ここでのｐは４である前記接合体。
9. 請求項３に記載のヘモグロビン接合体であって、Ｒはスクシンイミジルまたはｐ−ニトロフェニルである前記接合体。
10. 請求項９に記載のヘモグロビン接合体であって、Ｒはスクシンイミジルである前記接合体。
11. 請求項２〜１０の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、Ｘはヒドロキシ、アリーロキシ、またはＣ_１〜Ｃ_２０アルコキシである前記接合体。
12. 請求項２〜１０の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、Ｘはメトキシである前記接合体。
13. 請求項１〜１２の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、ｍは四量体当たり平均約６〜約１０のＰＡＯ分子である前記接合体。
14. 請求項１〜１２の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、ｍは四量体当たり平均約８〜約９のＰＡＯ分子である前記接合体。
15. 請求項１〜１４の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ポリアルキレンオキシドは、前記アミン反応性部分を介して前記ヘモグロビン分子上の前記アミノ酸側鎖のアミノ基に共有結合されており、前記ヘモグロビンは酸素付加状態にある前記接合体。
16. 請求項１〜１４の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ポリアルキレンオキシドは、アミン反応性部分を介して前記ヘモグロビン分子上のアミノ酸側鎖のアミノ基に共有結合されており、前記ヘモグロビンは脱酸素状態にある前記接合体。
17. 請求項１〜１６の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ヘモグロビンはβ，β−分子内架橋されている前記接合体。
18. 請求項１７に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ヘモグロビン分子の二つのβ８２リジン残基において、フマル酸ビス（２，５−ジブロモサリチル）が架橋されている前記接合体。
19. 請求項１〜１８の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記Ｐ５０が約２〜１５ｍｍＨｇである前記接合体。
20. 請求項１〜１８の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記Ｐ５０が約２〜１０ｍｍＨｇである前記接合体。
21. 請求項２０に記載のヘモグロビン接合体であって、前記Ｐ５０が約７ｍｍＨｇである前記接合体。
22. 請求項１〜１６の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ヘモグロビンがα，α−分子内架橋されている前記接合体。
23. 請求項２２に記載のヘモグロビン接合体であって、前記Ｐ５０は約２０〜３０ｍｍＨｇである前記接合体。
24. 請求項１〜２３の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記コロイド浸透圧は少なくとも５０ｍｍＨｇである前記接合体。
25. 請求項１〜２４の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、該ヘモグロビン接合体は酸素にリガンド結合される前記接合体。
26. 請求項１〜２５の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、該ヘモグロビン接合体は一酸化炭素にリガンド結合される前記接合体。
27. 請求項１〜２６の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、該ヘモグロビン接合体は一酸化窒素にリガンド結合される前記接合体。
28. 請求項１〜２４の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、該ヘモグロビン接合体は脱酸素化される前記接合体。
29. 請求項１、４〜８及び１３〜２８の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ＰＡＯはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である前記接合体。
30. 請求項２９に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ＰＥＧは約３，０００〜約１０，０００ダルトンの平均分子量を有する前記接合体。
31. 請求項２９に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ＰＥＧは約４，０００〜約６，０００ダルトンの平均分子量を有する前記接合体。
32. 請求項２９に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ＰＥＧは約５，０００ダルトンの平均分子量を有する前記接合体。
33. 請求項２９〜３２の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ＰＥＧはメトキシＰＥＧ−スクシンイミジル吉草酸（ｍＰＥＧ−ＳＶＡ）である前記接合体
