JP2016514114A - 単一高用量のｍｖａは、新生児及び幼児において防御免疫応答を引き起こす - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトの新生児又は生後６ヶ月未満の幼児における、痘瘡ウイルスに対する防御免疫応答を誘発する組成物及び方法に関する。本発明は、ヒトの新生児又は生後６ヶ月未満の幼児に単回の高用量のＭＶＡを投与することを含み、前記投与が、ヒトの新生児又は幼児における、痘瘡ウイルスに対する防御Ｔ−細胞及びＢ−細胞応答を誘導する方法を含む。【選択図】図１

Description

本発明は、少なくとも１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量のＭＶＡをヒトの新生児に投与することを含む、ヒトの新生児又は生後６ヶ月未満の幼児における、痘瘡ウイルスに対する防御免疫応答を誘発する方法に関する。

出生時に免疫するために世界的に認可されているワクチンはたったの３種類：すなわち、結核を予防するためのカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）、及びＢ型肝炎ワクチン（ＨＢＶ）である（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｓｃｈｍｉｔｚら，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３，９０ｐｓ２７（２０１１））。ＢＣＧは、凍結乾燥した、生菌のマイコバクテリウム・ボビスの単回投与ワクチンである（同上）。ＯＰＶは、弱毒化ポリオウイルスの単回投与ワクチンである（同上）。ＨＢＶワクチンは、出生時に開始する３回投与型のミョウバンとともに投与される、酵母内で発現した、組換え型Ｂ型肝炎表面抗原である（同上）。したがって、上記のうちの２種は複製生ワクチンであり、１種は３回投与される組換え型タンパク質である。

新生児においては免疫系が未熟なため、この年齢で安全かつ有効なワクチンを開発することの大きな障害となっている。幼児のために現在一般に行われているワクチン接種スケジュール下では、出生時にはＢ型肝炎のみが推奨されているが、他のワクチンは幼児期の後期に投与され（最初の１２ヶ月、例えば、ロタウイルス、不活化ポリオウイルスワクチン）、又は１２ヶ月若しくはそれ以降のみが推奨される（例えば、はしか／おたふくかぜ／風疹ワクチン）。しかし、全てのケースにおいて、高レベルの保護を誘発するには、幼児期／小児期に複数回のワクチン接種が必要であり（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｓｃｈｍｉｔｚら，Ｓｃｉ．）、ワクチンによって予防し得る疾患に対する感受性を増加させるには、出生後６〜９ヶ月の時間がある（同上）。天然痘、ＡＩＤＳ、マラリア、結核、及び他の疾患は、低年齢の小児において急速に、しばしば重篤な進行を伴って起こる。ＲＳＶ又ははしか等の幼児疾患であることを考慮に入れても、ワクチンは存在しないか、９ヶ月齢より前に投与することができない。その結果、新生児（最初の４週間以内）のワクチン接種、及び／又は幼児におけるスケジュールの縮小又はより効果的なスケジュールは、感染症に関連する死亡率及び罹患率を低下させるのに大きな進歩であろう。

一般的には、新生児は、主にＴ_Ｈ２に偏ったＴ細胞応答を開始し、抗体を産生しないか、限定的な親和力を有する抗体を低レベルで産生するのみである。更に、これらの応答は成人より短い期間である（Ａｄｋｉｎｓら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，５５３−５６４（２００４）；Ｍａｒｓｈａｌｌ−Ｃｌａｒｋｅら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１，３５−４１（２０００）；Ｓｉｅｇｒｉｓｔ，Ｃ．Ａ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １９，３３３１−３３４６（２００１））。

このようなパターン認識受容体の活性として、又は特定のウイルス感染時に、特定の環境下で、新生児マウスは、新生児の免疫付与の可能性を示す、経時的な防御Ｔ細胞応答を開始することができる（Ｆｏｒｓｔｈｕｂｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１，１７２８−１７３０（１９９６）；Ｓａｒｚｏｔｔｉら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１，１７２６−１７２８（１９９６））。

既存のワクチンを改良するアジュバントの開発と平行し（Ｇｒａｃｉａら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９，１５９５−１６０４（２０１１）；Ｋａｍａｔｈら，ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．３，ｅ３６８３（２００８））、ＤＮＡワクチンのような新規抗原送達系（Ｈａｓｓｅｔｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，２６２０−２６２７（２０００）；Ｒｉｇａｔｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０６，３７−４７（２０１０））及び３種の弱毒化複製細菌種、サルモネラ・エンテリカ（Ｒａｍｉｒｅｚら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８，６０６５−６０７５（２０１０））、リステリア・モノサイトゲネス（Ｋｏｌｌｍａｎｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８，３６９５−３７０１（２００７））及びＢＣＧ（Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏら，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．１０，１９８−２０２（２００８）；Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８，１５２−１６１（２００９））が、１週齢のマウス又は出生時にさえ投与された時に効率的な免疫応答を誘発することがわかった。しかし、生弱毒化複製ワクチンのみが、致死的感染に対して防御を誘発し、通常は数回の免疫後にのみ有効であり、したがって免疫学的成熟が進行した段階でのみ有効であった。したがって、複製ワクチンは十分な防御を誘発するには相当の時間を必要とし、生弱毒化複製ワクチンの制御されない播種性感染の危険性が、依然として大きな制限を示している（Ｇａｌｅｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８７，４００−４１２（２００９）；Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５，３０４−３１７（２０１１）；Ｌｉら，Ｚｈｏｎｇｈｕａ Ｅｒ．Ｋｅ．Ｚａ Ｚｈｉ．４８，６５−６８（２０１０）；Ｌｉｕら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２３９，６２−８４ ２０１１））。

変異ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ、ＭＶＡ）は、あらゆる合併症を伴わずに、天然痘撲滅キャンペーン中に１００，０００万人以上に投与された。しかし、ＭＶＡは、未だに種々のレベルの減衰及び免疫原性を有する、ウイルスの複合混合物である（Ｓｕｔｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２７，７４４２−７４５０（２００９））。Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ（ＭＶＡ−ＢＮ）が開発したプラーク精製ＭＶＡは、ヒト等のほ乳動物内で完全に複製されず、免疫力が低下した宿主内であっても安全である（同上）。その優れた安全プロファイルに加え、ＭＶＡはヒトにおいて高度に免疫原性であり（Ｖｏｌｌｍａｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２４，２０６５−２０７０（２００６））、その効果は、エクトロメリアウイルス（ＥＣＴＶ）、ウサギ痘又はサル痘のようないくつかの天然痘動物モデルにおいて証明された（Ｇａｒｚａら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２７，５４９６−５５０４（２００９）；Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １１８，１７７６−１７８４（２００８）；Ｓｔｉｔｔｅｌａａｒら．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９，７８４５−７８５１（２００５））。ＭＶＡの他の主な利点は、いくつかの抗原の遺伝的挿入を補助する能力であり（Ｔｉｍｍら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２４，４６１８−４６２１（２００６））、これは他の感染症又はがんに対する防御を付随的に誘発し得る（Ｈａｒｒｅｒら，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．１０，２８５−３００（２００５）；Ｍａｎｄｌら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１１）； Ｍｅｙｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４，４５３−４６７（２００５））。

マウスにおけるＥＣＴＶ（マウス痘の原因物質）は、ヒトの痘瘡感染の良好なモデル系である（Ｅｓｔｅｂａｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００５），８６，２６４５−２６５９）。マウス痘と天然痘では、侵入経路、低用量での高い感染性、ウイルス血症の発症、宿主範囲の限定、並びに遅いが致命的な予後を含む、疾患の進行が非常に類似している。したがって、マウス痘はヒト天然痘のための有益な小動物モデルとして、一般的に、急性の致死的ウイルス疾患のモデルとして考えることができる（Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈら，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，Ｖｏｌｕｍｅ ５（３）：ｅ９６５９（２０１０））。

