JP2016514701A - スルホラファン／スルホラファン前駆体およびフィトステロール／フィトスタノール組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は結合組織などに関連する疾患に有効な薬剤組成物を提供することである。【解決手段】本発明によれば、スルホラファン前駆体、スルホラファン前駆体をスルホラファンに変換し得る酵素、酵素増強剤およびフィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそのエステルの組合せが提供される。更に、本発明によれば、スルホラファン又はその誘導体およびフィトステロール、フィトスタノール又はそのエステルの組合せが提供される。更に、本発明によれば、ブロッコリーエキス又は粉末およびフィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそのエステルの組合せが提供される。本発明によれば、これらの組合せに関連する組成物および方法が提供される。【選択図】図１

Description

関連出願に対する相互参照

本特許出願は米国仮特許出願No.61/794,417(2013年3月15日出願に基づく優先権を主張するものであり、その全体が参照としてここに組み込まれている。

本発明はスルホラファン前駆体（sulforaphane precursor）、スルホラファン前駆体をスルホラファンに変換し得る酵素、酵素増強剤およびフィトステロール（phytosterol）及び／又はフィトスタノール（phytostanol）又はそのエステルの組合せに関する。本発明は更に、スルホラファン又はその誘導体およびフィトステロール、フィトスタノール又はそのエステルの組合せに関する。本発明は更に、ブロッコリーエキス又は粉末およびフィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそのエステルの組合せに関する。本発明はこれらの組合せに関連する組成物および方法を提供するものである。

結合組織は、関節接合部における軟骨、骨、滑膜、靭帯，半月板および腱の構造骨格である。結合組織の成分は定住細胞により作られ、ついで分泌されてこの組織の特徴である細胞外基質（ECM）を形成する。ECMは結合組織として利用されるだけでなく、細胞の伝達および機能において重要な役割を果たしている。関節軟骨において、軟骨細胞はタイプIIコラーゲンECM骨格内で特徴的パターンを以って整合している。骨形成骨芽細胞および骨細胞並びに骨吸収性破骨細胞は石化タイプIコラーゲンECMに組織化される。滑膜内における僅かな線維芽様およびマクロファージ様細胞もECMにより所定の場所に保持される。同様に、腱細胞および靭帯細胞はECM内にて一緒に組立てられる。結合組織ECMの合成および分解は調節分子のネットワークにより制御され、この調節分子も定住組織細胞により作られる。このネットワークには、成長因子および前（プロ）炎症性媒体（pro-inflammatory mediators）として知られる分子の広い配列が含まれる。これらには、サイトカイン、ケモカイン、プロスタグランジンおよび酸化窒素が含まれる。これらの分子は、多くの生物学的活性を示す。それらには細胞増殖又は細胞死が含まれる。更に、これらの物質はECM生産のための同化経路を誘起させたり、ECMを破壊する分解酵素を誘起させたりすることができる。生理学的条件下において、細胞の生存又は死、結合組織ECMの生産又は分解は、バランスのとれた恒常性（ホメオスタシス）を維持するため厳密に制御されている。調節分子の生産および機能は、機械的力、物理的力を含む多くのファクター、例えば温度、pH、化学物質、微生物およびそれらの生産物により調節されている。或る条件下において、これらのファクターは、過剰、かつ、タイムリーでない調節分子の生産を惹起させることがあり、それが修復できない組織の損傷、機能の損失および死につながる。

組織は、炎症反応による機械的、物理的、化学的侵襲および感染に対し反応する。この炎症プロセスは、回復、治癒、感染に対する防御に導かれることが知られており、これは通常、生命維持に向けられる。ヒトおよび動物における炎症反応は２つの段階からなっている。最初の段階は、プロスタグランジンおよびロイコトリエンなどの前炎症性媒体の局所的合成により特徴づけられる。これらはシクロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼの作用からのアラキドン酸から導出される。これらの前炎症性媒体は局所的血液流を増加させ、内皮細胞の浸透性を高め、白血球の補充および蓄積を可能にする。後に作られる他の前炎症性媒体としては、サイトカイン（IL-1β、TNF-α）、ケモカイン（IL-8）および酸化窒素が含まれる。第2の段階、つまり回復期において、最初の段階で発生したプロスタグランジンが酵素経路を活性化させ、それに沿って、アラキドン酸が抗炎症性を有する化学伝達物質に変換される。プロスタグランジンE₂(PG E₂)が15-リポキシゲナーゼの発現を活性化させ、それによりアラキドン酸から抗炎症性リポキシンを発生させることが報告されている。このように、この炎症促進反応により炎症からの回復が駆動されるのである。研究によれば、炎症プロセスの開始、進行および終了は厳密に制御されることが明らかになっている。長引き誇張された炎症は多くの障害に関連している。例えば変形性関節症（OA）、関節リウマチ（RA）、アルツハイマー病、循環器疾患、更に癌などの障害である。

関節組織においては、軟骨細胞、滑膜細胞、骨芽細胞、破骨細胞、靭帯細胞および腱細胞が、広範な前炎症性媒体を作り出す。これらの内でプロスタグランジンE₂(PGE₂)がある。これは、サイトカイン、酸化窒素および結合組織劣化基質メタロプロティナーゼ(MMP)酵素を含む他の媒体の生産を誘発させることにより規制的役割を果たすことが知られている。MMPsを誘発させる能力のため、PGE₂は軟骨ECMの分解に寄与する。加えて、PGE_２は骨吸収および骨棘形成を促進する。PGE_２は末梢神経末端の侵害受容体を感作し、それにより炎症性痛覚の発展に寄与する。PGE₂レベルは、誘導性シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)酵素、軟骨およびプロテオグリカン分解を抑制する軟骨細胞内の酸化窒素合成酵素により局所的に規制される。変形性関節症などの病的状態において、COX-2発現は、PGE₂生産の同時的増加を以って上方調節（アップレギュレート）される。

この炎症プロセスにおける他の組織の役割についても十分に確立されている。滑膜の炎症は変形性関節症における軟骨分解のカギとなる事象（特にこの疾患の初期の段階において）であることが今日、認識されている。滑膜炎は、滑膜中の定住マクロファージ様細胞および線維芽様細胞の活性化により特徴づけられ、この活性化は、TNF-アルファ、IL-ベータおよびPGE₂を含む前炎症性媒体の過剰の生産につながる。最近の証拠によれば、滑膜マクロファージが変形性関節症の初期の段階でのサイトカインの主な資源であり、これがこの疾患の進行全体を通して変形性関節症における軟骨損傷に対する重要な寄与物質であることが示唆されている。サイトカインは更にPGE₂および活性MMPsの生産を誘起させる。これらの媒体はECMの破壊と修復との間のバランスを制御することが今日、広く受け入れられており、そのことにより、これらの分子が治療的介入のための好ましい標的となっている。関節における他の組織、例えば軟骨下骨も、関節の健康を調節する前炎症性媒体を生産する。

サイトカインおよびプロスタグランジンなどの前炎症性媒体に加えて、反応性酸素種（ROS）も変形性関節症に見られる関節退化に関与している。酸化窒素、過酸化水素などのROSにより誘起される酸化的ストレスは軟骨細胞アポトーシスや軟骨ECM衰弱を生じさせることが示されている。更に、ROSは信号伝達経路を活性化し、これがサイトカインおよびプロスタグランジンを含む前炎症性媒体の生産を増加させることになるとの報告がなされている。試験管内（In vitro）による研究において、ROSおよび前炎症性媒体の生産に関与する経路間のリンク機構が実証されている。これらの研究は、酸化的ストレスおよび炎症経路の双方を抑制することができる薬剤が炎症の調節に特に有用であるとする考えを支持するものである。

変形性関節症の病態生理学におけるCOX-2およびPGE₂の中心的役割は、選択的COX-2阻害剤および種々の非選択的非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤs）をこの疾患の治療のために広範に使用することにおいて反映されている。しかし、これらの薬剤の長期に亘る投与は、有害な副作用をもたらす。例えば、胃腸病態および軟骨プロテオグリカン代謝異常などの発病である。ヒトおよび動物モデルでの研究では、COX阻害剤の使用により損傷した骨の治癒および修復が実証されている。従って、PGE₂および他の前炎症性媒体の生産を抑制するためにＮＳＡＩＤsの使用を中心とすることのない炎症管理のための別の治療法の必要性が存在する。

天然産物の使用が、ヒトおよび愛玩動物においてますますポピュラーになっている。これら天然産物の多くは化学的保護薬として有用であり、その多くは心臓血管の健康及び／又は関節の健康、特に炎症の管理において有用である。天然産物の或るものは、健康補助食品、栄養補助食品、医療食中に組み込まれている。

天然産物の使用を介しての化学的保護は、ヒトおよび家畜に影響する多くの疾患の発生を防止ないし減少させるための安全で、効果的で、安価で、簡単にアクセスでき、かつ、実際的な手段として進化している。分子レベルで細胞を損傷させる発がん性物質はしばしば、非毒性前駆物質として摂取されたり、吸入されている。これらの非毒性前駆物質は、ついで体内にて発がん性物質に変換されることになる。解毒酵素又はその補因子を活性化させる天然産物などの化学的保護薬は、中和作用を示し、発がん性物質の排除を可能にする。これらの同じ天然産物が免疫システムなどの他の自然に存在する防御作用の強化に寄与することができる。

或る種の天然産物は抗酸化活性を有する。酸化ストレスは、老化、神経変性疾患の進行並びに生理学的傷害例えば虚血において主たる役割を果たす。抗酸化剤は重要な生体分子の酸化を減少ないし抑制することができ、がん、冠状動脈性心臓病、脳卒中、神経変性疾患の発病の治療、防止又は減少において役割を果たすことができる。アルツハイマー病、認知症および脳卒中は酸化ストレスにより影響を受けた疾患の例である。

化学的保護および抗酸化特性を示すと考えられている天然産物はスルホラファンである。スルホラファンは有機硫黄化合物であり、１-イソチオシアナート-4-メチルスルフィニルブタンとしても知られている。スルホラファン前駆体、グルコラファニンはアブラナ科（Brassicaceae）（例えば、ブロッコリー、ブリュッセルもやし、キャベツ）の植物から得ることができる。しかし、化学的予防のために適するレベルを得るには、おびただしい量の植物が消費されなければならない。グルコラファニンは、ミロシナーゼと呼ばれるチオグルコシダーゼ酵素によりスルホラファンに変換される。これはアブラナ科植物などの種々の外因性供給源において、並びに腸内ミクロフローラ内にて生じる。しかし、グルコラファニンを摂取した際に、全ての動物がスルホラファンへの変換を達成することができるというものではない。殆んどの場合、その理由はミクロフローラの数および全体的健康に相違があるからである。加えて、胃などの酸性的環境においてグルコラファニンは不活性代謝物に変換されることがあるからである。この活性代謝物、スルホラファンは核因子、エリスロイド-2-関連因子（Nrf2）を誘発させることができ、これが次には、フェーズII解毒酵素および細胞保護酵素（例えば、グルタチオンS-転移酵素、NAD(P)H：キニーネ酸化還元酵素（NQO1）およびヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)）の生産を上方調整させる。スルホラファンは、P-450チトクローム酵素の合成を有意に変更させることなく、これらの酵素の生産を誘発させるものと思われている。フェーズII酵素の上方調整は種々の生物学的活性において役割を果たすものと考えられている。例えば、細胞毒性からの脳の保護、脂肪蓄積の毒性作用からの肝臓の保護、種々の他の組織の解毒などである。

