JP2016513470A - 4'-thio - ribonucleic acid and related method with modified nucleotides - Google Patents

4'-thio - ribonucleic acid and related method with modified nucleotides Download PDF

Info

Publication number
JP2016513470A
JP2016513470A JP2016502430A JP2016502430A JP2016513470A JP 2016513470 A JP2016513470 A JP 2016513470A JP 2016502430 A JP2016502430 A JP 2016502430A JP 2016502430 A JP2016502430 A JP 2016502430A JP 2016513470 A JP2016513470 A JP 2016513470A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mrna
thio
mrna molecule
embodiments
residues
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2016502430A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP2016513470A5 (en
Inventor
フランク デローサ,
フランク デローサ,
マイケル ハートレイン,
マイケル ハートレイン,
Original Assignee
シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド
シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US201361785098P priority Critical
Priority to US61/785,098 priority
Application filed by シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド, シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド filed Critical シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド
Priority to PCT/US2014/027422 priority patent/WO2014152513A1/en
Publication of JP2016513470A publication Critical patent/JP2016513470A/en
Publication of JP2016513470A5 publication Critical patent/JP2016513470A5/ja
Application status is Pending legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67General methods for enhancing the expression

Abstract

少なくとも1つのヌクレオチド残基のフラノース環内に4'−チオ修飾を組み込むメッセンジャーRNA分子及び関連組成物、ならびにコードされた治療用タンパク質をインビボで産生するため、および疾病または障害を治療または予防するために、これらのmRNAを使用する方法が開示される。 At least one messenger RNA molecules and related compositions incorporate 4'-thio modified within furanose ring of the nucleotide residues, as well as for producing the encoded therapeutic protein in vivo, and treating or preventing for the disease or disorder to methods of using these mRNA are disclosed. 特定の実施形態においては、4'−チオ修飾mRNAは、インビボでの治療における、向上した安定性及び/または低減した免疫原性を提供する。 In certain embodiments, the 4'-thio modified mRNA, in the treatment in vivo, providing improved stability and / or reduced immunogenicity.

Description

本出願は、2013年3月14日に出願された米国特許出願第61/785,098号の、米国特許法第119条(e)に基づく利益を主張し、その全体が、本明細書に参照によって組み込まれる。 This application is 2013 March 14 to No. filed US Patent Application No. 61 / 785,098, claims the benefit under 35 USC §119 (e), in its entirety, herein which is incorporated by reference.

本発明は、4'−チオ−修飾ヌクレオチド残基を含むメッセンジャーリボ核酸(mRNA)、これらのmRNAを含む組成物、及びそれを作製し、使用する方法に関する。 The present invention, 4'-thio - messenger ribonucleic acid comprising a modified nucleotide residue (mRNA), a composition containing these mRNA, and to prepare it relates to a method of using.

メッセンジャーRNAを使用する遺伝子治療は、様々な疾病の治療のためのアプローチとして提案されている。 Gene therapy using messenger RNA has been proposed as an approach for the treatment of various diseases. 宿主内でのタンパク質産生の手段としての、メッセンジャーRNA(mRNA)の導入の概念は、以前に報告されている。 As a means of protein production in a host, the concept of introducing the messenger RNA (mRNA) has been reported previously. Yamamoto,A. Yamamoto, A. et al. et al. Eur. Eur. J. J. Pharm. Pharm. 71:484−489(2009)、Debus,H. 71: 484-489 (2009), Debus, H. et al. et al. J. J. Control Rel. Control Rel. 148:334−343(2010)。 148: 334-343 (2010). しかしながら、インビボでのタンパク質産生のためのmRNAの投与の成功は、典型的にmRNAがパッケージ化されている(例えば、ポリマーまたは脂質担体と複合したmRNAなど)ことを必要とした。 However, the success of the administration of the mRNA for protein production in vivo, typically mRNA is packaged (e.g., mRNA complexed with polymeric or lipid carrier) to require that. 例えば、国際特許出願公開第WO2011/06810号及び同第WO2012/170930号を参照されたい。 For example, see International Patent Application Publication No. WO2011 / 06810 and ibid. No. WO2012 / 170930. パッケージ化されていない(裸の)mRNAの投与は、より安定かつ有益な治療もたらすために、化学修飾されたヌクレオチドがmRNA内に組み込まれることを必要とした。 Not packaged administration of (bare) mRNA, in order to bring about a more stable and beneficial treatment, it was required to be chemically modified nucleotide is incorporated into the mRNA. 例えば、M. For example, M. Kormann et al. Kormann et al. Nature Biotech. Nature Biotech. 29:154−159(2011)、K. 29: 154-159 (2011), K. Kariko,Molecular Therapy16(11):1833−1840(2008)を参照されたい。 Kariko, Molecular Therapy16 (11): 1833-1840 see (2008).
インビボで産生され得る治療用タンパク質をコードするmRNAの投与は、治療用タンパク質をコードするDNAの投与、及び治療用タンパク質の直接投与に対する有意な利点を提供し得る。 Administration of mRNA encoding a therapeutic protein that can be produced in vivo may provide significant advantages over direct administration of the administration, and the therapeutic protein DNA encoding a therapeutic protein. しかしながら、治療用タンパク質をコードする治療用mRNAの開発は医学治療における有望な前進を表す一方で、そのような治療の有用性は、mRNA、特に全長タンパク質をコードするmRNAのインビボでの不良な安定性によって依然として限定され得る。 However, while representing a promising advances in the development medical treatment of therapeutic mRNA encoding a therapeutic protein, such treatment of usefulness, mRNA, stable especially poor in vivo of the mRNA encoding the full-length protein It can still limited by gender.
特に、遺伝子置換治療において使用されるmRNAの不良な安定性は、コードされた治療用タンパク質のインビボでの不十分な、またはより最適でない産生をもたらし得る。 Particularly, poor stability of the mRNA to be used in gene replacement therapy, may result in poor or more non-optimal in vivo production of the encoded therapeutic protein. 治療用タンパク質をコードするmRNAの投与後、mRNAは、例えば、1つ以上のヌクレアーゼへのインビボでの暴露時に、分解を受け得る。 After administration of the mRNA encoding the therapeutic protein, mRNA, for example, during in vivo exposure to one or more nucleases, it may undergo degradation. リボヌクレアーゼ(例えば、エンドリボヌクレアーゼ及びエキソリボヌクレアーゼ)は、RNAのより小さい成分への分解を触媒することができ、これによりmRNAに治療用タンパク質を産生することをできなくする、ヌクレアーゼ酵素の分類を表す。 Ribonuclease (e.g., endoribonucleases and exoribonuclease) can catalyze the decomposition into smaller components of RNA, thereby unable to produce therapeutic proteins to mRNA, it represents a classification of nuclease enzyme. したがって、ヌクレアーゼ酵素(例えば、リボヌクレアーゼ)は、例えば、合成で、または組み換えで調製されたmRNAの循環半減期を短くすることができる。 Thus, nuclease enzymes (e.g., ribonucleases), for example, can be synthesized by, or to shorten circulating half-life of mRNA prepared by the recombinant. 核酸分解による分解後、mRNAは翻訳されないため、意図された治療用利益を発揮することが阻止され、これはmRNA遺伝子治療の有効性を有意に低減し得る。 After decomposition by acid decomposition, because mRNA is not translated, it is prevented to exhibit the intended therapeutic benefit, which can significantly reduce the effectiveness of mRNA gene therapy.

国際公開第2011/06810号 WO 2011/06810 国際公開第2012/170930号 International Publication No. WO 2012/170930

本発明は、より安定、堅固、かつ持続したインビボでのタンパク質産生のための、改良された修飾mRNAを提供する。 The present invention provides a more stable, robust, and for protein production in sustained in vivo, improved modified mRNA. 本発明は、一部には、治療用タンパク質をインビボで産生するために使用されるmRNAの安定性が、リボース部分内の4'酸素が硫黄によって置換される修飾リボヌクレオチドを組み込むことによって、更に改良され得るという認識に基づく。 The present invention is, in part, stability of the mRNA used to produce therapeutic proteins in vivo, by incorporating modified ribonucleotides 4 'oxygen in the ribose moiety is replaced by sulfur, more based on the recognition that may be improved. リボヌクレオチドのリボース部分内の4'酸素の硫黄での置換は、S. Substitutions at the 4 'oxygen of sulfur in the ribose moiety of ribonucleotides, S. Hoshika et al. Hoshika et al. (Nuc.Ac.Res.Supp.3:209−210(2003))及びM. (Nuc.Ac.Res.Supp.3: 209-210 (2003)) and M. Takahashi,M. Takahashi, M. et al. et al. (Nuc.Ac.Res.37:1353−1362(2009))によって以前に報告されているが、両方の報告が、RNA干渉のための、最大15残基長の4'−チオ残基を含有するRNAの短い合成断片を含み、4'−チオ−修飾ヌクレオチドを含む19〜21残基長の短いRNAもまた、RNA干渉(Dande et al.,J.Med.Chem.49:1624−1634(2006))及びアプタマーの発現(最大59残基長;Hoshika et al.,Nuc.Ac.Res.32:3815−3825(2004)、Kato et al.,Nuc.Ac.Res.33:2942−2951(2005)、Minakawa et al.,Bioorg.Med.Chem.16:9450−9456(2008))が (Nuc.Ac.Res.37: 1353-1362 (2009)) have been reported previously by both reports, containing 4'-thio residues, up to 15 residues long for the RNA interference includes a short synthetic fragment of RNA that, 4'-thio - short RNA of 19 to 21 residues in length including the modified nucleotides are also, RNA interference (Dande et al, J.Med.Chem.49:. 1624-1634 ( 2006)) and the expression of aptamers (up to 59 residues in length; Hoshika et al, Nuc.Ac.Res.32:.. 3815-3825 (2004), Kato et al, Nuc.Ac.Res.33: 2942-2951 (2005), Minakawa et al, Bioorg.Med.Chem.16:. 9450-9456 (2008)) is 報告されている。 It has been reported. しかしながら、これらの報告は、従来技術において試験されるあらゆる干渉RNAまたはアプタマーよりも、ずっと長い長さを一般的に有し、均一に二本鎖の状態では存在せず、大きな非螺旋及び/または単鎖の成分を有する立体構造の形をとり得る、全長mRNA(つまり、全長機能性治療用タンパク質をコードし、1つ以上の非コード領域を任意で含有するmRNA)への4'−チオリボヌクレオチドの組み込みの効果について、予測的ではない。 However, these reports than any interference RNA or aptamers are tested in the prior art generally have a much longer length, not present in the state of uniform duplex, large non-helical and / or It may take the form of a three-dimensional structure having components of a single chain full-length mRNA (i.e., encodes a full-length functional therapeutic protein, one or more non-coding region mRNA containing optionally) to 4'Chioribo the effect of nucleotide of built-in, not predictive a. より重要なことに、本発明の前に、4'−チオ−修飾ヌクレオチドを組み込むmRNAが、インビボでのタンパク質産生のための使用に成功し得るのかどうかは不明であった。 More importantly, prior to the present invention, 4'-thio - mRNA incorporating modified nucleotides, whether be successfully used for protein production in vivo was uncertain. 実施例を含めて本明細書に記載されるように、本発明者らは、1つ以上の4'−チオ−修飾ヌクレオチド(例えば、4'−チオ−ATP、4'−チオ−UTP、4'−チオ−GTP、及び/または4'−チオ−CTP)を組み込む全長mRNAの合成に成功した。 As described herein, including the examples, the present inventors have one or more 4'-thio - modified nucleotides (e.g., 4'-thio -ATP, 4'-thio -UTP, 4 '- thio -GTP, and / or 4'-thio -CTP) was successfully synthesized full-length mRNA incorporating. mRNAの長さに対する懸念にも関わらず、本発明者らは、最大100%の4'−チオ−ATP、100%の4'−チオ−UTP、100%の4'−チオ−GTP、及び/または100%の4'−チオ−CTPを組み込む全長mRNAを合成することができた。 Despite concerns about the length of the mRNA, the present inventors have found that up to 100% of the 4'-thio -ATP, 100% 4'-thio -UTP, 100% 4'-thio -GTP and / or it could be synthesized full-length mRNA to incorporate 100% 4'-thio -CTP. 実施例に示すように、そのような修飾mRNAは無修飾mRNAよりも安定し、驚くべきことに、そのような広範な修飾は修飾mRNAがインビボで効果的に翻訳される能力に影響を与えないようである。 As shown in the Examples, such modifications mRNA is stable than unmodified mRNA, surprisingly, such a broad modifications do not affect the ability of the modified mRNA is efficiently translated in vivo It is the case.

したがって、本発明は、例えば、mRNAの安定性、免疫原性、及び翻訳効率に対するより良い制御を可能にするmRNA、ならびにこれらのmRNA及び任意で担体を含む組成物、ならびにこれらのmRNA及び組成物を使用して、疾病及び/または障害の治療のための治療用タンパク質のインビボでの発現を誘発する方法を提供する。 Accordingly, the present invention is, for example, stability of the mRNA, immunogenicity, and mRNA to allow better control over the translation efficiency, and compositions comprising the carrier in these mRNA and optionally, as well as their mRNA and compositions use, provides a method of inducing expression in vivo of therapeutic proteins for the treatment of diseases and / or disorders.

いくつかの実施形態において、本発明は、コード領域及び任意で1つ以上の非コード領域を有するmRNA分子であって、mRNAが、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む少なくとも1つのヌクレオチド残基を含む、mRNA分子を提供する。 In some embodiments, the present invention provides a mRNA molecule having one or more non-coding regions in the coding region and optionally, mRNA is 4'-thio - at least one nucleotide residue include substitution furanose ring including, to provide the mRNA molecule. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%のヌクレオチド残基を含有する。 In some embodiments, mRNA is provided comprising 4'-thio - incorporating substituted furanose ring, at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% nucleotide residues contains. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む、100%のヌクレオチド残基を含有する。 In some embodiments, mRNA is provided comprising 4'-thio - incorporating substituted furanose ring, containing 100% of the nucleotide residues. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、最大5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の4'−チオ−ATPを含有する。 In some embodiments, mRNA is provided comprising up to 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, containing 99% or 100% of the 4'-thio -ATP. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、最大5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の4'−チオ−UTPを含有する。 In some embodiments, mRNA is provided comprising up to 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, containing 99% or 100% of the 4'-thio -UTP. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、最大5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の4'−チオ−GTPを含有する。 In some embodiments, mRNA is provided comprising up to 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, containing 99% or 100% of the 4'-thio -GTP. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、最大5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の4'−チオ−CTPを含有する。 In some embodiments, mRNA is provided comprising up to 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, containing 99% or 100% of the 4'-thio -CTP. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、本明細書に記載される様々な4'−チオ−修飾NTPの組み合わせを含有する。 In some embodiments, mRNA is provided comprising a variety of 4'-thio described herein - containing modified NTP combination.

いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、非コード領域を含む。 In some embodiments, mRNA provided include a non-coding region. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、ポリ−A及び/またはポリ−Uテールを含む。 In some embodiments, mRNA provided include poly -A and / or poly -U tail. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、5'キャップ構造を含む。 In some embodiments, mRNA provided includes a 5 'cap structure.

いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、少なくとも1つの非標準ヌクレオチド残基を更に含む。 In some embodiments, mRNA provided further comprises at least one non-standard nucleotide residues. いくつかの実施形態において、少なくとも1つの非標準ヌクレオチド残基は、5−メチル−シチジン、プソイドウリジン、及び2−チオ−ウリジンのうちの1つ以上から選択される。 In some embodiments, the at least one non-standard nucleotide residues are 5-methyl - is selected from one or more of the uridine - cytidine, pseudouridine, and 2-thio. いくつかの実施形態において、少なくとも1つの非標準ヌクレオチド残基は、4'−チオ−フラノース環を組み込む。 In some embodiments, the at least one non-standard nucleotide residues, 4'-thio - incorporating furanose ring. いくつかの実施形態において、最大5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の非標準ヌクレオチド残基は、4'−チオ−フラノース環を組み込む。 In some embodiments, up to 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% of the non-standard nucleotide residues, 4'-thio - incorporating furanose ring.

いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、少なくとも60残基長である。 In some embodiments, mRNA is provided, at least 60 residues long. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、少なくとも約70、約80、約90、約100、約150、約200、約300、約400、約500、約1,000、約1,500、約2,000、約2,500、約3,000、約3,500、約4,000、約4,500、または約5,000残基長である。 In some embodiments, mRNA is provided comprising at least about 70, about 80, about 90, about 100, about 150, about 200, about 300, about 400, about 500, about 1,000, about 1,500 , about 2,000, about 2,500, about 3,000, about 3,500, about 4,000, about 4,500, or about 5,000 residues in length.

本発明の更なる実施形態は、コード領域及び任意で1つ以上の非コード領域を有する少なくとも1つのmRNA分子を含む組成物であって、mRNAが、4'−チオ−置換フラノース環及び担体を組み込む少なくとも1つのヌクレオチド残基を含む、組成物を提供する。 A further embodiment of the present invention is a composition comprising at least one mRNA molecule having one or more non-coding regions in the coding region and optionally, mRNA is 4'-thio - substituted furanose ring and the carrier incorporating at least one nucleotide residue, to provide a composition. いくつかの実施形態において、提供される組成物は、コード領域及び任意で1つ以上の非コード領域を有する少なくとも1つのmRNAであって、mRNAが、4'−チオ−置換フラノース環及び担体を組み込む少なくとも1つのヌクレオチド残基を含み、mRNAが、少なくとも60残基長である、mRNAを含む。 In some embodiments, the compositions provided is at least one mRNA having one or more non-coding regions coding region and optionally, mRNA is 4'-thio - substituted furanose ring and the carrier comprising at least one nucleotide residue incorporated, mRNA is at least 60 residues long, including mRNA. 特定の実施形態において、本発明の組成物は、コード領域及び任意で1つ以上の非コード領域を有する少なくとも1つのmRNA分子であって、mRNAが、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む少なくとも1つのヌクレオチド残基を含み、ポリマーに基づく担体または脂質ナノ粒子と複合した、mRNA分子を含む。 In certain embodiments, the compositions of the present invention includes at least one mRNA molecule having one or more non-coding regions coding region and optionally, mRNA is 4'-thio - incorporating substituted furanose ring at least It contains one nucleotide residue was combined with a carrier or lipid nanoparticles based on a polymer, including mRNA molecules.

本発明は、コード領域及び任意で1つ以上の非コード領域を有する少なくとも1つのmRNA分子であって、mRNAが、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む少なくとも1つのヌクレオチド残基を含む、mRNA分子、またはそのようなmRNA及び担体を含む組成物を対象に投与することを含む、治療用タンパク質をインビボで産生する方法を更に提供する。 The present invention includes at least one mRNA molecule having one or more non-coding regions in the coding region and optionally, mRNA is 4'-thio - comprising at least one nucleotide residue include substitution furanose ring, mRNA molecules or comprising administering to the subject a composition comprising such mRNA and carriers, and further provides a method of producing a therapeutic protein in vivo. 本発明はまた、コード領域及び任意で非コード領域を有する少なくとも1つのmRNA分子であって、mRNAが、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む少なくとも1つのヌクレオチド残基を含む、mRNA分子、またはそのようなmRNA及び担体を含む組成物を投与することを含む、治療用タンパク質を必要とする対象を治療する方法を提供する。 The present invention also includes at least one mRNA molecule in coding regions and optionally having a non-coding region, mRNA is 4'-thio - comprising at least one nucleotide residue include substitution furanose ring, mRNA molecules or, comprising administering a composition comprising such mRNA and carriers, to provide a method of treating a subject in need of therapeutic proteins. いくつかの実施形態において、提供される方法において投与されるmRNAは、少なくとも60残基長である。 In some embodiments, mRNA is administered in the methods provided are at least 60 residues long. 本明細書に記載される様々な修飾mRNAは、治療用タンパク質の産生のために、または様々な疾病、障害、または状態の治療のために使用され得る。 Various modifications mRNA described herein, for the production of therapeutic proteins, or various diseases can be used for the treatment of a disorder or condition.

いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載される修飾mRNAを使用してタンパク質を産生する方法を提供する。 In some embodiments, the present invention provides a method for producing a protein using the modified mRNA as described herein. そのようなタンパク質産生の方法は、インビトロの無細胞系、インビトロの細胞に基づく系、またはインビボの系において使用され得る。 Such protein production methods, in vitro cell-free system can be used in vitro cell-based system or an in vivo system. 様々な実施形態において、適したmRNAは、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む少なくとも1つのヌクレオチド残基を含む。 In various embodiments, suitable mRNA is 4'-thio - comprising at least one nucleotide residue include substitution furanose ring. いくつかの実施形態において、適したmRNAは、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む、最大約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のヌクレオチド残基(例えば、ATP、CTP、GTP、UTP、及び/または非標準NTP)を含む。 In some embodiments, a suitable mRNA is 4'-thio - incorporating substituted furanose ring, up to about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45 %, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% of the nucleotide residues group (e.g., ATP, CTP, GTP, UTP, and / or non-standard NTP) including. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、ポリ(A)またはポリ(U)テールを含む。 In some embodiments, mRNA provided includes a poly (A) or poly (U) tail. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、少なくとも60残基長である。 In some embodiments, mRNA is provided, at least 60 residues long.

いくつかの実施形態において、本発明は、治療用タンパク質をインビボで産生することができる薬物の製造のための、提供されるmRNA分子の使用を提供する。 In some embodiments, the present invention provides for the manufacture of a medicament capable of producing a therapeutic protein in vivo, provides the use of a mRNA molecule provided.

いくつかの他の実施形態において、本発明は、提供されるmRNAを作製する方法を提供する。 In some other embodiments, the present invention provides a method of making a mRNA that is provided. いくつかの他の実施形態において、本発明は、提供されるmRNAのインビトロでの合成のための方法を提供する。 In some other embodiments, the present invention provides a method for the synthesis in vitro of mRNA are provided. いくつかの他の実施形態において、本発明は、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む、最大約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のヌクレオチド残基(例えば、ATP、CTP、GTP、UTP、及び/または非標準NTP)を含有する、提供されるmRNAを作製する(例えば、インビトロで合成する)方法を提供する。 In some other embodiments, the present invention is 4'-thio - incorporating substituted furanose ring, up to about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% of the nucleotides residues (e.g., ATP, CTP, GTP, UTP, and / or non-standard NTP) containing, producing a mRNA that is provided (e.g., synthesized in vitro) to provide a method. いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも約60、約70、約80、約90、約100、約150、約200、約300、約400、約500、約1,000、約1,500、約2,000、約2,500、約3,000、約3,500、約4,000、約4,500、または約5,000残基長の、提供されるmRNAを作製する(例えば、インビトロで合成する)ための方法を提供する。 In some embodiments, the present invention is at least about 60, about 70, about 80, about 90, about 100, about 150, about 200, about 300, about 400, about 500, about 000, about 1, 500, about 2,000, about 2,500, about 3,000, about 3,500, about 4,000, about 4,500, or about 5,000 residues in length, to produce a mRNA that is provided ( for example, synthesized in vitro) provides a method for.

本発明の追加の目的及び利点は、一部は以下の記載において説明され、及び一部は記載から明らかになる、または本発明の実践によって学ばれるであろう。 Additional objects and advantages of the invention will in part be explained in the following description, and in part will be learned by practice of the apparent, or the present invention from the description. 本発明の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせの手段によって認識され、達成されるであろう。 The objects and advantages of the invention will be recognized by means of the elements and combinations particularly pointed out in the appended claims, it will be achieved.

前述の一般的な記載及び以下の詳細な記載の両方は、例示的かつ説明的であるのみであって、主張される本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。 Both general description and the following detailed description of the foregoing, there is only an exemplary and explanatory and are not restrictive of the invention as claimed is to be understood. 本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、本発明のいくつかの実施形態を図示し、記載と共に、本発明の原理を更に説明する役割を果たす。 Are incorporated in the accompanying drawings which form a part of this specification, illustrate several embodiments of the present invention, together with the description, serve to further explain the principles of the present invention.

図面は、例示の目的であるのみであって、限定の目的ではない。 Drawings, there is only a for illustrative purposes and not for purposes of limitation.

例示的な4'−チオRNA塩基、4'−チオ−アデノシン、4'−チオ−グアノシン、4'−チオ−シチジン、4'−チオ−ウリジン、4'−チオ−5−メチル−シチジン、4'−チオ−プソイドウリジン、及び4'−チオ−2−チオウリジンの分子構造を示す。 Exemplary 4'-thio RNA bases, 4'-thio - adenosine, 4'-thio - guanosine, 4'-thio - cytidine, 4'-thio - uridine, 4'-thio-5-methyl - cytidine, 4 '- thio - indicates pseudouridine, and the molecular structure of 4'-thio-2-thiouridine. 修飾及び無修飾FFL mRNAの遺伝子導入後の、HEK293T細胞内でのFFLルシフェラーゼ産生からのルシフェラーゼ検出を示す。 After gene transfer modified and unmodified FFL mRNA, showing the luciferase detection from FFL luciferase production in HEK293T cells. 修飾及び無修飾FFL mRNAの安定性研究の結果を示す。 The results of stability studies of modified and unmodified FFL mRNA. 修飾及び無修飾FFL mRNAの投与後の、マウス肝臓内でのFFLルシフェラーゼ産生からのルシフェラーゼ検出を示す。 After administration of the modified and unmodified FFL mRNA, showing the luciferase detection from FFL luciferase production in mouse liver.

本明細書で使用する場合、「mRNA」という用語は、コード領域及び任意で非コード領域を含む、修飾及び/または無修飾RNAに言及するために使用される。 As used herein, the term "mRNA" in the coding region and optionally including a non-coding regions, are used to refer to modified and / or unmodified RNA. 「コード領域」という用語は、アミノ酸の鎖、すなわち、ペプチド結合によって結合した2つ以上のアミノ酸に翻訳され得るmRNAの一部または領域に言及する。 The term "coding region" chain of amino acids, i.e., refer to a portion or region of an mRNA which can be translated into two or more amino acids linked by peptide bonds. アミノ酸の鎖はまた、タンパク質(例えば、治療用タンパク質)に折り畳まれ得るペプチドまたはポリペプチドとも称され得る。 Chains of amino acids are also proteins (e.g., therapeutic protein) can also be referred to as peptides or polypeptides may be folded. 「非コード領域」という用語は、典型的に翻訳されないmRNAの一部または領域に言及する。 The term "noncoding region" typically refers to a portion or region of untranslated mRNA. 非コード領域は、典型的に、ポリ(A)またはポリ(U)テールを含むが、これに限定されない、5'非翻訳領域及び/または3'非翻訳領域を含む。 Noncoding region is typically poly (A) or poly (U) including tail, but not limited to, 5 including 'untranslated region and / or 3' untranslated region.

