JP2016510214A - 廃水の処理から得られる、バイオマスのためのフェドバッチプロセスにおけるポリヒドロキシアルカノエート（ｐｈａ）の生産性向上のための方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、開放混合培養からＰＨＡが豊富なバイオマスを生成するための方法に関する。バイオマスを含む混合液が、フェドバッチ反応器内に導かれる。反応器は、少なくとも１つのバイオマス刺激ゾーンと、少なくとも１つのバイオマス維持ゾーンとを含む。ＲＢＣＯＤ、生物学的に利用可能なＮ、及び生物学的に利用可能なＰを含むフィードが、フェドバッチ反応器内に導かれる。バイオマスの少なくとも一部の呼吸速度は、フィードをフェドバッチ反応器内に導き、バイオマスを比較的高い濃度のＲＢＣＯＤに曝露させることによって、刺激ゾーン内で断続的に繰り返し刺激される。バイオマスは、次いで、維持ゾーンに移送され、そこで、バイオマスは、比較的低い濃度のＲＢＣＯＤに曝露される。その後、バイオマスは、刺激ゾーンと維持ゾーンとの間で循環される。この方法を通じて、フィード中のＲＢＣＯＤに対するＮ及び／又はＰの濃度は、フィード中のＲＢＣＯＤに対するＮの比と、ＲＢＣＯＤに対するＰの比とを制御することによって制御される。

Description

［関連出願］
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９（ｅ）の下で、２０１３年１月１１日に出願された米国仮出願、出願番号６１／７５２４４９号からの優先権を主張する。この出願は、参照により本明細書にその全体が組み込まれている。

化学的酸素要求量（ＣＯＤ：ｃｈｅｍｉｃａｌ ｏｘｙｇｅｎ ｄｅｍａｎｄ）の除去のための廃水の生物学的処理は、バイオマスを生成する。無駄なバイオマスは、固体廃棄物処理の問題を表す。多くの関心を惹きつけている１つの機会は、廃水を処理することによる、活性スラッジのような、バイオマスによる生分解性ポリマの生成である。この方法では、生成される廃スラッジは、代わりに、処理プロセスから回収され得る価値のある副産物になる。

バイオマス処理廃水は、回収され、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ：ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）、中間炭素及びエネルギー貯蔵器としていくつかのバクテリアによって自然に生成されるポリエステルの群を蓄積させることができることが知られている。ＰＨＡは、バイオマスから取り出すことができ、広い範囲の特定の用途のために有用である商業的価値のある生分解性プラスチックに変換することができる（例えば、ＵＳ２０１０／０２００４９６、ＷＯ２０１１／０７０５４４Ａ２、ＷＯ２０１１／０７３７４４Ａ１、ＷＯ２０１２／０２２９９８Ａ１、ＷＯ２０１２／０２３１１４Ａ１参照）。

ＰＨＡ分子量を維持し、生成物品質（値）を改善するために、バイオマス中のＰＨＡの熱安定性を調整する実施形態は、ＷＯ２０１２／０２２９９８Ａ１に開示されている。組み合わせで、上記で引用した開示は、汚染防止及び残留物管理のサービスを、公知の実際的かつ経済的な価値の生分解性のバイオベースポリマの生成と統合するためのレシピを提供する。前述の開示に基づいて、汚染防止設備は、すでに今日、劇的な修正なしに多くの例で、スラッジ処分の経済的負担がＰＨＡが豊富なバイオマス生成の利益に相殺されるように転換することができる。

生物学的処理システムから来る過剰な活性スラッジのような効果的に無駄になるバイオマスは、このバイオマスをＰＨＡ蓄積プロセスに配置し、それによって、主要な有機基質として、揮発性脂肪酸のような易生分解性ＣＯＤ（ＲＢＣＯＤ）が、制御された方法で、無駄な（収集される）バイオマスに供給されることによって、付加価値生生成物、すなわち、ＰＨＡが豊富なバイオマスに変換される。バイオマス中のＰＨＡを蓄積し、高分子量を有するＰＨＡを含むＰＨＡが豊富なバイオマスを生成するための実施形態は、ＷＯ２０１１／０７０５４４Ａ２に記載されている。

ＷＯ２０１１／０７０５４４Ａ２に記載の方法及びプロセスの適用は、一般的に、バイオマスの混合培養物でのＰＨＡの蓄積を可能にする。混合培養物により、２つ以上のタイプのバクテリアの種の集団の混合物を含むバイオマスが意味される。バイオマスは、一般的に、ＲＢＣＯＤをＰＨＡに変換することができるバクテリアの種の集団で富化されることが予想される。そのような富化にもかかわらず、混合培養物バイオマスは、ＰＨＡを蓄えず、刺激された場合、ＰＨＡを含まないバイオマスを生成するようにＲＢＣＯＤを消費することになるバイオマス中のバクテリアの他の種も含むことになる。バイオマスによるＰＨＡ量の生成速度が、非ＰＨＡバイオマスの生成速度よりも低くなる場合、好ましい蓄積プロセス条件は、失われる。

ＷＯ２０１１／０７０５４４Ａ２では、工業規模の混合培養ＰＨＡ蓄積のための需要時供給プロセスを維持するために、刺激及び維持プロセスゾーンを使用することができる方法が教示されている。維持ゾーンは、一般的に、比較的低いＲＢＣＯＤ濃度の環境内に呼吸バイオマスを維持する。刺激ゾーンは、一般的に、バイオマスの画分を、所与の時点で、比較的高いＲＢＣＯＤに曝露させ、その際、プロセス全体のバイオマスを、かなりの程度まで、ＲＢＣＯＤを蓄えられたＰＨＡに変換する代謝プロセスによる高い呼吸に刺激するように働く。この全体的に高いバイオマス呼吸速度は、基質の需要を引き起こし、この高いバイオマス呼吸速度を維持することに基づいて基質供給を制御することは、それによって、「需要時供給」のプロセス制御戦略を確立することができる。バイオマスは、そうでなければ、比較的低いＲＢＣＯＤ濃度のゾーンに維持されるので、利用可能な基質の制限が存在する。非ＰＨＡバイオマス生成、すなわち、細胞分裂によるバイオマス成長は、一般的に、例えば、モノー式に記載のように、基質濃度が比較的低いとき、基質濃度に比例する呼吸速度を示す。維持ゾーンで比較的低い基質濃度を維持するように基質供給を制御することによって、非ＰＨＡバイオマス生成のレベルは、プロセス中のＰＨＡを蓄えるバクテリアによる呼吸及びＲＢＣＯＤ消費を優先することによって、軽減することができる。

本発明者らは、バクテリアを蓄えるＰＨＡの呼吸及び活動を、維持ゾーンとは別の刺激ゾーンで「饗宴（ｆｅａｓｔ）」の条件にバイオマスを周期的に繰り返しさらすことによって、持続させることができることを発見した。この饗宴刺激の条件は、好気的である必要はないが、短時間であっても十分な時間の曝露が、望ましいと思われる。実際には、このプロセスで非ＰＨＡを蓄えるバクテリアの増加した呼吸の発生を制限するように、この刺激の期間を比較的短く保ちたい。プロセスの他の解釈、及び、バイオマス呼吸に対する洞察の今後の展開にもかかわらず、本発明者らは、一般的に、低レベルの内因性呼吸から高い呼吸速度への完全な刺激に達するために必要な時間が、ＰＨＡ蓄積バイオマスに関して、１分未満の長さの時間スケールオーダのものであることを発見した。