スルホラファンおよびその前駆体グルコラファニンは広く研究されてきた。Shapiroら（Nutrition and Cancer, (2006), Vol. 55(1), pp.53-62）は、ブロッコリー芽、グルコシノレートおよびイソチオシアネートの安全性、耐性および代謝を確認する臨床フェーズI試験について論じている。Shapiroらは、グルコシノレート（例えばグルコラファニン）若しくはイソチオシアネート（例えばスルホラファン）を含有するスプラウトエキスの健康なヒト被験者におけるプラセボ対照試験、ダブルブラインド試験および無作為試験について論じている。この研究により、これらの物質の投与が全身的、臨床上かなりの有害作用をもたらすものでなかったことが見出されている。

時には、それぞれ植物ステロールおよび植物スタノールとも呼ばれているフィトステロールおよびフィトスタノールは、植物に典型的に見られる一群の化合物である。フィトステロールおよびフィトスタノールは、構造的にコレステロールと似ているが、側鎖の構造が異なっている。フィトステロールおよびフィトスタノールの双方とも、一般的にステロイド骨格からなり、ヒドロキシル基がAリングのC-3原子に結合し、脂肪族側鎖がDリングのC-17原子に結合している。フィトステロールは二重結合を一般にステロール部分のC-5とC-6との間に有している。フィトスタノールにおいては、この二重結合は飽和されている。

フィトステロールおよびフィトスタノールは有益な健康効果を有することが知られている。例えば、フィトステロールおよびフィトスタノールは、血清コレステロールレベル、特に総コレステロールおよびLDLコレステロールレベルを低下させるのに有効であると考えられている。このコレステロール低下効果に関連する作用のメカニズムについては十分に理解されていないが、フィトステロールおよびフィトスタノールは、消化管からのコレステロールの吸収を減少させるのに効果的であると考えられている。

フィトステロールおよびフィトスタノールは更に、有益な免疫調節特性を有することが知られている。Bouicら（“Plant Sterols and Sterolins: A Review of Their Immune-Modulating Properties”Alternative Medicine Review, 1999, Vol.4(3), pp.170-177）は、β-シトステロール（BSS）およびそのグリコシド（β-シトステロールグリコシド又はBSSG）の保護作用を評価する研究について論じている。特に、この研究は、BSSとBSSGとの混合物が抗炎症作用、抗腫瘍作用、解熱作用および免疫調節作用を呈することを示している。これは恐らく、特定のT-ヘルパーリンパ球（T_H1およびT_H2細胞）を標的にし、それらの機能を正常化するその働きを介してのものであり、その結果、T-リンパ球およびナチュラルキラー細胞活性の改善がもたらされる。BSSおよびBSSGは更に、過活性抗体反応を減衰させると共にDHEA:コルチゾール比の正常化およびインターロイキン-６（IL-6）血清レベルの低下をもたらす作用を有するものと考えられている。Gabayら（“Stigmasterol: a phytosterol with potential anti-osteoarthritic properties”Osteoarthritis and Cartilage, 2010, Vol.18, pp.106-116）は、炎症媒体および軟骨細胞により生産されたメタロプロテイナーゼに対するスチグマステロールの作用についての研究を論じている。この研究は、スチグマステロールが、一般的に変形性関節症誘発軟骨退化に関連する幾つかの前炎症性および基質退化媒体（MMP-3, MMP-13, ADAMTS-4, PGE₂）を抑制すること(少なくとも部分的に反作用的IL-1β-誘発NF-kB経路を介して)を示している。

200を超えるフィトステロールおよび関連化合物が認識されている。フィトステロールおよびフィトスタノールの例としては非制限的に、シトステロール（3β-stigmast-5-en-3-ol, CASナンバー83-46-5）、シトスタノール（3β,5α-stigmast-3-ol, CASナンバー83-45-4）、カンペステロール（3β-ergost-5-en-3-ol, CASナンバー474-62-4）、カンペスタノール（3β,5α-ergostan-3-ol, CASナンバー474-60-2）、スチグマステロール（3β-stigmasta-5,22-dien-3-ol, CASナンバー83-48-7）、ブラシカステロール（3β-ergosta-5,22,-dien-3-ol, CASナンバー474-67-9）などが含まれる。

商業製品としての使用のため、フィトステロールは一般に植物油（例えば、大豆油、菜種（キャノーラ）油、サフラワー油、綿実油、ひまわり油、コーン油、“タール油”（これは木材パルプの製造の際の副産物））から単離される。ついで、フィトステロールは水素添加されフィトスタノールが得られる。遊離フィトステロールおよびフィトスタノールは一般に高融点粉体であり、これらは水に不溶で、油中では比較的可溶性であり、アルコール中では可溶である。フィトステロールおよびフィトスタノールの双方は、例えば植物油源の脂肪酸でエステル化することができ、その結果得られるエステルは液状又は半液状物質である。フィトステロールエステルおよびフィトスタノールエステルは一般に、食用油脂と同等の化学的および物理的特性を有すると考えられている。従って、種々の加工食品をフィトステロールエステルおよびフィトスタノールエステルで補充することが可能となる。フィトステロール、フィトスタノール、それらのエステルおよびその製造方法については、米国特許No.5,892,068; 米国特許No.7,771,771; 米国特許出願公報No.2003/0104035; 米国特許No.8,338,564およびCantrillら（Phytosterols, Phytostanols and their Esters (CTA) 2008）に記載されている。これら文献の夫々はその全体が参照としてここに組み込まれるものとする。

追加成分は関節の健康および炎症にとって何らかの有益作用を有すると考えられている。グルコサミンはアミノ糖の１例であり、体内でグルコースから自然に形成される。外因的に供給されたとき、グルコサミンは結合組織細胞の合成を刺激し、正常な細胞外基質の量を増加させる。グルコサミンは更に、軟骨および他の結合組織におけるグルコサミノグリカン（“GAGｓ”）のための構築用ブロックとなる。従って、追加のグルコサミンを供給することは、結合組織における基質合成のための余分の原料を体内に供給することになる。アミノ糖は天然のもの、合成のもの、又は半合成的に得られるものであってもよい。グルコサミンの塩としては、非限定的に、グルコサミン塩酸塩、グルコサミン硫酸塩、グルコサミン燐酸塩が含まれる。マンノサミンおよびN-アセチルグルコサミンはアミノ糖の他の例である。アミノ糖は、例えばエステル化、硫酸化、ポリ硫酸化、アセチル化、メチル化により化学的に変性することができる。

コンドロイチンは記載のようにグルコサミノグリカン（GAG）の１例である。コンドロイチンスルフェートは関節軟骨中の最も豊富なグルコサミノグリカンであり、体内の多くの他の結合組織内にも存在する。更に、コンドロイチンスルフェートは、異常で過度の炎症の症状のもとで、結合組織を分解する分解酵素を競合的に抑制する。コンドロイチンスルフェートは、グルクロン酸と硫酸化ガラクトサミンとの繰返し単位からなるポリマーである。[Lester M. Morrison, M.D. and O. Arne Schjeide, Ph.D., Coronary Heart Disease and the Mucopolysaccharides (Glycosaminoglycans) 12 (1974); Philip C. Champe and Richard A. Harvey, Lippincott’s Illustrated Reviews; Biochemistry, 148-50 (2^nded. 1994)

アボガド/大豆不鹸化物（ASU）が変形性関節症および他の形の関節炎の治療[Thiers, M.H.,“Unsaponifiable constituents of avocado and soya oils. Treatment of certain forms of arthralgia”J.Med.Lyon 53(222):195−8(2月1972)（フランス語の記事）]ならびに軟部組織炎症の治療[Trevoux, R., “Unsaponifiable fractions of the avocado and soybean in gynecology”, J. Bynecol. Obstet. Biol. Reprod. 6(1):99−105(1月1977) （フランス語の記事）；Lamaud, M.E.ら、“Biochemical modifications of connective tissue induced by the non-saponifiables of avocado and soy−bean oils administered percutaneously in the ‘hairless’rat”Pathol. Biol.26(5):269-74(5-6月1978) （フランス語の記事）]に使用されている。この化合物の作用のメカニズムは、TGF(形質変換成長因子)ベータ１、TGFベータ２およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（“PAI-1”）の軟骨細胞発現を刺激することである。PAI-1を増加させることにより、ASUがメタロプロティナーゼ活性化につながるカスケードをブロックすることになる[Boumediene Kら. “Avocado/soya unsaponifiables enhance the expression of transforming growth factor beta 1 and beta 2 in cultured articular chondrocytes”Arthritis Rheum, 42(1); 148-56(1月1999)]。ASU混合物も又、軟骨細胞によるストロメリシン、IL-6、IL-8およびプロスタグランジンE2の自然産生を減少させると考えられている。更に、ASUはIL-1の作用を減少させ、それによりコラゲナーゼの軟骨細胞および滑膜細胞産生を減少させる。[Henrotin, Y.E.ら、“Effects of three avocado/soybean unsaponifiable mixtures on metalloproteinases, cytokines and prostaglandin E2 production by human articular chondrocytes”Clin. Rheumatol, 17(1); 31−9(1998)]

ボスウェリアコナラのゴム樹脂(伝統的アユルベーダ医薬)は２種のボスウェル酸（11-ケト-β-ボスウェル酸（KBA）およびアセチル-11-ケト-β-ボスウェル酸（AKBA））を含有している。Abdel１−Tawabらは、β-ボスウェル酸が炎症関連酵素であるミクロソームプロスタグランジンEシンターゼ-1およびセリンプロテアーゼカテプシンGを抑制し、それによりこれらのボスウェル酸が抗炎症特性を有し、関節の健康栄養補助食品の成分として好適なものとなるであろうと報告している[Clin Pharmacokinet 2011; 50(6); 349−369]。

緑茶は、エピカテキン（EC）、エピガロカテキン（EGC）、エピカテキン没食子酸塩（ECG）およびエピガロカテキン没食子酸塩（EGCG）を含むカテキン類の混合物を含有している。これらのカテキン類は強力な抗酸化活性を有し、細胞の損傷に関与する遊離ラジカル（ROSおよびRNS）のスカベンジャーとして作用する。これらは更に、ROSの生産に対し触媒作用する金属をキレート化するよう働く（１）。この抗酸化活性は、DJDを生じさせるフィブロネクチンフラグメント（Fn-f）やサイトカインなどの薬剤の損傷作用と干渉すると思われる。抗酸化剤は、サイトカインIL-1およびTNF-aの双方の発現および活性の増大を含むFn-fの作用をブロックする（２，３）。加えて、最近の研究によれば、緑茶のポリフェノールが、マウスにおけるコラーゲン誘発関節炎（TNF-aおよびシクロオキシゲナーゼ２の発現減少並びにプロスタグランジンE2の生産に対し触媒作用するTNF-a規制酵素に関連したもの）の発生率を有意に減少させることが示されている（４）。別の研究として、緑茶中のEGCGが、IL-1誘発による酸化窒素合成酵素の発現および酸化窒素生産を抑制し、核因子-kBの活性化（サイトカイン作用の開始における重要なステップ）を抑えることが示されている（５）。更に、緑茶中のカテキン類が、軟骨プロテオグリカンの破損の初期段階に関与することが知られているアグリカナーゼの活性を協力に抑制することが最近、示されている（６）。緑茶の成分は、多重のメカニズムを介してDJDの原因および兆候を改善する可能性を有している。この緑茶はエキスとして投与するか、あるいはポリフェノール又はカテキンに規格化してもよい。