「非標準核酸塩基」は、天然塩基アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、またはウラシル(U)以外の塩基部分である。 "Non-standard nucleobase" natural bases to an adenine (A), cytosine (C), guanine (G), thymine (T), or a base portion of a non-uracil (U). Tの類似体はまた、一般的にUの類似体でもあり、その逆もまた同様であるという例外はあるものの、非標準核酸塩基は、核酸二重螺旋(RNAポリメラーゼによるDNA鋳型の転写中に形成されるものなどの局所RNA−DNA螺旋を含む)内のDNAまたはRNAポリメラーゼによる組み込みの、核酸二重螺旋及び遺伝子座内のその塩基対合特性が、既に列記した5つの核酸塩基のうちの1つに最も類似する際の、特定の核酸塩基(A、C、G、T、またはU)の類似体である。 Analogs of T also is generally also the analog of U, although the opposite is also exceptions that are similar, non-standard nucleobases, during transcription of DNA template by a nucleic acid double helix (RNA polymerase of incorporation by topical RNA-DNA containing the helix) of the DNA or RNA polymerases, such as those formed, the base pairing properties of the double helix and locus nucleic acid, of the five nucleobases already listed when most similar to one is an analogue of a particular nucleic acid bases (a, C, G, T or U,). 「ヌクレオシド」、「塩基」、「ヌクレオチド」、または「残基」を含むが、これに限定されない用語と併せて使用される「非標準」という用語は、「核酸塩基」と併せて使用される場合と同一の様式で解釈されるべきである。 "Nucleoside", "nucleotide", "nucleotide", or comprise a "residue", the term "non-standard" as used in conjunction with the term is not limited thereto, it is used in conjunction with "nucleic acid base" If it should be interpreted in the same manner as.

本明細書で使用する場合、「治療用タンパク質」という用語は、対象に投与される場合、対象の健康及び健全性に対して有益な効果を提供する任意のタンパク質を含む。 As used herein, the term "therapeutic protein", when administered to a subject includes any protein that provides a beneficial effect on the health and integrity of the object. いくつかの実施形態において、対象におけるそのタンパク質の欠乏、欠如、または異常発現は、疾病または状態を生じさせる。 In some embodiments, a deficiency of the protein in a subject, the absence, or aberrant expression causes the disease or condition. 「治療用タンパク質」はまた、所望の治療的効果を達成するために、対象において通常は存在しない、または通常は十分な量で存在しないタンパク質にも言及し得る。 "Therapeutic protein" may also be used to achieve the desired therapeutic effect, usually absent, or normal can also refer to a protein which is not present in sufficient quantities in the subject.

「ヘルパー脂質」という用語は、本明細書で使用する場合、コレステロールを含む任意の中性または双性イオン脂質材料に言及する。 The term "helper lipid" as used herein, refers to any neutral or zwitterionic lipid material including cholesterol. 特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ヘルパー脂質は、脂質二重層/ナノ粒子内に安定性、強剛性、及び/または流動性を追加し得る。 Without wishing to be bound by any particular theory, the helper lipid may add stability to the lipid bilayer / the nanoparticles, strong stiffness, and / or flowability.

本発明のmRNAは、メッセンジャーリボ核酸分子へと置換して、対象に投与される際のその生物学的特性を向上させるために、ヌクレオチド残基のリボース部分内の4'酸素が硫黄で置換される特定の化学修飾された塩基を用いる。 mRNA of the present invention, by substituting into messenger ribonucleic acid molecule, in order to improve their biological properties when administered to a subject, 4 'oxygen in the ribose moiety of the nucleotide residues are replaced by sulfur that use of a specific chemically modified bases. 本発明のmRNAへの組み込みのための例示的4'−チオ修飾ヌクレオチド残基を、図1に描写する(チオ−置換フラノース環を含有する修飾ヌクレオチド残基を示す)。 Exemplary 4'-thio modified nucleotide residue for incorporation into mRNA of the present invention is depicted in FIG. 1 (thio - shows a modified nucleotide residue containing substituted furanose ring). いくつかの実施形態において、フラノース環の4'−チオ修飾は、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、及び/またはヒト血清中の他のRNA分解酵素に対する改良された抵抗性を提供する。 In some embodiments, 4'-thio modified furanose rings provide exonuclease, endonuclease, and / or improved resistance to other RNA degradation enzyme in human serum. そのような安定性は、増大したRNA半減期を提供し得る。 Such stability can provide RNA increased half-life. したがって、例えば、フラノース環内に4'−チオ修飾を有するmRNAまたはそのようなmRNAを含む組成物の投与は、改良された生物学的特性、例えば、それが今度はインビボでの増大したタンパク質産生に寄与する増大した半減期を有するmRNAの細胞取り込みをもたらす。 Thus, for example, administration of a composition comprising an mRNA or such mRNA having a 4'-thio modified within furanose ring, improved biological properties, for example, protein production which in turn was increased in vivo resulting in cell uptake of the mRNA having an increased half-life contributes to.

特定の実施形態において、RNA内のアデノシンヌクレオチド残基のうちの少なくとも1%は、フラノース環内に4'−チオ修飾を有する。 In certain embodiments, at least 1% of the adenosine nucleotide residues in the RNA has a 4'-thio modified in furanose ring. 例えば、mRNA内のアデノシンのうちの約1〜5%、5〜15%、15〜30%、30〜50%、50〜75%、75〜90%、90〜99%、または99〜100%は、4'−チオ−アデノシンであり得る。 For example, about 1-5% of the adenosine in the mRNA, 5~15%, 15~30%, 30~50%, 50~75%, 75~90%, 90~99%, or 99-100% is 4'-thio - it may be adenosine.

いくつかの実施形態において、mRNA内のアデノシン残基のうちの少なくとも約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%は、4'−チオ−アデノシンである。 In some embodiments, at least about 1% of the adenosine residue in the mRNA, about 5%, about 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about 30%, about 35%, about 40%, about 45%, about 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, about 96% , about 97%, about 98%, or about 99 percent, 4'-thio - is adenosine. いくつかの実施形態において、mRNA内のアデノシン残基のうちの約100%は、4'−チオ−アデノシンである。 In some embodiments, about 100% of the adenosine residue in the mRNA, 4'-thio - is adenosine.

特定の実施形態において、RNA内のグアノシンヌクレオチド残基のうちの少なくとも1%は、フラノース環内に4'−チオ修飾を有する。 In certain embodiments, at least 1% of the guanosine nucleotide residues in the RNA has a 4'-thio modified in furanose ring. 例えば、mRNA内のグアノシンのうちの約1〜5%、5〜15%、15〜30%、30〜50%、50〜75%、75〜90%、90〜99%、または99〜100%は、4'−チオ−グアノシンであり得る。 For example, about 1-5% of the guanosine in mRNA, 5~15%, 15~30%, 30~50%, 50~75%, 75~90%, 90~99%, or 99-100% is 4'-thio - it may be a guanosine.

いくつかの実施形態において、mRNA内のグアノシン残基のうちの少なくとも約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%は、4'−チオ−グアノシンである。 In some embodiments, at least about 1% of the guanosine residues in the mRNA, about 5%, about 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about 30%, about 35%, about 40%, about 45%, about 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, about 96% , about 97%, about 98%, or about 99 percent, 4'-thio - guanosine. いくつかの実施形態において、mRNA内のグアノシン残基のうちの約100%は、4'−チオ−グアノシンである。 In some embodiments, about 100% of the guanosine residues in the mRNA, 4'-thio - guanosine.

特定の実施形態において、RNA内のウリジンヌクレオチド残基のうちの少なくとも1%は、フラノース環内に4'−チオ修飾を有する。 In certain embodiments, at least 1% of the uridine nucleotides residues in the RNA has a 4'-thio modified in furanose ring. 例えば、mRNAのウリジンのうちの約1〜5%、5〜15%、15〜30%、30〜50%、50〜75%、75〜90%、90〜99%、または99〜100%は、4'−チオ−ウリジンであり得る。 For example, about 1-5% of the mRNA of uridine, 5-15%, 15% to 30%, 30-50% 50-75% 75-90%, 90-99%, or 99-100% are , 4'-thio - may be a uridine.

いくつかの実施形態において、mRNA内のウリジン残基のうちの少なくとも約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%は、4'−チオ−ウリジンである。 In some embodiments, at least about 1% of the uridine residues in the mRNA, about 5%, about 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about 30%, about 35%, about 40%, about 45%, about 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, about 96% , about 97%, about 98%, or about 99 percent, 4'-thio - uridine. いくつかの実施形態において、mRNA内のウリジン残基のうちの約100%は、4'−チオ−ウリジンである。 In some embodiments, about 100% of the uridine residues in the mRNA, 4'-thio - uridine.

特定の実施形態において、RNA内のシチジンヌクレオチド残基のうちの少なくとも1%は、フラノース環内に4'−チオ修飾を有する。 In certain embodiments, at least 1% of the cytidine nucleotide residues in the RNA has a 4'-thio modified in furanose ring. 例えば、mRNA内のシチジンのうちの約1〜5%、5〜15%、15〜30%、30〜50%、50〜75%、75〜90%、90〜99%、または99〜100%は、4'−チオ−シチジンであり得る。 For example, about 1-5% of the cytidine in mRNA, 5~15%, 15~30%, 30~50%, 50~75%, 75~90%, 90~99%, or 99-100% is 4'-thio - it may be a cytidine.

いくつかの実施形態において、mRNA内のシチジン残基のうちの少なくとも約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%は、4'−チオ−シチジンである。 In some embodiments, at least about 1% of the cytidine residue in mRNA, about 5%, about 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about 30%, about 35%, about 40%, about 45%, about 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, about 96% , about 97%, about 98%, or about 99 percent, 4'-thio - cytidine. いくつかの実施形態において、mRNA内のシチジン残基のうちの約100%は、4'−チオ−シチジンである。 In some embodiments, about 100% of the cytidine residues in the mRNA, 4'-thio - cytidine.

いくつかの実施形態において、提供されるmRNA内の各4'−チオ−修飾ヌクレオチドは、4'−チオ−ウリジンである。 In some embodiments, the 4'-thio in mRNA provided - modified nucleotides, 4'-thio - uridine. いくつかの実施形態において、提供されるmRNA内の各4'−チオ−修飾ヌクレオチドは、4'−チオ−シチジンである。 In some embodiments, the 4'-thio in mRNA provided - modified nucleotides, 4'-thio - cytidine. いくつかの実施形態において、提供されるmRNA内の各4'−チオ−修飾ヌクレオチドは、独立して4'−チオ−ウリジンまたは4'−チオ−シチジンである。 In some embodiments, the 4'-thio in mRNA provided - modified nucleotides independently 4'-thio - cytidine - uridine or 4'-thio. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個以上の4'−チオ−ウリジンまたは4'−チオ−シチジンを含む。 In some embodiments, mRNA is provided, at least 5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90, 95,100 or more 4'-thio - cytidine - uridine or 4'-thio. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、少なくとも1つの4'−チオ−アデノシン残基を含む。 In some embodiments, mRNA is provided comprising at least one 4'-thio - adenosine residues. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、少なくとも1つの4'−チオ−グアノシン残基を含む。 In some embodiments, mRNA is provided comprising at least one 4'-thio - containing guanosine residues. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、少なくとも1つの4'−チオ−グアノシンまたは4'−チオ−アデノシン残基を含む。 In some embodiments, mRNA is provided comprising at least one 4'-thio - adenosine residues - guanosine or 4'-thio. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個以上の4'−チオ−グアノシンまたは4'−チオ−アデノシン残基を含む。 In some embodiments, mRNA is provided, at least 5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90, 95,100 or more 4'-thio - adenosine residues - guanosine or 4'-thio.

特定の実施形態において、1つの塩基型(例えば、アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン)の、フラノース環内に4'−チオ修飾を有するヌクレオチド残基の画分は、他の塩基型の修飾ヌクレオチド残基の画分とは独立して変化する。 In certain embodiments, one base type (e.g., adenosine, guanosine, uridine or cytidine,) of the fraction of nucleotide residues which has a 4'-thio modified within furanose ring, other base form of modified nucleotides to change independently of the fraction of residues.

特定の実施形態において、ヌクレオチド残基のうちの10%未満は、フラノース環内に4'−チオ修飾を有する。 In certain embodiments, less than 10% of the nucleotide residues have a 4'-thio modified in furanose ring. 例えば、ヌクレオチド残基のうちの約1〜5%、5〜10%、3〜5%、1〜3%、0.1〜1%、または0.01〜0.1%は、4'−チオ−置換フラノース環を組み込み得る。 For example, about 1-5% of the nucleotide residues, 5-10%, 3-5%, 1-3%, 0.1% to 1%, or 0.01% to 0.1%, the 4' thio - may incorporate substituted furanose ring.

他の実施形態において、ヌクレオチド残基のうちの10%超は、フラノース環内に4'−チオ修飾を有する。 In other embodiments, more than 10% of the nucleotide residue has the 4'-thio modified in furanose ring. 例えば、ヌクレオチド残基のうちの約10〜15%、15〜20%、20〜25%、25〜30%、30〜35%、35〜40%、40〜45%、または45〜50%は、4'−チオ−置換フラノース環を組み込み得る。 For example, about 10 to 15% of the nucleotide residues, 15-20%, 20-25%, 25-30 percent, 30% to 35%, 35% to 40% 40 to 45%, or 45 to 50% is , 4'-thio - may incorporate substituted furanose ring. いくつかの実施形態において、ヌクレオチド残基のうちの50%超は、フラノース環内に4'−チオRNA修飾を有する。 In some embodiments, more than 50% of the nucleotide residue has the 4'-thio RNA modifications within furanose ring. 例えば、ヌクレオチド残基のうちの約50〜55%、55〜60%、60〜65%、65〜70%、70〜75%、75〜80%、80〜85%、85〜90%、90〜95%、95〜100%、95〜97%、97〜98%、98〜99%、99〜99.9%、または99.9〜100%は、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む。 For example, about 50-55% of the nucleotide residues, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75% to 80%, 80-85%, 85% to 90%, 90 95%, 95% to 100%, 95-97%, 97-98%, 98-99%, 99 to 99.9%, or 99.9 to 100%, the 4'-thio - incorporating substituted furanose ring .

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド残基のうちの少なくとも約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%は、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む。 In some embodiments, at least about 1% of the nucleotide residue, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% , 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, 4'-thio - incorporating substituted furanose ring. いくつかの実施形態において、約100%のヌクレオチド残基は、4'−チオ−置換フラノース環を組み込み得る。 In some embodiments, the nucleotide residues of about 100%, 4'-thio - may incorporate substituted furanose ring.

本発明のmRNA内のコード領域及び非コード領域は、配列の非近接領域を包含し得る。 Coding and non-coding regions within the mRNA of the present invention may encompass a non-proximity area of ​​the array. 任意の非コード領域は、5'非翻訳領域(UTR)、3'UTR、ポリ−A、ポリ−U、またはポリ−Cテール、及び/または5'キャップ構造のうちの1つ以上を含み得る。 Any non-coding region 5 may include 'untranslated region (UTR), 3'UTR, poly -A, poly -U or poly -C tail, and / or 5' one or more of the cap structure . いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、非コード領域を含む。 In some embodiments, mRNA provided include a non-coding region. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、5'UTRを含む。 In some embodiments, mRNA provided includes a 5'UTR. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、3'UTRを含む。 In some embodiments, mRNA provided includes a 3'UTR. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、5'キャップ構造を含む。 In some embodiments, mRNA provided includes a 5 'cap structure. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、ポリAテールを含む。 In some embodiments, mRNA provided include a poly A tail. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、5'−UTR配列、3'−UTR配列、及びポリAテールを含む。 In some embodiments, mRNA provided includes 5'-UTR sequence, 3'-UTR sequence, and the poly A tail. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、5'−UTR配列、コード領域、3'−UTR配列、及びポリAテールを含む。 In some embodiments, mRNA provided includes 5'-UTR sequence, coding region, 3'-UTR sequence, and the poly A tail. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、5'−UTR配列、5'キャップ、3'−UTR配列、及びポリAテールを含む。 In some embodiments, mRNA provided includes 5'-UTR sequences, 5 'caps, 3'-UTR sequence, and the poly A tail. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、5'−UTR配列、5'キャップ、コード領域、3'−UTR配列、及びポリAテールを含む。 In some embodiments, mRNA provided includes 5'-UTR sequences, 5 'caps, the coding region, 3'-UTR sequence, and the poly A tail.

特定の実施形態において、ポリ−A、ポリ−U、またはポリ−Cテールは、4'−チオ−置換フラノース環を組み込むヌクレオチド残基を含む。 In certain embodiments, the poly -A, poly -U or poly -C tail, is 4'-thio - containing nucleotide residue include substitution furanose ring. いくつかの実施形態において、ポリ−A、ポリ−U、またはポリ−Cテール、あるいは非コード領域の他の成分のみが、フラノース環内に4'−チオ置換を有するヌクレオチド残基を組み込む一方で、mRNA分子内のヌクレオチド残基の残部は、4'−チオ−フラノース修飾を含有しない。 In some embodiments, the poly -A, poly -U or poly -C tail, or only the other components of the non-coding regions, while incorporating nucleotide residues which has a 4'-thio substituent in the furanose ring, the remainder of the nucleotide residues in the mRNA molecule, 4'-thio - containing no furanose modified. いくつかの実施形態において、コード領域は、4'−チオ−置換フラノース環を組み込むヌクレオチド残基を含む。 In some embodiments, the coding region, 4'-thio - containing nucleotide residue include substitution furanose ring. 特定の実施形態において、コード領域及び非コード領域の両方(存在する場合)は、フラノース環内に4'−チオ置換を有するヌクレオチド残基を組み込む。 In certain embodiments, if present both coding and non-coding regions incorporates a nucleotide residues with 4'-thio substituent in the furanose ring. 特定の実施形態において、ポリ−A、ポリ−U、またはポリ−Cテールの長さは、変化し得る。 In certain embodiments, the poly -A, the length of the poly -U or poly -C tail, can vary. 例えば、ポリ−A、ポリ−U、またはポリ−Cテールの長さは、少なくとも約50、70、90、100、150、200、250、300、400、または500ヌクレオチド長であり得る。 For example, poly -A, the length of the poly -U or poly -C tail, can be at least about 50,70,90,100,150,200,250,300,400 or 500 nucleotides in length. いくつかの実施形態において、ポリ−A、ポリ−U、またはポリ−Cテールの長さは、約90、100、150、200、250、300、400、または500ヌクレオチド長未満であり得る。 In some embodiments, the poly -A, the length of the poly -U or poly -C tail, may be less than about 90,100,150,200,250,300,400 or 500 nucleotides in length. 特定の実施形態において、mRNA分子は、4'−チオ−置換フラノース環に加えて、他の修飾を含み得る。 In certain embodiments, mRNA molecules, 4'-thio - in addition to the substituted furanose ring, may include other modifications. 例えば、分子は、非標準核酸塩基を組み込み得る。 For example, the molecule may incorporate non-standard nucleobases. 特定の実施形態は、5−メチル−シチジン(「5mC」)、プソイドウリジン(「ψU」)、2−チオ−ウリジン(「2sU」)、5−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5−ブロモウラシル、5−プロピニルウラシル、6−アミノプリン、2−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び2−クロロ−6−アミノプリンシトシン、及びこれらの修飾の組み合わせなどのヌクレオチド残基修飾、ならびに他のヌクレオチド残基修飾を含み得る。 Certain embodiments, 5-methyl - cytidine ( "5mC"), pseudouridine ( "ψU"), 2-thio - uridine ( "2sU"), 5-methylcytosine, isocytosine, pseudoisocytosine isocytosine, 5-bromo uracil, 5-propynyl uracil, 6-aminopurine, 2-aminopurine, inosine, diaminopurine, and 2-chloro-6-aminopurine cytosine, and nucleotide residue modification, such as combinations of these modifications, as well as other nucleotides It may comprise residues modified. 特定の実施形態は、フラノース環またはヌクレオチド残基の他の部分、例えば、核酸塩基に対する追加の修飾を更に含み得る。 Particular embodiments other portions of the furanose ring or nucleotide residues, for example, may further comprise additional modifications to nucleic acid bases. 例えば、いくつかの実施形態において、4'−チオ置換フラノース環は、例えば、プソイドウリジン、2−チオウリジン、及び5−メチルシチジンなどの無修飾塩基または修飾塩基内に含まれ得る。 For example, in some embodiments, 4'-thio-substituted furanose ring, for example, pseudouridine, it may include 2-thiouridine, and 5-methyl cytidine the unmodified bases or modified inner base such. 特定の実施形態において、これらの修飾のいずれも、ヌクレオチド残基の0〜100%で、例えば、0%超、1%超、10%超、50%超、90%超、または95%超、あるいは個別または組み合わせでのヌクレオチド残基の100%で存在し得る。 In certain embodiments, none of these modifications, with 0-100% nucleotide residues, e.g., greater than 0%, 1% greater, 10% greater, 50% greater, 90% or 95%, or it may be present in 100% of the nucleotide residues individually or in combination. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、少なくとも1つの非標準ヌクレオチド残基を含む。 In some embodiments, mRNA provided includes at least one non-standard nucleotide residues. いくつかの実施形態において、少なくとも1つの非標準ヌクレオチド残基は、5−メチル−シチジン、プソイドウリジン、及び2−チオ−ウリジンのうちの1つ以上から選択される。 In some embodiments, the at least one non-standard nucleotide residues are 5-methyl - is selected from one or more of the uridine - cytidine, pseudouridine, and 2-thio. いくつかの実施形態において、5−メチル−シチジン内に少なくとも1つの非標準ヌクレオチド残基。 In some embodiments, 5-methyl - at least one non-standard nucleotide residues in cytidine. いくつかの実施形態において、少なくとも1つの非標準ヌクレオチド残基は、4'−チオ−フラノース環を組み込む。 In some embodiments, the at least one non-standard nucleotide residues, 4'-thio - incorporating furanose ring. いくつかの実施形態において、最大5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の非標準ヌクレオチド残基は、4'−チオ−フラノース環を組み込む。 In some embodiments, up to 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% of the non-standard nucleotide residues, 4'-thio - incorporating furanose ring.

追加の修飾は、例えば、糖修飾または糖置換(例えば、2'−O−アルキル修飾、ロックド核酸(LNA)のうちの1つ以上)を含み得る。 Additional modifications include, for example, sugar modification or sugar-substituted (e.g., 2'-O-alkyl modification, locked nucleic acids (one or more of the LNA)) may include. 糖修飾が2'−O−アルキル修飾である実施形態において、そのような修飾は、2'−デオキシ−2'−フルオロ修飾、2'−O−メチル修飾、2'−O−メトキシエチル修飾、及び2'−デオキシ修飾を含み得るが、これに限定されない。 In embodiments the sugar modification is a 2'-O- alkyl modification, such modifications, 2'-deoxy-2'-fluoro modified, 2'-O- methyl modified, 2'-O- methoxyethyl modification, and it may include 2'-deoxy modifications, but is not limited thereto.

特定の実施形態において、mRNAのうちの0〜100%は、単鎖であり得る。 In certain embodiments, 0-100% of the mRNA can be a single chain. 特定の実施形態において、RNAのうちの0〜100%は、非螺旋立体構造の形をとり得る。 In certain embodiments, 0-100% of the RNA may take the form of a non-helical conformation.

特定の実施形態において、本発明の組成物は、ウリジン残基の約100%が4'−チオ−ウリジンで置換される、mRNAを含む。 In certain embodiments, the compositions of the present invention comprises about 100% of the uridine residues 4'-thio - substituted uridine, including mRNA.

特定の実施形態において、本発明の組成物は、ウリジン残基の約100%が4'−チオ−ウリジンで置換され、シチジン残基の約100%が5−メチル−シチジンで置換される、mRNAを含む。 In certain embodiments, the compositions of the present invention comprises about 100% of the uridine residues 4'-thio - substituted with uridine, approximately 100% of the cytidine residue is 5-methyl - substituted cytidine, mRNA including.

特定の実施形態において、本発明の組成物は、ウリジン残基の約100%が4'−チオ−プソイドウリジンで置換される、mRNAを含む。 In certain embodiments, the compositions of the present invention comprises about 100% of the uridine residues 4'-thio - substituted with pseudouridine, including mRNA.

特定の実施形態において、本発明の組成物は、ウリジン残基の約100%が4'−チオ−プソイドウリジンで置換され、シチジン残基の約100%が5−メチル−シチジンで置換される、mRNAを含む。 In certain embodiments, the compositions of the present invention comprises about 100% of the uridine residues 4'-thio - substituted with pseudouridine, about 100% of the cytidine residue is 5-methyl - substituted cytidine, mRNA including.

いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、有益な生物学的効果を提供し、これは、例えば、対応する天然mRNAと比較して、増大した安定性、改良されたタンパク質産生率、及び/またはより高いタンパク質収率を含むが、これに限定されない。 In some embodiments, mRNA is provided, provide useful biological effects, which, for example, as compared to the corresponding native mRNA, increased stability, improved protein production rates, and / or a higher protein yields, but is not limited thereto. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、対応する天然mRNA(すなわち、修飾を有さない対応するmRNA)と比較して、インビボで投与される際、増大した安定性(例えば、より長い血清半減期)を有する。 In some embodiments, mRNA is provided, corresponding native mRNA (i.e., the corresponding mRNA without modification) as compared to when administered in vivo, increased stability (e.g., longer It has a serum half-life).

本発明のmRNAは、対象への投与時にmRNA転写物から翻訳される治療用タンパク質の量の増大を、修飾を有さない対応するmRNAと比較して、少なくとも約2.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%、25%、30%、33%、36%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%、100%、110%、120%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、750%、800%、900%、または1,000%、もたらす程度まで、ヌクレアーゼ(例えば、エンドヌクレアーゼ)分解に対してより抵抗性であり得る。 mRNA of the present invention, the increase in the amount of therapeutic protein translated from the mRNA transcript upon administration to a subject, as compared to the corresponding mRNA without modification, at least about 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 36%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, 110%, 120%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700% 750% 800%, 900% or 1,000%, to the extent that results, nucleases (e.g., endonucleases) may be more resistant to degradation.

特定の実施形態において、本発明の組成物内の修飾mRNA分子の長さは、少なくとも200ヌクレオチド残基長である。 In certain embodiments, the length of the modified mRNA molecules within the compositions of the present invention is at least 200 nucleotide residues in length. 例えば、mRNAは、少なくとも約200、300、400、400、1000、2000、3000、4000、または5000ヌクレオチド残基長であり得る。 E.g., mRNA can be at least about 200,300,400,400,1000,2000,3000,4000 or 5000 nucleotide residues in length. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、少なくとも60残基長である。 In some embodiments, mRNA is provided, at least 60 residues long. いくつかの実施形態において、提供されるmRNAは、少なくとも約70、約80、約90、約100、約150、約200、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約900、約1,000、約1,500、約2,000、約2,500、約3,000、約4,000、約5,000、約6,000、または約7000残基長である。 In some embodiments, mRNA is provided comprising at least about 70, about 80, about 90, about 100, about 150, about 200, about 300, about 400, about 500, about 600, about 700, about 800, about 900, about 1,000, about 1,500, about 2,000, about 2,500, about 3,000, about 4,000, about 5,000, about 6,000, or about 7,000 residues long, is there.

本発明のいくつかの実施形態において、本発明のmRNAによってコードされた治療用タンパク質は、そのタンパク質の欠乏、欠如、または異常発現が、疾病及び/または状態を生じさせる、任意のタンパク質であり得る。 In some embodiments of the present invention, the therapeutic protein encoded by the mRNA of the present invention, depletion of the protein, lack or abnormal expression causes a disease and / or condition can be any protein . いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、酵素であり得る。 In some embodiments, the therapeutic protein may be an enzyme. 他の実施形態において、治療用タンパク質は、所望の治療的効果を達成するために、対象において通常存在しない、または通常は十分な量で存在しないものである。 In other embodiments, therapeutic proteins in order to achieve the desired therapeutic effect, not normally present in a subject, or normal is not present in sufficient quantities.