本明細書の方法は、解放培養からＰＨＡが豊富なバイオマスを生成することに関する。バイオマスを含む混合液は、フェドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）反応器に導かれる。反応器は、少なくとも１つのバイオマス刺激ゾーンと、少なくとも１つのバイオマス維持ゾーンとを有する。生分解性化学的酸素需要量（ＲＢＣＯＤ）と、生物学的に利用可能な窒素（Ｎ）と、生物学的に利用可能なリン（Ｐ）とを含むフィードが供給される。フィード中の生物学的に利用可能なＮ及びＰの濃度は、ＲＢＣＯＤ比に対する平均Ｎが、２ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤと１５ｍｇ−Ｎ／ｇ／ＲＢＣＯＤとの間になり、ＲＢＣＯＤ比に対する平均Ｐが、０．５ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤと３ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤとの間になるように、ＲＢＣＯＤに対して調整される。反応器内のバイオマスの画分は、刺激ゾーン内の調整されたフィードに曝露される。これは、バイオマスの呼吸速度を刺激する。調整されたフィードは、刺激されたバイオマスの平均呼吸速度がバイオマスの現存の最大呼吸速度の５０％よりも大きくなるように供給される。調整されたフィードに曝露されたバイオマスの画分は、次いで、維持ゾーンに移動される。維持ゾーンでは、平均ＲＢＣＯＤ濃度は、刺激ゾーン内のＲＢＣＯＤの平均濃度の半分未満に維持される。バイオマスを含む混合液は、刺激ゾーンと維持ゾーンとの間で循環される。この結果、刺激ゾーン内のとき、バイオマスの画分は、フィードに繰り返し曝露され、高い呼吸速度に達し、同時に、維持ゾーン内のとき、バイオマスの画分を、低ＲＢＣＯＤ濃度であっても、この高い呼吸速度に維持する。

方法は、さらに、フェドバッチプロセス中の少なくともいくらかの期間中、非ＰＨＡバイオマスの同時の成長と共に、バイオマス中のＰＨＡ蓄積を促進させるように、基質を供給することによって、解放混合培養からのバイオマス内にＰＨＡを生成するためのフェドバッチプロセスに関し、それによって、
ａ．フェドバッチプロセスは、バイオマス中の増加する又は一定のレベルのＰＨＡ含有量で、一定の期間にわたって維持され、
ｂ．バイオマス中で達成されるＰＨＡ含有量の安定したレベルは、０．４０ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳよりも上、好ましくは、０．５０ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳよりも上、最も好ましくは、０．６０ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳよりも上であり、
ｃ．易生分解性有機基質又は易生分解性化学的酸素要求量（ＲＢＣＯＤ）は、生物学的に利用可能な窒素（Ｎ）及びリン（Ｐ）と共に、２〜１５ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲内の平均のＮ／ＣＯＤ比、及び、０．５〜３ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲内の平均のＰ／ＣＯＤ比で供給され、
ｄ．バイオマスは、そうでなければ１００ｍｇ−ＲＢＣＯＤ／Ｌ未満、好ましくは１０ｍｇ−ＲＢＣＯＤ／Ｌ未満の平均炭素基質濃度の条件下に維持される際に、平均で最大現存呼吸速度の５０パーセントを超え、好ましくは７０パーセントを超えて維持されるように、全体として、又は部分的に、繰り返し刺激され、
ｅ．バイオマスの画分は、任意の時点で、高い基質濃度のゾーンに循環され、１００ｍｇ−ＲＢＣＯＤ／Ｌを超える、しかし、好ましくは、５００ｍｇ−ＲＢＣＯＤ／Ｌ未満、最も好ましくは、２０００ｍｇ−ＲＢＣＯＤ／Ｌ未満のピーク平均有機基質濃度への曝露によって、最大現存呼吸速度に刺激され、
ｆ．フェドバッチプロセスに供給されるバイオマス中のＰＨＡの初期濃度は、０．１０ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ未満、好ましくは、０．０５ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ未満、最も好ましくは、０．０２ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ未満であり、
ｇ．プロセスにおけるバイオマスの初期濃度は、５００ｍｇ−ＶＳＳ／Ｌを超えるが、好ましくは、１０００ｍｇ−ＶＳＳ／Ｌを超え、最も好ましくは、２０００ｍｇ−ＶＳＳ／Ｌを超える。

ＲＢＣＯＤとしてのＦＷＰ、及び、ＲＢＣＯＤとしての酢酸塩に関するＰＨＡ蓄積潜在能力（ＰＡＰ：ＰＨＡ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ）を示すグラフである。 ＲＢＣＯＤとしての酢酸塩に関する時間（時間）がたつにつれてのＰＨＡ含有量（ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ）及び生成又は消費された質量（ｇ）を示すグラフである。 ＲＢＣＯＤとしてのＦＷＰに関する時間（時間）がたつにつれてのＰＨＡ含有量（ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ）及び生成又は消費された質量（ｇ）を示すグラフである。 ＲＢＣＯＤとしてのＦＷＰ、及び、ＲＢＣＯＤとしての酢酸塩に関するＲＢＣＯＤ（ｇ−ＣＯＤ／ｇ−ＣＯＤ）におけるバイオマス収量を示すグラフである。 バイオマス無機含有物及びＰＨＡの相対的な初期質量（ｇ／ｇ）に対するＰＨＡ蓄積潜在能力（ＰＨＡ）（ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ）を示すグラフである。 消費されるＮ又はＰのパーセントに対するＮ／ＣＯＤ又はＰ／ＣＯＤを示すグラフである。 相対的な質量増加（ｇ／ｇ）に対するＮ／ＣＯＤ比（ｍｇ Ｎ／ｇ ＣＯＤ）を示すグラフである。 相対的な質量増加（ｇ／ｇ）に対するＰ／ＣＯＤ比（ｍｇ Ｐ／ｇ ＣＯＤ）を示すグラフである。 廃水処理プロセスで本発明を実施するための実施形態を示す概略図である。 概略図である。 ＰＨＡ蓄積システムのフェドバッチ反応器への様々な成分のフィード及び濃度を制御するための制御概要を示す流れ図である。 ＰＨＡ蓄積システムのフェドバッチ反応器への様々な成分のフィード及び濃度を制御するための制御システムの概略図である。

混合培養物における廃水生物学的処理及びＰＨＡ生成は、２段階事業として実証されている。

第１の段階では、有意なＰＨＡ蓄積潜在能力を有するバイオマスを富化するような方法で水質改善のサービスを提供しながら、バイオマスが生成される（ＢｉＰＰ：Ｂｉｏｍａｓｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ−バイオマス生成プロセス）。米国特許出願公開第２０１０／０２００４９８号、ＷＯ２０１０／０７３７４４Ａ１、及びＷＯ２０１２／０２３１１４Ａ１を含む、当該技術分野での例の開示を参照することができる。ＢｉＰＰから回収されたバイオマスは、ＰＨＡ生成のための資源として利用される。一般的に、ＢｉＰＰから回収されるバイオマスは、無視できるＰＨＡ含有量しか有さない。この回収されたバイオマスからのＰＨＡ含有量は、１０％未満の乾燥バイオマス重量（ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ）であるべきであるが、より好ましくは、５％未満、さらにより好ましくは、２％未満であるべきである。

