JP2016516403A - がんの転移の予後診断および処置のための方法 - Google Patents

がんの転移の予後診断および処置のための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、がんにおける骨転移の予後診断のための方法に関し、その方法は、プローブを使用して原発腫瘍サンプル中の目的の遺伝子が増幅されているかを決定する工程を含む。同様に、本発明は、他の器官における転移についての骨転移を起こす傾向を決定するための方法にも関し、その方法は、プローブを使用して目的の遺伝子の発現レベル、または目的の遺伝子の増幅もしくは転座を決定する工程を含む。本発明は、がんに罹患している被験体における早期の骨転移を予測するための方法にも関する。本発明は、がん転移の処置における使用のための治療剤としてのｃ−ＭＡＦインヒビターにも関する。本発明は、骨転移を予測するためおよび骨転移に罹患している被験体の臨床転帰を予測するためのキットに関する。最後に、本発明は、がんに罹患している被験体をタイプ分けするためおよびがんに罹患している被験体をコホートに分類するための方法に関する。

Description

配列表への言及
本願とともに出願され、電子的に提出される配列表（「３１９０＿００８ＰＣ０１＿ＳＥＱＩＤＬｉｓｔｉｎｇ＿ａｓｃｉｉ．ｔｘｔ」、４８，４５２バイト、２０１４年３月１３日に作成）の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
発明の背景
発明の分野
本発明は、遺伝子異常の検出および遺伝子異常に基づくがんの骨転移の予後診断に関する。１つの実施形態において、本発明は、プローブを使用して原発腫瘍サンプルにおける目的の遺伝子のレベルを決定することを含む。同様に、本発明は、がんを有する被験体において個別化治療（ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ）を設計するための方法にも関し、その方法は、例えば、プローブを使用して、サンプル中の目的の遺伝子のレベルを決定する工程を含む。１つの実施形態において、目的の遺伝子は、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、および５ｓｒＲＮＡからなる群より選択される。別の実施形態において、がんは、乳がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、および腎臓がんからなる群より選択される。
課題
転移は、様々な重要な器官における腫瘍細胞と周囲の正常組織との間の精巧な相互作用によって引き起こされる複雑なプロセスであり、固形腫瘍を有する患者において、すべてのがん死の９０％を占める。この主要な生命を脅かす問題に対してより良好に取り組むために、原発腫瘍が転移を形成するよう導く分子メカニズムおよび細胞メカニズムが理解されなければならない。転移の遺伝子およびメカニズムの同定は、この致死的な状態の基本的な生物学、および臨床実務のためのその関連事項の理解のために必須である。以前の研究は、転移プロセスの複雑さの意味を提供したが、どのようにして、そしてなぜ転移が起こるのか、どのメカニズムが転移を組織特異的プロセスにするのか、どの事象が、原発腫瘍の除去後何年も経過してから、休眠状態の転移を活動的かつ致死的にすることを可能にするのか、そしてどの転移媒介遺伝子が最終的に価値のある診断マーカーおよび治療標的を構成するのかを説明することに失敗した。
本発明は、骨転移を予測するマーカーの同定が、がん細胞による骨転移組織の拡散およびコロニー形成に対して制限を課すことによって、予防的治療の機会を提供し、そして致死的状態を遅延または変換することの実現に基づいている。したがって、例えば、他の潜在的なメカニズムの中でも、１６ｑ２２−２４（１６ｑ２３）増幅または１６ｑ２３転座によって獲得された、正真正銘の乳がん骨転移の遺伝子、タンパク質、およびｍＲＮＡであるＭＡＦの蓄積が、がん性骨転移病変、および、好ましい実施形態においては、骨溶解性がん性骨転移を駆動する原因でもあることが示されてきた。
本発明者らは、播種性がん細胞骨転移に影響を与えるシグナルのバランスを同定することが、予後診断を確立するため、および疾患に対する予防的治療的介入のために、価値のある手がかりを提供するであろうことを決定付けた。
したがって、１つの態様において、本発明は、がん、例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、または腎臓がんに罹患している被験体における上記がんの骨転移の予測、診断、または予後診断のためのインビトロでの方法に関し、その方法は、
ｉ）上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルまたはコピー数の変化を決定または定量する工程、および
ｉｉ）工程ｉ）において得られた発現レベルまたはコピー数を参照値と比較する工程
を含み、ここで、上記参照値と比較して上昇した上記遺伝子の発現レベルまたはコピー数は、骨転移を起こす上昇したリスクの指標となる。
別の態様において、本発明は、がん、例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、または腎臓がんに罹患している患者の臨床転帰を予測するためのインビトロでの方法に関し、その方法は、
ｉ）上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルまたはコピー数を定量する工程、および
ｉｉ）工程ｉ）において得られた発現レベルまたはコピー数を参照値と比較する工程
を含み、ここで、上記参照値と比較して上昇した上記遺伝子の発現レベルまたはコピー数は、不良な臨床転帰の指標となる。
別の態様において、本発明は、がん、例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、または腎臓がんに罹患している被験体のために個別化治療を設計するためのインビトロでの方法に関し、その方法は、
ｉ）上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子、例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ ５ｓｒＲＮＡの遺伝子発現レベルまたはコピー数を定量する工程、および
ｉｉ）ｉ）において得られた発現レベルまたはコピー数を参照値と比較する工程
を含み、ここで、その発現レベルまたはコピー数が、上記参照値と比較して上昇している場合、上記被験体は、骨転移の予防、阻害および／または処置が意図される治療を受けることができる（ｉｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｒｅｃｅｉｖｅ ａ ｔｈｅｒａｐｙ）。発現レベルまたはコピー数が、上記参照値と比較して上昇していない場合、上記被験体は、骨転移の予防、阻害および／または処置が意図される治療を受けることができない。
別の態様において、本発明は、がん、例えば、乳がん、前立腺がん、肺がん、甲状腺がん、または腎臓がんに罹患している被験体における骨転移のリスクを決定するための方法に関し、その方法は、上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、５ｓｒＲＮＡ）の発現レベルまたはコピー数を決定する工程を含み、ここで、平均値＋１標準偏差より高い上記遺伝子の発現レベルまたはコピー数は、早期の骨転移の上昇したリスクの指標となる。
別の態様において、本発明は、骨転移のあるがんを有する被験体のために個別化治療を設計するためのインビトロでの方法に関し、その方法は、
ｉ）プローブを使用して、上記被験体の骨転移サンプル中の目的の遺伝子の遺伝子発現レベルを定量する工程、および
ｉｉ）工程（ｉ）において得られた発現レベルを参照値と比較する工程
を含み、ここで、目的の遺伝子の発現レベルが、上記参照値と比較して上昇している場合、上記被験体は、骨分解を予防するための治療を受けることができる。目的の遺伝子の発現レベルが、上記参照値と比較して上昇していない場合、上記被験体は、骨分解を予防するための治療を受けることができない。
別の態様において、本発明は、がん、例えば、乳がん、前立腺がん、肺がん、甲状腺がん、または腎臓がんに罹患している被験体における上記がんの骨転移を予測するためのインビトロでの方法に関し、その方法は、プローブを使用して、上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、５ｓｒＲＮＡ）が、参照遺伝子コピー数と比べて増幅されているかを決定する工程を含み、ここで、上記参照遺伝子コピー数についての目的の遺伝子の増幅は、骨転移を起こす上昇したリスクの指標となる。
別の態様において、本発明は、がん、例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、または腎臓がんに罹患している被験体における上記がんの骨転移を予測するためのインビトロでの方法に関し、その方法は、上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸまたは５ｓｒＲＮＡ）が、転座しているかを決定する工程を含み、ここで、目的の遺伝子の転座は、骨転移を起こす上昇したリスクの指標となる。
別の態様において、本発明は、がん、例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、または甲状腺がんに罹患している患者の臨床転帰を予測するためのインビトロでの方法に関し、その方法は、上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸまたは５ｓｒＲＮＡ）が、参照遺伝子コピー数と比べて増幅されているかを決定する工程を含み、ここで、上記参照遺伝子コピー数についての目的の遺伝子の増幅は、不良な臨床転帰の指標となる。別の実施形態において、本発明は、がん、例えば、肺がん、腎臓がん、乳がん、甲状腺がん、または前立腺がんに罹患している患者の臨床転帰を予測するためのインビトロでの方法に関し、その方法は、上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、５ｓｒＲＮＡ）が、転座しているかを決定する工程を含み、ここで、目的の遺伝子の転座（すなわち、ｔ（１４，１６））は、不良な臨床転帰の指標となる。
別の態様において、本発明は、がん、例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、甲状腺がんに罹患しており、かつ転移サンプルにおいてコントロールサンプルと比較して上昇した目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸまたは５ｓｒＲＮＡ）のレベル（ｌｅｖｅｌ ｏｒ）を有する被験体における骨転移の処置において使用するための、骨分解を回避するかもしくは予防することができる薬剤に関する。
別の態様において、本発明は、がん（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、または甲状腺がん）に罹患している被験体における上記がんの骨転移を予測するためのキットに関し、そのキットは：ａ）上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸまたは５ｓｒＲＮＡ）の発現レベルを定量するためのプローブ；およびｂ）上記サンプル中の定量された目的の遺伝子の発現レベルを参照の目的の遺伝子の発現レベルと比較するための手段を備える。
別の態様において、本発明は、がん（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、または甲状腺がん）に罹患している被験体における上記がんの骨転移を予測するためのキットに関し、そのキットは：ａ）上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸまたは５ｓｒＲＮＡ）の転座を決定するためのプローブ；およびｂ）上記サンプル中の目的の遺伝子の転座を参照の目的の遺伝子のサンプルと比較するための手段を備える。
別の態様において、本発明は、がん（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、または甲状腺がん）に罹患している被験体における上記がんの骨転移を予測するためのキットに関し、そのキットは：ａ）上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸまたは５ｓｒＲＮＡ）の増幅を定量するためのプローブ；およびｂ）上記サンプル中の目的の遺伝子の増幅されたレベルを参照の目的の遺伝子と比較するための手段を備える。
別の態様において、本発明は、がん（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、または甲状腺がん）からの骨転移に罹患している被験体の臨床転帰を予測するためのキットに関し、そのキットは：ａ）上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸまたは５ｓｒＲＮＡ）の発現レベルを定量するためのプローブ；およびｂ）上記サンプル中の定量された目的の遺伝子の発現レベルを参照の目的の遺伝子の発現レベルと比較するための手段を備える。
別の態様において、本発明は、がん（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、または甲状腺がん）に罹患している被験体に対する治療を決定するためのキットに関し、そのキットは：ａ）上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸまたは５ｓｒＲＮＡ）の発現レベルを定量するためのプローブ；ｂ）上記サンプル中の定量された目的の遺伝子の発現レベルを参照の目的の遺伝子の発現レベルと比較するための手段；ならびにｃ）定量された発現レベルと参照発現レベルとの比較に基づいて、上記被験体において骨転移を予防するためおよび／または減少させるための治療を決定するための手段を備える。
別の態様において、本発明は、ｉ）がん（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、または甲状腺がん）に罹患している被験体のサンプル中の目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸまたは５ｓｒＲＮＡ）の発現レベルを定量するための試薬、およびｉｉ）骨転移のリスクと相関するように予め決定されている１つまたは複数の目的の遺伝子ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現レベル指標を備えるキットに関する。
別の態様において、本発明は、がん（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、または甲状腺がん）に罹患している被験体のサンプルをタイプ分けするためのインビトロでの方法に関し、その方法は：
ａ）上記被験体からのサンプルを提供する工程；
ｂ）プローブを使用して、上記サンプル中の目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸまたは５ｓｒＲＮＡ）の発現レベルを定量する工程；
ｃ）定量された目的の遺伝子の発現レベルを目的の遺伝子の発現の所定の参照レベルと比較することによって上記サンプルをタイプ分けする工程；
を含み、ここで、上記タイプ分けは、上記被験体における骨転移のリスクに関する予後情報を提供する。
別の態様において、本発明は、がん（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、または甲状腺がん）に罹患している被験体における骨転移のリスクを予防するためまたは減少させるための方法に関し、上記方法は、骨転移を予防するかまたは減少させる薬剤を上記被験体に投与する工程を含み、ここで、上記薬剤は、上記被験体における目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸまたは５ｓｒＲＮＡ）の発現レベルの定量から決定された処置レジメンに従って投与される。
別の態様において、本発明は、がん（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、または甲状腺がん）に罹患している被験体における骨転移のリスクを予防するためまたは減少させるための方法に関し、上記方法は、骨転移を予防するかまたは減少させる薬剤を上記被験体に投与しない工程を含み、ここで、上記薬剤は、上記被験体における目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸまたは５ｓｒＲＮＡ）の発現レベルの定量から決定された処置レジメンに従って投与されない。
別の態様において、本発明は、がん（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、または甲状腺がん）に罹患している被験体をコホートに分類する方法に関し、その方法は：ａ）上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸまたは５ｓｒＲＮＡ）の発現レベルを決定する工程；ｂ）上記サンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを目的の遺伝子発現の所定の参照レベルと比較する工程；およびｃ）そのサンプル中の目的の遺伝子の上記発現レベルに基づいて、上記被験体をコホートに分類する工程を含む。特定の態様において、そのコホートは、臨床試験を行うために使用される。
図１は、１６ｑ２３過剰発現は骨転移と関連していることを示す。ａ）遺伝子発現に基づくコピー数の変化の解析（ＡＣＥアルゴリズム）。影の領域は、ＥＲ＋乳がん腫瘍において再発と有意に関連するＤＮＡゲノム増幅を表している（ＧＳＥ２６０３、ＧＳＥ２０３４およびＧＳＥ１２２７６データセットの組み合わせ）。ｂ）１６番染色体について、黒色の点および灰色の横線は、それぞれ、正規化されたｌｏｇ２強度比およびセグメントを表している。ＢｏＭ２は、ＭＣＦ７親細胞に対して比較される。下に灰色で１６ｑ２３を含む１６ｑ２２−２４ＤＮＡゲノム増幅が強調されている。ｃ）１６ｑ２３遺伝子コピー（使用されたプローブは５つの遺伝子ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、５ｓｒＲＮＡ、およびＭＡＦ（セントロマーからテロマーまでの順序）に隣接する（ｆｌａｎｋ））と１４ｑ３２遺伝子コピーとの比に基づいて、親細胞およびＭＡＦ遺伝子が増幅しているＢｏＭ２骨転移細胞のパーセンテージを示しているパネル。ＦＩＳＨで染色した親細胞およびＢｏＭ２細胞の代表的な画像。 図２は、１６ｑ２３ゲノムＤＮＡ領域の増幅は、使用されたプローブは５つの遺伝子ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、５ｓｒＲＮＡ、およびＭＡＦ（セントロマーからテロマーまでの順序）に隣接し、乳がんの骨転移と関連することを示す。ａおよびｂ）ステージＩ、ＩＩおよびＩＩＩ ＢＣヒト原発腫瘍セットにおける無骨転移生存率（ａ）または全生存率（ｂｔ）のカプラン・マイヤー曲線（ｎ＝３３４）。腫瘍１つあたり３つのコアを使用して、平均として細胞１つあたり１６ｑ２３の２．５コピーというカットオフに基づく１６ｑ２３ ＦＩＳＨ陰性群および１６ｑ２３ ＦＩＳＨ陽性群に従って、患者を層別化した。Ｓｅ−感度；Ｓｐ−特異度；ＨＲ−ハザード比。ｃ）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ ＢＣヒト原発腫瘍セットにおけるＥＲ陽性患者（左）またはトリプルネガティブ患者（右）における無骨転移生存率のカプラン・マイヤー曲線（それぞれｎ＝２５０およびｎ＝４３）。腫瘍１つあたり３つのコアを使用して、平均として細胞１つあたり１６ｑ２３に対する２．５コピーというカットオフに基づいて、患者を１６ｑ２３ ＦＩＳＨ陰性群および１６ｑ２３ ＦＩＳＨ陽性群に分けた。ＨＲ−ハザード比。ｄ，ｅ）全体（ｄ）およびＥＲ＋乳がん（ｅ）における１６ｑ２３増幅の診断性能についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。ＲＯＣ曲線において、真陽性率（感度）を、種々のカットオフ点に対する偽陽性率（１００−特異度）の関数でプロットする。ＲＯＣ曲線上の各点は、特定の決定閾値に対応する感度／特異度対を表す。
発明の詳細な説明
一般的な用語および表現の定義
本明細書中で使用されるとき、「骨分解を回避するためまたは予防するための薬剤」とは、骨芽細胞の増殖を刺激するか、または破骨細胞の増殖を阻害するかのいずれかによって、骨分解を予防するか、阻害するか、処置するか、減少させるか、または停止することができる任意の分子のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子の増幅」とは、遺伝子または遺伝子フラグメントの様々なコピーが、個別の細胞または細胞系において形成されるプロセスのことを指す。その遺伝子のコピーは、必ずしも同じ染色体に位置するとは限らない。その重複領域は、「アンプリコン」と呼ばれることが多い。通常は、生成されるｍＲＮＡの量、すなわち、遺伝子発現レベルは、特定の遺伝子のコピー数に比例して増加する。
本明細書中で使用されるとき、「がん」は任意のがんを指す。いくつかの実施形態において、がんは、乳がん（トリプルネガティブ乳がん、基底細胞様乳がん、およびＥＲ＋乳がんを含む）、前立腺がん、肺がん、甲状腺がん、または腎細胞癌腫であり得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「基底細胞様」「基底細胞様サブタイプ」、「基底細胞様サブタイプの乳がん」などは、本明細書中で使用されるとき、２つのレセプターＥＲおよびＨＥＲ２が陰性であること、ならびにＣＫ５／６、ＣＫ１４、ＣＫ１７およびＥＧＦＲからなる群のうちの少なくとも１つのレセプターが陽性であることを特徴とする特定のサブタイプの乳がんのことを指す。したがって、トリプルネガティブ乳がん（ＥＲ、ＨＥＲ−２、ＰｇＲ）を引き合いに出し、言及する本願中のすべての文は、ＥＲおよびＨＥＲ２が陰性であり、ＣＫ５／６、ＣＫ１４、ＣＫ１７およびＥＧＦＲのうちの少なくとも１つが陽性である、基底細胞様乳がんのことも引き合いに出し、言及し得る。あるいは、「基底細胞様」とは、以下の１０個の遺伝子のアップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションに基づく遺伝子発現プロファイルを特徴とする乳がんのことも指す：（１）フォークヘッドボックスＣＩ（ＦＯＸＣ １）；（２）メラノーマ阻害活性（ＭＩＡ）；（３）ＮＤＣ８０ホモログ，キネトコア複合体構成要素（ＫＮＴＣ２）；（４）中心体タンパク質５５ｋＤａ（ＣＥＰ５５）；（５）アニリン（Ａｎｉｌｌｉｎ），アクチン結合タンパク質（ＡＮＬＮ）；（６）母性胚性（Ｍａｔｅｒｎａｌ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）ロイシンジッパーキナーゼ（ＭＥＬＫ）；（７）Ｇタンパク質共役レセプター１６０（ＧＰＲ１６０）；（８）膜貫通タンパク質４５Ｂ（ＴＭＥＭ４５Ｂ）；（９）エストロゲンレセプター１（ＥＳＲ１）；（１０）フォークヘッドボックスＡｌ（ＦＯＸＡ１）。乳がん腫瘍を基底細胞様サブタイプとして分類するために使用される遺伝子発現プロファイルは、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプターまたはＨｅｒ２を含まないので、トリプルネガティブ乳がんと非トリプルネガティブ乳がんの両方が、基底細胞様サブタイプとして分類され得る。
本明細書中で使用されるとき、「トリプルネガティブ乳がん」とは、ＥＲとＰＲの両方の検出可能な発現を欠くことを特徴とする乳がんのことを指し（好ましくは、ＥＲおよびＰＲの発現の測定が、Ｍ．Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２８（１６）：２７８４−２７９５，２０１０によって開示された方法によって行われるとき）、その腫瘍細胞では、正常には細胞表面上に位置するレセプターである上皮成長因子レセプタータイプ２（ＨＥＲ２またはＥｒｂＢ２）が増幅されていない。標準的な免疫組織化学的技法を用いて、５パーセント未満の腫瘍細胞核しか、ＥＲおよびＰＲ発現について染色されない場合、その腫瘍細胞は、ＥＲおよびＰＲの発現について陰性であると考えられる。本明細書中で使用されるとき、腫瘍細胞は、ポリクローナル抗ＨＥＲ２一次抗体を使用する半定量的免疫組織化学的アッセイであるＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔＴＭＫｉｔ（Ｃｏｄｅ Ｋ５２０４，Ｄａｋｏ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いて試験されたときに０もしくは１＋もしくは２＋という試験結果スコアをもたらす場合、またはＨＥＲ２ ＦＩＳＨが陰性である場合、ＨＥＲ２過剰発現について陰性であると考えられる。
「肺がん」とは、肺において生じる任意のがんを指す。肺がんは、４つの主要なタイプの肺がんと、複数の副次的なまたはまれな形態からなる。臨床病理学的な理由により、燕麦細胞癌とも呼ばれる小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）と、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の広いカテゴリーにしばしば分けられる。ＮＳＣＬＣはさらに、３つの主要なタイプ、扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、腺がん、および大細胞癌腫に分けられる。
「前立腺がん」とは、前立腺において生じる任意のがんを指す。前立腺がんは、腺がんまたは腺性のがんとして分類され、これは、正常な精液を分泌する前立腺細胞ががん細胞に変異するときに開始する。腺がんが最も一般的である前立腺の領域は辺縁部である。最初はがん細胞の小塊が、他の点では正常な前立腺に限局されたままであり、これはインサイチュ癌腫または前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）として知られる状態である。ＰＩＮはがん前駆体であるという証拠はないが、これはがんと密接に関係している。
「甲状腺がん」とは、甲状腺濾胞細胞と濾胞傍Ｃ細胞の両方に由来するがんを含む。甲状腺濾胞細胞由来の腫瘍には、乳頭癌（ＰＴＣ）、濾胞腺癌（ＦＴＣ）、低分化がん（ＰＤＴＣ）、および未分化がん（ＡＴＣ）が含まれる。ＰＴＣとＦＴＣは、集合的に、分化がん（ＤＴＣ）として分類される。濾胞傍Ｃ細胞に由来する髄様がん（ＭＴＣ）は濾胞傍Ｃ細胞から誘導される。他の型のがんには、甲状腺リンパ腫、扁平上皮細胞甲状腺癌腫、および甲状腺の肉腫が含まれる。
本明細書中で使用されるとき、「目的の遺伝子」とは、１６ｑ２２−２４遺伝子座における任意の遺伝子を指す。目的の遺伝子はＭＡＦであり得る。目的の遺伝子はＶＡＴ１Ｌであり得る（遺伝子ＩＤ：５７６８７、１６番染色体に位置、ＮＣ＿００００１６．９（７７８２２４８３．．７８０１４００１））。目的の遺伝子はＣＬＥＣ３Ａであり得る（遺伝子ＩＤ：１０１４３、１６番染色体に位置、ＮＣ＿００００１６．９（７８０５６４４３．．７８０６６００３））。目的の遺伝子はＷＷＯＸであり得る（遺伝子ＩＤ：５１７４１、１６番染色体、ＮＣ＿００００１６．９（７８１３３３２７．．７９２４６５６４）。目的の遺伝子は５ｓｒＲＮＡであり得る（遺伝子ＩＤ：６４５９５７、１６番染色体に位置、ＮＣ＿００００１６．９（７８８５９１４９．．７８８５９９８２））。
本明細書中で使用されるとき、「ｃ−ＭＡＦ遺伝子」または「ＭＡＦ」（ＭＡＦまたはＭＧＣ７１６８５としても知られるｖ−ｍａｆ筋腱膜性線維肉腫癌遺伝子ホモログ（鳥類））は、ホモ二量体またはヘテロ二量体のように作用するロイシンジッパーを含む転写因子である。ＤＮＡ結合部位に応じて、コードされるタンパク質は、転写活性化因子または転写抑制因子であり得る。ｃ−ＭＡＦをコードするＤＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＧ＿０１６４４０（配列番号１（ゲノム））としてＮＣＢＩデータベースに記載されている。ｃ−ＭＡＦのコード配列は、配列番号１３に示されている。本発明の方法は、コード配列またはゲノムＤＮＡ配列を利用し得る。上記ＤＮＡ配列からは２つのメッセンジャーＲＮＡが転写され、その各々が、２つのｃ−ＭＡＦタンパク質アイソフォーム、αアイソフォームおよびβアイソフォームのうちの１つを生じる。上記アイソフォームの各々に対する相補ＤＮＡ配列は、それぞれ、アクセッション番号ＮＭ＿００５３６０．４（配列番号２）およびＮＭ＿００１０３１８０４．２（配列番号３）としてＮＣＢＩデータベースに記載されている。
本明細書中で使用されるとき、「ｃ−ＭＡＦ阻害剤」とは、ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現を完全にまたは部分的に阻害することができる（その両方が、上記遺伝子の発現産物の生成を妨げること（ｃ−ＭＡＦ遺伝子の転写を妨害することおよび／またはｃ−ＭＡＦ遺伝子発現に由来するｍＲＮＡの翻訳を阻止すること）およびｃ−ＭＡＦタンパク質活性を直接阻害することによって）任意の分子のことを指す。Ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現インヒビターは、国際特許出願ＷＯ２００５／０４６７３１（その全内容が本明細書によって参照により援用される）に示されているような、ｃ−ＭＡＦがインビトロにおける細胞増殖を促進する能力をいわゆるインヒビターが阻止する能力に基づく方法、ＷＯ２００８０９８３５１（その全内容が本明細書によって参照により援用される）に記載されているような、ｃ−ＭＡＦを発現する細胞においてサイクリンＤ２プロモーターもしくはｃ−ＭＡＦ応答領域（ＭＡＲＥまたはｃ−ＭＡＦ応答エレメント）を含むプロモーターの支配下のレポーター遺伝子の転写能力をいわゆるインヒビターが阻止する能力に基づく方法、またはＵＳ２００９０４８１１７Ａ（その全内容が本明細書によって参照により援用される）に記載されているような、ＮＦＡＴｃ２およびｃ−ＭＡＦを発現する細胞においてＰＭＡ／イオノマイシンによる刺激に応答してＩＬ−４プロモーターの支配下のレポーター遺伝子の発現をいわゆるインヒビターが阻止する能力に基づく方法を用いて同定され得る。
本明細書中で使用されるとき、ラパマイシンの哺乳動物における標的（ｍＴＯＲ）または「ｍＴｏｒ」とは、ＥＣ ２．７．１１．１に相当するタンパク質のことを指す。ｍＴｏｒ酵素は、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼであり、細胞増殖、細胞運動性、細胞成長、細胞生存および転写を制御する。
本明細書中で使用されるとき、「ｍＴｏｒインヒビター」とは、ｍＴｏｒ遺伝子の発現を完全にまたは部分的に阻害することができる（その両方が、上記遺伝子の発現産物の生成を妨げること（ｍＴｏｒ遺伝子の転写を妨害することおよび／またはｍＴｏｒ遺伝子発現に由来するｍＲＮＡの翻訳を阻止すること）およびｍＴｏｒタンパク質活性を直接阻害することによって）任意の分子のことを指す。二重またはそれより多くの標的および中でもｍＴｏｒタンパク質活性を有するインヒビターを含む。
本明細書中で使用されるとき、「Ｓｒｃ」とは、ＥＣ ２．７．１０．２に相当するタンパク質のことを指す。Ｓｒｃは、非レセプターチロシンキナーゼおよび癌原遺伝子である。Ｓｒｃは、細胞成長および胚発生において役割を果たし得る。
本明細書中で使用されるとき、「Ｓｒｃインヒビター」とは、Ｓｒｃ遺伝子の発現を完全にまたは部分的に阻害することができる（その両方が、上記遺伝子の発現産物の生成を妨げること（Ｓｒｃ遺伝子の転写を妨害することおよび／またはＳｒｃ遺伝子発現に由来するｍＲＮＡの翻訳を阻止すること）およびＳｒｃタンパク質活性を直接阻害することによって）任意の分子のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、「プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２」、「シクロオキシゲナーゼ−２」または「ＣＯＸ−２」とは、ＥＣ １．１４．９９．１に相当するタンパク質のことを指す。ＣＯＸ−２は、アラキドン酸からのプロスタグランジンエンドペルオキシドＨ２への変換に関与する。
本明細書中で使用されるとき、「ＣＯＸ−２インヒビター」とは、ＣＯＸ−２遺伝子の発現を完全にまたは部分的に阻害することができる（その両方が、上記遺伝子の発現産物の生成を妨げること（ＣＯＸ−２遺伝子の転写を妨害することおよび／またはＣＯＸ−２遺伝子発現に由来するｍＲＮＡの翻訳を阻止すること）およびＣＯＸ−２タンパク質活性を直接阻害することによって）任意の分子のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、「転帰」または「臨床転帰」とは、結果として生じる疾患の経過および／または疾患の進行のことを指し、例えば、再発、再発までの期間、転移、転移までの期間、転移の数、転移の部位の数および／または疾患に起因する死亡によって特徴付けられ得る。例えば、良好な臨床転帰としては、治癒、再発の予防、転移の予防および／または一定の期間内の生存（再発なし）が挙げられ、不良な臨床転帰としては、疾患の進行、転移および／または一定の期間内の死亡が挙げられる。
本明細書中で使用されるとき、「ＥＲ＋乳がん」は、その腫瘍細胞がエストロゲンレセプター（ＥＲ）を発現する乳がんとして理解される。このおかげで上記腫瘍はエストロゲンに感受性になり、これは、エストロゲンががん性の乳房腫瘍を成長させることを意味する。対照的に、「ＥＲ−乳がん」は、その腫瘍細胞がエストロゲンレセプター（ＥＲ）を発現しない乳がんとして理解される。
本明細書中で使用されるとき、本明細書中で使用される遺伝子の「発現レベル」という用語は、被験体のサンプル中の遺伝子によって生成される遺伝子産物の測定可能な量のことを指し、ここで、その遺伝子産物は、転写産物または翻訳産物であり得る。したがって、発現レベルは、核酸遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）またはポリペプチド遺伝子産物に関係し得る。発現レベルは、被験体のサンプルおよび／または参照サンプル（複数可）から得られ、例えば、新規に検出され得るか、または事前の測定値に対応し得る。発現レベルは、例えば、当業者に公知であるような、マイクロアレイ法、ＰＣＲ法（例えば、ｑＰＣＲ）および／または抗体ベースの方法を用いて、決定され得るかまたは測定され得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子コピー数」とは、細胞における核酸分子のコピー数のことを指す。遺伝子コピー数は、細胞のゲノム（染色体）ＤＮＡにおける遺伝子コピー数を含む。正常な細胞（非腫瘍細胞）では、遺伝子コピー数は、通常、２コピー（染色体対の各メンバーにおいて１コピー）である。遺伝子コピー数は、時折、細胞集団のサンプルから採取された遺伝子コピー数の半数を含む。
「上昇した発現レベル」は、それが参照サンプルまたはコントロールサンプルにおけるｃ−ＭＡＦ遺伝子のレベルよりも高いレベルのことを指すときの発現レベルと理解される。特に、患者から単離されたサンプル中の発現レベルが、参照またはコントロールと比較して、少なくとも、約１．１倍、１．５倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはなおもそれより高いとき、そのサンプルは、高いｃ−ＭＡＦ発現レベルを有すると考えられ得る。