例えば、適した治療用タンパク質の非限定的な選択は、エリスロポエチン、インスリン、ヒト成長ホルモン、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)、インスリン、アルファ−ガラクトシダーゼA、アルファ−L−イズロニダーゼ、イズロネート−2−スルファターゼ、N−アセチルグルコサミン−1−リン酸トランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミン6−スルファターゼ、N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−6−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ For example, non-limiting selection of suitable therapeutic proteins, erythropoietin, insulin, human growth hormone, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), insulin, alpha - galactosidase A, alpha -L- iduronidase, iduronate - 2-sulfatase, N- acetylglucosamine-1-phosphate transferase, N- acetylglucosaminidase, alpha - glucosaminide acetyltransferase, N- acetylglucosamine 6-sulfatase, N- acetylgalactosamine-4-sulfatase, beta - glucosidase, galactose 6-sulfate sulfatase, beta - galactosidase, beta - glucuronidase, glucocerebrosidase, heparan Le family peptidase, hyaluronidase ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)、カルバモイル−リン酸シンテターゼ1(CPS1)、アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギナーゼ1(ARG1)、グルコース−6−ホスファターゼ、グルコース−6−リン酸トランスロカーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、リソソームアルファ−グルコシダーゼ、1,4−アルファ−グルカン分枝酵素、グリコーゲンホスホリラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、GLUT−2、UDPグリコーゲンシンターゼ、アルファ−L−イズロニダーゼ、イズロネート硫酸シルファターゼ(silfatase)、ヘパラン硫酸スルファミダーゼ、アルファ−N−アセチルグルコースアミダ Galactocerebrosidase, ornithine transcarbamylase (OTC), a carbamoyl - synthetase phosphate 1 (CPS1), argininosuccinate synthetase (ASS1), argininosuccinate lyase (ASL), arginase 1 (ARG1), glucose-6-phosphatase, glucose - 6-phosphate translocase, glycogen debranching enzyme, lysosomal alpha - glucosidase, 1,4-alpha - glucan branching enzyme, glycogen phosphorylase, phosphofructokinase, liver phosphorylase, GLUT-2, UDP glycogen synthase, alpha -L- iduronidase, iduronate sulfate Silfa synthetase (silfatase), heparan sulfate sulfamidase, alpha -N- acetylglucosamine amidase ゼ、アルファ−グルコサミニド−N−アセチルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミン−6−硫酸スルファターゼ、アポリポタンパク質E、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)、例えば、第VIII因子、及び第IX因子などの凝血因子、脊髄運動ニューロン1(SMN1)、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プロピオニル−CoAカルボキシラーゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、メチルマロニル−CoAムターゼ、尿酸オキシダーゼ、C1エステラーゼ阻害剤、ならびに酸性アルファ−グルコシダーゼを含む。 Ze, alpha - glucosaminide -N- acetyltransferase, N- acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase, apolipoprotein E, low density lipoprotein receptor (LDLR), for example, Factor VIII, and clotting factors such as factor IX, spinal motor neurons 1 (SMN1), phenylalanine hydroxylase, propionyl -CoA carboxylase, porphobilinogen deaminase, methylmalonyl -CoA mutase, urate oxidase, C1 esterase inhibitor, and acid alpha - including glucosidase.

特定の実施形態において、本発明のmRNA分子は、裸の、またはパッケージ化されていないmRNAとして投与され得る。 In certain embodiments, mRNA molecules of the present invention can be administered as a mRNA which is not bare, or packaged. いくつかの実施形態において、本発明の組成物内のmRNAの投与は、適した担体の包含によって促進され得る。 In some embodiments, the administration of the mRNA in the compositions of the present invention may be facilitated by the inclusion of suitable carrier. 特定の実施形態において、担体は、1つ以上のmRNAを有する標的細胞の遺伝子導入を促進する、その能力に基づいて選択される。 In certain embodiments, the carrier facilitates gene transfer of target cells with one or more mRNA, are selected based on their ability.

本明細書で使用する場合、「担体」という用語は、mRNAを含む、生物学的活性剤の投与に関する使用を一般的に意図される、あらゆる標準的な医薬担体、媒介物、希釈剤、賦形剤、及び同様物を含む。 As used herein, the term "carrier" includes mRNA, are generally intended for use for the administration of biologically active agents, any of the standard pharmaceutical carriers, vehicle, diluent, excipient excipients, and the like. 本明細書に記載される組成物、及び特に担体は、多様なサイズのmRNAをそれらの標的細胞または組織に送達する、及び/または安定化することができる。 Compositions described herein, and in particular carriers, a variety of sizes of mRNA delivered to their target cells or tissue, and / or can be stabilized. 特定の実施形態において、本発明の組成物は、大きなmRNA(例えば、少なくとも5kDa、10kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、またはそれ以上のmRNA、あるいは少なくとも60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500、6,000、6,500、または7,000残基長のmRNA)を送達することができる担体を含む。 In certain embodiments, the compositions of the present invention, a large mRNA (e.g., at least 5kDa, 10kDa, 12kDa, 15kDa, 20kDa, 25kDa, 30kDa or more mRNA, or at least 60,70,80,90,100, , 150,200,300,400,500,600,700,800,900,1,000,1,500,2,000,2,500,3,000,3,500,4,000,4,500 comprises a carrier capable of delivering the mRNA) of 5,000,5,500,6,000,6,500 or 7,000, residues in length. 本発明に従うmRNAは、あらゆる様々な既知の方法に従って合成され得る。 mRNA according to the present invention can be synthesized according to any of a variety of known methods. 例えば、本発明に従うmRNAは、インビトロ転写(IVT)によって合成され得る。 For example, mRNA according to the present invention may be synthesized by in vitro transcription (IVT). 簡潔には、IVTは、所望の量(複数可)の4'−チオ−修飾標準及び/または非標準リボヌクレオチド(例えば、1つ以上の所望の4'−チオ−NTP(複数可))を含むリボヌクレオチドトリリン酸の貯蔵所であるプロモーターを含有する、線状または環状DNA鋳型で典型的に実行され、DTT及びマグネシウムイオン、ならびに適切なRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7、またはSP6 RNAポリメラーゼ)、デオキシリボヌクレアーゼI、及び/またはリボヌクレアーゼ阻害剤を含み得る緩衝系である無修飾リボヌクレオチドトリリン酸と任意で混合される。 Briefly, IVT is desired amount (s) of 4'-thio - modified standard and / or non-standard ribonucleotides (e.g., one or more desired 4'-thio-NTPs (s)) containing the promoter is a reservoir of ribonucleotide triphosphate containing typically run in linear or circular DNA template, DTT and magnesium ions, as well as appropriate RNA polymerase (e.g., T3, T7 or SP6 RNA polymerase) is mixed DNase I, and / or RNase inhibitors include obtaining a buffer system unmodified ribonucleotide triphosphate and optionally. 正確な条件は、特定の用途に従って変化するであろう。 The precise conditions will vary according to the particular application. 4'−チオ−修飾標準及び/または非標準リボヌクレオチドが、任意の長さの全長mRNAに効果的に組み込まれ得ることが観察される。 4'-thio - modified standard and / or non-standard ribonucleotides, it is observed that can be effectively incorporated into any length full-length mRNA of.

いくつかの実施形態において、本発明に従うmRNAの調製のために、DNA鋳型は、インビトロで転写される。 In some embodiments, for the preparation of mRNA according to the present invention, DNA template is transcribed in vitro. 適したDNA鋳型は、インビトロでの転写のために、プロモーター、例えば、T3、T7、またはSP6プロモーターを典型的に有し、対象のタンパク質及び終了信号をコードするための所望のヌクレオチド配列が続く。 Suitable DNA template for in vitro transcription, promoters, e.g., T3, T7 typically have or SP6 promoter, the desired nucleotide sequence for encoding the protein and the end signal of the target is followed. 典型的に、mRNA合成は、N−末端(5')の端部への「キャップ」の添加、及びC−末端(3')の端部への「テール」の添加を含む。 Typically, mRNA synthesis, including N-'addition of "cap" to the end of, and C- terminus (3' end (5 ') to the end of) the addition of "tail". キャップの存在は、ヌクレアーゼに対して、ほとんどの真核生物細胞に見られる抵抗性を提供する上で重要である。 The presence of the cap, against nucleases, in most important in providing seen resistance to eukaryotic cells. 「テール」の存在は、mRNAをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役割を果たす。 The presence of a "tail" serves to protect the mRNA from exonuclease degradation.

したがって、いくつかの実施形態において、本発明に従うmRNAは、5'キャップ構造を含む。 Thus, in some embodiments, mRNA according to the invention comprises a 5 'cap structure. 5'キャップは、典型的に以下のように添加される。 5 'cap is typically added as follows. まず、RNA末端ホスファターゼが、末端リン酸基のうちの1つを5'ヌクレオチドから除去し、2つの末端リン酸を残す。 First, RNA-terminal phosphatase, one of the terminal phosphate group is removed from the 5 'nucleotides, leaving two terminal phosphate. その後、グアニリルトランスフェラーゼによってグアノシントリリン酸(GTP)を末端リン酸に添加し、5'5'5トリリン酸連鎖を産生する。 Thereafter, the guanylyl transferase is added guano Sint Yi Lin acid (GTP) to the terminal phosphate, producing 5'5'5 triphosphate linkage. その後、メチルトランスフェラーゼによってグアニンの7−窒素をメチル化する。 Thereafter, methylation of 7-nitrogen of guanine by methyltransferases. キャップ構造の例は、m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A及びG(5')ppp(5')Gを含むが、これに限定されない。 Examples of the cap structure, m7G (5 ') ppp (5' (A, G (5 ') ppp (5') A and G (5 ') ppp (5') including G, but is not limited thereto.

いくつかの実施形態において、本発明に従うmRNAは、3'テール構造を含む。 In some embodiments, mRNA according to the present invention comprises a 3 'tail structure. 適した3'テール構造は、ポリ−A、ポリ−U、及び/またはポリ−Cテールを含むが、これに限定されない。 Suitable 3 'tail structure, poly -A, poly -U, and / or including poly -C tail is not limited thereto. 例示的な適したポリ−A、ポリ−U、及びポリ−Cテールは、上記に記載される。 Exemplary suitable poly -A, poly -U, and poly -C tail, are described above. ポリ−Uまたはポリ−Cテールは、ポリAテールに添加されても、ポリAテールを置換してもよい。 Poly -U or poly -C tail, be added to the poly-A tail, it may be replaced with a poly A tail.

いくつかの実施形態において、本発明に従うmRNAは、5'及び/または3'非翻訳領域を含む。 In some embodiments, mRNA according to the present invention comprises 5 'and / or 3' untranslated region. いくつかの実施形態において、5'非翻訳領域は、mRNAの安定性または翻訳に影響を与える1つ以上の要素、例えば、鉄応答性要素を含む。 In some embodiments, the 5 'untranslated region comprises one or more elements that affect stability or translation of mRNA, for example, iron-responsive element. いくつかの実施形態において、5'非翻訳領域は、約50〜500ヌクレオチド長(例えば、約50〜400ヌクレオチド長、約50〜300ヌクレオチド長、約50〜200ヌクレオチド長、または約50〜100ヌクレオチド長)の間であり得る。 In some embodiments, the 5 'untranslated region, about 50 to 500 nucleotides in length (e.g., about 50 to 400 nucleotides in length, about 50 to 300 nucleotides in length, about 50 to 200 nucleotides in length, or about 50 to 100 nucleotides It may be between length).

本発明の特定の実施形態において、担体は、標的細胞、組織、または器官へのmRNAの送達を最適化するように選択及び/または調製され得る。 In certain embodiments of the present invention, the carrier is a target cell, tissue, or may be selected and / or prepared so as to optimize the delivery of mRNA to an organ. 例えば、標的細胞が肺細胞である場合、担体の特性(例えば、サイズ、電荷及び/またはpH)は、そのような担体を標的細胞または器官に効果的に送達し、免疫クリアランスを低減し、及び/またはその標的器官内での維持を促進するように最適化され得る。 For example, if the target cells are lung cells, characteristics of the carrier (e.g., size, charge and / or pH) is effectively delivering such carriers to a target cell or organ, reduced immune clearance, and / or it may be optimized to facilitate maintenance of the the target organ. あるいは、標的組織が中枢神経系である場合、(例えば、標的脳領域(複数可)または脊髄組織へのmRNAポリヌクレオチドの送達を促進するための)担体の選択及び調製は、血液脳関門の透過及びその内部での維持、及び/またはそのような担体をそのような標的組織に直接送達する代替手段の使用を考慮しなくてはならない。 Alternatively, if the target tissue is the central nervous system, (e.g., for facilitating the delivery of mRNA polynucleotide to a target brain region (s) or spinal cord tissue) selection and preparation of the support, penetration of the blood brain barrier and inside the maintenance of, and / or such carriers it is not necessary to consider use of alternative means of delivering directly to such target tissues not. 特定の実施形態において、本発明の組成物は、局所組織または器官から、そのような組成物が1つ以上の末梢標的器官または組織に投与される場所への、外因性ポリヌクレオチドの転移を促進する薬剤と組み合わせられ得る。 In certain embodiments, the compositions of the present invention is to promote the local tissue or organ, to the location where such a composition is administered to one or more peripheral target organ or tissue, the metastatic exogenous polynucleotide It may be combined with an agent that.

特定の実施形態において、本発明の組成物内で用いられる担体は、mRNAの標的細胞及び組織への転移を促進するためのリポソーム小胞、または他の手段を含み得る。 In certain embodiments, the carrier used in the composition of the invention may comprise liposome vesicles or other means, to facilitate the transfer of mRNA into target cells and tissues. 適した担体は、ポリエチレンイミン(PEI)、脂質ナノ粒子、及びリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然及び合成誘導エキソソームの両方、天然、合成、及び半合成ラメラ体、ナノ微粒子、カルシウム蛍光体−ケイ酸ナノ微粒子、ゾルゲル、カルシウムリン酸ナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ポリ(D−アルギニン)、ナノデンドリマー、デンプンに基づく送達系、ミセル、乳剤、ニオソーム、プラスミド、ウイルス、カルシウムリン酸ヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ならびに他のベクトル性タグなどのポリマーに基づく担体を含むが、これに限定されない。 Suitable carriers polyethylenimine (PEI), lipid nanoparticles, and liposomes, both nanoliposome, ceramide-containing nanoliposome, proteoliposomes, natural and synthetically derived exosomes, natural, synthetic, and semi-synthetic lamellar bodies, nanoparticles, calcium phosphor - silicate nanoparticles, sol-gel, calcium phosphate nanoparticles, silicon nanoparticles dioxide, nanocrystalline particles, semiconductor nanoparticles, poly (D-arginine), nano dendrimer, based delivery systems starch, micelles, emulsions , niosomes, plasmid, virus, calcium phosphate nucleotides, aptamers, peptides, as well as comprising a carrier based on a polymer, such as other vectors of tag, but is not limited thereto. バイオナノカプセル及び他のウイルス性キャプシドタンパク質アセンブリの適した担体としての使用もまた、企図される。 Use as a suitable carrier bio nanocapsules and other viral capsid proteins assemblies are also contemplated. (Hum.Gene Ther.19(9):887−95(2008))。 (Hum.Gene Ther.19 (9): 887-95 (2008)).

本発明の特定の実施形態において、担体は、単体で、または他の担体との組み合わせで、ポリマーを担体として使用して製剤化される。 In certain embodiments of the present invention, the carrier alone, or in combination with other carriers, it is formulated using the polymer as a carrier. 適したポリマーは、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコライドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ペグ化プロタミン、PLL、ペグ化PLL、及び分枝状PEI(25kDa)を含むが、これに限定されない、ポリエチレンイミン(PEI)を含み得る。 Suitable polymers are, for example, polyacrylate, polyalkylene cyanoacrylates, polylactic acid, polylactic acid - polyglycolide copolymer, polycaprolactone, dextran, albumin, gelatin, alginic acid, collagen, chitosan, cyclodextrin, protamine, pegylated protamine, PLL, pegylated PLL, and including branched PEI (25 kDa), but not limited to, may comprise polyethyleneimine (PEI). いくつかの実施形態において、ポリマーは、1つ以上の多ドメインブロックポリマーであり得る。 In some embodiments, the polymer may be one or more multi-domain block polymer. いくつかの実施形態において、ポリマーは、ポリマーまたはポリマー(複数)の乾燥粉末製剤を含み得る。 In some embodiments, the polymer may comprise a dry powder formulation of a polymer or polymer (s).

ポリヌクレオチドの標的細胞への送達を促進するためのリポソーム担体の使用もまた、本発明によって企図される。 Using liposome carriers to facilitate the delivery of the polynucleotide to target cells are also contemplated by the present invention. リポソーム(例えば、リポソーム脂質ナノ粒子)は、研究、工業、及び医薬における様々な用途において、特に診断用または治療用化合物の担体としてのインビボでのそれらの使用のために、一般的に有用であり(Lasic et al.,Trends Biotechnol.,16:307−321(1998)、Drummond et al.,Pharmacol.Rev.,51:691−743(1999))、通常、1つ以上の二重層の膜によって外部培地から隔絶された内部水間隙を有する微視的な小胞として特徴付けられる。 Liposomes (e.g., liposomes lipid nanoparticles) research, industrial, and in a variety of applications in medicine, especially for their use in vivo as carriers of diagnostic or therapeutic compounds, are generally useful (. Lasic et al, Trends Biotechnol, 16:.. 307-321 (1998), Drummond et al, Pharmacol.Rev, 51:. 691-743 (1999)), typically by one or more bilayers of a membrane It characterized as microscopic vesicles having an internal water gap which is isolated from the outside medium. リポソームの二重層膜は、空間的に分離された親水性及び疎水性ドメインを含む、合成または天然起源の脂質などの両親媒性分子によって典型的に形成される。 Bilayer membrane of liposomes comprise spatially separated hydrophilic and hydrophobic domains, which are typically formed by amphipathic molecules such as lipids of synthetic or natural origin. リポソームの二重層膜はまた、両親媒性ポリマー及び界面活性物質(例えば、ポリメロソーム、ニオソームなど)によっても形成され得る。 Bilayer membrane of the liposome also amphiphilic polymers and surfactants (e.g., Porimerosomu, niosomes, etc.) may also be formed by.

特定の実施形態において、mRNA分子は、脂質ナノ粒子と複合して、標的細胞への送達を促進する。 In certain embodiments, mRNA molecules are complexed with the lipid nanoparticles, facilitate delivery to target cells. 適した脂質の例は、例えば、ホスファチジル化合物(例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシド)を含む。 Examples of suitable lipids include, for example, phosphatidyl compounds (e.g., phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, sphingolipids, cerebrosides, and gangliosides) a. 特定の実施形態において、本発明のmRNA分子及び組成物は、様々な核酸に基づく材料を被包するように設計された、1つ以上の陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、及びペグ化脂質を用いる多様な比率の多成分性脂質混合物と組み合わせられ得る。 In certain embodiments, mRNA molecules and compositions of the present invention was designed based materials various nucleic acid to encapsulate, using one or more cationic lipids, helper lipid, and a pegylated lipid It may be combined with multi-component lipid mixture of various proportions.

陽イオン性脂質は、DOTAP(1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DODAP(1,2−ジオレイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン)、cKK−E12(3,6−ビス(4−(ビス(2−ヒドロキシドデシル)アミノ)ブチル)ピペラジン−2,5−ジオン)、ジアルキルアミノに基づく、イミダゾールに基づく、グアニジウムに基づく、XTC(2,2−ジリノレイル(Dilinoleyl)−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソラン)、MC3(((6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタン酸)、ALNY−100((3aR,5s,6aS)−N,N−ジメチル−2,2−ジ((9Z, Cationic lipids, DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane), DODAP (1,2-dioleyl-3-dimethylammonium propane), cKK-E12 (3,6- bis (4- (bis (2-hydroxy-dodecyl) amino) butyl) piperazine-2,5-dione), based on dialkylamino, based on imidazole, based on guanidinium, XTC (2,2-Jirinoreiru (Dilinoleyl)-4-dimethylaminoethyl - [ 1,3] - dioxolane), MC3 (((6Z, 9Z, 28Z, 31Z) - hepta triacontanyl -6,9,28,31- tetraene-19-yl 4- (dimethylamino) butanoic acid), ALNY- 100 ((3aR, 5s, 6aS) -N, N- dimethyl-2,2-di ((9Z, 2Z)−オクタデカ−9,12−ジエニル)テトラヒドロ−3aH−シクロペンタ[d][1,3]ジオキソール−5−アミン))、NC98−5(4,7,13−トリス(3−オキソ−3−(ウンデシルアミノ)プロピル)−N1,N16−ジウンデシル−4,7,10,13−テトラアザヘキサデカン−1,16−ジアミド)、HGT4003(その教示の全体が、本明細書に参照によって組み込まれる、WO2012/170889)、ICE(その教示の全体が、本明細書に参照によって組み込まれる、WO2011/068810、)、HGT5000(その教示の全体が、本明細書に参照によって組み込まれる、米国仮特許出願第61/617,468号)、またはHGT5001(シスまたはトランス)(仮特許出願第61 2Z) - octadeca-9,12-dienyl) tetrahydro -3aH- cyclopenta [d] [1,3] dioxole-5-amine)), NC98-5 (4,7,13- tris (3-oxo-3- (undecyl-amino) propyl) -N1, N16- diundecyl -4,7,10,13- tetraazacyclododecane hexadecane-1,16-diamide), HGT4003 (the entire teachings are incorporated by reference herein, WO2012 / 170889), ICE (entire teachings of which are incorporated by reference herein, WO2011 / 068810,), HGT5000 (entire teachings of which are incorporated by reference herein, U.S. provisional Patent application No. 61 / 617,468 No.), or HGT5001 (cis or trans) (provisional Patent application No. 61 617,468号)、WO2010/053572に開示されるものなどのアミノアルコール脂質様物、DOTAP(1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2−ジ−O−オクタデセニル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA(Heyes,et al.,J.Contr.Rel.107:276−287(2005))、DLin−KC2−DMA(Semple,et al.,Nature Biotech.28:172−176(2010))、C12−200(Love,et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.107:1864−1869(2010))を含み得るが、これに限定されない。 No. 617,468), amino alcohols lipid-like materials such as those disclosed in WO2010 / 053572, DOTAP (1,2- dioleoyl-3-trimethylammonium propane), DOTMA (1,2-di -O- octadecenyl -3 - trimethylammonium propane), DLinDMA. (Heyes, et al, J.Contr.Rel.107:. 276-287 (2005)), DLin-KC2-DMA (Semple, et al, Nature Biotech.28: 172-176 (2010)), C12-200 (Love, et al, Proc.Nat'l.Acad.Sci.107:. 1864-1869 (2010)) may include, but is not limited to this. いくつかの実施形態において、陽イオン性脂質は、cKK−E12: In some embodiments, cationic lipids, ckk-E12:

である。 It is.

適したヘルパー脂質は、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPG(,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1'−rac−グリセロール))、及びコレステロールを含むが、これに限定されない。 Suitable helper lipids are, DSPC (1,2-distearoyl -sn- glycero-3-phosphocholine), DPPC (1,2-dipalmitoyl -sn- glycero-3-phosphocholine), DOPE (1,2-dioleyl - sn- glycero-3-phosphoethanolamine), DPPE (1,2-dipalmitoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine), DMPE (1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine) , DOPG (, 2-dioleyl -sn- glycero-3-phospho - (1'-rac- glycerol)), and cholesterol, but is not limited thereto.

ナノ粒子製剤における使用のためのペグ化脂質は、C6〜C20の長さのアルキル鎖(複数可)で脂質に共有的に結合した、最大5kDaの長さのポリ(エチレン)グリコール鎖、DMG−PEG2K、PEG−DSG、PEG−DMG、及びPEG−セラミドを含むが、これに限定されない。 Pegylated lipids for use in the nanoparticle formulation was covalently bound to the lipid by the length alkyl chains of C6 to C20 (s), the maximum length of 5kDa poly (ethylene) glycol chains, DMG- PEG2K, PEG-DSG, including PEG-DMG, and PEG- ceramides, not limited to this.

特定の実施形態において、脂質ナノ粒子担体は、以下の脂質製剤のうちの1つを含む: In certain embodiments, the lipid nanoparticle carrier comprises one of the following lipid formulations:
C12−200、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2K; C12-200, DOPE, cholesterol, DMG-PEG2K;
DODAP、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2K; DODAP, DOPE, cholesterol, DMG-PEG2K;
HGT5000、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2K; HGT5000, DOPE, cholesterol, DMG-PEG2K;
HGT5001、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2K; HGT5001, DOPE, cholesterol, DMG-PEG2K;
XTC、DSPC、コレステロール、PEG−DMG; XTC, DSPC, cholesterol, PEG-DMG;
MC3、DSPC、コレステロール、PEG−DMG; MC3, DSPC, cholesterol, PEG-DMG;
ALNY−100、DSPC、コレステロール、PEG−DSG。 ALNY-100, DSPC, cholesterol, PEG-DSG.

特定の実施形態において、これらのmRNAを含む本発明のmRNA及び組成物は、全身的な様式よりもむしろ局所的な様式で、例えば、好適には持続した放出性製剤での、標的組織への直接の医薬組成物の注入によって、投与され得る。 In certain embodiments, mRNA and compositions of the invention comprising these mRNA is a localized manner, rather than systemic manner, for example, preferably in the release formulations sustained, to a target tissue by injection of direct pharmaceutical compositions may be administered. 局所送達は、標的とされる組織に応じて、様々な方法で形を帯び得る。 Local delivery, depending on the tissue to be targeted may carry a form in a variety of ways. 例えば、本発明のmRNA及び組成物を含有するエアロゾルは、吸入され得る(経鼻、気管、または気管支送達のため)。 For example, an aerosol containing mRNA and compositions of the invention may be inhaled (for nasal, tracheal or bronchial delivery). 本発明のmRNA及び組成物は、例えば、傷害、疾病の顕性化、疼痛の部位に注入され得る。 mRNA and compositions of the present invention, for example, injury, overt of disease, may be injected at the site of pain. 組成物は、経口、気管、または食道適用のためにロゼンジで提供され得る。 The composition may be administered orally, can be provided in lozenge for tracheal or esophageal applications. 胃への、または腸内への投与のために、液体、錠剤、またはカプセルの形態で供給され得、直腸または腟適用のために坐薬の形態で供給され得、またはクリーム、液滴の使用によって、または注入によっても、目へさえも送達され得る。 For administration into the, or intestinal gastric, liquid, tablets or obtained be supplied in capsule form, obtained is supplied in the form of suppositories for rectal or 腟適 or cream, by use of the droplets, , or by infusion, it may also be delivered even to the eye.

本明細書に企図されるのはまた、本明細書に開示されるリポソームナノ粒子のうちの1つ以上を含む凍結乾燥された医薬組成物、及び例えば、その教示の全体が本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開第WO2012/170889号に開示されるような、そのような凍結乾燥された組成物の使用のための関連方法である。 Also being contemplated herein, lyophilized pharmaceutical compositions comprising one or more of the liposomal nanoparticles disclosed herein, and for example, refer entirety herein for its teachings which is incorporated by, as disclosed in International Patent Publication No. WO2012 / 170889, which is related methods for use of such freeze-dried composition. 例えば、本発明の凍結乾燥されたmRNA及び組成物は、投与前に再構成され得る、またはインビボで再構成され得る。 For example, lyophilized mRNA and compositions of the present invention may be reconfigured may be reconstituted, or in vivo prior to administration. 例えば、凍結乾燥されたmRNA及び/または組成物は、適切な剤形(例えば、円板、杆体、または膜など皮内剤形)で製剤化され、その剤形が、個体の体液によってインビボで経時的に再水和するように投与され得る。 For example, lyophilized mRNA and / or compositions, suitable dosage forms (e.g., disc, rod or film, such as intradermal dosage form) is formulated in, the dosage form, in vivo by body fluids of an individual It may be administered to over time rehydration.