局在的な複製及び全身への広がりを伴うマウスにおけるＥＣＴＶ感染の病因は、ヒトにおける天然痘ウイルスの病因と類似している（Ｃｈａｐｍａｎら， Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ ２０１０ ４７：８５２（２０１０））。ＶＡＣＶ−ＷＲ及びＥＣＴＶに感染したマウスにおける短期間及び暴露後保護の比較により、ＥＣＴＶ感染がより密接にヒトの天然痘に類似していることが示された（Ｐａｒａｎら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ；１９９：３９−４８（２００９））。

出生時のＭＶＡによるマウスのワクチン接種は安全であり、異種ウイルス感染に対する耐性の向上をもたらす形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の成長の加速及び古典的樹状細胞（ｃ）ＤＣの活性化を誘導する、ＦＬＴ３リガンドの増加を誘発する（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２，６３０４−６３１２（２００４），Ｖｏｌｌｓｔｅｄｔら，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１８４９−１８６０（２００４）Ｖｏｌｌｓｔｅｄｔら，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１２３１−１２４０（２００６））。２．５×１０^７ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡによる１又は２日齢マウスへのワクチン接種は、マウスを成体と考えた場合、ワクチン接種７〜８日後の致死量の単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）による誘発に対してほとんどのマウスを保護し、免疫４週後の致死量のワクシニアウイルスウエスタンリザーブ株（ＶＶ−ＷＲ）による誘発に対してほとんどのマウスを保護する（ＷＯ ０３／０８８９９４Ａ２）。ＣＤ１１ｃ＋細胞の最大誘導に必要なウイルス量を決定するために、ＭＶＡの段階的量について試験を行った。２．５×１０^６ＴＣＩＤ_５０のウイルスにより処理した後にＣＤ１１ｃ＋細胞の最大数を決定したが、これより多い量及び少ない量では効果はなかった（同上）。したがって、新生児のワクチン接種にとって、２．５×１０^６ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡは最適量であると考えられた。

したがって、当該技術分野には、強力なＴ−細胞及び抗体応答を達成し、病原体から保護するための、新生児のワクチン組成物及びワクチン接種法が必要とされる。本発明はこの要求を満たす。

本発明は、ヒトの新生児又は生後６ヶ月未満の幼児において、痘瘡ウイルスに対する防御免疫応答を誘導するための組成物及び方法を包含する。一実施態様においては、本発明は、少なくとも１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量のＭＶＡをヒトの新生児又は生後６ヶ月未満の幼児に投与することを含み、前記投与が、生後６ヶ月より前に、好ましくは投与２週間以内に、ヒトの新生児に痘瘡ウイルスに対する防御Ｔ−細胞及びＢ−細胞応答を誘導する。最も好ましくは、免疫応答は、ＭＶＡの２度目の投与なしで誘導される。

種々の実施態様においては、投与は、ヒトの新生児若しくは生後２ヶ月未満の幼児に、又は出生後７２時間以内に実施される。

好ましくは、投与は、痘瘡ウイルスに対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する。最も好ましくは、投与が、天然痘に対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する。

ある実施態様においては、本発明は、ＭＶＡを１回以上追加投与することを含む。

ある実施態様においては、ＭＶＡは組換え型ＭＶＡである。ある実施態様においては、投与は、組換え型ＭＶＡによりコードされる異種抗原に対するＴ−及びＢ−細胞応答を誘発する。

図１ａ〜ｄは、単回のＭＶＡ−ＢＮワクチン接種後の成体マウスに対する新生仔マウスにおけるワクシニア−特異的免疫応答の比較を示す。新生仔又は成体のＣ５７ＢＬ／６に、高用量（１×１０^８ＴＣＩＤ_５０）又は低用量（２×１０^６ＴＣＩＤ_５０）のＭＶＡを用いて免疫した。免疫の１、２、３、４又は７週後に動物から採血し、屠殺した。（ａ）血清中のワクシニア−特異的ＩｇＧをＥＬＩＳＡにより測定した。幾何平均力価＋／−平均値の標準誤差（ＧＭＴ ＋／− ＳＥＭ）を示す。（ｂ）脾臓中のＢ８Ｒ−特異的ＩＦＮγ−分泌性ＣＤ８＋Ｔ−細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定した。割合の平均＋／−平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。（ｃ）脾臓中のグランザイムＢ−発現ＣＤ８＋Ｔ−細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定した。割合の平均＋／−平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。（ｄ）脾臓から分離したＢ８Ｒ−特異的ＣＤ８＋Ｔ−細胞集団内のエフェクター細胞（ＣＤ４４^ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌ⁻ＣＤ１２７⁻）、エフェクターメモリー細胞（ＣＤ４４^ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌ⁻ＣＤ１２７^＋）、セントラルメモリー細胞（ＣＤ４４^ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ１２７^＋）の分布（％による）をフローサイトメトリーにより測定した。割合の平均＋／−平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。２種の用量のＭＶＡ−ＢＮで免疫した新生仔マウスでは分布は同じであった。１×１０^８ＴＣＩＤ_５０用量のみを示す。１週齢のマウスの分析は、脾臓中のＣＤ８＋Ｔ−細胞の数が不十分なため、不可能であった。 図２ａ〜ｄは、１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡで免疫された新生仔がＥＣＴＶ免疫に対して完全な防御を誘発することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、出生時に、高用量（１×１０^８ＴＣＩＤ_５０）又は低用量（２×１０^６ＴＣＩＤ_５０）のＭＶＡを用いて免疫し、又はＴＢＳを投与した。免疫の４週後、マウスに１×１０^４ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶを免疫した。（ａ）生存率及び（ｂ）相対的な体重変化の割合（平均＋／−ＳＥＭ）を２１日間監視した。同様に、出生時に、マウスに１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡを免疫し、（ｃ）免疫７週後に３×１０^４ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶ、又は（ｄ）免疫２週後に１×１０^２ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶを免疫した。 図３ａ〜ｄは、防御がＴ−及びＢ−細胞免疫応答に依存することを示す。（ａ，ｂ）ＦＬＴ３又は（ｃ，ｄ）ＴＣＲβδノックアウトマウスに、出生時に、１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡで免疫し、４週後に１×１０^３ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶで免疫した。（ａ，ｃ）生存率を２１日間監視した。（ｂ，ｄ）死亡時又は観察期間の最後に、肺を剖検し、均質化し、肺あたりのＥＣＴＶ力価を、プラークアッセイにより測定した（ＧＭＴ＋／−ＳＥＭ）。 図４ａ〜ｄは、Ｔ−及びＢ−細胞応答の両者が、完全な防御のために必要であることを示す。（ａ，ｂ）β２ｍノックアウト、又は（ｃ，ｄ）Ｔ１１μＭＴトランスジェニックマウスを、出生時に１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡで免疫し、４週後に１×１０^４ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶで免疫した。（ａ，ｃ）生存率を２１日間監視した。（ｂ，ｄ）死亡時又は観察期間の最後に、肺を剖検し、均質化し、肺あたりのＥＣＴＶ力価を、プラークアッセイにより測定した（ＧＭＴ＋／−ＳＥＭ）。 図５ａ〜ｂは、新生仔及び成体マウスにおける、組換え型ＭＶＡ−はしかワクチンの免疫原性を示す。（ａ，ｂ）新生仔又は成体のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ−はしかを用い、３週間離し、２度免疫した。（ａ）更に、新生仔の数頭には出生時にのみ免疫した。成体マウスは、最初の免疫の２、３、４及び５週後に採血したが、新生仔は、出生後３週間にのみ採血することができた。その後、２週毎に（４回）採血し、屠殺時（新生児の免疫の１５週後）に再度採血した。はしか特異的ＩｇＧを、ＥＬＩＳＡにより測定した（ＧＭＴ＋／−ＳＥＭ）。（ｂ）２度目の免疫の２週間後、はしか−特異的Ｔ−細胞を、ヌクレオカプシド特異的ペプチドを用いた脾細胞のインビトロ刺激後に測定し、ＩＦＮγの分泌細胞をＥＬＩＳｐｏｔにより検出した（刺激指数の平均値＋／−ＳＥＭ）。 図６は、ＭＶＡ又はＵＶ処理したＭＶＡで１回ワクチン接種した後の新生仔マウスにおける長期間のワクシニア特異的Ｂ−細胞応答を示す。新生仔Ｃ５７ＢＬ／６に、１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ、又は１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＵＶ処理したＭＶＡで免疫した。免疫の１、２、３、４、７又は１６週後に、動物を採血し、屠殺した。血清中のワクシニア特異的ＩｇＧをＥＬＩＳＡにより測定した。幾何平均力価＋／−平均値の標準誤差（ＧＭＴ＋／−ＳＥＭ）を示す。 図７は、ＭＶＡ又はＵＶ処理したＭＶＡで１回ワクチン接種した後の新生仔マウスにおける長期間のワクシニア特異的Ｔ−細胞応答を示す。新生仔Ｃ５７ＢＬ／６に、１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ、又は１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＵＶ処理したＭＶＡで免疫した。免疫の１、２又は１６週後に、動物を屠殺した。ワクシニア特異的Ｔ−細胞を、Ｂ８Ｒ特異的ペプチドを用いた脾細胞のインビトロ刺激後に測定し、ＩＦＮγ分泌細胞をＥＬＩＳｐｏｔにより検出した（刺激指数の平均値＋／−ＳＥＭ）。 図８は、成体マウスと比較した、新生仔マウスにおけるＣＤ８＋Ｔ−細胞の頻度を示す。１−、２−、３−、４−及び７−週齢の新生仔マウスについては、脾臓中のＣＤ８＋Ｔ−細胞の割合は、フローサイトメトリーにより測定し、成体マウスと比較した。割合の平均＋／−平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。 図９ａ〜ｂは、ウイルス排除のためには、免疫グロブリンクラススイッチが必要であることを示す。活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）ノックアウトマウスに、出生時に、１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡで免役し、４週後に１×１０^４ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶで免疫した。（ａ）生存率を２１日間監視した。（ｂ）死亡時又は観察期間の最後に、肺を剖検し、均質化し、肺あたりのＥＣＴＶ力価を、プラークアッセイにより測定した（ＧＭＴ＋／−ＳＥＭ）。

