JP2016518590A - 分析機器システム - Google Patents

Abstract

本発明は、生物学的アレイからのシグナルを分析し、分析対象サンプル中の標的核酸配列の存在の有無を特定するための分析的増幅反応を実施する、光学機器システム及び方法を提供する。【選択図】図１

Description

本願は、米国仮特許出願第６１／７９３，３８８号（２０１３年３月１５日出願）に基づく優先権を主張する。当該出願の前開示事項は、あらゆる目的において援用によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は米国国土安全保障省の助成（契約番号ＨＳＨＱＤＣ−ｌＯ−Ｃ−０００５３）による支援の下でなされたものである。米政府は本発明に一定の権利を有する。

複数の異なる光学シグナルの集合から個々のシグナルの同定、識別及び／又は定量を行うことは、種々の異なる技術分野において高い重要性を有する。

特に注目すべきは、例えば核酸分析、生物学的アッセイ、化学的アッセイ等の光学シグナル伝達に依存する分析操作が複数、多重化して使用されるという点である。生物学的アッセイや化学的アッセイのアレイから光学シグナルデータを収集、記録及び分析するべく、例えば核酸アレイスキャナ、多重化核酸配列決定システム等、多数の分析システムが開発され、商用化されてきた。
例として、サンプル中の１又は２以上の標的核酸の存在を特定するために、核酸アレイが広く用いられてきた。特に、典型的なアレイでは、平面基板表面上の位置的に識別可能な複数の領域に、複数の異なる核酸プローブ配列を結合させる。ここで結合部分、即ち捕捉プローブは、その種類及びそのアレイ表面における位置が既知である。異なる捕捉プローブの各々は、個別の捕捉プローブ位置又は領域内に配置され、当該領域内には同一種の捕捉プローブの集合が含まれることになる。サンプルを関心対象の標的核酸配列、即ちサンプルの試験対象となる配列に特異的なプライマー配列を用いた所望の増幅反応に供する。通常はプライマーの一方又は両方が、蛍光又は他の標識基を含みうる。増幅に引き続き、得られた反応混合物をアレイに接触させる。アレイ表面に蛍光シグナルが現れれば、その位置の捕捉プローブに対する配列相補領域が増幅されたこと、即ち斯かる配列相補領域がサンプル内に存在することが示されることとなる。

これらのアレイからの蛍光シグナルの読み取りには一般に、数々の異なる種類のシステムが用いられてきた。例えば、初期のアレイ読み取り機器は、走査型蛍光顕微鏡を用いてアレイ表面をラスター化し、放出される蛍光を走査位置の関数として読み取っていた。より最近の蛍光読み取り機器は、結像光学系及びセンサを用いてアレイ全体を一度に画像化することにより、分析プロセスの高速化を図っている。斯かるシステムは、診断アレイシステムや核酸配列決定等の種々の異なる用途に対応するため、例えばIllumina HiSeqシステムやPacBio RSシステム等のように、その構成がますます複雑化する傾向にある。

こうしたシステムが広く利用可能ではあるものの、これらのシステムの複雑さをより低減し、その機能性をより向上させる改良を提供することが望まれている。本発明はこれらを含む種々の要請に応えるものである。

本発明は生物学的アレイの分析に有用な分析機器システム及び分析方法を対象とするものである。斯かるシステムの機器は、ＲＴ−ＰＣＲプロセス等の現行の増幅反応プロセスの枠組み内でこうした分析を可能とするものであることが好ましい。斯かるシステムには、使用される反応容器に対して印加する光学トレーン、熱管理、及び反応操作プロセスにおける改良が含まれる。

少なくとも１つの側面によれば、本発明は、励起光源、反応容器、画像センサ、光学トレーン、１又は２以上の熱制御要素、及びプロセッサを含む検出システムであって、前記反応容器が、当該容器上に配置された捕捉プローブ位置のアレイを含み、ここで前記アレイが、励起光に応答して１又は２以上の蛍光シグナルを生成しうるものであり、前記光学トレーンが、前記励起光源からの励起光を前記アレイに伝達すると共に、前記アレイからの蛍光シグナルを前記画像センサに伝達し、前記１又は２以上の熱制御要素が、前記反応容器と熱連通するように配置され、前記プロセッサが、前記１又は２以上の熱制御要素と作動式に連結され、前記反応容器の内容物を熱サイクリングプロファイル（例えば試薬の熱混合等）に供しうる、検出システムを提供する。斯かる態様において、核酸アレイは任意により１又は２以上の蛍光プローブ（例えば捕捉プローブ等）を含んでいてもよく、斯かるアレイの蛍光は任意により、例えば蛍光捕捉プローブによる核酸の捕捉又は検出に基づいて、増強又は減弱されてもよい。斯かる側面のある態様によれば、当該システムの光学トレーンは、蛍光シグナルを画像センサ上に集光するための集光レンズ、及び、前記集光レンズと前記画像センサとの間の光路長調節成分、例えば回転式変厚ディスク等を含んでいてもよい。回転式変厚ディスクを含む態様によれば、斯かるディスクは、ガラス、石英、溶融シリカ、並びに、ポリメチルメタクリレート、ポリ（カーボネート）、ポリ（スチレン）、ポリ（エーテルスルフォン）、ポリ（脂肪族エーテル）、ハロゲン化ポリ（脂肪族エーテル）、ポリ（アリールエーテル）、ハロゲン化ポリ（アリールエーテル）、ポリ（アミド）、ポリ（イミド）、ポリ（エステル）、ポリ（アクリレート）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（オレフィン）、ハロゲン化ポリ（オレフィン）、ポリ（環状オレフィン）、ハロゲン化ポリ（環状オレフィン）、及びポリ（ビニルアルコール）から選択される１又は２以上の透明ポリマーから選択される透明材料を含んでいてもよい。斯かるシステムのある態様によれば、少なくとも１つの熱制御要素は、前記励起光源と前記アレイとの間の光路に配置された熱電要素であってもよく、任意によりその内部に配置され、励起光をアレイに伝送するための（例えば透明な熱伝導性材料を含む）光学的開口を有していてもよい。透明な熱伝導性材料をその内部に有する光学的開口を含む態様において、熱伝導性材料は、少なくとも１Ｗ／ｍＫ、好ましくは５Ｗ／ｍＫ超、及びより好ましくは１０Ｗ／ｍＫ超、場合により１００Ｗ／ｍＫ超、更には５００Ｗ／ｍＫ超の熱伝導性を有していてもよく、及び／又は、ガラス、サファイア、ダイアモンド、結晶性石英、ＭｇＡ１２０４及びＡＬＯＮから選択される材料を含んでいてもよい。本発明のある態様によれば、反応容器がその内部に開口を含む熱制御要素と熱連通するように配置された状態で、光学的に透明な熱伝導性材料と前記反応容器との間に約１〜約５０ミクロン厚の隙間が供されてもよい。更に、ある態様によれば、１又は２以上の熱制御要素によって、反応容器内部に複数の異なる温度領域を生成し、これにより前記反応容器の少なくとも一部において差温を印加してもよい。反応容器内に複数の異なる温度領域を印加する複数の熱制御要素を有する態様によれば、当該システムは、斯かる熱制御要素の複数の異なる温度領域（惹いては反応容器の複数の異なる領域）に対して異なる温度を印加するプログラミングを含むプロセッサを含んでいてもよい。ある態様によれば、熱制御要素は、反応容器中で１又は２以上の成分の熱混合を生じさせてもよい。