メチルスルホニルメタン（MSM）（DMSO₂、メチルスルホンおよびジメチルスルホンとしても知られている）は有機硫黄化合物である。MSMは硫黄を提供し、これがたんぱく質により潜在的に使用されてジスルフィド結合を形成すると考えられている。GAGｓは、硫黄の使用によってこれらのジスルフィド結合を介して一緒に架橋される。これらの結合はGAG鎖の配座柔軟性を減少させ、軟骨を堅固にさせ、弾力性を持たせる。

ヒアルロン酸（HA）は高分子量多糖類であり、全ての身体組織および体液に分布しており、これは関節軟骨の細胞外基質の１つの成分である。HAの粘弾性は滑液内の関節力学において重要な役割を果たしている。HAがアグリカンに結合したとき、負に帯電された大きな凝集体が形成され、これが水分子を吸引し関節にクッションを付与するのを助ける。外因性HAは抗炎症作用、同化作用、鎮痛作用、軟骨保護作用を有する[Sports Health. Mar 2013; 5(2): 153-159]。

リポ酸（LA）（1,2ジチオラン-３-ペンタン酸、1,2-ジチオラン-３-吉草酸又は6,8-チオクト酸としても知られている）は天然存在の有効な低分子抗酸化剤である。リポ酸はミトコンドリア内でオクタン酸から酵素的に合成される。これはミトコンドリアの脱炭酸反応の重要な補因子であり、適切なATP生産のために不可欠のものである。リポ酸は鏡像異性形態（R-リポ酸（R-LA）およびS-リポ酸（S-LA））で存在する。生物系において、R-LAのみがアミド結合内のリジン残基に共役している。酸化（LA）形および還元（DHLA）形が有効な酸化還元対を表わしている。LAの生物学的作用としては、反応性酸素種の除去、グルタチオンおよびビタミンEなどの内因性抗酸化剤の再生、金属イオンのキレート化、巨大分子の酸化的損傷の修復などが含まれる。LAおよびDHLAの双方とも、反応性酸素種（ROS）および反応性窒素種（RNS）を除去することができ、タンパク質カルボニルの形成を防止する能力を有する。LAおよびDHLAは、他の内因性抗酸化剤（ビタミンC、ビタミンEおよびグルタチオンなど）を再生させることができ、それにより細胞を酸化性ストレスから保護することができる。最近の証拠によれば、LAは真のオキシダント除去剤（スカベンジャー）として作用するだけでなく、加えて、細胞ストレス応答経路の活性化因子として作用することが示唆されている。リポ酸の誘導体が当該分野で知られている。リポ酸の誘導体の或るものは、改善された生物学的活性、改善された薬物動態学的特性（より長い半減期など）、改善された生物学的利用能、低減された薬物相互作用プロフィールを提供することができる。リポ酸の誘導体については以下の文献に記載されている。なお、これらは参照としてここに組み込まれるものとする。Gruzmanらによる「Synthesis and characterization of new and potent alpha-lipoic acid derivatives; Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2004, 12:1183-1190」；Melagrakiらによる「Synthesis and evaluation of the antioxidant and anti−inflammatory activity of novel coumarin−3−aminoamides and their alpha-lipoic acid adducts; European Journal of Medicinal Chemistry, 2009, 44:3020-3026」；Gurkanらによる「Syntheses of novel indole lipoic acid derivatives and their antioxidant effects on lipid peroxidation; Archiv der Pharmazie, 2005, 338:67-73」；Ortialらによる「Fluorinated amphiphilic amino acid derivatives as antioxidant carriers: a new class of protective agents; J. Med Chem, 2006, 12-2820」；およびKoufakiらによる「Sign and synthesis of antioxidant alpha-lipoic acid hybrids; Methods Mol Biol, 2010, 594:297-309」。

ホウ素は環境中に天然に見られる非金属元素である。ホウ素サプリメント投与は関節痛並びに不快感を軽減させることが見出されている。疫学的研究により、関節炎を患っているヒトからの大腿骨頭、骨および滑液中のホウ素濃度は、それを患っていないヒトからのものと比較して低いという分析的証拠が見出された。更に、世界でホウ素の通常の摂取が1.0mg以下/日である地域においては関節炎の推定発生率が20ないし70％に達し、他方、ホウ素の通常の摂取が3ないし10mg/日である地域においては関節炎の推定発生率が0ないし10％であることが見出された[Environ Health Perspect. 1994 Nov; 102 Suppl 7:83-5]。

コラーゲンタイプIIもまた、同化と異化との間の正常なバランスを維持するのを助けるという有益な作用を有する。具体的には、結合組織疾患は自己免疫プロセスからもたらされることがある。この場合、免疫システムが、あたかも“外部侵略者”が存在するかの如く、個人自身の結合組織を攻撃し、異化してしまう。コラーゲンタイプIIの経口投与は免疫システムを脱感作することができ、個人における免疫応答への更なる攻撃を防止すると共に免疫応答を正常化させる。これは結合組織における異化プロセスを減少させ、同化を最大化させる。コラーゲンタイプIIの摂取は、その分子を腸管関連リンパ組織（GALT, 別名 パイエル板））内の免疫細胞へと提供するものとなる。コラーゲン分子とGALT内の特定細胞との間の相互作用は、サプレッサーＴ細胞と呼ばれるモバイル免疫細胞を活性化するものとなる。翻って、これらの細胞は、個人自身のコラーゲンタイプII（結合組織内の）に対する破壊的免疫反応を和らげるものとなる。

レスベラトロルはスチルベノイドであり、これはストレスおよび細菌又は真菌感染の間に、ぶどう内およびイタドリの根内に一般に見られる。マウスおよびラットでの実験において、レスベラトロルは、テロメアの延長、テロメラーゼの活性化向上、血糖低下、血小板凝集の抑制、NOの生産を高めることによる血管拡張の促進などにおいて役割を果たし、抗炎症特性を有することが示されている。

没食子酸はトリヒドロキシ安息香酸であり、没食子、ウルシ、マンサク、茶葉およびオーク樹皮に天然的に生じる。研究によれば、没食子酸は抗酸化特性、プロアポトーシス特性および抗炎症特性を有することが示されている。

オメガ-3脂肪酸は、体内では天然に産生されないALA、DHAおよびEPAを含む必須脂肪酸であり、従って、一般的には魚を食べることにより食事で消費される必要がある。研究によれば、オメガ-3脂肪酸は、トリグリセリド類および血圧を低下させる助けとして効果的であることが実証されている。別の研究によれば、オメガ-3脂肪酸は、血管系および関節において抗炎症作用を有すると示されている。

オキアミ油は、オメガ-3脂肪酸、エイコサペンタエン酸（EPA）およびドコサヘキサエン酸（DHA）並びに抗酸化剤アスタキサンチンを多く含んでいる。オキアミ油は、抗酸化特性を有し、コレステロールを低下させ、C-反応性タンパク質（Reactive Protein）（心臓病リスクの増大と関連する炎症マーカー）を低下させることが示されている。研究によれば更に、抗炎症作用およびリウマチおよび変形性関節症と関連する苦痛および硬直の低減が明らかになっている。

S-アデノシルメチオニン（SAMe）は重要な内因性化合物であり、体全体に存在し、硫黄転移反応など多くの生物学的反応に関与している。その役割として、これはプロテインおよびプロテオグリカンなどの結合組織の多くの構造成分の合成において重要な反応物質である。すなわち、SAMeは重要な同化作用を有し、これは他の同化剤の作用を向上させる。SAMeは更に、その抗酸化作用により抗炎症作用を示す。SAMeの主なCNS機能は、神経伝達物質やリン脂質などの種々の重要な化合物を合成する反応においてメチル基を供与することである。例えば、SAMeはホスファチジルエタノールアミンをホスファチジルコリンに変換するのを容易にする。このホスファチジルコリンは原形質膜の内部脂質層の一部を形成するものである。そうすることにより、SAMeは膜流動性を増加させ、レセプター/リガンド結合の有効性を向上させることができる。[Champe and Harvey, Biochemistry, 1994; Stramentinoli, G., “Pharmacologic Aspects of S-Adenosylmethionine”American J. Med., 83(5A):35 (1987); Baldessarini, F., “Neuropharmacology of S-Adenosyl Methionine” American J. Med., 83(5A):95 (1987); Camey, M., “Neuropharmacology of S-Adenosyl Methionine” Clin. Neuropharmacol., 9(3):235 (1986); Janicak, P.,“S-Adenosylmethionine in Depression” Alabama J. Med. Sci. 25(3):306 (1988)]。これらの機能は他のメチル供与体、例えばベタイン（トリメチルグリシン）、5-メチルテトラヒドロフォレート、葉酸、ジメチルグリシンにも属するものである。[Champe and Harvey, Biochemistry, 1994]

シリマリンおよびシリマリンの活性成分は幾つかの作用のメカニズムを有する。例えば、核小体のポリメラーゼAの刺激である。この刺激は翻ってリボソーム活性を増大させ、それにより細胞タンパク質の合成の増大および肝細胞修復速度の増加がもたらされる[Conti, M., ら、Protective activity of Silipide on liver damage in rodents, Japan J. Pharmacol., 60, 1992, pp.315-21]。他の保護メカニズムは、肝細胞膜の分子構造の変化が関連し、細胞への毒素の結合および侵入を減少させること、並びに抗酸化作用である[Parish, R. & Doering, P., Treatment of Amanita mushroom poisoning: a review, Vet. Hum. Toxocol., 28(4) 1986, pp.318-22]。

ビタミンK2(メナキノンとしても知られている)は、メナキノン-4(MK-4)、メナキノン-5(MK-5)、メナキノン-6 (MK-6)、メナキノン-7(MK-7)、メナキノン-8(MK-8)、メナキノン-9(MK-9)、メナキノン-10 (MK-10)、メナキノン-11(MK-11)およびフィロキノンの形態で提供される。フィロキノンは緑葉野菜などの植物源から得ることができ、血漿内での半減期は短い。しかし、これは内皮、精巣およびすい臓によりメナキノン-4(MK-4)に変換される。更に、これは腸内細菌によっても合成され、チーズ内でも見出すことができる。

ヨーロッパ特許出願No.2 213 280には、グルコラファニンのようなグルコシノレートおよびミロシナーゼを有してなる製剤が開示されており、この製剤はカプセル化ないしコーティングされている。

ここに引用されている全ての参照文献は、その全体が参照として組み込まれるものである。

米国特許No.5,892,068 米国特許No.7,771,771 米国特許出願公報No.2003/0104035 米国特許No.8,338,564 ヨーロッパ特許出願No.2 213 280 米国特許No.5,411,986 米国特許No.5,725,895 米国特許No.5,968,505 米国特許No.5,968,567 米国特許No.6,177,122 米国特許No.6,242,018 米国特許No.6,521,818 米国特許No.8,124,135