ヒト集団における潜在的なバイオテロ攻撃又は人畜共通痘瘡ウイルスの出現の脅威は、ＡＣＡＭ２０００（商標）についての禁忌の危険にある住民に適した、より安全な第三世代の天然痘ワクチンを開発するためのいくつかの努力を促し、天然痘ワクチンは、現在米国で許可されている。しかし、危険にある集団には、アトピー性皮膚炎のような皮膚疾患を患っているＨＩＶ患者、又は免疫不全状態の個人だけでなく、免疫系が未熟な１歳未満の子供たちも含まれる。複製欠損生ウイルスとしての優れた安全プロファイルを有するＭＶＡ−ＢＮは、マウスにおける生まれて最初の週にウイルス感染に対する広域なスペクトル抵抗を増強することが、以前、示された（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２，６３０４−６３１２（２００４））。

出生直後に致死的感染から保護されることが不可能でないなら、新生児を処置しないことは困難であると考えられる。しかし、ワクチン接種用量を、１×１０^８ＴＣＩＤ_５０の変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に増加させることにより、出生時のマウスの１回の免疫により、致死的なオルソポックスウイルスの攻撃からの十分な防御が急速に付与される、完全な機能的Ｔ−及びＢ−細胞応答が誘発されることが証明された。意外にも、防御は２週間以内に誘発され、主にＴ−細胞依存的である。更に、この１回のワクチン接種により、免疫学的なＴ−細胞記憶及び抗体の中和の持続が得られる。したがって、出生後早期にＭＶＡを投与することにより、致死的疾患に対する即時的かつ長期の防御が誘発され、小児期早期のワクチンのためのプラットフォームとして魅力的に思われる。

出生時にＭＶＡによりマウスを１回投与することにより、自然免疫反応だけでなく、エフェクター及び長期メモリーＴ細胞のような適応免疫反応、並びに中和抗体反応も誘発される。重要なことには、ワクチン接種の２週間以内に、適応免疫反応は、ＥＣＴＶによる致死的な鼻腔内攻撃からマウスを完全に保護する。

本明細書において、Ｔ細胞にとっての重要な役割が新生仔マウスに存在することが示される。低用量の２×１０^６ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡで免疫した場合に、強力な細胞毒性Ｔ−細胞応答が誘発され、これにより、検出可能な抗体応答の非存在下でのＥＣＴＶ攻撃からの部分的な防御がもたらされる。完全な防御は、Ｂ−細胞応答をも誘発する用量である、高用量の１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡのワクチン接種後にのみ達成される。これは、部分的防御が、出生時のＭＶＡの１回のワクチン接種後に完全な防御を達成するためには、Ｂ−細胞も必要であることを示す、Ｔ１１μＭＴトランスジェニックマウスにおいて確認された。

本発明は、ヒトの新生児又は幼児における、痘瘡ウイルスに対する防御免疫応答を誘発するための組成物及び方法を包含する。一実施態様においては、本発明は、少なくとも１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量のＭＶＡをヒトの新生児又は幼児に投与することを含む。ＭＶＡは、免疫系が完全に成熟する前のヒトの新生児又は幼児に投与することができる。

本発明は、更に、ヒトの新生児又は幼児において、痘瘡ウイルスに対する防御免疫応答を誘発するために使用されるＭＶＡを含む。

本発明は、また、ヒトの新生児又は幼児にワクチン接種するために使用されるＭＶＡを含む。本発明は、また、ヒトの新生児又は幼児を治療するためのワクチンとしてのＭＶＡの使用、並びにヒトの新生児又は幼児を治療し、ワクチン接種するためのワクチン又は医薬の調製におけるＭＶＡの使用を含む。

ヒトの新生児及び幼児
本発明の関係において、「ヒトの新生児」という用語は、１ヶ月齢未満の新生児を意味し、「ヒトの幼児」という用語は、出生から１歳のヒトを意味する。好ましくは、ヒトの新生児は、４週齢未満、３週齢未満、２週齢未満、又は１週齢未満である。更に好ましくは、ヒトの新生児は、６、５、４、３、２又は１日齢未満である。

一実施態様においては、ある用量のＭＶＡがヒトの新生児に投与される。種々の実施態様においては、ある用量のＭＶＡが、４週齢未満、３週齢未満、２週齢未満、又は１週齢未満のヒトの新生児に投与される。種々の実施態様においては、ある用量のＭＶＡが、６、５、４、３、２又は１日齢未満のヒトの新生児に投与される。好ましい実施態様においては、ある用量のＭＶＡが、生後３、２又は１日以内にヒトの新生児に投与される。

一実施態様においては、ある用量のＭＶＡが、６、５、４、３、２又は１ヶ月齢未満のヒトの幼児に投与される。種々の実施態様においては、ある用量のＭＶＡが、８週齢未満、７週齢未満、６週齢未満、又は５週齢未満のヒトの幼児に投与される。好ましい実施態様においては、ある量のＭＶＡが、生後２ヶ月未満のヒトの幼児に投与される。