34. 請求項２９〜３３の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ＰＥＧのアミノ反応性部分は、前記ヘモグロビンのリジン残基のε−アミノ部分、前記ヘモグロビンの末端バリン残基のα−アミノ部分、またはこれらの組合せから選択される前記ヘモグロビンのアミノ部分に接合される前記接合体。
35. 請求項３４に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ＰＥＧのアミノ反応性部分は、ヘモグロビンα−サブユニットまたはβ−サブユニットのリジン残基のε−アミノ部分に接合される前記接合体。
36. 請求項３４または３５に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ＰＥＧのアミノ反応性部分は、ヘモグロビンα−サブユニットまたはβ−サブユニットにおける末端バリン残基のα−アミノ部分に接合される前記接合体。
37. 請求項３５または３６に記載のヘモグロビン接合体であって、前記リジン残基は、リジン−７、リジン−１１、リジン−１６、リジン−４０、リジン−５６、リジン−６０、リジン−６１、リジン−９０、リジン−９９、リジン−１２７、リジン−１３９及びこれらの組合せからなる群から選択されるヒトヘモグロビンα−サブユニットのリジン残基である前記接合体。
38. 請求項３５または３６に記載のヘモグロビン接合体であって、前記リジン残基は、リジン−８、リジン−１７、リジン−５９、リジン−６１、リジン−６５、リジン−６６、リジン−８２、リジン−９５、リジン−１２０、リジン−１３２、リジン−１４４及びこれらの組合せからなる群から選択されるヒトヘモグロビンβ−サブユニットのリジン残基である前記接合体。
39. 請求項１〜３８の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、Ｎ−エチルマレイミドが、前記ヘモグロビンのβ９３システイン残基に接合される前記接合体。
40. 請求項１〜３９の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、該ヘモグロビン接合体は、前記ＰＡＯポリマーが、前記ヘモグロビンのチオール基またはβ９３システイン残基を介して接合され且つ下記の構造を有する以外は同一であるヘモグロビン接合体に比較して、−２０℃で３６月または周囲温度で少なくとも１８月保存したときにより大きな安定性を有する前記接合体：
    

    

    ここで、Ｘは末端基である。
41. 請求項２〜４０の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、Ｘがヒドロキシ、アリーロキシ、またはＣ_１〜Ｃ_２０アルコキシである前記接合体。
42. 請求項１〜４１の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ヘモグロビンが組換え体である前記接合体。
43. 請求項１〜４２の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体及び医薬的に許容可能な担体を含有してなる医薬組成物。
44. 請求項４３に記載の医薬組成物であって、該組成物は血液と同張性（ｎｏｒｍｏ−ｏｎｃｏｔｉｃ）である前記医薬組成物。
45. 請求項４３に記載の医薬組成物であって、該組成物は、血液と比較して高張性（ｈｙｐｅｒｏｎｃｏｔｉｃ）である前記医薬組成物。
46. 請求項４３〜４５の何れか１項に記載の医薬組成物であって、急性肝不全、β地中海貧血症、火傷、慢性重症四肢虚血（ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、二酸化炭素またはシアン化物中毒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、鬱血性心不全、低酸素症、マラリア、臓器虚血、抹消血管疾患、ポルフィリン症、妊娠における子癇前症、敗血症、鎌形赤血球病、網膜症、眼内症状、精巣捻転症、外傷、ショック、外傷性脳障害、潰瘍、血管痙攣、またはこれらの組合せの治療において使用するための前記医薬組成物。
47. 請求項４６に記載の医薬組成物であって、前記臓器虚血が、急性腸管虚血（腸軸捻症）、急性腸管虚血（塞栓症）、心原性ショック、急性血管性臓器虚血、発作、心筋梗塞、または重篤な心臓虚血を含んでなる前記医薬組成物。
48. 請求項４３〜４５の何れか１項に記載の医薬組成物であって、非外傷性出血性ショック、病院到着前の外傷、外傷性出血性ショック、急性肺損傷、成人呼吸困難症候群、外傷性脳損傷、発作、固形腫瘍癌、臓器退廃（ｅｘ−ｖｉｖｏ）、臓器退廃（レシピエントにおいて）、重篤な敗血症、敗血症ショック、心筋梗塞、心虚血、心原性ショック、急性心不全、肺塞栓症、またはこれらの組合せの治療において使用するための前記医薬組成物。
49. 請求項４３〜４５の何れか１項に記載の医薬組成物であって、血管形成術に対する補助療法として、形成外科のための補助療法として、または補助人工心臓を移植する際の補助療法として；血液代用剤、心保護剤、冷凍保存剤、血液透析補助剤、腫瘍治療剤、臓器保存剤、性能強化剤、手術補助剤、または創傷治癒剤として；撮像において；肺機能を改善するため；またはそれらの組合せにおいて使用するためのものである前記医薬組成物。