第２の段階では、ＢｉＰＰから回収された余剰バイオマスは、フェドバッチＰＨＡ生成プロセス（ＰＰＰ：ＰＨＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）で利用される。ＰＰＰの目的は、このバイオマス中のＰＨＡ蓄積の高い程度を達成することである。バイオマスのＰＨＡ含有量は、有機乾燥固体含有量（ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ）の４０％よりも高くあるべきであるが、好ましくは、５０％よりも高くあるべきであり、さらにより好ましくは、６０％よりも高くあるべきである。バイオマスの高いＰＨＡ含有量は、できるだけ短い期間で達成されるべきである。一般的に、バイオマス中の最大ＰＨＡ含有量に達するためのＰＨＡ蓄積プロセスは、４８時間未満であるべきであり、好ましくは、２４時間未満であるべきであり、さらにより好ましくは、１２時間未満であるべきである。

ＰＰＰにおける現存のＰＨＡ生成速度と、平均ＰＨＡ生成速度との間の違いを認識することが重要である。栄養飢餓ＰＨＡ生成プロセスでは、現存のＰＨＡ生成速度は、一般的に、初期により高く、バイオマスがそのＰＨＡ蓄積潜在能力（ＰＡＰ）に達する数時間後には無視できる。しかしながら、本発明者らは、現存のＰＨＡ生成速度が、十分な栄養素が、高い呼吸速度、及びＣＯＤの制限された利用可能性と組み合わせて提供されるとき、維持することができ、より高い平均生成速度になり得ることを発見した。栄養素が適切な量で供給される場合、ＰＨＡ貯蔵有機体及びＰＨＡ蓄積の成長を維持することができそれによって現存のＰＡＰがバイオマスによって示され、同時に、全体の活性バイオマス容量が遅れずに増加する。制限されたプロセス時間を前提として、増加した平均ＰＨＡ蓄積速度は、ＰＰＰ中のＰＨＡを蓄積する活性バイオマスの同時増加と連動して、プロセスの生産性の向上をもたらすことになる。したがって、実際には、プロセスに十分なＲＢＣＯＤ以外の追加の栄養素を追加することにより、ＰＰＰは、バイオマスの最大ＰＨＡに達した後、長く生産的に作動させることができる。したがって、フェドバッチ混合培養物ＰＨＡ蓄積プロセスは、非常に長い期間、生産性向上の目的のために作動させることができる。プロセスにおける高すぎるバイオマス濃度の蓄積を避けるために、ＰＨＡが豊富なバイオマスを、バッチプロセス終了の時点ではなく、徐々に時間をかけて回収することができる。一般的に、ＰＨＡ蓄積プロセスは、バイオマスのＰＨＡ含有量が非ＰＨＡバイオマス生成と同時に維持される限り、１２時間よりも長く、好ましくは、２４時間よりも長く、さらにより好ましくは、４８時間よりも長く作動させることができる。ＰＰＰのために利用可能な時間の制約は、ＲＢＣＯＤ、Ｎ、及びＰを含む原料、並びに、ＢｉＰＰから回収されるバイオマスの供給速度に関連する。

ＰＨＡ蓄積は、基質が要求に応じて供給速度で供給されるＣＯＤの供給速度と、ＰＨＡとしてより迅速に炭素を同化しやすいこれらの微生物によって優先的に高い呼吸速度を維持する適用の手段とによって、促進される。本明細書に示されるように、ＰＰＰの開始時にＰＨＡ蓄積の最大呼吸に刺激されるこれらの微生物は、また、ＰＨＡ蓄積の活性と同時に活性バイオマス中で増加すると思われる。これは、バイオマスのＰＨＡ含有量の速度増加がゼロ以上でありながら、バイオマスが増加するときに示される。

本明細書で論じる実験結果は、ＰＨＡを蓄積することができる回収されたＢｉＰＰバイオマス中のこれらの微生物が、ＣＯＤ同化における運動性の競争の有利性を維持するために奨励され得ることを示唆している。適切な活性バイオマス成長のレベルよりも下で、栄養飢餓のレベルよりも上の、選択された制限された栄養素（Ｎ、Ｐ）の供給は、ＣＯＤの供給と共に、従来の方法によって与えられる成長及び生成を超えて、ＰＰＰでのＰＨＡ生成による強固な持続される活性バイオマス成長をもたらす。戦略は、ＰＨＡを蓄積するバイオマスの画分が、フェドバッチプロセス操作におけるできるだけ長い間、それ自体の成長のための栄養素の利用のための選択有利性を維持するように、ＰＰＰにおけるバイオマスの代謝刺激を発生させることである。そのような有利性は、最大化されたバイオマス呼吸を保証する制限された炭素基質利用可能性の条件の下で栄養素が供給される場合、ＰＰＰにおいて促進させることができ、したがって、増加した時間平均ＰＨＡ蓄積収量を有するバイオマス成長を促進する。組み合わされた成長及び蓄積のそのような条件の下で、フェドバッチシステムからの生成物のより大きい最終的な質量を達成するために、ＰＨＡ蓄積プロセスを駆動し、ＰＰＰを動作させることができる。

一般的には、容易に利用可能な炭素基質による栄養素の利用可能性の下では、成長は、蓄積と比較して恵まれているが、栄養素が制限されている下では、基質のより大きい画分は、蓄積に向かって駆動されることが可能であり、バイオマスの成長は、制限されるようになる。例えば、アンモニウムが制限された条件の下で、成長収量は、増加するアンモニウム濃度に比例して増加し、蓄積収量は、減少する（Ｓｅｒａｆｉｍ他、２００４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８７：１４５−１６０．）。蓄積の過剰な成長がＰＨＡバッチ蓄積の間に発生した場合、バイオマス中のＰＨＡ含有量は、最大値に達することになり、非ＰＨＡバイオマスの優先的な成長がＰＨＡの蓄積の間に支配的になるので、そこから減少することになる（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ他、２００８年、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９９：５０９−５１６）。したがって、本開示は、バッチ混合培養物ＰＨＡ精製プロセスから得られるＰＨＡの質量の生産性の増加を達成するための条件を達成する目的のための栄養素及び基質の供給の最適化に関する。