変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス
本発明は、ありとあらゆるＭＶＡウイルスを包含する。好ましいＭＶＡウイルスとしては、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ０ＪＧ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ（ＥＣＡＣＣ）に受託番号Ｖ０００８３００８として２０００年８月３０日に寄託されている）、ＭＶＡ−５７５（ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ００１２０７０７として２０００年１２月７日に寄託されている）、及びＭＶＡ−５７２（ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ９４０１２７０７として１９９４年１月２７日に寄託されている）等のＭＶＡ変異株が挙げられる。寄託されている株の誘導体も好ましい。

好ましくは、ＭＶＡは、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）若しくは他の鳥類細胞株においてインビトロで、又は孵化鶏卵においてインビボで再生複製能力を有するが、ＭＶＡ５７５又はＭＶＡ５７２が再生的に複製し得るヒト細胞内では再生複製能力を有していない。最も好ましくは、ＭＶＡは、ヒトケラチノサイト株化細胞ＨａＣａｔ、ヒト胎児由来腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３とも呼ばれる）、ヒト骨肉腫株化細胞１４３Ｂ、及びヒト子宮頸がん株化細胞ＨｅＬａ内で再生複製能力を有しない。

好ましい実施態様においては、変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスは、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）におけるインビトロでの再生複製能力を有することにより、また、ヒトケラチノサイト株化細胞ＨａＣａｔ内、ヒト骨肉腫株化細胞１４３Ｂ、及びヒト子宮頸がん株化細胞ＨｅＬａ内で、ＭＶＡ−５７５よりも弱毒化されることにより特徴づけられる。好ましくは、ＭＶＡウイルスは、ＣＥＦ細胞内で５００倍以上の増幅率が可能である。ウイルスの「増幅率」は、第一段階にいて細胞を感染させるために最初に使用された量（Ｉｎｐｕｔ）に対する、感染細胞から産生された（Ｏｕｔｐｕｔ）ウイルスの比である。Ｏｕｔｐｕｔ及びＩｎｐｕｔ間の「１」の比は、感染細胞から産生されたウイルス量が、細胞を感染するために最初に使用された量と同じである増幅状態と定義される。

組換え型ＭＶＡ
本発明は、ありとあらゆるＭＶＡウイルスを用いて生成された組換え型ＭＶＡウイルスを含む。一実施態様においては、組換え型ＭＶＡウイルスは、組換え型ＭＶＡ−ＢＮウイルスである。組換え型ＭＶＡウイルスは、少なくとも１つの異種核酸配列を含む。本発明との関連で、「異種」核酸配列という用語は、ＭＶＡ内に自然には見られない核酸配列を意味する。

好ましくは、異種核酸配列は、少なくとも１つの抗原、抗原性エピトープ、及び／又は治療化合物をコードする配列である。抗原性エピトープ及び／又は抗原は、感染性因子の抗原性エピトープ及び／又は抗原であってもよい。感染性因子は、ウイルス、真菌類、病原性単細胞真核又は原核生物、及び寄生生物であってもよい。ある実施態様においては、感染性因子は、以下のいずれか、すなわち、ロタウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス（特に、デング熱ウイルス及び黄熱病ウイルス）、パラミクソウイルス（特に、はしかウイルス、おたふくかぜウイルス、及び呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ））、肝炎ウイルス（特に、Ａ型、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス）、ヒト免疫不全ウイルス（特に、ＨＩＶ−１）、フィロウイルス（特に、エボラウイルス及びマールブルクウイルス）から選択されるウイルス、又は出血熱を起こす他のウイルスである。ある実施態様においては、感染性因子は、以下のいずれか、すなわち、炭疽菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、インフルエンザ菌、ジフテリア菌、破傷風菌、ブルクホルデリア、野兎病菌、コクシエラ菌、又は百日咳菌から選択される細菌である。

Ｔ−細胞応答を誘発するものを含む、任意の抗原は、本発明の組換え型ＭＶＡにより発現することができる。ウイルス、細菌、真菌及びがん抗原が好ましい。好ましい抗原は、上述したウイルス又は細菌のいずれかの抗原である。ＨＩＶ−１抗原、デング熱ウイルス抗原、炭疽菌抗原、はしかウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ピコナウイルス抗原、コロナウイルス抗原、及び呼吸器合抱体ウイルス抗原が、特に好ましい抗原である。好ましくは、抗原は異種抗原又は新抗原である。本発明との関連において、「新抗原」という用語は、痘瘡ウイルスベクターによって自然には発現されない抗原を意味する。

ある実施態様においては、投与により、組換え型ＭＶＡによってコードされる異種抗原に対するＴ−及び／又はＢ−細胞応答が誘導される。Ｔ−細胞応答は、エフェクター及び／又は長期メモリーＴ−細胞応答であってもよい。Ｂ−細胞応答は、中和抗体応答であってもよい。

投与
本発明は、ある用量のＭＶＡを、任意の経路によりヒトの新生児又は幼児に投与することを含む。好ましい投与経路としては、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、骨髄内（ｉ．ｂｍ．）又は静脈内（ｉ．ｖ．）注射、経口投与、及び粘膜投与、特に鼻内投与、又は吸入が挙げられる。投与される量（用量）は、治療すべき対象に依存し、特に、患者の状態、固体の免疫系の状態、投与経路、及び宿主の大きさを考慮する。

本発明は、更にヒトの新生児又は幼児にワクチン接種するための医薬組成物又はワクチンとして使用するためのＭＶＡ、ヒトの新生児又は幼児を治療するための医薬組成物又はワクチンとしてのＭＶＡの使用、並びにヒトの新生児又は幼児を治療し、又はワクチン接種するための医薬組成物、ワクチン又は医薬の調製におけるＭＶＡの使用を含む。

医薬組成物、ワクチン又は医薬は、通常、薬学的に許容され、及び／又は承認される、担体、添加剤、抗生物質、防腐剤、補助剤、希釈剤及び／又は安定化剤等の、１種以上の補助物質を含んでいてもよい。このような補助物質は、水、食塩水、グリセロール、エタノール、油、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質等であってもよい。適切な担体は、通常、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体のような、大きな、徐々に代謝される分子である。

本発明の医薬組成物、ワクチン、又は医薬、ＭＶＡの調整は、生理学的に許容される形状に変換し得る。これは、天然痘に対するワクチンのために使用される痘瘡ウイルスの調製における実験に基づいて実施することができる（Ｓｔｉｃｋｌら、１９７４に記載されている）。精製したウイルスは、液体中で凍結し、−２０℃又は−８０℃に保存することができる。好ましくは、ウイルスは５×１０^８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価を有し、緩衝溶液、例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ ７．４中に製剤化することができる。

ウイルス製剤は、インビボ投与に適した、マンニトール、デキストラン、糖類、グリシン、乳糖若しくはポリビニルピロリドン等の追加の添加剤、又は抗酸化剤、不活性ガス、安定化剤若しくは組換え型タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、又はＨＳＡ）等の他の補助物質を含んでもよい。

また、ワクチンは、製剤中のウイルスの段階的な凍結乾燥により製造することができる。例えば、１０^８個のウイルス粒子を、アンプル、好ましくはガラスアンプル内で、２％ペプトン及び１％ＨＳＡの存在下、１００μＬ〜１ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥することができる。その後、ガラスアンプルを密封し、４℃〜室温で数ヶ月保存することができる。しかし、必要でない限り、アンプルは好ましくは−２０℃未満で保存される。

ワクチン接種又は治療のために、ウイルスは、全身又は局所に、すなわち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、又は当業者に公知の他のあらゆる投与経路によって投与することができる。