「プローブ」は、本明細書中で使用されるとき、目的の特定の核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列のことを指す。いくつかの実施形態において、プローブは、転座を起こすと知られている染色体の領域に特異的であり得る。いくつかの実施形態において、プローブは、特異的な標識またはタグを有する。いくつかの実施形態において、タグは、フルオロフォアである。いくつかの実施形態において、プローブは、その標識が核酸およびタンパク質への白金の安定な配位結合（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）に基づくＤＮＡインサイチュハイブリダイゼーションプローブである。いくつかの実施形態において、プローブは、米国特許出願１２／０６７５３２および米国特許出願１２／１８１，３９９（これらの全体が参照により援用される）に記載されているか、またはＳｗｅｎｎｅｎｈｕｉｓら、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｅａｔ−ｆｒｅｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０（３）：ｅ２０（２０１２）に記載されている。
「タグ」または「標識」は、本明細書中で使用されるとき、プローブまたはプローブの位置を可視化するか、マークするか、または別途捕捉することを可能にする、プローブと直接または間接的に会合されている任意の物理的な分子のことを指す。
「転座」は、本明細書中で使用されるとき、等しくない量または等しい量で染色体間で染色体材料が交換することを指す。場合によっては、転座は、同じ染色体上で起きる。場合によっては、転座は、異なる染色体間で起きる。転座は、乳がんおよび白血病を含む多くのタイプのがんにおいて高頻度で生じる。転座は、主要な相互転座またはより複雑な二次転座であり得る。多くのがんの起因事象を構成すると考えられている免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座が関わる主要な転座がいくつかある（Ｅｙｃｈeｎｅ，Ａ．，Ｒｏｃｑｕｅｓ，Ｎ．，およびＰｕｏｐｏｎｎｏｔ，Ｃ．，Ａ ｎｅｗ ＭＡＦｉａ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃａｎｃｅｒ．８：６８３−６９３）。
「倍数体」または「倍数性」は、本明細書中で使用されるとき、細胞が、２より多いコピーの目的の遺伝子を含むことを示す。場合によっては、目的の遺伝子は、ＭＡＦである。いくつかの実施形態において、倍数性は、目的の遺伝子の発現の蓄積に関連する。いくつかの実施形態において、倍数性は、ゲノム不安定性に関連する。いくつかの実施形態において、ゲノム不安定性は、染色体転座に至り得る。
「ホールゲノムシーケンシング」は、本明細書中で使用されるとき、生物のゲノム全体が１回で配列決定されるプロセスである。例えば、Ｎｇ．，Ｐ．Ｃ．ａｎｄ Ｋｉｒｋｎｅｓｓ，Ｅ．Ｆ．，Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．２０１０．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．６２８：２１５−２２６を参照のこと。
「エクソームシーケンシング」または「エクソソームシーケンシング」は、本明細書中で使用されるとき、生物のＤＮＡのコード領域全体が配列決定されるプロセスである。エクソームシーケンシングでは、ｍＲＮＡが配列決定される。ゲノムの非翻訳領域は、エクソームシーケンシングに含められない。例えば、Ｃｈｏｉ，Ｍ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｂｙ ｗｈｏｌｅ ｅｘｏｍｅ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．２００９．ＰＮＡＳ．１０６（４５）：１９０９６−１９１０１を参照のこと。
「転移」は、本明細書中で使用されるとき、最初にがんが生じた器官から異なる器官へのがんの伝播として理解されている。転移は、通常、血液またはリンパ系を通じて起きる。がん細胞が広がって、新しい腫瘍を形成するとき、後者は、二次性腫瘍または転移性腫瘍と呼ばれる。二次性腫瘍を形成しているがん細胞は、元の腫瘍のがん細胞に似ている。乳がんが、例えば、肺に広がる（転移する）場合、二次性腫瘍は、悪性の乳がん細胞から形成される。その肺における疾患は、転移性乳がんであって、肺がんではない。本発明の方法の特定の実施形態において、転移は、骨に広がっている（転移している）。
「予測する」は、本明細書中で使用されるとき、がんに罹患している被験体が遠隔器官への転移を起こす可能性の決定のことを指す。本明細書中で使用されるとき、「予後良好」は、被験体が、一定期間内において生存するおよび／または再発もしくは遠隔転移を有しないかもしくは有するリスクが低いと予想される（例えば、予測される）ことを示す。用語「低い」は、相対的な用語であり、本願の文脈において、臨床転帰（再発、遠隔転移など）に関して「低」発現グループのリスクのことを指す。「低」リスクは、不均一ながん患者集団に対する平均リスクより低いリスクと考えられ得る。Ｐａｉｋら（２００４）の研究では、再発の全体的な「低」リスクは、１５パーセントより低いと考えられた。そのリスクはまた、期間に応じて変動し得る。その期間は、がんの最初の診断の後または予後診断が行われた後の、例えば、５年、１０年、１５年またはなおも２０年であり得る。
本明細書中で使用されるとき、「予後不良」は、被験体が、一定期間内において生存しないおよび／または再発もしくは遠隔転移を有するかもしくは有するリスクが高いと予想される、例えば、予測されることを示す。用語「高い」は、相対的な用語であり、本願の文脈において、臨床転帰（再発、遠隔転移など）に関して「高」発現グループのリスクのことを指す。「高」リスクは、不均一ながん患者集団に対する平均リスクより高いリスクと考えられ得る。Ｐａｉｋら（２００４）の研究では、再発の全体的な「高」リスクは、１５パーセントより高いと考えられた。そのリスクはまた、期間に応じて変動し得る。その期間は、がんの最初の診断のまたは予後診断が行われた後の、例えば、５年、１０年、１５年またはなおも２０年であり得る。
「参照値」は、本明細書中で使用されるとき、患者または患者から回収されたサンプルの臨床検査によって得られた値／データに対する参照として使用される検査値のことを指す。参照値または参照レベルは、絶対値；相対値；上限および／もしくは下限を有する値；一連の値；平均値（ａｖｅｒａｇｅ ｖａｌｕｅ）；中央値、平均値（ｍｅａｎ ｖａｌｕｅ）、または特定のコントロール値もしくはベースライン値と比較される値であり得る。参照値は、個別のサンプル値、例えば、試験されている被験体から得られた値などであるが、より早い時点における値に基づき得る。参照値は、多数のサンプル（例えば、暦年齢が一致する群の被験体の集団由来）に基づいてもよいし、試験されるべきサンプルを含むまたは除外したサンプルのプールに基づいてもよい。
本明細書中で使用されるとき、「被験体」または「患者」とは、哺乳動物として分類されるすべての動物のことを指し、それらとしては、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）および家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、霊長類およびヒト、例えば、人間、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、被験体は、任意の年齢または人種のヒトの男性または女性である。
用語「処置」は、本明細書中で使用されるとき、本明細書中に記載されるような臨床状態を終結させるか、予防するか、回復させるか、またはその臨床状態への罹患性を低下させることが意図される任意のタイプの治療のことを指す。好ましい実施形態において、処置という用語は、本明細書中で定義されるような障害または状態の予防的処置（すなわち、臨床状態への罹患性を低下させる治療）に関する。したがって、「処置」、「処置する」およびそれらの等価な用語は、ヒトを含む哺乳動物において、病理学的な状態または障害の任意の処置を包含する、所望の薬理学的効果または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、障害もしくはその徴候を完全にもしくは部分的に予防することに関して予防的であり得、かつ／または障害および／もしくはその障害に起因し得る有害作用に対する部分的もしくは完全な治癒に関して治療的であり得る。すなわち、「処置」は、（１）被験体において障害が生じることもしくは再発することを予防すること、（２）障害を阻害すること、例えば、その進行を停止すること、（３）例えば、失った機能、不足している機能もしくは不完全な機能を再建するかもしくは修復するか、または非効率なプロセスを刺激することによって、宿主が障害もしくはその徴候にもはや罹患していないように、障害もしくはそれに関連する少なくとも徴候を停止することもしくは終結させること（例えば、障害またはその徴候の後退を引き起こすこと）、または（４）障害もしくはそれに関連する徴候を軽減すること、緩和すること、もしくは回復させること（ここで、回復させることとは、少なくとも、パラメータ（例えば、炎症、疼痛または免疫不全）の大きさの減少のことを指すために広い意味において使用される）を含む。
本明細書中で使用されるとき、「サンプル」または「生物学的サンプル」は、被験体から単離された生物学的材料を意味する。生物学的サンプルは、ｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベルの決定に適した任意の生物学的材料を含み得る。サンプルは、任意の好適な生物学的組織または体液（例えば、腫瘍組織、血液、血漿、血清、尿または脳脊髄液（ＣＳＦ）など）から単離され得る。
「腫瘍組織サンプル」は、原発性がん腫瘍を起源とする組織サンプルと理解される。上記サンプルは、従来の方法、例えば、関連する医学的技法の当業者に周知の方法を用いる生検によって、得ることができる。
「骨溶解性骨転移」とは、骨吸収（骨密度の進行性消失）が、腫瘍細胞による破骨細胞活性の刺激に起因する転移の近くにおいて生じる転移のタイプのことを指し、重篤な疼痛、病理学的骨折、高カルシウム血症、脊髄圧迫、および神経圧迫に起因する他の症候群を特徴とする。
第１の態様において、本発明は、がんに罹患している被験体における上記がんの骨転移を予測するためのインビトロでの方法（本明細書中以後、本発明の第１の方法）に関し、その方法は：
ｉ）プローブを使用して、上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを決定する工程、および
ｉｉ）工程ｉ）において得られた発現レベルを参照値と比較する工程
を含み、ここで、上記参照値と比較して上昇した上記遺伝子の発現レベルは、骨転移を起こす上昇したリスクの指標となる。
本発明の方法は、第１の工程に、被験体由来のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを決定する工程を含む。好ましい実施形態において、サンプルは、腫瘍組織サンプルである。
生検サンプルを得るための方法は、腫瘍を大きな片に分割する工程、または顕微解剖、または当該分野で公知の他の細胞分離方法を含む。腫瘍細胞は、さらに、小ゲージ針を用いた吸引による細胞診によって得ることができる。サンプルの保存および取扱いを単純にするために、サンプルは、ホルマリン中で固定されて、パラフィンに浸され得るか、またはまず凍結されて、次いで、急速凍結を可能にする極低温媒体（ｈｉｇｈｌｙ ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｍｅｄｉｕｍ）への浸漬によってＯＣＴ化合物などの組織凍結媒体に浸され得る。
好ましい実施形態において、本発明の第１の方法は、目的の遺伝子の発現レベルだけを単一マーカーとして定量する工程を含み、すなわち、その方法は、いかなる追加のマーカーの発現レベルを決定する工程も含まない。
当業者が理解するように、遺伝子発現レベルは、上記遺伝子の、または上記遺伝子によってコードされるタンパク質のメッセンジャーＲＮＡレベルならびに上記遺伝子を含むゲノム領域のコピー数または転座数を測定することによって、定量され得る。
この目的のために、生物学的サンプルは、組織または細胞の構造を物理的にまたは機械的に壊すように処理されて、細胞内の構成要素が核酸を調製するための水溶液中または有機溶液中に放出され得る。核酸は、当業者に公知の商業的に利用可能な方法によって抽出される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１−３巻）。
したがって、目的の遺伝子の発現レベルは、上記遺伝子の転写に起因するＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡすなわちｍＲＮＡ）またはあるいは上記遺伝子の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から定量され得る。ゆえに、本発明の特定の実施形態において、目的の遺伝子の発現レベルの定量は、ｃ−ＭＡＦ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡもしくは上記ｍＲＮＡのフラグメント、ｃ−ＭＡＦ遺伝子の相補ＤＮＡもしくは上記ｃＤＮＡのフラグメントまたはそれらの混合物の定量を含む。
ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３、ＷＷＯＸ、５ｓｒＲＮＡによってコードされるｍＲＮＡレベルまたはその対応するｃＤＮＡのｍＲＮＡレベルを検出するためおよび定量するために、実質的に任意の従来の方法を本発明の範囲内で使用することができる。非限定的な例証として、上記遺伝子によってコードされるｍＲＮＡレベルは、従来の方法、例えば、ｍＲＮＡ増幅および上記ｍＲＮＡ増幅産物の定量を含む方法（例えば、電気泳動および染色、またはあるいはサザンブロットおよび好適なプローブの使用、ノーザンブロットおよび目的の遺伝子のｍＲＮＡの、またはその対応するｃＤＮＡの特異的プローブの使用、Ｓ１ヌクレアーゼを用いたマッピング、ＲＴ−ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイなど）を用いて、好ましくは、好適なマーカーを使用するリアルタイム定量的ＰＣＲによって、定量され得る。同様に、目的の遺伝子によってコードされる上記ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡレベルもまた、従来の技法を用いることによって定量され得る；この場合、本発明の方法は、対応するｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）によって、対応するｃＤＮＡを合成し、それに続く増幅および上記ｃＤＮＡ増幅産物の定量のための工程を含む。発現レベルを定量するための従来の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１（上掲）に見出すことができる。これらの方法は、当該分野で公知であり、当業者は、各技法に必要な正規化に精通している。例えば、多重ＰＣＲを使用して生成された発現の測定値は、測定された遺伝子の発現をいわゆる「ハウスキーピング」遺伝子（その発現は、すべてのサンプルにわたって一定であるはずであるので、比較するためのベースライン発現を提供する）またはその発現ががんによって調節されると知られている他のコントロール遺伝子と比較することによって正規化されるべきである。
特定の実施形態において、目的の遺伝子の発現レベルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡ／ＲＮＡアレイまたはヌクレオチドハイブリダイゼーション技術によって定量される。
さらに、目的の遺伝子の発現レベルは、上記遺伝子によってコードされるタンパク質、例えば、ｃ−ＭＡＦタンパク質（ｃ−ＭＡＦ）［ＮＣＢＩ，アクセッション番号Ｏ７５４４４］またはｃ−ＭＡＦタンパク質、ＶＡＴ１Ｌタンパク質、ＣＬＥＣ３Ａタンパク質、ＷＷＯＸタンパク質、５ｓｒＲＮＡタンパク質の任意の機能的に等価なバリアントの発現レベルを定量することによっても定量され得る。２つのｃ−ＭＡＦタンパク質アイソフォーム、４０３アミノ酸で構成されているαアイソフォーム（ＮＣＢＩ，ＮＰ＿００５３５１．２）（配列番号４）および３７３アミノ酸で構成されているβアイソフォーム（ＮＣＢＩ，ＮＰ＿００１０２６９７４．１）（配列番号５）が存在する。ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現レベルは、いずれかのｃ−ＭＡＦタンパク質アイソフォームの発現レベルを定量することによって定量され得る。したがって、特定の実施形態において、ｃ−ＭＡＦ遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルの定量は、ｃ−ＭＡＦタンパク質の定量を含む。
本発明の文脈において、「目的の遺伝子、例えば、ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、および５ｓｒＲＮＡの機能的に等価なバリアント」は、（ｉ）アミノ酸残基の１つまたは複数が、保存されたまたは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）によって置換された、目的の遺伝子のバリアント（ここで、そのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸残基であってもよいし、そうでなくてもよい）または（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸の挿入または欠失を含みかつ目的の遺伝子のタンパク質と同じ機能を有する、すなわち、ＤＮＡ結合転写因子として作用するバリアントと理解される。目的の遺伝子のタンパク質のバリアントは、国際特許出願ＷＯ２００５／０４６７３１（その全体が参照により本明細書中に援用される）に示されているような、目的の遺伝子がインビトロにおける細胞増殖を促進する能力に基づく方法、ＷＯ２００８０９８３５１（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されているような、ｃ−ＭＡＦを発現する細胞においてサイクリンＤ２プロモーターまたはｃ−ＭＡＦ応答領域（ＭＡＲＥまたはｃ−ＭＡＦ応答エレメント）を含むプロモーターの支配下のレポーター遺伝子の転写能力をいわゆるインヒビターが阻止する能力に基づく方法、またはＵＳ２００９０４８１１７Ａ（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されているような、ＮＦＡＴｃ２およびｃ−ＭＡＦを発現する細胞においてＰＭＡ／イオノマイシンによる刺激に応答してＩＬ−４プロモーターの支配下のレポーター遺伝子の発現をいわゆるインヒビターが阻止する能力に基づく方法を用いて同定され得る。
本発明に係るバリアントは、好ましくは、いずれかの目的の遺伝子のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列類似性を有する。バリアントと先に定義された特定の目的の遺伝子のタンパク質配列との間の類似性の程度は、当業者に広く公知のアルゴリズムおよびコンピュータプロセスを用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の類似度は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）］を用いて決定される。
目的の遺伝子のタンパク質発現レベルは、被験体由来のサンプル中の上記タンパク質の検出および定量を可能にする任意の従来の方法によって定量され得る。非限定的な例証として、上記タンパク質レベルは、例えば、目的の遺伝子についての結合能を有する抗体（または抗原決定基を含むそのフラグメント）を使用し、続いて、形成された複合体を定量することによって、定量され得る。これらのアッセイにおいて使用される抗体は、標識されていてもよいし、されていなくてもよい。使用され得るマーカーの例証的な例としては、放射性同位体、酵素、フルオロフォア、化学発光試薬、酵素基質または補因子、酵素インヒビター、粒子、色素などが挙げられる。標識されていない抗体（一次抗体）および標識された抗体（二次抗体）を使用する本発明において使用され得る幅広い公知のアッセイがある；これらの技法としては、ウエスタンブロットまたはウエスタントランスファー、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合ＥＩＡ（競合酵素免疫測定法）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学的および免疫組織化学的技法、特異的抗体を含むタンパク質マイクロアレイもしくはバイオチップの使用に基づく技法、またはディップスティックなどの形式でのコロイド沈殿に基づくアッセイが挙げられる。上記目的の遺伝子のタンパク質を検出するためおよび定量するための他の方法としては、アフィニティークロマトグラフィー法、リガンド結合アッセイなどが挙げられる。免疫学的方法が使用されるとき、目的の遺伝子のタンパク質に高親和性で結合すると知られている任意の抗体または試薬が、その量を検出するために使用され得る。それにもかかわらず、抗体、例えば、ポリクローナル血清、ハイブリドーマの上清またはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ヒト化ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ナノボディ、アルファボディ、ステープルド（ｓｔａｐｌｅｄ）ペプチド、シクロペプチドおよび抗体の使用が、好ましい。例えば、本発明の状況において使用され得る市販の抗ｃ−ＭＡＦタンパク質抗体は、販売されている（例えば、抗体ａｂ４２７、ａｂ５５５０２、ａｂ５５５０２、ａｂ７２５８４、ａｂ７６８１７、ａｂ７７０７１（Ａｂｃａｍ ｐｌｃ，３３０ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＣＢ４ ０ＦＬ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ＡｂＤ ＳｅｒｏｔｅｃのＯ７５４４４モノクローナル抗体（マウス抗ヒトＭＡＦアジド不含モノクローナル抗体、非結合体化、クローン６ｂ８（Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＭＡＦ Ａｚｉｄｅ ｆｒｅｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ，Ｃｌｏｎｅ ６ｂ８））など）。抗ｃ−ＭＡＦ抗体を提供している多くの営利会社がある（例えば、Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏｗｏｒｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＧｅｎｅＴｅｘなど）。
特定の実施形態において、目的の遺伝子のタンパク質レベルは、ウエスタンブロット、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡまたはタンパク質アレイによって定量される。
別の特定の実施形態において、目的の遺伝子のタンパク質レベルは、エキソソームまたは循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）ＤＮＡから定量される。エキソソームは、インビボおよびインビトロにおいてほとんどの細胞型によって分泌される４０〜１００ｎｍの膜ベシクルである。エキソソームは、コンパートメントの内腔に内向きに出芽することによって、多胞体（ＭＶＢ）と呼ばれるエンドソームの特定の集団として形成する。ＭＶＢと原形質膜とが融合すると、これらの内部ベシクルが分泌される。エキソソームは、当該分野で周知のいくつかの方法によって多種多様な細胞系または体液から単離され得る（Ｔｈeｒｙ Ｃ．ら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ａｐｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｕｎｉｔ ３．２２）（その全内容が、本明細書中に参照により援用される）。ＥｘｏＱｕｉｃｋＴＭまたはＥｘｏＴｅｓｔＴＭなどのいくつかの市販キットが、エキソソームを単離するために利用可能である。
本発明の第１の方法は、第２の工程に、被験体由来のサンプル（例えば、腫瘍サンプル）において得られた目的の遺伝子の発現レベルを参照値と比較する工程を含む。
いったん、がんを有する被験体由来のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルが、測定されて、参照値と比較されたら、上記遺伝子の発現レベルが、上記参照値と比較して上昇している場合、上記被験体は、骨転移を起こす傾向がより高いと結論づけられ得る。
目的の遺伝子の発現レベルの決定は、参照値と相関するはずである。
ある実施形態において、本明細書中で意図されるような参照値（複数可）は、目的の遺伝子の絶対量を伝達し得る。別の実施形態において、試験されている被験体由来のサンプル中のいずれか１つまたは複数のバイオマーカーの量は、参照値と直接比べて決定され得る（例えば、増加もしくは減少または増加率もしくは減少率に関して）。有益なことに、これにより、いずれの１つまたは複数のバイオマーカーのそれぞれの絶対量を最初に決定する必要なく、被験体由来のサンプル中の該１つまたは複数のバイオマーカーの量を参照値と比較すること（換言すれば、参照値に対する被験体由来のサンプル中のいずれか１つまたは複数のバイオマーカーの相対量を測定すること）が可能になり得る。
好ましい実施形態において、参照値は、コントロールサンプルまたは参照サンプルにおける目的の遺伝子の発現レベルである。解析されるべき腫瘍のタイプに応じて、コントロールサンプルまたは参照サンプルの正確な性質は変動し得る。したがって、予後が評価されるべき事象において、参照サンプルは、転移していないがんを有する被験体由来のサンプル、または転移していないがんを有する被験体由来の生検サンプルの腫瘍組織コレクションにおいて測定された目的の遺伝子の発現レベルの中央値に対応するサンプルである。
上記参照サンプルは、代表的には、被験体集団由来の等量のサンプルを合わせることによって得られる。一般に、代表的な参照サンプルは、臨床的に十分に考証されている被験体および転移が無いことが十分に特徴付けられている被験体から得られる。そのようなサンプルでは、バイオマーカー（目的の遺伝子）の正常濃度（参照濃度）が、例えば、参照集団の平均濃度を提供することによって決定され得る。マーカーの参照濃度を決定する場合に、様々な考慮がなされる。そのような考慮すべき事柄は、患者の年齢、体重、性別、全般的な身体的状態などである。例えば、好ましくは、上記の考慮すべき事柄に従って、例えば、様々な年齢カテゴリーに従って分類された、等量の少なくとも約２人、少なくとも約１０人、少なくとも約１００人から好ましくは、約１０００人を超える被験体の群が、参照群としてみなされる。参照レベルが由来するサンプル集合は、好ましくは、その研究の患者対象と同じタイプのがんに罹患している被験体によって形成される。
特定の実施形態において、目的の遺伝子の発現の「上昇した」または「低下した」発現に対する参照値は、有している疾患が上で述べられた方法のいずれかによって十分に考証された被験体から単離された１つまたはいくつかのサンプルにおいてアッセイを行うことを含む従来の手段によって目的の遺伝子の発現レベルのパーセンタイルを計算することによって決定される。次いで、目的の遺伝子の「低下した」レベルは、好ましくは、目的の遺伝子の発現レベルが正常集団における５０パーセンタイル以下である（例えば、正常集団における６０パーセンタイル以下、正常集団における７０パーセンタイル以下、正常集団における８０パーセンタイル以下、正常集団における９０パーセンタイル以下および正常集団における９５パーセンタイル以下である発現レベルを含む）サンプルに対して割り当てられ得る。次いで、「上昇した」目的の遺伝子の発現レベルは、好ましくは、ｃ−ＭＡＦ遺伝子発現レベルが正常集団における５０パーセンタイル以上である（例えば、正常集団における６０パーセンタイル以上、正常集団における７０パーセンタイル以上、正常集団における８０パーセンタイル以上、正常集団における９０パーセンタイル以上および正常集団における９５パーセンタイル以上である発現レベルを含む）サンプルに対して割り当てられ得る。
当業者は、原発性癌腫瘍が転移する傾向の予測が、同定されるすべての被験体（すなわち、被験体の１００％）に対して正しくある必要はないことを理解する。それにもかかわらず、その用語は、被験体の統計学的に有意な一部（例えば、コホート研究におけるコホート）の同定を可能にすることを必要とする。ある一部が統計学的に有意であるかどうかは、当業者によって、様々な周知の統計評価ツール、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、スチューデントｔ検定、マン・ホイットニー検定などを使用する単純な様式で決定され得る。詳細は、ＤｏｗｄｙおよびＷｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８３に提供されている。好ましい信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。ｐ値は、好ましくは、０．１、０．０５、０．０１、０．００５または０．０００１である。より好ましくは、集団の被験体の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、本発明の方法によって適切に同定され得る。
なおも別の実施形態において、骨への転移は、骨溶解性骨転移である。
なおも別の実施形態において、平均より高い目的の遺伝子の発現レベルは、骨転移の上昇したリスクを示し、上記リスクは、目的の遺伝子の発現のレベルに比例する。したがって、がんに罹患している被験体における骨転移のリスクは、用量依存的である。
目的の遺伝子の発現レベルに基づいて、がんからの骨転移に罹患している患者の臨床転帰を予測するための方法
別の態様において、本発明は、プローブを使用して骨転移性がんに罹患している患者の臨床転帰を予測するためのインビトロでの方法（本明細書中以後、本発明の第２の方法）に関し、その方法は：
ｉ）プローブを使用して、上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量する工程、および
ｉｉ）工程ｉ）において得られた発現レベルを参照値と比較する工程
を含み、ここで、上記参照値と比較して上昇した上記遺伝子の発現レベルは、不良な臨床転帰の指標となる。
本発明の第２の方法は、第１の工程に、がんに罹患している被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量する工程を含む。好ましい実施形態において、サンプルは、腫瘍組織サンプルである。
好ましい実施形態において、本発明の第２の方法は、目的の遺伝子の発現レベルだけを単一マーカーとして定量する工程を含み、すなわち、その方法は、いかなる追加のマーカーの発現レベルを決定する工程も含まない。
第２の工程において、被験体の腫瘍サンプルにおいて得られた目的の遺伝子の発現レベルは、参照値と比較される。好ましい実施形態において、参照値は、コントロールサンプル中の上記遺伝子の発現レベルである。目的の遺伝子の発現レベルの決定は、コントロールサンプルまたは参照サンプルの値と相関するはずである。解析されるべき腫瘍のタイプに応じて、コントロールサンプルの正確な性質は変動し得る。したがって、本発明の第２の方法を含む場合において、参照サンプルは、骨転移に罹患していないがんを有する被験体のサンプルまたは転移に罹患していないがんを有する被験体の生検サンプルの腫瘍組織コレクションにおいて測定された目的の遺伝子の発現レベルの中央値に対応するサンプルである。
いったん、サンプル中の目的の遺伝子の発現レベルが、測定されて、コントロールサンプルと比較されたら、上記遺伝子の発現レベルが、コントロールサンプル中の発現レベルと比較して上昇している場合、それは、不良な臨床転帰の指標となる。
具体的な実施形態において、骨転移は、骨溶解性転移である。
別の具体的な実施形態において、目的の遺伝子の発現レベルの定量は、上記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または上記ｍＲＮＡのフラグメント、上記遺伝子の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または上記ｃＤＮＡのフラグメントを定量する工程を含む。より好ましい実施形態において、発現レベルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡアレイもしくはＲＮＡアレイにより定量される。
別の実施形態において、目的の遺伝子の発現レベルの定量は、上記遺伝子によってコードされるタンパク質またはそのバリアントのレベルを定量する工程を含む。なおもより好ましい実施形態において、タンパク質レベルは、ウエスタンブロット、免疫組織化学検査、ＥＬＩＳＡまたはタンパク質アレイにより決定される。
別の実施形態において、参照サンプルは、転移に罹患していない被験体由来のがんの腫瘍組織サンプルである。
患者の臨床転帰の決定のために広く認められている任意のパラメータが、本発明において使用され得、それらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・本明細書中で使用されるとき、研究中の期間に疾患を再発しなかった完全寛解の被験体の比率のことを記載する、無病進行
・本明細書とともに使用されるとき、被験体が疾患の兆候なしに生存している、その疾患に対する処置後の時間の長さと理解される、無病生存率（ＤＦＳ）
・本発明において使用されるとき、完全奏効または部分奏効がみとめられる処置された被験体の比率のことを記載する、客観的奏効
・本発明において使用されるとき、６ヶ月以上、完全奏効、部分奏効、低奏功（ｍｉｎｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）または安定病態がみとめられる、処置された被験体の比率に関する、腫瘍制御（ｔｕｍｏｕｒ ｃｏｎｔｒｏｌ）
・本明細書中で使用されるとき、処置開始からがんの成長が最初に決定されるまでの時間と定義される、無進行生存期間
・本明細書中で使用されるとき、疾患が処置された後、疾患が悪化し始めるまでの時間に関する、進行までの期間（ＴＴＰ）。用語「進行」は、先に定義されている
・本明細書中で使用されるとき、治療の開始後、最初の６ヶ月で進行しない被験体のパーセンテージに関する、６ヶ月無進行生存率または「ＰＦＳ６」率、および
・本明細書中で使用されるとき、研究に登録された被験体の半数が未だ生存している時間に関する、生存期間中央値。