いくつかの学術的な研究が、ＰＰＰを用いて行われており、そこでは、バイオマスＰＨＡ蓄積潜在能力（ＰＡＰ）における供給されるＮ及びＰレベルの影響が調査されている。（例えば、Ｄｉｏｎｉｓｉ Ｄ他、２００４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５：５６９−５７９、Ｄｉｏｎｉｓｉ Ｄ他、２００５年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８０：１３０５−１３１８、Ｄｉｏｎｉｓｉ Ｄ他、２００６年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９３（１）：７６−８８、Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ Ｓ．他、２００６年、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９９：５０９−５１６、Ｊｏｈｎｓｏｎ他、２０１０年、Ｗａｔｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４４．２１４１−２１５２、Ｗｅｎ他、２０１０年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２２（１０）：１６０２−１６０７、Ｂａｓａｋ他、２０１１年、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３４（６）：１００７−１０１６を参照）。ＰＰＰでの栄養素の使用の実験の審査された調査結果にもかかわらず、これらの研究は、主に発現したバイオマスＰＡＰに対する栄養素の影響に焦点を当てており、活性バイオマス成長と組み合わされたＰＨＡ蓄積の安定したプロセスを確実に駆動する事に関するＰＰＰ生産性には焦点を当てていない。ＰＰＰに供給されるバイオマスによって生成されるＰＨＡの質量に関するプロセスの生産性の増加の結果による、ＰＨＡ蓄積の持続的な活動のためのフェドバッチプロセスの制御に向けたバイオマスへのＮ及びＰ供給の選択された範囲の組み合わせを理解することに関して、ノウハウが欠落している。

本明細書に記載の方法は、生物学的処理システムから回収されたバイオマスからのＰＨＡが豊富なバイオマス生成物の生産性を向上させるための手段に関する（例３）。そのような生産性を向上させる手段は、単位体積及び時間あたりに生成されるＰＨＡの質量の増加を達成するものである。蓄積プロセス中に供給されるＲＢＣＯＤに対する窒素及びリンの供給を制御することによって、生成されるＰＨＡが豊富なバイオマスの質量の全体的な増加を達成することができる。蓄積プロセスへの栄養素の選択された追加は、バイオマス中のＰＨＡの含有量を減少させることなく、バイオマスの非ＰＨＡ蓄積部分を刺激するために使用することができる。ＰＨＡ蓄積速度を超える非ＰＨＡバイオマス生成速度の増加の傾向は、ＰＨＡの蓄積なしに成長するバイオマスのプロセスに関して一般的に理解されている栄養素要件に関する制限であるレベルで、窒素及びリンのような栄養素を供給することによって軽減することができる。

一実施形態では、ＰＨＡ蓄積プロセスのためのバイオマスに生物学的に利用可能な窒素及びリンの供給源の評価が実行される。生物学的に利用可能な窒素及びリンは、蓄積プロセスに配置されているバイオマスを含む（回収された）混合液中にすでに存在する可能性がある。この実施形態では、収集プロセスに導入されるバイオマスを有する混合液は、蓄積プロセスの前に濃化する必要がある可能性がある。濃化された場合、蓄積プロセス中に供給すべきＣＯＤの質量に対して窒素及びリンの混合溶液の質量を減少させるために、過剰な水が少なくとも部分的に除去される。濃化し、過剰な水をバイオマスから除去した後、混合液は、直接用いることができる。必要ならば、混合液を、例えば、無視できる生物学的に利用可能なＣＯＤと、無視できる窒素及びリンとを含む希釈水で希釈することができる。この文脈では、無視できる窒素及びリンは、蓄積プロセスの過程で、バイオマスに供給される生物学的に利用可能な窒素及びリンが、１５ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＣＯＤ及び３ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＣＯＤの制限の関係でバイオマスによって消費されるべきＲＢＣＯＤの総質量を超えないように、十分に低い初期窒素及びリン濃度を意味する。

生物学的に利用可能な窒素及びリンは、ＰＨＡ蓄積プロセスのためのバイオマスによって使用されるべきＣＯＤの供給を提供する流入液ストリーム中にも存在する可能性がある。一般的に、本発明者らは、窒素及びリンの供給が、蓄積プロセスでのバイオマスの高い呼吸速度を維持するためのバイオマスへのＣＯＤの需要と歩調を合わせて提供されるべきであることを発見した。一実施形態では、蓄積プロセスのためのＣＯＤ供給を含む流入液は、容易に生物学的に利用可能なＣＯＤと共にバイオマスに供給される窒素及びリンの供給が、２〜１５ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤ及び０．５〜３ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲内に維持されるように、前処理され、又は、他のＣＯＤの供給若しくは流入液と混合される。流入液ストリームの前処理又は混合は、ＲＢＣＯＤ：Ｎ：Ｐが、蓄積プロセス、ＰＨＡ及び非ＰＨＡバイオマス生成の少なくとも一部をサポートする範囲内に入るように、窒素及びリンの濃度を追加、除去、又は希釈のいずれかをする手段である。当業者は、水から窒素及びリンを除去するために、物理化学的処理のような他の前処理プロセスを使用することができることを理解するであろう。

本出願の文脈では、バイオマスは、ＰＨＡバイオマス及び非ＰＨＡバイオマスの画分に分割される。バイオマスは、これらの両方の画分の合計である。一般的に、本発明者らは、バイオマスの有機画分、すなわち、反応器要素の揮発性有機固体（ＶＳＳ：ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｉｄ）濃度掛けるそれぞれのボリュームのみを測定の目的ために検討する。この文脈における「活性バイオマス」は、バイオマスの非ＰＨＡ画分、又は、言い換えると、総バイオマス（又はプロセスＶＳＳ）マイナスＰＨＡバイオマスである。ＰＨＡは、バイオマスを構成するバクテリアによる細胞内顆粒として蓄えられるので、本発明者らは、ＰＨＡバイオマスと言う。本明細書で開示される栄養素の制限は、「活性バイオマス」における質量増加速度が蓄積プロセスのためのＰＨＡにおける質量増加速度以下であることの高い信頼性を保証することを意図している。