用量
本発明は、ヒトの新生児又は幼児に投与される、少なくとも１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量のＭＶＡを含む。好ましくは、前記用量は、少なくとも１０^８ＴＣＩＤ_５０、２×１０^８ＴＣＩＤ_５０、３×１０^８ＴＣＩＤ_５０、４×１０^８ＴＣＩＤ_５０、５×１０^８ＴＣＩＤ_５０、６×１０^８ＴＣＩＤ_５０、７×１０^８ＴＣＩＤ_５０、８×１０^８ＴＣＩＤ_５０、９×１０^８ＴＣＩＤ_５０、又は１０^９ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡである。特に好ましい用量は、２×１０^８ＴＣＩＤ_５０、３×１０^８ＴＣＩＤ_５０、４×１０^８ＴＣＩＤ_５０、５×１０^８ＴＣＩＤ_５０、６×１０^８ＴＣＩＤ_５０、７×１０^８ＴＣＩＤ_５０、８×１０^８ＴＣＩＤ_５０、９×１０^８ＴＣＩＤ_５０、又は１０^９ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡである。特に好ましくは、１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量である。

ヒトの新生児又は幼児は、追加（追加免疫）の投与なしで、ＭＶＡの１回の投与によりワクチン接種をすることができる。他の実施態様においては、１回以上の追加投与が実施される。一実施態様においては、２度目の投与は、最初のワクチン接種の４週〜８週後に実施される。好ましくは、２度目の投与は、最初のワクチン接種の２、４、６又は８週後に実施される。他の実施態様においては、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の追加の投与が実施される。

追加免疫投与は、最初の応答が弱かった場合に免疫応答を増強させるため、又は最初の応答を更に増強させるために投与することができる。したがって、ある実施態様においては、追加免疫投与は、免疫応答の所望のレベルを増強又は再確立するために設けられている。

最初の投与と２度目の投与の間の時間、並びに投与と次の投与の間の時間は変化し得る。一実施態様においては、投与間の時間は２〜６週間である。種々の実施態様においては、投与間の時間は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１５、３０又は５２週間である。種々の実施態様においては、投与間の時間は、少なくとも１、３、６、９、１２、２４、３６又は４８ヶ月である。種々の実施態様においては、投与間の時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０年である。

防御免疫応答
本発明は、ある量のＭＶＡをヒトの新生児又は幼児に投与することにより、痘瘡ウイルスに対する防御免疫応答を誘発することを含む。好ましくは、この投与により、ヒトの新生児又は生後６ヶ月より前の幼児において痘瘡ウイルスに対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答が誘発される。最も好ましくは、免疫応答は、ＭＶＡの２度目の投与なしで誘発される。本発明との関連において、「免疫応答がＭＶＡの２度目の投与なしで誘発される」という表現は、免疫応答がＭＶＡの２度目の（すなわち、追加）の用量の投与に依存しないことを意味する。免疫応答は、最初の投与により誘発される。したがって、本発明との関連において、「免疫応答がＭＶＡの２度目の投与なしで誘発される」という表現は、２度目の投与が実施されないことを意味せず、これは、２度目の投与が防御免疫応答を誘発するのに必要でないことのみを意味する。ある実施態様においては、２度目又はそれ以降の投与が実施される。２度目又はそれ以降の投与は、免疫応答のレベルを増強し、及び／又は免疫応答の期間を延長し得る。

防御免疫応答は、ＭＶＡが投与された新生児又は幼児の少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を、死及び／又は疾患の症状から防御することができる。

好ましくは、防御免疫応答は、痘瘡ウイルス、特にオルソポックスウイルスに対するものである。ある実施態様においては、痘瘡ウイルスはワクシニアウイルス又は天然痘ウイルスである。最も好ましくは、防御免疫応答は天然痘に対するものである。

好ましくは、防御免疫応答は、ヒトの新生児又は生後６ヶ月より前の幼児において誘発される。更に好ましくは、防御免疫応答は、ヒトの新生児又は生後５、４、３、２又は１ヶ月より前の幼児に誘発される。最も好ましくは、防御免疫応答は、ヒトの新生児又は幼児において、投与の４、３又は２週以内に誘発される。

組成物
本発明は、防御免疫応答を誘発するために幼児又は新生児に投与するための少なくとも１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量のＭＶＡを含む、医薬組成物及びワクチンを含む。好ましくは、組成物は、１０^８ＴＣＩＤ_５０、２×１０^８ＴＣＩＤ_５０、３×１０^８ＴＣＩＤ_５０、４×１０^８ＴＣＩＤ_５０、５×１０^８ＴＣＩＤ_５０、６×１０^８ＴＣＩＤ_５０、７×１０^８ＴＣＩＤ_５０、８×１０^８ＴＣＩＤ_５０、９×１０^８ＴＣＩＤ_５０、又は１０^９ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡを含む。特に好ましい用量は、２×１０^８ＴＣＩＤ_５０、３×１０^８ＴＣＩＤ_５０、４×１０^８ＴＣＩＤ_５０、５×１０^８ＴＣＩＤ_５０、６×１０^８ＴＣＩＤ_５０、７×１０^８ＴＣＩＤ_５０、８×１０^８ＴＣＩＤ_５０、９×１０^８ＴＣＩＤ_５０、又は１０^９ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡである。特に好ましくは、１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量である。

実施例
以下の実施例は、本発明を更に詳細に説明する。提供される実施例は、本発明により提供される技術の適用性を本実施例に限定するように解釈されることはないと当業者に理解されるであろう。

実施例１：マウス
タイミングよく交配した（ｔｉｍｅ−ｍａｔｅｄ）、メスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎから得たが、Ｃ５７ＢＬ／６をバックグラウンドとする、Ｂ−細胞受容体／Ｔ１１μＭＴトランスジェニック、活性化誘導シチジンデアミナーゼ欠損（ＡＩＤ−欠損）、ＭＨＣクラスＩ／β２ｍ−欠損、Ｔ−細胞受容体βδ欠損及びＦＬＴ３−欠損マウスは、チューリッヒ大学の動物施設又はバヴァリアンノルディック−ミュンヘンから得た。同腹仔をオスメス一緒にした。子供は、４週齢で離乳した。

実施例２：ワクチン及びウイルスによる免疫
使用したＭＶＡは、バヴァリアンノルディックにより開発され、ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８で寄託されているＭＶＡ−ＢＮ（上記を参照されたい）であった。組換え型ＭＶＡ−はしかワクチンＭＶＡ−ｍＢＮ８５Ｂは、３つのはしか遺伝子、Ｆｕｓｉｏｎ−、Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−及びＮｕｃｌｅｏ−タンパク質をコードしている。遺伝子配列は、はしか株Ｋｈａｒｔｏｕｍ ＳＵＤ／３４．９７（遺伝子型Ｂ３）のＲＮＡから得た。両方のウイルスを増殖させ、１１日齢の病原体を含まない有胚雌鳥卵（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から調製したニワトリ胚繊維芽細胞の初代培養細胞に滴下し、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。ＥＣＴＶ株Ｍｏｓｃｏｗは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から、受託番号ＶＲ−１３７２で得、増殖させ、Ｖｅｒｏ Ｃ１００８細胞（ＥＣＡＣＣ受託番号８５０２０２０６）に滴下し、１０％ＦＣＳを補充し、抗生物質を含まないダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に維持した。全てのウイルスは、スクロースクッションにより精製した。