用語「不良」または「良好」は、本明細書中で使用されるとき、被験体が好ましいまたは好ましくない転帰を示すことを意味する臨床転帰のことを指す。当業者によって理解されるように、そのような確率の評価は、診断される被験体の１００％に対して正しいことが好ましいが、正しくない場合もある。しかしながら、この用語は、被験体の統計学的に有意な一部が、所与の転帰についての素因を有すると同定され得ることを要求する。ある一部が統計学的に有意であるかどうかは、当業者によって、様々な周知の統計評価ツール、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、スチューデントｔ検定、マン・ホイットニー検定などを使用して容易に決定され得る。詳細には、ＤｏｗｄｙおよびＷｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８３に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０５、０．０１、０．００５もしくは０．０００１またはそれ未満である。より好ましくは、集団の被験体の少なくとも約６０パーセント、少なくとも約７０パーセント、少なくとも約８０パーセントまたは少なくとも約９０パーセントが、本発明の方法によって適切に同定され得る。
がんを有する患者において個別化治療を設計するための方法
当該分野において公知であるように、がんに罹患している被験体に施されるべき処置は、後者が悪性腫瘍であるかどうか、すなわち、それが転移を起こす高い確率を有するかどうか、または後者が良性の腫瘍であるかどうかに左右される。第１の仮定では、一般に好まれる処置は、化学療法などの全身性処置であり、第２の仮定では、一般に好まれる処置は、放射線治療などの局所性処置である。
ゆえに、本発明に記載されるように、がん細胞における目的の遺伝子の過剰発現が、骨転移の存在に関係することを考えれば、目的の遺伝子の発現レベルは、上記がんに罹患している被験体に最も適した治療に関して決定するために有用である。
したがって、別の態様において、本発明は、がんに罹患している被験体のために個別化治療を設計するためのインビトロでの方法（本明細書中以後、本発明の第３の方法）に関し、その方法は、
ｉ）上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量する工程、および
ｉｉ）ｉ）において得られた発現レベルを参照値と比較する工程
を含み、ここで、その発現レベルが、上記参照値と比較して上昇している場合、上記被験体は、骨転移の予防および／または処置が意図される治療を受けることができる。その発現レベルが、上記参照値と比較して上昇していない場合、上記被験体は、骨転移の予防および／または処置が意図される治療を受けることができない。
特定の実施形態において、骨転移は、骨溶解性転移である。
本発明の第３の方法は、第１の工程に、がんに罹患している被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量する工程を含む。好ましい実施形態において、サンプルは、腫瘍組織サンプルである。
別の特定の実施形態において、本発明の第３の方法は、目的の遺伝子の発現レベルだけを単一マーカーとして定量する工程を含み、すなわち、その方法は、いかなる追加のマーカーの発現レベルを決定する工程も含まない。
本発明の第３の方法の場合、サンプルは、被験体の原発腫瘍組織サンプルであり得る。
第２の工程において、被験体の腫瘍サンプルにおいて得られた目的の遺伝子の発現レベルは、参照値と比較される。好ましい実施形態において、参照値は、コントロールサンプル中の上記遺伝子の目的の遺伝子の発現レベルである。目的の遺伝子の発現レベルの決定は、コントロールサンプルまたは参照サンプルの値と関係づけられるはずである。解析されるべき腫瘍のタイプに応じて、コントロールサンプルの正確な性質は変動し得る。したがって、好ましくは、参照サンプルは、転移していないがんを有する被験体のサンプル、または転移していないがんを有する被験体の生検サンプルの腫瘍組織コレクションにおいて測定された目的の遺伝子の発現レベルの中央値に対応するサンプルである。
いったん、サンプル中の目的の遺伝子の発現レベルが、測定されて、参照値と比較されたら、上記遺伝子の発現レベルが、参照値と比較して上昇している場合、上記被験体は、転移の予防（被験体がまだ転移を起こしていない場合）および／または処置（被験体がすでに転移を受けている場合）が意図される治療を受けることができると結論づけられ得る。
がんが転移していたとき、化学療法、ホルモン処置、免疫療法またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない全身性処置が使用され得る。さらに、放射線治療および／または手術が使用され得る。処置の選択は、通常、原発がんのタイプ、サイズ、転移の位置、患者の年齢、全般的な健康状態、および以前に使用された処置のタイプに左右される。
全身性処置は、全身に到達する処置であり、例えば：
・化学療法は、がん細胞を破壊する医薬の使用である。それらの医薬は、通常、経口または静脈内の経路によって投与される。時折、化学療法は、放射線処置とともに使用される。がんに対する好適な化学療法処置としては、アントラサイクリン（ドキソルビシン、エピルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル、アルブミンナノ粒子結合型パクリタキセル）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ持続注入、カペシタビン）、ビンカアルカロイド（ビノレルビン、ビンブラスチン）、ゲムシタビン、白金塩（シスプラチン、カルボプラチン）、シクロホスファミド、エトポシド、および上記の１つまたは複数の組み合わせ、例えば、シクロホスファミド／アントラサイクリン ＋／− ５−フルオロウラシルレジメン（例えば、ドキソルビシン／シクロホスファミド（ＡＣ）、エピルビシン／シクロホスファミド、（ＥＣ）シクロホスファミド／エピルビシン／５−フルオロウラシル（ＣＥＦ）、シクロホスファミド／ドキソルビシン／５−フルオロウラシル（ＣＡＦ）、５−フルオロウラシル／エピルビシン／シクロホスファミド（ＦＥＣ））、シクロホスファミド／メトトレキサート（ｍｅｔｏｔｈｒｅｘａｔｅ）／５−フルオロウラシル（ＣＭＦ）、アントラサイクリン／タキサン（例えば、ドキソルビシン／パクリタキセルまたはドキソルビシン／ドセタキセル）、ドセタキセル／カペシタビン、ゲムシタビン／パクリタキセル、タキサン／白金レジメン（例えば、パクリタキセル／カルボプラチンまたはドセタキセル／カルボプラチン）が挙げられるがこれらに限定されない
・免疫療法は、がんと戦う患者の免疫系自体を助ける処置である。患者における転移を処置するために使用される免疫療法にはいくつかのタイプがある。これらとしては、サイトカイン、モノクローナル抗体および抗腫瘍ワクチンが挙げられるがこれらに限定されない。
別の態様において、がんは手術を必要とし得る。一般的な手術には、甲状腺摘出術および肺葉切除術が挙げられる。
別の態様において、放射性ヨウ素１３１が、手術後の残りの甲状腺組織のアブレーションのため、およびがんの処置のために、乳頭がんまたは濾胞がんを有する患者において使用される。髄様がん、未分化がん、および大部分のＨｕｒｔｈｌｅ細胞がんを有する患者はこの治療からの利益はない。
別の実施形態において、がんが切除不能であるとき、がんが切除後に再発するとき、または骨転移からの痛みを軽減するために、外部放射線が使用され得る。
別の態様において、処置は、アルファラディン（ラジウム２２３二塩化物）である。アルファラディンは、がん細胞を殺すために、ラジウム２２３の崩壊から（ｆｒｏｍｒａｄｉｕｍ）のアルファ線を使用する。ラジウム２２３は、天然に、カルシウム模倣物としてのその特性のおかげで骨転移に対して自身を標的化する。アルファ線は、２〜１０個の細胞という非常に短い範囲（ベータまたはガンマ線に基づく現行の放射線治療と比べて）を有するので、周囲の健常な組織（特に骨髄）にもたらす損傷はより少ない。カルシウムとよく似た特性を有するので、ラジウム２２３は、身体内の骨を構築するためにカルシウムが使用されている位置（去勢抵抗性の進行前立腺がんを有する男性の骨格転移に見られるようなより速い異常な骨成長の部位を含む）に引き込まれる。ラジウム２２３は、注射後、異常に骨が成長している部位に血流によって運ばれる。がんが身体内で生じ始めた位置は、原発腫瘍として公知である。これらの細胞のうちのいくつかは、離脱して、血流によって身体の別の部位に運ばれ得る。次いで、それらのがん細胞は、身体のその位置に定着して、新しい腫瘍を形成し得る。これが起きる場合、それは、二次がんまたは転移と呼ばれる。末期の前立腺がんを有するほとんどの患者は、骨にその疾患の最大の負担を被る。ラジウム２２３を用いる目的は、この二次がんを選択的に標的化することである。骨に取り込まれない任意のラジウム２２３は、すみやかに腸へと経路を定められ、排泄される。
別の態様において、処置はバンデタニブである。バンデタニブは、血管内皮増殖因子レセプター（ＶＥＧＦＲ）、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）、およびＲＥＴチロシンキナーゼの小分子阻害剤であり、髄様がん（ＭＴＣ）を有する患者における臨床的な利益を実証してきた。
別の態様において、処置はソラフェニブまたはスニチニブである。ソラフェニブおよびスニチニブは、他の兆候に対して認可され、がんに対する有望を示し、臨床試験を受けることができないいくつかの患者に使用されている。
別の態様において、処置は、ｍＴｏｒインヒビターである。いくつかの態様において、ｍＴｏｒインヒビターは、ｍＴｏｒ／ＰＩ３キナーゼの二重インヒビターである。いくつかの態様において、ｍＴｏｒインヒビターは、転移を予防するためまたは阻害するために使用される。いくつかの態様において、ｍＴｏｒインヒビターは：ＡＢＩ００９（シロリムス）、ラパマイシン（シロリムス）、Ａｂｒａｘａｎｅ（パクリタキセル）、Ａｂｓｏｒｂ（エベロリムス）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス）、Ｇｌｅｅｖｅｃと併用のＡｆｉｎｉｔｏｒ、ＡＳ７０３０２６（ピマセルチブ（ｐｉｍａｓｅｒｔｉｂ））、Ａｘｘｅｓｓ（ウミロリムス（ｕｍｉｒｏｌｉｍｕｓ））、ＡＺＤ２０１４、ＢＥＺ２３５、Ｂｉｏｆｒｅｅｄｏｍ（ウミロリムス）、ＢｉｏＭａｔｒｉｘ（ウミロリムス）、ＢｉｏＭａｔｒｉｘ ｆｌｅｘ（ウミロリムス）、ＣＣ１１５、ＣＣ２２３、Ｃｏｍｂｏ Ｂｉｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ Ｅｌｕｔｉｎｇ Ｓｔｅｎｔ ＯＲＢＵＳＮＥＩＣＨ（シロリムス）、Ｃｕｒａｘｉｎ ＣＢＬＣ１０２（メパクリン）、ＤＥ１０９（シロリムス）、ＤＳ３０７８、Ｅｎｄｅａｖｏｒ ＤＥＳ（ゾタロリムス）、Ｅｎｄｅａｖｏｒ Ｒｅｓｏｌｕｔｅ（ゾタロリムス）、Ｆｅｍａｒａ（レトロゾール）、Ｈｏｃｅｎａ（アントロキノノール（ａｎｔｒｏｑｕｉｎｏｎｏｌ））、ＩＮＫ１２８、Ｉｎｓｐｉｒｏｎ（シロリムス）、ＩＰＩ５０４（レタスピマイシン（ｒｅｔａｓｐｉｍｙｃｉｎ）塩酸塩）、ＫＲＮ９５１（チボザニブ（ｔｉｖｏｚａｎｉｂ））、ＭＥ３４４、ＭＧＡ０３１（テプリズマブ（ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ））、ＭｉＳｔｅｎｔ ＳＥＳ（シロリムス）、ＭＫＣ１、Ｎｏｂｏｒｉ（ウミロリムス）、ＯＳＩ０２７、ＯＶＩ１２３（コルジセピン）、Ｐａｌｏｍｉｄ ５２９、ＰＦ０４６９１５０２、Ｐｒｏｍｕｓ Ｅｌｅｍｅｎｔ（エベロリムス）、ＰＷＴ３３５９７、Ｒａｐａｍｕｎｅ（シロリムス）、Ｒｅｓｏｌｕｔｅ ＤＥＳ（ゾタロリムス）、ＲＧ７４２２、ＳＡＲ２４５４０９、ＳＦ１１２６、ＳＧＮ７５（ボルセツズマブマホドチン（ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ））、Ｓｙｎｅｒｇｙ（エベロリムス）、Ｔａｌｔｏｒｖｉｃ（リダフォロリムス（ｒｉｄａｆｏｒｏｌｉｍｕｓ））、Ｔａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）、Ｔｏｒｉｓｅｌ（テムシロリムス）、Ｘｉｅｎｃｅ Ｐｒｉｍｅ（エベロリムス）、Ｘｉｅｎｃｅ Ｖ（エベロリムス）、Ｚｏｍａｘｘ（ゾタロリムス）、Ｚｏｒｔｒｅｓｓ（エベロリムス）、ゾタロリムス溶出性末梢ステント（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｓｔｅｎｔ）ＭＥＤＴＲＯＮＩＣ（ゾタロリムス）、ＡＰ２３８４１、ＡＰ２４１７０、ＡＲｍＴＯＲ２６、ＢＮ１０７、ＢＮ１０８、Ｃａｎｓｔａｔｉｎ ＧＥＮＺＹＭＥ（カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ））、ＣＵ９０６、ＥＣ０３７１、ＥＣ０５６５、ＫＩ１００４、ＬＯＲ２２０、ＮＶ１２８、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ ＯＮＣＯＩＭＭＵＮＥ（シロリムス）、ＳＢ２６０２、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ ＰＮＰ ＳＡＭＹＡＮＧ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ（シロリムス）、ＴＯＰ２１６、ＶＬＩ２７、ＶＳ５５８４、ＷＹＥ１２５１３２、ＸＬ３８８、Ａｄｖａｃａｎ（エベロリムス）、ＡＺＤ８０５５、Ｃｙｐｈｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｌｕｓ シロリムス溶出性冠動脈ステント（シロリムス）、Ｃｙｐｈｅｒ シロリムス溶出性冠動脈ステント（シロリムス）、薬物コーティングされたバルーン（シロリムス）、Ｅ−Ｍａｇｉｃ Ｐｌｕｓ（シロリムス）、Ｅｍｔｏｒ（シロリムス）、Ｅｓｐｒｉｔ（エベロリムス）、Ｅｖｅｒｔｏｒ（エベロリムス）、ＨＢＦ００７９、ＬＣＰ−Ｓｉｒｏ（シロリムス）、Ｌｉｍｕｓ ＣＬＡＲＩＳ（シロリムス）、ｍＴＯＲインヒビター ＣＥＬＬＺＯＭＥ、Ｎｅｖｏ シロリムス溶出性冠動脈ステント（シロリムス）、ｎＰＴ−ｍＴＯＲ、Ｒａｐａｃａｎ（シロリムス）、Ｒｅｎａｃｅｐｔ（シロリムス）、ＲｅＺｏｌｖｅ（シロリムス）、Ｒｏｃａｓ（シロリムス）、ＳＦ１１２６、Ｓｉｒｏｌｉｍ（シロリムス）、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ ＮＯＲＴＨ ＣＨＩＮＡ（シロリムス）、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ ＲＡＮＢＡＸＹ（シロリムス）、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ ＷＡＴＳＯＮ（シロリムス）Ｓｉｒｏｐａｎ（シロリムス）、Ｓｉｒｏｖａ（シロリムス）、Ｓｕｐｒａｌｉｍｕｓ（シロリムス）、Ｓｕｐｒａｌｉｍｕｓ−Ｃｏｒｅ（シロリムス）、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ ＷＡＴＳＯＮ（タクロリムス）、ＴＡＦＡ９３、Ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ ＡＣＣＯＲＤ（テムシロリムス）、Ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ ＳＡＮＤＯＺ（テムシロリムス）、ＴＯＰ２１６、Ｘｉｅｎｃｅ Ｐｒｉｍｅ（エベロリムス）、Ｘｉｅｎｃｅ Ｖ（エベロリムス）からなる群より選択される。具体的な態様において、ｍＴｏｒインヒビターは、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｉｎｉｔｏｒ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ？ｕｓｅｒｔｒａｃｋ．ｆｉｌｔｅｒ＿ａｐｐｌｉｅｄ＝ｔｒｕｅ＆ＮｏｖａＩｄ＝４０２９４６２０６４３３８２０７９６３；最終アクセス日２０１２年１１月２８日）である。別の態様において、エベロリムスは、アロマターゼインヒビターと組合わされる（例えば、Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．ら、Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ ｉｎ Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６（６）：５２０−５２９（これは本明細書中で参照により援用される）を参照のこと）。別の態様において、ｍＴｏｒインヒビターは、当該分野で公知の方法によって特定され得る（例えば、Ｚｈｏｕ，Ｈ．ら、Ｕｐｄａｔｅｓ ｏｆ ｍＴｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．２０１０．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０（７）：５７１−８１（これは本明細書中で参照により援用される）を参照のこと）。いくつかの態様において、ｍＴｏｒインヒビターは、ホルモンレセプターが陽性である患者において転移を処置するためまたは予防するためまたは阻害するために使用される（例えば、Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．ら、Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ ｉｎ Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６（６）：５２０−５２９を参照のこと）。いくつかの態様において、ｍＴｏｒインヒビターは、進行がんを有する患者において転移を処置するためまたは予防するためまたは阻害するために使用される。いくつかの態様において、ｍＴｏｒインヒビターは、第２の処置と組み合わせて使用される。いくつかの態様において、第２の処置は、本明細書中に記載される任意の処置である。
別の態様において、処置は、Ｓｒｃキナーゼインヒビターである。いくつかの態様において、Ｓｒｃインヒビターは、転移を予防するためまたは阻害するために使用される。いくつかの態様において、Ｓｒｃキナーゼインヒビターは、以下の群：ＡＺＤ０５３０（サラカチニブ（ｓａｒａｃａｔｉｎｉｂ））、Ｂｏｓｕｌｉｆ（ボスチニブ（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ））、ＥＮＭＤ９８１６９３、ＫＤ０２０、ＫＸ０１、Ｓｐｒｙｃｅｌ（ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ））、Ｙｅｒｖｏｙ（イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ））、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３４８５、ＡＰ２３５８８、ＡＺＤ０４２４、ｃ−Ｓｒｃキナーゼインヒビター ＫＩＳＳＥＩ、ＣＵ２０１、ＫＸ２３６１、ＳＫＳ９２７、ＳＲＮ００４、ＳＵＮＫ７０６、ＴＧ１００４３５、ＴＧ１００９４８、ＡＰ２３４５１、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ ＨＥＴＥＲＯ（ダサチニブ）、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ ＶＡＬＥＡＮＴ（ダサチニブ）、Ｆｏｎｔｒａｘ（ダサチニブ）、Ｓｒｃキナーゼインヒビター ＫＩＮＥＸ、ＶＸ６８０（トザセルチブ（ｔｏｚａｓｅｒｔｉｂ）乳酸塩）、ＸＬ２２８およびＳＵＮＫ７０６から選択される。いくつかの実施形態において、Ｓｒｃキナーゼインヒビターは、ダサチニブである。別の態様において、Ｓｒｃキナーゼインヒビターは、当該分野で公知の方法によって特定され得る（例えば、Ｓｅｎ，Ｂ．ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｆ．Ｍ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｒｃ Ｆａｍｉｌｙ Ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ．２０１１．Ｊ．Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．２０１１：１４ ｐａｇｅｓ（これは本明細書中で参照により援用される）を参照のこと）。いくつかの態様において、Ｓｒｃキナーゼインヒビターは、ＳＲＣ応答性シグネチャ（ＳＲＳ）が陽性である患者において転移を処置するためまたは予防するためまたは阻害するために使用される。いくつかの態様において、患者は、ＳＲＳ＋である（例えば、Ｚｈａｎｇ，ＣＨ．−Ｆ，ら、Ｌａｔｅｎｔ Ｂｏｎｅ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｉｅｄ ｔｏ Ｓｒｃ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｉｇｎａｌｓ．２００９．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．１６：６７−７８（これは本明細書中で参照により援用される）を参照のこと）。いくつかの態様において、Ｓｒｃキナーゼインヒビターは、進行がんを有する患者において転移を処置するためまたは予防するためまたは阻害するために使用される。いくつかの態様において、Ｓｒｃキナーゼインヒビターは、第２の処置と組み合わせて使用される。いくつかの態様において、第２の処置は、本明細書中に記載される任意の処置である。
別の態様において、処置は、ＣＯＸ−２インヒビターである。いくつかの態様において、ＣＯＸ−２インヒビターは、転移を予防するためまたは阻害するために使用される。いくつかの態様において、ＣＯＸ−２インヒビターは、以下の群：ＡＢＴ９６３、Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ ＥＲ ＪＯＨＮＳＯＮ（アセトアミノフェン）、Ａｃｕｌａｒ Ｘ（ケトロラクトロメタミン）、ＢＡＹ１０１９０３６（アスピリン）、ＢＡＹ９８７１１１（ジフェンヒドラミン、ナプロキセンナトリウム）、ＢＡＹｌ１９０２（ピロキシカム）、ＢＣＩＢＵＣＨ００１（イブプロフェン）、Ｃａｐｏｘｉｇｅｍ（アプリコキシブ（ａｐｒｉｃｏｘｉｂ））、ＣＳ５０２、ＣＳ６７０（ペルビプロフェン（ｐｅｌｕｂｉｐｒｏｆｅｎ））、Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ ＨＰＢＣＤ（ジクロフェナク）、Ｄｉｒａｃｔｉｎ（ケトプロフェン）、ＧＷ４０６３８１、ＨＣＴ１０２６（ニトロフルルビプロフェン（ｎｉｔｒｏｆｌｕｒｂｉｐｒｏｆｅｎ））、Ｈｙａｎａｌｇｅｓｅ−Ｄ（ジクロフェナク）、ＨｙｄｒｏｃｏＤｅｘ（アセトアミノフェン、デキストロメトルファン、ヒドロコドン）、Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ Ｓｏｄｉｕｍ ＰＦＩＺＥＲ（イブプロフェンナトリウム）、Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ ｗｉｔｈ Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ ＰＦＩＺＥＲ（アセトアミノフェン、イブプロフェン）、Ｉｍｐｒａｃｏｒ（ケトプロフェン）、ＩＰ８８０（ジクロフェナク）、ＩＰ９４０（インドメタシン）、ＩＳＶ２０５（ジクロフェナクナトリウム）、ＪＮＳ０１３（アセトアミノフェン、トラマドール塩酸塩）、Ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ ＴＤＳ（ケトプロフェン）、ＬＴＮＳ００１（ナプロキセンエテメシル（ｎａｐｒｏｘｅｎ ｅｔｅｍｅｓｉｌ））、Ｍｅｓａｌａｍｉｎｅ ＳＡＬＩＸ（メサラミン）、Ｍｅｓａｌａｍｉｎｅ ＳＯＦＡＲ（メサラミン）、Ｍｅｓａｌａｚｉｎｅ（メサラミン）、ＭＬ３０００（リコフェロン（ｌｉｃｏｆｅｌｏｎｅ））、ＭＲＸ７ＥＡＴ（エトドラク）、Ｎａｐｒｏｘｅｎ ＩＲＯＫＯ（ナプロキセン）、ＮＣＸ４０１６（ニトロアスピリン）、ＮＣＸ７０１（ニトロアセトアミノフェン）、Ｎｕｐｒｉｎ ＳＣＯＬＲ（イブプロフェン）、ＯＭＳ１０３ＨＰ（アミトリプチリン塩酸塩、ケトプロフェン、オキシメタゾリン塩酸塩）、Ｏｒａｌｅａｓｅ（ジクロフェナク）、ＯｘｙｃｏＤｅｘ（デキストロメトルファン、オキシコドン）、Ｐ５４、ＰｅｒｃｏＤｅｘ（アセトアミノフェン、デキストロメトルファン、オキシコドン）、ＰＬ３１００（ナプロキセン、ホスファチジルコリン）、ＰＳＤ５０８、Ｒ−Ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ（ケトプロフェン）、Ｒｅｍｕｒａ（ブロムフェナクナトリウム）、ＲＯＸ８２８（ケトロラクトロメタミン）、ＲＰ１９５８３（ケトプロフェンリジン）、ＲＱ００３１７０７６、ＳＤＸ１０１（Ｒ−エトドラク）、ＴＤＳ９４３（ジクロフェナクナトリウム）、ＴＤＴ０７０（ケトプロフェン）、ＴＰＲ１００、ＴＱ１０１１（ケトプロフェン）、ＴＴ０６３（Ｓ−フルルビプロフェン）、ＵＲ８８８０（シミコキシブ（ｃｉｍｉｃｏｘｉｂ））、Ｖ０４９８ＴＡ０１Ａ（イブプロフェン）、ＶＴ１２２（エトドラク、プロプラノロール）、ＸＰ２０Ｂ（アセトアミノフェン、デキストロプロポキシフェン）、ＸＰ２１Ｂ（ジクロフェナクカリウム）、ＸＰ２１Ｌ（ジクロフェナクカリウム）、Ｚｏｅｎａｓａ（アセチルシステイン、メサラミン）、Ａｃｅｐｈｅｎ、Ａｃｔｉｆｅｄ Ｐｌｕｓ、Ａｃｔｉｆｅｄ−Ｐ、Ａｃｕｌａｒ、Ａｃｕｌａｒ ＬＳ、Ａｃｕｌａｒ ＰＦ、Ａｃｕｌａｒ Ｘ、Ａｃｕｖａｉｌ、Ａｄｖｉｌ、Ａｄｖｉｌ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｓｉｎｕｓ、Ａｄｖｉｌ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｓｉｎｕｓ、Ａｄｖｉｌ Ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ Ｒｅｌｉｅｆ、Ａｄｖｉｌ ＰＭ、Ａｄｖｉｌ ＰＭ Ｃａｐｓｕｌｅ、Ａｉｒ Ｓａｌｏｎｐａｓ、Ａｉｒｔａｌ、Ａｌｃｏｈｏｌ−Ｆｒｅｅ ＮｙＱｕｉｌ Ｃｏｌｄ ＆ Ｆｌｕ Ｒｅｌｉｅｆ、Ａｌｅｖｅ、Ａｌｅｖｅ ＡＢＤＩ ＩＢＲＡＨＩＭ、Ａｌｅｖｅ−Ｄ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ ＢＡＹＥＲ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ Ｅｘｔｒａ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ Ｌｅｍｏｎ−Ｌｉｍｅ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ Ｏｒｉｇｉｎａｌ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ Ｐｌｕｓ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ ｐｌｕｓ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｃｏｕｇｈ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ ｐｌｕｓ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｃｏｕｇｈ Ｆｏｒｍｕｌａ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ Ｐｌｕｓ Ｄａｙ ａｎｄ Ｎｉｇｈｔ Ｃｏｌｄ Ｆｏｒｍｕｌａ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ Ｐｌｕｓ Ｄａｙ Ｎｏｎ−Ｄｒｏｗｓｙ Ｃｏｌｄ Ｆｏｒｍｕｌａ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ Ｐｌｕｓ Ｆｌｕ Ｆｏｒｍｕｌａ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ Ｐｌｕｓ Ｎｉｇｈｔ Ｃｏｌｄ Ｆｏｒｍｕｌａ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ Ｐｌｕｓ Ｓｉｎｕｓ Ｆｏｒｍｕｌａ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ Ｐｌｕｓ Ｓｐａｒｋｌｉｎｇ Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｃｏｌｄ Ｆｏｒｍｕｌａ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ ＰＭ、Ａｌｋａ−Ｓｅｌｔｚｅｒ Ｗａｋｅ−Ｕｐ Ｃａｌｌ、Ａｎａｃｉｎ、Ａｎａｐｒｏｘ、Ａｎａｐｒｏｘ ＭＩＮＥＲＶＡ、Ａｎｓａｉｄ、Ａｐｉｔｏｘｉｎ、Ａｐｒａｎａｘ、Ａｐｒａｎａｘ ａｂｄｉ、Ａｒｃｏｘｉａ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｆｏｒｍｕｌａ Ｂｅｎｇａｙ、Ａｒｔｈｒｏｔｅｃ、Ａｓａｃｏｌ、Ａｓａｃｏｌ ＨＤ、Ａｓａｃｏｌ ＭＥＤＵＮＡ ＡＲＺＮＥＩＭＩＴＴＥＬ、Ａｓａｃｏｌ ＯＲＩＦＡＲＭ、Ａｓｐｉｒｉｎ ＢＡＹＥＲ、Ａｓｐｉｒｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ、Ａｓｐｉｒｉｎ Ｍｉｇｒａｎ、ＡＺＤ３５８２、Ａｚｕｌｆｉｄｉｎｅ、Ｂａｒａｌｇａｎ Ｍ、ＢＡＹ１０１９０３６、ＢＡＹ９８７１１１、ＢＡＹｌ１９０２、ＢＣＩＢＵＣＨ００１、Ｂｅｎａｄｒｙｌ Ａｌｌｅｒｇｙ、Ｂｅｎａｄｒｙｌ Ｄａｙ ａｎｄ Ｎｉｇｈｔ、Ｂｅｎｙｌｉｎ ４ Ｆｌｕ、Ｂｅｎｙｌｉｎ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ、Ｂｅｎｙｌｉｎ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ Ｄａｙ ａｎｄ Ｎｉｇｈｔ、Ｂｅｎｙｌｉｎ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｓｉｎｕｓ Ｄａｙ ａｎｄ Ｎｉｇｈｔ、Ｂｅｎｙｌｉｎ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｓｉｎｕｓ Ｐｌｕｓ、Ｂｅｎｙｌｉｎ Ｄａｙ ａｎｄ Ｎｉｇｈｔ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ Ｒｅｌｉｅｆ、Ｂｅｎｙｌｉｎ１ Ａｌｌ−Ｉｎ−Ｏｎｅ、Ｂｒｅｘｉｎ、Ｂｒｅｘｉｎ ＡＮＧＥＬＩＮＩ、Ｂｒｏｍｄａｙ、Ｂｕｆｆｅｒｉｎ、Ｂｕｓｃｏｐａｎ Ｐｌｕｓ、Ｃａｌｄｏｌｏｒ、Ｃａｌｍａｔｅｌ、Ｃａｍｂｉａ、Ｃａｎａｓａ、Ｃａｐｏｘｉｇｅｍ、Ｃａｔａｆｌａｍ、Ｃｅｌｅｂｒｅｘ、Ｃｅｌｅｂｒｅｘ ＯＲＩＦＡＲＭ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ａｄｖｉｌ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｓｉｎｕｓ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｔｙｌｅｎｏｌ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｃｏｕｇｈ ａｎｄ Ｒｕｎｎｙ Ｎｏｓｅ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｔｙｌｅｎｏｌ ｐｌｕｓ ｃｏｌｄ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｔｙｌｅｎｏｌ ｐｌｕｓ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｃｏｕｇｈ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｔｙｌｅｎｏｌ ｐｌｕｓ ｃｏｌｄ ａｎｄ ｓｔｕｆｆｙ ｎｏｓｅ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｔｙｌｅｎｏｌ ｐｌｕｓ Ｆｌｕ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｔｙｌｅｎｏｌ ｐｌｕｓ ｃｏｌｄ ＆ ａｌｌｅｒｇｙ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｔｙｌｅｎｏｌ ｐｌｕｓ Ｃｏｕｇｈ ＆ Ｒｕｎｎｙ Ｎｏｓｅ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｔｙｌｅｎｏｌ ｐｌｕｓ Ｃｏｕｇｈ ＆ Ｓｏｒｅ Ｔｈｒｏａｔ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｔｙｌｅｎｏｌ ｐｌｕｓ ｍｕｌｔｉ ｓｙｍｐｔｏｍ ｃｏｌｄ、Ｃｌｉｎｏｒｉｌ、Ｃｏｄｒａｌ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ、Ｃｏｄｒａｌ Ｄａｙ ａｎｄ Ｎｉｇｈｔ Ｄａｙ Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｃｏｄｒａｌ Ｄａｙ ａｎｄ Ｎｉｇｈｔ Ｎｉｇｈｔ Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｃｏｄｒａｌ Ｎｉｇｈｔｉｍｅ、Ｃｏｌａｚａｌ、Ｃｏｍｂｕｎｏｘ、Ｃｏｎｔａｃ Ｃｏｌｄ ｐｌｕｓ Ｆｌｕ、Ｃｏｎｔａｃ Ｃｏｌｄ ｐｌｕｓ Ｆｌｕ Ｎｏｎ−Ｄｒｏｗｓｙ、Ｃｏｒｉｃｉｄｉｎ Ｄ、Ｃｏｒｉｃｉｄｉｎ ＨＢＰ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ、Ｃｏｒｉｃｉｄｉｎ ＨＢＰ Ｄａｙ ａｎｄ Ｎｉｇｈｔ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｙｍｐｔｏｍ Ｃｏｌｄ、Ｃｏｒｉｃｉｄｉｎ ＨＢＰ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｆｌｕ、Ｃｏｒｉｃｉｄｉｎ ＨＢＰ Ｎｉｇｈｔｔｉｍｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｙｍｐｔｏｍ Ｃｏｌｄ、Ｃｏｒｉｃｉｄｉｎ ＩＩ Ｅｘｔｒａ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ、ＣＳ５０２、ＣＳ６７０、Ｄａｙｐｒｏ、Ｄａｙｐｒｏ Ａｌｔａ、ＤＤＳ０６Ｃ、Ｄｅｍａｚｉｎ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ、Ｄｅｍａｚｉｎ Ｃｏｕｇｈ、Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ、Ｄｅｍａｚｉｎ ｄａｙ／ｎｉｇｈｔ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ、Ｄｅｍａｚｉｎ ＰＥ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ、Ｄｅｍａｚｉｎ ＰＥ ｄａｙ／ｎｉｇｈｔ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ、Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ ＨＰＢＣＤ、Ｄｉｍｅｔａｐｐ Ｄａｙ Ｒｅｌｉｅｆ、Ｄｉｍｅｔａｐｐ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｙｍｐｔｏｍ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ、Ｄｉｍｅｔａｐｐ Ｎｉｇｈｔ Ｒｅｌｉｅｆ、Ｄｉｍｅｔａｐｐ Ｐａｉｎ ａｎｄ Ｆｅｖｅｒ Ｒｅｌｉｅｆ、Ｄｉｍｅｔａｐｐ ＰＥ Ｓｉｎｕｓ Ｐａｉｎ、Ｄｉｍｅｔａｐｐ ＰＥ Ｓｉｎｕｓ Ｐａｉｎ ｐｌｕｓ Ａｌｌｅｒｇｙ、Ｄｉｐｅｎｔｕｍ、Ｄｉｒａｃｔｉｎ、Ｄｉｓｐｒｉｎ Ｃｏｌｄ ’ｎ’ Ｆｅｖｅｒ、Ｄｉｓｐｒｉｎ Ｅｘｔｒａ、Ｄｉｓｐｒｉｎ Ｆｏｒｔｅ．Ｄｉｓｐｒｉｎ Ｐｌｕｓ、Ｄｒｉｓｔａｎ Ｃｏｌｄ、Ｄｒｉｓｔａｎ Ｊｕｎｉｏｒ、Ｄｒｉｘｏｒａｌ Ｐｌｕｓ、Ｄｕｅｘｉｓ、Ｄｙｎａｓｔａｔ、Ｅｆｆｅｒａｌｇａｎ、Ｅｆｆｅｒａｌｇａｎ Ｐｌｕｓ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ、Ｅｆｆｅｒａｌｇａｎ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ、Ｅｌｉｘｓｕｒｅ ＩＢ、Ｅｘｃｅｄｒｉｎ Ｂａｃｋ ａｎｄ Ｂｏｄｙ、Ｅｘｃｅｄｒｉｎ Ｍｉｇｒａｉｎｅ、Ｅｘｃｅｄｒｉｎ ＰＭ、Ｅｘｃｅｄｒｉｎ Ｓｉｎｕｓ Ｈｅａｄａｃｈｅ、Ｅｘｃｅｄｒｉｎ Ｔｅｎｓｉｏｎ Ｈｅａｄａｃｈｅ、Ｆａｌｃｏｌ、Ｆａｎｓａｍａｃ、Ｆｅｌｄｅｎｅ、ＦｅｖｅｒＡｌｌ、Ｆｉｏｒｉｎａｌ、Ｆｉｏｒｉｎａｌ ｗｉｔｈ Ｃｏｄｅｉｎｅ、Ｆｌａｎａｘ、Ｆｌｅｃｔｏｒ Ｐａｔｃｈ、Ｆｌｕｃａｍ、Ｆｏｒｔａｇｅｓｉｃ、Ｇｅｒｂｉｎ、Ｇｉａｚｏ、Ｇｌａｄｉｏ、Ｇｏｏｄｙ’ｓ Ｂａｃｋ ａｎｄ Ｂｏｄｙ Ｐａｉｎ、Ｇｏｏｄｙ’ｓ Ｃｏｏｌ Ｏｒａｎｇｅ、Ｇｏｏｄｙ’ｓ Ｅｘｔｒａ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ、Ｇｏｏｄｙ’ｓ ＰＭ、Ｇｒｅａｓｅｌｅｓｓ Ｂｅｎｇａｙ、ＧＷ４０６３８１、ＨＣＴ１０２６、Ｈｅ Ｘｉｎｇ Ｙｉ、Ｈｙａｎａｌｇｅｓｅ−Ｄ、ＨｙｄｒｏｃｏＤｅｘ、Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ Ｓｏｄｉｕｍ ＰＦＩＺＥＲ、Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ ｗｉｔｈ、Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ ＰＦＩＺＥＲ、Ｉｃｙ Ｈｏｔ ＳＡＮＯＦＩ ＡＶＥＮＴＩＳ、Ｉｍｐｒａｃｏｒ、Ｉｎｄｏｃｉｎ、Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ ＡＰＰ ＰＨＡＲＭＡ、Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ ＭＹＬＡＮ、Ｉｎｆａｎｔｓ’ Ｔｙｌｅｎｏｌ、ＩＰ８８０、ＩＰ９４０、Ｉｒｅｍｏｄ、ＩＳＶ２０５、ＪＮＳ０１３、Ｊｒ．Ｔｙｌｅｎｏｌ、Ｊｕｎｉｆｅｎ、Ｊｕｎｉｏｒ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ａｄｖｉｌ、Ｊｕｎｉｏｒ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｍｏｔｒｉｎ、Ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ ＴＤＳ、Ｌｅｍｓｉｐ Ｍａｘ、Ｌｅｍｓｉｐ Ｍａｘ Ａｌｌ ｉｎ Ｏｎｅ、Ｌｅｍｓｉｐ Ｍａｘ Ａｌｌ Ｎｉｇｈｔ、Ｌｅｍｓｉｐ Ｍａｘ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ、Ｌｉａｌｄａ、Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅ Ｍｏｕｔｈ Ｗａｓｈ、Ｌｌｏｙｄｓ Ｃｒｅａｍ、Ｌｏｄｉｎｅ、Ｌｏｒｆｉｔ Ｐ、Ｌｏｘｏｎｉｎ、ＬＴＮＳ００１、Ｍｅｒｓｙｎｄｏｌ、Ｍｅｓａｌａｍｉｎｅ ＳＡＬＩＸ、Ｍｅｓａｌａｍｉｎｅ ＳＯＦＡＲ、Ｍｅｓａｌａｚｉｎｅ、Ｍｅｓａｓａｌ ＧＬＡＸＯ、Ｍｅｓａｓａｌ ＳＡＮＯＦＩ、Ｍｅｓｕｌｉｄ、