Shapiro et al.（Nutrition and Cancer, (2006), Vol. 55(1), pp.53-62） Bouic et al.（"Plant Sterols and Sterolins: A Review of Their Immune-Modulating Properties" Alternative Medicine Review, 1999, Vol.4(3), pp.170-177） Gabay et al.（"Stigmasterol: a phytosterol with potential anti-osteoarthritic properties" Osteoarthritis and Cartilage, 2010, Vol.18, pp.106-116） Cantrill et al.（Phytosterols, Phytostanols and their Esters (CTA) 2008） Lester M. Morrison, M.D. and O. Arne Schjeide, Ph.D., Coronary Heart Disease and the Mucopolysaccharides (Glycosaminoglycans) 12 (1974) Philip C. Champe and Richard A. Harvey, Lippincott’s Illustrated Reviews: Biochemistry, 148−50 (2nded. 1994) Thiers, M.H., "Unsaponifiable constituents of avocado and soya oils. Treatment of certain forms of arthralgia"J.Med.Lyon 53(222):195-8 (February 1972)（article in French） Trevoux, R., "Unsaponifiable fractions of the avocado and soybean in gynecology," J. Bynecol. Obstet. Biol. Reprod. 6(1):99-105 (January 1977) （article in French） Lamaud, M.E.et al., "Biochemical modifications of connective tissue induced by the non-saponifiables of avocado and soy-bean oils administered percutaneously in the ‘hairless’rat,"Pathol. Biol.26(5):269-74(May-June 1978) （article in French） Boumediene K., et al.,"Avocado/soya unsaponifiables enhance the expression of transforming growth factor beta 1 and beta 2 in cultured articular chondrocytes"Arthritis Rheum, 42(1); 148-56(January 1999) Henrotin, Y.E., et al.,"Effects of three avocado/soybean unsaponifiable mixtures on metalloproteinases, cytokines and prostaglandin E2 production by human articular chondrocytes"Clin. Rheumatol. 17(1): 31-9(1998) Clin Pharmacokinet 2011; 50(6); 349-369 Sports Health. Mar 2013; 5(2): 153-159 Gruzman et al.「Synthesis and characterization of new and potent alpha-lipoic acid derivatives; Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2004, 12:1183-1190」 Melagraki et al.「Synthesis and evaluation of the antioxidant and anti-inflammatory activity of novel coumarin-3-aminoamides and their alpha-lipoic acid adducts; European Journal of Medicinal Chemistry, 2009, 44:3020-3026」 Gurkan et al.「Syntheses of novel indole lipoic acid derivatives and their antioxidant effects on lipid peroxidation; Archiv der Pharmazie, 2005, 338:67-73」 Ortial et al.「Fluorinated amphiphilic amino acid derivatives as antioxidant carriers: a new class of protective agents; J. Med Chem 2006, 12-2820」 Koufaki et al.「Sign and synthesis of antioxidant alpha-lipoic acid hybrids; Methods Mol Biol, 2010, 594:297-309」 Environ Health Perspect. 1994 Nov; 102 Suppl 7:83-5 Champe and Harvey, Biochemistry, 1994 Stramentinoli, G., "Pharmacologic Aspects of S-Adenosylmethionine,"American J. Med., 83(5A):35 (1987) Baldessarini, F., "Neuropharmacology of S-Adenosyl Methionine," American J. Med., 83(5A):95 (1987) Camey, M., "Neuropharmacology of S-Adenosyl Methionine," Clin. Neuropharmacol., 9(3):235 (1986) Janicak, P.,"S-Adenosylmethionine in Depression" Alabama J. Med. Sci. 25(3):306 (1988) Champe and Harvey, Biochemistry, 1994 Conti, M., et al., Protective activity of Silipide on liver damage in rodents, Japan J. Pharmacol., 60, 1992, pp.315-21 Parish, R. & Doering, P., Treatment of Amanita mushroom poisoning: a review, Vet. Hum, Toxocol., 28(4) 1986, pp.318-22 Hu et al., Eur J Med Chem, 2013, 64:529-539 Ahn et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(21):9590-9595 Morimistu et al., J. Biol. Chem, 2002, 277:3456-3463 Baird et al., Arch Toxicol, 2011, 85(4):241-272

本発明は、(i) スルホラファン前駆体、好ましくはグルコラファニン；(ii) スルホラファン前駆体をスルホラファンに変換できる酵素、好ましくはグルコシダーゼ酵素、より好ましくはチオグルコシダーゼ酵素、最も好ましくはミロシナーゼ酵素；(iii)酵素増強剤、好ましくはアスコルビン酸;および(iv) フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステルを具備してなる組成物を提供するものである。更に本発明は、(i)スルホラファン又はその誘導体および(ii)フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステルを具備してなる組成物を提供するものである。本発明は更に、(i)ブロッコリーエキス又は粉末および(ii)フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステルを具備してなる組成物を提供するものである。

本発明は更に、本出願に記載された組成物の１又はそれ以上の組合せを投与することを具備してなる方法を提供するものである。本発明は、被験者における結合組織、肝臓、前立腺、脳、脊髄、肺、腎臓、大腸、胸部、食道、すい臓、卵巣と関連する症状の治療、予防、発症の減少のための方法、及び／又はこれらに関連する病気、疾患又は損傷の二次再発の減少のための方法を提供するものであり、その方法は、本発明の組成物の１つを、必要とする被験者に投与することからなる。本発明は更に、炎症と関連する症状の治療、予防、程度の軽減、発生の減少を行なうための方法を提供するものである。本発明は更に、被験者におけるマトリクスメタロプロティナーゼ13(MMP-13)などのマトリクスメタロプロティナーゼのレベル減少又は遺伝子発現の下方制御又は減少のための方法を提供するものであり、その方法は、本発明の組成物の１つを、それを必要とする被験者に投与することからなる。本発明は更に、被験者におけるMMP-13及び／又はPGE₂の増大又は異常レベルと関連する症状又は病気の治療、予防、発症の減少、症状軽減のための方法、及び／又はこれらに関連する症状又は病気の二次再発の減少のための方法を提供するものであり、その方法は、本発明の組成物の１つを、必要とする被験者に投与することからなる。

実施例４に記載したように、アスコルビン酸なしで、グルコラファニンの変換を38℃で行なったことを示すグラフ図である。 実施例４に記載したように、アスコルビン酸濃度を関数としてグルコラファニンの変換を38℃で約10分間以内で行なったことを示すグラフ図である。 実施例４に記載したように、１mMのアスコルビン酸で、スルホラファンへの変換を38℃で30分間以内で行なったことを示すグラフ図である。 実施例５に記載したように、グルコラファニンのスルホラファンへの変換を模擬腸液内で行なったことを示すグラフ図である。 実施例６に記載した実験の結果を示すグラフ図である。 実施例７に記載した実験の結果を示すグラフ図である。

発明の詳細な説明

本発明はスルホラファン前駆体と、スルホラファン前駆体をスルホラファンに変換できる酵素と、酵素増強剤と、フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステルとの組合せに関するものである。本発明は更に、スルホラファン又はその誘導体と、フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステルとの組合せに関するものである。本発明は更に、ブロッコリーエキス又は粉末と、フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステルとの組合せ、又はこれらの混合物に関するものである。本発明は更に、フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステルを、以下の物質（つまり、スルホラファン前駆体、スルホラファン又はその誘導体、ブロッコリーエキス）の1又はそれ以上の混合物と一緒に使用することに関する。本発明はこれらの組合せに関する組成物を提供するものである。

本発明はこれらの組合せを投与することからなる方法を提供するものである。或る実施例として、この組合せは、被験者における結合組織、肝臓、前立腺、脳、脊髄、肺、腎臓、大腸、胸部、食道、すい臓、卵巣と関連する症状の治療、予防、発症の減少のための方法、及び／又はこれらに関連する病気、疾患又は損傷の二次再発の減少のために投与される。この組合せは、被験者における炎症と関連する症状の治療、予防、発病減少又は程度の軽減、症状の減少のために投与される。この組合せは、被験者におけるマトリクスメタロプロティナーゼ13(MMP-13)などのマトリクスメタロプロティナーゼ及び／又はプロスタグランジンE₂（PGE₂）のレベル減少又は遺伝子発現の下方制御又は減少のために投与される。更に、この組合せは、被験者におけるMMP-13及び／又はPGE₂の増大又は異常レベルと関連する症状又は病気の治療、予防、発症の減少、症状軽減のための方法、及び／又はこれらに関連する症状又は病気の二次再発の減少のために投与される。更に、この組合せは、体内の有害な遊離ラジカルの存在を最小化ないし減少させるのに効果的なグルタチオンのレベルを誘発させるために投与し、iNOS/NOシステムの有害な作用を抑制ないし減少させ、炎症誘発性遺伝子発現を減少させることができる。

スルホラファンは、1-イソチオシアナート-4-メチルスルフィニルブタンとしても知られている。スルホラファンの誘導体としては、非限定的に、スルホラファンのスルホキシチオカーバメート類似体、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアナート（6-HITC）および異なる側鎖及び／又はイソチオシアナート基とスルホキシド基との間に種々の長さのスペーサーを有するスルホラファン構造を有する化合物を挙げることができる。スルホラファンの誘導体の例は以下の文献に記載されている（これらは参照としてここに組み込まれるものとする）。すなわち、Huら、Eur J Med Chem, 2013, 64:529-539; Ahnら、Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(21):9590-9595; Morimistuら、J. Biol. Chem, 2002, 277:3456-3463; Bairdら、Arch Toxicol, 2011, 85(4):241-272である。

或る具体例として、この組成物はスルホラファン又はその誘導体、好ましくはスルホラファンを約1μｇないし10ｇ、好ましくは約3μｇないし5ｇ、更に好ましくは約5μｇないし1000mｇ、更に好ましくは約7μｇないし750mｇ、より好ましくは約10μｇないし500mｇ、最も好ましくは約100μｇないし100mｇ含む。或る具体例として、ヒトへの適用のための組成物はこれらを約1mｇないし20mｇ含むものとする。

或る具体例として、本発明の方法は、被験者に対しスルホラファン又はその誘導体、好ましくはスルホラファンを約1μｇないし10ｇ、好ましくは約3μｇないし約5ｇ、更に好ましくは約5μｇないし約1000mｇ、更に好ましくは約7μｇないし約750mｇ、より好ましくは約10μｇないし約500mｇ、最も好ましくは約100μｇないし約100mｇ投与することからなる。被験者がヒトである場合は、その方法は上記化合物を約1mｇないし約20mｇ投与することからなる。或る具体例においては、本発明の方法は、被験者に対しスルホラファン又はその誘導体、好ましくはスルホラファンを約0.01μｇ/kgないし約0.2ｇ/kg、好ましくは約0.05μｇ/kgないし約0.07ｇ/kg、より好ましくは約0.07μｇ/kgないし約15mｇ/kg、より好ましくは約0.1μｇ/kgないし約11mｇ/kg、最も好ましくは約0.2μｇ/kgないし約7mｇ/kg投与することからなる。被験者がヒトである或る好ましい具体例の場合、この方法は上記化合物を約2μｇ/kgないし約2mｇ/kg、さもなければ約0.01mｇ/kgないし約1mｇ/kg、さもなければ約0.1mｇ/kgないし約0.4mｇ/kg投与することからなる。上述の投与量は各用量又は1日当りの総用量を指すものである。この1日当りの総用量とは24時間の間に被験者に投与される化合物又は成分の総量を指すものである。

或る具体例においては、上記方法はスルホラファン又はその誘導体の１を超えるものを投与することからなる。或る具体例においては、上記組成物はスルホラファン又はその誘導体の１を超えるものを含むものである。例えば、上記方法又は組成物はスルホラファンおよび１又はそれ以上のその誘導体の双方、又は2種又はそれ以上の誘導体を含むものである。上記方法又は組成物がスルホラファン又はその誘導体の１を超えるものを含む或る具体例においては、上記用量は、スルホラファン又はその誘導体の夫々の量を指すか、あるいは、スルホラファン又はその誘導体の１を超えるものの総量を指すものである。