実施例３：免疫及び追加免疫
生後６〜２４時間以内に、５０μＬのウイルス懸濁液により皮下注射によってマウスを免疫した。成体に対する新生仔の比較のために、８週齢の動物を使用した（すなわち、成体は８週齢であった）。低用量（２×１０^６ＴＣＩＤ_５０）又は１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＵＶ不活化ＭＶＡを投与した数頭の動物を除き、１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ又はＭＶＡ−ｍＢＮ８５Ｂを投与した（Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１８，１７７６−１７８４（２００８））。対照の動物は、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水、ｐＨ７．７で処置した。ＭＶＡ−ｍＢＮ８５Ｂについては、３週間離して２回マウスを免疫した。免疫原性試験については、種々の時点で動物を採血し、屠殺し、脾臓をフローサイトメトリー分析で処理した。

ＥＣＴＶによる免疫のため、マウスをケタミン／キシラミンで麻酔し、２５μＬ容量のウイルスを鼻腔内に投与し、２週齢の動物については１２．５μＬ容量のウイルスを投与した。各年齢群及びマウス株について、２週間以内に１００％の死亡を誘発し、検死胚中に約８Ｌｏｇ_１０ｐｆｕのウイルス量を示す最適用量を決定した。２９日齢のマウスについて、最適用量は、ＦＬＴ３欠損及びＴＣＲβδ欠損マウスを除き、１×１０^４ＴＣＩＤ_５０であった（成体のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスについて決定したＬＤ_５０の４倍；Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ １１８， １７７６−１７８４（２００８））。これらの非常に感受性のマウスでは、１×１０^３ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶは十分であった。２週齢及び７週齢のマウスについては、抗原投与量は、それぞれ１×１０^２ＴＣＩＤ_５０及び３×１０^４ＴＣＩＤ_５０であった。抗原投与後、体重減少、及び死亡を２１日間監視した。５〜７頭の子供を各群に含ませ、データは２又は３つの実験の代表値である。

実施例４：ＥＣＴＶプラークアッセイ
検死胚中のウイルス量を測定するためにＥＣＴＶプラークアッセイを使用した。胚を均質化し、１：１００で開始し、４倍の連続希釈を用い、Ｖｅｒｏ Ｃ１００８細胞上で力価を測定した。インキュベーション及びクリスタルバイオレット染色（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の３日後、１５０以下の平均プラーク数を示す最初の希釈段階から力価を計算した。

実施例５：ＥＬＩＳＡ
ワクシニア特異的血清ＩｇＧの力価は、既に開示されているような直接ＥＬＩＳＡ（Ｇａｒｚａら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２７，５４９６−５５０４（２００９））により測定した。手短に言えば、９６ウェルプレートをＭＶＡ抗原で一晩コーティングした。１：５０で開始し、２倍の連続希釈を用い、試験血清を滴定した。検出抗体として、ヒツジ抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）を使用した。抗体価は線形回帰により計算し、ＯＤ_４５０における、０．３０の吸光度を与える血清希釈度として定義された。はしか特異的血清ＩｇＧの力価は、Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）を用いて測定したが、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合した、ヤギ抗−マウスＩｇＧを使用した。

実施例６：プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイ
ワクシニアをベースとするＰＲＮＴアッセイは、Ｇａｒｚａら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２７，５４９６−５５０４（２００９）に記載されたように実施した。手短に言えば、熱不活化した血清を連続希釈し、ワクシニアウイルスウエスタンリザーブ株（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）とインキュベートした。インキュベーション後、混合物をＶｏｒｏ細胞に７０分間吸着させた。次いで、重層培地を加え、プラークを２４時間インキュベートした。クリスタルバイオレットで染色した後、中和力価を、５０％の成熟ウイルスを中和し得る血清希釈度として決定した。

実施例７：フローサイトメトリー及びＥＬＩＳｐｏｔ
赤血球溶解後、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下、Ｂ８Ｒ−ペプチド（Ｔｓｃｈａｒｋｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１，９５−１０４（２００５））（５μｇ／ｍＬ Ｂ８Ｒ_{２０−２７}）， Ｃｏｒｉｎｇ）とともに、又はなしで、脾細胞の一部を、５時間インキュベートした。次いで、細胞を、抗−ＣＤ８＋−ｅＦｌｕｏｒ（商標）−４５０、抗−ＣＤ４＋−ｅＦｌｕｏｒ（商標）−７８０、抗−ＣＤ４４−ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ６２Ｌ−ＰｅｒｃＰ−Ｃｙ５．５、抗−ＣＤ１２７−ＡＰＣ、抗−ＩＦＮγ−ＰＥ−Ｃｙ７（全て、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗−Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により染色した。固定／透過処理（ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）後、細胞内染色を実施した。フローサイトメトリー分析は、ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）によりデータを分析した。残りの脾細胞を、Ｂ８Ｒ／ワクシニア−又はＮ／はしか−特異的（Ｈａｌａｓｓｙら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２４，１８５−１９４（２００６）；Ｂｅｒｇｅｎら，ＰＬｏＳ ｏｎｅ ５（４）：ｅ１０２９７，２０１０）ペプチド（５μｇ／ｍＬ；ａａ３３５〜３４５；Ｎ）を用い、又は用いずに２０時間刺激し、ＩＦＮγ分泌細胞を、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により検出した。刺激指数は、特異的刺激により得られるスポット数から、比刺激細胞からの非特異的スポット数を引くことにより得た。

実施例８：新生仔マウスにおいて、抗体の中和、並びにエフェクター及び長期メモリーＴ−細胞はＭＶＡによって誘発される
新生仔マウスにおいて以前に使用した高用量（１×１０^８ＴＣＩＤ_５０）又は低用量（２×１０^６ＴＣＩＤ_５０）のＭＶＡにより、出生時に新生仔マウスを免疫した（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２，６３０４−６３１２（２００４））。ワクシニア特異的ＩｇＧ抗体応答は、免疫の１、２、３、４及び７週後に実施した酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）により決定した（図１ａ）。成体のマウスでは、１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡの１回の免疫の７日後にワクシニア特異的抗体が検出され、１週間後に一定の値に達した。意外にも、出生時の１回の高用量免疫後の特定のＩｇＧ応答は、１〜２週の遅れはあるが、同程度の抗体レベルに達した（図１ａ）。新生仔免疫系が未熟であるにもかかわらず、完全な血清転換は観察されず、力価は成体マウスよりも約１０倍低かったが、ワクシニア中和抗体さえ誘発された（表１）。