ある側面によれば、本発明は、核酸増幅産物を検出する方法であって：反応混合物中の標的核酸を核酸アレイの存在下で増幅し；ハイブリダイゼーション工程において、反応混合物をハイブリダイゼーション温度まで冷却し、前記増幅産物の前記アレイへのハイブリダイゼーションを生じさせ；前記ハイブリダイゼーション工程の前又は当該工程中に、斯かる反応混合物を対流混合に供し；アレイにハイブリダイズする増幅産物を検出することによる方法を含む。斯かる態様において、核酸アレイは任意により、１又は２以上の蛍光プローブ （例えば捕捉プローブ等）を含んでいてもよく、斯かるアレイの蛍光は任意により、例えば蛍光捕捉プローブによる核酸の捕捉又は検出に基づいて、増強又は減弱されてもよい。

図１は、本明細書に記載のシステム及び方法と有用に組み合わせられるアッセイフォーマットの例を模式的に示す図である。

図２は、本発明の機器システム全体の模式図である。

図３は、本明細書に記載の機器システムのサンプルホルダー成分の例を示す図である。

図４Ａは、機器システムの基板ホルダー部分の熱制御要素と組み合わせられる反応容器の例を模式的に示す図である。 図４Ｂは、対流混合を模式的に示す図である。

図５は、光路長調整成分を含む本発明の機器の光学トレーン部分を示す図である。

図６Ａ及び６Ｂは、アレイ上に配置されたアンプリコン等の検体をそれぞれ混合した場合及び混合しない場合における、アレイ上でのサンプル分布を模式的に示す図である。

図７Ａ及び７Ｂは、増幅時にそれぞれ混合を行った場合及び行わない場合における、増幅反応時のアレイ上の蛍光シグナルデータを比較して示す図である。 同上。

図８Ａ及び８Ｂも、増幅時にそれぞれ混合を行った場合及び行わない場合における、増幅反応時のアレイ上の蛍光シグナルデータを比較して示す図である。 同上。

図９は、本発明のシステムと一緒に使用できるアッセイ法の例を模式的に示す図である。

図１０は、本発明のシステムに含まれる反応容器内での試薬の熱混合を示す図である。

Ｉ．概要
本発明は概して、生物学的及び生物化学的分析を行うための分析機器、システム、及び方法を対象とする。本発明の機器及びシステムはとりわけ、標的化された核酸増幅反応に由来する蛍光シグナルをモニターするのに適しており、更に通常は、その基となる増幅プロセスを実施するのにも適している。即ち、本発明のシステムの種々の態様は、検出能力を含むのみならず、例えば熱サイクリング等の操作パラメーターなど、関心対象の反応を実施する能力をも含んでいる。

議論の目的のために、本発明の種々の態様を説明するに際して、例えば米国特許出願第１３／８４４，４２６号（２０１３年３月１５日出願）等に記載のアッセイ法を参照する。本出願は、その全体があらゆる目的において、援用により本明細書に組み込まれる。斯かるアッセイの簡略化したプロセスフローを図９に示す。図９に示すように、各々関連する蛍光部分又はフルオロフォア（Ｆ）を有する捕捉プローブのセット９０２が、基板９０４の表面に固定化される。捕捉プローブ９０２及び関心対象の標的核酸配列の双方に相補的な標的特異的プローブ９０６も提供される。これらの標的特異的プローブは、関連するクエンチャー部分（Ｑ）を含む。捕捉プローブ９０２上のフルオロフォアＦと標的特異的プローブ９０６上のクエンチャーＱとの位置関係は、プローブ９０２及び９０６が一緒にハイブリダイズした場合に、クエンチャーがフルオロフォアの十分近傍に位置し、励起照射に応じて生じるはずの蛍光をクエンチしうる用に選択される。