Ｍｅｔｓａｌ Ｈｅａｔ Ｒｕｂ、Ｍｉｄｏｌ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｍｉｄｏｌ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｒｅｌｉｅｆ、Ｍｉｄｏｌ Ｌｉｑｕｉｄ Ｇｅｌｓ、Ｍｉｄｏｌ ＰＭ、Ｍｉｄｏｌ Ｔｅｅｎ Ｆｏｒｍｕｌａ、Ｍｉｇｒａｎｉｎ ＣＯＡＴＥＤ ＴＡＢＬＥＴＳ、ＭＬ３０００、Ｍｏｂｉｃ、Ｍｏｈｒｕｓ、Ｍｏｔｒｉｎ、Ｍｏｔｒｉｎ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｓｉｎｕｓ Ｐａｉｎ、Ｍｏｔｒｉｎ ＰＭ、Ｍｏｖａｌｉｓ ＡＳＰＥＮ、ＭＲＸ７ＥＡＴ、Ｎａｌｆｏｎ、Ｎａｌｆｏｎ ＰＥＤＩＮＯＬ、Ｎａｐｒｅｌａｎ、Ｎａｐｒｏｓｙｎ、Ｎａｐｒｏｓｙｎ ＲＰＧ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｎａｐｒｏｘｅｎ ＩＲＯＫＯ、ＮＣＸ４０１６、ＮＣＸ７０１、ＮｅｏＰｒｏｆｅｎ ＬＵＮＤＢＥＣＫ、Ｎｅｖａｎａｃ、Ｎｅｘｃｅｄｅ、Ｎｉｆｌａｎ、Ｎｏｒｇｅｓｉｃ ＭＥＤＩＣＩＳ、Ｎｏｖａｌｇｉｎ、Ｎｕｐｒｉｎ ＳＣＯＬＲ、Ｎｕｒｏｆｅｎ、Ｎｕｒｏｆｅｎ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ、Ｎｕｒｏｆｅｎ Ｍａｘ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｍｉｇｒａｉｎｅ、Ｎｕｒｏｆｅｎ Ｐｌｕｓ、Ｎｕｒｏｍｏｌ、ＮｙＱｕｉｌ ｗｉｔｈ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ、Ｏｃｕｆｅｎ、ＯＭＳ１０３ＨＰ、Ｏｒａｌｅａｓｅ、Ｏｒｕｄｉｓ ＡＢＢＯＴＴ ＪＡＰＡＮ、Ｏｒｕｖａｉｌ、Ｏｓｔｅｌｕｃ、ＯｘｙｃｏＤｅｘ、Ｐ５４、Ｐａｎａｄｏｌ、Ｐａｎａｄｏｌ Ａｃｔｉｆａｓｔ、Ｐａｒａｄｉｎｅ、Ｐａｒａｍａｘ、Ｐａｒｆｅｎａｃ、Ｐｅｄｅａ、Ｐｅｎｎｓａｉｄ、Ｐｅｎｔａｓａ、Ｐｅｎｔａｓａ ＯＲＩＦＡＲＭ、Ｐｅｏｎ、Ｐｅｒｃｏｄａｎ、Ｐｅｒｃｏｄａｎ−Ｄｅｍｉ、ＰｅｒｃｏＤｅｘ、Ｐｅｒｃｏｇｅｓｉｃ、Ｐｅｒｆａｌｇａｎ、ＰＬ２２００、ＰＬ３１００、Ｐｏｎｓｔｅｌ、Ｐｒｅｘｉｇｅ、Ｐｒｏｌｅｎｓａ、ＰＳＤ５０８、Ｒ−Ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ、Ｒａｎｔｕｄｉｌ、Ｒｅｌａｆｅｎ、Ｒｅｍｕｒａ、Ｒｏｂａｘｉｓａｌ、Ｒｏｔｅｃ、Ｒｏｗａｓａ、ＲＯＸ８２８、ＲＰ１９５８３、ＲＱ００３１７０７６、Ｒｕｂｏｒ、Ｓａｌｏｆａｌｋ、Ｓａｌｏｎｐａｓ、Ｓａｒｉｄｏｎ、ＳＤＸ１０１、Ｓｅｌｔｏｕｃｈ、ｓｆＲｏｗａｓａ、Ｓｈｉｎｂａｒｏ、Ｓｉｎｕｍａｘ、Ｓｉｎｕｔａｂ、Ｓｉｎｕｔａｂ、ｓｉｎｕｓ、Ｓｐａｌｔ、Ｓｐｒｉｘ、Ｓｔｒｅｆｅｎ、Ｓｕｄａｆｅｄ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｃｏｕｇｈ、Ｓｕｄａｆｅｄ Ｈｅａｄ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｓｉｎｕｓ、Ｓｕｄａｆｅｄ ＰＥ Ｃｏｌｄ ｐｌｕｓ Ｃｏｕｇｈ、Ｓｕｄａｆｅｄ ＰＥ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｌｕｓ Ｐａｉｎ、Ｓｕｄａｆｅｄ ＰＥ、Ｓｅｖｅｒｅ Ｃｏｌｄ、Ｓｕｄａｆｅｄ ＰＥ Ｓｉｎｕｓ Ｄａｙ ｐｌｕｓ Ｎｉｇｈｔ Ｒｅｌｉｅｆ Ｄａｙ Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｓｕｄａｆｅｄ ＰＥ Ｓｉｎｕｓ Ｄａｙ ｐｌｕｓ Ｎｉｇｈｔ Ｒｅｌｉｅｆ Ｎｉｇｈｔ Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｓｕｄａｆｅｄ ＰＥ Ｓｉｎｕｓ ｐｌｕｓ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｉｎ Ｒｅｌｉｅｆ、Ｓｕｄａｆｅｄ Ｓｉｎｕｓ Ａｄｖａｎｃｅ、Ｓｕｒｇａｍ、Ｓｙｎａｌｇｏｓ−ＤＣ、Ｓｙｎｆｌｅｘ、Ｔａｖｉｓｔ ａｌｌｅｒｇｙ／ｓｉｎｕｓ／ｈｅａｄａｃｈｅ、ＴＤＳ９４３、ＴＤＴ０７０、Ｔｈｅｒａｆｌｕ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｓｏｒｅ Ｔｈｒｏａｔ、Ｔｈｅｒａｆｌｕ Ｄａｙｔｉｍｅ Ｓｅｖｅｒｅ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｃｏｕｇｈ、Ｔｈｅｒａｆｌｕ Ｄａｙｔｉｍｅ Ｗａｒｍｉｎｇ Ｒｅｌｉｅｆ，Ｔｈｅｒａｆｌｕ Ｗａｒｍｉｎｇ Ｒｅｌｉｅｆ Ｃａｐｌｅｔｓ Ｄａｙｔｉｍｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｙｍｐｔｏｍ Ｃｏｌｄ、Ｔｈｅｒａｆｌｕ Ｗａｒｍｉｎｇ Ｒｅｌｉｅｆ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｃｈｅｓｔ Ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ、Ｔｈｏｍａｐｙｒｉｎ、Ｔｈｏｍａｐｙｒｉｎ Ｃ、Ｔｈｏｍａｐｙｒｉｎ Ｅｆｆｅｒｖｅｓｃｅｎｔ、Ｔｈｏｍａｐｙｒｉｎ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｔｉｌｃｏｔｉｌ、Ｔｉｓｐｏｌ、Ｔｏｌｅｃｔｉｎ、Ｔｏｒａｄｏｌ、ＴＰＲ１００、ＴＱ１０１１、Ｔｒａｕｍａ−Ｓａｌｂｅ、Ｔｒａｕｍａ−Ｓａｌｂｅ Ｋｗｉｚｄａ、Ｔｒｅｏ、Ｔｒｅｘｉｍｅｔ、Ｔｒｏｖｅｘ、ＴＴ０６３、Ｔｙｌｅｎｏｌ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｙｍｐｔｏｍ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｂａｃｋ Ｐａｉｎ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｃｏｌｄ ＆ Ｃｏｕｇｈ Ｄａｙｔｉｍｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｃｏｌｄ ＆ Ｃｏｕｇｈ Ｎｉｇｈｔｔｉｍｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｓｉｎｕｓ Ｄａｙｔｉｍｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｓｉｎｕｓ Ｎｉｇｈｔｔｉｍｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｃｏｌｄ Ｈｅａｄ Ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ Ｓｅｖｅｒｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｃｏｌｄ Ｍｕｌｔｉ Ｓｙｍｐｔｏｍ Ｄａｙｔｉｍｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｃｏｌｄ Ｍｕｌｔｉ Ｓｙｍｐｔｏｍ Ｎｉｇｈｔｔｉｍｅ Ｌｉｑｕｉｄ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｃｏｌｄ Ｍｕｌｔｉ Ｓｙｍｐｔｏｍ Ｓｅｖｅｒｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｃｏｌｄ Ｎｏｎ−Ｄｒｏｗｓｉｎｅｓｓ Ｆｏｒｍｕｌａ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｃｏｌｄ Ｓｅｖｅｒｅ Ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ Ｄａｙｔｉｍｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｏｌｄ，Ｃｏｕｇｈ ａｎｄ Ｆｌｕ Ｎｉｇｈｔ ｔｉｍｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｆｌｕ Ｎｉｇｈｔｔｉｍｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｍｅｎｓｔｒｕａｌ、Ｔｙｌｅｎｏｌ ＰＭ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｓｉｎｕｓ Ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ ＆ Ｐａｉｎ Ｄａｙｔｉｍｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｓｉｎｕｓ Ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ ＆ Ｐａｉｎ Ｎｉｇｈｔｔｉｍｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｓｉｎｕｓ Ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ ＆ Ｐａｉｎ Ｓｅｖｅｒｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｓｉｎｕｓ Ｓｅｖｅｒｅ Ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ Ｄａｙｔｉｍｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ Ｕｌｔｒａ Ｒｅｌｉｅｆ、Ｔｙｌｅｎｏｌ ｗｉｔｈ Ｃａｆｆｅｉｎｅ ａｎｄ Ｃｏｄｅｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｔｙｌｅｎｏｌ ｗｉｔｈ Ｃｏｄｅｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｕｌｔｒａ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｂｅｎｇａｙ Ｃｒｅａｍ、Ｕｌｔｒａｃｅｔ、ＵＲ８８８０、Ｖ０４９８ＴＡ０１Ａ、Ｖｉｃｋｓ ＮｙＱｕｉｌ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ｆｌｕ Ｒｅｌｉｅｆ、Ｖｉｃｏｐｒｏｆｅｎ、Ｖｉｍｏｖｏ、Ｖｏｌｔａｒｅｎ Ｅｍｕｌｇｅｌ、Ｖｏｌｔａｒｅｎ ＧＥＬ、Ｖｏｌｔａｒｅｎ ＮＯＶＡＲＴＩＳ ＣＯＮＳＵＭＥＲ ＨＥＡＬＴＨ ＧＭＢＨ、Ｖｏｌｔａｒｅｎ ＸＲ、ＶＴ１２２、Ｘｅｆｏ、Ｘｅｆｏ Ｒａｐｉｄ、Ｘｅｆｏｃａｍ、Ｘｉｂｒｏｍ、ＸＬ３、Ｘｏｄｏｌ、ＸＰ２０Ｂ、ＸＰ２１Ｂ、ＸＰ２１Ｌ、ＺｉｐｓｏｒおよびＺｏｅｎａｓａから選択される。別の態様において、ＣＯＸ−２インヒビターは、当該分野で公知の方法によって特定され得る（例えば、Ｄａｎｎｈａｒｄｔ，Ｇ．ａｎｄ Ｋｉｅｆｅｒ，Ｗ．Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．２００１．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１０９−１２６（これは本明細書中で参照により援用される）を参照のこと）。いくつかの態様において、ＣＯＸ−２インヒビターは、進行がんを有する患者において転移を処置するためまたは予防するためまたは阻害するために使用される。いくつかの態様において、ＣＯＸ−２インヒビターは、第２の処置と組み合わせて使用される。いくつかの態様において、第２の処置は、本明細書中に記載される任意の処置である。いくつかの態様において、ＣＯＸ−２インヒビターは、デノスマブ、Ｚｏｍｅｔａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｓ．ｚｏｍｅｔａ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ？ｕｓｅｒｔｒａｃｋ．ｆｉｌｔｅｒ＿ａｐｐｌｉｅｄ＝ｔｒｕｅ＆ＮｏｖａＩｄ＝２９３５３７６９３４４６７６３３６３３；最終アクセス日２０１２年１２月２日）、Ｃａｒｂｏｚａｎｔｉｎｉｂまたはカボザンチニブ、ＰＴＨＬＨ（副甲状腺ホルモン様ホルモン）またはＰＴＨｒＰ（副甲状腺ホルモン関連タンパク質）を阻止する抗体またはペプチドおよびＥｖｅｒｏｌｉｍｕｓからなる群より選択される第２の処置と組み合わせて使用される。
別の態様において、骨転移を予防するためまたは阻害するための処置は以下から選択される：
・副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）インヒビターおよび副甲状腺様ホルモン（ＰＴＨＬＨ）インヒビター（阻止抗体を含む）またはそれらの組換え型（ＰＴＨのアミノ酸７〜３４に対応するテリパラチド）。このホルモンは、破骨細胞を刺激してその活性を高めることによって作用する
・ラネル酸ストロンチウムは、代替の経口処置であり、骨芽細胞の増殖を刺激し、破骨細胞の増殖を阻害するので、「二重作用骨剤（ｄｕａｌ ａｃｔｉｏｎ ｂｏｎｅ ａｇｅｎｔｓ）」（ＤＡＢＡ）と呼ばれる薬物の群の一部を形成する
・「エストロゲンレセプター調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」（ＳＥＲＭ）は、機序に関係なくエストロゲンがレセプターに結合するのを干渉するかまたは阻害する化合物のことを指す。エストロゲンレセプター調節因子の例としては、とりわけ、エストロゲンプロゲスターゲン、エストラジオール、ドロロキシフェン、ラロキシフェン、ラソホキシフェン（ｌａｓｏｆｏｘｉｆｅｎｅ）、ＴＳＥ−４２４、タモキシフェン、イドキシフェン（ｉｄｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ３５３３８１、ＬＹ１１７０８１、トレミフェン、フルベストラント（ｆｌｕｖｅｓｔｒａｎｔ）、４−［７−（２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ−４−メチル−２−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル］−フェニル−２，２−ジメチルプロパノエート ４，４’ジヒドロキシベンゾフェノン−２，４−ジニトロフェニル−ヒドラゾンおよびＳＨ６４６が挙げられる
・カルシトニンは、カルシトニンレセプターを介して破骨細胞の活性を直接阻害する。カルシトニンレセプターは、破骨細胞の表面上で同定されている
・ビスホスホネートは、骨粗鬆症および骨転移を伴うがん（後者は、乳がんおよび前立腺がんに関連する高カルシウム血症を伴うかまたは伴わない）などの、骨吸収および再吸収を伴う疾患の予防および処置のために使用される医薬品の群である。本発明の第５の方法によって設計される治療において使用され得るビスホスホネートの例としては、窒素含有ビスホスホネート（例えば、パミドロネート、ネリドロネート（ｎｅｒｉｄｒｏｎａｔｅ）、オルパドロネート（ｏｌｐａｄｒｏｎａｔｅ）、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート、インカドロネート、ゾレドロネート（ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）またはゾレドロン酸など）および窒素非含有ビスホスホネート（例えば、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネートなど）が挙げられるが、これらに限定されない
・「カテプシンＫインヒビター」とは、カテプシンＫシステインプロテアーゼ活性に干渉する化合物のことを指す。カテプシンＫインヒビターの非限定的な例としては、４−アミノ−ピリミジン−２−カルボニトリル誘導体（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＧＭＢＨの名称下の国際特許出願ＷＯ０３／０２０２７８に記載されている）、公報ＷＯ０３／０２０７２１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＧＭＢＨ）および公報ＷＯ０４／０００８４３（ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＢ）に記載されているピロロ−ピリミジン、ならびにＡｘｙｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの公報ＰＣＴ ＷＯ００／５５１２６、Ｍｅｒｃｋ Ｆｒｏｓｓｔ Ｃａｎａｄａ ＆ Ｃｏ．およびＡｘｙｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＷＯ０１／４９２８８に記載されているインヒビターが挙げられる
・本明細書中で使用されるとき「ＤＫＫ−１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１）インヒビター」は、ＤＫＫ−１活性を低下させることができる任意の化合物のことを指す。ＤＫＫ−１は、主に成体の骨において発現され、骨溶解性病変を有するミエローマ患者においてアップレギュレートされる、可溶性Ｗｎｔ経路アンタゴニストである。ＤＫＫ−１を標的化する薬剤は、多発性骨髄腫患者における骨溶解性骨疾患の予防に役割を果たし得る。Ｎｏｖａｒｔｉｓ製のＢＨＱ８８０は、ファースト・イン・クラスの完全にヒトの抗ＤＫＫ−１中和抗体である。前臨床試験は、ＢＨＱ８８０が骨形成を促進し、それによって、腫瘍が誘導する骨溶解性疾患を阻害するという仮説を支持している（Ｅｔｔｅｎｂｅｒｇ Ｓ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ．Ａｐｒｉｌ １２−１６，２００８；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．要旨）
・本明細書中で使用されるとき「ＭＥＴおよびＶＥＧＦＲ２の二重インヒビター」は、ＭＥＴによって駆動される腫瘍エスケープを阻止するように設計された、ＭＥＴ経路およびＶＥＧＦ経路の強力な二重インヒビターである任意の化合物のことを指す。ＭＥＴは、腫瘍細胞および内皮細胞だけでなく、骨芽細胞（骨を形成する細胞）および破骨細胞（骨を除去する細胞）においても発現される。ＨＧＦは、これらの細胞型のすべてにおいてＭＥＴに結合し、ＭＥＴ経路に複数のオートクラインループおよびパラクリンループにおける重要な役割を与える。腫瘍細胞におけるＭＥＴの活性化は、転移性の骨病変の確立において重要であるとみられる。同時に、骨芽細胞および破骨細胞におけるＭＥＴ経路の活性化は、異常な骨の成長（すなわち、芽細胞性の病変）または破壊（すなわち、溶解性の病変）を含む骨転移の病理学的特色をもたらし得る。したがって、ＭＥＴ経路の標的化は、転移性の骨病変の確立および進行を予防する実行可能なストラテジーであり得る。以前はＸＬ１８４（ＣＡＳ８４９２１７−６８−１）として知られていたカボザンチニブ（カボザンチニブ）（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ，Ｉｎｃ）は、ＭＥＴによって駆動される腫瘍エスケープを阻止するように設計された、ＭＥＴ経路およびＶＥＧＦ経路の強力な二重インヒビターである。複数の前臨床試験において、カボザンチニブは、腫瘍細胞を死滅させ、転移を減少させ、血管新生（腫瘍の成長を支えるために必要な新しい血管の形成）を阻害することが示されている。別の好適な二重インヒビターは、Ｅ７０５０（Ｎ−［２−フルオロ−４−（｛２−［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ピペリジン−１−イル］カルボニルアミノピリジン−４−イル｝オキシ）フェニル］−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド（２Ｒ，３Ｒ）−タルトレート）（ＣＡＳ９２８０３７−１３−２）またはフォレチニブ（ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ）（ＧＳＫ１３６３０８９、ＸＬ８８０、ＣＡＳ８４９２１７−６４−７としても知られる）である
・本明細書中で使用されるとき「ＲＡＮＫＬインヒビター」は、ＲＡＮＫ活性を低下させることができる任意の化合物のことを指す。ＲＡＮＫＬは、ストローマ細胞およびＴ−リンパ球細胞の骨芽細胞膜の表面上に見出され、これらのＴ−リンパ球細胞は、それを分泌する能力が証明されている唯一の細胞である。その主要な機能は、骨吸収に関わる細胞である破骨細胞の活性化である。ＲＡＮＫＬインヒビターは、ＲＡＮＫＬがそのレセプター（ＲＡＮＫ）に結合するのを阻止すること、ＲＡＮＫ媒介性シグナル伝達を阻止すること、またはＲＡＮＫＬの転写もしくは翻訳を阻止することによってＲＡＮＫＬの発現を減少させることによって、作用し得る。本発明における使用に適したＲＡＮＫＬアンタゴニストまたはインヒビターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・ＲＡＮＫＬに結合することができ、ＲＡＮＫタンパク質の細胞外ドメインの全体またはフラグメントを含む、好適なＲＡＮＫタンパク質。可溶性ＲＡＮＫは、マウスもしくはヒトＲＡＮＫポリペプチドのシグナルペプチドおよび細胞外ドメインを含み得るか、またはあるいは、シグナルペプチドが除去されたそのタンパク質の成熟型が使用され得る
・オステオプロテゲリンまたはＲＡＮＫＬ結合能を有するそのバリアント
・ＲＡＮＫＬ特異的アンチセンス分子
・ＲＡＮＫＬの転写産物をプロセシングすることができるリボザイム
・特異的な抗ＲＡＮＫＬ抗体。「抗ＲＡＮＫＬ抗体またはＲＡＮＫＬに対し指向する抗体」は、１つまたは複数のＲＡＮＫＬの機能を阻害する、核因子κＢに対する活性化レセプターのリガンド（ＲＡＮＫＬ）に特異的に結合することができるすべての抗体と本明細書中で理解される。それらの抗体は、当業者に公知の任意の方法を用いて調製され得る。したがって、ポリクローナル抗体は、阻害されるべきタンパク質で動物を免疫することによって調製される。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６：４９５）に記載されている方法を用いて調製される。本発明の文脈において好適な抗体としては、可変抗原結合領域および定常領域を含むインタクトな抗体、フラグメント「Ｆａｂ」、「Ｆ（ａｂ’）２」および「Ｆａｂ’」、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディおよび二重特異性抗体が挙げられる
・特異的な抗ＲＡＮＫＬナノボディ。ナノボディは、天然に存在する重鎖抗体の独特の構造的および機能的特性を含む、抗体由来の治療タンパク質である。ナノボディ技術は、ラクダ科動物（ラクダおよびラマ）が軽鎖を欠く完全に機能的な抗体を有するという発見の後に、最初に開発された。ナノボディの一般構造は、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
であり、ここで、ＦＲ１からＦＲ４は、フレームワーク領域１〜４であり、ＣＤＲ１からＣＤＲ３は、相補性決定領域１〜３である。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）および２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。重要なことには、クローニングされ、単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を有する完全に安定なポリペプチドである。独特の構造的および機能的特性を有するこれらの新しく発見されたＶＨＨドメインは、Ａｂｌｙｎｘがナノボディと名付けた新世代の治療用抗体の基礎を形成している。
１つの実施形態において、ＲＡＮＫＬインヒビターは、ＲＡＮＫＬ特異的抗体、ＲＡＮＫＬ特異的ナノボディおよびオステオプロテゲリンからなる群より選択される。具体的な実施形態において、抗ＲＡＮＫＬ抗体は、モノクローナル抗体である。なおもより具体的な実施形態において、抗ＲＡＮＫＬ抗体は、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）（Ｐａｇｅａｕ，Ｓｔｅｖｅｎ Ｃ．（２００９）．ｍＡｂｓ １（３）：２１０−２１５、ＣＡＳ番号６１５２５８−４０−７）（その全内容が本明細書によって参照により援用される）である。デノスマブは、ＲＡＮＫＬに結合して、その活性化を妨げる完全にヒトのモノクローナル抗体である（これは、ＲＡＮＫレセプターには結合しない）。デノスマブの様々な態様が、米国特許第６，７４０，５２２号；同第７，４１１，０５０号；同第７，０９７，８３４号；同第７，３６４，７３６号（これらの各々の全内容が本明細書によってその全体において参照により援用される）によって包含されている。別の実施形態において、ＲＡＮＫＬインヒビターは、デノスマブと同じエピトープに結合する抗体、抗体フラグメントまたは融合構築物。
好ましい実施形態において、抗ＲＡＮＫＬナノボディは、ＷＯ２００８１４２１６４（その内容は参照により本願に援用される）に記載されているようなナノボディのいずれかである。なおもより好ましい実施形態において、抗ＲＡＮＫＬ抗体は、ＡＬＸ−０１４１（Ａｂｌｙｎｘ）である。ＡＬＸ−０１４１は、閉経後の骨粗鬆症、関節リウマチ、がんおよびある特定の医薬に関連する骨減少を阻害するように、および健常な骨代謝のバランスを再建するように、設計された。
好ましい実施形態において、骨分解を予防する薬剤は、ビスホスホネート、ＲＡＮＫＬインヒビター、ＰＴＨおよびＰＴＨＬＨインヒビターまたはＰＲＧアナログ、ラネル酸ストロンチウム、ＤＫＫ−１インヒビター、ＭＥＴおよびＶＥＧＦＲ２の二重インヒビター、エストロゲンレセプター調節因子、カルシトニンならびにカテプシンＫインヒビターからなる群より選択される。より好ましい実施形態において、骨分解を予防する薬剤は、ビスホスホネートである。なおもより好ましい実施形態において、ビスホスホネートは、ゾレドロン酸である。
１つの実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、骨への原発性がん腫瘍の転移を予防するためまたは阻害するために投与される。１つの実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、大分子である。別の実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、小分子である。いくつかの実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、マラビロク（Ｍａｒａｖｉｒｏｃ）（Ｖｅｌａｓｃｏ−Ｖｅｌaｑｕｅｚ，Ｍ．ら、２０１２．ＣＣＲ５ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｂｌｏｃｋｓ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ Ｂａｓａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７２：３８３９−３８５０）である。いくつかの実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、ビクリビロク（Ｖｉｃｒｉｖｉｒｏｃ）（Ｖｅｌａｓｃｏ−Ｖｅｌaｑｕｅｚ，Ｍ．ら、２０１２．ＣＣＲ５ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｂｌｏｃｋｓ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ Ｂａｓａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７２：３８３９−３８５０）である。いくつかの態様において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、アプラビロク（Ａｐｌａｖｉｒｏｃ）（Ｄｅｍａｒｅｓｔ Ｊ．Ｆ．ら、２００５．Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ Ａｐｌａｖｉｒｏｃ：Ａｎ ＨＩＶ Ｅｎｔｒｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＣＲ５．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ ２（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ１３）である。いくつかの態様において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、スピロピペリジンＣＣＲ５アンタゴニスト（Ｒｏｔｓｔｅｉｎ Ｄ．Ｍ．ら、２００９．Ｓｐｉｒｏｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ＣＣＲ５ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ．１９（１８）：５４０１−５４０６）である。いくつかの実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、ＩＮＣＢ００９４７１（Ｋｕｒｉｔｚｋｅｓ，Ｄ．Ｒ．２００９．ＨＩＶ−１ ｅｎｔｒｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＨＩＶ ＡＩＤＳ．４（２）：８２−７）である。
好ましい実施形態において、ＭＥＴおよびＶＥＧＦＲ２の二重インヒビターは、カボザンチニブ、フォレチニブおよびＥ７０５０からなる群より選択される。
好ましい実施形態において、ラジウム２２３塩は、ラジウム２２３ジクロリド（ラジウム２２３ ｄｉｃｌｏｒｉｄｅ）からなる群より選択される。
あるいは、転移を処置するためおよび／もしくは予防するために上で述べられた薬剤のうちの１つを超える薬剤が組み合わされる組合せ処置が行われ得るか、または上記薬剤は、他のサプリメント（例えば、カルシウムまたはビタミンＤ）もしくはホルモン処置と組合わされ得る。
がん患者における早期の骨転移を予測するための方法
別の態様において、本発明は、プローブを使用して、がんに罹患している被験体における骨転移のリスクを決定するためのインビトロでの方法に関し、その方法は、上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを決定する工程を含み、ここで、平均値＋１標準偏差より高い上記遺伝子の発現レベルは、早期の骨転移の上昇したリスクの指標となる。
好ましい実施形態において、骨転移は、非常に早期の骨転移である。
好ましい実施形態において、骨転移は、骨溶解性転移である。
「早期の骨転移」は、本明細書中で使用されるとき、がんの患者における手術後５年より前に現れる骨転移に関する。
「非常に早期の骨転移」は、本明細書中で使用されるとき、がんの患者における手術後３年より前に現れる骨転移に関する。
本発明の第４の方法は、第１の工程に、がんに罹患している被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量する工程を含む。好ましい実施形態において、サンプルは、腫瘍組織サンプルである。
好ましい実施形態において、本発明の第４の方法は、目的の遺伝子の発現レベルだけを単一マーカーとして定量する工程を含み、すなわち、他のマーカーを定量しない。その方法は、いかなる追加のマーカーの発現レベルを決定する工程も含まない。目的の遺伝子の発現レベルは、本発明の第１の方法に対して先に開示されたように定量され得る。