“スルホラファン前駆体”の用語は、スルホラファンを生産するのに使用することができるあらゆる化合物、物質又は材料を指すものである。好ましい具体例において、スルホラファン前駆体は、好ましくは酵素により、スルホラファンに変換ないし代謝される化合物を有してなるものである。或る好ましい具体例において、スルホラファン前駆体はグルコラファニンからなる。グルコラファニンは、4-メチルスルフィニルブチルグルコシノレートおよび1-S-[(1E)-5-(メチルスルフィニル)-N-(スルホナトキシ)ペンタニミドイル]-1-チオ-β-D-グルコピラノースとしても知られているグルコシノレートである。

或る具体例として、上記組成物は、スルホラファン前駆体、好ましくはグルコラファニンを約1μｇないし10ｇ、好ましくは約250μｇないし5ｇ、より好ましくは約500μｇないし2000mｇ、更に好ましくは約1mμｇないし750mｇ、より好ましくは約1.5mｇないし250mｇ、更に好ましくは約2mｇないし100mｇ、最も好ましくは約3mｇないし75mｇ含む。或る具体例として、ヒトへの適用のための組成物はスルホラファン前駆体、好ましくはグルコラファニンを約3.5mｇないし50mｇ含むものとする。

或る具体例として、上記方法は、被験者に対しスルホラファン前駆体、好ましくはグルコラファニンを約1μｇないし10ｇ、好ましくは約250μｇないし約5ｇ、より好ましくは約500μｇないし約2000mｇ、更に好ましくは約1mｇないし約750mｇ、更により好ましくは約1.5mｇないし約250mｇ、更により好ましくは約2mｇないし約100mｇ、最も好ましくは約3mｇないし約75mｇ投与することからなる。被験者がヒトである場合は、その方法は上記化合物を約3.5mｇないし約50mｇ投与することからなる。或る具体例においては、上記方法は、被験者に対しスルホラファン前駆体を約1μｇ/kgないし約1000mｇ/kg、好ましくは約5μｇ/kgないし約500mｇ/kg、より好ましくは約7.5μｇ/kgないし約100mｇ/kg、より好ましくは約10μｇ/kgないし約25mｇ/kg、最も好ましくは約25μｇ/kgないし約10mｇ/kg投与することからなる。被験者がヒトである場合、この方法は上記化合物を約50μｇ/kgないし約800μｇ/kg投与することからなる。上述の投与量は各用量又は1日当りの総用量を指すものである。

或る具体例においては、上記方法はスルホラファン前駆体の１を超えるものを投与することからなる。或る具体例においては、上記組成物はスルホラファン前駆体の１を超えるものを含むものである。上記方法又は組成物がスルホラファン駆動体の１を超えるものを含む或る具体例においては、上記用量は、スルホラファン駆動体の夫々の量を指すか、あるいは、スルホラファン駆動体の総量を指すものである。

スルホラファン駆動体はスルホラファンに変換ないし代謝させることができる。或る具体例においては、スルホラファン駆動体は酵素によりスルホラファンに変換される。或る具体例においては、スルホラファン駆動体をスルホラファンに変換させることのできる酵素は、グルコシダーゼ酵素、好ましくはチオグルコシダーゼ酵素、最も好ましくはミロシナーゼ酵素からなる。ミロシナーゼはチオグルコシドグルコヒドロラーゼとしても知られている。

或る具体例においては、上記組成物は上記酵素を約1pｇないし約1uｇ、好ましくは約50pｇないし約500nｇ、最も好ましくは約1nｇないし約150nｇ含む。或る具体例においては、ヒトでの使用に適した組成物は上記酵素を約5nｇないし約75nｇ含む。

或る具体例においては、上記方法は、上記酵素、好ましくはミロシナーゼを約1pｇないし約1μｇ、好ましくは約50pｇないし約500nｇ、最も好ましくは約1nｇないし約150nｇ含む。被験者がヒトである具体例においては、上記方法は上記酵素を約5nｇないし約75nｇ投与することからなる。或る具体例においては、上記方法は、被験者に対し上記酵素を約0.02pｇ/kgないし約0.02uｇ/kg、好ましくは約0.7pｇ/kgないし約7nｇ/kg、最も好ましくは約0.02nｇ/kgないし約2nｇ/kg投与することからなる。被験者がヒトである場合、この方法は上記酵素を約0.1nｇ/kgないし約1nｇ/kg投与することからなる。上述の投与量は各用量又は1日当りの総用量を指すものである。

或る具体例においては、上記方法は、スルホラファン駆動体をスルホラファンに変換させることができる一種を超える酵素を投与することからなる。或る具体例においては、上記組成物は、スルホラファン駆動体をスルホラファンに変換させることができる一種を超える酵素を含むものである。或る具体例においては、上記方法又は組成物は、一種を超える酵素を含むものであり、上記用量は夫々の酵素の量、又は複数の酵素の総量を指すものである。

本発明は更に、非限定的に、ブロッコリーの種およびスプラウトエキスを含むブロッコリーエキス及び／又は粉末を使用することを提供するものである。本発明は、ブロッコリーエキス及び／又は粉末を投与する方法、並びにブロッコリーエキス及び／又は粉末を含む組成物を提供するものである。或る具体例においては、ブロッコリーエキス又は粉末は、スルホラファン駆動体、好ましくはグルコラファニンを、約１%ないし約75%（w/w）、好ましくは約2.5%ないし約50%、より好ましくは約5%ないし約25%、最も好ましくは約10%ないし約20%含むよう規格化される。ブロッコリーのエキスおよび粉末の例については、非限定的に、米国特許No.5,411,986; No.5,725,895；No.5,968,505; No.5,968,567; No.6,177,122；No.6,242,018; No.6,521,818；No.7,303,770; No.8,124,135に記載されている。これらは夫々参照として、ここに組み込まれるものとする。ブロッコリー粉は、例えば、空気乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、スプレー乾燥、加熱乾燥及び／又は部分的真空乾燥によりブロッコリー、好ましくはブロッコリースプラウトを乾燥させることにより得ることができる。或る具体例においては、上記組成物又は方法は、ブロッコリーエキスを、約１μgないし約10g、好ましくは約250μgないし約5g、より好ましくは約500μgないし約1g、より好ましくは約600μgないし約500mg、より好ましくは約750μgないし約400mg、最も好ましくは約1mgないし約300mg使用することを含むものである。或る具体例においては、ブロッコリーエキス又は粉末は、上述の量を以ってスルホラファン前駆体又はスルホラファンを提供するのに十分な量を組成物中に含ませるか、あるいは被験者に投与される。或る具体例においては、上記組成物は更に、酵素増強剤、好ましくはアスコルビン酸を含有させてもよい。或る具体例においては、上記方法は更に、酵素増強剤、好ましくはアスコルビン酸を投与することを含むものである。

スルホラファン又はその誘導体、スルホラファン前駆体及び／又はスルホラファン前駆体をスルホラファンに変換し得る酵素は任意の資源から得ることができる。例えば、非限定的な意味で、アブラナ科（Cruciferaeとしても知られている）からの1又はそれ以上の植物から得ることができる。アブラナ科からの植物の例としては、非限定的に、ブロッコリー、芽キャベツ、カリフラワー、キャベツ、セイヨウワサビ、パースニップ、大根、ワサビ、クレソン、白ガラシなどが含まれる。或る好ましい具体例として、スルホラファン、好ましくはグルコラファニンおよび上記酵素好ましくはミロシナーゼは、ブロッコリー、ブロッコリースプラウト又はブロッコリーの種から得る。スルホラファン前駆体及び上記酵素は同一又は異なる資源から得ることができる。或る具体例においては、スルホラファン前駆体及び上記酵素の双方とも、これらの植物からのエキス又は粉体（好ましくは、ブロッコリーの種又はスプラウトエキス又は粉）から得ることができる。

本発明は酵素増強剤の使用について提供するものである。酵素増強剤は、スルホラファン前駆体をスルホラファンに変換し得る酵素の活性を高めるために使用される。或る具体例として、酵素増強剤は、酵素補助因子、好ましくはアスコルビン酸からなる。アスコルビン酸塩又はビタミンCとしても知られているアスコルビン酸は、ミロシナーゼの活性を強化することができる。或る具体例として、アスコルビン酸などの酵素増強剤なしの場合、このスルホラファンへの変換反応は遅すぎて、ピーク吸収を必要とする部位では生じ得ないと思われる。この酵素増強剤は天然資源から得ることができるし、あるいは合成により生産することもできる。

或る具体例として、この組成物は酵素増強剤を約1mgないし約500mg、好ましくは約1mgないし約250mg、最も好ましくは約1mgないし約125mg含むものである。或る好ましい具体例として、ヒトへの使用に適した組成物の場合、酵素増強剤を約1mgないし約50mg含むものとする。

或る具体例として、本発明の方法は、酵素増強剤、好ましくはアスコルビン酸を約1mgないし約500mg、好ましくは約1mgないし約250mg、最も好ましくは約1mgないし約125mgの用量を以って投与することからなる。被験者がヒトである好ましい具体例においては、酵素増強剤を約1mgないし約50mg投与するものとする。或る具体例においては、本発明の方法は、酵素増強剤、好ましくはアスコルビン酸を約0.01mg/kgないし約3mg/kg、最も好ましくは約0.02mg/kgないし約2mg/kgの用量を以って投与することからなる。被験者がヒトである好ましい具体例においては、この方法は酵素増強剤を約0.02mg/kgないし約0.7mg/kgの用量を以って投与することからなる。上記用量は夫々の投与量、又は1日当りの総投与量を指すものである。

或る具体例として、本発明の方法は、1種を越える数の酵素増強剤を投与することからなる。或る具体例として、本発明の組成物は、1種を越える数の酵素増強剤を含むものである。この方法又は組成物が1種を越える数の酵素増強剤を含む具体例においては、上記用量は夫々の酵素増強剤の投与量、又はそれら酵素増強剤の総投与量を指すものである。

本発明は更に、フィトステロール又はそのエステル及び／又はフィトスタノール又はそのエステル、及び／又はそれらの混合物の使用を含むものである。用語“フィトステロール”は、非限定的に、4-デスメチルステロール、4-モノメチルステロール、4,4-ジメチルステロール（トリテルペンアルコール）およびそれらの混合物を含むものである。4-デスメチルステロールの例としては、非限定的に、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、22-デヒドロブラシカステロール、5-アベナステロールが含まれる。4,4-ジメチルステロールの例としては、非限定的に、シクロアルテノール、24-メチレンシクロアルテノール、シクロブラノールが含まれる。用語“フィトスタノール”はフィトステロールの飽和型を示すもので、非限定的に、シトスタノール、カンペスタノールおよびその24-エピマー、シクロアルタノールの飽和型、24-メチレンシクロアルタノール、シクロブラノールおよびそれらの混合物が含まれる。用語“フィトステロールエステル”および“フィトスタノールエステル”は、脂肪酸のような酸でエステル化されたフィトステロール及びフィトスタノールを夫々指すものである。脂肪酸の例は、不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸であり、例えば、非限定的に、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸が含まれる。或る具体例においては、フィトステロール及びフィトスタノールでエステル化させることのできる酸の例としては、非限定的に、パルミチン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、ステアリン酸が含まれる。或る具体例として、本発明は１つのフィトステロール又はそのエステル又は１つのフィトスタノール又はそのエステルの使用に関する。或る具体例として、本発明は２種以上のフィトステロール（又はそのエステル）又は２種以上のフィトスタノール（又はそのエステル）の使用に関する。或る具体例として、本発明はフィトステロール及び／又はフィトステロールエステルの混合物、又はフィトスタノール及び／又はフィトスタノールエステルの混合物、又はフィトステロールおよびフィトスタノール及び／又はそれらのエステルの混合物の使用に関するものである。或る具体例として、本発明は、シトステロール、カンペステロール及び／又はスチグマステロール又はそれらの混合物の使用を提供するものである。或る具体例として、本発明は、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、カンペスタノール、シトスタノールおよびブラシカステロールを含む混合物の使用を提供するものである。

フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルは任意の形態、例えばエキス又は粉体で提供することができる。或る具体例として、これらエキス又は粉体は、米国特許No.8,338,564に記載されているように植物油、例えば大豆油、菜種（キャノーラ）油、サフラワー油、綿実油、ひまわり油、コーン油、タール油、タール油ピッチから単離ないし抽出されたフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルからなるものである。これらエキス又は粉体の例としては、非限定的に、フィトステロールコンプレックス（Total Nutrition社から市販）、フィトステロールコンプレックス（Source Natulals社から市販）、ハート・チョイス・プラント・ステロール（Vitamin Shoppe社から市販）、フィトステロールコンプレックス（Puritan’s Pride社から市販）などがある。或る具体例においては、これらエキス又は粉体は、シトステロール、カンペステロール及び／又はスチグマステロールからなる。或る具体例においては、これらエキス又は粉体は、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルを約5%ないし約99%（w/w）、若しくは約15%ないし約95%、若しくは約30%ないし約90%、若しくは約40%ないし約80%含むよう規格化される。これらの％量はフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの各々を指すか、又はフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの合計量を指すものである。本発明のフィトステロール及び／又はフィトスタノールを含有する粉体は当業界における任意の方法で得ることができる。例えば、非限定的に、空気乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、スプレー乾燥、加熱乾燥及び／又は部分的真空乾燥などを挙げることができる。

或る具体例として、上記組成物および方法は、約1mgないし約1000mgのフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの使用が含まれる。或る具体例として、上記組成物および方法は、約5mgないし約750mg、若しくは約10mgないし約500mg、若しくは約15mgないし約400mg、若しくは約20mgないし約300mg、若しくは約25mgないし約250mg、若しくは約25mgないし約200mgのフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの使用が含まれる。これらの用量はフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの各々を指すか、又はフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの合計量を指すものである。これらの用量は更に、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルからなる混合物、エキス又は粉体の量を指すものであってもよい。或る具体例として、上記組成物および方法は、約25mgないし約200mgのシトステロール、スチグマステロール及び／又はカンペステロールの使用を含むものである。

或る具体例として、上記方法は、約0.01mg/kgないし約15mg/kg、若しくは約0.05mg/kgないし約10mg/kg、若しくは約0.1mg/kgないし約8mg/kg、若しくは約0.2mg/kgないし約6mg/kg、若しくは約0.35mg/kgないし約5mg/kg、若しくは約0.3mg/kgないし約3mg/kgのフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルを投与することが含まれる。これらの用量はフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの各々を指すか、又はフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの合計量を指すものである。これらの用量は更に、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルからなる混合物、エキス又は粉体の量を指すものであってもよい。上記用量は夫々の投与量、又は1日当りの総投与量を指すものである。

本発明の方法は更に、1（種）又はそれ以上の追加成分の投与を含むものであってもよい。本発明の組成物は更に、1（種）又はそれ以上の追加成分を含むものであってもよい。本発明は更に、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルに加えて又は代えて、これら追加成分の1（種）又はそれ以上の使用を含む方法および組成物を提供するものである。これらの追加成分の使用により相乗効果を期待できる。これら追加成分としては、活性薬剤成分、栄養成分、栄養エキスなどが含まれる。これら追加成分の例としては、非限定的に、ケルセチン又はその誘導体、グルコサミンなどのアミノ糖、コンドロイチンなどのグリコサミノグリカン、アボガド/大豆不鹸化物、ビタミンK2などのビタミン、コーヒーフルーツ、マグネシウム、ウルソル酸、プロアントシアニジン、カテキン、α-又はβ-グルカン、クルクミン、S-アデノシルメチオニン（SAMe）、ベタレイン、リポ酸、没食子酸、レスベラトロル、ヒアルロン酸、ホウ素、メチルスルホニルメタン（MSM）、コラーゲンタイプIIなどが含まれる。これらの追加成分はクランベリー（Vaccinium macrocarpon）エキス（プロアントシアニジン、ケルセチンおよびウルソル酸）、ウコン（Curcuma longa）、薬用キノコエキス（シイタケ（Lentinus edodes））、マイタケ（Grifola frondosa）キノコエキス、オオアザミエキス又は粉、霊芝（Ganoderma lucidum）キノコエキス、緑茶エキス、卵殻膜などに存在する。

或る具体例として、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルのスルホラファン又はその誘導体に対する割合は、約1:50ないし約1500:1、若しくは約1:25ないし約1000:1、若しくは約1:10ないし約750:1、若しくは約1:5ないし約500:1、若しくは約1:2ないし約250:1、若しくは約2:1ないし約100:1、若しくは約2:1ないし約50:1、若しくは約2.5:1ないし約25:1、若しくは約3:1ないし約15:1、若しくは約3:1ないし約10:1、若しくは約3:1ないし約8:1とする。或る具体例として、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルのスルホラファン前駆体に対する割合は、約1:50ないし約1000:1、若しくは約1:25ないし約750:1、若しくは約1:10ないし約500:1、若しくは約1:5ないし約250:1、若しくは約1:2ないし約150:1、若しくは約2:1ないし約100:1、若しくは約2.5:1ないし約75:1、若しくは約3:1ないし約50:1、若しくは約4:1ないし約25:1、若しくは約4:1ないし約10:1、若しくは約4:1ないし約7:1とする。これらの割合はフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの各々の量についてのもの、又はフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの合計量についてのものである。

或る具体例においては、上記組成物は、単位剤形からなるものとする。例えば、非限定的に、経口投与、直腸投与、静脈投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、経粘膜投与、局所投与などに適した薬剤投薬形態である。或る具体例として、上記組成物は経口投与形、又は直腸投与形からなっている。経口投与形の例としては、非限定的に、錠剤、カプセル、飲料に分散可能な粉体、液体（例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン）、ソフトゲル/咀嚼カプセル、咀嚼用バー、その他の当業界公知の投与形態が含まれる。好ましい具体例として、上記組成物は、タブレット、カプセル又はソフト咀嚼用トリートからなる。上記の経口投与用量形は即時放出、長期放出又は遅延放出用に製剤されていてもよい。

或る具体例においては、少なくとも上記スルホラファン前駆体、上記酵素および上記酵素増強剤は剤形で提供されるもので、これはpHが少なくとも4、好ましくは少なくとも5である消化管の領域（例えば、小腸、好ましくは十二指腸）での放出が可能なものである。或る具体例においては、少なくとも上記スルホラファン又はその誘導体及び／又はブロッコリーエキス又は粉が、pHが少なくとも4、好ましくは少なくとも5である消化管の領域（例えば、小腸、好ましくは十二指腸）での放出が可能な剤形で提供される。或る具体例においては、上記フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）及び／又は任意の追加成分もまた、pHが少なくとも4、好ましくは少なくとも5である消化管の領域（例えば、小腸、好ましくは十二指腸）での放出が可能となっている。この小腸には、十二指腸、空腸および回腸が含まれる。

或る具体例においては、これらの成分の夫々（すなわち、スルホラファン前駆体、酵素、酵素増強剤、スルホラファン又はその誘導体、ブロッコリーエキス又は粉、フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステル（それらの混合物）、及び／又は追加成分）は同時に、又は付随的に（すなわち、互いに短時間内に）放出されるようになっている。これは、胃などのpＨが4以下の消化管領域においてグルコラファニンを放出するように製剤されたグルコラファニン含有組成物に利益を提供するものとなる。このような低pＨ環境において、その酸性環境はスルホラファン前駆体の、他の生理学的に不活性な最終生成物（スルホラファンニトリルおよびエピチオニトリルなど）への変換をそらすものとなる。

或る具体例においては、上記組成物は、経口投与可能な組成物であって、これは腸溶性コーティング投薬形あるいは胃などのpＨが4以下の消化管領域での劣化に耐性を有する任意の投薬形などの胃保護製剤からなる。例えば、この経口投与可能な組成物は、腸溶性コーティングを含むタブレット又はカプセルからなるものでもよい。この腸溶性コーティングとしては、非制限的に、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、メタクリル酸コポリマー、メタクリル酸：アクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートコハク酸塩、ヒドロキシプロピルメチルセルローストリメリテート、シェラック、セルロースアセテートトリメリテート、カルボキシメチルセルロース、およびこれらの混合物などの物質が含まれる。この腸溶性コーティングは、当業界で公知の任意の適当な腸溶性ポリマーからなるものであってもよい。或る具体例においては、上記組成物の1又はそれ以上の成分は腸溶性ポリマーの基質内に埋め込むようにしてもよい。或る具体例においては、この経口投与可能な組成物は、胃酸内で徐々に溶解し小腸に移動するようなカプセルを含むものである。例えば、DRCAPS^TM耐酸性カプセル（CAPSUGEL（登録商標）で市販されている）又は、その他の耐酸性カプセルである。

最も好ましい具体例においては、上記の経口投与可能な組成物は、周囲の媒体が少なくとも４のpＨ、より好ましくは少なくとも５のpＨでない限り、溶解しないコーティングにより被覆されている。その他、pＨではなく、時間により放出が制御されるようなコーティングを使用することもできる。その場合、その放出速度は、消化管のpＨが少なくとも４、より好ましくは少なくとも５に上昇するまで、その成分が放出されないように調整する。このように、時間放出製剤を使用して、スルホラファン前駆体、スルホラファン前駆体をスルホラファンに変換させる酵素、酵素増強剤又はスルホラファンの胃内での存在を防止するようにする。この被覆層は経口投与可能な組成物に対し標準的なコーティング技術を用いて適用することができる。腸溶性コーティング物質は、有機溶媒又は水性溶媒内に溶解させたり、分散させたりしてもよい。腸溶性コーティングが溶解するときのpＨは、ポリマー又はポリマーの組合せ、選択された側基及び／又は側基の比により制御することができる。例えば、ポリマーフィルムの溶解特性は、エステル基に対する遊離カルボキシル基の比により変化させることができる。腸溶性コーティング層も薬理学的に許容し得る可塑化剤、例えばクエン酸トリエチル、ジブチルフタレート、トリアセチン、ポリエチレングリコール、ポリソルベート、又はその他の可塑化剤を含むものである。添加剤、例えば分散剤、着色剤、抗接着剤および抗泡剤も含めることができる。