特定の実施形態において、本発明のmRNAまたは組成物を投与することを含む、対象を治療する方法もまた、企図される。 In certain embodiments, comprising administering an mRNA or composition of the present invention, a method of treating a subject are also contemplated. 例えば、本発明の特定の実施形態は、特定のタンパク質の産生、及び/または特定のタンパク質の利用が不十分な、または易感染性である状態を治療または予防する方法を提供する。 For example, certain embodiments of the present invention, production of a particular protein, and / or the use of a specific protein to provide a method of insufficient or state treating or preventing a compromised. いくつかの実施形態において、本発明は、標的細胞内の1つ以上のmRNAの翻訳効率を調節する(例えば、増大する、改良する、または他の方法で向上させる)方法を提供する。 In some embodiments, the present invention modulate the translational efficiency of one or more mRNA in the target cells (e.g., increase, improve, or enhance in other ways) to provide a method. 本明細書で使用する場合、「翻訳効率」という語句は、mRNAが翻訳され、コードされた治療用タンパク質が産生される程度に言及する。 As used herein, the phrase "translational efficiency" is, mRNA is translated, the encoded therapeutic protein refers to the extent produced.

特定の実施形態において、本発明のmRNA分子、またはそのようなmRNAを含む組成物は、患者に投与される。 In certain embodiments, mRNA molecule or a composition comprising such mRNA, the present invention is administered to a patient.

いくつかの実施形態において、本発明のmRNA分子、またはそのようなmRNAを含む組成物は、インビトロまたはインビボ系におけるタンパク質産生のために使用される。 In some embodiments, a composition comprising an mRNA molecule or such mRNA, the present invention is used for protein production in vitro or in vivo system. 適したインビトロ系私のは、インビトロの無細胞系またはインビトロの細胞に基づく系である。 Suitable in vitro system mine is an in vitro cell-free system or in vitro system based on the cell. 適したインビボ系は、非ヒト動物(例えば、ラット、マウス、豚、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、非ヒト霊長類など)、またはヒトなどの、任意の生きている生物であり得る。 Suitable in vivo systems, non-human animal (e.g., rats, mice, pigs, dogs, chickens, sheep, non-human primate, etc.), or such as a human can be any living organism.

以下の特定の実施例は、図示的なもののみとして解釈されるべきであり、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。 Following specific examples are, should be interpreted only as illustrated ones, it should not be construed as limiting the scope of the present disclosure. 更なる精錬なく、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明をその最大限まで利用し得ると考えられる。 Further refining without, one skilled in the art based on the description herein is believed to be capable of utilizing the present invention to its fullest extent.

実施例1:4'−チオ−置換フラノース環を組み込むmRNAの合成及び発現 タンパク質をコードするmRNAを合成する。 Example 1: 4'-thio - synthesizing mRNA encoding the synthesis and expression protein mRNA include substitution furanose ring. mRNAは、少なくとも1つの4'−チオ−置換フラノース環を含有する。 mRNA is at least one 4'-thio - containing substituted furanose ring. mRNAは、医薬組成物に製剤化され、対象に投与される。 mRNA is formulated into a pharmaceutical composition, it is administered to a subject. mRNAは、より長い半減期を呈し、4'−チオ−置換フラノース環を含有しない対照mRNAよりも多い量の、mRNAによってコードされたタンパク質の合成もたらし得る。 mRNA exhibits a longer half-life, 4'-thio - a greater amount than the control mRNA containing no substituted furanose ring, may result in the synthesis of the protein encoded by mRNA.

I. I. 製剤の実験的詳細: Formulation of the experimental details:
I−A. I-A. メッセンジャーRNA材料 ホタルルシフェラーゼ(FFL)、ヒトエリスロポエチン(EPO)、及びヒトアルファ−ガラクトシダーゼ(GLA)を、遺伝子をコードするプラスミドDNA鋳型からのインビトロ転写によって合成し、ゲル電気泳動によって決定される、5'キャップ構造(キャップ1)(Fechter and Brownlee,J.Gen.Virology86:1239−1249(2005))及び約200ヌクレオチド長の3'ポリ(A)テールの添加を続ける。 Messenger RNA material firefly luciferase (FFL), human erythropoietin (EPO), and human alpha - galactosidase (GLA), was synthesized by in vitro transcription from plasmid DNA template encoding the gene, as determined by gel electrophoresis, 5 ' cap structure (cap 1) (Fechter and Brownlee, J.Gen.Virology86: 1239-1249 (2005)) and continued 3 'addition of poly (a) tail of about 200 nucleotides in length. 各mRNA産生物中に存在する5'及び3'非翻訳領を、それぞれX及びYとして表し、述べるように定義した(下記参照)。 The 5 'and 3' untranslated territory present in each mRNA production organism, expressed as X and Y, respectively, were defined as described (see below).

ヒトエリスロポエチン(EPO)mRNA(配列番号1):X AUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUC Human erythropoietin (EPO) mRNA (SEQ ID NO 1): X 1 AUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUC UGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGAY UGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGAY 1

ヒトアルファ−ガラクトシダーゼ(GLA)mRNA(配列番号2):X AUGCAGCUGAGGAACCCAGAACUACAUCUGGGCUGCGCGCUUGCGCUUCGCUUCCUGGCCCUCGUUUCCUGGGACAUCCCUGGGGCUAGAGCACUGGACAAUGGAUUGGCAAGGACGCCUACCAUGGGCUGGCUGCACUGGGAGCGCUUCAUGUGCAACCUUGACUGCCAGGAAGAGCCAGAUUCCUGCAUCAGUGAGAAGCUCUUCAUGGAGAUGGCAGAGCUCAUGGUCUCAGAAGGCUGGAAGGAUGCAGGUUAUGAGUACCUCUGCAUUGAUGACUGUUGGAUGGCUCCCCAAA Human alpha - galactosidase (GLA) mRNA (SEQ ID NO 2): X 1 AUGCAGCUGAGGAACCCAGAACUACAUCUGGGCUGCGCGCUUGCGCUUCGCUUCCUGGCCCUCGUUUCCUGGGACAUCCCUGGGGCUAGAGCACUGGACAAUGGAUUGGCAAGGACGCCUACCAUGGGCUGGCUGCACUGGGAGCGCUUCAUGUGCAACCUUGACUGCCAGGAAGAGCCAGAUUCCUGCAUCAGUGAGAAGCUCUUCAUGGAGAUGGCAGAGCUCAUGGUCUCAGAAGGCUGGAAGGAUGCAGGUUAUGAGUACCUCUGCAUUGAUGACUGUUGGAUGGCUCCCCAAA AGAUUCAGAAGGCAGACUUCAGGCAGACCCUCAGCGCUUUCCUCAUGGGAUUCGCCAGCUAGCUAAUUAUGUUCACAGCAAAGGACUGAAGCUAGGGAUUUAUGCAGAUGUUGGAAAUAAAACCUGCGCAGGCUUCCCUGGGAGUUUUGGAUACUACGACAUUGAUGCCCAGACCUUUGCUGACUGGGGAGUAGAUCUGCUAAAAUUUGAUGGUUGUUACUGUGACAGUUUGGAAAAUUUGGCAGAUGGUUAUAAGCACAUGUCCUUGGCCCUGAAUAGGACUGGCAGAAGCAUUGUGUACUCCUGUGAGUGGCCUCUUUAUAUGUGGCCCUU AGAUUCAGAAGGCAGACUUCAGGCAGACCCUCAGCGCUUUCCUCAUGGGAUUCGCCAGCUAGCUAAUUAUGUUCACAGCAAAGGACUGAAGCUAGGGAUUUAUGCAGAUGUUGGAAAUAAAACCUGCGCAGGCUUCCCUGGGAGUUUUGGAUACUACGACAUUGAUGCCCAGACCUUUGCUGACUGGGGAGUAGAUCUGCUAAAAUUUGAUGGUUGUUACUGUGACAGUUUGGAAAAUUUGGCAGAUGGUUAUAAGCACAUGUCCUUGGCCCUGAAUAGGACUGGCAGAAGCAUUGUGUACUCCUGUGAGUGGCCUCUUUAUAUGUGGCCCUU UCAAAAGCCCAAUUAUACAGAAAUCCGACAGUACUGCAAUCACUGGCGAAAUUUUGCUGACAUUGAUGAUUCCUGGAAAAGUAUAAAGAGUAUCUUGGACUGGACAUCUUUUAACCAGGAGAGAAUUGUUGAUGUUGCUGGACCAGGGGGUUGGAAUGACCCAGAUAUGUUAGUGAUUGGCAACUUUGGCCUCAGCUGGAAUCAGCAAGUAACUCAGAUGGCCCUCUGGGCUAUCAUGGCUGCUCCUUUAUUCAUGUCUAAUGACCUCCGACACAUCAGCCCUCAAGCCAAAGCUCUCCUUCAGGAUAAGGACGUAAUUGCCAUCAAUCAGGA UCAAAAGCCCAAUUAUACAGAAAUCCGACAGUACUGCAAUCACUGGCGAAAUUUUGCUGACAUUGAUGAUUCCUGGAAAAGUAUAAAGAGUAUCUUGGACUGGACAUCUUUUAACCAGGAGAGAAUUGUUGAUGUUGCUGGACCAGGGGGUUGGAAUGACCCAGAUAUGUUAGUGAUUGGCAACUUUGGCCUCAGCUGGAAUCAGCAAGUAACUCAGAUGGCCCUCUGGGCUAUCAUGGCUGCUCCUUUAUUCAUGUCUAAUGACCUCCGACACAUCAGCCCUCAAGCCAAAGCUCUCCUUCAGGAUAAGGACGUAAUUGCCAUCAAUCAGGA CCCUUGGGCAAGCAAGGGUACCAGCUUAGACAGGGAGACAACUUUGAAGUGUGGGAACGACCUCUCUCAGGCUUAGCCUGGGCUGUAGCUAUGAUAAACCGGCAGGAGAUUGGUGGACCUCGCUCUUAUACCAUCGCAGUUGCUUCCCUGGGUAAAGGAGUGGCCUGUAAUCCUGCCUGCUUCAUCACACAGCUCCUCCCUGUGAAAAGGAAGCUAGGGUUCUAUGAAUGGACUUCAAGGUUAAGAAGUCACAUAAAUCCCACAGGCACUGUUUUGCUUCAGCUAGAAAAUACAAUGCAGAUGUCAUUAAAAGACUUACUUUAAY CCCUUGGGCAAGCAAGGGUACCAGCUUAGACAGGGAGACAACUUUGAAGUGUGGGAACGACCUCUCUCAGGCUUAGCCUGGGCUGUAGCUAUGAUAAACCGGCAGGAGAUUGGUGGACCUCGCUCUUAUACCAUCGCAGUUGCUUCCCUGGGUAAAGGAGUGGCCUGUAAUCCUGCCUGCUUCAUCACACAGCUCCUCCCUGUGAAAAGGAAGCUAGGGUUCUAUGAAUGGACUUCAAGGUUAAGAAGUCACAUAAAUCCCACAGGCACUGUUUUGCUUCAGCUAGAAAAUACAAUGCAGAUGUCAUUAAAAGACUUACUUUAAY 1

コドン最適化ホタルルシフェラーゼ(FFL)mRNA(配列番号3):X AUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGU Codon optimized firefly luciferase (FFL) mRNA (SEQ ID NO 3): X 2 AUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGU UGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUAC UGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUAC CGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGG CGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGG GGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCU GGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCU CAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAA CAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAA GGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAY GGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAY 2

(5'非翻訳配列)(配列番号4):GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG X 1 (5 'untranslated sequence) (SEQ ID NO: 4): GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG

(5'非翻訳配列)(配列番号5): X 2 (5 'untranslated sequence) (SEQ ID NO: 5):
GGGAUCCUACC GGGAUCCUACC

(3'非翻訳配列)(配列番号6): Y 1 (3 'untranslated sequences) (SEQ ID NO: 6):
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC

(3'非翻訳配列)(配列番号7): Y 2 (3 'untranslated sequences) (SEQ ID NO: 7):
UUUGAAUU UUUGAAUU

I−b. I-b. 製剤プロトコル プロトコルA:C12−200、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kの50mg/mLのエタノール性溶液の一定分量を、混合し、エタノールで3mLの最終容積に希釈する。 Formulation Protocol Protocol A: C12-200, DOPE, cholesterol, and an aliquot of 50 mg / mL ethanol solution of DMG-PEG2K, mixed, diluted to a final volume of 3mL of ethanol. 別個に、GLA mRNAの水性緩衝液(10mMのクエン酸/150mMのNaCl、pH4.5)を1mg/mLのストックから調製する。 Separately, an aqueous buffer GLA mRNA (10 mM citric acid / 150 mM of NaCl, pH 4.5) are prepared from a stock of 1 mg / mL. 脂質溶液を、水性mRNA溶液中に急速に注入し、振盪して、20%エタノール中に最終懸濁液を生じさせる。 The lipid solution was rapidly injected into an aqueous mRNA solution, shaken, causing the final suspension in 20% ethanol. 結果として生じるナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)で透析濾過し、濃縮し、2〜8℃で保管する。 Results nanoparticle suspension occurring as a filtered, diafiltered with 1 × PBS (pH7.4), concentrated and stored at 2 to 8 ° C.. 最終濃度=0.85mg/mLのGLA mRNA(被包)。 Final concentration = 0.85 mg / mL of GLA mRNA (encapsulation). Z平均=81.2nm(偏差(50)=63.2nm;偏差(90)=104nm)。 Z average = 81.2nm (deviation (50) = 63.2nm; deviation (90) = 104nm).

プロトコルB:DODAP、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kの50mg/mLのエタノール性溶液の一定分量を、混合し、エタノールで3mLの最終容積に希釈する。 Protocol B: DODAP, DOPE, cholesterol, and an aliquot of 50 mg / mL ethanol solution of DMG-PEG2K, mixed, diluted to a final volume of 3mL of ethanol. 別個に、EPO mRNAの水性緩衝液(10mMのクエン酸/150mMのNaCl、pH4.5)を1mg/mLのストックから調製する。 Separately prepared aqueous buffer EPO mRNA the (10 mM citric acid / 150 mM of NaCl, pH 4.5) from a stock of 1 mg / mL. 脂質溶液を、水性mRNA溶液中に急速に注入し、振盪して、20%エタノール中に最終懸濁液を生じさせる。 The lipid solution was rapidly injected into an aqueous mRNA solution, shaken, causing the final suspension in 20% ethanol. 結果として生じるナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)で透析濾過し、濃縮し、2〜8℃で保管した。 Results nanoparticle suspension occurring as a filtered, 1 × diafiltered with PBS (pH 7.4), concentrated, and stored at 2 to 8 ° C.. 最終濃度=1.35mg/mLのEPO mRNA(被包)。 Final concentration = 1.35 mg / mL of EPO mRNA (encapsulation). Z平均=75.9nm(偏差(50)=57.3nm;偏差(90)=92.1nm)。 Z average = 75.9nm (deviation (50) = 57.3nm; deviation (90) = 92.1nm).

プロトコルC:2.0mg/mLの水性溶液PEI(分枝状、25kDa)の一定分量を、CFTR mRNAの水性溶液(1.0mg/mL)と混合する。 Protocol C: 2.0 mg / mL aqueous solution PEI (branched, 25 kDa) aliquots, mixed with CFTR mRNA in aqueous solution (1.0mg / mL). 結果として生じる複合した混合物を、上下に数回ピペッティングし、注入前に20分間放置する。 The resulting composite mixture was pipetting up and down several times, allowed to stand for 20 minutes prior to injection. 最終濃度=0.60mg/mLのCFTR mRNA(被包)。 Final concentration = 0.60 mg / mL of CFTR mRNA (encapsulation). Z平均=75.9nm(偏差(50)=57.3nm;偏差(90)=92.1nm)。 Z average = 75.9nm (deviation (50) = 57.3nm; deviation (90) = 92.1nm).

II. II. 修飾メッセンジャーRNA対無修飾mRNAの分析: Analysis of the modified messenger RNA versus unmodified mRNA:
II−a. II-a. メッセンジャーRNA構築物内の修飾塩基の定量化 4'−チオNTP修飾メッセンジャーRNAを、リボヌクレアーゼIまたはヌクレアーゼP1に様々な期間にわたって供し、十分に分解させる。 Quantification 4'-thio NTP modified messenger RNA modified bases in the messenger RNA constructs, subjected over various periods RNase I or nuclease P1, it is well resolved. 完了時、結果として生じる一リン酸ヌクレオチドを、アルカリホスファターゼで更に分解して、それぞれのヌクレオシドを提供する。 Upon completion, the monophosphate nucleotides resulting in further degraded by alkaline phosphatase, to provide respective nucleosides. ヌクレオシド混合物を、効率的な酵素除去のためにAmiconスピンカラム(30,000MWCO)に適用する。 The nucleoside mixture for efficient enzyme removal applied to Amicon spin columns (30,000 MWCO). 結果として生じるヌクレオシド溶液を、HPLCによって分析し、それぞれの無修飾ヌクレオシドとのピーク面積比較によって定量化する。 Results nucleoside solution occurring as the, analyzed by HPLC, quantified by peak area comparison with a respective unmodified nucleosides.

II−b. II-b. 4'−チオNTP修飾メッセンジャーRNA構築物の安定性 4'−チオNTP修飾メッセンジャーRNAを、リボヌクレアーゼIまたはヌクレアーゼP1に様々な期間にわたって供し、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を評価する。 Stability 4'-thio NTP modified messenger RNA 4'-thio NTP modified messenger RNA constructs, subjected over various periods RNase I or nuclease P1, to evaluate the resistance to nuclease degradation. 同様に、4'−チオNTP修飾メッセンジャーRNAを、血清(ヌクレアーゼを含有)で様々な期間にわたって処理し、ヌクレアーゼ分解を評価した。 Similarly, the 4'-thio NTP modified messenger RNA, serum (containing nuclease) was treated over different periods, were evaluated nuclease degradation. 指定の時点で、ヌクレアーゼ反応物を阻害剤で急冷し、結果として生じる溶液を、効率的な酵素除去のためにAmiconスピンカラム(30,000MWCO)に適用する。 At the specified time, quenched nuclease reaction inhibitors, the resulting solution, for efficient enzymatic removal applied to Amicon spin columns (30,000 MWCO). 完了時、残余分をアガロースゲルに適用し、mRNA構築物の生存率(サイズ、分解産生物など)について分析する。 Upon completion the retentate was applied to agarose gel and analyzed for viability of mRNA construct (size, decomposition producing organism). 同一の実験を無修飾mRNA上に実行し、直接比較及び推測が導かれ得る。 The same experiments were run on unmodified mRNA, may compare and speculation led directly.

II−c. II-c. タンパク質産生に対する4'−チオNTP修飾メッセンジャーRNAの効果 インビトロでの研究:4'−チオNTP修飾mRNA及び無修飾mRNAのインビトロでの遺伝子導入を、HEK293T細胞を使用して実行する。 Research in effect in vitro 4'-thio NTP modified messenger RNA for protein production: the 4'-thio NTP modified mRNA and unmodified mRNA gene transfer in vitro, performed using HEK293T cells. 1マイクログラムの各mRNA構築物の遺伝子導入を、別個のウェル内でリポフェクタミンを使用して実行する。 Gene transfer of each mRNA constructs 1 microgram, performed using Lipofectamine in separate wells. 選択時点(例えば、4時間、8時間、24時間、48時間、72時間など)で細胞を収集し、それぞれのタンパク質産生を分析する。 Selection time (e.g., 4 hours, 8 hours, 24 hours, 48 ​​hours, etc. 72 hours) to collect cells, analyzing the respective protein production. FFL mRNAにおいて、生物発光アッセイによって、細胞可溶化液をルシフェラーゼ産生について分析する。 In FFL mRNA, by bioluminescent assay, cell lysates are analyzed for luciferase production. EPO及びGLA mRNA研究において、細胞上清を取得し、ELISAに基づく方法を使用して、EPO及びGLAタンパク質についてそれぞれ分析する。 In EPO and GLA mRNA studies, it obtains the cell supernatant, using a method based on ELISA, and analyzed respectively for EPO and GLA protein. 無修飾対4'−チオNTP修飾mRNAの経時的なタンパク質産生の比較が、行われ得る。 Comparison over time protein production unmodified pair 4'-thio NTP modified mRNA, can be performed.

インビボでの研究:経時的なタンパク質産生の比較を、野生型マウス(CD−1)への4'チオNTP修飾mRNA被包ナノ粒子(脂質またはポリマー)の注入、対同一の様式で送達される無修飾mRNAによって行う。 Vivo studies: is delivered in temporal comparisons protein production, injection of 4 'thio-NTP modified mRNA encapsulated nanoparticles to wild-type mice (CD-1) (lipid or polymer), versus the same manner carried out by unqualified mRNA. 選択時点(例えば、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間など)で血清及び器官を採取し、それぞれのタンパク質レベルを監視する。 Selection point (e.g., 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 ​​hours, etc. 72 hours) the serum and organs were collected by monitors respective protein levels. FFL mRNAにおいて、生物発光アッセイによって、肝臓ホモジネートをルシフェラーゼ産生について分析する。 In FFL mRNA, by bioluminescent assay, liver homogenates are analyzed for luciferase production. EPO及びGLAmRNA研究において、マウス血清を取得し、ELISAに基づく方法を使用して、EPO及びGLAタンパク質についてそれぞれ分析する。 In EPO and GLAmRNA studies to obtain mouse serum, using a method based on ELISA, and analyzed respectively for EPO and GLA protein. 無修飾対4'−チオNTP修飾mRNAの経時的なタンパク質産生の比較を行う。 And it compares the time protein production unmodified pair 4'-thio NTP modified mRNA.

同様に、被包されていない(裸の)4'チオNTP修飾mRNA及び無修飾mRNAを、静脈内、皮下、または気管内投与のいずれかによって注入し、安定性及びタンパク質産生の差を評価するために、上記に記載されるような同一の分析が、実行され得る。 Similarly, non-encapsulating (naked) 4 'thio-NTP modified mRNA and unmodified mRNA, injected intravenously, subcutaneously or by either intratracheal administration, to assess the differences in stability and protein production for the same analysis as described above, it may be performed.

III. III. 投与された裸の修飾mRNAまたはmRNA負荷ナノ粒子によって産生されるFFL、EPO、及びGLAタンパク質の分析: FFL produced by modifying mRNA or mRNA-loaded nanoparticles of the administered naked, EPO, and analysis of GLA protein:
III−a. III-a. 注入プロトコル 全ての研究は、各実験の開始時点で生後約6〜8週間の雄のCD−1マウスを使用して実行する。 Injection protocol All studies performed using the age of about 6-8 weeks Male CD-1 mice at the start of each experiment. 試料を、30〜200マイクログラムの等価全用量の被包されていない、または被包されたFFL、EPO、またはGLA mRNA(修飾または無修飾)の単一ボーラス尾静脈注入によって導入する。 Samples of 30 to 200 are not encapsulated micrograms equivalent total dose, or encapsulated FFL, is introduced by a single bolus tail vein injection of EPO or GLA mRNA, (modified or unmodified). 指定された時点でマウスを屠殺し、生理食塩水で灌流する。 Mice were sacrificed at the specified time, perfused with saline.

III−b. III-b. 分析のための器官組織の単離 各マウスの肝臓及び脾臓を収集し、3つの部分に配分し、分析のために、10%の中性緩衝ホルマリン中で保管するか、またはスナップ冷凍し、−80℃で保管するかのいずれかにする。 The organ tissues isolated liver and spleen of each mouse for analysis were collected, allocated into three parts, for analysis, or stored in 10% neutral buffered formalin or snap frozen, - to either be stored at 80 ℃.

III−c. III-c. 分析のための血清の単離 全ての動物を、CO 窒息によって用量投与(±5%)の48時間後に安楽死させ、開胸及び末端心臓血液採取を続ける。 Serum isolated all animals for analysis, were euthanized 48 hours after dose administration (± 5%) by CO 2 asphyxiation, continued thoracotomy and terminal heart blood collection. 安楽死させた動物への心臓穿刺によって、血清分離チューブ内に全血(最大取得可能容積)を採取し、室温で少なくとも30分間凝血させ、22℃±5℃で、9300gで10分間遠心分離し、その後血清を抽出する。 By cardiac puncture into euthanized animals, in serum separator tubes were collected whole blood (maximum obtainable volume), allowed to clot for at least 30 minutes at room temperature, at 22 ° C. ± 5 ° C., then centrifuged for 10 minutes at 9300g , and then extract the serum. 中間血液採取のために、顔面静脈穿刺または尾切除によって約40〜50μLの全血を採取する。 For intermediate blood collection, whole blood is approximately 40~50μL by facial vein puncture or tail excision. 未処理の動物から採取した試料を、研究動物との比較のための基線GLAレベルとして使用する。 The samples taken from untreated animals, for use as a baseline GLA levels for comparison with the study animals.

III−d. III-d. 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)分析 EPO ELISA:EPOタンパク質の定量化を、ヒトEPO ELISAキット(Quantikine IVD,R&D Systems、カタログ#Dep−00)について報告される手順に従って実行する。 Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) analysis EPO ELISA: Quantification of EPO protein, carried out according to the procedure reported human EPO ELISA kit (Quantikine IVD, R & D Systems, Cat # Dep-00) for. 用いられ得る陽性対照は、超高純度、及び組織培養等級の組み換えヒトエリスロポエチンタンパク質(それぞれ、R&D Systems、カタログ#286−EP及び287−TC)からなる。 That may be used positive control consists of ultra high purity, and recombinant human erythropoietin protein tissue culture grade (respectively, R & D Systems, Cat # 286-EP and 287-TC). 指定された時点で血液試料を採取し、上記に記載するように処理する。 Blood samples were taken at the given time point, treated as described above. Molecular Device Flex Station装置上吸収(450nm)によって、検出を監視する。 By Molecular Device Flex Station apparatus on absorption (450 nm), it monitors the detection.

GLA ELISA:ヒツジ抗REPLAGAL(登録商標)G−188IgGを捕捉抗体として、ウサギ抗REPLAGAL(登録商標)TK−88IgGを二次(検出)抗体として用いて、標準ELISA手順に従った(Shire Human Genetic Therapies)。 GLA ELISA: Sheep Anti REPLAGAL (TM) G-188IgG the capture antibody, rabbit anti REPLAGAL (R) TK-88IgG used as a secondary (detection) antibody, followed standard ELISA procedure (Shire Human Genetic Therapies ). 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)接合ヤギ抗ウサギIgGを、3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン(TMB)基質溶液の活性化のために使用する。 Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit IgG, 3,3 ', used for the activation of 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate solution. 2N H SO を使用して、反応物を20分後に急冷する。 Use 2N H 2 SO 4, quenching the reaction after 20 minutes. Molecular Device Flex Station装置上吸収(450nm)によって、検出を監視する。 By Molecular Device Flex Station apparatus on absorption (450 nm), it monitors the detection. 未処理のマウス血清及びヒトREPLAGAL(登録商標)タンパク質を、それぞれ陰性及び陽性対照として使用する。 Mouse sera and human REPLAGAL (TM) protein of the untreated, respectively used as negative and positive controls.