上記のプローブを関心対象の標的核酸、例えば標的配列９０８を含んでいる可能性があるサンプル材料と接触させてもよく、標的配列は例えば固有のエキソヌクレアーゼ活性等を含むポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応プロセスに供してもよい。ＰＣＲプロセスは溶融、アニーリング、及び伸長反応工程の複数の繰り返しを含み、その結果として標的配列９０８に沿って適切なプライマー９１０の伸長が行われてもよい。各アニーリング工程の際には、少なくとも標的特異的プローブ９０６の一部が標的配列９０８にアニールする。伸長反応時に標的配列がポリメラーゼによって複製されるにつれて、標的にハイブリダイズした標的特異的プローブ９０６が、ポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ活性によって消化されることにより、これらの捕捉プローブ９０２へのハイブリダイズが防止され、惹いては捕捉プローブに関連するフルオロフォアがクエンチされずに維持される。所与の反応混合物において、標的特異的プローブが捕捉プローブ又は標的配列の何れに結合するかには、平衡が存在する。ＰＣＲ反応時に標的配列が増幅されるに従って、この平衡は、より多くの標的特異的プローブが、標識化された捕捉プローブに結合してこれをクエンチするのではなく、標的に結合する方向にシフトする。結果として、増幅に伴って蛍光シグナルが徐々に増大することになる。

追加及び／又は代替のアッセイ法として、例えば米国特許出願第１３／３９９，８７２号に記載のアッセイ法を、本発明の種々の態様と組み合わせて使用してもよい。斯かる出願はその全体があらゆる目的において援用により本明細書に組み込まれる。斯かるアッセイの簡略化したプロセスフローを図１に示す。要約すると、工程Ｉに示すように、サンプル材料を、１又は２以上の関心対象の標的核酸配列１０２の増幅に特異的な増幅プライマー配列１０４を提供することにより、当該標的配列を増幅するように設計されたＰＣＲ増幅に供する。斯かる増幅反応は、関心対象の標的配列をハイブリダイズするように設計された１又は２以上のプローブ配列１０６の存在下で行われる。特に、プローブ１０６は通常、当該標的配列に対して相補的な第一の部分１０６ａと、当該標的配列に対して相補的ではない第二の標識化フラップ部分１０６ｂとを含む。標的配列（工程II）が増幅されると、増幅に使用されるポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ活性によって、標識化フラップ部分１０６ｂが放出される。放出されたフラップ部分１０６ｂは、基板表面等の固相支持体１１０上に供される相補的捕捉プローブ１０８配列によって捕捉される。先に述べたように、これらの捕捉プローブは通常、基板表面上の互いに分離した領域又は部位に配置される。ここで各部位は、全て同一の配列及び／又は特異領域を有する捕捉プローブの群を含む。
固相支持体１１０表面に標識化フラップ部分１０６ｂが蓄積される場合、これは標的配列１０２が存在し、増幅されていることを示す。アッセイ対象となる複数の異なる標的配列に応じて複数の異なるフラップ部分配列を用い、これらのフラップ部分配列に対して相補的な複数の異なる捕捉プローブを基板上の異なる位置にアレイ化することにより、単一サンプル中の複数の異なる標的配列の存在を、単一の増幅反応プロセスによって効率的に検出することができる。更に、標識化フラップ部分が標的にハイブリダイズする必要はないことから、その配列を基板上の所望の捕捉プローブ配列又は配列に基づいて選択することができる。結果として、どのような標的配列又は複数の配列をアッセイする場合でも、ユニバーサル捕捉プローブや複数の捕捉プローブのセットを用いることができる。

本発明のシステム／デバイスと共に使用可能な方法の一部は、クエンチされたプローブの表面からの放出、又は、標識化蛍光プローブの表面への結合に基づく（例えば、表面関連捕捉プローブの放出又は当該プローブへの結合を通じた）基板表面上の蛍光の蓄積に基づいて説明されるが、種々のシグナルフォーマットが容易に実施可能であることは明らかであろう。例えば、あるフォーマットによれば、プローブのフラップ部分の蓄積は、表面に結合された捕捉プローブの蛍光基に関連するシグナルのクエンチングを通じて、プローブのフラップ部分のクエンチャー基により検出することができる。同様に、捕捉プローブを、標的の増幅により消化される標識化標的特異的プローブに相互作用により結合し、惹いては蓄積される蛍光の減少を招くと共に、場合により（例えば上述のような）標的特異的プローブに存在するクエンチャーによる捕捉プローブ関連フルオロフォアのクエンチングの減少を招くように設計してもよい。最後に、代替的な標識化の構成を変更し、例えばＦＲＥＴに基づく標識化等を用いることにより、支持された捕捉プローブから発せられるシグナルの蛍光スペクトルをシフトさせることも可能である。これらの種々のスキームば、例えば同時係属中の米国仮特許出願第１３／３９９，８７２号（出願）及び同第１３／５８７，８８３号（２０１２年８月１６日出願）等に記載されている。これらの出願は、その全体があらゆる目的において、援用により本明細書に組み込まれる。

種々の態様において、上記のアッセイ法は、例えば反応容器又はチャンバー内で行われる。当該チャンバーは、その少なくとも１つの表面上に設けられた平面核酸検出アレイ、例えば１又は２以上の異なる捕捉プローブ領域を含む検出領域を含む。各捕捉プローブ領域は、当該領域内に固定化された同一の特定の捕捉プローブ配列を有するプローブ群を含んでいてもよく、これにより斯かるプローブが、溶液中の任意の遊離相補的核酸、例えば相補的標識化フラッププローブ部分と、当該領域内でハイブリダイズし、局在化することが可能となる。他のプローブ領域は、複数の異なる核酸配列を有するプローブ群を含んでいてもよい。当該チャンバーは、アレイから検出されたシグナルに対して、バックグラウンドのシグナルを低減するように構成されていてもよい。例えば、チャンバーの深さは、アレイに近接する部分の少なくとも１つの寸法において約５００μｍ未満、例えば約１０μｍ〜約２００μｍであってもよい。アレイが形成されるチャンバー表面、例えば検出領域は、光学的シグナル、及び特に蛍光シグナルが収集できるように、透明材料から形成されていることが好ましい。それゆえ、この検出領域の表面は任意により、ガラス、石英、又は透明ポリマー、例えばポリ（スチレン）、ポリ（カーボネート）、ポリ（エーテルスルフォン）、ポリ（脂肪族エーテル）、ハロゲン化ポリ（脂肪族エーテル）、ポリ（アリールエーテル）、ハロゲン化ポリ（アリールエーテル）、ポリ（アミド）、ポリ（イミド）、ポリ（エステル）、ポリ（アクリレート）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（オレフィン）、ハロゲン化ポリ（オレフィン）、ポリ（環状オレフィン）、ハロゲン化ポリ（環状オレフィン）、ポリ（ビニルアルコール）等からなっていてもよい。