上記組成物は、1又はそれ以上の非活性薬剤成分（一般に腑形剤としても知られている）を含むものであってもよい。非活性薬剤成分は、活性成分を例えば、可溶化させ、懸濁させ、濃縮させ、稀釈させ、乳化させ、安定化させ、保存させ、保護させ、着色させ、風味付けさせ、変形させて、安全で便利で、さもなくば使用に適した実用的で効果的な製剤にさせるのに役立つ。上記腑形剤は好ましくは薬理学的に許容し得る腑形剤である。薬理学的に許容し得る腑形剤の類の例としては、滑剤、緩衝剤、安定剤、発泡剤、顔料、着色剤、香料、充填剤、増量剤、芳香剤、放出調整剤、アジュバント、可塑化剤、流動促進剤、離型剤、ポリオール、顆粒化剤、稀釈剤、バインダー、緩衝剤、吸収剤、接着剤、抗付着剤、酸味剤、柔軟剤、樹脂、粘滑剤、溶剤、界面活性剤、エラストマー、およびこれらの混合物を挙げることができる。

或る具体例においては、(i) スルホラファン前駆体、好ましくはグルコラファニン；(ii) スルホラファン前駆体をスルホラファンに変換できる酵素、好ましくはグルコシダーゼ酵素、より好ましくはチオグルコシダーゼ酵素、最も好ましくはミロシナーゼ酵素；(iii)酵素増強剤、好ましくは酵素補助因子、より好ましくはアスコルビン酸;および(iv) フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）からなるコンビネーションは相乗効果を実証している。或る具体例においては、スルホラファン（又は、その誘導体）およびフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又は、それらの混合物）からなるコンビネーションは相乗効果を実証している。相乗効果とは、2又はそれ以上の成分のコンビネーションが、単独で使用された薬剤により得られる効果の総計よりも大きい結果を創生させることを指すものである。好ましい具体例においては、この相乗効果は付加的効果よりも大きい。或る具体例においては、スルホラファン前駆体、スルホラファン前駆体をスルホラファンに変換できる酵素、酵素増強剤、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）からなるコンビネーションは、(i)各成分単独、(ii) スルホラファン前駆体と上記酵素とのコンビネーション単独、(iii) スルホラファン前駆体と上記酵素と上記酵素増強剤とのコンビネーション単独のものと比較して統計的に有意で大きい効果を奏している。

好ましい具体例においては、スルホラファン前駆体、上記酵素、酵素増強剤、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）からなるコンビネーションは、スルホラファン前駆体単独、および、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）単独との比較において、付加的効果よりも統計的に有意な、及び／又は、より大きい相乗効果を実証している。或る具体例として、グルコラファニン、ミロシナーゼ、アスコルビン酸並びにフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）からなるコンビネーションは、グルコラファニン、ミロシナーゼ、アスコルビン酸からなるコンビネーション単独との比較;並びにフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）単独との比較において相乗効果を奏するものである。或る具体例として、グルコラファニン、ミロシナーゼ、アスコルビン酸並びに１又はそれ以上のフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの混合物からなるコンビネーションは、グルコラファニン、ミロシナーゼ、アスコルビン酸からなるコンビネーション単独との比較;並びにフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル単独との比較において相乗効果を奏するものである。

好ましい具体例として、スルホラファン（又はその誘導体）と、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）とのコンビネーションは、スルホラファン（又はその誘導体）単独との比較;並びに、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）単独との比較において付加的効果よりも統計的に有意な、及び／又は、より大きい相乗効果を実証している。或る具体例として、スルホラファン（又はその誘導体）と、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの１又はそれ以上の混合物とのコンビネーションは、スルホラファン（又はその誘導体）のコンビネーションとの比較;並びに、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル単独との比較において相乗効果を有している。

或る具体例において、ブロッコリーエキス又は粉と、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）とのコンビネーションは、(i) ブロッコリーエキス又は粉単独との比較、及び／又は(ii) フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）単独との比較において付加的効果よりも統計的に有意な、及び／又は、より大きい相乗効果を有している。或る具体例において、ブロッコリーエキス又は粉と、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）とのコンビネーションは、ブロッコリーエキス又は粉単独、並びにフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）単独との比較において相乗効果を有している。或る具体例において、ブロッコリーエキス又は粉と、1又はそれ以上のフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの混合物とのコンビネーションは、ブロッコリーエキス又は粉単独、並びにフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステルの単独との比較において相乗効果を有している。

或る具体例として、本発明の方法および組成物は更に、ボスウェリア（ボスウェリアコナラ（Boswellia serrata））エキス又はボスウェリアエキス内に見出される任意の成分（例えば、非限定的に、ボスウェル酸、ペンタサイクリックトリテルペン酸など）の使用を含む。上記成分の例としては、非限定的に、α-ボスウェル酸、β-ボスウェル酸、３−アセチル α-ボスウェル酸、３−アセチル β-ボスウェル酸、11-ケト-β-ボスウェル酸(KBA)、アセチル-11-ケト-β-ボスウェル酸(AKBA)が含まれる。或る具体例として、本発明の上記コンビネーションへのボスウェリアエキス及び／又はボスウェリアエキスの成分の添加は、上記コンビネーション単独との比較において相乗効果を奏するものとなる。

本発明は、必要とする被験者への投与方法をふくむ、使用方法を提供するものである。或る具体例として、上記方法は、スルホラファン前駆体、スルホラファン前駆体をスルホラファンに変換し得る酵素、酵素増強剤、およびフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）のコンビネーションを投与することからなる。或る具体例においては、上記方法は、スルホラファン又はその誘導体と、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）とのコンビネーションを投与することからなる。或る具体例においては、上記方法は、ブロッコリーエキス又は粉と、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）とのコンビネーションを投与することからなる。

或る具体例として、上記方法は、被験者における結合組織、肝臓、尿生殖器系（前立腺、胸部、卵巣を含む）、脳、肺、腎臓、大腸、食道、すい臓、造血系と関連する症状の治療、予防、発症の減少に関連し、及び／又はこれらに関連する病気、疾患又は損傷の二次再発の減少に関連し、被験者に本発明の組成物を投与することからなる。この方法は、結合組織、肝臓、尿生殖器系（前立腺、胸部、卵巣を含む）、脳、肺、腎臓、大腸、食道、すい臓などの組織および器官への損傷を軽減ないし緩和させるのに有益である。或る具体例として、上記方法は、グルタチオンのレベルを、それを必要とする被験者において増加させることに関する。本発明は更に、マトリクスメタロプロティナーゼ13(MMP-13)およびプロスタグランジンE₂（PGE₂）などの前炎症性媒体の異常又は高いレベルと関連する症状を治療、予防、軽減させるのに、及び／又は、これらに関連する病気又は症状の二次再発の減少に有用である。このような病気又は症状の例としては、非限定的に、変形性関節症、関節リウマチ、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、ガン（肝臓、肺、前立腺、大腸、乳部、脳、卵巣、食道、すい臓、鼻咽頭、骨肉腫などのガン）、白血病、嚢胞性線維症、HIV、グルタチオン合成酵素欠損症、認知機能障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ失調症、多発性硬化症、線維筋痛、慢性疲労、自閉症、糖尿病、肝毒性および環境因子による毒性などが含まれる。

或る実施例として、上記方法は、バイオマーカーに対し有益な作用を提供することに関すると共に、これらのバイオマーカーの異常レベルに関連する症状の治療、予防、発生減少、並びにその症状を減少させることに関する。このようなバイオマーカーの例としては、非限定的に、NADPH依存性酵素、チオレドキシン(TXN)、チオレドキシン還元酵素-1(Txnrd-1)、グルタミン酸システインリガーゼサブユニット（GCLC）、スルホトランスフェラーゼ 1A1 (SULT1A1)、ヘムオキシゲナーゼ-1(HMOX1)、グルタチオンペルオキシダーゼ（GPx-3）、グルタチオンS-トランスフェラーゼシータ2（GSTT2）、ミクロソームグルタチオンS-トランスフェラーゼ１（MGST1）、アルデヒドオキシダーゼ（AOX1）、アルドケトリダクターゼ1B8（Akr1b8）、フラビン含有モノオキシゲナーゼ2（FMO2）、Fc受容体領域レセプターIII(Fcgr3)、トリプターゼベータ１（TPSB1）、マスト細胞プロテアーゼ-6(Mcpt6)、ニューレキシン-1-α（NRXN-1）、小眼球症関連転写因子（MITF）、タイプIIヨードチロニン脱ヨウ素酵素（DIO2）、アンギオポイエチン-14（Angpt14）、CD分類（cluster of differentiation）(CD36)、およびNtelなどが含まれる。これらのバイオマーカーの高又は異常レベルに関連する病気又は症状の例としては、非限定的に、ガン、肺および中枢神経系の結核、多発性硬化症、クローン病、アテローム性動脈硬化症、変形性関節症、ぜんそく、脳卒中、肺気腫、糖尿病性腎症、胎盤の慢性組織球インタービロシティス（intervillositis）、高血圧、腹部大動脈瘤、炎症性腸疾患、鼻副鼻腔炎、冠動脈疾患、腎臓病などが含まれる。

或る具体例においては、上記方法は、必要とする被験者に対し、スルホラファンと、フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）とのコンビネーションを投与することからなる。或る具体例においては、上記方法は、必要とする被験者に対し、ブロッコリーエキス又は粉と、フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）とのコンビネーションを投与することからなる。或る好ましい具体例として、上記方法は、被験者に対し、グルコラファニン、ミロシナーゼ、アスコルビン酸並びにフィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）からなるコンビネーションを投与することからなる。好ましい具体例においては、上記コンビネーションは本発明の方法において相乗効果を実証している。

好ましい具体例として、上記コンビネーション、例えば、スルホラファン前駆体、スルホラファン前駆体をスルホラファンに変換し得る酵素、酵素増強剤、フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）からなるコンビネーション；又は、スルホラファン又はその誘導体、およびフィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）から成るコンビネーション;又は、ブロッコリーエキス又は粉と、フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）とから成るコンビネーションの1又はそれ以上の成分は、１つの組成物内又は剤形内で一緒に、又は別々に投与することができ、それをそれら成分の治療効果が互いにオーバーラップする時間内に行なうことが好ましい。或る具体例として、上記コンビネーションの成分（複数）は、2又はそれ以上の経口投与可能な組成物又は剤形として投与してもよい。例えば、或る具体例においては、スルホラファン前駆体、スルホラファン前駆体をスルホラファンに変換し得る酵素および酵素増強剤が１つの経口投与可能な剤形として投与され、他方、フィトステロール、フィトスタノール又はそれらのエステル（又はそれらの混合物）は、１又はそれ以上の別の又は追加の経口投与可能な剤形として投与させることができる。好ましい具体例においては、上記コンビネーションの成分（複数）は１つの剤形（投薬形態）として投与させる。

或る具体例として、上記コンビネーションは、1日当り、1ないし10回の頻度で、好ましくは、1日当り、1ないし5回の頻度で、より好ましくは、1日当り、1ないし3回の頻度で、最も好ましくは、1日当り、1回の頻度で投与する。

本出願で記載されている用量は一般にヒト（体重、約68kg）に適した用量を指している。用量計算は、体重、表面積、代謝率および人種の相違などを考慮して当業者が判断し得るであろう。

用語“被験者”とは、哺乳動物および鳥を含むあらゆる動物を指すものである。哺乳動物としては、非限定的に、ヒト、イヌ、ネコ、馬、牛、ラクダ、象、ライオン、トラ、熊、アザラシ、ウサギなどが含まれる。好ましい具体例としては、この被験者は、ヒト、ネコ、イヌなどの食べ物として消費されない哺乳動物を指すものである。