50. 血液喪失の獣医学的治療のための請求項４３〜４５の何れか１項に記載の医薬組成物であって、前記血液喪失は、傷害、溶血性貧血、感染性貧血、細菌感染、第ＩＶ因子断片化、脾機能亢進及び脾腫大、家禽における出血性症候群、再生不良性貧血、形成不全性貧血、突発性免疫性溶血症状、鉄欠乏症、同種免疫溶血性貧血、微小血管性溶血性貧血、寄生、もしくは外科麻酔に誘導された脳損傷によるものである前記医薬組成物。
51. 請求項１〜４２の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体または請求項４３〜４５の何れか１項に記載の医薬組成物を、それを必要としている被験者に投与することを含んでなる治療方法。
52. 請求項５１に記載の治療方法であって、前記被験者が動物である前記治療方法。
53. 請求項５１に記載の治療方法であって、前記被験者がヒトである前記治療方法。
54. 請求項５１〜５３の何れか１項に記載の治療方法であって、該方法は、急性肝不全、β地中海貧血症、火傷、慢性重症四肢虚血（ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、二酸化炭素またはシアン化物中毒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、鬱血性心不全、低酸素症、マラリア、臓器虚血、抹消血管疾患、ポルフィリン症、妊娠における子癇前症、敗血症、鎌形赤血球病、網膜症、眼内症状、精巣捻転症、外傷、ショック、外傷性脳障害、潰瘍、血管痙攣、またはこれらの組合せの治療のためのものである前記治療方法。
55. 請求項５４に記載の治療方法であって、前記臓器虚血が、急性腸管虚血（腸軸捻症）、急性腸管虚血（塞栓症）、心原性ショック、急性血管性臓器虚血、発作、心筋梗塞、または重篤な心臓虚血を含んでなる、前記治療方法。
56. 請求項５１〜５３の何れか１項に記載の治療方法であって、該方法は、非外傷性出血性ショック、病院到着前の外傷、外傷性週血性ショック、急性肺損傷、成人呼吸困難症候群、外傷性脳損傷、発作、固形腫瘍癌、臓器退廃（ｅｘ−ｖｉｖｏ）、臓器退廃（レシピエントにおいて）、重篤な敗血症、敗血症ショック、心筋梗塞、心虚血、心原性ショック、急性心不全、肺塞栓症、またはこれらの組合せを治療するための方法である前記治療方法。
57. 請求項５１〜５３の何れか１項に記載の治療方法であって、前記ヘモグロビン四量体または医薬組成物は、血管形成術に対する補助療法として、形成外科のための補助療法として、または補助人工心臓を移植する際の補助療法として；血液代用剤、心保護剤、冷凍保存剤、血液透析補助剤、腫瘍治療剤、臓器保存剤、性能強化剤、手術補助剤、または創傷治癒剤として；撮像において；肺機能を改善するため；またはそれらの組合せのために投与される前記治療方法。
58. 請求項５１〜５３の何れか１項に記載の治療方法であって、前記ヘモグロビン四量体または医薬組成物は、血管形成術に対する補助療法として、胸部大動脈修復に対する補助療法として、心肺バイパス術に対する補助療法として、または心肺バイパスのためのプライミング溶液として投与される前記治療方法。
59. 請求項５１または５２に記載の治療方法であって、前記被験者は非ヒト動物であり、また前記方法は、傷害、溶血性貧血、感染性貧血、細菌感染、第ＩＶ因子断片化、脾機能亢進及び脾腫大、家禽における出血性症候群、再生不良性貧血、形成不全性貧血、突発性免疫性溶血症状、鉄欠乏症、同種免疫溶血性貧血、微小血管性溶血性貧血、寄生、もしくは外科麻酔に誘導された脳損傷による血液喪失の獣医学的治療のための方法である前記治療方法。
60. 酸素、一酸化窒素、一酸化炭素またはそれらの混合物を組織へと送達し、微小血管系中で亜硝酸塩を一酸化窒素（ＮＯ）へと還元する方法であって、該方法は、請求項１〜４２の何れか１項のヘモグロビン接合体または請求項４３〜５０の何れか１項の医薬組成物を、それを必要としている被験者に投与することを含んでなり、ここでの投与後に、前記ヘモグロビンは脱リガンドされるに至り、前記微小血管系において亜硝酸塩を一酸化窒素に変換する前記方法。
61. 請求項２に記載のヘモグロビン接合体を調製する方法であって、該方法はヘモグロビンを、下記の構造を有するＰＡＯポリマーと反応させることを含んでなり、
    

    

    ここで、Ｒは前記アミノ反応性部分であり、Ｌはリンカーの−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−であり、Ｘは末端基であり、ｎは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧにおけるオキシエチレン単位の平均数であり、ｐは１〜２０の整数である前記方法。
62. 請求項６１に記載の方法であって、前記アミノ反応性部分は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−によって前記ＰＡＯに連結され、ここでのｐは１〜１２の整数である前記方法。
63. 請求項６１または６２に記載の方法であって、前記アミノ反応性部分は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−によって前記ＰＡＯに連結され、ここでのｐは１〜８の整数である前記方法。
64. 請求項６３に記載のヘモグロビン接合体であって、前記アミノ反応性部分は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−によって前記ＰＡＯに連結され、ここでのｐは２〜６の整数である前記接合体。