第２の工程において、平均値＋１標準偏差より高い上記遺伝子の発現レベルは、早期の骨転移の上昇したリスクの指標となる。
「平均レベル」は、本明細書中で使用されるとき、一群の等しくない値の全体的な有意性を要約するかまたは表す、発現レベルの単一の値（平均値、最頻値または中央値として）に関する。好ましい実施形態において、平均レベルは、がん腫瘍の代表的なコホートから得られる発現レベルの平均に対応する。その患者コホートは、評価しようとしている個々の患者を代表する年齢によって定義される。
「標準偏差」は、本明細書中で使用されるとき、数値の集合のばらつきの尺度に関する。例えば、目的の遺伝子の正常な平均レベルに対する標準偏差は、がんサンプルに見出される目的の遺伝子のレベルの集合のばらつきである。そのデータから離れて広がるほど、偏差は大きくなる。標準偏差は、度数分布における平均値からの、実測値の平方偏差の平均値の平方根を求めることによって得ることができる。
いったん、がんを有する被験体由来のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルが、測定されて、平均レベルと比較されたら、上記遺伝子の発現レベルが、平均レベルと比較して平均＋１標準偏差より高い場合、上記被験体は、早期の骨転移を起こす傾向がより高いと結論づけられ得る。
骨転移を伴うがん患者において個別化治療を設計するための方法
別の態様において、本発明は、がんを有する被験体のために個別化治療を設計するためのインビトロでの方法（本明細書中以後、本発明の第５の方法）に関し、その方法は、
ｉ）上記被験体の骨転移サンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量する工程、および
ｉｉ）工程（ｉ）において得られた発現レベルを参照値と比較する工程
を含み、ここで、目的の遺伝子の発現レベルが、上記参照値と比較して上昇している場合、上記被験体は、骨分解の予防が意図される治療を受けることができる。
好ましい実施形態において、骨転移は、骨溶解性転移である。
本発明の第５の方法は、第１の工程に、がんに罹患している被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベル（または目的の遺伝子の転座もしくは増幅）を定量する工程を含む。本発明の第５の方法の場合、サンプルは、骨転移からの組織サンプルであり得る。
好ましい実施形態において、本発明の第５の方法は、目的の遺伝子の発現レベルだけを単一マーカーとして定量する工程を含み、すなわち、その方法は、いかなる追加のマーカーの発現レベルを決定する工程も含まない。
第２の工程において、被験体の腫瘍サンプルにおいて得られた目的の遺伝子の発現レベル（または目的の遺伝子の転座もしくは増幅）は、参照値と比較される。好ましい実施形態において、参照値は、コントロールサンプルにおける目的の遺伝子の発現レベルである。解析されるべき腫瘍のタイプに応じて、コントロールサンプルの正確な性質は変動し得る。したがって、本発明の第５の方法を含む場合において、参照サンプルは、転移に罹患していないがんを有する被験体のサンプル、または転移に罹患していないがんを有する被験体の生検サンプルの腫瘍組織コレクションにおいて測定された目的の遺伝子の発現レベルの中央値に対応するサンプルである。
いったん、サンプル中の目的の遺伝子の発現レベルが、測定されて、参照値（例えば、コントロールサンプルの目的の遺伝子の発現レベル）と比較されたら、上記遺伝子の発現レベルが、参照値と比較して上昇している場合、これは、上記被験体が、骨分解の回避または予防が意図される治療を受けることができることを示している。
骨分解の回避および／または予防のために使用される薬剤の例証的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）インヒビターおよび副甲状腺様ホルモン（ＰＴＨＬＨ）インヒビター（阻止抗体を含む）またはそれらの組換え型（ＰＴＨのアミノ酸７〜３４に対応するテリパラチド）。このホルモンは、破骨細胞を刺激してその活性を高めることによって作用する
・ラネル酸ストロンチウムは、代替の経口処置であり、骨芽細胞の増殖を刺激し、破骨細胞の増殖を阻害するので、「二重作用骨剤」（ＤＡＢＡ）と呼ばれる薬物の群の一部を形成する
・「エストロゲンレセプター調節因子」（ＳＥＲＭ）は、機序に関係なくエストロゲンがレセプターに結合するのを干渉するかまたは阻害する化合物のことを指す。エストロゲンレセプター調節因子の例としては、とりわけ、エストロゲンプロゲスターゲン、エストラジオール、ドロロキシフェン、ラロキシフェン、ラソホキシフェン、ＴＳＥ−４２４、タモキシフェン、イドキシフェン、ＬＹ３５３３８１、ＬＹ１１７０８１、トレミフェン、フルベストラント、４−［７−（２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ−４−メチル−２−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル］−フェニル−２，２−ジメチルプロパノエート４，４’ジヒドロキシベンゾフェノン−２，４−ジニトロフェニル−ヒドラゾンおよびＳＨ６４６が挙げられる
・カルシトニンは、カルシトニンレセプターを介して破骨細胞の活性を直接阻害する。カルシトニンレセプターは、破骨細胞の表面上で同定されている
・ビスホスホネートは、骨粗鬆症および骨転移を伴うがん（後者は、乳がんおよび前立腺がんに関連する高カルシウム血症を伴うかまたは伴わない）などの、骨吸収および再吸収を伴う疾患の予防および処置のために使用される医薬品の群である。本発明の第５の方法によって設計される治療において使用され得るビスホスホネートの例としては、窒素含有ビスホスホネート（例えば、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート、インカドロネート、ゾレドロネートまたはゾレドロン酸など）および窒素非含有ビスホスホネート（例えば、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネートなど）が挙げられるが、これらに限定されない
・「カテプシンＫインヒビター」とは、カテプシンＫシステインプロテアーゼ活性に干渉する化合物のことを指す。カテプシンＫインヒビターの非限定的な例としては、４−アミノ−ピリミジン−２−カルボニトリル誘導体（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＧＭＢＨの名称下の国際特許出願ＷＯ０３／０２０２７８に記載されている）、公報ＷＯ０３／０２０７２１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＧＭＢＨ）および公報ＷＯ０４／０００８４３（ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＢ）に記載されているピロロ−ピリミジン、ならびにＡｘｙｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの公報ＰＣＴ ＷＯ００／５５１２６、Ｍｅｒｃｋ Ｆｒｏｓｓｔ Ｃａｎａｄａ ＆ Ｃｏ．およびＡｘｙｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＷＯ０１／４９２８８に記載されているインヒビターが挙げられる
・本明細書中で使用されるとき「ＤＫＫ−１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１）インヒビター」は、ＤＫＫ−１活性を低下させることができる任意の化合物のことを指す。ＤＫＫ−１は、主に成体の骨において発現され、骨溶解性病変を有するミエローマ患者においてアップレギュレートされる、可溶性Ｗｎｔ経路アンタゴニストである。ＤＫＫ−１を標的化する薬剤は、多発性骨髄腫患者における骨溶解性骨疾患の予防に役割を果たし得る。Ｎｏｖａｒｔｉｓ製のＢＨＱ８８０は、ファースト・イン・クラスの完全にヒトの抗ＤＫＫ−１中和抗体である。前臨床試験は、ＢＨＱ８８０が骨形成を促進し、それによって、腫瘍が誘導する骨溶解性疾患を阻害するという仮説を支持している（Ｅｔｔｅｎｂｅｒｇ Ｓ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ．４月 １２−１６，２００８；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．要旨）
・本明細書中で使用されるとき「ＭＥＴおよびＶＥＧＦＲ２の二重インヒビター」は、ＭＥＴによって駆動される腫瘍エスケープを阻止するように設計された、ＭＥＴ経路およびＶＥＧＦ経路の強力な二重インヒビターである任意の化合物のことを指す。ＭＥＴは、腫瘍細胞および内皮細胞だけでなく、骨芽細胞（骨を形成する細胞）および破骨細胞（骨を除去する細胞）においても発現される。ＨＧＦは、これらの細胞型のすべてにおけるＭＥＴに結合し、ＭＥＴ経路に、複数のオートクラインループおよびパラクリンループにおいて重要な役割を与える。腫瘍細胞におけるＭＥＴの活性化は、転移性の骨病変の確立において重要であるとみられる。同時に、骨芽細胞および破骨細胞におけるＭＥＴ経路の活性化は、異常な骨の成長（すなわち、芽細胞性の病変）または破壊（すなわち、溶解性の病変）を含む骨転移の病理学的特色をもたらし得る。したがって、ＭＥＴ経路の標的化は、転移性の骨病変の確立および進行の予防の実行可能なストラテジーであり得る。以前はＸＬ１８４（ＣＡＳ８４９２１７−６８−１）として知られていたカボザンチニブ（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ，Ｉｎｃ）は、ＭＥＴによって駆動される腫瘍エスケープを阻止するように設計された、ＭＥＴ経路およびＶＥＧＦ経路の強力な二重インヒビターである。複数の前臨床試験において、カボザンチニブは、腫瘍細胞を死滅させ、転移を減少させ、血管新生（腫瘍の成長を支えるために必要な新しい血管の形成）を阻害することが示されている。別の好適な二重インヒビターは、Ｅ７０５０（Ｎ−［２−フルオロ−４−（｛２−［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ピペリジン−１−イル］カルボニルアミノピリジン−４−イル｝オキシ）フェニル］−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド（２Ｒ，３Ｒ）−タルトレート）（ＣＡＳ９２８０３７−１３−２）またはフォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９、ＸＬ８８０、ＣＡＳ８４９２１７−６４−７としても知られる）である
・本明細書中で使用されるとき「ＲＡＮＫＬインヒビター」は、ＲＡＮＫ活性を低下させることができる任意の化合物のことを指す。ＲＡＮＫＬは、ストローマ細胞およびＴ−リンパ球細胞の骨芽細胞膜の表面上に見出され、これらのＴ−リンパ球細胞は、それを分泌する能力が証明されている唯一の細胞である。その主要な機能は、骨吸収に関わる細胞である破骨細胞の活性化である。ＲＡＮＫＬインヒビターは、ＲＡＮＫＬがそのレセプター（ＲＡＮＫ）に結合するのを阻止すること、ＲＡＮＫ媒介性シグナル伝達を阻止すること、またはＲＡＮＫＬの転写もしくは翻訳を阻止することによってＲＡＮＫＬの発現を減少させることによって、作用し得る。本発明における使用に適したＲＡＮＫＬアンタゴニストまたはインヒビターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・ＲＡＮＫＬに結合することができ、ＲＡＮＫタンパク質の細胞外ドメインの全体またはフラグメントを含む、好適なＲＡＮＫタンパク質。可溶性ＲＡＮＫは、マウスもしくはヒトＲＡＮＫポリペプチドのシグナルペプチドおよび細胞外ドメインを含み得るか、またはあるいは、シグナルペプチドが除去されたそのタンパク質の成熟型が使用され得る
・オステオプロテゲリンまたはＲＡＮＫＬ結合能を有するそのバリアント
・ＲＡＮＫＬ特異的アンチセンス分子
・ＲＡＮＫＬの転写産物をプロセシングすることができるリボザイム
・特異的な抗ＲＡＮＫＬ抗体。「抗ＲＡＮＫＬ抗体またはＲＡＮＫＬに対し指向する抗体」は、１つまたは複数のＲＡＮＫＬの機能を阻害する、核因子κＢに対する活性化レセプターのリガンド（ＲＡＮＫＬ）に特異的に結合することができるすべての抗体と本明細書中で理解される。それらの抗体は、当業者に公知の任意の方法を用いて調製され得る。したがって、ポリクローナル抗体は、阻害されるべきタンパク質で動物を免疫することによって調製される。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６：４９５）に記載されている方法を用いて調製される。本発明の文脈において好適な抗体としては、可変抗原結合領域および定常領域を含むインタクトな抗体、フラグメント「Ｆａｂ」、「Ｆ（ａｂ’）２」および「Ｆａｂ’」、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディおよび二重特異性抗体が挙げられる
・特異的な抗ＲＡＮＫＬナノボディ。ナノボディは、天然に存在する重鎖抗体の独特の構造的および機能的特性を含む、抗体由来の治療タンパク質である。ナノボディ技術は、ラクダ科動物（ラクダおよびラマ）が軽鎖を欠く完全に機能的な抗体を有するという発見の後に、最初に開発された。ナノボディの一般構造は、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
であり、ここで、ＦＲ１からＦＲ４は、フレームワーク領域１〜４であり、ＣＤＲ１からＣＤＲ３は、相補性決定領域１〜３である。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）および２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。重要なことには、クローニングされ、単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を有する完全に安定なポリペプチドである。独特の構造的および機能的特性を有するこれらの新しく発見されたＶＨＨドメインは、Ａｂｌｙｎｘがナノボディと名付けた新世代の治療用抗体の基礎を形成している。
１つの実施形態において、ＲＡＮＫＬインヒビターは、ＲＡＮＫＬ特異的抗体、ＲＡＮＫＬ特異的ナノボディおよびオステオプロテゲリンからなる群より選択される。具体的な実施形態において、抗ＲＡＮＫＬ抗体は、モノクローナル抗体である。なおもより具体的な実施形態において、抗ＲＡＮＫＬ抗体は、デノスマブ（Ｐａｇｅａｕ，Ｓｔｅｖｅｎ Ｃ．（２００９）．ｍＡｂｓ １（３）：２１０−２１５、ＣＡＳ番号６１５２５８−４０−７）（その全内容が本明細書によって参照により援用される）である。デノスマブは、ＲＡＮＫＬに結合して、その活性化を妨げる完全にヒトのモノクローナル抗体である（これは、ＲＡＮＫレセプターには結合しない）。デノスマブの様々な態様が、米国特許第６，７４０，５２２号；同第７，４１１，０５０号；同第７，０９７，８３４号；同第７，３６４，７３６号（これらの各々の全内容が本明細書によって参照により援用される）によって包含されている。別の実施形態において、ＲＡＮＫＬインヒビターは、デノスマブと同じエピトープに結合する抗体、抗体フラグメントまたは融合構築物。
好ましい実施形態において、抗ＲＡＮＫＬナノボディは、ＷＯ２００８１４２１６４（その内容は参照により本願に援用される）に記載されているようなナノボディのいずれかである。なおもより好ましい実施形態において、抗ＲＡＮＫＬ抗体は、ＡＬＸ−０１４１（Ａｂｌｙｎｘ）である。ＡＬＸ−０１４１は、閉経後の骨粗鬆症、関節リウマチ、がんおよびある特定の薬剤に関連する骨減少を阻害するように、および健常な骨代謝のバランスを再建するように、設計された。
好ましい実施形態において、骨分解を予防する薬剤は、ビスホスホネート、ＲＡＮＫＬインヒビター、ＰＴＨおよびＰＴＨＬＨインヒビターまたはＰＲＧアナログ、ラネル酸ストロンチウム、ＤＫＫ−１インヒビター、ＭＥＴおよびＶＥＧＦＲ２の二重インヒビター、エストロゲンレセプター調節因子、カルシトニンならびにカテプシンＫインヒビターからなる群より選択される。より好ましい実施形態において、骨分解を予防する薬剤は、ビスホスホネートである。なおもより好ましい実施形態において、ビスホスホネートは、ゾレドロン酸である。
１つの実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、骨への原発性がん腫瘍の転移を予防するためまたは阻害するために投与される。１つの実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、大分子である。別の実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、小分子である。いくつかの実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、マラビロク（Ｖｅｌａｓｃｏ−Ｖｅｌaｑｕｅｚ，Ｍ．ら、２０１２．ＣＣＲ５ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｂｌｏｃｋｓ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ Ｂａｓａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７２：３８３９−３８５０）である。いくつかの実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、ビクリビロク（Ｖｅｌａｓｃｏ−Ｖｅｌaｑｕｅｚ，Ｍ．ら、２０１２．ＣＣＲ５ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｂｌｏｃｋｓ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ Ｂａｓａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７２：３８３９−３８５０）である。いくつかの態様において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、アプラビロク（Ｄｅｍａｒｅｓｔ Ｊ．Ｆ．ら、２００５．Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ Ａｐｌａｖｉｒｏｃ：Ａｎ ＨＩＶ Ｅｎｔｒｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＣＲ５．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ ２（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ１３）である。いくつかの態様において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、スピロピペリジンＣＣＲ５アンタゴニスト（Ｒｏｔｓｔｅｉｎ Ｄ．Ｍ．ら、２００９．Ｓｐｉｒｏｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ＣＣＲ５ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ．１９（１８）：５４０１−５４０６）である。いくつかの実施形態において、ＣＣＲ５アンタゴニストは、ＩＮＣＢ００９４７１（Ｋｕｒｉｔｚｋｅｓ，Ｄ．Ｒ．２００９．ＨＩＶ−１ ｅｎｔｒｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＨＩＶ ＡＩＤＳ．４（２）：８２−７）である。
好ましい実施形態において、ＭＥＴおよびＶＥＧＦＲ２の二重インヒビターは、カボザンチニブ、フォレチニブおよびＥ７０５０からなる群より選択される。
好ましい実施形態において、ラジウム２２３塩は、ラジウム２２３ジクロリドからなる群より選択される。
あるいは、転移を処置するためおよび／もしくは予防するために上で述べられた薬剤のうちの１つを超える薬剤が組み合わされる組合せ処置が行われ得るか、または上記薬剤は、他のサプリメント（例えば、カルシウムまたはビタミンＤ）もしくはホルモン処置と組合わされ得る。
目的の遺伝子の増幅の検出に基づく、がんにおける転移の予後診断の方法
別の態様において、本発明は、がんに罹患している被験体における上記がんの骨転移を予測するためのインビトロでの方法（本明細書中以後、本発明の第６の方法）に関し、その方法は、上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子が、参照遺伝子コピー数と比べて増幅されているかを決定する工程を含み、ここで、上記参照遺伝子コピー数についての目的の遺伝子の増幅は、骨転移を起こす上昇したリスクの指標となる。
いくつかの実施形態において、増幅は、１６ｑ２３遺伝子座の領域における増幅である。いくつかの実施形態において、増幅は、およそ１６番染色体の７９，３９２，９５９ｂｐ〜約７９，６６３，８０６ｂｐ（セントロメアからテロメアまで）の染色体領域の任意の部分における増幅である。いくつかの実施形態において、増幅は、およそ１６番染色体の７９，３９２，９５９ｂｐ〜約７９，６６３，８０６ｂｐであるがＤＮＡ反復エレメントを排除したゲノム領域における増幅である。いくつかの実施形態において、増幅は、その領域に特異的なプローブを使用して測定される。
特定の実施形態において、増幅される目的の遺伝子は、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡである。特定の実施形態において、目的の遺伝子の増幅の程度は、上記遺伝子を含む染色体領域の増幅の決定によって決定され得る。好ましくは、その増幅が目的の遺伝子の増幅の存在の指標となる染色体領域は、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡ遺伝子を含む遺伝子座１６ｑ２２−ｑ２４である。遺伝子座１６ｑ２２−ｑ２４は、１６番染色体、上記染色体の長腕およびバンド２２〜バンド２４の範囲に位置する。この領域は、ＮＣＢＩデータベースにおいてコンティグＮＴ＿０１０４９８．１５およびＮＴ＿０１０５４２．１５と対応する。別の好ましい実施形態において、この遺伝子の増幅の程度は、上記遺伝子に特異的なプローブを使用することによって決定され得る。別の好ましい実施形態において、目的の遺伝子の増幅は、１４ｑ３２および１６ｑ２３に対するプローブを含むＶｙｓｉｓ ＬＳＩ ＩＧＨ／ＭＡＦ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ二重融合プローブを使用することによって決定される。
本発明の第６の方法は、第１の工程に、目的の遺伝子が被験体のサンプルにおいて増幅されているかを決定する工程を含む。好ましい実施形態において、サンプルは、腫瘍組織サンプルである。その目的のために、腫瘍サンプル中の目的の遺伝子の増幅は、コントロールサンプルと比較される。特定の実施形態において、増幅される目的の遺伝子は、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡである。
特定の実施形態において、がんを有する被験体において骨転移を起こす傾向の予後診断のための本発明の第６の方法は、上記被験体のサンプル中の遺伝子コピー数を決定する工程および上記コピー数をコントロールサンプルまたは参照サンプルのコピー数と比較する工程を含み、ここで、コピー数が、コントロールサンプルの目的の遺伝子のコピー数と比べて多い場合、その被験体は、骨転移を起こす傾向がより高い。
コントロールサンプルとは、転移に罹患していないがんを有する被験体のサンプル、または転移に罹患していない、それぞれがんを有する被験体の生検サンプルの腫瘍組織コレクションにおいて測定された遺伝子のコピー数の中央値に対応するサンプルのことを指す。上記参照サンプルは、代表的には、被験体集団由来の等量のサンプルを合わせることによって得られる。遺伝子のコピー数が、コントロールサンプル中の上記遺伝子のコピー数と比較して増加している場合、被験体は、転移を起こす傾向がより高い。
好ましい実施形態において、遺伝子のコピー数が、参照サンプルまたはコントロールサンプルが有するコピー数より多いとき、目的の遺伝子は、参照遺伝子コピー数と比較して、増幅されている。１つの例において、遺伝子のゲノムコピー数が、試験サンプルにおいて、コントロールサンプルと比べて少なくとも、２倍増加している（すなわち、６コピー）、３倍増加している（すなわち、８コピー）、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍または５０倍増加している場合、目的の遺伝子は、「増幅されている」と言われる。別の例において、細胞１つあたりのｃ−ＭＡＦ遺伝子のゲノムコピー数が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０などである場合、ｃ−ＭＡＦ遺伝子は、「増幅されている」と言われる。
特定の実施形態において、増幅またはコピー数は、インサイチュハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによって決定される。
目的の遺伝子または染色体領域１６ｑ２２−ｑ２４が増幅されているかを決定するための方法は、当該分野において広く公知である。上記方法としては、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）（例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、色素形成インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）またはシルバーインサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ））、ゲノム比較ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（例えば、リアルタイム定量的ＰＣＲ）が挙げられるがこれらに限定されない。いずれのＩＳＨ法の場合も、増幅またはコピー数は、染色体または核における、蛍光の点、有色の点または銀を有する点の数を数えることによって測定され得る。
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、染色体における特定のＤＮＡ配列の有無を検出するためおよびその特定のＤＮＡ配列の位置を特定するために使用される、細胞遺伝学的技法である。ＦＩＳＨは、染色体のいくつかの部分にだけ結合する蛍光プローブ（このプローブは、それらの部分と高い程度の配列類似性を示す）を使用する。代表的なＦＩＳＨ法では、ＤＮＡプローブは、ニックトランスレーションまたはＰＣＲなどの酵素反応を用いてＤＮＡに組み込まれる、代表的には、フッ素−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ、ビオチン−ｄＵＴＰまたはハプテン−ｄＵＴＰの形態の、蛍光分子またはハプテンで標識される。遺伝物質（染色体）を含むサンプルを、スライドガラスに載せ、ホルムアミド処理によって変性させる。次いで、標識されたプローブを、当業者が決定する好適な条件下で、その遺伝物質を含むサンプルとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、直接（フッ素で標識されたプローブの場合）または間接的に（ハプテンを検出する蛍光標識された抗体を使用して）サンプルを観察する。
ＣＩＳＨの場合、プローブを、ジゴキシゲニン、ビオチンまたはフルオレセインで標識し、好適な条件において、遺伝物質を含むサンプルとハイブリダイズさせる。
ＤＮＡに結合し得る任意のマーキング分子または標識分子が、本発明の第４の方法において使用されるプローブを標識するために使用され得、それにより、核酸分子の検出が可能になる。標識するための標識の例としては、放射性同位体、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光剤、フルオロフォア、ハプテン、酵素およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。標識するための方法および種々の目的のために適した標識を選択するための指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８）に見られ得る。
目的の遺伝子の増幅を直接決定すること、または遺伝子座１６ｑ２２−ｑ２４の増幅を決定することによって、増幅の存在が決定され、コントロールサンプル中の上記遺伝子の増幅と比較されたら、その後、目的の遺伝子における増幅が検出される場合、被験体が骨転移を起こす傾向がより高いという事実の指標となる。特定の実施形態において、増幅され、被験体が骨転移を起こす傾向がより高いという事実の指標となる目的の遺伝子は、ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡである。
目的の遺伝子の増幅の決定は、転移に罹患していないがんを有する被験体のサンプルにおいて計測された目的の遺伝子の増幅のレベルに対応するか、または転移に罹患していないがんを有する被験体の生検サンプルの腫瘍組織コレクションにおいて測定された目的の遺伝子の増幅の中央値に対応する、コントロールサンプルまたは参照サンプルの値と相関させることを必要とする。上記参照サンプルは、代表的には、被験体集団由来の等量のサンプルを合わせることによって得られる。一般に、代表的な参照サンプルは、臨床的に十分に考証されている被験体および転移が無いことが十分に特徴付けられている被験体から得られる。参照レベルが由来するサンプルコレクションは、好ましくは、その研究の患者対象と同じタイプのがんに罹患している被験体で構成されている。いったん、この中央値が確立されたら、患者の腫瘍組織における目的の遺伝子の増幅のレベルは、この中央値と比較され得、ゆえに、増幅が存在する場合、被験体は、転移を起こす傾向がより高い。
好ましい実施形態において、骨転移は、骨溶解性骨転移である。本明細書中で使用されるとき、「骨溶解性骨転移」と言う表現は、腫瘍細胞による破骨細胞活性の刺激に起因して転移の近傍で骨吸収（骨密度の進行性消失）が生じ、重篤な疼痛、病理学的骨折、高カルシウム血症、脊髄圧迫、および神経圧迫に起因する他の症候群を特徴とする、転移のタイプを指す。
目的の遺伝子の転座の検出に基づく、がんにおける転移の予後診断の方法
別の態様において、本発明は、がんに罹患している患者の臨床転帰を予測するためのインビトロでの方法に関し、その方法は、上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子が、転座しているかを決定する工程を含み、ここで、目的の遺伝子の転座は、不良な臨床転帰の指標となる。いくつかの実施形態において、転座される目的の遺伝子は、ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡである。
別の態様において、本発明は、がんに罹患している患者の臨床転帰を予測するためのインビトロでの方法に関し、その方法は、上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子が、転座しているかを決定する工程を含み、ここで、目的の遺伝子の転座は、不良な臨床転帰の指標となる。
いくつかの実施形態において、転座遺伝子は、１６ｑ２３遺伝子座の領域由来である。いくつかの実施形態において、転座遺伝子は、およそ１６番染色体の７９，３９２，９５９ｂｐ〜約７９，６６３，８０６ｂｐ（セントロメアからテロメアまで）の染色体領域の任意の部分由来である。いくつかの実施形態において、転座遺伝子は、およそ１６番染色体の７９，３９２，９５９ｂｐ〜約７９，６６３，８０６ｂｐであるがＤＮＡ反復エレメントを排除したゲノム領域由来である。いくつかの実施形態において、転座は、その領域に特異的なプローブを使用して測定される。
特定の実施形態において、目的の遺伝子の転座は、上記遺伝子を含む染色体領域の転座の決定によって決定され得る。１つの実施形態において、転座は、ｔ（１４，１６）転座である。別の実施形態において、転座している染色体領域は、遺伝子座１６ｑ２２−ｑ２４由来である。遺伝子座１６ｑ２２−ｑ２４は、１６番染色体、上記染色体の長腕およびバンド２２〜バンド２４の範囲に位置する。この領域は、ＮＣＢＩデータベースにおいてコンティグＮＴ＿０１０４９８．１５およびＮＴ＿０１０５４２．１５と対応する。好ましい実施形態において、ｃ−ＭＡＦ遺伝子は、１４番染色体の遺伝子座１４ｑ３２に転座し、転座ｔ（１４，１６）（ｑ３２，ｑ２３）が生じる。この転座は、ＩｇＨ遺伝子座における強力なエンハンサーの隣に目的の遺伝子を配置し、このことは、場合によってはＭＡＦの過剰発現をもたらす（Ｅｙｃｈeｎｅ，Ａ．，Ｒｏｃｑｕｅｓ，Ｎ．，ａｎｄ Ｐｕｏｐｏｎｎｏｔ，Ｃ．，Ａ ｎｅｗ ＭＡＦｉａ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃａｎｃｅｒ．８：６８３−６９３）。いくつかの実施形態において、転座され過剰発現される目的の遺伝子はｃ−ＭＡＦである。
好ましい実施形態において、目的の遺伝子の転座は、上記転座に特異的なプローブを使用することによって決定され得る。いくつかの実施形態において、転座は、二色プローブを使用して測定される。いくつかの実施形態において、転座は、二重融合プローブを使用して測定される。いくつかの実施形態において、転座は、二色の二重融合プローブを使用して測定される。いくつかの実施形態において、転座は、２つの別個のプローブを使用して測定される。