種々の態様によれば、デバイスの操作時において、アレイ上の捕捉核酸プローブは、律速条件とならない密度で存在していてもよい。当該アレイは任意により、例えばアレイの空間的に離断された領域に局在化する、複数の捕捉核酸型を含んでいてもよい。例えば、アレイ上に５種以上の異なる捕捉核酸型、例えば最大約１００種以上の異なる型が存在していてもよい。上述のように、デバイスの例は、先に援用により本明細書に組み入れられた米国特許出願第１３／５８７，８８３号等に詳細に記載されている。

捕捉核酸は、アレイの熱サイクリングを容易とするべく、任意によりチャンバー表面上の熱安定コーティングに連結される。コーティングの例としては、任意により化学反応性基、求電子性基、ＮＨＳエステル、テトラ又はペンタフルオロフェニルエステル、モノ又はジニトロフェニルエステル、チオエステル、イソシアネート、イソチオッシアナート、アシルアジド、エポキシド、アジリジン、アルデヒド、α，β−不飽和ケトン又はアミド、例えばビニルケトン又はマレイミド、アシルハライド、スルホニルハライド、イミデート、環状酸無水物、シクロ付加反応の活性基、アルケン、ジエン、アルキン、アジド、又はこれらの組合せが挙げられる。有用な表面コーティングについては、例えば米国特許出願第１３／７６９，１２３号に記載されている。本特許はその全体があらゆる目的において援用により本明細書に組み込まれる。

II．一般的なシステム構成
本発明は概して、特に上述の増幅反応及び分析を実施するのに有用な機器、システム、及び方法を対象とする。特に当該システムは、反応容器内での増幅反応を実施し、その後にこれらの反応容器内に組み込まれた捕捉プローブアレイからの蛍光シグナルデータを収集する。

図２は本発明の全システムの例示的態様を模式的に示す図である。図示するように、全システム２００は反応容器２０２を含み、これが基板ホルダー２０４に可逆的に挿入されてなる。記述のように、反応容器は通常、反応容器２０２の透明表面２０８上に組み込まれた捕捉プローブアレイ２０６を含む。基板ホルダーは通常、選択又はプログラムされた指示に従って、反応容器２０２に印加される温度を上昇又は下降させるための、適切な温度制御要素２１０を含む。温度制御要素２１０は、コンピューター又はプロセッサ２１２によって制御されてもよく、これらは本発明の機器システム内に、斯かる制御の選択及び／又はプログラミングを可能とする適切なユーザーインターフェース（図示せず）と一緒に組み込まれていてもよい。
或いは、斯かるプログラミングを、機器システムと連動するよう連結されたプロセッサ又はコンピューター２１２により達成してもよい。更に、基板ホルダー２０４は通常、反応容器が基板ホルダー２０４に挿入された状態で、反応容器２０２の対応する透明表面２０８と整列するように配置された観測窓２１６を含んでいてもよい。

全システム２００の機器部分である部分２２０は、基板ホルダー２０４内の反応容器２０２から放出される蛍光シグナルを集めて記録する蛍光検出光学部２２２を含む。

図示するように、機器は光学トレーン２２２を含み、これは励起光源２２６、例えばレーザー、レーザーダイオード、ＬＥＤ等を含む。操作時には、光源２２６からの光が励起光集光レンズ２２８及びフィルター２３０を通過することにより、励起光が集光され、励起光スペクトルが所望の蛍光分析に応じて、例えばアッセイ成分の標識化に使用されたフルオロフォア又はフルオロフォア、例えば上述の標識化フラッププローブ部分を励起する等の目的に応じて調整される。図示の便宜上、光路を点線矢印で示す。続いて励起光はダイクロイックミラー２３２に進入する。ダイクロイックミラー２３２は対物レンズ２３４を通じて励起光を反射するように構成される。対物レンズ２３４は基板ホルダー２０４内及び反応容器２０２上の開口又は観測窓２１６を通じて光を集光する。反応容器内の蛍光反応物の励起により生じた蛍光シグナルは、続いて対物レンズ２３４により集められ、ダイクロイック２３２を通過する。ダイクロイックは励起光を反射する一方で、異なる波長の蛍光シグナルは通過させるように構成されている。次に、蛍光シグナルは放射フィルター２３６、例えば狭帯域パス又はスロットフィルターを通過する。これらは、ダイクロイック２３２で除去できなかった直接反射励起光や他の光学ノイズを低減するように構成されている。続いて、フィルターにより選択された蛍光シグナルは放射レンズ２３８、更に任意により追加の集光光学部（図示せず）を通過した後、画像センサ２４０上に放射される。デバイス／システムの画像センサは、種々の適切なセンサアレイの何れかを含んでいてもよい。例としては、ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、ＩＣＣＤ、ＣＭＯＳセンサ等が挙げられる。画像センサ２４０は通常、画像化されたシグナルを記録し、得られた画像化シグナルを分析するための適切なプロセッサ電子機器、例えばプロセッサ２１２に連結される。これらについては以下に詳細に論じる。