III−e. III-e. 生物発光分析 ルシフェラーゼアッセイ:Promega Luciferase Assay System(品目#E1500)を使用して、生物発光アッセイを行う。 Bioluminescent analysis Luciferase Assay: using a Promega Luciferase Assay System (item # E1500), performing a bioluminescent assay. 10mLのルシフェラーゼアッセイ緩衝液をルシフェラーゼアッセイ基質に添加することによって、Luciferase Assay Reagentを調製し、ボルテックスによって混合する。 Luciferase assay buffer 10mL by adding the luciferase assay substrate, was prepared Luciferase Assay Reagent, mix by vortexing. 約20uLのホモジネート試料を、96ウェルの平板上に充填し、各試料に対して20uLの平板制御を続ける。 The homogenate samples of approximately 20uL, loaded onto a flat plate of 96-well, continued flat control of 20uL for each sample. 別個に120uLのLuciferase Assay Reagent(上記に記載するように調製)を96ウェルの平底平板の各ウェルに添加する。 Separately added to the Luciferase Assay Reagent each well of flat-bottom flat plate (prepared as described above) the 96-well 120 uL. その後、Molecular Device Flex Station装置を使用して、各平板を適切なチャンバーに挿入し、発光を測定(相対光単位(RLU)で測定)する。 Then, using a Molecular Device Flex Station apparatus, inserting each flat to a suitable chamber, for emitting a measurement (measured in relative light units (RLU)).

実施例2.4'−チオ修飾を有するmRNAの送達及び発現のための例示的リポソーム製剤 本実施例は、4'−チオ修飾mRNAのインビボでの効果的な送達及び発現のための、例示的リポソーム製剤を提供する。 Exemplary liposome formulations the present embodiment for the delivery and expression of mRNA with Example 2.4'- thio modifications, for effective delivery and expression in vivo of 4'-thio modified mRNA, exemplary to provide a liposomal formulation.

脂質材料 本明細書に記載される製剤は、様々な核酸に基づく材料を被包するように設計された、1つ以上の陽イオン性脂質、ヘルパー脂質(例えば、非陽イオン性脂質及び/またはコレステロールに基づく脂質)、ならびにペグ化脂質を用いる、多様な比率の多成分性脂質混合物を含む。 Formulations described lipid material herein were designed based materials various nucleic acid to encapsulate one or more cationic lipids, helper lipid (e.g., non-cationic lipids and / or lipid-based cholesterol), as well as use of pegylated lipids, including multi-component lipid mixture of various proportions. 陽イオン性脂質は、DOTAP(1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DODAP(1,2−ジオレイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2−ジ−O−オクタデセニル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA(Heyes,J.;Palmer,L.;Bremner,K.;MacLachlan,I.“Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids”J.Contr.Rel.2005,107,276−287)、DLin−KC2−DMA(Semple,S.C.et al.“Rational Design of C Cationic lipids, DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane), DODAP (1,2-dioleyl-3-dimethylammonium propane), DOTMA (1,2-di -O- octadecenyl 3- trimethylammonium propane), DLinDMA (Heyes, J;. Palmer, L;. Bremner, K;.. MacLachlan, I "Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids" J.Contr.Rel.2005,107,276- 287), DLin-KC2-DMA (Semple, S.C.et al. "Rational Design of C ationic Lipids for siRNA Delivery”Nature Biotech.2010,28,172−176),C12−200(Love,K.T.et al.“Lipid−like materials for low−dose in vivo gene silencing”PNAS2010,107,1864−1869)、HGT4003、HGT5000、HGT5001、MC3、cKK−E12(3,6−ビス(4−(ビス(2−ヒドロキシドデシル)アミノ)ブチル)ピペラジン−2,5−ジオン)、ICE、ジアルキルアミノに基づくもの、イミダゾールに基づくもの、グアニジウムに基づくものなどを含み得る(が、排他的ではない)。 ationic Lipids for siRNA Delivery "Nature Biotech.2010,28,172-176), C12-200 (Love, K.T.et al." Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing "PNAS2010,107,1864 -1869), HGT4003, HGT5000, HGT5001, MC3, cKK-E12 (3,6- bis (4- (bis (2-hydroxy-dodecyl) amino) butyl) piperazine-2,5-dione), ICE, the dialkylamino based, based on imidazole, it may include such as those based on guanidium (but not exclusive). ヘルパー脂質は、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPG(,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1'−rac−グリセロール))、コレステロールなどを含み得る(が、排他的ではない)。 Helper lipids, DSPC (1,2-distearoyl -sn- glycero-3-phosphocholine), DPPC (1,2-dipalmitoyl -sn- glycero-3-phosphocholine), DOPE (1,2-dioleyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine), DPPE (1,2- dipalmitoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine), DMPE (1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine), DOPG (2-dioleyl -sn- glycero-3-phospho - (1'-rac- glycerol)), it may include such as cholesterol (but not exclusive). ペグ化脂質は、C 〜C 20の長さのアルキル鎖(複数可)で脂質に共有的に結合した、最大5kDaの長さのポリ(エチレン)グリコール鎖を含み得る(が、排他的ではない)。 Pegylated lipids were covalently bound to the lipid by the length alkyl chains of C 6 -C 20 (s), may include a maximum length of 5kDa poly (ethylene) glycol chains (but exclusively the Absent).

ポリマー材料 本明細書に記載される更なる製剤は、分枝状ポリエチレンイミン(PEI)(25kDa)(Sigma#408727)、プロタミン、ペグ化プロタミン、PLL、ペグ化PLLなどを含み得る(が、排他的ではない)、様々な帯電したポリマー材料を含む。 Additional formulations described polymeric material herein, branched polyethyleneimine (PEI) (25kDa) (Sigma # 408727), which may include protamine, pegylated protamine, PLL, etc. pegylated PLL (but exclusive an unsubstantial is), includes various charged polymeric material.

mRNA材料 ホタルルシフェラーゼ(FFL)、ヒトエリスロポエチン(EPO)、及びヒトアルファ−ガラクトシダーゼ(GLA)を、遺伝子をコードするプラスミドDNA鋳型からのインビトロ転写によって合成し、ゲル電気泳動によって決定される、5'キャップ構造(キャップ1)(Fechter,P.;Brownlee,G.G.“Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins”J.Gen.Virology2005,86,1239−1249)及び約200ヌクレオチド長の3'ポリ(A)テールの添加を続けた。 mRNA material firefly luciferase (FFL), human erythropoietin (EPO), and human alpha - galactosidase (GLA), was synthesized by in vitro transcription from plasmid DNA template encoding the gene, as determined by gel electrophoresis, 5 'cap structure (cap 1) (Fechter, P;.. Brownlee, G.G "Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J.Gen.Virology2005,86,1239-1249) and 3 to about 200 nucleotides in length 'poly (a) followed by the addition of the tail. 各mRNA産生物中に存在する5'及び3'非翻訳領域を、それぞれX及びYとして表し、述べるように定義した(下記参照)。 The 5 'and 3' untranslated regions present in each mRNA production organism, expressed as X and Y, respectively, were defined as described (see below).

ヒトエリスロポエチン(EPO)、ヒトアルファ−ガラクトシダーゼ(GLA)、及びコドン最適化ホタルルシフェラーゼ(FFL)の例示的なmRNA配列を、配列番号1、2、及び3にそれぞれ描写する。 Human erythropoietin (EPO), human alpha - Exemplary mRNA sequence of galactosidase (GLA), and codon optimized firefly luciferase (FFL), depicted in SEQ ID NO: 1, 2, and 3. 例示的な5'及び3'UTR配列を、配列番号4、5、6、及び7に記載する。 Exemplary 5 'and 3'UTR sequences set forth in SEQ ID NO: 4, 5, 6, and 7.

例示的な製剤プロトコル A. Exemplary formulations protocol A. C12−200及びGLA C12-200 and GLA
C12−200、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kの50mg/mLのエタノール性溶液の一定分量を、混合し、エタノールで3mLの最終容積に希釈した。 C12-200, DOPE, cholesterol, and an aliquot of the ethanolic solution of 50 mg / mL of DMG-PEG2K, mixed and diluted to a final volume of 3mL of ethanol. 別個に、GLA mRNAの水性緩衝液(10mMのクエン酸/150mMのNaCl、pH4.5)を1mg/mLのストックから調製した。 Separately, they were prepared aqueous buffer of GLA mRNA (10 mM citric acid / 150 mM of NaCl, pH 4.5) from stock 1 mg / mL. 脂質溶液を、水性mRNA溶液中に急速に注入し、振盪して、20%エタノール中に最終懸濁液を生じさせた。 The lipid solution was rapidly injected into an aqueous mRNA solution, and shaken to yield a final suspension in 20% ethanol. 結果として生じるナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)で透析濾過し、濃縮し、2〜8℃で保管した。 Results nanoparticle suspension occurring as a filtered, 1 × diafiltered with PBS (pH 7.4), concentrated, and stored at 2 to 8 ° C.. 最終濃度=0.85mg/mLのGLA mRNA(被包)。 Final concentration = 0.85 mg / mL of GLA mRNA (encapsulation). 平均 =81.2nm(偏差(50) =63.2nm;偏差(90) =104nm)。 Z average = 81.2nm (deviation (50) = 63.2nm; deviation (90) = 104nm).

B. B. DODAP及びEPO DODAP and EPO
DODAP、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kの50mg/mLのエタノール性溶液の一定分量を、混合し、エタノールで3mLの最終容積に希釈した。 DODAP, DOPE, cholesterol, and an aliquot of the ethanolic solution of 50 mg / mL of DMG-PEG2K, mixed and diluted to a final volume of 3mL of ethanol. 別個に、EPO mRNAの水性緩衝液(10mMのクエン酸/150mMのNaCl、pH4.5)を1mg/mLのストックから調製した。 Separately, they were prepared an aqueous buffer EPO mRNA (10 mM citric acid / 150 mM of NaCl, pH 4.5) from stock 1 mg / mL. 脂質溶液を、水性mRNA溶液中に急速に注入し、振盪して、20%エタノール中に最終懸濁液を生じさせた。 The lipid solution was rapidly injected into an aqueous mRNA solution, and shaken to yield a final suspension in 20% ethanol. 結果として生じるナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)で透析濾過し、濃縮し、2〜8℃で保管した。 Results nanoparticle suspension occurring as a filtered, 1 × diafiltered with PBS (pH 7.4), concentrated, and stored at 2 to 8 ° C.. 最終濃度=1.35mg/mLのEPO mRNA(被包)。 Final concentration = 1.35 mg / mL of EPO mRNA (encapsulation). 平均 =75.9nm(偏差(50) =57.3nm;偏差(90) =92.1nm)。 Z average = 75.9nm (deviation (50) = 57.3nm; deviation (90) = 92.1nm).

C. C. PEI及びCFTR PEI and CFTR
2.0mg/mLの水性溶液PEI(分枝状、25kDa)の一定分量を、CFTR mRNAの水性溶液(1.0mg/mL)と混合した。 2.0 mg / mL aqueous solution PEI (branched, 25 kDa) aliquots were mixed with CFTR mRNA in aqueous solution (1.0mg / mL). 結果として生じる複合した混合物を、上下に数回ピペッティングし、注入前に20分間放置した。 The resulting composite mixture was pipetting up and down several times and allowed to stand prior to injection 20 minutes. 最終濃度=0.60mg/mLのCFTR mRNA(被包)。 Final concentration = 0.60 mg / mL of CFTR mRNA (encapsulation). 平均 =75.9nm(偏差(50) =57.3nm;偏差(90) =92.1nm)。 Z average = 75.9nm (deviation (50) = 57.3nm; deviation (90) = 92.1nm).

実施例3:修飾mRNA対無修飾mRNAのインビボでの安定性及びタンパク質産生の分析 本実施例は、修飾mRNAの安定性、及び様々な標的組織におけるインビボでのタンパク質の発現を分析するための例示的な方法を図示する。 Example 3: Analysis embodiment of in vivo stability of modified mRNA pairs unmodified mRNA and protein production, the stability of the modified mRNA, and examples for analyzing the expression of the protein in vivo in a variety of target tissues to illustrate the way.

mRNA構築物内の修飾塩基の定量化 4'−チオNTP修飾mRNAを、リボヌクレアーゼIまたはヌクレアーゼP1に様々な期間にわたって供し、十分に分解させた。 Quantification 4'-thio NTP modified mRNA of modified bases in the mRNA construct, subjected over various periods RNase I or nuclease P1, was well resolved. 完了時、結果として生じる一リン酸ヌクレオチドを、アルカリホスファターゼで更に分解して、それぞれのヌクレオシドを提供した。 Upon completion, the monophosphate nucleotides resulting in further degradation with alkaline phosphatase to provide respective nucleosides. ヌクレオシド混合物を、効率的な酵素除去のためにAmiconスピンカラム(30,000MWCO)に適用した。 The nucleoside mixture was applied to a Amicon spin columns (30,000 MWCO) for efficient enzyme removal. 結果として生じるヌクレオシド溶液を、HPLCによって分析し、それぞれの無修飾ヌクレオシドとのピーク面積比較によって定量化した。 Results nucleoside solution occurring as the, analyzed by HPLC, and quantified by peak area comparison with a respective unmodified nucleosides.

4'−チオNTP修飾mRNA構築物の安定性 4'−チオNTP修飾mRNAを、リボヌクレアーゼIまたはヌクレアーゼP1に様々な期間にわたって供し、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を評価した。 Stability 4'-thio NTP modified mRNA of 4'-thio NTP modified mRNA construct, subjected over various periods RNase I or nuclease P1, to evaluate the resistance to nuclease degradation. 指定の時点で、ヌクレアーゼ反応物を阻害剤で急冷し、結果として生じる溶液を、効率的な酵素除去のためにAmiconスピンカラム(30,000MWCO)に適用した。 At the specified time, quenched nuclease reaction inhibitors, the resulting solution was applied to a Amicon spin columns (30,000 MWCO) for efficient enzyme removal. 完了時、残余分をアガロースゲルに適用し、mRNA構築物の生存率(サイズ、分解産生物など)について分析した。 Upon completion the retentate was applied to agarose gel and analyzed for viability of mRNA construct (size, decomposition producing organism). 同一の実験を無修飾mRNA上に実行し、直接比較及び推測を導いた。 The same experiments were run on unmodified mRNA, it led to comparison and directly inferred.

タンパク質産生に対する4'−チオNTP修飾mRNAの効果 Effect of 4'-thio NTP modified mRNA for protein production

インビトロでの研究: Studies in vitro:
4'−チオNTP修飾mRNA及び無修飾mRNAのインビトロでの遺伝子導入を、HEK293T細胞を使用して実行した。 4'-thio NTP modified mRNA and unmodified mRNA gene transfer in vitro were performed using HEK293T cells. 1マイクログラムの各mRNA構築物の遺伝子導入を、別個のウェル内でリポフェクタミンを使用して実行した。 Gene transfer of each mRNA constructs 1 microgram was performed using Lipofectamine in separate wells. 選択時点(例えば、4時間、8時間、32時間、48時間、56時間、80時間など)で細胞を収集し、それぞれのタンパク質産生を分析した。 Selection time (e.g., 4 hours, 8 hours, 32 hours, 48 ​​hours, 56 hours, etc. 80 hours) to collect cells, and analyze each of the protein production. FFL mRNAにおいて、生物発光アッセイによって、細胞可溶化液をルシフェラーゼ産生について分析した。 In FFL mRNA, by bioluminescent assay, cell lysates were analyzed for luciferase production. EPO及びGLA mRNA研究において、細胞上清を取得し、ELISAに基づく方法を使用して、EPO及びGLAタンパク質についてそれぞれ分析した。 In EPO and GLA mRNA studies, it obtains the cell supernatant, using a method based on ELISA, and analyzed, respectively for EPO and GLA protein. 無修飾対4'−チオNTP修飾mRNAの経時的なタンパク質産生の比較を行った。 Comparison over time in protein production unmodified pair 4'-thio NTP modified mRNA was performed. 例示的な結果を、図2に示す。 Exemplary results are shown in Figure 2.

インビボでの研究: Vivo studies:
経時的なタンパク質産生の比較を、野生型マウス(CD−1)への4'チオNTP修飾mRNA被包ナノ粒子(脂質またはポリマー)の注入、対同一の様式で送達される無修飾mRNAによって行った。 Comparison over time in protein production, carried out by the wild-type mice 4 'injection of thio NTP modified mRNA encapsulated nanoparticles (lipid or polymer) of (CD-1) to, unmodified mRNA delivered in pairs the same manner It was. 選択時点(例えば、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間など)で血清及び器官を採取し、それぞれのタンパク質レベルを監視した。 Selection point (e.g., 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 ​​hours, etc. 72 hours) the serum and organs were taken at was monitored each protein level. FFL mRNAにおいて、生物発光アッセイによって、肝臓ホモジネートをルシフェラーゼ産生について分析した。 In FFL mRNA, by bioluminescent assay, and the liver homogenate were analyzed for luciferase production. EPO及びGLA mRNA研究において、マウス血清を取得し、ELISAに基づく方法を使用して、EPO及びGLAタンパク質についてそれぞれ分析した。 In EPO and GLA mRNA studies, it acquires the mouse serum, using a method based on ELISA, and analyzed, respectively for EPO and GLA protein. 無修飾対4'−チオNTP修飾mRNAの経時的なタンパク質産生の比較を行った。 Comparison over time in protein production unmodified pair 4'-thio NTP modified mRNA was performed.

同様に、被包されていない(裸の)4'チオNTP修飾mRNA及び無修飾mRNAを、静脈内、皮下、または気管内投与のいずれかによって注入し、安定性及びタンパク質産生における差を評価するために、上記に記載されるような同一の分析を実行した。 Similarly, non-encapsulating (naked) 4 'thio-NTP modified mRNA and unmodified mRNA, injected intravenously, subcutaneously or by either intratracheal administration, to assess differences in stability and protein production for, it was performed the same analysis as described above.

実施例4. Example 4. 裸の修飾mRNAまたはmRNA負荷ナノ粒子の投与後の、FFL、EPO、及びGLAタンパク質産生の分析 本実施例は、裸の、修飾された、mRNAまたはmRNA負荷ナノ粒子のいずれかの投与後の、例示的なタンパク質産生を分析するためのプロトコルを記載し、無修飾mRNAと比較した、4'−チオ修飾mRNAに関するmRNA安定性及びタンパク質産生を実証する。 After administration of naked modified mRNA or mRNA-loaded nanoparticles, FFL, EPO, and analysis embodiment of GLA protein production, naked, modified, after administration of either mRNA or mRNA-loaded nanoparticles, It describes a protocol for analyzing an exemplary protein production, compared to unmodified mRNA, demonstrating mRNA stability and protein production related 4'-thio modified mRNA.

全ての研究は、各実験の開始時点で生後約6〜8週間の雄のCD−1マウスを使用して実行した。 All studies were performed using the age of about 6-8 weeks Male CD-1 mice at the start of each experiment. 30〜200マイクログラムの等価全用量の、被包されていない、または被包されたFFL、EPO、またはGLA mRNA(修飾または無修飾)の単一ボーラス尾静脈注入によって試料を導入した。 Equivalent total dose of 30 to 200 micrograms, not encapsulated, or encapsulated FFL, Samples were introduced by a single bolus tail vein injection of EPO or GLA mRNA, (modified or unmodified). 指定された時点でマウスを屠殺し、生理食塩水で灌流した。 Mice were sacrificed at the specified time, and perfused with saline.

各マウスの肝臓及び脾臓を収集し、3つの部分に配分し、分析のために、10%の中性緩衝ホルマリン中で保管するか、またはスナップ冷凍し、−80℃で保管するかのいずれかにした。 The liver and spleen were collected for each mouse, allocated into three parts, for analysis, or stored in 10% neutral buffered formalin or snap frozen, either stored at -80 ° C. It was.

全ての動物を、CO 窒息によって用量投与(±5%)の48時間後に安楽死させ、開胸及び末端心臓血液採取を続けた。 All animals were euthanized after 48 hours of dose administration (± 5%) by CO 2 asphyxiation, continued thoracotomy and terminal heart blood collection. 安楽死させた動物から血清分離チューブ内に、全血(最大取得可能容積)を心臓穿刺によって採取し、室温で少なくとも30分間凝血させ、22℃±5℃で、9300gで10分間遠心分離し、その後血清を抽出した。 Serum separation in the tube from euthanized animals, whole blood (maximum obtainable volume) was collected by cardiac puncture, allowed to clot for at least 30 minutes at room temperature, at 22 ° C. ± 5 ° C., then centrifuged 10 min at 9300 g, then it was extracted serum. 中間血液採取のために、顔面静脈穿刺または尾切除によって約40〜50μLの全血を採取した。 For intermediate blood collection, whole blood was drawn about 40~50μL by facial vein puncture or tail excision. 未処理の動物から採取した試料を、研究動物との比較のための基線GLAレベルとして使用した。 The samples taken from untreated animals was used as a baseline GLA levels for comparison with the study animals.

酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)分析 EPOタンパク質の定量化を、ヒトEPO ELISAキット(Quantikine IVD,R&D Systems、カタログ#Dep−00)について報告される手順に従って実行した。 Quantification of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analysis EPO protein was performed according to the procedure reported human EPO ELISA kit (Quantikine IVD, R & D Systems, Cat # Dep-00) for. 用いた陽性対照は、超高純度、及び組織培養等級の組み換えヒトエリスロポエチンタンパク質(それぞれ、R&D Systems、カタログ#286−EP及び287−TC)からなった。 Using the positive control consisted of ultra high purity, and recombinant human erythropoietin protein tissue culture grade (respectively, R & D Systems, Cat # 286-EP and 287-TC). 指定された時点で血液試料を採取し、上記に記載するように処理した。 Blood samples were taken at the given time points, treated as described above. Molecular Device Flex Station装置上の吸収(450nm)によって、検出を監視した。 By absorption on Molecular Device Flex Station apparatus (450 nm), and monitored detection.

GLAタンパク質の分析のために、ヒツジ抗Replagal G−188IgGを捕捉抗体として、ウサギ抗Replagal IgGを二次(検出)抗体として用いて、標準的なELISA手順に従った。 For analysis of GLA protein, as the capture antibody Sheep anti Replagal G-188IgG, with rabbit anti Replagal IgG as a secondary (detection) antibody, in accordance with standard ELISA procedures. 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)接合ヤギ抗ウサギIgGを、3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン(TMB)基質溶液の活性化のために使用した。 Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit IgG, 3,3 ', was used for activation of 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate solution. 2N H SO を使用して、反応物を20分後に急冷した。 Use 2N H 2 SO 4, The reaction was quenched after 20 minutes. Molecular Device Flex Station装置上の吸収(450nm)によって、検出を監視した。 By absorption on Molecular Device Flex Station apparatus (450 nm), and monitored detection. 未処理のマウス血清及びヒトReplagal(登録商標)タンパク質を、それぞれ陰性及び陽性対照として使用した。 Mouse sera and human Replagal (TM) protein of the untreated, were used as negative and positive controls.

生物発光分析 Promega Luciferase Assay System(品目#E1500)を使用して、生物発光アッセイを行った。 Using bioluminescence analysis Promega Luciferase Assay System (item # E1500), it was bioluminescence assay. 10mLのルシフェラーゼアッセイ緩衝液をルシフェラーゼアッセイ基質に添加することによって、Luciferase Assay Reagentを調製し、ボルテックスによって混合した。 Luciferase assay buffer 10mL by adding the luciferase assay substrate, was prepared Luciferase Assay Reagent, and mixed by vortexing. 20uLのホモジネート試料を、96ウェルの平板上に充填し、各試料に対して20uLの平板制御を続けた。 The homogenate sample 20uL, loaded onto a flat plate of 96 wells continued to flat control of 20uL for each sample. 別個に120uLのLuciferase Assay Reagent(上記に記載するように調製)を96ウェルの平底平板の各ウェルに充填した。 Luciferase Assay Reagent of separately 120uL were filled into each well of a flat bottom flat plate (prepared as described above) and 96 wells. その後、Molecular Device Flex Station装置を使用して、各平板を適切なチャンバーに挿入し、発光を測定(相対光単位(RLU)で測定)した。 Then, using a Molecular Device Flex Station apparatus, inserting each flat to the appropriate chamber and emission measurement (measured in relative light units (RLU)).

例示的な結果 4'−チオ修飾または無修飾FFL mRNAの遺伝子導入によるFFLタンパク質の産生を、HEK293T細胞内で試験した。 Production of FFL protein by exemplary results 4'-thio modified or unmodified FFL mRNA gene transfer were tested in HEK293T cells. 図2は、遺伝子導入の4時間、8時間、32時間、56時間、80時間後に取得した加重相対蛍光単位(RLU)スコアを表す。 2, 4 hours transgenic represent 8 hours, 32 hours, 56 hours, weighting relative fluorescence units obtained after 80 hours (RLU) score. それぞれの時点で、25%の4'−チオウリジン(25%の4'−S−U)または100%の4'−チオウリジン(100%の4'−S−U)FFL mRNAのいずれかで遺伝子導入した細胞は、SNIM(登録商標)FFLまたは市販のFFLのいずれかで遺伝子導入した細胞よりも高い加重RLUスコアを有した。 At each time point, the transgenic either 25% of the 4'-thiouridine (25% of the 4'-S-U) or 100% of the 4'-thiouridine (100% 4'-S-U) FFL mRNA cells had a higher weight RLU scores than SNIM (TM) FFL or commercial cells transduced gene in one of FFL.

4'−チオ修飾及び無修飾FFL mRNAの経時的な安定性もまた、試験した。 Stability over time of the 4'-thio modified and unmodified FFL mRNA was also tested. 3マイクログラムのmRNAを、マウス血清に暴露し、1時間にわたって監視した。 3 micrograms of mRNA, exposed to mouse sera were monitored over one hour. 図3に見られるように、SNIM(登録商標)FFL及び市販のFFL mRNAと比較して、4'−チオ修飾mRNA、特に100%の4'−チオウリジン(100%の4'−S−U)FFL mRNAは、経時的により安定しているようである。 As seen in FIG. 3, SNIM (TM) FFL and compared to commercial FFL mRNA, 4'-thio modified mRNA, in particular 100% 4'-thiouridine (100% 4'-S-U) FFL mRNA appears to be stable over time manner.

4'−チオ修飾または無修飾FFL mRNAの遺伝子導入によるFFLタンパク質の産生を、野生型マウスにおいて試験した。 4'-thio modified or unmodified FFL mRNA transgenic production of FFL protein by, were tested in wild type mice. 1.0mg/kg用量のC12−200負荷脂質ナノ粒子を、静脈内に投与し、動物を屠殺し、上記に記載されるように、分析のためにそれらの肝臓を除去した。 The C12-200 load lipid nanoparticles 1.0 mg / kg dose, administered intravenously, animals were sacrificed as described above, to remove them liver for analysis. 図4は、投与の6時間後に取得した、RLU/mg全タンパク質スコアを表す。 Figure 4 were obtained after 6 hours of administration represent RLU / mg total protein score. 25%の4'−チオウリジン(25%の4'−S−U)及び100%の4'−チオウリジン(100%の4'−S−U)で処理したマウスからの肝臓は、無修飾mRNAで処理したマウスからの肝臓よりも高いRLU/mgスコアを有した。 25% of the 4'-thiouridine (25% of the 4'-S-U) and 100% of 4'-thiouridine (100% 4'-S-U) livers from mice treated with the unmodified mRNA It had higher RLU / mg scores than livers from treated mice.

とりわけ、本明細書に記載される例示的な結果は、4'−チオ−修飾ヌクレオチドを含む、提供されるmRNAが、合成に成功し得ること、増大した安定性を有すること、及び細胞内でタンパク質を産生するための使用に成功し得ることを実証した。 Especially, exemplary results described herein, 4'-thio - containing modified nucleotides, mRNA is provided, that may be successfully synthesized, having increased stability, and in the cell protein demonstrated that it is possible to successfully use to produce.