蓄積プロセスの流入液が２〜１５ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤ及び０．５〜３ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲以下のＣＯＤ：Ｎ：Ｐを有する別の実施形態では、窒素及びリンは、主要な流入液ＣＯＤ供給とは別の流入液ストリームとして追加することができる。そのようなプロセスでは、ＣＯＤ供給ストリームの主要な流入液、及び別個の流入液栄養素供給により、栄養素の流入流量は、蓄積プロセスの間、動的に調整することができる。本実施形態では、バイオマス濃度及びＰＨＡ含有量は、比較的速いオフライン測定によって、又は、オンラインでも、赤外線又は近赤外線分光法を含む、光吸収の分光法を使用することによって測定することができる。懸濁固形物濃度（ＶＳＳ）及び懸濁固形物のＰＨＡ含有量の両方の変化を並行して考えることができる。そのような測定から、バイオマスのＰＨＡ含有量の傾向を、時間的に追跡することができる。この傾向の傾きは、重要である。
・正の傾きは、活性バイオマス生成速度よりも高いＰＨＡ生成速度の条件を示す。これらの条件の下では、バイオマスのＰＨＡの全体的な増加によって示されるように、バイオマス中のＰＨＡの正味の蓄積がある。
・ゼロの傾きは、ＰＨＡ生成速度と活性バイオマス生成速度との間の均衡を示す。これらの条件の下では、プロセスにおけるバイオマスの質量が依然として増加している場合、個々の細胞が同時にＰＨＡを蓄積しながら、バイオマス中のＰＨＡ蓄積バクテリアが増加していることが示される。ＰＨＡを含むバクテリアが分裂したとき、両方の娘細胞が同じ数のＰＨＡ顆粒を受け継ぐことが、当該分野の専門家に一般的に知られている。言い換えると、６つのＰＨＡ顆粒を含む細胞が分裂したとき、両方の娘細胞は、３つの顆粒を含むことになる。娘細胞は、再び分裂する前に、「活性質量」及びＰＨＡ含有量の両方が比例して増加し、成長し、再び分裂し、と同様に続く。このようにして、個々のセルのＰＨＡ含有量は、バイオマスの成長により維持され、バイオマス全体におけるＰＨＡの一定の含有量をもたらす。
・負の傾きは、活性バイオマス生成速度よりも低いＰＨＡ生成速度を示し、この場合には、全体としてのバイオマスは、バクテリア細胞増殖又は他の非ＰＨＡバイオマス生成に起因して増加しているが、非ＰＨＡバイオマスの成長は、一般的に、ここでは、バイオマスＰＨＡ蓄積活性と競合する。
限定はしないが、例えば、制御戦略は、以下の定性的な決定要素を含むことができる。
１．正の傾き：ＰＨＡ含有量は、
ａ．減少する特定のＣＯＤ需要、その後の増加する栄養素供給速度、又は、
ｂ．増加する若しくは一定の特定のＣＯＤ需要、その後の一定の栄養素供給速度の維持、若しくは栄養素供給速度の減少
により増加する。
２．ゼロの傾き：ＰＨＡ含有量は、
ａ．減少する特定のＣＯＤ需要、その後の増加する栄養素供給速度、又は、
ｂ．増加する又は一定の特定のＣＯＤ需要、その後の一定の栄養素供給速度の維持、若しくは栄養素供給速度の減少
により一定である。
３．負の傾き：ＰＨＡ含有量は、
ａ．減少する特定のＣＯＤ需要、その後の停止するフェドバッチプロセス、又は、
ｂ．増加する又は一定の特定のＣＯＤ需要、その後の減少する栄養素供給速度若しくは停止するフェドバッチプロセス
により減少する。

本明細書に含まれる知見を踏まえて、そのような制御戦略における栄養素供給速度は、ＣＯＤ：Ｎ：Ｐ供給が２〜１５ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤ及び０．５〜３ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲内に保たれるように維持されるべきである。

栄養素（窒素及びリン）が混合微生物培養のバイオマス中のＰＨＡ蓄積の生産性を改善することに向けて使用され得る程度は、十分に理解されていない。混合微生物培養からのＰＨＡ生成に関する科学文献は、ＰＨＡとしての炭素基質蓄積を促進させ、最終的なバイオマス中に蓄積されたＰＨＡの高いレベルに達するために、少なくとも１つの栄養素の制限の下で、ＰＨＡ蓄積が最高に達成されると考えている。したがって、この対象領域における学術的焦点は、混合培養物ＰＨＡ蓄積プロセスにおいて、バイオマスのできるだけ高いＰＨＡ含有量を達することになっている。逆に、バイオマスの適度に高いＰＨＡ含有量が重要であると仮定されている一方で、本開示の焦点は、混合培養物フェドバッチＰＨＡ蓄積プロセスからのＰＨＡ生成の全体的に改善された生産性を達成するための方法及びプロセスである。ＰＨＡ蓄積のためのフェドバッチプロセスの高い生産性は、バイオマス中のＰＨＡの総含有量だけに依存せず、さらに、フェドバッチプロセスに供給されるバイオマスの初期量から開始する反応器の単位体積当たりに生成されるＰＨＡの最終的な総質量又は量に依存する。生産性は、さらに、単位体積当たりのＰＨＡ質量の生成速度に依存すると考えることができる。生産性はＰＨＡ生成プロセスに関して異なる方法で定義され得るが、本開示は、フェドバッチ蓄積で処理されるバイオマスのバット毎の蓄積プロセスに提供されるバイオマスの量に対する、フェドバッチＰＨＡ蓄積プロセスに関する生産性の改善に関係する。言い換えると、本明細書に記載の方法及び実施形態は、
１．４０％（ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ）よりも大きい予想されるＰＨＡ蓄積能力を有するが、無視できる初期ＰＨＡ含有量を有するバイオマスの初期量、
２．一般的に１２時間よりも長いが、ＢｉＰＰからのバイオマスのストリームを管理するコスト及びロジスティクスにおける実際的な考慮事項のため、７２時間未満である、供給されたバイオマスからのＰＨＡ生成を達成するための定義された利用可能な時間、
を仮定して、フェドバッチプロセス混合培養物蓄積プロセスにおけるＰＨＡ含有量の合理的な範囲内のＰＨＡのより大きい全質量を生成する目的がある。

本明細書で開示する方法を利用して、窒素及びリンの同時供給範囲内の有機基質の「需要時供給」の条件の下で高いバイオマス呼吸速度を維持するフェドバッチプロセスは、ＰＨＡ及び活性バイオマス生成の組み合わせ及び持続した均衡をサポートする。フィード中の制限された栄養素（Ｎ及びＰ）供給、（維持ゾーン環境によって確立された）制限された有機基質の利用可能性、並びに、（刺激ゾーン環境によって確立された）高いバイオマス呼吸速度の組み合わせの効果は、プロセスに供給される活性バイオマスの質量当たりに生成されるＰＨＡのより大きい可能な質量をもたらす。

窒素及びリンの少なすぎる供給は、ほとんどない又は無視できる活性バイオマス成長による独占的又はほとんど独占的なＰＨＡ生成のうちの１つとなるようにフェドバッチプロセスを制限する。栄養飢餓のこの場合には、フェドバッチプロセスの潜在能力は、利用されていない。栄養素の最適なレベルがＲＢＣＯＤによって提供される場合、ＰＨＡ及び活性バイオマス生成の組み合わせは、蓄積プロセスに供給されるバイオマスから生成することができるＰＨＡの総質量において、少なくとも２５％の増加、好ましくは、少なくとも５０％より多い増加をもたらすことができる。一般的に、より大きいプロセスの生産性は、バイオマスがその現存のＰＡＰによって表されるＰＨＡ含有量に達した後、（組み合わされたＰＨＡ蓄積により）バイオマス成長の期間を延長することによって増すことができる。

窒素及びリンの多すぎる供給は、バイオマス代謝「需要」を十分に超える有機炭素供給速度との組み合わせで、非ＰＨＡバイオマス生成がプロセスを支配し、生産性の正味の減少をもたらすリスクを増大させる。過剰な栄養素及び有機基質の供給のこの場合には、ＰＨＡ生産性に関するフェドバッチプロセス及びバイオマスの潜在能力は、バイオマスがＰＨＡなしで生成されるので、失われている可能性がある。