III．反応容器
反応容器の例を拡大して模式的に示すのが図３Ａ及び３Ｂである。図３Ａ及び３Ｂに示すように、反応容器３０２はその内部に配置された反応及び検出チャンバー３０４を含む。好ましい側面によれば、検出チャンバーは透明窓部３０６を含むとと共に、好ましくは、その内部表面、例えば表面３０６ａ上に配置された核酸アレイを含む。図示するように、好ましい側面によれば、反応容器は通常、平面形状及び浅いプロファイルを有する上部窓部３０６を含み、例えば溶液中の蛍光標識試薬、即ち表面に結合していない試薬等から発せられるバックグラウンドの蛍光レベルを、関連するアッセイフォーマットに対して低減するように構成される。斯かる平面デバイスは、例えば先に援用により本明細書に組み込まれた米国特許出願第１３／５８７，８８３号に記載されている。図示したデバイスには、試薬をデバイスに導入するための１又は２以上の試薬ポート３０８が含まれている。

少なくとも１つの例示的側面によれば、反応チャンバーは、図3Bに示すような層状の構造を含んでいてもよい。図示するように、反応容器は、底部表面層３１０及び上部表面層３１２と、これらを連結する中間層３１４とを含む。層３１０、３１２、及び３１４を組み立てることにより、切欠き部３１６がチャンバーを形成する。ポート３０８は、組み立て後のチャンバーに対して緩衝剤や試薬を送達し易くする手段である。核酸捕捉アレイは上部又は底部層上に、切欠き部３１６の上部又は底部表面を形成する領域内に形成される。アレイに結合した標識の検出に外部蛍光検出を用いる、利便性に優れた一態様によれば、当該アレイは下部表面３１０上に形成され、前記下部表面の下方に設けられた本発明のデバイス及びシステムの検出光学部により観測可能に構成される。
通常、上部又は底部表面（又はその両方）が窓を含み、これを通じて検出光学部がアレイを観測可能となるように構成されることになろう。

IV．反応容器ホルダー
図２を参照して上述したように、本発明の反応容器は、機器システム２００の反応容器又は基板ホルダー部２０４に挿入することができる。基板ホルダー２０４に挿入された反応容器の熱制御を実施するために、熱制御要素も含まれる。図４Ａは、基板ホルダー部内部に設けられる熱制御要素の例の模式図である。本要素によって、反応容器内の増幅反応の熱管理、例えば熱サイクリング等がなされると共に、反応容器内に組み込まれた捕捉プローブアレイに対する光学的アクセスが位置決め及び提供される。

図示するように、少なくとも２つの熱制御要素４０２及び４０４が基板ホルダー部分内に設けられ、反応容器が容器ホルダーに挿入された場合、言い換えれば、反応容器と熱連通されるように配置された場合に、反応容器及びその内容物の温度を制御することができるように構成される。ある態様によれば、反応容器内の熱サイクリング反応を制御しうる単一の熱制御要素を含んでいてもよい。熱制御要素４０２及び４０４は、基板ホルダー部分に挿入された反応容器の反対側と接触し、又は熱連通するように配置される。これらの温度制御要素としては、本分野で公知の種々の異なる熱制御要素のうち任意の者が挙げられるが、必要に応じて反応容器の加熱及び冷却の双方ができる熱電要素が好ましい。反応容器と温度制御要素との間の接触は、種々の機構で達成することが可能である。例としては、反応容器及び熱制御要素の一方又は双方に圧力を付加して両者を接触させる付勢機構、クランプ、カムスプリング、その他の機械的要素が挙げられる。

反応容器への光学的アクセスは、上述の様に、基板ホルダーの少なくとも片面に配置された開口によって提供することができる。相補的開口４０６は、熱制御要素４０４の一方を通じて、挿入された反応容器４０８及びその関連するプローブアレイとの光学的連通を許容することにより達成できる。特に好ましい側面によれば、熱制御要素４０４を通じた基板ホルダーの観測窓を画定する開口４０６は、これを貫通する透明層４１０を含む。特に好ましい側面によれば、この透明層は、極めて高い熱伝導性を有する透明材料からなる。これにより、熱制御要素の操作と干渉することがなく、自己蛍光も低く抑えることができる。結果として、透明窓は一定の温度や及び変動幅の激しい温度に耐えることができると共に、反応容器との間で迅速な熱伝達も許容することができる。ある側面によれば、透明材料の熱伝導性は１Ｗ／ｍＫ超、好ましくは５Ｗ／ｍＫ超、より好ましくは１０Ｗ／ｍＫ超、場合により１００Ｗ／ｍＫ超、更には５００Ｗ／ｍＫ超である。特に有用な透明材料の例としては、それぞれ約３６Ｗ／ｍＫ及び約１０００Ｗ／ｍＫの熱伝導性を有するサファイア及びダイアモンドが挙げられる。他に有用な透明材料として、例えば結晶性石英、スピネル（ＭｇＡ１２０４）及びＡＬＯＮは、熱伝導性が５Ｗ／ｍＫ超であり、本明細書に記載の態様に好ましく用いられる。ある場合には、熱伝導性の透明窓は熱制御要素内の開口を貫通する部分のみに設けられるのに対し、別の場合には、熱制御要素の層全体に設けることができる。

ある態様では、反応容器が基板ホルダーに挿入された場合に、窓と反応容器との界面における光学的干渉を防止するために、熱伝導性窓と反応容器との間に小さな隙間を含む。特に、光学的干渉を防止するに十分な距離であると共に、基板と熱伝導性窓との間に実質的な絶縁層を形成する程の距離ではない、１〜５０ミクロンの隙間を提供することができる。通常、干渉縞を回避するのに必要な隙間の幅は、それを通過する光のコヒーレンス長と概ね同程度またはそれ以上であろう。このコヒーレンス長は波長及び光帯域幅に依存し、ガウス分布の場合は波長^２／帯域幅として算出できる。例えばMarion and Heald, Classical Electrodynamic Radiation, second edition (Academic Press, New York), 1980を参照のこと。