実施例5.4'−チオ−修飾ヌクレオチドの例示的な合成 合成手順: Example 5.4'- thio - modified nucleotide exemplary Synthesis Procedure:

中間体の調製: Preparation of Intermediate:

2,3−O−イソプロピリデン−D−リボン酸−1,4−ラクトンの合成 2,3-O-Synthesis of isopropylidene -D- ribbon acid-1,4-lactone

Carbohydrate Research 2008,1790−1800 Carbohydrate Research 2008,1790-1800

アセトン(2.79L)中、D−リボン酸−1,4−ラクトン(270.0g、1.823mol)及び硫酸(18.0g、0.182mol、0.1当量)の溶液を、室温で3日間撹拌した。 In acetone (2.79L), D- ribbon acid-1,4-lactone (270.0g, 1.823mol) and sulfuric acid (18.0g, 0.182mol, 0.1 eq) was treated with 3 at room temperature days and the mixture was stirred. 固体炭酸水素ナトリウム(約450g)の添加によって、反応混合物を急冷し、濾過し、濾液を蒸発させた。 By the addition of solid sodium bicarbonate (about 450 g), the reaction mixture was quenched, filtered and the filtrate evaporated. 残部を、酢酸エチルと水との間で分割した。 The remainder was partitioned between ethyl acetate and water. 酢酸エチルで水性層を抽出した。 The aqueous layer was extracted with ethyl acetate. 組み合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮させて、所望の産生物を白色固体(318.8g、93%)として生じさせた。 The combined organic layers were dried over magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to give the desired of the product as a white solid (318.8g, 93%). H NMR(300MHz、CDCl )δ4.83(d,J=5.5Hz、1H)、4.77(d,J=5.5Hz、1H)、4.64〜4.62(m、1H)、3.99(ddd,J=2.3、5.5、及び12.4Hz、1H)、3.81(ddd,J=2.3、5.5、及び12.4Hz、1H)、2.67(t,J=5.5Hz、1H)、1.46(s、3H)、1.37(s、3H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ4.83 (d, J = 5.5Hz, 1H), 4.77 (d, J = 5.5Hz, 1H), 4.64~4.62 (m, 1H ), 3.99 (ddd, J = 2.3,5.5, and 12.4Hz, 1H), 3.81 (ddd, J = 2.3,5.5, and 12.4Hz, 1H), 2.67 (t, J = 5.5Hz, 1H), 1.46 (s, 3H), 1.37 (s, 3H).

5−O−メタンスルホニル−2,3−O−イソプロピリデン−D−リボン酸−1,4−ラクトンの合成 5-O-synthesis methanesulfonyl-2,3-O-isopropylidene--D- ribbon acid-1,4-lactone

Organic Process Research and Development2006,487−492 Organic Process Research and Development2006,487-492

塩化メタンスルホニル(116.0g、1.014mol、1.2当量)を、0℃でジクロロメタン(2.43L)中、2,3−O−イソプロピリデン−D−リボン酸−1,4−ラクトン(159.0g、0.845mol)及びトリエチルアミン(128.0g、1.267mol)の溶液に滴加した。 Methanesulfonyl chloride (116.0g, 1.014mol, 1.2 eq) in dichloromethane (2.43L) at 0 ° C., 2,3-O-isopropylidene--D- ribbon acid-1,4-lactone ( 159.0 g, was added dropwise to a solution of 0.845Mol) and triethylamine (128.0g, 1.267mol). 反応混合物を、室温で1時間撹拌し、その後ジクロロメタンで希釈し、水、NaHCO 飽和水溶液、及び鹹水で洗浄した。 The reaction mixture was stirred for 1 hour at room temperature, then diluted with dichloromethane, washed with water, NaHCO 3 saturated solution and brine. 有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮させて、5−O−メタンスルホニル−2,3−O−イソプロピリデン−D−リボン酸−1,4−ラクトンを橙色の油(231.0g、約100%)として生じさせた。 The organic layer was dried over magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure, 5-O-methanesulfonyl-2,3-O-isopropylidene -D- ribbon acid-1,4-lactone orange oil (231.0g, about 100%) resulted in as. H NMR(300MHz、CDCl )δ4.82〜4.77(m、3H)、4.49〜4.41(m、2H)、3.04(s、3H)、1.47(s、3H)、1.38(s、3H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ4.82~4.77 (m, 3H), 4.49~4.41 (m, 2H), 3.04 (s, 3H), 1.47 (s, 3H), 1.38 (s, 3H).

2,3−O−イソプロピリデン−L−リキソン酸−1,4−ラクトンの合成 2,3-O-Synthesis of isopropylidene -L- lyxonic acid-1,4-lactone

Organic Process Research and Development2006,487−492 Organic Process Research and Development2006,487-492

水(1.1L)中、水酸化カリウム(137.0g、2.45mol)を、5−O−メタンスルホニル−2,3−O−イソプロピリデン−D−リボン酸−1,4−ラクトン(225.0g、0.85mol)に添加し、室温で18時間撹拌した。 In water (1.1 L), potassium hydroxide (137.0g, 2.45mol) and, 5-O-methanesulfonyl-2,3-O-isopropylidene--D- ribbon acid-1,4-lactone (225 .0G, it was added to 0.85 mol), and stirred at room temperature for 18 hours. 反応混合物を、2MのHCl水溶液(pHメーターを使用)でpH3に酸性化し、その後蒸発させた。 The reaction mixture was acidified to pH3 with aqueous HCl 2M (using a pH meter), then evaporated. 残部を加熱して、アセトン中に逆流させ、アセトンをデカントした(×3)。 Heating the remainder was reflux in acetone was decanted acetone (× 3). 組み合わせた抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮させて、2,3−O−イソプロピリデン−L−リキソン酸−1,4−ラクトンを淡黄色固体(115.4g、73%)として生じさせた。 Dried combined extracts over magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure, 2,3-O-isopropylidene--L- lyxonic acid-1,4-lactone as a pale yellow solid (115.4 g, It resulted as 73%). H NMR(300MHz、CDCl )δ4.89〜4.84(m、2H)、4.63〜4.59(m、1H)、4.08〜3.91(m、2H)、1.46(s、3H)、1.38(s、3H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ4.89~4.84 (m, 2H), 4.63~4.59 (m, 1H), 4.08~3.91 (m, 2H), 1. 46 (s, 3H), 1.38 (s, 3H).

5−O−tert−ブチルジメチルシリル−2,3−O−イソプロピリデン−L−リキソン酸−1,4−ラクトンの合成 5-O-tert synthesis butyldimethylsilyl-2,3-O-isopropylidene--L- lyxonic acid-1,4-lactone

Carbohydrate Research 2008,1790−1800 Carbohydrate Research 2008,1790-1800

ジクロロメタン(85.0mL)中、2,3−O−イソプロピリデン−L−リキソン酸−1,4−ラクトン(5.0g、0.027mol)の溶液に、イミダゾール(2.2g、32mmol)に続けてtert−塩化ブチルジメチルルシリル(butyldimethyllsilyl)(4.4g、29mmol、1.1当量)を添加し、反応混合物を室温で1.5時間撹拌した。 In dichloromethane (85.0 mL), a solution of 2,3-O-isopropylidene--L- lyxonic acid-1,4-lactone (5.0g, 0.027mol), followed by imidazole (2.2 g, 32 mmol) tert- butyl dimethylsilyl Le silyl (Butyldimethyllsilyl) Te was added (4.4 g, 29 mmol, 1.1 eq) and the reaction mixture was stirred for 1.5 hours at room temperature. 反応混合物を、ジクロロメタンで希釈し、NaHCO 飽和水溶液、鹹水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮させて、5−O−tert−ブチルジメチルシリル−2,3−O−イソプロピリデン−L−リキソン酸−1,4−ラクトンを淡黄色の油(7.3g、89%)として生じさせた。 The reaction mixture was diluted with dichloromethane, NaHCO 3 saturated solution, washed with brine, dried over magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure, 5-O-tert-butyldimethylsilyl-2,3 O- isopropylidene -L- lyxonic acid-1,4-lactone as a pale yellow oil (7.3g, 89%) resulted as. H NMR(300MHz、CDCl )δ4.79(s、2H)、4.54〜4.49(m、1H)、4.00〜3.86(m、2H)、1.45(s、3H)、1.38(s、3H)、0.89(s、9H)、0.08(s、6H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ4.79 (s, 2H), 4.54~4.49 (m, 1H), 4.00~3.86 (m, 2H), 1.45 (s, 3H), 1.38 (s, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.08 (s, 6H).

5−O−tert−ブチルジメチルシリル−2,3−O−イソプロピリデン−L−リキシトールの合成 5-O-tert-butyldimethylsilyl-2,3-O-isopropylidene--L- lyxitol Synthesis of

Carbohydrate Research 2008,1790−1800 Carbohydrate Research 2008,1790-1800

テトラヒドロフラン(63mL)及びメタノール(13mL)中、5−O−tert−ブチルジメチルシリル−2,3−O−イソプロピリデン−L−リキソン酸−1,4−ラクトン(7.2g、24mmol)の溶液に、水素化ホウ素ナトリウム(1.4g、0.036mol、1.5当量)を室温で一部ずつ添加した。 Tetrahydrofuran (63 mL) and methanol (13mL), 5-O-tert- butyldimethylsilyl-2,3-O-isopropylidene--L- lyxonic acid-1,4-lactone (7.2 g, 24 mmol) to a solution of , sodium borohydride (1.4 g, 0.036 mol, 1.5 eq) was added portionwise at room temperature. 反応混合物を室温で1時間撹拌し、その後減圧下で濃縮させた。 The reaction mixture was stirred for 1 hour at room temperature and then concentrated under reduced pressure. 残部を、酢酸エチルと1Mクエン酸水溶液との間で分割した。 The remainder was partitioned between ethyl acetate and 1M aqueous citric acid solution. 有機層を1Mクエン酸水溶液、鹹水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮させて、5−O−tert−ブチルジメチルシリル−2,3−O−イソプロピリデン−L−リキシトールを、静置時に結晶化する無色の油(6.3g、86%)として生じさせた。 The organic layer aqueous 1M citric acid, washed with brine, dried over magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure, 5-O-tert-butyldimethylsilyl-2,3-O-isopropylidene -L - the lyxitol, as colorless oil which crystallized on standing (6.3g, 86%). H NMR(300MHz、CDCl )δ4.26〜4.20(m、2H)、3.84〜3.59(m、5H)、1.51(s、3H)、1.37(s、3H)、0.89(s、9H)、0.07(s、6H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ4.26~4.20 (m, 2H), 3.84~3.59 (m, 5H), 1.51 (s, 3H), 1.37 (s, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.07 (s, 6H).

5−O−tert−ブチルジメチルシリル−2,3−O−イソプロピリデン−1,4−ジ−O−メタンスルホニル−L−リキシトールの合成 5-O-tert-butyldimethylsilyl-2,3-O-isopropylidene-1,4-di -O- methanesulfonyl -L- lyxitol Synthesis of

Carbohydrate Research 2008,1790−1800 Carbohydrate Research 2008,1790-1800

塩化メタンスルホニル(15.2mL、0.196mol、10当量)を、10℃未満でピリジン(15.8mL、0.196mol、10当量)に滴加した。 Methanesulfonyl chloride (15.2 mL, 0.196 mol, 10 eq.), Pyridine below 10 ℃ (15.8mL, 0.196mol, 10 equiv) was added dropwise to. ジクロロメタン(16mL)中、5−O−tert−ブチルジメチルシリル−2,3−O−イソプロピリデン−L−リキシトール(6g、0.0196mol)の溶液を、10℃未満で滴加した。 In dichloromethane (16mL), 5-O-tert- butyldimethylsilyl-2,3-O-isopropylidene -L- lyxitol (6g, 0.0196mol) the solution was added dropwise at below 10 ° C.. 反応混合物を室温で2時間撹拌した。 The reaction mixture was stirred for 2 hours at room temperature. 冷却浴を交換し、氷の添加によって塩化メタンスルホニルの過剰量を加水分解した。 Replace the cooling bath to hydrolyze the excess of methanesulfonyl chloride by the addition of ice. その後、反応混合物に水(300mL)を注ぎ、Et O(3×50mL)で抽出した。 Thereafter, the reaction mixture poured into water (300 mL), and extracted with Et 2 O (3 × 50mL) . 組み合わせた有機層を1Mクエン酸水溶液、NaHCO 飽和水溶液及び鹹水で洗浄し、乾燥させ(MgSO )、濾過し、減圧下で濃縮させた。 The combined organic layers with 1M aqueous citric acid, NaHCO 3 and washed with a saturated aqueous solution and brine, dried (MgSO 4), filtered, and concentrated under reduced pressure. フラッシュクロマトグラフィーによって、1:6の酢酸エチル/ヘプタンを有するシリカゲル上で粗産生物を精製して、5−O−tert−ブチルジメチルシリル−2,3−O−イソプロピリデン−1,4−ジ−O−メタンスルホニル−L−リキシトールを黄色の油(8g、91%)として生じさせた。 By flash chromatography 1: Purification of the crude production organism over silica gel with 6 ethyl acetate / heptane, 5-O-tert-butyldimethylsilyl-2,3-O-isopropylidene-1,4-di the-L--O- methanesulfonyl lyxitol resulted as a yellow oil (8g, 91%). H NMR(300MHz、CDCl )δ4.76〜4.69(m、1H)、4.46〜4.34(m、4H)、3.95(dd,J=5.5及び11.0Hz、1H)、3.82(dd,J=6.0及び11.0Hz、1H)、3.11(s、3H)、3.07(s、3H)、1.51(s、3H)、1.37(s、3H)、0.89(s、9H)、0.09(s、6H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ4.76~4.69 (m, 1H), 4.46~4.34 (m, 4H), 3.95 (dd, J = 5.5 and 11.0Hz , 1H), 3.82 (dd, J = 6.0 and 11.0Hz, 1H), 3.11 (s, 3H), 3.07 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.37 (s, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.09 (s, 6H).

tert−ブチル(((3aS,4R,6aR)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)メトキシ)ジメチルシランの合成 tert- butyl (((3aS, 4R, 6aR) -2,2- dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxol-4-yl) methoxy) Synthesis of dimethyl silane

ジメチルホルムアミド(250mL)中、5−O−tert−ブチルジメチルシリル−2,3−O−イソプロピリデン−1,4−ジ−O−メタンスルホニル−L−リキシトール(25.1g、0.056mol)の溶液に、Na S. In dimethylformamide (250mL), 5-O-tert- butyldimethylsilyl-2,3-O-isopropylidene-1,4-di -O- methanesulfonyl -L- lyxitol of (25.1 g, 0.056 mol) the solution, Na 2 S. 9H O(16.1g、0.067mol、1.2当量)を添加し、反応混合物を80℃で3時間加熱した。 9H 2 O was added (16.1 g, 0.067 mol, 1.2 eq) and the reaction mixture was heated at 80 ° C. 3 hours. 反応混合物を室温まで冷却し、水と酢酸エチルとの間で分割した。 The reaction mixture was cooled to room temperature and partitioned between water and ethyl acetate. 層を分離させ、水性層を酢酸エチルで抽出した。 The layers were separated and the aqueous layer was extracted with ethyl acetate. 組み合わせた有機層を乾燥させ(MgSO )、濾過し、減圧下で濃縮した。 The combined organic layers were dried (MgSO 4), filtered, and concentrated under reduced pressure. フラッシュクロマトグラフィーによって、酢酸エチル/ヘプタン(10:1)を有するシリカゲル上で粗産生物を精製して、tert−ブチル(((3aS,4R,6aR)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)メトキシ)−ジメチル−シラン(10.3g、60%)を生じさせた。 By flash chromatography, eluting with ethyl acetate / heptane (10: 1) to give the crude production organism on silica gel with, tert- butyl (((3aS, 4R, 6aR)-2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3, 4-d] [1,3] dioxol-4-yl) methoxy) - dimethyl - silane (10.3 g, yield a 60%). H NMR(300MHz、CDCl )δ4.89(dt,J=1.4及び4.6Hz、1H)、4.79(d,J=6.0Hz、1H)、3.80(dd,J=5.0及び10.5Hz、1H)、3.60(dd,J=6.4及び10.6Hz、1H)、3.33(t,J=5.0Hz、1H)、3.16(dd,J=5.0及び12.4Hz、1H)、2.85(dd,J=0.9及び12.8Hz、1H)、1.52(s、3H)、1.32(s、3H)、0.89(s、9H)、0.06(s、6H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ4.89 (dt, J = 1.4 and 4.6Hz, 1H), 4.79 (d , J = 6.0Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 5.0 and 10.5Hz, 1H), 3.60 (dd, J = 6.4 and 10.6Hz, 1H), 3.33 (t, J = 5.0Hz, 1H), 3.16 ( dd, J = 5.0 and 12.4Hz, 1H), 2.85 (dd, J = 0.9 and 12.8Hz, 1H), 1.52 (s, 3H), 1.32 (s, 3H ), 0.89 (s, 9H), 0.06 (s, 6H).

(3aS,4R,5R,6aR)−4−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール5−酸化物の合成 (3aS, 4R, 5R, 6aR) -4 - (((tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxole 5- oxide synthesis of

ジクロロメタン(150mL)中、約70%のm−クロロ過安息香酸(16g、66mmol)の溶液を、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過した。 In dichloromethane (150 mL), a solution of about 70% m- chloroperbenzoic acid (16g, 66 mmol), dried over magnesium sulfate and filtered. ジクロロメタン(50mL)で洗浄した後、組み合わせた濾液を、−78℃でジクロロメタン(400mL)中、tert−ブチル(((3aS,4R,6aR)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)メトキシ)ジメチルシラン(20g、66mmol)の溶液に滴加した。 After washing with dichloromethane (50 mL), the combined filtrates in dichloromethane (400 mL) at -78 ° C., tert-butyl (((3aS, 4R, 6aR) -2,2- dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d ] [1,3] dioxol-4-yl) methoxy) dimethylsilane (20 g, was added dropwise to a solution of 66 mmol). −78℃で1時間撹拌した後、反応物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で急冷し、ジクロロメタンで希釈した。 After stirring for 1 hour at -78 ° C., the reaction was quenched with saturated sodium bicarbonate solution and diluted with dichloromethane. 層を分離させ、有機層を鹹水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。 The layers were separated and the organic layer was washed with brine, dried over magnesium sulfate, filtered, and concentrated. 取得した残部を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル/ジクロロメタン:ジエチルエーテル(30:1)によって精製して、(3aS,4R,5S,6aR)−4−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール5−酸化物(8.8g、42%)及び(3aS,4R,5R,6aR)−4−((((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチルテトラ−ヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール5−酸化物(7.3g、35%)を生じさせた。 The obtained remainder, flash chromatography (silica gel / dichloromethane: diethyl ether (30: 1) to give, (3aS, 4R, 5S, 6aR) -4 - (((tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxole 5- oxide (8.8g, 42%) and (3aS, 4R, 5R, 6aR) -4 - (((( tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2,2-dimethyl-tetra - Hidorochieno [3,4-d] [1,3] dioxole 5- oxide (7.3 g, yield a 35%).

ヌクレオシド中間体の合成: The synthesis of nucleoside intermediates:

1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(ヒドロキシメチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)ピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオン 1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6- (hydroxymethyl) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxol-4-yl) pyrimidine-2,4 (1H, 3H) - dione

1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチル−テトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)ピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオンの合成 1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6 - (((tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2,2-dimethyl - tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxole 4-yl) pyrimidine -2,4 (1H, 3H) - synthesis of dione

トルエン(62mL)中、ウラシルの懸濁液(140g、12.5mmol)に、トリエチルアミン(3.5mL、2.53g、25mmol)及びトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸(9.01mL、11,1g、50mmol)を添加した。 In toluene (62 mL), a suspension of uracil (140 g, 12.5 mmol) in triethylamine (3.5 mL, 2.53 g, 25 mmol) and trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate (9.01mL, 11,1g, 50mmol) and It was added. 室温で1時間撹拌した後、ジクロロメタン(34mL)を二相性混合物に添加して、溶液を生じさせた。 After stirring for 1 hour at room temperature, it was added dichloromethane (34 mL) in a biphasic mixture, to yield a solution. その後これを、ジクロロメタン(34mL)中、(3aS,4R,5R,6aR)−4−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール5−酸化物(2.0g、6.25mmol)の溶液に滴加し、その後トリエチルアミン(3.5mL、25mmol)を添加した。 Then this, in dichloromethane (34mL), (3aS, 4R, 5R, 6aR) -4 - (((tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxole 5- oxide (2.0 g, 6.25 mmol) was added dropwise to a solution of was then added triethylamine (3.5 mL, 25 mmol). 室温で90分間撹拌した後、反応物を氷で急冷し、その後酢酸エチルで希釈した。 After stirring for 90 minutes at room temperature, the reaction was quenched with ice and then diluted with ethyl acetate. 層を分離させ、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し(×2)、その後鹹水で洗浄した。 The layers were separated and the organic layer was washed with saturated sodium bicarbonate solution (× 2), then washed with brine. 硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、減圧下での濃縮によって粗産生物を生じさせ、これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、酢酸エチル:ジクロロメタン1:5)によって精製して、1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチル−テトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)ピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオン(1.55g、60%)を生じさせた。 After drying over magnesium sulfate, causes the crude producing organism by concentration under reduced pressure, purified by flash chromatography (silica gel, ethyl acetate: dichloromethane 1: 5) to give, 1 - ((3aR, 4R , 6R, 6aS) -6 - (((tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2,2-dimethyl - tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxol-4-yl) pyrimidine - 2,4 (1H, 3H) - dione (1.55g, 60%) yield a. H NMR(300MHz、CDCl )δ8.43(s、1H)、7.96(d,J=8.3Hz、1H)、6.12(d,J=2.3Hz、1H)、5.74(dd,J=1.9及び7.8Hz、1H)、4.71(m、2H)、3.89(m、2H)、3.74(m、1H)、1.60(s、3H)、1.32(s、3H)、0.92(s、9H)、0,11(s、3H)、0.10(s、3H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ8.43 (s, 1H), 7.96 (d, J = 8.3Hz, 1H), 6.12 (d, J = 2.3Hz, 1H), 5. 74 (dd, J = 1.9 and 7.8Hz, 1H), 4.71 (m, 2H), 3.89 (m, 2H), 3.74 (m, 1H), 1.60 (s, 3H), 1.32 (s, 3H), 0.92 (s, 9H), 0,11 (s, 3H), 0.10 (s, 3H).

1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(ヒドロキシメチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)ピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオンの合成 1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6- (hydroxymethyl) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxol-4-yl) pyrimidine-2,4 (1H, 3H) - synthesis of dione

テトラヒドロフラン(85mL)中、1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチル−テトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)ピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオン(3.70g、8.92mmol)の溶液を、アルゴン下、氷浴内で冷却した。 In tetrahydrofuran (85mL), 1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6 - (((tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2,2-dimethyl - tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxol-4-yl) pyrimidine-2,4 (IH, 3H) - dione (3.70 g, a solution of 8.92 mmol), under argon and cooled in an ice bath. テトラヒドロフラン(10.7mL、10.7mmol)中、1Mのフッ化テトラブチルアンモニウムの溶液を添加し、混合物を室温で2時間撹拌した。 In tetrahydrofuran (10.7mL, 10.7mmol), was added a solution of tetrabutylammonium fluoride 1M, the mixture was stirred for 2 hours at room temperature. 粗産生物を濾過によって採取し、テトラヒドロフランで洗浄し、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル;メタノール:ジクロロメタン1:30)によって精製して、1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(ヒドロキシメチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)ピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオン(2.30g、86%)を生じさせた。 The crude producing organisms were collected by filtration, washed with tetrahydrofuran, flash chromatography;: (silica gel methanol dichloromethane 1:30), 1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6- (hydroxymethyl ) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxol-4-yl) pyrimidine -2,4 (1H, 3H) - cause dione (2.30 g, 86%) It was. H NMR(300MHz、CDCl )δ8.97(brs、1H)、7.76(d,J=8.3Hz、1H)、5.93(s、1H)、5.76(d,J=8.3Hz)、4.91(s、2H)、3.96(dd,J=4.6及び11.0Hz、1H)、3.89(dd,J=4.6及び11.0Hz、1H)、3.79(t,J=4.6Hz、1H)、2.64(brs、1H)、1.59(s、3H)、1.33(s、3H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ8.97 (brs, 1H), 7.76 (d, J = 8.3Hz, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.76 (d, J = 8.3Hz), 4.91 (s, 2H), 3.96 (dd, J = 4.6 and 11.0Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 4.6 and 11.0 Hz, IH ), 3.79 (t, J = 4.6Hz, 1H), 2.64 (brs, 1H), 1.59 (s, 3H), 1.33 (s, 3H).

4−アミノ−1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(ヒドロキシメチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)−5−メチルピリミジン−2(1H)−オン 4-amino -1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6- (hydroxymethyl) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxol-4-yl) - 5-methyl-pyrimidin -2 (1H) - on

以下に類似するが、シトシンをチミンと交換した手順を使用して、4−アミノ−1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(ヒドロキシメチル)−2,2−ジメチルテトラ−ヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)ピリミジン−2(1H)−オン(13.1)を合成し得る。 It is similar to the following, using the procedure to replace the cytosine and thymine, 4-amino -1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6- (hydroxymethyl) -2,2-dimethyl-tetra - Hidorochieno [3,4-d] [1,3] dioxol-4-yl) pyrimidin -2 (IH) - capable of synthesizing one (13.1).

1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)−5−メチルピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオンの合成 1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6 - (((tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxol - 4-yl) -5-methyl-pyrimidine -2,4 (1H, 3H) - synthesis of dione

トルエン(112mL)中、チミン(2.60g、20.6mmol)の懸濁液に、トリエチルアミン(4.17g、41.2mmol)及びトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸(18.3g、82.5mmol)を添加した。 In toluene (112 mL), a suspension of thymine (2.60g, 20.6mmol), was added triethylamine (4.17 g, 41.2 mmol) and trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate (18.3 g, 82.5 mmol) . 室温で1時間撹拌した後、ジクロロメタン(34mL)を二相性混合物に添加して、溶液を生じさせた。 After stirring for 1 hour at room temperature, it was added dichloromethane (34 mL) in a biphasic mixture, to yield a solution. その後これを、ジクロロメタン(56mL)中、(3aS,4R,5R,6aR)−4−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール5−酸化物(3.30g、10.3mmol)の溶液に滴加し、その後トリエチルアミン(4.17g、41.2mmol)を添加した。 Then this, in dichloromethane (56mL), (3aS, 4R, 5R, 6aR) -4 - (((tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxole 5- oxide (3.30 g, 10.3 mmol) was added dropwise to a solution of, followed by triethylamine (4.17 g, 41.2 mmol). 室温で60分間撹拌した後、反応物を氷で急冷し、その後酢酸エチルで希釈した。 After stirring for 60 minutes at room temperature, the reaction was quenched with ice and then diluted with ethyl acetate. 層を分離させ、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し(×2)、その後鹹水で洗浄した。 The layers were separated and the organic layer was washed with saturated sodium bicarbonate solution (× 2), then washed with brine. 硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、減圧下での濃縮によって粗産生物を生じさせ、これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、酢酸エチル:ヘプタン0〜50%)によって精製して、1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)−5−メチルピリミジン− 2,4(1H,3H)−ジオン(2.9g、66%)を生じさせた。 After drying over magnesium sulfate, causes the crude producing organism by concentration under reduced pressure, purified by flash chromatography (silica gel, ethyl acetate: heptane 0-50%) to give, 1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6 - (((tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxol-4-yl) -5 - caused dione (2.9g, 66%) - methylpyrimidine - 2,4 (1H, 3H). H NMR(300MHz、CDCl )δ8.43(s、1H)、7.46(d,J=1.4Hz、1H)、6.07(d,J=32Hz、1H)、5.72(m、2H)、3.87(m、2H)、3.71(m、1H)、1.93(s、3H)、1.59(s、3H)、1.32(s、3H)、0.92(s、9H)、0.10(s、3H)、0.09(s、3H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ8.43 (s, 1H), 7.46 (d, J = 1.4Hz, 1H), 6.07 (d, J = 32Hz, 1H), 5.72 ( m, 2H), 3.87 (m, 2H), 3.71 (m, 1H), 1.93 (s, 3H), 1.59 (s, 3H), 1.32 (s, 3H), 0.92 (s, 9H), 0.10 (s, 3H), 0.09 (s, 3H).