高分子量のＰＨＡ蓄積の目的のための全体的に高いバイオマス呼吸速度を維持するプロセスにおける需要時の炭素基質の搬送の実施形態は、以前にＷＯ２０１１／０７０５４４Ａ２に開示されている。バイオマス呼吸能力が少なくとも１つの刺激ゾーン内のバイオマスの画分の繰り返される刺激によって維持される、需要時のフェドバッチプロセスのプロセスが記載されている。しかしながら、フェドバッチプロセスの少なくとも一部の間、バイオマスにおける成長及びＰＨＡ蓄積の組み合わせを促進される傾向がある栄養素供給の条件は、以前に開示されていない。

富化されたＰＨＡ蓄積潜在能力を有する混合培養物を含むバイオマスは、０．４０ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳを超えるレベルまでのＰＨＡのかなりの量を蓄積することを期待することができる。実際にはより頻繁に、０．５０ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳを十分に超える混合培養物ＰＨＡ蓄積結果が実証されている。混合培養物バイオマスにおけるＰＨＡ蓄積潜在能力のこれらの高くて均一な過剰なレベルは、しばしば、バイオマスへの窒素及び／又はリンの供給なしに、バイオマスにＲＢＣＯＤだけを供給することによって実証されている（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００９、１０、６７０−６７５の開放培養結果を参照されたい）。しかしながら、ＰＨＡ蓄積を伴いかつバイオマスのＰＨＡ含有量を犠牲にすることなく、活性バイオマス生成の組み合わせを刺激するために、そのような蓄積プロセス中に栄養素を追加するためのレシピは、以前には記載されていない。

本発明者らは、４０パーセントと７０パーセント（ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ）との間のＰＨＡ蓄積潜在能力を有するバイオマスに関して、フィードのＣＯＤ：Ｎ：Ｐ比は、２００：０．４：０．１と２００：３：０．６との間にあるべきであることを発見した。制限された量の生物学的に利用可能な窒素及びリンをＲＢＣＯＤと共に加えることによって、需要時供給プロセス制御戦略により、本発明者らは、活性バイオマスの同じ初期ソースからのＰＨＡの生産性の増加を発見した。生産性におけるこの増加は、同じＲＢＣＯＤを有するが、窒素又はリンをフィードに追加しない、バイオマスの同じソースからのＰＨＡの蓄積に対してであった。ＲＢＣＯＤの同じ供給で、過剰な栄養素を追加した（すなわち、２００：５：１を超えるＣＯＤ：Ｎ：Ｐ）とき、本発明者らは、バイオマスが、ＰＨＡ蓄積潜在能力におけるその期待される潜在能力に到達することなく、活性バイオマスに成長することになるリスクの増加を観察した。

本開示は、開放培養プロセス条件の下での混合培養物のためのフェドバッチＰＨＡ生成プロセスに向けられた方法に関し、それによって、改善されたプロセス生産性が、フェドバッチプロセス中の制限された活性バイオマス成長を促進させるように、
・窒素とリンの両方の制限された利用可能性と組み合わされた、
・易生分解性炭素源の制限された「需要時の」利用可能性による高いバイオマス呼吸を保証することによって達成され得る。バイオマスにおける成長及びＰＨＡ蓄積の組み合わせを維持することは、蓄積プロセスの過程で、オンライン及び／又はオフラインで容易に監視することができる。フェドバッチプロセスは、時間若しくは生産性の目標が達成された時点（収穫逓減の基準）で、又は、生産性の減少の始まりが検出されるように、成長の条件がＰＨＡ蓄積を上回った時点で終了することができる。生産性のそのような減少は、例えば、バイオマスのＰＨＡ含有量における進行的な減少をもたらす、ＰＨＡ蓄積速度を超える成長の始まりに起因する可能性がある。

ＰＨＡを生成する混合微生物培養物における微生物バイオマスは、細胞内顆粒としてＰＨＡを蓄積することができる有機体と、ＰＨＡを蓄積しない有機体とを含む。再び、本明細書の活性バイオマスは、サンプルのＰＨＡ質量を差し引いた総バイオマスの量を表す。本明細書で開示する方法及びプロセスの１つの目的は、ＰＨＡを蓄積し続けながら成長する活性バイオマスの画分の優先的な成長と並行してＰＨＡ蓄積を促進させるように、フェドバッチプロセス中の条件を作成することである。

フェドバッチ蓄積プロセスのための合理的な時間内に単体積当たりに生成されるＰＨＡの増加した質量に到達することは、具体的には、単体積当たりの成長及び蓄積速度に関して、活性バイオマスの成長及びＰＨＡ蓄積の組み合わせを促進させることを必要とする。そのような組み合わせは、主基質としての易生分解性有機炭素又はＲＢＣＯＤに対してバイオマスと共に供給される栄養素の量によって影響される可能性がある。栄養素の追加は、バイオマス中のＰＨＡ含有量が少なくとも一定、又は、より好ましくは時間的に増加するように選択される。ＰＨＡ蓄積のために典型的に使用されるＲＢＣＯＤは、揮発性脂肪酸である。ここで、本発明者らは、混合微生物培養において増加した生体高分子の生産性を達成するために必要なフェドバッチＰＨＡ蓄積プロセスを駆動するための条件を発見しており、戦略は、バイオマスのＰＨＡ含有量が、延長された期間（６時間〜７２時間）の間、４０％ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳよりも高い有意なレベルに維持されるように、ＰＨＡ蓄積活性バイオマスの成長とＰＨＡ蓄積の両方を刺激することである。混合微生物培養物での課題は、蓄積プロセス中にそのようなＰＨＡ蓄積有機体の成長を優先的に促進させることである。本発明者らは、バイオマス中のＰＨＡ蓄積有機体の優先的な成長及びＰＨＡ蓄積活動は、
１．選択されたＮ／ＣＯＤ（ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤとして）及びＰ／ＣＯＤ（ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤとして）の比の範囲内でＲＢＣＯＤとともに栄養素の窒素及びリンを同時供給する、
２．最大又は最大に近い呼吸速度を維持するような方法でＣＯＤを供給する、並びに、
３．炭素基質を「需要時」であるように制限し、それによって、同時のＰＨＡ蓄積ではない種類の活性バイオマス成長の開始を妨げるように、そうでなければＣＯＤの利用可能性が最小限である環境にバイオマスを維持する
の組み合わされた条件の下で、フェドバッチシステムにおいて達成することができることを発見している。

バイオ処理を必要とする多くの廃水流は、易生分解性ＣＯＤに加えて栄養素を含み、したがって、そのような流れからの効率的なＰＨＡ生成は、最も高いＰＨＡ生産性を与えるＣＯＤ：Ｎ：Ｐの実際的な作用範囲を確立することに依存する。Ｎ又はＰが必要であるよりも多い又は少ないＣＯＤ流を含む場合には、フィードの目標ＣＯＤ：Ｎ：Ｐは、ＰＨＡ蓄積活性バイオマス成長によるＰＨＡ蓄積を維持する目的を提供するＣＯＤ：Ｎ：Ｐ比に到達するために、必要に応じて、ＣＯＤ若しくはＮ及びＰの他の供給源を組み合わせることによって、又は、Ｎ及びＰを除去することによって調整することができる。本発明者らは、そのようなやり方が、そのようなフェドバッチプロセスにおける全体的な生産性を大幅に改善することに適用され得ることを発見している。