ある態様によれば、熱制御要素は、増幅プロセス時における反応容器内での加熱及び対流混合を促進するように構成してもよい。特に、アレイ担持捕捉プローブに対する流体担持核酸のハイブリダイゼーションを検出する核酸アレイ系アッセイでは、プロセスの律速工程の一つは、溶液プローブが拡散してアレイプローブにハイブリダイズする速度である。これらのプロセスを加速するための手法として、磁性粒子又は電気泳動ストラテジーを用いて核酸をアレイ表面に引き寄せ、ハイブリダイゼーション工程へと誘導する手法など、多くのアプローチが報告されている。多くの場合、アレイ上に配置された流体を単に混合すれば、十分な接触を達成することができ、流体担持核酸がアレイプローブに十分に接近し、接触する速度を上昇させることができる。単純なアレイシステムにおいても、アレイチャンバー内で要素を混合する工程を加え、或いは単に流体をチャンバー内外にポンプで出し入れすることで達成することができるが、本発明の反応容器の場合には、これらの方法はあまり好ましくない。従って、特に本明細書に記載の態様では、対流混合プロセス が用いられる。

この対流混合を達成するための構成の例を図４Ｂに示す。図示するように、基板ホルダー内に設けられた熱制御要素は、反応チャンバー内で対流混合を生じさせるような熱プロファイルを反応チャンバーに印加するように構成することができる。特に、複数の熱制御要素のサブセットを提供し、一部の熱制御要素の温度を別の熱制御要素の温度よりも低く制御することで、反応チャンバー内に対流混合を生じさせることができる。例えば、図２に示すように、熱制御要素２１０の各々を互いに異なる温度に維持し、反応チャンバー内に対流混合を生じさせてもよい。或いは、図４Ｂに示すように、熱制御要素（図では熱制御要素４５０として表示）の少なくとも１つ、個別に制御可能な二つの部分４５２及び４５４を有し、前記反応容器の少なくとも一部に沿って差温、例えばより温度の低い部分とより温度の高い部分とを生じさせてもよい。他の熱制御要素は、同様に構成してもよいが、一定の温度に制御してもよい。対流混合を生じさせるために、部分４５２の温度を部分４５４よりも低く設定し、反応チャンバー４５６内で矢印で示す向きに対流混合を生じさせる。斯かる不連続の加熱プロファイルを反応チャンバーに印加することで、反応容器内の流体に対流混合を生じさせる。

反応混合物への対流混合プロセスの印加は、例えば反応チャンバー内における乾燥試薬の迅速な溶解及び分配を促進させるべく、液体を反応チャンバーに加えた後、熱サイクリング工程の前に、及び／又は、複数の熱サイクリング工程の間、例えば、反応物を冷却してアレイ上の捕捉プローブへの増幅産物（即ちアンプリコン）のハイブリダイゼーションを生じさせるハイブリダイゼーション工程の間に実施する。

前述したように、本発明の機器システムは通常、熱制御要素を所望の温度プロファイルに従って制御する工程の一方又は両方のために、プロセッサ成分を含む。例えば、これらの機器システム内で実施することが好ましいＰＣＲ増幅反応との関連では、プロセッサは、増幅熱サイクリングプロファイルを反応容器及びその内容物に印加するように熱制御要素を制御するプログラミングを含むことができる。斯かる熱プロファイルは通常、反応混合物を例えば９５℃に加熱し、ハイブリダイズしている標的の相補的核酸鎖を分離する変性工程と、それに続きプライマー配列が標的配列にハイブリダイズし、ポリメラーゼ酵素によってプライマーが標的に沿って伸長する温度、例えば４５〜６０℃まで反応物を冷却するアニーリング及び伸長工程とを。斯かる温度プロファイルを数サイクルに亘って繰り返し、共存する標的配列を増幅してもよい。従って、本発明のシステムは、これらの熱サイクリングプロファイルを実施するためのプログラミングを含んでいてもよい。斯かるプロファイルの例は、先に本明細書に組み込まれた同時係属中の米国仮特許出願第１３／３９９，８７２号（２０１２年２月１７日出願）及び同第１３／５８７，８８３号（２０１２年８月１６日出願）に記載されている。更にプロセッサは、反応容器中における複数の反応物の結合混合、例えばアンプリコン混合を生じさせるべく、１又は２以上の熱制御要素の異なる複数の部分に対して差温プロファイルを印加し、或いは、少なくとも二つの異なる熱制御要素の各々に異なる温度を印加するプログラミングを含むこともできる。また、プロセッサは、アレイから画像センサに受容されたシグナルデータを受信し、分析するためのプログラミング、例えば陽性シグナルを同定し、これらを当初のサンプル材料中の所与の標的配列の存在に関連付けるプログラミングを含んでいてもよい。

Ｖ．集光光学部
上述したように、全機器システムの光学トレーンは通常、反応容器からの蛍光シグナルの画像を画像センサに集光するための集光光学部も含んでいる。ある態様によれば、構成の簡素化及び費用の観点から、簡易光学トレーンが好ましい。特に、図５に示すように、光学トレーン５００は二つの主集光レンズ、即ち、反応容器５０４内のアレイからの蛍光シグナルを収集し、励起光をアレイへと誘導するための対物レンズ５０２と、アレイからの蛍光シグナルの画像を画像化センサ５０８上に集光するための集光レンズ５０６とを含む。より簡素でコスト効率の高い機器システムを提供するために、これらのレンズを互いに対して、更には反応容器５０４及び画像センサ５０８の各々に対して、固定した構成とすることが好ましい。より微細な焦点調節を提供するべく、光路長調節成分５１０が光路内に設けられる。可変光路長を提供することにより、画像の焦点面を画像センサ５０８上に調節することができる。