4−アミノ−1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)−5−メチルピリミジン−2(1H)−オンの合成 4-amino -1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6 - (((tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1, 3] dioxol-4-yl) -5-methyl-pyrimidin -2 (IH) - one synthesis of

アセトニトリル(140mL)中、1,2,4−トリアゾール(6.55g、94.8mmol)の懸濁液を、氷バッチ内で0℃まで冷却した。 In acetonitrile (140 mL), 1,2,4-triazole (6.55 g, 94.8 mmol) the suspension was cooled in an ice batch to 0 ° C.. オキシ塩化リン(2.53mL、27.1mmol)、続けてトリエチルアミン(18.9mL、135mmol)を、滴加した。 Phosphorus oxychloride (2.53 mL, 27.1 mmol), triethylamine (18.9 mL, 135 mmol) followed, was added dropwise. 混合物を0℃で30分間撹拌し、その後アセトニトリル(25mL)中、1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)−5−メチルピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオン(2.9g、6.77mmol)の溶液を滴加した。 The mixture was stirred for 30 min at 0 ° C., then in acetonitrile (25mL), 1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6 - (((tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2,2 dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxol-4-yl) -5-methyl-pyrimidine -2,4 (1H, 3H) - solution droplets dione (2.9 g, 6.77 mmol) the pressure was. 反応物を、室温まで温め、150分間撹拌し、その後酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウム溶液との間で分割した。 The reaction was warmed to room temperature and stirred for 150 minutes, and then partitioned between ethyl acetate and saturated sodium bicarbonate solution. 有機層を鹹水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。 The organic layer was washed with brine, dried over magnesium sulfate, filtered, and concentrated. 取得した残部を、オートクレーブ内でジオキサン(62mL)中に溶解させた。 The obtained remainder, was dissolved in dioxane (62 mL) in an autoclave. 水酸化アンモニウム(62mL)を添加し、容器を密封し、室温で一晩撹拌した。 Was added ammonium hydroxide (62 mL), the vessel was sealed and stirred overnight at room temperature. 反応混合物を酢酸エチルと水との間で分割した。 The reaction mixture was partitioned between ethyl acetate and water. 有機層を鹹水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。 The organic layer was washed with brine, dried over magnesium sulfate, and concentrated under reduced pressure. フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル:メタノール:酢酸エチル1:10)による精製によって、アミノ−1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)−5−メチルピリミジン−2(1H)−オン(2.60g、90%)を生じさせた。 Flash chromatography Purification by (silica gel: methanol ethyl acetate 1:10), amino -1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6 - (((tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2 , 2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxol-4-yl) -5-methyl-pyrimidin -2 (IH) - on (2.60 g, yield a 90%). H NMR(300MHz、CDCl )δ8.74(brs、2H)、7.49(s、1H)、6.00(d,J=2.3Hz、1H)、4.82(dd,J=2.3及び5.5Hz、1H)、4.74(dd,J=3.2及び5.5Hz、1H)、3.91(dd,J=5.5及び10.5Hz、1H)、3.81(dd,J=6.4及び10.5Hz、1H)、3.65(m、1H)、1.91(s、3H)、1.56(s、3H)、1.27(s、3H)0.89(s、9H)、0.07(s、3H)、0.06(s、3H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ8.74 (brs, 2H), 7.49 (s, 1H), 6.00 (d, J = 2.3Hz, 1H), 4.82 (dd, J = 2.3 and 5.5Hz, 1H), 4.74 (dd, J = 3.2 and 5.5Hz, 1H), 3.91 (dd, J = 5.5 and 10.5Hz, 1H), 3 .81 (dd, J = 6.4 and 10.5Hz, 1H), 3.65 (m, 1H), 1.91 (s, 3H), 1.56 (s, 3H), 1.27 (s , 3H) 0.89 (s, 9H), 0.07 (s, 3H), 0.06 (s, 3H).

4−アミノ−1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(ヒドロキシメチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)−5−メチルピリミジン−2(1H)−オンの合成 4-amino -1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6- (hydroxymethyl) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxol-4-yl) - 5-methyl-pyrimidin -2 (1H) - one synthesis of

テトラヒドロフラン(1.4mL)中、4−アミノ−1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)−5−メチルピリミジン−2(1H)−オン(500mg、1.17mmol)の溶液を、アルゴン下、氷浴内で冷却した。 In tetrahydrofuran (1.4 mL), 4-amino -1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) -6 - (((tert- butyldimethylsilyl) oxy) methyl) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3 , 4-d] [1,3] dioxol-4-yl) -5-methyl-pyrimidin -2 (IH) - on (500mg, a solution of 1.17 mmol), under argon and cooled in an ice bath. テトラヒドロフラン(1.4mL、1.90mmol)中、1Mのフッ化テトラブチルアンモニウムの溶液を添加し、混合物を室温で2時間撹拌した。 In tetrahydrofuran (1.4mL, 1.90mmol), was added a solution of tetrabutylammonium fluoride 1M, the mixture was stirred for 2 hours at room temperature. 粗産生物を濾過によって採取し、テトラヒドロフランで洗浄し、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル;メタノール:酢酸エチル1:10)によって精製して、4−アミノ−1−((3aR,4R,6R,6aS)−6−(ヒドロキシメチル)−2,2−ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4−d][1,3]ジオキソール−4−イル)−5−メチルピリミジン−2(1H)−オン(436mg、量)を生じさせた。 The crude producing organisms were collected by filtration, washed with tetrahydrofuran, flash chromatography;: (silica gel methanol ethyl acetate 1:10), 4-amino -1 - ((3aR, 4R, 6R, 6aS) - oN (436 mg, quantity) - 6- (hydroxymethyl) -2,2-dimethyl-tetrahydrothieno [3,4-d] [1,3] dioxol-4-yl) -5-methyl-pyrimidin -2 (IH) resulting allowed was. H NMR(300MHz、DMSO)δ7.64(s、1H)、7.38(brs、1H)、6.85(brs、1H)、5.97(d,J=2.8Hz、1H)、5.19(t,J=5.5Hz、1H)、4.88(dd,J=2.8及び5.35Hz、1H)、4.80(dd,J=3.2及び5.9Hz、1H)、3.67(m、1H)、3.54(m、1H)、3.47(td,J=2.8及び6.4Hz、1H)、1.80(s、3H)、1.43(s、3H)、1.21(s、3H)。 1 H NMR (300MHz, DMSO) δ7.64 (s, 1H), 7.38 (brs, 1H), 6.85 (brs, 1H), 5.97 (d, J = 2.8Hz, 1H), 5.19 (t, J = 5.5Hz, 1H), 4.88 (dd, J = 2.8 and 5.35Hz, 1H), 4.80 (dd, J = 3.2 and 5.9 Hz, 1H), 3.67 (m, 1H), 3.54 (m, 1H), 3.47 (td, J = 2.8 and 6.4Hz, 1H), 1.80 (s, 3H), 1 .43 (s, 3H), 1.21 (s, 3H).

ヌクレオチド標的の合成: Synthesis of the nucleotide target:
一般的な計画 General plan

ヌクレオシド5'−トリリン酸の合成を上記に示す。 The synthesis of nucleoside 5'-triphosphate shown above. ヌクレオシドAを、ジメチルホルムアミド中、イミダゾールHCl/イミダゾールの存在下で、ホスホラミダイト試薬と反応させ、H との亜リン酸の後続する酸化を続けて、良好な収率(シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製後、典型的には60〜83%の収率)でBを生じさせる。 Nucleosides A, in dimethylformamide, in the presence of imidazole HCl / imidazole, is reacted with a phosphoramidite reagent, continue to subsequent oxidation of phosphorous acid and H 2 O 2, good yields (column on silica gel after purification by chromatography, typically produces a B in 60-83% yield). O/ジクロロメタン中、トリフルオロ酢酸での処理による保護基の開裂によって、一リン酸Cを、典型的には定量的収率で生じさせる。 During H 2 O / dichloromethane, by cleavage of the protecting groups by treatment with trifluoroacetic acid, the monophosphate C, typically resulting in quantitative yield. 最終的に、Bogachev(Bogachev,Synthesis of deoxynucleoside 5'−triphosphates using trifluoroacetic anhydride as activation reagent.Russ.J.Bioorg.Chem.,1996,22,599−604)によって開発された方法を使用して、トリリン酸Dを取得する。 Finally, Bogachev (Bogachev, Synthesis of deoxynucleoside 5'-triphosphates using trifluoroacetic anhydride as activation reagent.Russ.J.Bioorg.Chem., 1996,22,599-604) using the method developed by triphosphate to get the acid D.

一般的な実験的手順: General experimental procedure:

Bの合成 Synthesis of B

ジメチルホルムアミド(Aの3mL/mmol)中、A(1当量)、イミダゾールHCl(1.5当量)、及びイミダゾール(1当量)の溶液に、アルゴン下、室温でジ−tert−ブチルジイソプロピルホスホラミダイト(1.5当量)を滴加する。 During (3 mL / mmol of A) dimethylformamide, A (1 eq), imidazole HCl (1.5 eq), and the solution, under argon, di -tert- butyl diisopropyl phosphoramidite at room temperature imidazole (1 eq) It is added dropwise (1.5 eq). 開始材料の完全な消費が観察されるまで、反応混合物を撹拌する(LC−MSまたはTLC)(典型的には30〜90分間)。 Complete consumption of starting material until the observed, the reaction mixture is stirred (LC-MS or TLC) (typically 30-90 minutes). その後、反応混合物を氷水浴内で冷却し、液滴で、35%のH (2.6当量)で処理する。 Thereafter, the reaction mixture was cooled in an ice-water bath, droplet, is treated with 35% H 2 O 2 (2.6 eq). 反応混合物を、室温まで温め、完全な反応が観察されるまで撹拌する(LC−MSまたはTLC)。 The reaction mixture was allowed to warm to room temperature and stirred until complete reaction was observed (LC-MS or TLC). その後それを氷水浴内で冷却し、チオ硫酸ナトリウム飽和水溶液で慎重に急冷する。 Then it was cooled in an ice-water bath, carefully quenched with saturated aqueous sodium thiosulfate. 産生物を、酢酸エチルで抽出する。 The production organism, extracted with ethyl acetate. 有機層を鹹水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮させる。 The organic layer was washed with brine, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. 適切な溶離液(一般的にはメタノール/ジクロロメタン)での、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製によって、Bを、典型的には60〜85%の収率で生じさせる。 With a suitable eluent (typically methanol / dichloromethane), Purification by column chromatography on silica gel, the B, typically cause in 60-85% yield.

Cの合成 C Synthesis of

ジクロロメタン(Bの2mL/mmol)、水(Bの3mL/mmol)、及びトリフルオロ酢酸(Bの3mL/mmol)中、B(1当量)の混合物を室温で一晩撹拌する。 Dichloromethane (2 mL / mmol of B), water (3 mL / mmol of B), and trifluoroacetic acid (3 mL / mmol of B), a mixture of B (1 eq) and stirred overnight at room temperature. 反応混合物を減圧下で濃縮(水浴、50℃未満)して、Cを、典型的には定量的な収率で生じさせる。 The reaction mixture was concentrated under reduced pressure (water bath below 50 ° C.) to the C, typically resulting in a quantitative yield.

Dの合成 Synthesis of D

アセトニトリル(無水トリフルオロ酢酸の0.3mL/mmol)中、無水トリフルオロ酢酸(5当量)の冷却した溶液(氷水浴)を、アルゴン下でアセトニトリル(Cの4mL/mmol)、トリエチルアミン(1当量)、及びN,N−ジメチルアニリン(4当量)中、C(1当量)の冷却した懸濁液に滴加する。 Acetonitrile cooled solution in (0.3 mL / mmol of trifluoroacetic anhydride), trifluoroacetic anhydride (5 equivalents) (ice-water bath), (4 mL / mmol of C) acetonitrile under argon, triethylamine (1 eq) , and N, N- dimethyl aniline (4 equivalents) is added dropwise to a cooled suspension of C (1 eq). その後、反応物を室温まで温め、室温で30分間撹拌し、揮発物を減圧下で除去する。 Thereafter, the reaction was allowed to warm to room temperature and stirred for 30 minutes at room temperature, the volatiles are removed under reduced pressure.

結果として生じるシロップを、アセトニトリル(Cの4mL/mmol)中に溶解させ、氷水浴内で冷却し、1−メチルイミダゾール(3当量)及びトリエチルアミン(5当量)をアルゴン下で添加する。 The syrup resulting dissolved in acetonitrile (C in 4 mL / mmol), cooled in an ice-water bath, 1-methyl imidazole (3 eq) and triethylamine (5 eq) are added under argon. 反応混合物を15分間撹拌し、その後室温まで温める。 The reaction mixture was stirred for 15 min, warmed then to room temperature.

アセトニトリル(ピロリン酸の1mL/mmol)中、トリス(テトラブチルアンモニウム)ピロリン酸(1.5当量)の溶液を、アルゴン下、室温で滴加し、混合物を室温で45分間撹拌する。 In acetonitrile (1 mL / mmol of pyrophosphate), a solution of tris (tetrabutylammonium) pyrophosphate (1.5 eq) under argon, was added dropwise at room temperature, the mixture is stirred at room temperature for 45 minutes. その後、反応物を脱イオン水(Cの約10〜15mL/mmol)で急冷し、1時間撹拌する。 The reaction was then quenched with deionized water (approximately 10-15 mL / mmol of C), stirred for 1 hour. 混合物をクロロホルム(3×10mL)で洗浄し、組み合わせた有機層を一度脱イオン水(5mL)で逆抽出する。 The mixture was washed with chloroform (3 × 10mL), back extracted and the combined organic layer once with deionized water (5 mL). 組み合わせた水性層を、DEAE Sepharose Fast Flowを充填したカラム上に直接充填し、0.01M〜0.5Mの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液の勾配で溶出させる。 The combined aqueous layers were directly loaded onto a column packed with DEAE Sepharose Fast Flow, eluting with a gradient of triethylammonium bicarbonate buffer 0.01M~0.5M. 産生物を含有する画分を組み合わせ、凍結乾燥させる。 Combining fractions containing the production organism and lyophilized. 結果として生じるヌクレオシドトリリン酸トリエチルアミン塩を、脱イオン水中で溶解させ、その後Dowex50W8イオン交換カラムに供する。 Results triphosphate triethylamine salt which occurs as dissolved in deionized water, then subjected to Dowex50W8 ion exchange column. UV活性を示す画分を組み合わせ、凍結乾燥によって水を除去して、ヌクレオシド5'−トリリン酸をそのナトリウム塩として発生させる。 Combining the fractions showing a UV active, the water is removed by freeze drying, to generate 5'-triphosphate as its sodium salt.

((2R,3S,4R,5R)−5−(2,4−ジオキソ−3,4−ジヒドロピリミジン−1(2H)−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラ−ヒドロチオフェン−2−イル)メチルトリリン酸ナトリウム塩 ((2R, 3S, 4R, 5R) -5- (2,4- dioxo-3,4 -1 (2H) - yl) -3,4-dihydroxy-tetra - tetrahydrothiophene-2-yl) methyl triphosphate sodium salt

AのBへの転換について上記に記載する方法を使用して、10(935mg、3.11mmol)を14(1.25g、81%)に転換した。 For conversion to A and B using the methods described above, it was converted to 10 (935 mg, 3.11 mmol) and 14 (1.25g, 81%). H NMR(300MHz、CDCl )δ8.38(brs、1H)、7.74(d,J=8.3Hz、1H)、6.05(s、1H)、5.79(d,J=8.3Hz)、4.85(m、2H)、4.19(m、2H)、3.83(t,J=5.0Hz、1H)、1.54(s、3H)、1.49(s、18H)、1.31(s、3H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ8.38 (brs, 1H), 7.74 (d, J = 8.3Hz, 1H), 6.05 (s, 1H), 5.79 (d, J = 8.3Hz), 4.85 (m, 2H), 4.19 (m, 2H), 3.83 (t, J = 5.0Hz, 1H), 1.54 (s, 3H), 1.49 (s, 18H), 1.31 (s, 3H).

BのCへの転換について上記に記載する方法を使用して、14(1.25g、2.58mmol)を15(0.9g、量)に転換した。 Using the methods described above for the conversion to C of B, it was converted 14 (1.25 g, 2.58 mmol) to 15 (0.9 g, amount). H NMR(300MHz、D O)δ8.13(d,J=7.8Hz、1H)、5.81(d,J=5.5Hz、1H)、5.76(d,J=8.3Hz、1H)、4.24(dd,J=4.1及び6.0Hz、1H)、4.11(t,J=4.1Hz、1H)、3.98(m、2H)、3.43(m、1H)。 1 H NMR (300MHz, D 2 O) δ8.13 (d, J = 7.8Hz, 1H), 5.81 (d, J = 5.5Hz, 1H), 5.76 (d, J = 8. 3Hz, 1H), 4.24 (dd, J = 4.1 and 6.0Hz, 1H), 4.11 (t, J = 4.1Hz, 1H), 3.98 (m, 2H), 3. 43 (m, 1H).

CのDへの転換について上記に記載する方法を使用して、15(200mg、0.59mmol)を4'−チオ−UTP(215mg、62%(4Na+塩の場合))に転換した。 For conversion to C of D using the methods described above, it was converted to 15 (200 mg, 0.59 mmol) and 4'-thio -UTP (215mg, 62% (if the 4Na + salt)). H NMR(300MHz、D O)δ8.14(d,J=8.3Hz、1H)、5.85(d,J=6.4Hz、1H)、5.81(d,J=7.8Hz、1H)、4.31(dd,J=3.7及び6.4Hz、1H)、4.24(t,J=3.7Hz、1H)、4.12(m、1H)、4.00(m、1H)、3.44(m、1H)。 1 H NMR (300MHz, D 2 O) δ8.14 (d, J = 8.3Hz, 1H), 5.85 (d, J = 6.4Hz, 1H), 5.81 (d, J = 7. 8Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 3.7 and 6.4Hz, 1H), 4.24 (t, J = 3.7Hz, 1H), 4.12 (m, 1H), 4. 00 (m, 1H), 3.44 (m, 1H). 31 P NMR(300MHz、D O)δ−8.57(d)、−10.91(d)、−22.09(t)。 31 P NMR (300MHz, D 2 O) δ-8.57 (d), - 10.91 (d), - 22.09 (t). HPLC/MS:RT9.638分、m/z501(M+H) HPLC / MS: RT9.638 minutes, m / z501 (M + H ) +.

(((2R,3S,4R,5R)−5−(4−アミノ−5−メチル−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラ−ヒドロチオフェン−2−イル)メチルトリリン酸)ナトリウム塩 (((2R, 3S, 4R, 5R) -5- (4- amino-5-methyl-2-oxo-pyrimidin -1 (2H) - yl) -3,4-dihydroxy-tetra - tetrahydrothiophene-2-yl) Mechirutoririn acid) sodium salt

AのBへの転換について上記に記載する方法を使用して、13(400mg、1.28mmol)を16(910mg、65%)に転換した。 For conversion to A and B using the methods described above, it was converted 13 (400 mg, 1.28 mmol) to 16 (910mg, 65%). H NMR(300MHz、CDCl )δ8.19(brs、2H)、7.45(s、1H)、5.92(d,J=2.1Hz、1H)、4.98(dd,J=1.8及び6.0Hz、1H)、4.95(dd,J=2.3及び5.5Hz、1H)、4.24(m、2H)、3.80(td,J=1.8及び6.0Hz、1H)、1.99(s、3H)、1.56(s、3H)、1.49(s、9H)、1.48(s、9H)、1.29(s、3H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ8.19 (brs, 2H), 7.45 (s, 1H), 5.92 (d, J = 2.1Hz, 1H), 4.98 (dd, J = 1.8 and 6.0Hz, 1H), 4.95 (dd, J = 2.3 and 5.5Hz, 1H), 4.24 (m, 2H), 3.80 (td, J = 1.8 and 6.0Hz, 1H), 1.99 (s, 3H), 1.56 (s, 3H), 1.49 (s, 9H), 1.48 (s, 9H), 1.29 (s, 3H).

BのCへの転換について上記に記載する方法を使用して、16(180mg、0.977mmol)を17(350mg、量)に転換した。 For conversion to C and B using the methods described above, it was converted 16 (180 mg, 0.977 mmol) to 17 (350 mg, amount). H NMR(300MHz、D O)δ8.16(s、1H)、5.80(d,J=6.0Hz、1H)、4.25(dd,J=4.1及び5.5Hz、1H)、4.10(t,J=4.6Hz、1H)、4.00(m、2H)、3.45(m、1H)、1.92(s、3H)。 1 H NMR (300MHz, D 2 O) δ8.16 (s, 1H), 5.80 (d, J = 6.0Hz, 1H), 4.25 (dd, J = 4.1 and 5.5 Hz, 1H), 4.10 (t, J = 4.6Hz, 1H), 4.00 (m, 2H), 3.45 (m, 1H), 1.92 (s, 3H). 31 P NMR(300MHz、D O)δ0.41。 31 P NMR (300MHz, D 2 O) δ0.41.

CのDへの転換について上記に記載する方法を使用して、15(300mg、0.849mmol)を4'−チオ−5−メチルCTP(136mg、28%(4Na+塩の場合))に転換した。 For conversion to C of D using the methods described above, was converted to 15 (300mg, 0.849mmol) and 4'-thio-5-methyl-CTP (136mg, 28% (if the 4Na + salt)) . H NMR(300MHz、D O)δ7.84(s、1H)、5.85(d,J=6.4Hz、1H)、4.23(m、2H)、4.09(m、1H)、3.97(m、1H)、3.40(m、1H)、1.82(s、3H)。 1 H NMR (300MHz, D 2 O) δ7.84 (s, 1H), 5.85 (d, J = 6.4Hz, 1H), 4.23 (m, 2H), 4.09 (m, 1H ), 3.97 (m, 1H), 3.40 (m, 1H), 1.82 (s, 3H). 31 P NMR(300MHz、D O)δ−8.96(d)、−11.00(d)、−22.28(t)。 31 P NMR (300MHz, D 2 O) δ-8.96 (d), - 11.00 (d), - 22.28 (t). 13 C NMR(300MHz、D O)δ165.52(Cq)、158.09(Cq)、139.80(CH)、105.40(Cq)、77.26(CH)、73.25(CH)、66.06(CH)、64.04(CH2)、50.09(CH)、12.33(CH3)。 13 C NMR (300MHz, D 2 O) δ165.52 (Cq), 158.09 (Cq), 139.80 (CH), 105.40 (Cq), 77.26 (CH), 73.25 (CH ), 66.06 (CH), 64.04 (CH2), 50.09 (CH), 12.33 (CH3). HPLC/MS:RT10.280分、m/z514(M+H) HPLC / MS: RT10.280 minutes, m / z514 (M + H ) +.

先行する4'−チオ−5−メチルCTPの合成に類似するが、13.1を13と交換した手順を使用して、4'−チオ−CTPが作製され得る。 Analogous to the synthesis of the preceding 4'-thio-5-methyl-CTP, but employing the procedure was replaced with 13.1 13, 4'-thio -CTP can be produced.

((2R,3S,4R,5R)−5−(6−アミノ−9H−プリン−9−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラヒドロチオフェン−2−イル)メチルトリリン酸ナトリウム塩 ((2R, 3S, 4R, 5R) -5- (6- amino -9H- purin-9-yl) -3,4-dihydroxy-tetrahydronaphthalen-2-yl) Mechirutoririn acid sodium salt

AのBへの転換について上記に記載する方法を使用して、19(504mg、1.81mmol)を20(444mg、52%)に転換した。 For conversion to A and B using the methods described above, it was converted 19 (504 mg, 1.81 mmol) in 20 (444mg, 52%). H NMR(300MHz、CDCl )δ8.24(s、1H)、8.19(brs、1H)、7.71(brs、1H)、7.09(s、1H)、6.20(brs、2H)、6.01(d,J=5.0Hz、1H)、4.76(m、1H)、4.50(m、1H)、4.23(m、2H)、3.77(m、1H)、1.48(s、18H)。 1 H NMR (300MHz, CDCl 3 ) δ8.24 (s, 1H), 8.19 (brs, 1H), 7.71 (brs, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.20 (brs , 2H), 6.01 (d, J = 5.0Hz, 1H), 4.76 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.23 (m, 2H), 3.77 ( m, 1H), 1.48 (s, 18H).

BのCへの転換について上記に記載する方法を使用して、20(430mg、0.904mmol)を21(330mg、量)に転換した。 For conversion to C and B using the methods described above, it was converted to 20 (430mg, 0.904mmol) and 21 (330 mg, amount). H NMR(300MHz、D O)δ8.64(s、1H)、8.26(s、1H)、5.86(d,J=5.5Hz、1H)、4.54(m、1H)、4.26(m、1H)、4.06(m、2H)、3.54(m、1H)。 1 H NMR (300MHz, D 2 O) δ8.64 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 5.86 (d, J = 5.5Hz, 1H), 4.54 (m, 1H ), 4.26 (m, 1H), 4.06 (m, 2H), 3.54 (m, 1H).

CのDへの転換について上記に記載する方法を使用して、21(82mg、0.162mmol)を4'−チオ−ATP(36mg、26%(4Na+塩の場合))に転換した。 Using the methods described above for the conversion of the C and D, it was converted to 21 (82 mg, 0.162 mmol) and 4'-thio -ATP (36mg, 26% (if the 4Na + salt)). H NMR(300MHz、D O)δ8.49(s、1H)、8.03(s、1H)、5.76(d,J=5.6Hz、1H)、4.54(dd,J=3.7及び5.6Hz、1H)、4.35(t,J=4.1Hz、1H)、4.13(m、2H)、3.54(dd,J=4.1及び8.7Hz、1H)。 1 H NMR (300MHz, D 2 O) δ8.49 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 5.76 (d, J = 5.6Hz, 1H), 4.54 (dd, J = 3.7 and 5.6Hz, 1H), 4.35 (t, J = 4.1Hz, 1H), 4.13 (m, 2H), 3.54 (dd, J = 4.1 and 8. 7Hz, 1H). 31 P NMR(300MHz、D O)δ−9.07(d)、−10.81(d)、−22.15(t)。 31 P NMR (300MHz, D 2 O) δ-9.07 (d), - 10.81 (d), - 22.15 (t). HPLC/MS:RT10.467分、m/z524(M+H) HPLC / MS: RT10.467 minutes, m / z524 (M + H ) +.