出生時にＭＶＡ−ＢＮにより１回免疫することにより誘発されたＢ−細胞応答は、免疫の１６週後にも、いまだに検出可能であり（図６）、出生の３又は４週後の２度目の免疫により、応答は増強した。Ｂ−細胞応答と同様に、出生時にＭＶＡにより免疫することによって誘導されたＣＤ８＋Ｔ−細胞におけるわずかな遅延が観察された。新生仔マウスの免疫２週後にＩＦＮγ細胞内染色により測定した、ワクシニア特異的Ｔ−細胞応答は、免疫１週後に観察された成体マウスでのピーク応答と類似していた（図１ｂ）。低用量のＭＶＡをワクチン接種した後に抗体応答は検出することができなかった（図１ａ）のに対し、低用量のワクチン接種により、同程度又は高いレベルのＴ−細胞応答が誘発された（図１ｂ）。出生時にＭＶＡのワクチン接種によって誘導されるワクシニア特異的Ｔ−細胞の存在は、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイにより確認され、免疫の１週後には、すでにワクシニア特異的ＩＦＮ−γ産生細胞を検出する。（図７）。１週齢のマウスの脾臓中のＣＤ８＋Ｔ−細胞数が少ないことを考慮すると、この初期の時点では、いっそう顕著である（図８）。また、Ｔ−細胞活性化は、ＣＤ８＋Ｔ−細胞集団内のグランザイムＢ発現の分析によって確認された。この細胞障害性Ｔ−細胞のエフェクター分子は、１週間遅れにもかかわらず、成体にもたらされるのと類似の発現レベルでＭＶＡの両方の量で出生時の免疫によって誘導された（図１ｃ）。より詳細な分析のために、ワクシニア特異的ＣＤ８＋Ｔ−細胞を、Ｋａｅｃｈら，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，１１９１−１１９８（２００３）に記載されたように、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１２７の発現の差に基づいて、エフェクター細胞、エフェクターメモリー細胞及びセントラルメモリー細胞に細分化した。予想されるように、ワクシニア特異的Ｔ−細胞の大部分は、新生仔及び成体マウスの両方におけるＴ−細胞応答のピークにおいてエフェクター細胞であった（図１ｄ）。その後の収縮期の間に、両方の年齢群において、同様のエフェクターメモリー又はセントラルメモリーの表現型を獲得した（図１ｄ）。Ｂ−細胞応答としては、ＭＶＡに特異的なＴ−細胞は、新生仔の免疫の１６週後にもまだ検出可能であった（図７）。非複製ＭＶＡの転写及びタンパク質合成のための要件を示す抗原特異的Ｂ−及びＴ−細胞応答は、免疫前のＭＶＡのＵＶ処理後に誘導されなかった（図６及び７）。ＵＶ処理後の抗原特異的Ｂ−及びＴ−細胞応答がないことは、単純ヘルペスウイルスについて以前に示されていた（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５，８３−８９（２００１））。

実施例９：ＭＶＡは、２週齢のマウスにおいて、致死的なＥＣＴＶの投与に対して防御を誘発する
出生時におけるＭＶＡの免疫によって誘発されるＴ−及びＢ−細胞応答の機能性を更に調査するため、更に、鼻腔内ＥＣＴＶ投与モデルと若いマウスに適応した。低用量又は高用量のＭＶＡを用いた出生４週後の免疫は、動物に、１×１０^４ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶを鼻腔内経路により投与した。プラセボ（トリス緩衝食塩水、ＴＢＳ ｐＨ７．７；１．２１ｍｇ／ｍＬのＴＲＩＳ−（ヒドロキシメチル）−アミノ−メタン、８．１８ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム）で処置した、全ての対照マウスは、肺に約８Ｌｏｇ_１０ＥＣＴＶのプラーク形成単位（ｐｆｕ）を伴い、投与９〜１２日後に死亡した（図２ａ）が、１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡで処置した全てのマウスは、処置されなければ致死的である投与から生き延び、わずかな一時的体重減少後に完全に回復した（図２ａ及び２ｂ）。ワクチン接種した全てのマウスは、肺からＥＣＴＶが除去され、完全に防御されることが確認された。低用量のＭＶＡによる免疫により、この群における投与前にＴ−細胞応答のみが検出され、抗体を検出することができないにもかかわらず、８０％のマウスで保護された（図２ａ）。生存率の低下に加え、低用量で免疫されたマウスは、１×１０^８ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡをワクチン投与したマウスと比較し、疾患の症状及び体重減少の増大を示した（図２ｂ）。ＭＶＡ−ＢＮを新生仔に免疫した後にＢ−及びＴ−細胞応答について観察された寿命は（図６及び７）、成体における防御を長期間とし、マウスは、試験を行った最も遅い時点、すなわち新生仔免疫の７週後に、３×１０^４ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶの致死的用量の投与から完全に保護された（図２ｃ）。一方、動物の大きさのためにＥＣＴＶ投与が技術的に実行可能な最も早い時点である、新生仔免疫の２週後において、防御は既に立証することができた。この週齢では、１０^２ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶは６〜８日以内に未処置マウスを死亡させるが、出生時のＭＶＡ免疫は１００％防御した（図２ｄ）。

実施例１０：致死的ＥＣＴＶ投与に対する防御は適応免疫応答に依存する
出生時におけるＭＶＡの注射が、ＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ）の増加により、ｐＤＣ及び白血球前駆体の初期発生を増大させ、出生後の最初の１週間のウイルス感染に対する抵抗性を増大させることを既に示している（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２，６３０４−６３１２（２００４）；Ｖｏｌｌｓｔｅｄｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６，１２３１−１２４０（２００６））。したがって、致死的なＥＣＴＶ投与に対する防御におけるＦＬＴ３−Ｌの役割を、ＦＬＴ３−Ｌノックアウトマウスを使用して調査した。これらのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスよりも約１０倍未満のｐＤＣを有しており、ｐＤＣの情報制御をすることができない。更に、これらのマウスは、他の細胞型の先天性免疫系を欠損している（Ｖｏｌｌｓｔｅｄｔ ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６，１２３１−１２４０ （２００６））。ＦＬＴ３−Ｌノックアウトマウスに、出生時にＭＶＡで免疫し、４週後に１×１０^３ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶを投与した。ワクチン接種した全てのマウスは感染に対して生き残り（図３ａ）、肺からＥＣＴＶが完全に除去された（図３ｂ）が、ワクチン接種していない全てのマウスは感染して死亡した。ＦＬＴ３−Ｌノックアウトマウスはウイルス感染に、より敏感であるため、この１×１０^３ＴＣＩＤ_５０ＥＣＴＶの低用量が選択された（図３ａ）。２週齢のＦＬＴ３−Ｌノックアウトマウスで同様の結果が得られた。Ｂ−及びＴ−細胞免疫応答は、両者ともｐＤＣレベルの低下及び他の先天性細胞の欠損によって影響されないので、先天性免疫系がＭＶＡにより誘発される防御の唯一の機構でないことが明らかに示された。

新生仔の免疫により付与される防御における適応免疫応答の役割を調べた。Ｔ−細胞受容体βδ（ＴＣＲβδ）ノックアウトマウスはＴ−細胞を欠損しており、Ｔ−ヘルパー細胞が存在しないため、ワクシニア特異的Ｂ−細胞応答を開始することができない。出生時にＭＶＡのワクチン接種を受けたＴＣＲβδノックアウトマウスは、１×１０^３ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶの鼻腔内投与を受けた１１〜１２日後に死亡し、これは、防御のための適応免疫応答の必要性を立証する（図３ｃ）。ＦＬＴ３−Ｌノックアウトマウスと同様に、この低用量の投与は、ＴＣＲβδノックアウトマウスのウイルス感染に対する急性感受性に基づいて選択された。死亡時、未処置及びＭＶＡで免疫したマウスの両者は、１×１０^４ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶを投与した未処置の野生型マウスよりも、肺中にウイルス量を有していた（図３ｄ）。上記２種のノックマウスモデルを使用することにより、新生仔免疫により付与される防御が、先天性免疫の増強により付与された非特異的耐性によるものでなく、比較的に未発達の免疫系により開始されるワクシニア特異的適応免疫応答により付与されることが示された。

実施例１１：Ｔ−及びＢ−細胞応答は、両者とも完全防御に必要である
防御における体液性免疫応答に対する細胞性免疫の役割を調べた。Ｔ−細胞が応答するが、ほとんど抗体を検出することができない時点で２週齢のマウスが防御されたという事実は、生まれたばかりのマウスの防御におけるＴ−細胞の優先的な役割についての概念を導く。実際に、β２ｍノックマウスにはＣＤ８＋Ｔ−細胞がないので、ＭＶＡによる免疫は防御を誘発しないが（図４ａ及びｂ）、抗体応答は影響を受けなかった。ワクシニア特異的Ｂ−細胞の必要性を評価するため、遺伝子改変マウスＴ１１μＭＴを利用した。これらのマウスはＶＳＶウイルスに特異的な再配列重鎖遺伝子を有しており、そのため、ＭＶＡによるワクチン接種によって特異的抗体を生成することができない。ワクシニア特異的Ｂ−細胞応答の非存在下で、ＭＶＡで免疫した、１頭のＴ１１μＭＴマウスは観察期間の最後の２日前にＥＣＴＶ感染で死亡し（図４ｃ）、２１日間の観察期間の最後に、わずか２／３のマウスが肺からＥＣＴＶを除去していた（図４ｄ）。ＩｇＭ応答のみを開始し得るＡＩＤノックアウトマウスで、同様の観察がなされた（図９）。まとめると、これらの結果は、出生時にＭＶＡワクチン接種によって誘発される完全な防御を付与するための抗体によるサポートを必要とする、細胞障害性Ｔ−細胞の重要な役割を明らかにした。