従来、光を光学軸に対して垂直に転換可能な１又は２以上のくさび形プリズムを導入することにより、光路長を調整し、光学システムの焦点を修正する光路長差を導入できることが報告されている。例えば１９４１年の特許“Variable Focus System for Optical Instruments”、（Mitchell、米国特許第２，２５８，９０３号）を参照のこと。
同様に、加工したくさび形プリズムを用いて、システムの光路長を離散的に変更することもできる（例えば米国特許第５，０４０，８７２号、“Beam Splitter／Combiner with Path Length Compensator”、Steinleを参照のこと）。別の例では、誘電性媒体（例えばガラスやプラスチックの窓）の光路長と、開放空間（即ち空気）の光路長との差を、（ｄ／ｎ０−ｄ／ｎ１）とする（ここで、ｎ０は開放空間の屈折率（〜１）であり、ｎ１は誘電性媒体の屈折率（例えばプラスチックの場合−１．５）である）。例としては遅延プレート及び補償板が挙げられる。上述の要素の何れを用いて光路長調節成分を構成することも可能であり、何れの要素も任意により、本明細書に記載の種々の態様に存在していてもよい。

本明細書に記載の機器システムとの関連において、簡素且つコスト効率性に優れた成分を提供するように、光路調節成分を選択することができる。特に好ましいシステムによれば、光路中に配置された回転式変厚ディスクを含む光路長さ調節成分が含まれる。ディスクを回転させ、ディスクの厚い部分を光路中に介挿することにより、光路長を徐々に増加させることができる。最適な画像焦点が達成されるまでディスクを回転させる。調節可能な光路長成分５１０の一例たる変厚ディスク５１０ａの拡大図を図５に示す。光路長調整成分、例えば回転式変厚ディスクは、透明材料を含む。斯かる透明材料は、任意により種々の光学材料、例えばガラス、石英、溶融シリカ、及び透明ポリマーs、例えばポリメチルメタクリレート、ポリ（カーボネート）、ポリ（スチレン）、ポリ（エーテルスルフォン）、ポリ（脂肪族エーテル）、ハロゲン化ポリ（脂肪族エーテル）、ポリ（アリールエーテル）、ハロゲン化ポリ（アリールエーテル）、ポリ（アミド）、ポリ（イミド）、ポリ（エステル）ポリ（アクリレート）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（オレフィン）、ハロゲン化ポリ（オレフィン）、ポリ（環状オレフィン）、ハロゲン化ポリ（環状オレフィン）、又はポリ（ビニルアルコール）等のうち、任意のものから構成することができる。

以下の実施例は本発明の例示として提供するものであるが、本発明は必ずしもこれらの例に限定されるものではない。本明細書に記載の例及び態様はあくまでも例示のみを目的とするものであって、当業者にはこれらを基にした種々の変形又は改変が示唆されるであろう。これらの変形や改変も、本願の精神及び範囲及び添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。

反応成分のインサイチュ（In Situ）対流混合
上述の様に、アレイを用いたアッセイにより、流体担持核酸、例えば蛍光標識フラッププローブや標識化アンプリコン等の、表面担持捕捉プローブへのハイブリダイゼーションを検出する場合において、より高い感度を得るためには、流体担持核酸を能動的に混合し、アレイ表面へと移送することが好ましい。図６Ａは、検出チャンバーが分子拡散のみに依存して斯かる輸送を行うシナリオを示す。標的コピー数が低い場合には、許容し得る時間範囲内にアンプリコンがアレイにハイブリダイズしない可能性が高い。しかし、混合を加えれば、アンプリコンはチャンバー内で均等に分配され（図６Ｂ）、これにより核酸がアレイの表面と相互作用し、ハイブリダイズする可能性が高まることになる。

混合がＰＣＲ感度に及ぼす影響を試験するために、既知の標的核酸（１００コピーのＨ３ＤＮＡ）を有する試験サンプルを、上述したような標的特異的核酸プローブを含むフラッププローブの存在下で増幅する標準的なアッセイを実施した。増幅プロセス中、増幅反応のサイクル９とサイクル１０との間に混合工程を実施した。同時に、増幅反応のサイクル９とサイクル１０との間に混合を行わない対照実験も行った。計１６回のスプリットＰＣＲ反応を実施した。下の表に示すように、混合を加えたＰＣＲ試験では、試験毎の閾値サイクル（Ｃｔ）の分布がより狭くなった。

１００コピーのＦｌｕＢ標的ＤＮＡを用いて実験を繰り返した。混合あり及び混合なしの各条件下でスプリット反応を再度実施した。この場合、アレイ内の全てのスポットにはＦｌｕＢ捕捉プローブをスポットした。その結果、理想的には全てのスポットにおいて増幅後にシグナルが生じるはずである。混合を加えた場合（図７Ａ）、全てのスポットがＣｔの付近となり、ΔＲｎからアンプリコンが均一に分配されたことが示された。しかし、積極的に混合を生じさせなかった場合には、図７Ｂに示すように、Ｃｔ及びΔＲｎのばらつきはより大きく、アレイ上のスポットの一部は何らシグナルを生じなかった。これらの結果は、アレイ上のアンプリコン濃度は広範な範囲に亘っており、その一部は検出限界未満であったことを示している。

上記実験を繰り返したところ、よりいっそう明確な差異が現れ、サイクル９とサイクル１０との間に混合を含まないスプリットでは、アレイ表面に検出可能なアンプリコンは見られなかったのに対し、混合を加えたサンプルでは非常に良いシグナルが現れた。これらの結果を図８Ａ（混合あり）及び図８Ｂ（混合なし）に示す。

試薬成分の対流混合
本発明のある態様によれば、本システムの検出又は反応容器は、凍結乾燥試薬等を含んでいてもよい。例えば、凍結乾燥試薬には、逆転写（ＲＴ）及びＰＣＲに必要な酵素、ヌクレオチド、塩、及び他の試薬が含まれていてもよい。ＲＴ及びＰＣＲが生じる前に、試薬及びサンプルを検出容器内に均一且つ均質に分配するのが望ましい。斯かる均質な分布を達成するために、図１０に示すように、本発明の一部の態様では、３つのＴＥＣ温度コントローラーを含む構成による熱混合を用いる。