5−((3R,4S,5R)−3,4−ジヒドロキシ−5−(ヒドロキシメチル)テトラヒドロチオフェン−2−イル)ピリミジン2,4(1H,3H)ジオン(4'−S−プソイドウリジン)。 5 - ((3R, 4S, 5R) -3,4- dihydroxy-5- (hydroxymethyl) tetrahydropyran-2-yl) pyrimidin-2, 4 (IH, 3H) dione (4'-S- pseudouridine). 本化合物は、当業者に既知である手順を使用して、以下の計画に従って作製され得る。 This compound was prepared using the procedure known to those skilled in the art, it may be prepared according to the following schedule.

((2R,3S,4R,5S)−5−(2,4−ジオキソ−1,2,3,4−テトラヒドロピリミジン−5−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラヒドロチオフェン−2−イル)メチルトリリン酸ナトリウム塩(4'−チオ−ψUTP)。 ((2R, 3S, 4R, 5S) -5- (2,4- dioxo-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-5-yl) -3,4-dihydroxy-tetrahydronaphthalen-2-yl) Mechirutoririn acid sodium salt (4'-thio -ψUTP). 本化合物は、当業者に既知である手順を使用して、以下の計画に従って作製され得る。 This compound was prepared using the procedure known to those skilled in the art, it may be prepared according to the following schedule.

((2R,3S,4R,5R)−3,4−ジヒドロキシ−5−(4−オキソ−2−チオキソ−3,4−ジヒドロピリミジン−1(2H)−イル)テトラヒドロチオフェン−2−イル)メチルテトラハイドロゲントリリン酸(4'−S−2−S−UTP)。 ((2R, 3S, 4R, 5R) -3,4- dihydroxy-5- (4-oxo-2-thioxo-3,4-dihydro-pyrimidin--1 (2H) - yl) tetrahydropyran-2-yl) methyl tetra hydrogensulfate triphosphate (4'-S-2-S-UTP). 本化合物は、当業者に既知である手順を使用して、以下の計画に従って作製され得る。 This compound was prepared using the procedure known to those skilled in the art, it may be prepared according to the following schedule.

((2R,3S,4R,5R)−5−(2−アミノ−6−オキソ−1H−プリン−9(6H)−イル)−3,4−ジヒドロキシテトラヒドロチオフェン−2−イル)メチルテトラハイドロゲントリリン酸(4'−S−GTP)。 ((2R, 3S, 4R, 5R) -5- (2- amino-6-oxo -1H- purine -9 (6H) - yl) -3,4-dihydroxy-tetrahydronaphthalen-2-yl) methyl tetra hydrogensulfate tri phosphate acid (4'-S-GTP). 本化合物は、当業者に既知である手順を使用して、以下の計画に従って作製され得る。 This compound was prepared using the procedure known to those skilled in the art, it may be prepared according to the following schedule.
*** ***

本明細書は、本明細書中に引用した参考文献の教示に照らして、最も完全に理解される。 Herein, in light of the teachings of the references cited herein it is most thoroughly understood. 本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の説明を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。 The embodiments within the specification provide an explanation of the embodiments of the present invention and should not be construed as limiting the scope of the present invention. 当業者は、多くの他の実施形態が、本発明によって包含されることを容易に認識する。 Those skilled in the art, many other embodiments readily recognize to be encompassed by the present invention. 本開示内に引用した全ての出版物及び特許は、その全体が参照によって組み込まれる。 All publications and patents cited in this disclosure are incorporated by reference in their entirety. 参照によって組み込まれる材料が本明細書と矛盾する、または不一致である程度まで、本明細書は、任意のそのような材料に取って代わる。 Material is incorporated by reference conflict with the present specification, or to some extent mismatch herein supersedes any such materials. 本明細書のいかなる参照の引用も、そのような参照が、本発明に対する従来技術であることを認めるものではない。 The citation of any reference herein, such reference is not an admission that it is prior art to the present invention.

別段示さない限り、特許請求の範囲を含む本明細書中で使用される、成分、反応条件などの量を表す全ての数は、近似値として理解されるべきであり、本発明によって取得されることが求められる所望の特性に応じて変化し得る。 Unless otherwise indicated, as used herein, including the claims, components, all numbers expressing quantities such as the reaction conditions are to be understood as approximations is obtained by the present invention it may vary depending upon the desired properties sought. 最低限において、及び特許請求の範囲の等価物の原理の適用を限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、有効桁数及び通常の丸め技術に照らして解釈されるべきである。 In the very least, and not as an attempt to limit the application of the principles of equivalency of the claims, each numerical parameter should be construed in light of the number of significant digits and ordinary rounding techniques. 本明細書中の異なる量の有効桁を有する一連の数の列挙は、より少ない有効桁を与えられた数が、より多くの有効桁を与えられた数と同一の精度を有することを暗示するものとして解釈されるべきではない。 Series of numbers enumeration with different amounts of significant digits of this specification Shochu is a given number less significant digits, implies that with the same accuracy and a given number more significant digits It should not be interpreted as ones.

特許請求の範囲及び/または明細書において「を含む」という用語と併せて使用される際の「1つの(a)」または「1つの(an)」という単語の使用は、「1つの(one)」を意味し得るが、それはまた、「1つ以上の」、「少なくとも1つの」、及び「1つまたは1つ以上」の意味と一致する。 Use of the word "one (a)" or "one (an,)" when used in conjunction with the term "comprising" in the range and / or the specification of claims, "one (one ), "but may mean, it is also consistent with the meaning of" one or more "," at least one "and" one or more than one. " 本開示は、代替物のみ及び「及び/または」に言及する定義を支持するものの、特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみに言及すること、または代替物が互いに排他的であることが別段明白に示されない限り、「及び/または」を意味するために使用される。 The present disclosure, but supports a definition that refers only alternatives and "and / or" used in the term "or" in the claims, exclusive to refer only to the alternatives, or alternatives to each other unless indicated otherwise apparent that a manner, is used to mean "and / or".

別段示さない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、その一連の全ての要素に言及すると理解されるべきである。 Unless otherwise indicated, the term "at least" preceding a series of elements is to be understood as referring to all of the series of elements. 当業者は、ほんの通例的な実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識する、または確認することができるであろう。 Those skilled in the art using only customary experimentation, recognize many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein, or will be able to ascertain. そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。 Such equivalents are intended to be encompassed by the following claims.

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。 Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have generally the same meaning as understood by those skilled in the art to which this invention belongs. 本明細書に記載されるものに類似する、または等価である任意の方法及び材料が、本発明の実践または試験において使用され得るものの、好適な方法及び材料が、ここで記載される。 Although any methods and materials similar to those described herein, or equivalent is, although can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods and materials are now described.

本明細書で論じられる出版物は、本出願の出願日前にそれらを開示するためだけに提供される。 The publications discussed herein are provided solely for their disclosure prior to the filing date of the present application. 本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような出版物に先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。 Any of the contents of this specification, the present invention should not be construed as an admission that not entitled to antedate such publication by virtue of prior invention. 更に、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。 Further, the dates of publication provided may be different from the actual publication dates which may need to be confirmed separately.

本発明の他の実施形態は、本明細書及び本明細書に開示される本発明の実践を考慮することによって、当業者にとって明らかになるであろう。 Another embodiment of the present invention, by considering the practice of the invention disclosed herein and herein will become apparent to those skilled in the art. 本明細書及び実施例は、例示的のみであると見なされるべきであることが意図され、本発明の真の範囲及び趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示される。 The specification and examples are intended to to be regarded as illustrative only, with a true scope and spirit of the invention being indicated by the following claims.

Claims (29)

  1. コード領域及び任意で1つ以上の非コード領域を有するmRNA分子であって、前記mRNAが、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む少なくとも1つのヌクレオチド残基を含む、前記mRNA分子。 A mRNA molecule having one or more non-coding regions coding region and optionally, the mRNA is, 4'-thio - comprising at least one nucleotide residue include substitution furanose ring, the mRNA molecule.
  2. 前記アデノシンヌクレオチド残基のうちの少なくとも1%が、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む、請求項1に記載の前記mRNA分子。 Wherein at least 1% of the adenosine nucleotide residues, 4'-thio - incorporating substituted furanose ring, the mRNA molecule of claim 1.
  3. 前記グアノシン残基のうちの少なくとも1%が、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む、請求項1または請求項2に記載の前記mRNA分子。 At least 1% of the guanosine residue, 4'-thio - incorporating substituted furanose ring, said mRNA molecule according to claim 1 or claim 2.
  4. 前記ウリジン残基のうちの少なくとも1%が、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の前記mRNA分子。 At least 1% of the uridine residues found 4'-thio - incorporating substituted furanose ring, said mRNA molecule according to any one of claims 1 to 3.
  5. 前記シチジン残基のうちの少なくとも1%が、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の前記mRNA分子。 At least 1% of the cytidine residue, 4'-thio - incorporating substituted furanose ring, said mRNA molecule according to any one of claims 1-4.
  6. 前記ヌクレオチド残基のうちの10%未満が、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の前記mRNA分子。 Less than 10% of the nucleotide residues, 4'-thio - incorporating substituted furanose ring, said mRNA molecule according to any one of claims 1 to 5.
  7. 前記残基のうちの少なくとも50%が、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の前記mRNA分子。 At least 50% of the residues, 4'-thio - incorporating substituted furanose ring, said mRNA molecule according to any one of claims 1 to 5.
  8. 前記ヌクレオチド残基のうちの少なくとも99%が、4'−チオ−置換フラノース環を組み込む、請求項1〜5または7のいずれか一項に記載の前記mRNA分子。 At least 99% of the nucleotide residues, 4'-thio - incorporating substituted furanose ring, said mRNA molecule according to any one of claims 1 to 5 or 7.
  9. 前記非コード領域がポリAテールを含み、前記ポリAテールが4'−チオ−アデノシン残基を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の前記mRNA分子。 The non-coding region comprises a poly-A tail, wherein the poly A tail 4'-thio - adenosine residues, said mRNA molecule according to any one of claims 1-8.
  10. 前記ポリAテールが、少なくとも約90ヌクレオチド残基長である、請求項9に記載の前記mRNA分子。 The poly A tail is at least about 90 nucleotide residues in length, said mRNA molecule according to claim 9.
  11. 前記ポリAテールが、少なくとも約500ヌクレオチド残基長である、請求項9または請求項10に記載の前記mRNA分子。 The poly A tail is at least about 500 nucleotide residues in length, said mRNA molecule according to claim 9 or claim 10.
  12. 前記mRNAが、少なくとも1つの非標準ヌクレオチド残基を更に含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の前記mRNA分子。 The mRNA further comprises at least one non-standard nucleotide residues, said mRNA molecule according to any one of claims 1 to 11.
  13. 前記非標準ヌクレオチド残基が、5−メチル−シチジン、プソイドウリジン、及び2−チオ−ウリジンのうちの1つ以上から選択される、請求項12に記載の前記mRNA分子。 The non-standard nucleotide residues, 5-methyl - cytidine, pseudouridine, and 2-thio - is selected from one or more of the uridine, the mRNA molecule of claim 12.
  14. 前記1つ以上の非標準ヌクレオシド残基が、4'−チオ−フラノースを含むように更に修飾される、請求項13に記載の前記mRNA分子。 Wherein one or more non-standard nucleoside residues, 4'-thio - is further modified to include a furanose, said mRNA molecule according to claim 13.
  15. 前記分子が、少なくとも200個のヌクレオチド残基を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の前記mRNA分子。 The molecule comprises at least 200 nucleotide residues, said mRNA molecule according to any one of claims 1 to 14.
  16. 前記分子が、少なくとも5000個のヌクレオチド残基を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の前記mRNA分子。 The molecule comprises at least 5000 nucleotide residues, said mRNA molecule according to any one of claims 1 to 15.
  17. 前記コード領域が、治療用タンパク質をコードする、請求項1〜16のいずれか一項に記載の前記mRNA分子。 The coding region encodes a therapeutic protein, the mRNA molecule according to any one of claims 1 to 16.
  18. 前記治療用タンパク質が、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)、インスリン、アルファ−ガラクトシダーゼA、アルファ−L−イズロニダーゼ、イズロネート−2−スルファターゼ、N−アセチルグルコサミン−1−リン酸トランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミン6−スルファターゼ、N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−6−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチン It said therapeutic protein is erythropoietin, human growth hormone, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), insulin, alpha - galactosidase A, alpha -L- iduronidase, iduronate-2-sulfatase, N- acetylglucosamine-1- transferase phosphate, N- acetylglucosaminidase, alpha - glucosaminide acetyltransferase, N- acetylglucosamine 6-sulfatase, N- acetylgalactosamine-4-sulfatase, beta - glucosidase, galactose-6-sulfate sulfatase, beta - galactosidase, beta - glucuronidase, glucocerebrosidase, heparan Le family peptidase, hyaluronidase, galactocerebrosidase, ornithine ランスカルバミラーゼ(OTC)、カルバモイル−リン酸シンテターゼ1(CPS1)、アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、及びアルギナーゼ1(ARG1)、グルコース−6−ホスファターゼ、グルコース−6−リン酸トランスロカーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、リソソームアルファ−グルコシダーゼ、1,4−アルファ−グルカン分枝酵素、グリコーゲンホスホリラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、GLUT−2、UDPグリコーゲンシンターゼ、アルファ−L−イズロニダーゼ、イズロネート硫酸シルファターゼ、ヘパラン硫酸スルファミダーゼ、アルファ−N−アセチルグルコースアミダーゼ、アルファ−グルコサミニド−N−アセチルトランスフェ Lance carba mirror peptidase (OTC), a carbamoyl - synthetase phosphate 1 (CPS1), argininosuccinate synthetase (ASS1), argininosuccinate lyase (ASL), and arginase 1 (ARG1), glucose-6-phosphatase, glucose-6-phosphate translocase, glycogen debranching enzyme, lysosomal alpha - glucosidase, 1,4-alpha - glucan branching enzyme, glycogen phosphorylase, phosphofructokinase, liver phosphorylase, GLUT-2, UDP glycogen synthase, alpha -L- iduronidase , iduronate sulfate Silfa synthetase, heparan sulfate sulfamidase, alpha -N- acetylglucosamine amidase, alpha - glucosaminide -N- acetyl transfected ーゼ、N−アセチルグルコサミン−6−硫酸スルファターゼ、アポリポタンパク質E、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)、第VIII因子、第IX因子、脊髄運動ニューロン1(SMN1)、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プロピオニル−CoAカルボキシラーゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ペチルマロニル(pethylmalonyl)−CoAムターゼ、尿酸オキシダーゼ、C1エステラーゼ阻害剤、及び酸性アルファ−グルコシダーゼから選択される、請求項17に記載の前記mRNA分子。 Over Ze, N- acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase, apolipoprotein E, low density lipoprotein receptor (LDLR), factor VIII, factor IX, spinal motor neuron 1 (SMN1), phenylalanine hydroxylase, propionyl -CoA carboxylase, porphobilinogen deaminase, Pechirumaroniru (pethylmalonyl) -CoA mutase, urate oxidase, C1 esterase inhibitor, and acid alpha - is selected from glucosidase, said mRNA molecule according to claim 17.
  19. 請求項1〜18のいずれか一項に記載の少なくとも1つのmRNA分子及び担体を含む、組成物。 Comprising at least one mRNA molecule and carrier according to any one of claims 1 to 18, the composition.
  20. 前記担体が、脂質を含む、請求項19に記載の前記組成物。 Wherein said carrier comprises a lipid, the composition of claim 19.
  21. 前記mRNAが、脂質ナノ粒子内に被包される、請求項20に記載の前記組成物。 The mRNA is encapsulated within lipid nanoparticles, the composition of claim 20.
  22. 前記担体が、XTC(2,2−ジリノレイ1−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソラン)、MC3(((6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタン酸)、ALNY−100((3aR,5s,6aS)−N,N−ジメチル−2,2−ジ((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニル)テトラヒドロ−3aH−シクロペンタ[d][1,3]ジオキソール−5−アミン))、NC98−5(4,7,13−トリス(3−オキソ−3−(ウンデシルアミノ)プロピル)−N1,N16−ジウンデシル−4,7,10,13−テトラアザヘキサデカン−1,16−ジアミド)、DODAP(1,2−ジオレイル−3−ジメチルアンモ Wherein said carrier, XTC (2,2-Jirinorei 1-4- dimethylaminoethyl - [1,3] - dioxolane), MC3 (((6Z, 9Z, 28Z, 31Z) - hepta triacontanyl -6,9,28 , 31-tetraene-19-yl 4- (dimethylamino) butanoic acid), ALNY-100 ((3aR, 5s, 6aS) -N, N- dimethyl-2,2-di ((9Z, 12Z) - octadeca - 9,12-dienyl) tetrahydro -3aH- cyclopenta [d] [1,3] dioxole-5-amine)), NC98-5 (4,7,13- tris (3-oxo-3- (undecyl-amino) propyl) -N1, N16- diundecyl -4,7,10,13- tetraazacyclododecane hexadecane-1,16-diamide), DODAP (1,2-dioleyl-3-dimethylamino ammonium ウムプロパン)、HGT4003、ICE、HGT5000、シス、またはトランスHGT5001、DOTAP(1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2−ジ−O−オクタデセニル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA、DLiN−KC2−DMA、及びC12−200から選択される1つ以上の陽イオン性脂質を含む脂質ナノ粒子である、請求項19〜21のいずれか一項に記載の前記組成物。 Umupuropan), HGT4003, ICE, HGT5000, cis or trans HGT5001, DOTAP (1,2- dioleoyl-3-trimethylammonium propane,), DOTMA (1,2- di -O- octadecenyl 3-trimethylammonium propane), DLinDMA a lipid nanoparticle comprising one or more cationic lipids selected from DLiN-KC2-DMA, and C12-200, the composition according to any one of claims 19 to 21.
  23. 前記脂質ナノ粒子が、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPG(,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1'−rac−グリセロール))、及びコレステロールから選択される1つ以上のヘルパー脂質を含む、請求項21または請求項22に記載の前記組成物。 The lipid nanoparticles, DSPC (1,2-distearoyl -sn- glycero-3-phosphocholine), DPPC (1,2-dipalmitoyl -sn- glycero-3-phosphocholine), DOPE (1,2-dioleyl - sn- glycero-3-phosphoethanolamine), DPPE (1,2-dipalmitoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine), DMPE (1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine) , DOPG (, 2-dioleyl -sn- glycero-3-phospho - (1'-rac- glycerol)), and one or more helper lipids selected from cholesterol, according to claim 21 or claim 22 said composition.
  24. 前記脂質ナノ粒子が、ペグ化脂質を含む、請求項21〜23のいずれか一項に記載の前記組成物。 The lipid nanoparticles comprise pegylated lipid, the composition according to any one of claims 21 to 23.
  25. 前記脂質ナノ粒子が、1つ以上の陽イオン性脂質、1つ以上のヘルパー脂質、及びペグ化脂質を含む、請求項21に記載の前記組成物。 The lipid nanoparticles, one or more cationic lipids, one or more helper lipids, and pegylated lipid, wherein the composition of claim 21.
  26. 前記担体が、ポリマーを含む、請求項19に記載の前記組成物。 Wherein said carrier comprises a polymer, the composition according to claim 19.
  27. 前記ポリマーが、ポリエチレンイミンである、請求項26に記載の前記組成物。 Wherein the polymer is polyethylene imine, the composition of claim 26.
  28. 請求項1〜18のいずれか一項に記載の前記mRNA、または請求項19〜27のいずれか一項に記載の前記組成物を対象に投与することを含む、タンパク質をインビボで産生する方法。 Comprising administering to the subject the composition according to the mRNA or any one of claims 19 to 27, according to any one of claims 1 to 18, a method of producing a protein in vivo.
  29. 治療用タンパク質のインビボでの発現を誘発することができる薬物の前記製造のための、請求項1〜18のいずれか一項の記載のmRNA分子の使用。 For the manufacture of a medicament capable of eliciting expression in vivo of a therapeutic protein, the use of mRNA molecules according to any one of claims 1-18.
JP2016502430A 2013-03-14 2014-03-14 4'-thio - ribonucleic acid and related method with modified nucleotides Pending JP2016513470A (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361785098P true 2013-03-14 2013-03-14
US61/785,098 2013-03-14
PCT/US2014/027422 WO2014152513A1 (en) 2013-03-14 2014-03-14 RIBONUCLEIC ACIDs WITH 4'-THIO-MODIFIED NUCLEOTIDES AND RELATED METHODS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2016513470A true JP2016513470A (en) 2016-05-16
JP2016513470A5 JP2016513470A5 (en) 2017-04-13

Family

ID=50639964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016502430A Pending JP2016513470A (en) 2013-03-14 2014-03-14 4'-thio - ribonucleic acid and related method with modified nucleotides

Country Status (16)

Country Link
US (1) US10266559B2 (en)
EP (2) EP2970351B1 (en)
JP (1) JP2016513470A (en)
KR (1) KR20150127582A (en)
CN (1) CN105026411A (en)
AU (2) AU2014239562B2 (en)
BR (1) BR112015022507A2 (en)
CA (1) CA2902884A1 (en)
EA (1) EA201591281A1 (en)
ES (1) ES2647832T3 (en)
HK (1) HK1219955A1 (en)
IL (1) IL240465D0 (en)
MX (1) MX2015011943A (en)
SG (1) SG11201507474QA (en)
WO (1) WO2014152513A1 (en)
ZA (1) ZA201507605B (en)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140206753A1 (en) 2011-06-08 2014-07-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery
MX2015012865A (en) 2013-03-14 2016-07-21 Shire Human Genetic Therapies Methods for purification of messenger rna.
DK2968586T3 (en) 2013-03-14 2018-10-08 Translate Bio Inc CFTR mRNA compositions and related methods and uses
WO2014152030A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Removal of dna fragments in mrna production process
US10138507B2 (en) 2013-03-15 2018-11-27 Modernatx, Inc. Manufacturing methods for production of RNA transcripts
EP3004130A1 (en) * 2013-06-05 2016-04-13 Idenix Pharmaceuticals LLC. 1',4'-thio nucleosides for the treatment of hcv
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
EA201690581A1 (en) 2013-10-22 2016-09-30 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. TREATMENT OF phenylketonuria C mRNA
CA2944800A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods for purification of messenger rna
EP3157573A4 (en) 2014-06-19 2018-02-21 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
EP3405579A1 (en) 2016-01-22 2018-11-28 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
WO2017180917A2 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
JP2019516710A (en) 2016-05-18 2019-06-20 モデルナティーエックス, インコーポレイテッド Polynucleotide encoding interleukin-12 (IL12) and use thereof
US20180251755A1 (en) 2017-02-27 2018-09-06 Translate Bio, Inc. Methods For Purification of Messenger RNA
US20180251754A1 (en) 2017-02-27 2018-09-06 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
WO2018165257A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Translate Bio, Inc. Polyanionic delivery of nucleic acids
WO2018231709A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Translate Bio, Inc. Poly(phosphoesters) for delivery of nucleic acids
WO2018231990A2 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
WO2018236849A1 (en) 2017-06-19 2018-12-27 Translate Bio, Inc. Messenger rna therapy for the treatment of friedreich's ataxia

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007514643A (en) * 2003-09-18 2007-06-07 アイシス ファーマシューティカルズ、インク. 4'-thio nucleosides and oligomeric compounds

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
FR2687679B1 (en) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
JP2010519203A (en) * 2007-02-16 2010-06-03 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション Compositions and methods for enhancing the activity of the bioactive molecule
ES2646630T3 (en) 2008-11-07 2017-12-14 Massachusetts Institute Of Technology Lipidoides aminoalcohol and uses thereof
DE102009032885A1 (en) 2009-07-13 2011-02-03 Siemens Aktiengesellschaft Ring-shaped rotor for an electrical machine
EP3318248B1 (en) 2009-12-01 2019-04-10 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
CN103748078B (en) 2011-06-08 2016-11-09 夏尔人类遗传性治疗公司 Cleavable lipid
US20140206753A1 (en) 2011-06-08 2014-07-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery
US9428535B2 (en) 2011-10-03 2016-08-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
WO2015051173A2 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc Polynucleotide molecules and uses thereof
US20160237108A1 (en) 2013-10-02 2016-08-18 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
EP3053585A1 (en) 2013-12-13 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
WO2016164762A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor egf-a and intracellular domain mutants and methods of using the same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007514643A (en) * 2003-09-18 2007-06-07 アイシス ファーマシューティカルズ、インク. 4'-thio nucleosides and oligomeric compounds

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY, vol. Vol. 16, JPN6018005722, 2008, pages pp. 9450-9456 *
J. MED. CHEM., vol. Vol. 49, JPN6019000562, 2006, pages pp. 1624-1634 *
MOLECULAR THERAPY, vol. Vol. 21, No. 2, JPN6018005720, February 2013 (2013-02-01), pages pp. 358-367 *
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. Vol. 29, No. 2, JPN6018005718, 2011, pages pp. 154-157 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2902884A1 (en) 2014-09-25
MX2015011943A (en) 2015-12-01
US10266559B2 (en) 2019-04-23
IL240465D0 (en) 2015-09-24
AU2018203985A1 (en) 2018-06-21
CN105026411A (en) 2015-11-04
AU2014239562A1 (en) 2015-08-27
EP3301102A1 (en) 2018-04-04
EA201591281A1 (en) 2016-02-29
HK1219955A1 (en) 2017-04-21
EP2970351B1 (en) 2017-09-13
WO2014152513A1 (en) 2014-09-25
US20160031928A1 (en) 2016-02-04
AU2014239562B2 (en) 2018-07-05
BR112015022507A2 (en) 2017-10-24
ES2647832T3 (en) 2017-12-26
KR20150127582A (en) 2015-11-17
EP2970351A1 (en) 2016-01-20
ZA201507605B (en) 2017-01-25
SG11201507474QA (en) 2015-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2833922B1 (en) In vivo production of proteins
JP3250802B2 (en) Expression of an exogenous polynucleotide sequence in a vertebrate
US9221891B2 (en) In vivo production of proteins
CN100393209C (en) Modified oligonucleotides for telomerase inhibition
Meade et al. Efficient delivery of RNAi prodrugs containing reversible charge-neutralizing phosphotriester backbone modifications
US8575123B2 (en) Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
US9186372B2 (en) Split dose administration
US9796756B2 (en) Galactose cluster-pharmacokinetic modulator targeting moiety for siRNA
US20170258915A1 (en) Delivery and Formulation of Engineered Nucleic Acids
US9758797B2 (en) Methods and products for expressing proteins in cells
US9597380B2 (en) Terminally modified RNA
US20090143322A1 (en) Cell transfecting formulations of small interfering rna related compositions and methods of making and use
US10022435B2 (en) Nucleic acid vaccines
US20150050354A1 (en) Modified polynucleotides for the treatment of otic diseases and conditions
US20170056528A1 (en) Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
JP5990468B2 (en) Methods and agents for inhibiting the expression of a particular gene
JP4267233B2 (en) Oligonucleotide n3 '→ p5' thiophosphoramidate: their synthesis and use
US20080076701A1 (en) Dicer substrate rna peptide conjugates and methods for rna therapeutics
ES2663360T3 (en) cleavable lipids
EP2918275B1 (en) Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
US20190192653A1 (en) Compositions and methods for tolerizing cellular systems
US20020065236A1 (en) CpG reduced plasmids and viral vectors
US20160244501A1 (en) Polynucleotides Encoding Low Density Lipoprotein Receptor
US20110294869A1 (en) Self delivering bio-labile phosphate protected pro-oligos for oligonucleotide based therapeutics and mediating rna interference
EP2971010A1 (en) Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170309

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170309

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180220

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180518

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180713

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180820

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190115

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190412