別の好ましい実施形態において、目的の遺伝子の転座は、１４ｑ３２および１６ｑ２３に対するプローブを含むＶｙｓｉｓ ＬＳＩ ＩＧＨ／ＭＡＦ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ二重融合プローブ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｂｏｔｔｍｏｌｅｃｕｌａｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｎａｌｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｒｅａｇｅｎｔ／ｆｉｓｈ／ｖｙｓｉｓ−ｌｓｉ−ｉｇｈ−ｍａｆ−ｄｕａｌ−ｃｏｌｏｒ−ｄｕａｌ−ｆｕｓｉｏｎ−ｐｒｏｂｅ．ｈｔｍｌ；最終アクセス日２０１２年１１月５日）を使用して決定される。別の好ましい実施形態において、目的の遺伝子の転座は、Ｋｒｅａｔｅｃｈ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＭＡＦ／ＩＧＨ ｇｔ（１４；１６）Ｆｕｓｉｏｎプローブ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｒｅａｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｅｐｅａｔ−ｆｒｅｅｔｍ−ｐｏｓｅｉｄｏｎｔｍ−ｆｉｓｈ−ｐｒｏｂｅｓ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／ｍａｆ−ｉｇｈ−ｇｔ１４１６−ｆｕｓｉｏｎ−ｐｒｏｂｅ．ｈｔｍｌ；最終アクセス日２０１２年１１月５日）、Ａｂｎｏｖａ ＭＡＦ ＦＩＳＨプローブ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｎｏｖａ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ＿ｄｅｔａｉｌ．ａｓｐ？Ｃａｔａｌｏｇ＿ｉｄ＝ＦＡ０３７５；最終アクセス日２０１２年１１月５日）、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｔａｌｉａ ＩＧＨ／ＭＡＦ Ｔｗｏ Ｃｏｌｏｒ，Ｔｗｏ Ｆｕｓｉｏｎ転座プローブ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｇｅｎｅｔｉｃｓｉｔａｌｉａ．ｃｏｍ／ｄｎａ−ｆｉｓｈ−ｐｒｏｂｅ／ｉｇｈｍａｆ／；最終アクセス日２０１２年１１月５日）、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏａｒｒａｙ ＩＧＨ／ＭＡＦ−ｔ（１４；１６）（ｑ３２；ｑ２３）ＦＩＳＨプローブ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｅａｔｉｖｅ−ｂｉｏａｒｒａｙ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ａｓｐ？ｃｉｄ＝３５＆ｐａｇｅ＝１０；最終アクセス日２０１２年１１月５日）、Ａｒｕｐ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＦＩＳＨによる多発性骨髄腫パネル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒｕｐｌａｂ．ｃｏｍ／ｆｉｌｅｓ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ−ｂｕｌｌｅｔｉｎｓ／Ｍｕｌｔｉｐｌｅ％２０Ｍｙｅｌｏｍａ％２０％２８ＭＭ％２９％２０ｂｙ％２０ＦＩＳＨ．ｐｄｆ；最終アクセス日２０１２年１１月５日）、Ａｇｉｌｅｎｔの１６ｑ２３または１４ｑ３２に特異的なプローブ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ＰｒｏｄｕｃｔＳｅａｒｃｈ．ａｓｐｘ？ｃｈｒ １６＆ｓｔａｒｔ＝７９４８３７００＆ｅｎｄ＝７９７５４３４０；最終アクセス日２０１２年１１月５日；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ＰｒｏｄｕｃｔＳｅａｒｃｈ．ａｓｐｘ？Ｐａｇｅｉｄ＝３０００＆ＰｒｏｄｕｃｔＩＤ＝６３７；最終アクセス日２０１２年１１月５日）、Ｄａｋｏの１６ｑ２３または１４ｑ３２に特異的なプローブ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄａｋｏ．ｃｏｍ／ｕｓ／ａｒ４２／ｐｓｇ４２８０６０００／ｂａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｓ＿ｓｕｒｅｆｉｓｈ．ｈｔｍ？ｓｅｔＣｏｕｎｔｒｙ＝ｔｒｕｅ＆ｐｕｒｌ＝ａｒ４２／ｐｓｇ４２８０６０００／ｂａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｓ＿ｓｕｒｅｆｉｓｈ．ｈｔｍ？ｕｎｄｅｆｉｎｅｄ＆ｓｕｂｍｉｔ＝Ａｃｃｅｐｔ％２０ｃｏｕｎｔｒｙ；最終アクセス日２０１２年１１月５日）、Ｃｙｔｏｃｅｌｌ ＩＧＨ／ＭＡＦ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ，Ｄｕａｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｅｎｔｅｃｈ．ｂｅ／ｕｐｌｏａｄｓ／ｄｏｃｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ＿ｉｎｆｏ／ｐｒｅｎａｔａｌｏｇｙ／ｃｙｔｏｃｅｌｌ％２０２０１２−２０１３％２０ｃａｔａｌｏｇｕｅ％５Ｂ３％５Ｄ．ｐｄｆ；最終アクセス日２０１２年１１月５日）、Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ ＸＬ ＩＧＨ／ＭＡＦ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ−Ｄｕａｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ−ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｏｐｔｉｏｎ＝ｃｏｍ＿ｊｏｏｄｂ＆ｖｉｅｗ＝ａｒｔｉｃｌｅ＆ｊｏｏｂａｓｅ＝５＆ｉｄ＝１２％３Ａｄ−５０２９−１００−ｏｇ＆Ｉｔｅｍｉｄ＝２７２；最終アクセス日２０１２年１１月５日）、Ｚｅｉｓｓ ＦＩＳＨ Ｐｒｏｂｅｓ ＸＬ，１００μｌ，ＩＧＨ／ＭＡＦＢ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏ−ｓｈｏｐ．ｚｅｉｓｓ．ｃｏｍ／？ｓ＝４４０６７５６７５ｄｅｄｃ６＆ｌ＝ｅｎ＆ｐ＝ｕｋ＆ｆ＝ｒ＆ｉ＝５０００＆ｏ＝＆ｈ＝２５＆ｎ＝１＆ｓｄ＝００００００−０５２８−２３１−ｕｋ；最終アクセス日２０１２年１１月５日）またはＧｅｎｙｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＩＧＨ／ＭＡＦ Ｄｕａｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｕｒｌ？ｓａ＝ｔ＆ｒｃｔ＝ｊ＆ｑ＝＆ｅｓｒｃ＝ｓ＆ｓｏｕｒｃｅ＝ｗｅｂ＆ｃｄ＝１＆ｖｅｄ＝０ＣＣＱＱＦｊＡＡ＆ｕｒｌ＝ｈｔｔｐ％３Ａ％２Ｆ％２Ｆｗｗｗ．ｇｅｎｙｃｅｌｌ．ｅｓ％２Ｆｉｍａｇｅｓ％２Ｆｐｒｏｄｕｃｔｏｓ％２Ｆｂｒｏｃｈｕｒｅｓ％２Ｆｌｐｈｍｉｅ６＿８６．ｐｐｔ＆ｅｉ＝ＭｈＧＹＵＯｉ３ＧＫＷＨ０ＱＧｌｔ４ＤｏＤｗ＆ｕｓｇ＝ＡＦＱｊＣＮＥｑＱＭｂＴ８ｖＱＧｊＪｂｉ９ｒｉＥｆ３ｌＶｇｏＦＴＦＱ＆ｓｉｇ２＝Ｖ５ＩＳ８ｊｕＥＭＶＨＢ１８Ｍｖ２Ｘｘ＿Ｗｗ；最終アクセス日２０１２年１１月５日）を使用して決定される。
いくつかの実施形態において、プローブ上の標識は、フルオロフォアである。いくつかの実施形態において、プローブ上のフルオロフォアは、橙色である。いくつかの実施形態において、プローブ上のフルオロフォアは、緑色である。いくつかの実施形態において、プローブ上のフルオロフォアは、赤色である。場合によっては、プローブ上のフルオロフォアは、黄色である。いくつかの実施形態において、１つのプローブは、赤色フルオロフォアで標識され、１つは、緑色フルオロフォアで標識される。いくつかの実施形態において、１つのプローブは、緑色フルオロフォアで標識され、１つは、橙色フルオロフォアで標識される。場合によっては、プローブ上のフルオロフォアは、黄色である。例えば、ＭＡＦ特異的プローブが、赤色フルオロフォアで標識され、ＩＧＨ特異的プローブが、緑色フルオロフォアで標識され、白色が見られる場合、それは、それらのシグナルが重なっており、転座が起きていることを示す。
いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅである。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎである。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＤＡＰＩである。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ４０５である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ４１５である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ４９５である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ５０５である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ５５０である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ５４７である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ５７０である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ５９０である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ６４７である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ４９５／５５０である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ４１５／４９５／５５０である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＤＡＰＩ／ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ４９５／５５０である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＦＩＴＣである。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄである。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＤＥＡＣである。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、Ｒ６Ｇである。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、Ｃｙ５である。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄおよびＤＡＰＩである。いくつかの実施形態において、ＤＡＰＩ対比染色は、転座、増幅またはコピー数の変化を可視化するために使用される。
本発明の１つの実施形態は、第１の工程において目的の遺伝子が被験体のサンプル中で転座しているかを決定する方法を含む。好ましい実施形態において、サンプルは、腫瘍組織サンプルである。
特定の実施形態において、がんを有する被験体において骨転移を起こす傾向の予後診断のための本発明の方法は、目的の遺伝子が転座している上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子のコピー数を決定する工程および上記コピー数をコントロールサンプルまたは参照サンプルのコピー数と比較する工程を含み、ここで、目的の遺伝子のコピー数が、コントロールサンプルの目的の遺伝子のコピー数と比較して多い場合、その被験体は、骨転移を起こす傾向がより高い。
目的の遺伝子または染色体領域１６ｑ２２−ｑ２４が転座しているかを決定するための方法は、当該分野において広く公知であり、ｃ−ＭＡＦの増幅および転座について先に記載された方法を含む。上記方法としては、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）（例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、色素形成インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）またはシルバーインサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ））、ゲノム比較ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（例えば、リアルタイム定量的ＰＣＲ）が挙げられるがこれらに限定されない。いずれのＩＳＨ方法の場合も、増幅、コピー数または転座は、染色体または核における、蛍光の点、有色の点または銀を有する点の数を数えることによって決定され得る。他の実施形態において、コピー数の変化および転座の検出は、ホールゲノムシーケンシング、エクソームシーケンシングの使用、または任意のＰＣＲに由来する技術の使用によって検出され得る。例えば、ＰＣＲは、転座を検出するためにゲノムＤＮＡのサンプルにおいて行われ得る。１つの実施形態において、定量的ＰＣＲが使用される。１つの実施形態において、ＰＣＲは、ｃ−ＭＡＦ遺伝子に特異的なプライマーおよびＩＧＨプロモーター領域に特異的なプライマーを用いて行われる；生成物が生成される場合、転座が生じている。
いくつかの実施形態において、目的の遺伝子の増幅およびコピー数は、目的の遺伝子の転座が決定された後に、決定される。いくつかの実施形態において、プローブを使用して、細胞が目的の遺伝子について倍数体であるかが決定される。いくつかの実施形態において、倍数性の決定は、目的の遺伝子からの２種より多いシグナルが存在するかを決定することによって行われる。いくつかの実施形態において、倍数性は、目的の遺伝子に特異的なプローブからのシグナルを測定し、それをセントロメアプローブまたは他のプローブと比較することによって決定される。
目的の遺伝子の増幅の検出に基づく、がんにおける臨床転帰の予後診断の方法
別の態様において、本発明は、がんに罹患している患者の臨床転帰を予測するためのインビトロでの方法（本明細書中以後、本発明の第７の方法）に関し、その方法は、上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子が、参照遺伝子コピー数と比べて増幅されているかを決定する工程を含み、ここで、上記参照遺伝子コピー数についての目的の遺伝子の増幅は、不良な臨床転帰の指標となる。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡである。
本発明の第７の方法は、第１の工程に、目的の遺伝子が被験体のサンプルにおいて増幅されているかを決定する工程を含む。目的の遺伝子の増幅の決定は、本質的に本発明の第５の方法に記載されているように行われる。好ましい実施形態において、サンプルは、腫瘍組織サンプルである。好ましい実施形態において、目的の遺伝子の増幅は、遺伝子座１６ｑ２２−ｑ２４の増幅を決定することによって決定される。別の好ましい実施形態において、目的の遺伝子の増幅は、目的の遺伝子に特異的なプローブを使用することによって決定される。
いくつかの実施形態において、増幅は、１６ｑ２３遺伝子座の領域における増幅である。いくつかの実施形態において、増幅は、およそ１６番染色体の７９，３９２，９５９ｂｐ〜約７９，６６３，８０６ｂｐ（セントロメアからテロメアまで）の染色体領域の任意の部分における増幅である。いくつかの実施形態において、増幅は、およそ１６番染色体の７９，３９２，９５９ｂｐ〜約７９，６６３，８０６ｂｐであるがＤＮＡ反復エレメントを排除したゲノム領域における増幅である。いくつかの実施形態において、増幅は、その領域に特異的なプローブを使用して測定される。
第２の工程において、本発明の第７の方法は、上記コピー数をコントロールサンプルまたは参照サンプルのコピー数と比較する工程を含み、ここで、目的の遺伝子のコピー数が、コントロールサンプルの目的の遺伝子のコピー数と比べて多い場合、これは、不良な臨床転帰の指標となる。
好ましい実施形態において、目的の遺伝子のコピー数が、参照サンプルまたはコントロールサンプルが有するコピー数より多いとき、目的の遺伝子は、参照遺伝子コピー数と比較して、増幅されている。１つの例において、目的の遺伝子のゲノムコピー数が、試験サンプルにおいて、コントロールサンプルと比べて少なくとも、２倍増加（すなわち、６コピー）、３倍増加（すなわち、８コピー）、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍または５０倍増加している場合、目的の遺伝子は、「増幅されている」と言われる。別の例において、細胞１つあたりのｃ−ＭＡＦ遺伝子のゲノムコピー数が、少なくとも、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０などである場合、ｃ−ＭＡＦ遺伝子は、「増幅されている」と言われる。
別の実施形態において、参照遺伝子コピー数は、骨転移に罹患していない被験体由来のがんのサンプル中の遺伝子コピー数である。
別の実施形態において、増幅は、インサイチュハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによって決定される。
ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡ阻害剤を使用して、がんからの骨転移を処置するための方法
別の態様において、本発明は、診断剤としてのｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡに特異的なプローブの使用後の骨転移がんの処置または予防において使用するためのｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡ阻害剤（本明細書中以後、本発明の阻害剤）の使用に関する。
別の態様において、本発明は、がんからの骨転移の処置または予防のための医薬を製造するための、ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡ阻害剤の使用に関する。
別の態様において、本発明は、がんからの骨転移の処置または予防を必要とする被験体へのｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡ阻害剤の投与を含む、上記被験体におけるそのような処置または予防のための方法に関する。
別の態様において、本発明は、がんに罹患している被験体における骨転移のリスクを予防するためまたは減少させるための方法に関し、上記方法は、骨転移を予防するかまたは減少させる薬剤を上記被験体に投与する工程を含み、ここで、上記薬剤は、上記被験体におけるｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡの発現レベルの定量から決定された処置レジメンに従って投与される。
非限定的な例証として、本発明における使用に適したｃ−ＭＡＦ阻害剤としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、触媒ＲＮＡ、特異的なリボザイム、阻害性抗体もしくはナノボディ、ドミナントネガティブｃ−ＭＡＦバリアント、または表１もしくは表２の化合物が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明のさらなる態様は、発現を阻害する、例えば、活性が阻害されるべきであるｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡをコードする核酸の転写および／または翻訳を阻害するための、単離された「アンチセンス」核酸の使用に関する。アンチセンス核酸は、従来の塩基相補性によって、または、例えば、二重らせんの主溝（ｌａｒｇｅ ｇｒｏｏｖｅ）における特異的な相互作用を介して二本鎖ＤＮＡに結合する場合、薬物の潜在的な標的に結合し得る。通常、これらの方法は、当該分野において通常使用される一連の技法のことを指し、それらには、オリゴヌクレオチド配列への特異的結合に基づく任意の方法が含まれる。
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、細胞において転写されるときに、ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡをコードする細胞ｍＲＮＡの少なくとも１つの独特の部分に相補的なＲＮＡを生成する発現プラスミドとして、分配され得る。あるいは、アンチセンス構築物は、細胞に導入されたら、標的核酸のｍＲＮＡおよび／または遺伝子配列とハイブリダイズして遺伝子発現の阻害をもたらす、エキソビボにおいて生成されたオリゴヌクレオチドプローブである。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに抵抗性であるがゆえにインビボにおいて安定である、改変されたオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしてそれらを使用するための核酸分子の例は、ホスホルアミデート、ホスホチオネートおよびメチルホスホネートのＤＮＡアナログである（米国特許第５，１７６，９９６号；同第５，２６４，５６４号；および同第５，２５６，７７５号も参照のこと）（これらの各々は、その全体が参照により本明細書中に援用される）。さらに、アンチセンス治療において有用なオリゴマーを構築するための一般的なアプロキシメーション（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎｓ）は、例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６，１９８８；およびＳｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２６５９−２６６８，１９８８に概説されている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して、標的遺伝子の翻訳開始部位由来のオリゴデオキシリボヌクレオチド領域、例えば、−１０〜＋１０が、好ましい。アンチセンスアプロキシメーションは、標的ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドの設計（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、転写されたｍＲＮＡに結合して、翻訳が妨げられる。
ｍＲＮＡの５’末端、例えば、開始コドンＡＵＧを含むそこまでの非翻訳５’配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害するために最も効率的な様式で機能するに違いない。それにもかかわらず、ｍＲＮＡの非翻訳３’配列に相補的な配列もまた、ｍＲＮＡ翻訳を阻害するために効率的であることが最近示された（Ｗａｇｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３，１９９４）。ゆえに、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプロキシメーションでは、遺伝子の非コード領域である非翻訳５’または３’領域において相補的なオリゴヌクレオチドが、使用され得る。ｍＲＮＡの非翻訳５’領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、開始コドンＡＵＧの相補体を含まなければならない。ｍＲＮＡのコード領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、それほど効率的な翻訳インヒビターでないが、それらも、本発明に従って使用され得る。それらが、ｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域とハイブリダイズするように設計される場合、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長を有しなければならず、好ましくは、およそ１００未満、より好ましくは、およそ５０、２５、１７または１０未満のヌクレオチド長を有しなければならない。
好ましくは、まず、アンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を阻害する能力を定量するインビトロ研究を行う。好ましくは、これらの研究は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス遺伝子阻害と非特異的な生物学的作用とを識別するコントロールを使用する。また、好ましくは、これらの研究は、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルをＲＮＡまたはタンパク質の内部コントロールのレベルと比較した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して得られる結果は、コントロールオリゴヌクレオチドを使用して得られる結果と比較され得る。好ましくは、コントロールオリゴヌクレオチドは、アッセイされるオリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであり、オリゴヌクレオチド配列は、標的配列への特異的なハイブリダイゼーションを妨げるために必要であると考えられるアンチセンス配列にすぎないものと異ならない。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾されたバージョンであり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、そのハイブリダイゼーション能力などを改善するために、塩基の基、糖の基またはリン酸骨格において修飾され得る。オリゴヌクレオチドは、他の結合基（例えば、ペプチド（例えば、オリゴヌクレオチドを宿主細胞のレセプターに導くためのペプチド）または細胞膜を通じた輸送を促進するための物質（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６，１９８９；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２，１９８７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）もしくは血液脳関門を通じた輸送を促進するための物質（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）、挿入剤（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９，１９８８を参照のこと））を含み得る。このために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、輸送剤（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、ハイブリダイゼーションによって惹起される切断剤などに結合体化され得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された塩基の少なくとも１つの基を含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含むがこれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾された糖の基も含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、中性ペプチドに類似の骨格も含み得る。そのような分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーとして知られており、例えば、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４６７０，１９９６およびＥｇｌｏｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６，１９９３に記載されている。
なおも別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたリン酸骨格を含む。なおも別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アルファ−アノマーオリゴヌクレオチドである。
標的ｍＲＮＡ配列のコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができるが、転写される非翻訳領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することもできる。
場合によっては、内因性のｍＲＮＡ翻訳を抑制するのに十分な細胞内濃度のアンチセンスに到達することが難しいことがある。ゆえに、好ましいアプロキシメーションは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを強力なｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターの支配下に配置した組換えＤＮＡ構築物を使用する。
あるいは、遺伝子制御領域（すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列に、体内の標的細胞において遺伝子転写を妨げる三重らせん構造を形成するように指示することによって、標的遺伝子発現を減少させることができる（Ｈｅｌｅｎｅ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６（６）：５６９−８４，１９９１を広く参照のこと）。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスモルホリンである。
ｓｉＲＮＡ
低分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉によって標的遺伝子の発現を阻害することができる物質である。ｓｉＲＮＡは、化学的に合成され得るか、インビトロ転写によって得ることができるか、または標的細胞においてインビボで合成され得る。代表的には、ｓｉＲＮＡは、１５〜４０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡからなり、１〜６ヌクレオチドの３’および／または５’突出領域を含み得る。その突出領域の長さは、ｓｉＲＮＡ分子の全長と無関係である。ｓｉＲＮＡは、転写後の標的メッセンジャーの分解またはサイレンシングによって作用する。
本発明のｓｉＲＮＡは、ｃ−ＭＡＦをコードする遺伝子のｍＲＮＡまたは上記タンパク質をコードする遺伝子配列と実質的に相同である。「実質的に相同」は、ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡ干渉によって後者を分解することができるほど、標的ｍＲＮＡと十分に相補的または類似である配列を有すると理解される。上記干渉を引き起こすために適したｓｉＲＮＡとしては、ＲＮＡによって形成されるｓｉＲＮＡ、ならびに種々の化学修飾を含むｓｉＲＮＡ、例えば：
・ヌクレオチド間の結合が天然に見られる結合と異なる（例えば、ホスホロチオネート結合）ｓｉＲＮＡ
・フルオロフォアなどの機能的な試薬とＲＮＡ鎖の結合体
・２’位の種々のヒドロキシル官能基での修飾による、ＲＮＡ鎖の末端、特に３’末端の修飾
・２’−Ｏ−メチルリボースまたは２’−Ｏ−フルオロリボースのような２’位におけるＯ−アルキル化残基などの改変された糖を有するヌクレオチド
・ハロゲン化された塩基（例えば、５−ブロモウラシルおよび５−ヨードウラシル）、アルキル化された塩基（例えば、７−メチルグアノシン）などの改変された塩基を有するヌクレオチド
が挙げられる。
ｓｉＲＮＡは、そのままで、すなわち、上述の特徴を有する二本鎖ＲＮＡの形態で、使用され得る。あるいは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含むベクターを、目的の細胞におけるその発現に好適なプロモーターの支配下で使用することが、可能である。
ｓｉＲＮＡの発現に適したベクターは、ｓｉＲＮＡの２本の鎖をコードする２つのＤＮＡ領域が、転写の際にループを形成するスペーサー領域によって分断された１本の同じＤＮＡ鎖においてタンデムに配置されているベクターであり、単一のプロモーターが、ｓｈＲＮＡを生じるＤＮＡ分子の転写を指示する。
あるいは、ｓｉＲＮＡを形成する各鎖が、異なる転写単位の転写から形成されるベクターを使用することも可能である。これらのベクターは、その後、分岐（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）転写ベクターと収束（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）転写ベクターとに分割される。分岐転写ベクターでは、ｓｉＲＮＡを形成する各ＤＮＡ鎖の転写が、同じであっても異なってもよいそれ自体のプロモーターに依存するように、その各ＤＮＡ鎖をコードする転写単位が、ベクター内でタンデムに配置される（Ｗａｎｇ，Ｊ．ら、２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１００：５１０３−５１０６およびＬｅｅ，Ｎ．Ｓ．ら、２００２，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：５００−５０５）。収束転写ベクターでは、ｓｉＲＮＡを生じるＤＮＡ領域は、２つの逆方向のプロモーターに隣接したＤＮＡ領域のセンス鎖およびアンチセンス鎖を形成する。センスおよびアンチセンスのＲＮＡ鎖の転写の後、後者は、機能的ｓｉＲＮＡを形成するためにハイブリッドを形成する。２つのＵ６プロモーター（Ｔｒａｎ，Ｎ．ら、２００３，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：２１）、マウスＵ６プロモーターおよびヒトＨ１プロモーター（Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．ら、２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１３５−１４０およびＷＯ２００５０２６３２２）ならびにヒトＵ６プロモーターおよびマウスＨ１プロモーター（Ｋａｙｋａｓ，Ａ．ａｎｄ Ｍｏｏｎ，Ｒ．，２００４，ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５：１６）が使用される逆方向プロモーター系を有するベクターが記載されている。
収束発現ベクターまたは分岐発現ベクターからのｓｉＲＮＡの発現におけるその使用に適したプロモーターには、ｓｉＲＮＡを発現させようとする細胞と適合性の任意のプロモーターまたはプロモーター対が含まれる。したがって、本発明に適したプロモーターとしては、構成的プロモーター（例えば、真核生物ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ＣＭＶ、トリ肉腫ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス）のゲノムに由来するプロモーター）、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、レトロウイルスＬＴＲ領域、免疫グロブリン遺伝子プロモーター、アクチン遺伝子プロモーター、ＥＦ−１アルファ遺伝子プロモーター、ならびにタンパク質発現が分子または外来性シグナルの添加に依存する誘導性プロモーター、例えば、テトラサイクリンシステム、ＮＦカッパーＢ／ＵＶ光システム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステムおよび熱ショック遺伝子プロモーター、ＷＯ／２００６／１３５４３６に記載されている制御可能なＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターならびに組織特異的プロモーター（例えば、ＷＯ２００６０１２２２１に記載されているＰＳＡプロモーター）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい実施形態において、プロモーターは、恒常的に作用するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、限られた数の遺伝子（例えば、５Ｓ ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、７ＳＬ ＲＮＡおよびＵ６ ｓｎＲＮＡ）にしか見られない。他のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターとは異なり、ＩＩＩ型プロモーターは、いかなる遺伝子内配列も必要とせず、むしろ、−３４および−２４位におけるＴＡＴＡボックス、−６６〜−４７の近位配列エレメントすなわちＰＳＥ、および場合によっては、−２６５〜−１４９位の遠位配列エレメントすなわちＤＳＥを含む５’方向の配列を必要とする。好ましい実施形態において、ＩＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、ヒトまたはマウスのＨ１遺伝子およびＵ６遺伝子のプロモーターである。なおもより好ましい実施形態において、プロモーターは、２つのヒトまたはマウスのＵ６プロモーター、マウスＵ６プロモーターおよびヒトＨ１プロモーターまたはヒトＵ６プロモーターおよびマウスＨ１プロモーターである。本発明の文脈において、ＥＲアルファ遺伝子プロモーターまたはサイクリンＤ１遺伝子プロモーターは、特に好適であり、ゆえに、がん腫瘍において目的の遺伝子を特異的に発現させるために特に好ましい。
ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを形成する逆平行鎖がループまたはヘアピン領域によって接続されていることを特徴とするいわゆるｓｈＲＮＡ（短ヘアピンＲＮＡ）から細胞内に産生され得る。ｓｈＲＮＡは、プラスミドまたはウイルス、特にレトロウイルスによってコードされ得、プロモーターの支配下にある。ｓｈＲＮＡの発現に適したプロモーターは、ｓｉＲＮＡの発現についての上記のパラグラフにおいて示されたプロモーターである。
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現に適したベクターとしては、原核生物発現ベクター（例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびそれらの誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏＩＥｌ、ｐＣＲｌ、ＲＰ４）、ファージベクターおよびシャトルベクター（例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８）、酵母発現ベクター（例えば、２−ミクロンプラスミドタイプのベクター、インテグレーションプラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドなど）、昆虫細胞発現ベクター（例えば、ｐＡＣシリーズベクターおよびｐＶＬシリーズベクター）、植物発現ベクター（例えば、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥシリーズベクターなど）およびウイルスベクターベース（アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルスならびにレトロウイルス、特にレンチウイルス）の高等真核生物細胞発現ベクターまたは非ウイルスベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴｌ）が挙げられる。好ましい実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
本発明のｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、当業者に公知の一連の技法を用いて得ることができる。ｓｉＲＮＡを設計するための基礎と考えられるヌクレオチド配列の領域は、限定的でなく、それは、コード配列（開始コドンと終止コドンの間）の領域を含み得るか、またはあるいは、好ましくは、２５〜５０ヌクレオチド長で、開始コドンに対して３’方向の任意の位置の非翻訳５’または３’領域の配列を含み得る。ｓｉＲＮＡを設計する１つの方法は、ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴモチーフの識別（ここで、Ｎは、ｃ−ＭＡＦ遺伝子配列内の任意のヌクレオチドであり得る）および高Ｇ／Ｃ含有量を有するそれらのモチーフの選択を含む。上記モチーフが見つからない場合、ＮＡ（Ｎ２１）モチーフ（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る）を識別することができる。
ｃ−ＭＡＦ特異的ｓｉＲＮＡには、ＷＯ２００５０４６７３１（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されているｓｉＲＮＡが含まれ、その鎖のうちの一方は、ＡＣＧＧＣＵＣＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡ（配列番号６）である。他のｃ−ＭＡＦ特異的ｓｉＲＮＡ配列としては、ＣＵＵＡＣＣＡＧＵＧＵＧＵＵＣＡＣＡＡ（配列番号７）、ＵＧＧＡＡＧＡＣＵＡＣＵＡＣＵＧＧＡＵＧ（配列番号８）、ＡＵＵＵＧＣＡＧＵＣＡＵＧＧＡＧＡＡＣＣ（配列番号９）、ＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＵＡＣＧＡＧＡＡＧＵ（配列番号１０）、ＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＵＡＣＧＡＧＡＡＧ（配列番号１１）およびＡＣＣＵＧＧＡＡＧＡＣＵＡＣＵＡＣＵＧＧ（配列番号１２）が挙げられるが、これらに限定されない。
ＤＮＡ酵素
他方で、本発明は、本発明のｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現を阻害するＤＮＡ酵素の使用も企図する。ＤＮＡ酵素は、アンチセンス技術とリボザイム技術の両方の機構的な特色のいくつかを組み込んでいる。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様の特定の標的核酸配列を認識するが、それにもかかわらず、リボザイムと同様に触媒性であり、標的核酸を特異的に切断するように、設計される。
リボザイム
活性が阻害されるべきであるｃ−ＭＡＦをコードするｍＲＮＡの翻訳を妨げるために標的ｍＲＮＡの転写産物を触媒的に切断するために設計されたリボザイム分子もまた、使用され得る。リボザイムは、特定のＲＮＡの切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である（概説として、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：４６９−４７１，１９９４を参照のこと）。リボザイムの作用機序は、相補的な標的ＲＮＡへのリボザイム分子配列の特異的なハイブリダイゼーションとその後のエンドヌクレアーゼによる切断事象を含む。リボザイム分子の組成は、好ましくは、標的ｍＲＮＡに相補的な１つまたは複数の配列およびｍＲＮＡの切断を担う周知の配列または機能的に等価な配列を含む（例えば、米国特許第５０９３２４６号を参照のこと、これはその全体が参照により本明細書中に援用される）。
本発明において使用されるリボザイムは、エンドリボヌクレアーゼＲＮＡであるハンマーヘッド型リボザイム（本明細書中以後、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）（Ｚａｕｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：５７４−５７８，１９８４を含む。
リボザイムは、改変されたオリゴヌクレオチド（例えば、安定性、標的化などを改善するように改変されたオリゴヌクレオチド）によって形成され得、そしてそれらはインビボで標的遺伝子を発現する細胞に分配されるべきである。好ましい分配方法は、トランスフェクトされた細胞が、内因性の標的メッセンジャーを破壊して翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するように、強力な構成的ｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターの支配下においてリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することを含む。リボザイムは、触媒的であるので、他のアンチセンス分子とは異なり、その効率のために、低い細胞内濃度しか必要ない。
阻害性抗体
本発明の文脈において、「阻害性抗体」は、目的の遺伝子（例えば、ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、５ｓｒＲＮＡ）によって発現されるタンパク質に特異的に結合して、上記タンパク質の機能の１つまたは複数、好ましくは、転写に関連する機能を阻害することができる任意の抗体と理解される。それらの抗体は、当業者に公知である任意の方法（そのうちのいくつかが上で述べられた）を使用して、調製され得る。したがって、ポリクローナル抗体は、阻害されるべきタンパク質で動物を免疫することによって調製される。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６：４９５）によって記載された方法を用いて調製される。本発明の文脈において、好適な抗体としては、可変抗原結合領域および定常領域を含むインタクトな抗体、「Ｆａｂ」、「Ｆ（ａｂ’）２」および「Ｆａｂ’」、Ｆｖ、ｓｃＦｖフラグメント、ダイアボディ、二重特異性抗体、アルファボディ、シクロペプチドおよびステープルドペプチドが挙げられる。いったん、目的の遺伝子のタンパク質結合能を有する抗体が同定されたら、このタンパク質の活性を阻害することができる抗体が、阻害剤識別アッセイを用いて選択される。
阻害性ペプチド
本明細書中で使用されるとき、用語「阻害性ペプチド」とは、上で説明されたように目的の遺伝子によって発現されるタンパク質に結合してその活性を阻害することができる、ペプチドのことを指す。
ネガティブｃ−ＭＡＦドミナント
ＭＡＦファミリーのタンパク質は、ホモ二量体化およびＡＰ−１ファミリーの他のメンバー（例えば、ＦｏｓおよびＪｕｎ）とのヘテロ二量体化をすることができるので、ｃ−ＭＡＦ活性を阻害する１つの方法は、ｃ−ＭＡＦと二量体化することができるが転写を活性化させる能力を欠くネガティブドミナントの使用によるものである。したがって、ネガティブｃ−ＭＡＦドミナントは、細胞に存在し、トランス活性化ドメイン（例えば、ｍａｆＫ、ｍａｆＦ、ｍａｆｇおよびｐｉ８）を含むアミノ末端の３分の２を欠く、任意の小さいｍａｆタンパク質であり得る（Ｆｕｊｉｗａｒａら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８，２３７１−２３８０；Ｉｇａｒａｓｈｉら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，７６１５−７６２４；Ａｎｄｒｅｗｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，１１４８８−１１４９２；Ｋａｔａｏｋａら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，２１８０−２１９０）（Ｋａｔａｏｋａら（１９９６）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １２，５３−６２）。
あるいは、ネガティブｃ−ＭＡＦドミナントには、他のタンパク質と二量体化する能力を維持しているが転写を活性化する能力を欠くｃ−ＭＡＦバリアントが含まれる。これらのバリアントは、例えば、タンパク質のＮ末端に位置するｃ−ＭＡＦトランス活性化ドメインを欠いているバリアントである。したがって、例証的な様式では、ネガティブｃ−ＭＡＦドミナントバリアントには、少なくともアミノ酸１〜１２２、少なくともアミノ酸１〜１８７または少なくともアミノ酸１〜２５７（米国特許第６２７４３３８号に記載されているようなヒトｃ−ＭＡＦのナンバリングを考慮することによって）が除去されているバリアントが含まれる。
本発明は、ネガティブｃ−ＭＡＦドミナントバリアントと、標的細胞における発現に適したプロモーターの作動性の支配下のｃ−ＭＡＦをコードするポリヌクレオチドとの両方の使用を企図する。本発明のポリヌクレオチド転写を制御するために使用され得るプロモーターは、構成的プロモーター、すなわち、基底レベルの転写を指示するプロモーター、または転写活性に外部のシグナルが必要である誘導性プロモーターであり得る。転写の制御に適した構成的プロモーターは、とりわけ、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＤＨＦＲプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、１ａ伸長因子（ＥＦ１ａ）プロモーター、アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡ１プロモーター、ケラチンプロモーター、ＣＤ３プロモーター、免疫グロブリン重鎖または軽鎖プロモーター、ニューロフィラメントプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、Ｌ７プロモーター、ＣＤ２プロモーター、ミオシン軽鎖キナーゼプロモーター、ＨＯＸ遺伝子プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＭｙｏＤ遺伝子プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子プロモーター、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）プロモーター、アクチン遺伝子プロモーターである。好ましい実施形態において、トランス活性化因子の発現を制御するプロモーターは、ＰＧＫ遺伝子プロモーターである。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド転写を制御するプロモーターは、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。
好ましくは、本発明の文脈において使用され得る誘導性プロモーターは、誘導剤（ｉｎｄｕｃｅｒ ａｇｅｎｔ）の非存在下ではゼロまたは無視できる基底発現を示す誘導剤に応答するプロモーターであり、３’位に位置する遺伝子の活性化を促進することができる。誘導剤のタイプに応じて、誘導性プロモーターは、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆプロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ら、１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９；Ｒｏｓｓｉ，Ｆ．Ｍ．Ｖ．ａｎｄ Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕ，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４５１−４５６）；Ｐｉｐ ｏｎ／ｏｆｆプロモーター（米国特許第６２８７８１３号）；抗黄体ホルモン依存性プロモーター（ＵＳ２００４１３２０８６）、エクジソン依存性プロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６３１４−６３１８；Ｎｏら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１，Ｓｕｈｒら、１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：７９９９−８００４およびＷＯ９７３８１１７）、メタロチオネイン依存性プロモーター（ＷＯ８６０４９２０、これは、その全体が参照により本明細書中に援用される）およびラパマイシン依存性プロモーター（Ｒｉｖｅｒａら、１９９６，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１０２８−３２）として分類される。
ネガティブｃ−ＭＡＦドミナントバリアントをコードするポリヌクレオチドの発現に適したベクターとしては、原核生物発現ベクター由来のベクター（例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびそれらの誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥｌ、ｐＣＲｌ、ＲＰ４）、ファージおよびシャトルベクター（例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８）、酵母発現ベクター（例えば、２−ミクロンタイプのプラスミドベクター、インテグレーションプラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドなど）、昆虫細胞発現ベクター（例えば、ｐＡＣシリーズベクターおよびｐＶＬシリーズベクター）、植物発現ベクター（例えば、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥシリーズベクターなど）およびウイルスベクターベース（アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルスならびにレトロウイルスおよび特にレンチウイルス）の高等真核生物細胞発現ベクターまたは非ウイルスベクター（例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴｌ）が挙げられる。
小分子
本発明における使用に適した他のｃ−ＭＡＦ阻害性化合物には以下が挙げられる：
他のｃ−ＭＡＦインヒビターは、特許出願ＷＯ２００５０６３２５２（その全体が本明細書中に参照により援用される）に記載されている（例えば、以下の表（表２）に示されるもの）。
好ましい実施形態において、骨転移は、骨溶解性転移である。
ｃ−ＭＡＦ阻害剤は、代表的には、薬学的に許容され得るキャリアとともに投与される。
用語「キャリア」とは、希釈剤または賦形剤のことを指し、それによって、活性成分が投与される。そのような薬学的キャリアは、滅菌された液体（例えば、水および油（石油、動物、植物または合成起源のものを含む（例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）））であり得る。特に注射可能な溶液用の、水または食塩水溶液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液が、キャリアとして使用されるのが好ましい。好適な薬学的キャリアは、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，１９９５によって「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。好ましくは、本発明のキャリアは、州政府もしくは連邦政府の規制当局によって承認されたものであるか、または米国薬局方、もしくは動物、より具体的には人間におけるその使用について一般に認識されている他の薬局方に列挙されているものである。
本発明の薬学的組成物の所望の薬学的剤形を製造するために必要なキャリアおよび補助物質は、他の因子のなかでも、選択される薬学的剤形に依存する。薬学的組成物の上記薬学的剤形は、当業者に公知の従来の方法に従って製造されるだろう。活性成分を投与するための種々の方法、使用されるべき賦形剤およびそれらを生成するためのプロセスの概説は、「Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌeｎｉｃａ」，Ｃ．Ｆａｕｌi ｉ Ｔｒｉｌｌｏ，Ｌｕｚaｎ ５，Ｓ．Ａ．１９９３ Ｅｄｉｔｉｏｎに見られる。薬学的組成物の例としては、経口投与、局所投与または非経口投与用の、任意の固体組成物（錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤など）または液体組成物（溶液、懸濁液またはエマルジョン）が挙げられる。さらに、薬学的組成物は、必要であると見なされる場合、安定剤、懸濁剤、保存剤、界面活性剤などを含み得る。
医薬において使用するために、ｃ−ＭＡＦ阻害剤は、単離されたものとして、またはさらなる活性剤とともに、プロドラッグ、塩、溶媒和化合物もしくは包接化合物の形態で見出され得、薬学的に許容され得る賦形剤とともに製剤化され得る。本発明におけるその使用にとって好ましい賦形剤としては、糖、デンプン、セルロース、ゴムおよびタンパク質が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物は、固体の薬学的剤形（例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、坐剤、液体の形態を得るために再構成され得る滅菌された結晶または無定形固体など）、液体の薬学的剤形（例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル剤、ローション、軟膏など）または半固体の薬学的剤形（ゲル、軟膏、クリームなど）として製剤化されるだろう。本発明の薬学的組成物は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、動脈内経路、髄内（ｉｎｔｒａｍｅｄｕｌａｒｒｙ）経路、鞘内経路、心室内経路（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｒｏｕｔｅｒ）、経皮的経路、皮下経路、腹腔内経路、鼻腔内経路、腸管経路、局所経路、舌下経路または直腸経路が挙げられるがこれらに限定されない任意の経路によって投与され得る。活性成分を投与するための種々の方法、使用されるべき賦形剤およびそれらの製造プロセスの概説は、Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌeｎｉｃａ，Ｃ．Ｆａｕｌi ｉ Ｔｒｉｌｌｏ，Ｌｕｚaｎ ５，Ｓ．Ａ．，１９９３ ＥｄｉｔｉｏｎおよびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．），２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ＰＡ，ＵＳＡ（２０００）に見られる。薬学的に許容され得るキャリアの例は、当該分野において公知であり、それらとしては、リン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）、種々のタイプの湿潤剤、滅菌された溶液などが挙げられる。上記キャリアを含む組成物は、当該分野で公知の従来のプロセスによって製剤化され得る。
核酸（ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、またはネガティブｃ−ＭＡＦドミナントをコードするポリヌクレオチド）が投与される場合、本発明は、上記核酸を投与するために個々に調製された薬学的組成物を企図する。その薬学的組成物は、上記裸の核酸、すなわち、身体のヌクレアーゼによる分解から核酸を保護する化合物の非存在下の核酸を含み得、それは、トランスフェクションのために使用される試薬に関連する毒性が排除されるという利点を必要とする。裸の化合物に適した投与経路としては、血管内経路、腫瘍内経路、頭蓋内経路、腹腔内経路、脾臓内経路、筋肉内経路、網膜下経路、皮下経路、粘膜経路、局所経路および経口経路が挙げられる（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，２００２，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２１：８５７−８６７）。あるいは、それらの核酸は、コレステロールに結合体化された、または細胞膜を通過して転座を促進することができる化合物（例えば、ＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質由来のＴａｔペプチド、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒアンテナペディアタンパク質のホメオドメインの３番目のらせん、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質、アルギニンオリゴマー、およびＷＯ０７０６９０９０に記載されているようなペプチド）に結合体化された、リポソームの一部を形成して、投与され得る（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ａ．ら、２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ，２１：９９−１０３、Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．ら、２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２１：４５−４８、Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｍら、２００３，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１４３−１５０およびＳｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｌ．ａｎｄ Ｄｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．，２００４，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１：３８９−３９３）。あるいは、そのポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）またはレンチウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ）に基づくウイルス）において、プラスミドベクターまたはウイルスベクター、好ましくは、アデノウイルスベースのベクターの一部を形成して、投与され得る。
ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡ阻害剤またはそれらを含む薬学的組成物は、体重１キログラムあたり１０ｍｇ未満、好ましくは、体重１ｋｇあたり５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５または０．００００１ｍｇ未満の用量で投与され得る。単位用量は、注射、吸入または局所投与によって投与され得る。
用量は、処置される状態の重症度および応答に依存し、それは、数日間〜数ヶ月間またはその状態が鎮静するまで、変動し得る。患者の身体におけるその薬剤の濃度を定期的に測定することによって、最適な投与量が決定され得る。動物モデルにおける事前のインビトロまたはインビボアッセイによって得られるＥＣ５０値から、最適な用量が決定され得る。単位用量は、１日に１回または１日に１回未満、好ましくは、２、４、８または３０日ごとに１回未満で投与され得る。あるいは、開始用量の後、１回または数回の維持用量（通常、開始用量よりも少ない量）を投与することが可能である。維持レジメンは、０．０１μｇ〜１．４ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば、１０、１、０．１、０．０１、０．００１または０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量範囲での患者の処置を含み得る。維持用量は、好ましくは、５、１０または３０日ごとにせいぜい１回投与される。処置は、患者が罹患している障害のタイプ、その重症度および患者の状態に従って変動する時間にわたって継続されなければならない。処置の後、その疾患がその処置に応答しない場合、用量を増加すべきかどうか、またはその疾患の改善がみとめられる場合もしくは望まれない副作用がみとめられる場合、用量を減少させるかどうかを決定するために、患者の進行をモニターしなければならない。
上昇したｃ−ＭＡＦレベルを有する、骨転移を伴うがん患者における骨分解の処置または予防
別の態様において、本発明は、がんに罹患しており、かつ、ｃ−ＭＡＦ、またはｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、もしくは５ｓＲＮＡを含有する染色体領域に特異的なプローブの使用を通して、転移サンプルにおいてコントロールサンプルと比較して上昇したｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡレベルが存在すると決定された被験体における骨転移の処置において使用するための、ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、もしくは５ｓＲＮＡ阻害剤、または骨分解を回避するかもしくは予防することができる薬剤に関する。
別の態様において、本発明は、がんに罹患しており、かつ、ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、もしくは５ｓＲＮＡ、またはｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、もしくは５ｓＲＮＡを含有する染色体領域に特異的なプローブの使用を通して、転移サンプルにおいてコントロールサンプルと比較して上昇したｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡレベルを有する被験体における骨転移の処置のための医薬を製造するための、ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、もしくは５ｓＲＮＡ阻害剤、または骨分解を回避するかもしくは予防することができる薬剤の使用に関する。
あるいは、本発明は、がんに罹患しており、かつ転移サンプルにおいてコントロールサンプルと比較して上昇したｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡレベルを有する被験体における分解の予防および／または処置の方法に関し、その方法は、ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、もしくは５ｓＲＮＡ阻害剤、または骨分解を回避するためもしくは予防するための薬剤を上記被験体に投与する工程を含む。
特定の実施形態において、骨転移は、骨溶解性転移である。
本発明に記載される治療方法に適した、ｃ−ＭＡＦ阻害剤、および骨分解を回避するかまたは予防することができる薬剤は、個別化治療法の文脈において、上で詳細に記載されている。
参照サンプルまたはコントロールサンプルは、転移に罹患していないがんを有する被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ ｃａｎｃｅｒ）のサンプル、または転移に罹患していないがんを有する被験体の生検サンプルの腫瘍組織コレクションにおいて計測されたｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡ遺伝子発現レベルの中央値に対応するサンプルである。
ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡレベルがコントロールサンプルと比較して上昇しているかどうかを決定するためまたは定量するための方法は、本発明の第１の方法に関して詳細に記載されてきたが、骨分解を回避するためまたは予防するための薬剤にも等しく適用可能である。
あるいは、骨分解を回避するためまたは予防するための、上で述べられた薬剤のうちの１つを超える薬剤が組合わされることにより転移が処置されるおよび／もしくは予防される組み合わせ処置が行われ得るか、または上記薬剤が、他のサプリメント（例えば、カルシウムまたはビタミンＤ）もしくはホルモンと組み合わされ得る。
骨分解を回避するためまたは予防するための薬剤は、代表的には、薬学的に許容され得るキャリアとともに投与される。用語「キャリア」およびキャリアのタイプは、ｃ−ＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡ阻害剤、ならびにそれらが投与され得る形態および用量について上で定義されてきたが、骨分解を回避するためまたは予防するための薬剤にも等しく適用可能である。
以下の例は、本発明を例証するものであって、その範囲を限定しない。
本発明のキット
別の態様において、本発明は、がんに罹患している被験体における上記がんの骨転移を予測するためのキットに関し、そのキットは：ａ）上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベル、増幅、または転座を定量するためのプローブ；およびｂ）上記サンプル中の定量された目的の遺伝子の発現レベルを参照の目的の遺伝子の発現レベルと比較するための手段を備える。
別の態様において、本発明は、がんからの骨転移に罹患している被験体の臨床転帰を予測するためのキットに関し、そのキットは：ａ）上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベル、増幅、または転座を定量するためのプローブ；およびｂ）上記サンプル中の定量された目的の遺伝子の発現レベル、増幅、または転座を参照の目的の遺伝子の発現レベルと比較するための手段を備える。
別の態様において、本発明は、がんに罹患している被験体に対する治療を決定するためのキットに関し、そのキットは：ａ）上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量するためのプローブ；ｂ）上記サンプル中の定量された目的の遺伝子の発現レベルを参照の目的の遺伝子の発現レベルと比較するための手段；およびｃ）定量された発現レベルと参照発現レベルとの比較に基づいて、上記被験体において骨転移を予防するためおよび／または減少させるための治療を決定するための手段を備える。
別の態様において、本発明は、ｉ）がんに罹患している被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量するためのプローブ、およびｉｉ）骨転移のリスクと相関するように予め決定されている１つまたは複数の目的の遺伝子の発現レベル指標を備えるキットに関する。
上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベル、増幅、または転座を定量するためのプローブは、先に詳細に記載された。好ましい実施形態において、発現を定量するためのプローブは、目的の遺伝子に特異的に結合および／または増幅するプローブおよび／またはプライマーのセットを含む。
本発明の方法の特定の実施形態のすべてが、本発明のキットおよびそれらの使用に適用可能である。
がんに罹患している被験体のサンプルをタイプ分けするための方法
別の態様において、本発明は、がんに罹患している被験体のサンプルをタイプ分けするためのインビトロでの方法に関し、その方法は：
ａ）上記被験体からサンプルを提供する工程；
ｂ）プローブを使用して、上記サンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量する工程；
ｃ）定量された目的の遺伝子の発現レベルを目的の遺伝子の発現の所定の参照レベルと比較することによって上記サンプルをタイプ分けする工程；
を含み、ここで、上記タイプ分けは、上記被験体における骨転移のリスクに関する予後情報を提供する。
上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子（例えば、ｃ−ＭＡＦ）の発現レベル、増幅、または転座を定量するためのプローブは、先に詳細に記載された。
好ましい実施形態において、サンプルは、腫瘍組織サンプルである。
がんに罹患している被験体を分類するための方法