例１．ＲＢＣＯＤとしてアセテート又はＶＦＡの混合物を含む工業プロセス水のいずれかを使用するＰＨＡ生成プロセスにおけるＮ／ＣＯＤ及びＰ／ＣＯＤフィード供給比の影響の評価。

２系統の需要時供給フェドバッチＰＨＡ生成実験が、２つのそれぞれのＲＢＣＯＤ供給源を用いて行われた。ＰＨＡ生成フェドバッチプロセスの評価を含んだ実験の各系統は、プロセスフィードにおける適用されたＮ／ＣＯＤ（ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤ）及びＰ／ＣＯＤ（ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤ）比の範囲にわたって進行する。すべての実験に関して、バイオマスの同じ供給源が使用された。

材料及び方法
ソースバイオマスは、かなりのＰＨＡ蓄積潜在能力で富化された活性スラッジの混合培養物であった。このバイオマスは、パイロット規模のＳＢＲ（４００ｌ）で生産された。パイロット規模のＳＢＲ（バイオマス生成プロセス又はＢｉＰＰ）は、フィードのためのＲＢＣＯＤの供給源として発酵されたチーズホエー透過液を用いて、ＯＬＲ=１〜１．６ｇ−ＣＯＤ／Ｌ／ｄ、ＳＲＴ＝４〜８ｄ、及びＨＲＴ＝１〜２ｄの好気的饗宴−飢餓選択条件の下で、３年よりも長く作動された。ＳＢＲサイクル（飢餓）の終わりに回収された余剰バイオマスは、ＰＨＡ蓄積能力において安定した性能を有していた。したがって、バイオマスは、ＰＨＡ生成の生産性に対する所与のＲＢＣＯＤによる栄養素レベルの影響をテストするための富化バイオマスの供給源として使用された。

蓄積フェドバッチセットアップは、各々、ＤＯ（Ｏｘｙｍａｘ Ｗ ＣＯＳ４１、Ｅｎｄｒｅｓｓ＋Ｈａｕｓｅｒ）、ｐＨ（Ｈ６３ Ｓｃｈｏｔｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｒｅａｇｅｃｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄｓ；Ｌｉｑｕｉｓｙｓ Ｍ ＣＰ ２２３／２５３トランスミッタ）、及び温度プローブ、隔膜フィードストック−投与ポンプ（Ｇｒｕｎｄｆｏｓ ＤＭＥ）、磁気撹拌プレート（４００ｒｐｍ）、空気供給用の空気ポンプ、及び、温度調節水ジャケットを備えた、２つの並列作動された１ｌ反応器（０．５ｌ作動容量）で構成された。各蓄積実験のために、２つのフェドバッチ反応器は、並列に作動された。一方のフェドバッチ反応器は、常に同じＮ／ＣＯＤ及びＰ／ＣＯＤ比を使用する基準であり、それによって、それぞれの実験系統の過程でバイオマス性能の一貫性を確認するための実験対照として用いられた。第２のフェドバッチ反応器では、異なる範囲のＮ／ＣＯＤ又はＰ／ＣＯＤ比が適用された。基質送達は、需要時供給呼吸制御（ＷＯ２０１１／０７０５４４Ａ２）に基づく、トリガパルスにおける半連続なものであった。そのような小規模の実験室プロセスでは、刺激ボリューム及び維持ボリュームを組み合わせ、それによって、プロセスにおけるすべてのバイオマスを同時に刺激することが実際的であることに留意されたい。工業規模では、ＷＯ２０１１／０７０５４４Ａ２によって具体化された方法は、バイオマスの画分が別個の刺激ゾーン内で所定の時間刺激される、バイオマスの非同時刺激の方法を開示している。

蓄積は、２ｍｇ／ｌよりも高い溶存酸素レベル、及び、２００ｍｇ−ＲＢＣＯＤ／ｌのパルス当たりの基質濃度の基質刺激で、３０℃の一定温度で２４時間実行された。両方の反応器からのプロセス混合液（４〜１０ｍｌ）のグラブサンプルは、プロセス性能を監視するために、蓄積の間の選択された時点で収集された。

２系統の蓄積実験は、２つの異なるＲＢＣＯＤ供給源、発酵チーズホエー透過液（ＦＷＰ）及びアセテートで実行された。ＦＷＰ（表１）は、８〜１２ｄのＨＲＴで作動されたパイロット規模のＣＳＴＲ（Ｖ＝２００ｌ）で生成され、発酵された放流水が、使用前に４℃で冷蔵保存された。ＦＷＰは、４００−ＬパイロットＢｉＰＰにおけるバイオマス生成のために使用されたフィードストックとして使用されたのと同じＲＢＣＯＤ供給源であった。

４つの蓄積実験の最初のセットでは、目的は、バイオマス応答に対するＮ／ＣＯＤ比の影響を評価することであった。ここで、基準反応器には、規定されたレベルのＮ／ＣＯＤ及びＰ／ＣＯＤ（表２）を含んだＦＷＰ対照フィードを供給した。並行反応器には、フィードストック選択された範囲のＮ／ＣＯＤ比（表２）をカバーするようにＮＨ_４Ｃｌを追加した同じＦＷＰを供給した。蓄積のうちの一方では、Ｎ及びＰ飢餓状態（Ｎ／ＣＯＤ=０、Ｐ／ＣＯＤ=０）が、ＦＷＰのＶＦＡ組成及びｐＨ（表１）を模倣するＶＦＡ混合物を使用することによって適用された。リンは、ＦＷＰにおいて過剰にある（表１）とみなされ、したがって、実験の第１のセットでは、Ｎ／ＣＯＤ比のみが系統的に変化された。ＦＷＰによる各実験の前に、ＢｉＰＰを発生源とするバイオマス混合液中の残留栄養素レベルの変化に起因する実験の変動の影響の可能性を除去するために、ＳＢＲバイオマスが遠心分離され（４０００ｘｇ、５分）、次いで、水道水に再懸濁された。