図１０は、例えば本発明のシステム内において、熱混合を用いて凍結乾燥試薬をサンプルと共に再構成し、均質化する態様の例を示す。図１０ａに、検出容器（深さ６００μｍ、幅７ｍｍ、長さ１２ｍｍ）の画像を示す。容器には凍結乾燥されたＲＴ−ＰＣＲ試薬が含まれている。図１０ｂには、サンプルを加えた後、試薬等を混合する前の画像を示す。試薬とサンプルとが容器内で不完全に混合されている様子を見ることができる（中央のパッチにより明るい彩色が施されていることから明らかである）。
しかし、熱混合後には、図１０ｃからわかるように、液体が均一に混合される（容器全体の色が均一であることから明らかである）。混合に際しては、この例では３つの温度コントローラーＴＥＣ１、ＴＥＣ２、ＴＥＣ３を、それぞれ７０、３０、及び３０℃で二分間ずつセットした。

以上、発明を明確化及び理解の便宜のために詳しく説明したが、本明細書を読んだ当業者には明らかなように、本発明の真の範囲を逸脱しない限りにおいて、形式的及び実質的に種々の変更を加えることが可能である。例えば、上に記載の技術及び機器は何れも、種々の組み合わせで使用することが可能である。本明細書に引用する全ての公報、特許、特許出願、及び／又は他の文献は、個々の公報、特許、特許出願、及び／又は他の文献が個別独立に援用により本明細書に組み込まれると明示されているのと同程度において、その全体があらゆる目的において、援用により本明細書に組み込まれる。

Claims (13)

1. 励起光源、反応容器、画像センサ、光学トレーン、１又は２以上の熱制御要素、及びプロセッサを含む検出システムであって、
   前記反応容器が、当該容器上に配置された捕捉プローブ位置のアレイを含み、ここで前記アレイが、励起光に応答して１又は２以上の蛍光シグナルを生成し、
   前記光学トレーンが、前記励起光源からの励起光を前記アレイに伝達すると共に、前記アレイからの蛍光シグナルを前記画像センサに伝達し、
   前記１又は２以上の熱制御要素が、前記反応容器と熱連通するように配置され、
   前記プロセッサが、前記１又は２以上の熱制御要素と作動式に連結され、前記反応容器の内容物を熱サイクリングプロファイルに供しうる、検出システム。
2. 前記光学トレーンが、前記蛍光シグナルを前記画像センサ上に集光する集光レンズ、及び、前記集光レンズと前記画像センサとの間の光路長調節成分を含む、請求項１に記載のシステム。
3. 前記光路長調節成分が、回転式変厚ディスク（rotatable variable thickness disk）を含む、請求項２に記載のシステム。
4. 前記回転式変厚ディスクが、ガラス、石英、溶融シリカ、及び透明ポリマーから選択される透明材料を含む、請求項３に記載のシステム。
5. 前記透明ポリマーが、ポリメチルメタクリレート、ポリ（カーボネート）、ポリ（スチレン）、ポリ（エーテルスルフォン）、ポリ（脂肪族エーテル）、ハロゲン化ポリ（脂肪族エーテル）、ポリ（アリールエーテル）、ハロゲン化ポリ（アリールエーテル）、ポリ（アミド）、ポリ（イミド）、ポリ（エステル）、ポリ（アクリレート）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（オレフィン）、ハロゲン化ポリ（オレフィン）、ポリ（環状オレフィン）、ハロゲン化ポリ（環状オレフィン）、及びポリ（ビニルアルコール）から選択される、請求項４に記載のシステム。
6. 少なくとも１つの熱制御要素が、前記励起光源と前記アレイとの間の光路内に配置された熱電要素であり、前記熱制御要素が、当該要素内に配置され、前記励起光を前記アレイに伝達しうる光学的開口を有し、前記光学的開口が、透明な熱伝導性材料を含む、請求項１に記載のシステム。
7. 前記透明な熱伝導性材料の熱伝導性が、少なくとも１Ｗ／ｍＫ、好ましくは５Ｗ／ｍＫ超、より好ましくは１０Ｗ／ｍＫ超、場合により１００Ｗ／ｍＫ超、更には５００Ｗ／ｍＫ超である、請求項６に記載のシステム。
8. 前記透明な熱伝導性材料が、ガラス、サファイア、ダイアモンド、結晶性石英、ＭｇＡ１２０４、及びＡＬＯＮから選択される材料を含む、請求項６に記載のシステム。
9. 前記反応容器が貫通開口を有する前記熱制御要素と熱連通するように配置した状態で、前記光学的に透明な熱伝導性材料と前記反応容器との間に約１〜約５０ミクロン厚の隙間が存在する、請求項６に記載のシステム。
10. 前記１又は２以上の熱制御要素が、前記反応容器内に複数の異なる温度領域を生成し、これにより前記反応容器の少なくとも一部に差温を印加する、請求項1に記載のシステム。
11. 前記プロセッサが、前記熱制御要素の前記複数の異なる温度領域に異なる温度を印加するプログラミングを含む、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記熱制御要素が、前記反応容器内の１又は２以上の成分に熱混合を生じさせうる、請求項１０に記載のシステム。
13. 核酸増幅産物を検出する方法であって、
    反応混合物中の標的核酸を核酸アレイの存在下で増幅し、
    ハイブリダイゼーション工程において、前記反応混合物をハイブリダイゼーション温度まで冷却し、前記増幅産物の前記アレイへのハイブリダイゼーションを生じさせ、
    前記ハイブリダイゼーション工程の前又は当該工程中に、前記反応混合物を対流混合に供し、
    前記アレイにハイブリダイズする増幅産物を検出する
    ことを含む方法。