別の態様において、本発明は、がんに罹患している被験体をコホートに分類するための方法に関し、その方法は：ａ）プローブを使用して、上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベル、増幅、または転座を決定する工程；ｂ）上記サンプル中の目的の遺伝子の発現レベル、増幅、または転座を目的の遺伝子の発現の所定の参照レベルと比較する工程；およびｃ）そのサンプル中の目的の遺伝子の上記発現レベルに基づいて、上記被験体をコホートに分類する工程を含む。
上記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベル、増幅、または転座を定量するためのプローブは、先に詳細に記載された。
好ましい実施形態において、サンプルは、腫瘍組織サンプルである。
好ましい実施形態において、上記コホートは、上記参照発現レベルと比較して、匹敵する目的の遺伝子の発現レベルを有すると判定された少なくとも１つの他の個体を含む。
別の好ましい実施形態において、上記サンプル中の目的の遺伝子の上記発現レベル、増幅、または転座は、上記所定の参照レベルと比べて上昇しており、コホートのメンバーは、骨転移の上昇したリスクを有すると分類される
別の好ましい実施形態において、上記コホートは、臨床試験を行うためのコホートである。好ましい実施形態において、サンプルは、腫瘍組織サンプルである。
実施例１
Ｖｙｓｉｓプローブを使用する乳がん腫瘍サンプルの分析
コホートＩ．乳がん原発腫瘍コホートの発見
患者の情報は、ＧＥＯ（Ｂａｒｒｅｔｔら、（２００７）（Ｔ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｕｐ，Ｓ．Ｅ．Ｗｉｌｈｉｔｅ，Ｐ．Ｌｅｄｏｕｘ，Ｄ．Ｒｕｄｎｅｖ，Ｃ．Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ，Ｉ．Ｆ．Ｋｉｍ，Ａ．Ｓｏｂｏｌｅｖａ，Ｍ．Ｔｏｍａｓｈｅｖｓｋｙ，ａｎｄ Ｒ．Ｅｄｇａｒ．ＮＣＢＩ ＧＥＯ：ｍｉｎｉｎｇ ｔｅｎｓ ｏｆ ｍｉｌｌｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ−ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ｔｏｏｌｓ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，Ｊａｎｕａｒｙ ２００７．ＩＳＳＮ １３６２−４９６２））からダウンロードした。以下のデータセットを使用した：ＧＳＥ１２２７６の組み合わせ。このコホートは、２０４人の乳がん患者の原発腫瘍生検遺伝子発現プロフィール、およびＧＥＯにおいて記載されているような遠隔転移の時間および部位についてのその臨床的注釈を有する。体系的なバイアス（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂｉａｓｅ）を排除するために、マージする前に、すべての遺伝子の発現の測定値をｚ−スコアに変換した。すべての統計解析を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（Ｇｅｎｔｌｅｍａｎら、（２００４）（Ｒ．Ｃ．Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ，Ｖ．Ｊ．Ｃａｒｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｂａｔｅｓ，Ｂ．Ｂｏｌｓｔａｄ，Ｍ．Ｄｅｔｔｌｉｎｇ，ｏＳ．Ｄｕ−ｄｏｉｔ，Ｂ．Ｅｌｌｉｓ，Ｌ．Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｙ．Ｇｅ，Ｊ．Ｇｅｎｔｒｙ，Ｋ．Ｈｏｒｎｉｋ，Ｔ．Ｈｏｔｈｏｒｎ，Ｗ．Ｈｕｂｅｒ，Ｓ．Ｉａｃｕｓ，Ｒ．Ｉｒｉｚａｒｒｙ，Ｆ．Ｌｅｉｓｃｈ，Ｃ．Ｌｉ，Ｍ．Ｍａｅｃｈｌｅｒ，Ａ．Ｊ．Ｒｏｓｓｉｎｉ，Ｇ．Ｓａｗｉｔｚｋｉ，Ｃ．Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｓｍｙｔｈ，Ｌ．Ｔｉｅｒｎｅｙ，Ｊ．Ｙ．Ｈ．Ｙａｎｇ，ａｎｄ Ｊ．Ｚｈａｎｇ．Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：Ｏｐｅｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：Ｒ８０，２００４．ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｂｉｏｌｏｇｙ．ｃｏｍ／２００４／５／１０／Ｒ８０））を使用して行った。
コホートＩＩ．乳がん原発腫瘍サンプルコホートの検証：
上記の患者腫瘍サンプルコホートＩで見出された仮説を検証するために、第２のヒト乳房腫瘍コホートを使用した。独立した検証セットは、ステージＩ、ＩＩまたはＩＩＩ ＢＣを有し、追跡の注釈が付けられている患者由来の３８０個より多くの原発乳がん検体から構成される（Ｒｏｊｏ Ｆ．，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２３（５）：１１５６−１１６４（２０１２））。組織マイクロアレイを標準的な手順に従って処理した。腫瘍を、ＥＲ＋、トリプルネガティブおよびＨＥＲ２＋に従って３つのサブタイプに分類できた。１６ｑ２３増幅またはこれらの腫瘍に含まれる遺伝子のいくつかの発現が、全体の集団または所与のサブタイプのいくつかにおいて骨転移事象と相関するかを確かめるために、適切な統計解析を行った。
この第２のコホートにおける統計解析は、以下の前提に基づいた：
ｉ）ベースラインの特徴の比較。
年齢の分散の一様性を、Ｆｏｌｄｅｄ Ｆ検定を用いて検定する。年齢の平均値の差異を、分散の一様性に応じて、プールされた（ｐｏｏｌｅｄ）ｔ検定またはＳａｔｔｅｒｈｗａｉｔｅ ｔ検定（複数のカテゴリーを比較するための、ＡＮＯＶＡまたはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）を用いて検定する。適用できる場合、分類変数を、カイ二乗検定またはＦｉｓｈｅｒ検定を用いて比較する。
ｉｉ）ＦＩＳＨおよびＩＨＣの診断性能
・ｐ＜０：２の変数を算入するためのｐ値の判定基準および調整後のモデルにおいてｐ＜０．１０の変数を保持するための判定基準を用いるステップワイズ選択（ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を介して、多変量解析を行う。診断性能は、ＲＯＣ曲線のＡＵＣを比較することによって評価される。モデルの適合度は、Ｈｏｓｍｅｒ−Ｌｅｍｅｓｈｏｗ検定を用いて評価される（有意である場合、さらなる解析は行わない）。
・最も予測的な変数（１６ｑ２３ ＦＩＳＨ）に基づいて、各分類カテゴリーに対して感度（Ｓｅ）、特異度（Ｓｐ）、陽性予測値（ＰＰＶ）および陰性予測値（ＮＰＶ）を計算する。
ｉｉｉ）予後診断の役割
・骨転移までの結果時間（ｏｕｔｃｏｍｅ ｔｉｍｅ）のＣｏｘ回帰モデリングを、同順位の「ｅｆｒｏｎ」マネジメントを用いて行った。事象の数は、それらのモデルに入れられる変数の数を操る（各５〜１０事象につき約１変数）。
実施例２
ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、５ｓｒＲＮＡ、およびＭＡＦの遺伝子を含む１６ｑ２３に位置する染色体領域の増幅は骨転移と関連する
ＡＣＥアルゴリズムを適用することによって、転移のリスクに関連する原発性乳がん検体においてコピー数の変化（ＣＮＡ）を同定した（発現データによるＣＮＡの解析）（図１ａ）。中でも、染色体１６ｑ２３に位置する増幅された領域は、転移のリスクと有意に（ｐ＜０．０５）関連し、その発現の増加が、個別におよび独立して、ＥＲ＋ヒト乳がんにおける骨転移のリスクと関連すると予想される遺伝子であるＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、５ｓｒＲＮＡ、およびＭＡＦを含んだ（すなわち、ＷＷＯＸの発現については、ＨＲ＝１．３３ ｐ＝０．０４４、ＧＳＥ１２２７６に基づく乳がん原発腫瘍データセット）。同様に、ＦＩＳＨ（１６ｑ２３）および比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）によって親ＭＣＦ７（ＥＲ＋）を骨転移性ＭＣＦ７派生物（ＢｏＭ２）細胞と比較したとき、１６ｑ２３染色体領域の獲得を確認した（図１ａ、ｂ）。親細胞のサブセット（３２．７％）が、このゲノム増幅を保有していたが、インビボでの骨転移選択により、この残余集団がその残りを引き継ぐこととなった（８８．６％）。したがって、本発明者らは、１６ｑ２３が、転移、特に骨転移のリスクを有する乳がんにおいて増幅されており、インビボにおいて選択された細胞において、骨に転移する能力について裏付けられることを示す。
実施例３
コホートＩＩにおける、ＦＩＳＨ決定による１６ｑ２３ＤＮＡゲノム増幅の骨転移を予測する予後診断能力の検証
１６ｑ２３ゲノム増幅が骨転移リスクを特異的に予測する能力をさらに検証するために、ステージＩ、ＩＩまたはＩＩＩ ＢＣを有し、追跡の注釈が付けられている患者由来の３３４個の原発性乳がん検体から構成される独立した検証セットにおいて、ＦＩＳＨによって（１６ｑ２３ゲノム領域を決定する商業的に入手可能な診断プローブ、ＩＧＨ／ＭＡＦ Ａｂｂｏｔｔ Ｖｙｓｉｓプローブを使用した）、１６ｑ２３染色体領域ゲノムの獲得を解析した（Ｒｏｊｏ Ｆ．，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２３（５）：１１５６−１１６４（２０１２））。
Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからの商業的に入手可能な診断プローブを使用した。このＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅプローブは、ＭＡＦ遺伝子領域に隣接し、およそ２．２Ｍｂギャップを伴う各々およそ３５０ｋｂである２つのセグメントから構成される。このセントロメアセグメントは１６番染色体：７５７２９９８５−７６０７９７０５に位置し（２００６年３月アセンブリー、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ）、テロメアセグメントは１６番染色体：７８２９０００３−７８６３５８７３に位置する（２００６年３月アセンブリー、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ）。このプローブは、５つの遺伝子、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、５ｓｒＲＮＡ、およびＭＡＦ（セントロメアからテロメアまでの順番）に隣接する。
本発明者らは、ＦＩＳＨプローブによって隣接される５つの遺伝子、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、５ｓｒＲＮＡ、およびＭＡＦ（セントロメアからテロメアまでの順番）に本発明者らの注意を集中した。
組織マイクロアレイを標準的な手順に従って処理した。スライドを、１６ｑ２３およびＩＧＨ １４ｑ３２プローブ混合物（Ａｂｂｏｔｔ ｖｙｓｉｓプローブ）とともにインキュベートした。ＤＡＰＩ対比染色を適用し、適切な顕微鏡を用いて画像を取得した。
ステージＩ、ＩＩおよびＩＩＩ ＢＣヒト原発腫瘍セット（ｎ＝３３４）における無骨転移生存率（図２ａ）または全生存率（図２ｂ）のカプラン・マイヤー曲線を決定した。腫瘍１つあたり３つのコアを使用して、平均として細胞１つあたり２．５コピーの１６ｑ２３というカットオフに基づく１６ｑ２３ ＦＩＳＨ陰性群および１６ｑ２３ ＦＩＳＨ陽性群に従って、患者を層別化した。骨転移を予測するマーカーのハザード比（骨転移）、特異度および感度を算出した。データセットのベースラインの特徴および乳がん全体に対するＣｏｘ多変量解析を、上に記載されたように行った（表３および４）。

Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ ＢＣヒト原発腫瘍セットにおけるＥＲ陽性患者（左）またはトリプルネガティブ患者（右）に対する無骨転移生存率のカプラン・マイヤー曲線（それぞれｎ＝２５０およびｎ＝４３）（図２ｃ）も決定した。腫瘍１つあたり３つのコアを使用して、平均として細胞１つあたり２．５コピーの１６ｑ２３というカットオフに基づいて、患者を１６ｑ２３ ＦＩＳＨ陰性群および１６ｑ２３ ＦＩＳＨ陽性群に分けた。ＥＲ＋乳がんに対するＣｏｘ多変量解析を上に記載されたように行った（表５）。
乳がん全体（図２ｄ）およびＥＲ＋乳がん（図２ｅ）における１６ｑ２３増幅の診断性能に対する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線も、診断性能を推定するために算出した。ＲＯＣ曲線において、真陽性率（感度）は、種々のカットオフ点に対する偽陽性率（１００−特異度）の関数としてプロットされる。ＲＯＣ曲線上の各点は、特定の決定閾値に対応する感度／特異度対を表す。
要約すると、５つの遺伝子、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、５ｓｒＲＮＡ、およびＭＡＦ（セントロメアからテロメアまでの順番）と隣接する１６ｑ２３ ＦＩＳＨプローブを用いて本明細書中で測定された１６ｑ２３増幅は、乳がん原発腫瘍、特に、ＴＮおよびＥＲ＋乳がんサブタイプにおける骨転移のリスクを有意に予測する。したがって、原則的には、任意のこれら５つの遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはタンパク質発現レベルを使用して、骨転移を予測することができた。
実施例４
ＷＷＯＸ遺伝子発現がコホート乳がんにおける骨転移を予測する能力の分析
コホートＩ（ＧＳＥ１２２７６）における骨転移を分析するときに、骨転移がＷＷＯＸ発現を通して説明できるかを調べるためにＣｏｘ比例ハザードモデル（パッケージ生存からＲ関数ｃｏｘｐｈを使用する）を調整した。ＷＷＯＸは、乳がん原発腫瘍において、骨転移を予測する統計学的に有意な能力を有していた（ＨＲ（骨転移）＝１．２３ ｐ＝０．０２）。原発腫瘍におけるＷＷＯＸ発現は、乳がんを有する被験体において転移を起こす傾向の予後診断を決定するために使用できる。
同様に、ＷＷＯＸは、ＥＲ＋乳がん原発腫瘍において、骨転移を予測する統計学的に有意な能力を有していた（ＨＲ（骨転移）＝１．３３ ｐ＝０．０４４）。原発腫瘍におけるＷＷＯＸ発現は、乳がんを有する被験体において転移を起こす傾向の予後診断を決定するために使用できる。
本明細書中に記載される例および実施形態は、単なる例証目的であり、それを考慮した様々な改変または変更が、当業者に示唆され、本願の精神および範囲とともに含められるべきであることが理解される。
本明細書に引用されたすべての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイトおよびアクセッション番号／データベース配列（ポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列の両方を含む）は、各個別の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイトまたはアクセッション番号／データベース配列が、参照により援用されると具体的かつ個別に示されたのと同程度にすべての目的のためにそれらの全体が本明細書中に参照により援用される。

Claims (69)

  1. がんの被験体における転移の診断のため、および／またはがんの被験体における転移を起こす傾向の予後診断のためのインビトロでの方法であって、前記方法は：
    （ｉ）前記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量する工程、および
    （ｉｉ）（ｉ）において得られた発現レベルをコントロールサンプルにおける目的の遺伝子の発現レベルと比較する工程
    を含み、ここで、前記サンプルにおける目的の遺伝子の発現レベルが前記コントロールサンプルにおける目的の遺伝子の発現レベルと比較して上昇している場合、前記被験体は転移について陽性の診断または転移を起こすより高い傾向を有する、インビトロでの方法。
  2. がんの被験体のために個別化治療（ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ）を設計するためのインビトロでの方法であって、前記方法は：
    （ｉ）前記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量する工程、および
    （ｉｉ）（ｉ）において得られた発現レベルをコントロールサンプルにおける目的の遺伝子の発現レベルと比較する工程
    を含み、ここで、前記サンプルにおける目的の遺伝子の発現レベルが前記コントロールサンプルにおける目的の遺伝子の発現レベルと比較して上昇している場合、前記被験体は前記がんの転移を予防、阻害および／または処置することが意図される治療を受けることができる、インビトロでの方法。
  3. 前記転移が骨転移である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記骨転移が骨溶解性転移である、請求項３に記載の方法。
  5. 骨転移を伴うがんを有する被験体のために個別化治療を設計するためのインビトロでの方法であって、前記方法は：
    （ｉ）前記被験体の骨転移腫瘍組織サンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量する工程、および
    （ｉｉ）工程（ｉ）において得られた発現レベルをコントロールサンプルにおける目的の遺伝子の発現レベルと比較する工程
    を含み、ここで、前記腫瘍組織サンプルにおける目的の遺伝子の発現レベルが前記コントロールサンプルにおける目的の遺伝子の発現レベルと比較して上昇している場合、前記被験体は骨分解を予防または阻害することが意図される治療を受けることができる、インビトロでの方法。
  6. 骨分解を予防または阻害することが意図される前記治療が、ビスホスホネート、ＲＡＮＫＬインヒビター、ＰＴＨ、ＰＴＨＬＨインヒビター（中和抗体およびペプチドを含む）、ＰＲＧアナログ、ラネル酸ストロンチウム、ＤＫＫ−１インヒビター、ＭＥＴおよびＶＥＧＦＲ２の二重インヒビター、エストロゲンレセプター調節因子、カルシトニン、ラジウム２２３、ＣＣＲ５アンタゴニスト、Ｓｒｃキナーゼインヒビター、ＣＯＸ−２インヒビター、ｍＴｏｒインヒビター、およびカテプシンＫインヒビターからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ＲＡＮＫＬインヒビターが、ＲＡＮＫＬ特異的抗体、ＲＡＮＫＬ特異的ナノボディ、およびオステオプロテゲリンからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ＲＡＮＫＬ特異的抗体が、デノスマブである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸である、請求項６に記載の方法。
  10. 目的の遺伝子の発現レベルの前記定量が、前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記ｍＲＮＡのフラグメント、前記遺伝子の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または前記ｃＤＮＡのフラグメントを定量する工程を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記発現レベルが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアレイ、またはヌクレオチドハイブリダイゼーション技術によって定量される、請求項１０に記載の方法。
  12. 目的の遺伝子の発現レベルの前記定量が、前記遺伝子によってコードされるタンパク質またはそのバリアントのレベルを定量する工程を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  13. 前記タンパク質のレベルが、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはタンパク質アレイによって定量される、請求項１２に記載の方法。
  14. がんの被験体における転移を診断するため、および／またはがんの被験体における転移を起こす傾向の予後診断のためのインビトロでの方法であって、前記方法は、前記被験体の腫瘍サンプル中の目的の遺伝子が、参照遺伝子コピー数と比べて増幅されているかを決定する工程を含み、ここで、前記参照遺伝子コピー数についての前記目的の遺伝子の増幅は、転移の存在または転移を起こす上昇したリスクの指標となる、インビトロでの方法。
  15. 前記目的の遺伝子の増幅が、遺伝子座１６ｑ２２−ｑ２４の増幅を決定することによって決定される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記目的の遺伝子の増幅が、ｃ−ＭＡＦ遺伝子特異的プローブを使用することによって決定される、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 前記参照遺伝子コピー数が、転移に罹患していない被験体由来のがんの腫瘍組織サンプルの遺伝子コピー数である、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
  18. 前記増幅が、インサイチュハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによって決定される、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 前記転移が骨転移である、請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. 前記骨転移が骨溶解性転移である、請求項１９に記載の方法。
  21. がんからの骨転移を処置および／または予防するための医薬品の調製における、目的の遺伝子のための阻害剤の使用。
  22. 前記目的の遺伝子のための阻害剤が、ｃ−ＭＡＦ特異的ｓｉＲＮＡ、ｃ−ＭＡＦ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｃ−ＭＡＦ特異的リボザイム、ｃ−ＭＡＦ阻害性抗体もしくはナノボディ、ドミナントネガティブｃ−ＭＡＦバリアント、表１もしくは表２の化合物、ｃ−ＭＡＦ特異的小分子、ｃ−ＭＡＦ特異的抗体、ｃ−ＭＡＦ特異的抗体様分子、ｃ−ＭＡＦ特異的な構造的に制約された（環状の）ペプチド、ｃ−ＭＡＦ特異的ステープルドペプチド、またはｃ−ＭＡＦ特異的アルファボディからなる群より選択される、請求項２１に記載の使用。
  23. がんに罹患しており、かつコントロールサンプルと比較して転移性腫瘍サンプルにおける目的の遺伝子の発現レベルが上昇している被験体において、骨転移の処置のための医薬品の調製における、骨分解を予防または阻害することが可能である薬剤の使用。
  24. 骨分解を回避または予防することが可能である前記薬剤が、ビスホスホネート、ＲＡＮＫＬインヒビター、ＰＴＨ、ＰＴＨＬＨインヒビター（中和抗体およびペプチドを含む）、ＰＲＧアナログ、ラネル酸ストロンチウム、ＤＫＫ−１インヒビター、ＭＥＴおよびＶＥＧＦＲ２の二重インヒビター、エストロゲンレセプター調節因子、ＥＧＦＲインヒビター、カルシトニン、ラジウム２２３、ＣＣＲ５アンタゴニスト、Ｓｒｃキナーゼインヒビター、ＣＯＸ−２インヒビター、ｍＴｏｒインヒビター、およびカテプシンＫインヒビターからなる群より選択される、請求項２３に記載の使用。
  25. 前記ＲＡＮＫＬインヒビターが、ＲＡＮＫＬ特異的抗体、ＲＡＮＫＬ特異的ナノボディ、およびオステオプロテゲリンからなる群より選択される、請求項２４に記載の使用。
  26. 前記ＲＡＮＫＬ特異的抗体が、デノスマブである、請求項２５に記載の使用。
  27. 前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸である、請求項２４に記載の使用。
  28. 前記骨転移が骨溶解性転移である、請求項２４〜２７のいずれかに記載の使用。
  29. がんに罹患している被験体における前記がんの骨転移を予測するためのキットであって、前記キットは：ａ）前記被験体の腫瘍サンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量するための手段；およびｂ）前記サンプル中の定量されたレベルの目的の遺伝子の発現レベルを参照のｃ−ＭＡＦの発現レベルと比較するための手段を備える、キット。
  30. がんに罹患している被験体のサンプルをタイプ分けするためのインビトロでの方法であって、前記方法は：
    ａ）前記被験体からサンプルを提供する工程；
    ｂ）前記サンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量する工程；
    ｃ）定量された目的の遺伝子の発現レベルを目的の遺伝子の発現の所定の参照レベルと比較することによって前記サンプルをタイプ分けする工程；
    を含み、ここで、前記タイプ分けする工程は、前記被験体における骨転移のリスクに関する予後情報を提供する、インビトロでの方法。
  31. がんに罹患している被験体における骨転移のリスクを予防するか、阻害するか、または減少させるための方法であって、前記方法は、骨転移を予防するかまたは減少させる薬剤を前記被験体に投与する工程を含み、ここで、前記薬剤は、前記被験体における目的の遺伝子の発現レベルの定量から決定された処置レジメンに従って投与される、方法。
  32. がんに罹患している被験体をコホートに分類する方法であって、前記方法は、ａ）前記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを決定する工程；ｂ）前記サンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを前記目的の遺伝子の発現の所定の参照レベルと比較する工程；およびｃ）前記サンプル中の前記目的の遺伝子の前記発現レベルに基づいて、前記被験体をコホートに分類する工程を含む、方法。
  33. 前記ＲＡＮＫＬ特異的ナノボディが、ＡＬＸ−０１４１である、請求項６に記載の方法。
  34. 前記ＭＥＴおよびＶＥＧＦＲ２の二重インヒビターが、カボザンチニブである、請求項６に記載の方法。
  35. 前記ＲＡＮＫＬ特異的ナノボディが、ＡＬＸ−９１４１である、請求項２４に記載の使用。
  36. 前記ＭＥＴおよびＶＥＧＦＲ２の二重インヒビターが、カボザンチニブである、請求項２４に記載の使用。
  37. 前記遺伝子特異的プローブが、Ｖｙｓｉｓ ＬＳＩ／ＩＧＨ ＭＡＦ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｄｕａｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅである、請求項１６に記載の方法。
  38. がんに罹患している被験体に対する治療を決定するためのキットであって、前記キットは：ａ）前記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量するための手段；ｂ）前記サンプル中の定量されたｃ−ＭＡＦの発現レベルを前記目的の遺伝子の参照発現レベルと比較するための手段；ならびにｃ）定量された前記発現レベルと前記参照発現レベルとの比較に基づいて、前記被験体において骨転移を予防するため、阻害するため、および／または減少させるための治療を決定するための手段を備える、キット。
  39. ｉ）がんに罹患している被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量するための試薬、およびｉｉ）骨転移のリスクと相関するように予め決定されている１つまたは複数のｃ−ＭＡＦ遺伝子の発現レベル指標を備える、キット。
  40. 発現を定量するための前記手段が、前記目的の遺伝子、１６ｑ２３遺伝子座または１６ｑ２２−１６ｑ２４染色体領域に特異的に結合および／またはこれを増幅するプローブおよび／またはプライマーのセットを含む、請求項３８または３９に記載のキット。
  41. がんに罹患している被験体のサンプルをタイプ分けするためのインビトロでの方法であって、前記方法は：
    （ｉ）前記被験体から腫瘍サンプルを提供する工程；
    （ｉｉ）前記サンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを定量する工程；
    （ｉｉｉ）定量された目的の遺伝子の発現レベルを目的の遺伝子の発現の所定の参照レベルと比較することによって前記サンプルをタイプ分けする工程；
    を含み、ここで、前記タイプ分けする工程は、前記被験体における骨転移のリスクに関する予後情報を提供する、インビトロでの方法。
  42. がんに罹患している被験体における骨転移のリスクを予防するため、阻害するため、または減少させるための方法であって、前記方法は、骨転移を予防するかまたは減少させる薬剤を前記被験体に投与するかまたは投与しない工程を含み、ここで、前記薬剤は、前記被験体における目的の遺伝子の発現レベルの定量から少なくとも部分的に決定された処置レジメンに従って投与される、方法。
  43. がんに罹患している被験体をコホートに分類する方法であって、前記方法は、ａ）前記被験体のサンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを決定する工程；ｂ）前記サンプル中の目的の遺伝子の発現レベルを目的の遺伝子の発現の所定の参照レベルと比較する工程；およびｃ）前記サンプル中の前記目的の遺伝子の前記発現レベルに基づいて、前記被験体をコホートに分類する工程を含む、方法。
  44. 前記コホートが、前記参照発現レベルと比較して、匹敵する目的の遺伝子の発現レベルを有すると決定された少なくとも１つの他の個体を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記サンプル中の目的の遺伝子の前記発現レベルが、前記所定の参照レベルと比べて上昇しており、前記コホートのメンバーが、骨転移の上昇したリスクを有すると分類される、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. 前記コホートが、臨床試験を行うためのコホートである、請求項４３〜４５のいずれかに記載の方法。
  47. がんに罹患している被験体における前記がんの骨転移を予測するためのインビトロでの方法であって、前記方法は、前記被験体のサンプル中の目的の遺伝子が、転座しているかを決定する工程を含み、ここで前記目的の遺伝子の転座が骨転移の上昇したリスクの指標となる、インビトロでの方法。
  48. 骨転移を伴うがんを有する被験体のために個別化治療を設計するためのインビトロでの方法であって、前記方法は、前記被験体のサンプル中の目的の遺伝子が、参照遺伝子コピー数と比べて増幅されているかを決定する工程を含み、ここで、前記参照遺伝子コピー数についての前記目的の遺伝子の増幅は、前記被験体が骨分解を予防または阻害するために意図される治療を受けるための候補であることを示す、インビトロでの方法。
  49. 骨分解を予防または阻害するために意図される前記治療が、ビスホスホネート、ＲＡＮＫＬインヒビター、ＰＴＨ、ＰＴＨＬＨインヒビター（中和抗体およびペプチドを含む）、ＰＲＧアナログ、ラネル酸ストロンチウム、ＤＫＫ−１インヒビター、ＭＥＴおよびＶＥＧＦＲの二重インヒビター、エストロゲンレセプター調節因子、カルシトニン、ラジウム２２３、ＣＣＲ５アンタゴニスト、Ｓｒｃキナーゼインヒビター、ＣＯＸ−２インヒビター、ｍＴｏｒインヒビター、およびカテプシンＫインヒビターからなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記ＲＡＮＫＬインヒビターが、ＲＡＮＫＬ特異的抗体、ＲＡＮＫＬ特異的ナノボディ、およびオステオプロテゲリンからなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ＲＡＮＫＬ特異的抗体が、デノスマブである、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸である、請求項４９に記載の方法。
  53. 発現を定量するための前記手段が、前記目的の遺伝子、１６ｑ２３遺伝子座または１６ｑ２２−１６ｑ２４染色体領域に特異的に結合および／またはこれを増幅するプローブおよび／またはプライマーのセットを含む、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法。
  54. 発現を定量するための前記手段が、前記目的の遺伝子、１６ｑ２３遺伝子座または１６ｑ２２−１６ｑ２４染色体領域に特異的に結合および／またはこれを増幅するプローブおよび／またはプライマーのセットを含む、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
  55. 発現を定量するための前記手段が、ｃ−ＭＡＦ遺伝子、１６ｑ２３遺伝子座または１６ｑ２２−１６ｑ２４染色体領域に特異的に結合および／またはこれを増幅するプローブおよび／またはプライマーのセットを含む、請求項４１〜４７のいずれかに記載の方法。
  56. 前記目的の遺伝子がＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡである、請求項１〜２０、３０〜３４、３７、および４１〜５５のいずれか１項に記載の方法、または請求項２１〜２８もしくは３５〜３６のいずれか１項に記載の使用。
  57. 前記目的の遺伝子がＭＡＦである、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記目的の遺伝子がＶＡＴ１Ｌである、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記目的の遺伝子がＣＬＥＣ３Ａである、請求項５６に記載の方法。
  60. 前記目的の遺伝子がＷＷＯＸである、請求項５６に記載の方法。
  61. 前記目的の遺伝子が５ｓＲＮＡである、請求項５６に記載の方法。
  62. 前記目的の遺伝子がＭＡＦ、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＷＷＯＸ、または５ｓＲＮＡである、請求項２９または３８〜４０のいずれか１項に記載のキット。
  63. 前記目的の遺伝子がＭＡＦである、請求項６２に記載のキット。
  64. 前記目的の遺伝子がＶＡＴ１Ｌである、請求項６２に記載のキット。
  65. 前記目的の遺伝子がＣＬＥＣ３Ａである、請求項６２に記載のキット。
  66. 前記目的の遺伝子がＷＷＯＸである、請求項６２に記載のキット。
  67. 前記目的の遺伝子が５ｓＲＮＡである、請求項６２に記載のキット。
  68. 前記がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、甲状腺がん、または腎細胞癌腫である、請求項１〜２０、３０〜３４、３７および４１〜５５のいずれか１項に記載の方法、または請求項２１〜２８および３５〜３６に記載の使用。
  69. 前記がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、甲状腺がん、または腎細胞癌腫である、請求項２９または３８〜４０のいずれかに記載のキット。
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