実施例１２：幼児疾患に対するワクチンのためのベクターとしての組換え型ＭＶＡ
出生時にＭＶＡによる１回の免疫が、短期及び長期の防御免疫を誘発したという事実は、子供用ワクチンを開発するためのウイルスベクターとしての使用機会を示唆している。したがって、幼児疾患に対するワクチンとしての組換え型ＭＶＡの可能性を、新生仔マウスモデルにおいてＭＶＡ−はしかを用いて分析した。ＭＶＡ−はしかは、ＭＶＡバックボーン内に３種の異なるはしかウイルスタンパク質、すなわち宿主細胞との結合及び融合に関与する赤血球凝集素、及び融合タンパク質、並びにウイルス一本鎖ＲＮＡと関連するヌクレオキャプシドタンパク質をコードしている。ＭＶＡによる新生仔のワクチン接種に見られるように、組換え型ＭＶＡ−はしかは、出生時における免疫及び３週間後の追加免疫後に強力なワクシニア特異的Ｂ−及びＴ−細胞応答をも誘発した。更に重要なことには、はしか特異的なＢ−及びＴ−細胞応答も容易に検出することができた（図５ａ及び５ｂ）。応答の規模は、ＭＶＡ−誘発性ワクシニア応答に見られる抗体応答と同様に１〜２週間の遅延があるにもかかわらず、同じスケジュールを用いたＭＶＡ−はしかでワクチン接種した成体マウスに見られるのと同等であった。この場合も、出生時にＭＶＡ−はしかによる１度のワクチン接種は、追加のワクチン接種を受けたマウスで観察されたのと比較してわずかに低いレベルで、強力かつ持続的なはしか特異的抗体応答を導いた（図５ａ）。

Claims (40)

1. 少なくとも１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量のＭＶＡをヒトの新生児に投与することを含む、ヒトの新生児又は生後６ヶ月未満の幼児において痘瘡ウイルスに対する防御免疫応答を誘導する方法であって、前記投与が、ＭＶＡの２度目の投与なしで、生後６ヶ月より前にヒトの新生児に痘瘡ウイルスに対する防御Ｔ−細胞及びＢ−細胞応答を誘導する、前記方法。
2. 前記投与が、生後２ヶ月未満のヒトの幼児に実施される、請求項１記載の方法。
3. 前記投与がヒトの新生児に実施される、請求項１記載の方法。
4. 前記投与が、出生後７２時間以内にヒトの新生児に実施される、請求項１記載の方法。
5. 前記投与が、オルソポックスウイルスに対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項１記載の方法。
6. 前記投与が、ワクシニアウイルスに対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項１記載の方法。
7. 前記投与が、天然痘に対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項１記載の方法。
8. ＭＶＡの１回以上の追加投与を更に含む、請求項１記載の方法。
9. 前記ＭＶＡが組換え型ＭＶＡである、請求項１記載の方法。
10. 前記投与が、前記組換え型ＭＶＡによりコードされる異種抗原に対するＴ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項９記載の方法。
11. 少なくとも１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量のＭＶＡをヒトの新生児又は生後６ヶ月未満の幼児に投与することを含む、ヒトの新生児又は幼児において痘瘡ウイルスに対する防御免疫応答を誘導する方法であって、前記投与が、投与２週間以内にヒトの新生児又は幼児において痘瘡ウイルスに対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘導する、前記方法。
12. 前記投与が、生後２ヶ月未満のヒトの幼児に実施される、請求項１１記載の方法。
13. 前記投与がヒトの新生児に実施される、請求項１１記載の方法。
14. 前記投与が、出生後７２時間以内にヒトの新生児に実施される、請求項１１記載の方法。
15. 前記投与が、オルソポックスウイルスに対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項１１記載の方法。
16. 前記投与が、ワクシニアウイルスに対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項１１記載の方法。
17. 前記投与が、天然痘に対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項１１記載の方法。
18. ＭＶＡの１回以上の追加投与を更に含む、請求項１１記載の方法。
19. 前記ＭＶＡが組換え型ＭＶＡである、請求項１１記載の方法。
20. 前記投与が、前記組換え型ＭＶＡによりコードされる異種抗原に対するＴ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項１９記載の方法。
21. 少なくとも１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量のＭＶＡをヒトの新生児に投与することを含む、ヒトの新生児又は生後６ヶ月未満の幼児における痘瘡ウイルスに対する防御免疫応答を誘導において使用するためのＭＶＡであって、前記投与が、ＭＶＡの２度目の投与なしで、生後６ヶ月より前にヒトの新生児に痘瘡ウイルスに対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘導する、前記ＭＶＡ。
22. 前記投与が、生後２ヶ月未満のヒトの幼児に実施される、請求項２１記載のＭＶＡ。
23. 前記投与がヒトの新生児に実施される、請求項２１記載のＭＶＡ。
24. 前記投与が、出生後７２時間以内にヒトの新生児に実施される、請求項２１記載のＭＶＡ。
25. 前記投与が、オルソポックスウイルスに対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項２１記載のＭＶＡ。
26. 前記投与が、ワクシニアウイルスに対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項２１記載のＭＶＡ。
27. 前記投与が、天然痘に対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項２１記載のＭＶＡ。
28. ＭＶＡの１回以上の追加投与を更に含む、請求項２１記載のＭＶＡ。
29. 前記ＭＶＡが組換え型ＭＶＡである、請求項２１記載のＭＶＡ。
30. 前記投与が、前記組換え型ＭＶＡによりコードされる異種抗原に対するＴ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項２９記載のＭＶＡ。
31. 少なくとも１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量のＭＶＡをヒトの新生児又は生後６ヶ月未満の幼児に投与することを含む、ヒトの新生児又は幼児における痘瘡ウイルスに対する防御免疫応答を誘導において使用するためのＭＶＡであって、前記投与が、投与２週間以内にヒトの新生児又は幼児において痘瘡ウイルスに対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘導する、前記ＭＶＡ。
32. 前記投与が、生後２ヶ月未満のヒトの幼児に実施される、請求項３１記載のＭＶＡ。
33. 前記投与がヒトの新生児に実施される、請求項３１記載のＭＶＡ。
34. 前記投与が、出生後７２時間以内にヒトの新生児に実施される、請求項３１記載のＭＶＡ。
35. 前記投与が、オルソポックスウイルスに対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項３１記載のＭＶＡ。
36. 前記投与が、ワクシニアウイルスに対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項３１記載のＭＶＡ。
37. 前記投与が、天然痘に対する防御Ｔ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項３１記載のＭＶＡ。
38. ＭＶＡの１回以上の追加投与を更に含む、請求項３１記載のＭＶＡ。
39. 前記ＭＶＡが組換え型ＭＶＡである、請求項３１記載のＭＶＡ。
40. 前記投与が、前記組換え型ＭＶＡによりコードされる異種抗原に対するＴ−及びＢ−細胞応答を誘発する、請求項３９記載のＭＶＡ。