実施例：
実施例１
以下のものは代表的な製剤である。
グルコラファニン含有ブロッコリーエキス（約12%w/w）: 50mgないし5g
ミロシナーゼ含有凍結乾燥ブロッコリースプラウト粉：25mgないし500mg
アスコルビン酸：5mgないし500mg
タール油 フィトステロール及び／又はフィトスタノール：25mgないし50mg

実施例２
疎水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）法が以下の条件で実施された。
カラム：ウオーターズBEHアミド、1.7μm粒子サイズ：2.1mm x 100mm
移動相：20％ 10mM酢酸アンモニウム、pH 5.0; 80%アセトニトリル；
分離モード：アイソクラチック
カラム温度：70℃
流速：0.7mL/分
上記条件により、スルホラファン前駆体及びグルコラファニンを含む5つの典型的なアブラナ科のグルコシノレートの分離が得られた。

実施例３
アスコルビン酸濃度の関数としたときのグルコラファニンの消費：
約12％（W/W）のグルコラファニンを含有するブロッコリーの種エキス約250mgを、0ないし600μmol/Lの範囲の種々の濃度のアスコルビン酸の存在下で、ブロッコリープラウト由来のミロシナーゼの一定濃度により加水分解させた。この反応混合物を38℃で温度調整し、アリコートを60分間に亘って、15分ごとに分取し、グルコラファニンの濃度をクロマトグラフィーにより判定した。グルコラファニンの消費割合を、そのスルホラファンへの変換割合として解釈した。増大するアスコルビン酸濃度の関数としてのグルコラファニンの含有量減少のグラフ表示は、一連の直線状プロットをもたらした。ここで線形回帰ラインの傾きはグルコラファニンの消費速度（μmol/分）を反映するものである。アスコルビン酸の600μmol/Lの濃度の存在下では、アスコルビン酸の調節作用の欠損のもとで進行させたものと比較して、反応速度は13倍に増加した。

実施例４
グルコラファニンのスルホラファンへの等モル変換：
ミロシナーゼ活性を変調することに対するアスコルビン酸の役割を更に明らかにするため、二部構成実験を行なった。全ての溶液を20mMトリス緩衝食塩水中、pH=7.5で作った（ミロシナーゼ活性に最適なものとして予め認められたもの）。各サンプル管はミロシナーゼ源として正確に計量した凍結乾燥のブロッコリー粉100mgを収容したものである。実験は38℃で2時間行い、サンプルのアリコートを30分単位で取り出し、グルコラファニンおよびスルホラファンの双方の含量をHPLCにより評価した。強い酸性の“停止液”を利用し、分取したアリコート中での更なるミロシナーゼ活性を即座に抑制させた。対照サンプルはアスコルビン酸を含有していないものである。この酵素による変換は補因子による補助なしに行なわれた。
パート１：一定濃度（1mmol/L）のアスコルビン酸の存在下で、ブロッコリーの種エキス（約12％（W/W）のグルコラファニン含有）の量を250mgから500mgへと増加させながら添加した。
パート２：ブロッコリーの種エキスの量を250mgで一定に保ちながら、アスコルビン酸の濃度を0.4mmol/Lから3.8mmol/Lに変化させた。下記表は、グルコラファニンおよびスルホラファンを濃度、μmol/Lで示したものである。最初の30分内で、殆んど全ての反応混合物において、グルコラファニンからスルホラファンへの変換が完了したことが明らかになっている。しかし、アスコルビン酸の刺激作用のない対照サンプルの場合における酵素的変換を精査したところ、スルホラファンへのグルコラファニンの等モル変換（すなわち、消費されたグルコラファニンの量が生産されたスルホラファンの当量となる）が明らかであった。

この実験のパート２において、ミロシナーゼの活性に対するアスコルビン酸の濃度増大の調節作用が評価された。スルホラファンへのグルコラファニンのミロシナーゼ促進による変換において、最初の明らかに直線状の増大が、約2mmol/Lのアスコルビン酸濃度で観察され、その後は可なりの平坦化が見られた。

最後に、この実験のパート1内での30分後のスルホラファン生産について検査した結果、1mmol/Lのアスコルビン酸の存在下では、凍結乾燥されたブロッコリースプラウト粉100mg中に含まれる一定量のミロシナーゼが少なくとも200μmolのスルホラファンを予想通り生成し得ることが見出された。図１，２，３および4はこの研究の結果を実証している。

実施例５
模擬腸液の存在下でのグルコラファニンのスルホラファンへの変換：
模擬腸液（SIF）粉（組成、pH、イオン強度の点で、ヒトの腸内容物と近似させた市販の濃縮物）が使用された。この実験では、USP溶解装置２（パドル）を利用し、ここでは６個の溶解容器に、500mLの模擬腸液を、ミロシナーゼ源として150mLの凍結乾燥したブロッコリースプラウト粉と共に分注した。容器１−４においては、アスコルビン酸の濃度を0.25mmol/Lから1.00mmol/Lの範囲に変化させた。容器５においては、1mmol/Lのアスコルビン酸に加えて3.125gのパンクレアチン（8x USP）を懸濁させた。容器６においては、1mmol/Lのアスコルビン酸および3.125gのパンクレアチン（8x USP）に加えて2倍量の凍結乾燥したブロッコリースプラウト粉（300mg）を添加した。これら容器を38℃に加熱したのち、250mgのグルコラファニンリッチ（12％W/W）のブロッコリーの種エキスを夫々の容器内に添加した。その結果得られた懸濁液を75rpmで2時間攪拌した。アリコートを15分ごとに分取し、スルホラファンについて検定した。図４は、スルホラファンのより大きい収率と、アスコルビン酸のより高い濃度との間の直接的相関関係（特に実験の初期の段階で）を示している。

実施例６
以下の研究は、マトリクスメタロプロティナーゼ13(MMP-13)の遺伝子発現レベルに対するフィトステロールのコンビネーションの作用を判定するために行なったものである。MMP-13は主要II型コラーゲン分解コラーゲナーゼであり、これは変形性関節症などの炎症性疾患の進行のためのマーカーとしてしばしば使用されている。MMP-13はストレスおよび炎症性シグナルの双方によって規制される。MMP-13の下方制御は関節の健康のためには有益である。

この研究において、ウマ軟骨細胞を、(1)0.5μMのスルホラファン（SFN）で、(2)8.3μg/mLのフィトステロールとフィトスタノールとの混合物で、又は(3) 0.5μMのスルホラファン（SFN）と、8.3μg/mLのフィトステロールおよびフィトスタノールの混合物とのコンビネーションで24時間処理した。予備処理に続いて、この軟骨細胞をインターロイキン-１β（IL-１β）で24時間活性化させMMP-13の遺伝子発現を誘発させた。これは細胞外基質又は細胞の支持系統を分解させるタンパク質をコード化させるものとなる。MMP-13のレベルは定量RT-PCRを介して評価し、倍数表現で提示した。

それらの結果は、スルホラファンとMMP-13とのコンビネーションが、夫々単独のものと比較して相乗効果を奏することを実証している。事実、それらの結果は、フィトステロールとフィトスタノールとの混合物単独のものが遺伝子発現の増加をもたらすことを示している。しかし、スルホラファンとフィトステロールとフィトスタノールとのコンビネーションは、MMP-13遺伝子発現を相乗効果的に減少させた。

実施例７
以下の研究は、プロスタグランジンE₂（PGE₂）の産生レベルに対するフィトステロールとフィトスタノールとのコンビネーションの作用を判定するために行なったものである。PGE₂は痛みおよび炎症誘発性媒体であり、これは炎症組織内にしばしば見られる。PGE₂は、侵害受容性一次感覚ニューロン（侵害受容体とも呼ばれる）を直接的に興奮させ、痛み関連ペプチド物質P(SP)およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）を間接的に刺激することにより痛みを生じさせると考えられている。

この研究において、RAWマウスマクロファージ細胞を、(1)0.5μMのスルホラファン（SFN）で、(2)8.3μg/mLのフィトステロールとフィトスタノールとの混合物で、又は(3) 0.5μMのスルホラファン（SFN）と、8.3μg/mLのフィトステロールおよびフィトスタノールの混合物とのコンビネーションで24時間処理した。ついで、これらの細胞をLPSで活性化させ、炎症およびPGE₂の産生を誘発させた。PGE₂の産生はELISAを介して評価した。これらの結果は、スルホラファン、フィトステロールおよびフィトスタノールのコンビネーションが、それぞれの単独との比較において、相乗効果を奏したことを示している。このコンビネーションはPGE₂の産生の減少をもたらした。

Claims (14)

1. スルホラファン前駆体；
   スルホラファン前駆体をスルホラファンに変換できる酵素；
   酵素増強剤；および
   フィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステル；
   を具備してなることを特徴とする経口投与可能な組成物。
   
2. 前記スルホラファン前駆体がグルコラファニンからなる請求項１に記載の経口投与可能な組成物。
   
3. 前記のスルホラファン前駆体をスルホラファンに変換できる酵素がミロシナーゼを含む請求項１に記載の経口投与可能な組成物。
   
4. 前記酵素増強剤がアスコルビン酸を含む請求項１に記載の経口投与可能な組成物。
   
5. 前記組成物が腸溶性コーティング剤形を含む請求項１に記載の経口投与可能な組成物。
   
6. 前記組成物が更に、1（種）又はそれ以上の追加成分を具備してなり、該追加成分が、ケルセチン、アミノ糖、グリコサミノグリカン、アボガド/大豆不鹸化物、ビタミン、コーヒーフルーツ、マグネシウム、ウルソル酸、プロアントシアニジン、カテキン、α-又はβ-グルカン、クルクミン、S-アデノシルメチオニン（SAMe）、ベタレイン、リポ酸、没食子酸、レスベラトロル、ヒアルロン酸、ホウ素、メチルスルホニルメタン（MSM）、アセチル-ケト-β-ボスウェル酸(AKBA)およびコラーゲンタイプIIを含む群から選択されるものである請求項１に記載の経口投与可能な組成物。
   
7. グルコラファニン、ミロシナーゼ、アスコルビン酸および１又はそれ以上のフィトステロール及び／又はフィトスタノールを含む混合物を具備してなる請求項１に記載の経口投与可能な組成物。
   
8. 前記組成物がブロッコリーエキス又は粉末を含有してなる請求項１に記載の経口投与可能な組成物。
   
9. 結合組織に関連する症状の治療、予防、発症の減少、軽減のため、並びにそれに関連する病気、疾患又は損傷の二次再発の減少のための方法であって、必要とする被験者に対し、スルホラファン前駆体；スルホラファン前駆体をスルホラファンに変換できる酵素；酵素増強剤；およびフィトステロール及び／又はフィトスタノール又はそれらのエステルを投与することを含むことを特徴とする方法。
   
10. 前記スルホラファン前駆体がグルコラファニンを含む請求項９に記載の方法。
    
11. 前記のスルホラファン前駆体をスルホラファンに変換できる酵素がミロシナーゼを含む請求項９に記載の方法。
    
12. 前記酵素増強剤がアスコルビン酸を含む請求項９に記載の方法。
    
13. グルコラファニン、ミロシナーゼ、アスコルビン酸および１又はそれ以上のフィトステロール及び／又はフィトスタノールを含む混合物を投与することからなる請求項９に記載の方法。
    
14. 前記組成物が腸溶性コーティング剤形を含むものを投与することからなる請求項９に記載の方法。

Images