65. 請求項６３に記載のヘモグロビン接合体であって、前記アミノ反応性部分は、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｐ−によって前記ＰＡＯに連結され、ここでのｐは４である前記接合体。
66. 請求項６１に記載の方法であって、前記ＰＡＯポリマーは、前記ヘモグロビン濃度に対して約８〜２０倍モル過剰の濃度で存在する前記方法。
67. 請求項６１に記載の方法であって、前記ＰＡＯポリマーは、前記ヘモグロビン濃度に対して約１０倍モル過剰の濃度で存在する前記方法。
68. 請求項６１〜６７の何れか１項に記載の方法であって、前記反応は、約６．５〜約８．５のｐＨにおいて、約５〜約１５℃で約１〜２時間行われる前記方法。
69. 請求項６１〜６８の何れか１項に記載の方法であって、前記アミノ反応性部分はスクシンイミジルまたはｐ−ニトロフェニルである前記方法。
70. 請求項６９に記載の方法であって、前記アミノ反応性部分はスクシンイミジルである前記方法。
71. 請求項６１〜７０の何れか１項に記載の方法であって、Ｘはヒドロキシ、アリーロキシ、またはＣ_１〜Ｃ_２０アルコキシである前記方法。
72. 請求項７１に記載の方法であって、前記Ｘはメトキシである前記方法。
73. 請求項６１〜７２の何れか１項に記載の方法であって、前記ヘモグロビンは、四量体当たり平均で約６〜約１０のＰＡＯ分子に接合される前記方法。
74. 請求項６１〜７２の何れか１項に記載の方法であって、前記ヘモグロビンは、四量体当たり平均で約７〜約９のＰＡＯ分子に接合される前記方法。
75. 請求項６１〜７４の何れか１項に記載の方法であって、前記ポリアルキレンオキシドは、前記ヘモグロビンが酸素付加された状態にある間に、前記アミノ反応性部分を介して前記ヘモグロビン分子上の前記アミノ酸側鎖におけるアミノ基に共有結合される前記方法。
76. 請求項６１〜７４の何れか１項に記載の方法であって、前記ポリアルキレンオキシドは、前記ヘモグロビンが脱酸素化された状態にある間に、前記アミノ反応性部分を介して前記ヘモグロビン分子上の前記アミノ酸側鎖におけるアミノ基に共有結合される前記方法。
77. 請求項６１〜７６の何れか１項に記載の方法であって、前記ヘモグロビンはβ，β−分子内架橋される前記方法。
78. 請求項７７に記載のヘモグロビン接合体であって、フマル酸ビス（２，５−ジブロモサリチル）が、前記ヘモグロビン分子の二つのβ８２リジン残基において架橋した前記接合体。
79. 請求項６１〜７７の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記ヘモグロビンはα，α−分子内架橋される前記接合体。
80. 請求項６１〜７９の何れか１項に記載の方法であって、前記コロイド浸透圧は少なくとも５０ｍｍＨｇである前記方法。
81. 請求項６１〜８０の何れか１項に記載の方法であって、前記Ｐ５０は約２〜１５ｍｍＨｇである前記方法。
82. 請求項６１〜８０の何れか１項に記載のヘモグロビン接合体であって、前記Ｐ５０は約２〜１０ｍｍＨｇである前記接合体。
83. 請求項８２に記載の方法であって、前記Ｐ５０は約７ｍｍＨｇである前記方法。
84. 請求項６１〜８３の何れか１項に記載の方法であって、更に、前記ヘモグロビン接合体を酸素に露出して酸素付加されたヘモグロビンを形成することを含んでなる前記方法。
85. 請求項６１〜８３の何れか１項に記載の方法であって、更に、前記ヘモグロビン接合体を一酸化炭素に露出してＣＯ−ＰＥＧ−ヘモグロビン接合体を形成することを含んでなる前記方法。
86. 請求項６１〜８５の何れか１項に記載の方法であって、更に、ＣＯヘモグロビンを一酸化窒素に露出してＮＯ−ＰＥＧ−ヘモグロビン接合体を形成することを含んでなる前記方法。
87. 請求項６１〜８４の何れか１項に記載の方法であって、更に、前記ヘモグロビン接合体を脱酸素化することを含んでなる前記方法。
88. 請求項６１〜８７の何れか１項に記載の方法であって、前記ＰＡＯはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である前記方法。
89. 請求項８８に記載の方法であって、前記ＰＥＧは約３，０００〜約１０，０００ダルトンの平均分子量を有する前記方法。
90. 請求項８９に記載の方法であって、前記ＰＥＧは約４，０００〜約６，０００ダルトンの平均分子量を有する前記方法。
91. 請求項９０に記載の方法であって、前記ＰＥＧは約５，０００ダルトンの平均分子量を有する前記方法。
92. 請求項６１〜９１の何れか１項に記載の方法であって、前記ＰＥＧはメトキシＰＥＧ−スクシンイミジル吉草酸（ｍＰＥＧ−ＳＶＡ）である前記方法。
93. 請求項６１〜９２の何れか１項に記載の方法であって、前記ＰＥＧのアミノ反応性部分が、前記ヘモグロビンのリジン残基のε−アミノ部分、前記ヘモグロビンの末端バリン残基のα−アミノ部分、またはそれらの組合せから選択されるヘモグロビンのアミノ部分に接合される前記方法。
94. 請求項６１〜９３の何れか１項に記載の方法であって、更に、Ｎ−エチルマレイミドを前記ヘモグロビンのβ９３システイン残基に接合することを含んでなる前記方法。

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