７つの蓄積の第２のセットは、酢酸ナトリウム（５０ｇ−ＣＯＤ／Ｌ）のフィードストックＣＯＤを用いて行われ、ある範囲のＮＨ_４Ｃｌ及びＮＨ_２ＰＨ_４レベルが、フィードにおける異なるＮ／ＣＯＤ及びＰ／ＣＯＤ比（表３）を目標とするために適用された。これらの蓄積実験では、フィードストックにおける栄養素レベルの影響を比較する一貫した基盤を維持するために、ＳＢＲバイオマスは、遠心分離され（４０００ｘｇ、５分）、緩衝溶液（０．２４８ｇ−Ｎａ_２ＣＯ_５／Ｌ、０．２６２ｇ−ＮａＨＣＯ_３／Ｌ、０．５ｇ−ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ／Ｌ、０．２５ｇ−ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ／Ｌ）に再懸濁された。ｐＨは、蓄積中、７〜８の間であった。微量栄養素は、実験の開始時に、それぞれ、０．２及び０．６ｍｌのＦｅ／Ｚｎ原液及び微量元素溶液の単独追加によって提供された。Ｆｅ／Ｚｎ溶液は、７．８ｇ−ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ／Ｌ及び０．７８ｇ−ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ／Ｌを含み、微量元素溶液は、０．２５ｇ−Ｈ_３ＢＯ_３／Ｌ、０．２５ｇ−ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ／Ｌ、０．２０５ｇ−ＭｎＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ／Ｌ、０．１ｇ−ＮａＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ／Ｌ、０．０５ｇ−ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ／Ｌ、及び０．３ｇ−ＫＩ／Ｌを含んだ。フィードのｐＨは、４Ｍ ＮａＯＨで３．５に調整された。１００：１：０．９のフィードの固定されたＣＯＤ：Ｎ：Ｐ比が、基準反応器における実験対照として適用された。並行蓄積反応器では、適用されたＣＯＤ：Ｎ：Ｐ比は、飢餓、制限、及び過剰のＮ及びＰ条件をカバーした。制限及び過剰の定義は、ＦＷＰ（表２）による蓄積の第１のセットにおける同じＳＢＲバイオマスによる観察された栄養素除去に基づいて定義された。実験の両方のセットにおいて、基準蓄積は、実験が実行された期間にわたるＰＨＡ蓄積潜在能力におけるＳＢＲバイオマスの性能の再現性を評価するために使用された。

蓄積反応器からの混合溶液サンプルは、遠心分離され（５分間４０００ｘｇ）、遠心分離液は、次いで、濾過された（Ｍｕｎｋｔｅｌｌ ＭＧＡ、１．６μｍ）。濾液は、可溶性ＣＯＤ（ＬＣＫ１１４）、Ｎ−ＮＨ_４ ^＋（ＬＣＫ１３８及び２３８）並びにＰ−ＰＯ_４ ^３−（ＬＣＫ３４９及び３５０）について、必要に応じて蒸留水希釈液を使用して、ハック・ランゲ法（ＬＴ１００、Ｘｉｏｎ５００分光光度計）によって分析された。ＶＦＡ濃度は、少し修正したＭｏｒｇａｎ−Ｓａｇａｓｔｕｍｅら（２０１０．Ｗａｔｅｒ Ｒｅｓ．４４：５１９６−５２１１）により、０．２２μｍフィルタを通してさらに濾過した後、ガスクロマトグラフィ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｕｔｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定され、２５％の蟻酸及び３ｇＬ−１クロトン酸を含む内部標準が、０．９ｍｌの濾過サンプルに加えられた。

バイオマスペレットは、７０℃で一晩乾燥され、ＴＳＳ測定のために秤量され、次いで、ＰＨＡ分析のために使用された。混合液ＴＳＳ及びＶＳＳは、標準的な方法（ＡＰＨＡ、１９９８）に基づいて、蓄積の開始、中間、及び終了時に測定された。バイオマスペレットのＰＨＡ含有量は、他の場所で以前に報告されたように（Ｗｅｒｋｅｒ他 ２００８．Ｗａｔｅｒ Ｒｅｓ．４２：２５１７−２５２６）測定された。Ｐ（３ＨＢ）及びグルコース（Ａｉｄｒｉｃｈ３６、３５０−２）は、それぞれ、３ＨＢ及び多糖類の校正標準のために使用された。

バイオマス中のＰＨＡ含有量は、ｇ−ＶＳＳ当たりのｇ−ＰＨＡとして計算された。収量は、消費されたＣＯＤによって形成されたＰＨＡの質量（１．６７ｇ−ＣＯＤ／ｇ−／ＰＨＢ及び１．９２ｇ−ＣＯＤ／ｇ−ＰＨＶ）を変換することによって、ＣＯＤ基準で計算された。活性バイオマス（Ｘ_ａ）は、ＰＨＡ含有量を減じたＶＳＳとして定義された。ＣＯＤ基準でのバイオマス生成を考慮するために、１．４２ｇ−ＣＯＤ／ｇ−Ｘ_ａの変換係数が、Ｃ_５Ｈ_７ＮＯ_２の公称バイオマス組成を仮定してＣＯＤ基準で活性バイオマスを表すために使用された。全体のバイオマス収量は、したがって、消費されたＲＢＣＯＤに対するＣＯＤ基準で生成された推定ＶＳＳであった。

経験的な漸近的又は二次の関数が、バイオマスのＰＨＡ含有量、ＶＳＳ生成、及びＣＯＤ消費の測定値から時間（ｔ）での質量収支傾向を表すために使用された。それぞれの時間ベースの経験的関数の導関数は、変化の累積パラメータ率に関する傾向を推定するために使用された。

結果及び考察
図１は、数ヶ月にわたる２２のＰＨＡ生成実験にわたる発現したＰＨＡ蓄積潜在能力におけるバイオマスの性能の一貫性を示す。全体的に、バイオマスは、５０％と７０％（ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ）の間のＰＡＰを示した。ＰＡＰにおける異常値は、アセテートＲＢＣＯＤに関して観測され、そうでなければ均衡している、リンに関する窒素制限及び窒素過剰に関連していた。過剰なＮと均衡するＰの結果は、過剰な栄養素による性能は、十分に強くない可能性があることを示唆した。いずれにしても、（必要な場合）栄養素を追加するコストのため、及び／又はＰＨＡ生成の放流水管理のため、蓄積プロセスのために過剰に栄養素を追加することは、有利ではない。理想的には、ＰＨＡ生成プロセスからの放流水は、プロセス放流水管理における不必要な運用コスト及び投資を回避するために、できる限り処理された廃水であるべきである。

図２及び図３は、すべての場合において需要時供給プロセス方法によって供給されたアセテート及びＦＷＰ ＲＢＣＯＤ基質に関するＰＨＡ蓄積の典型的な観測された傾向を示す。これらの図では、バイオマスＰＨＡ含有量（ａ）、ＲＢＣＯＤ消費量（ｂ）、バイオマス（ＶＳＳ）生成量（ｃ）、及びＰＨＡ生成量（ｄ）の典型的な経験的フィット傾向が示されている。図２では、活性バイオマス成長の開始は、経時的にＰＨＡ生成を超えるバイオマス生成の傾向によって観察される。その間じゅう、常にゼロ以上であるＰＨＡ含有量の傾きによって示されるように、ＰＨＡ蓄積速度は、活性バイオマス生成以上である。図３は、ＦＷＰ基準の蓄積の場合に関して、活性バイオマス生成は、やがてＰＨＡ含有量において観測された最大値のために、ＰＨＡ生成活動を引き継ぐようになり、ＰＨＡ含有量の傾向における最終的な負の傾きが観察された。

ＲＢＣＯＤにおけるバイオマスの収量は、ＲＢＣＯＤ供給源としてＦＷＰの場合に関して、平均してより大きかったが、ＲＢＣＯＤにおけるバイオマスの全収量は、比較的一貫していた（図４）。バイオマスは、ＦＷＰを処理するプロセスから供給され、したがって、このフィードストックのより多様な有機内容物への順応のより高いレベルを期待することができる。もう一度、異常値は、制限された（ＦＷＰの上ひげ（ｕｐｐｅｒ ｗｈｉｓｋｅｒ））又は過剰な（アセテート異常値）窒素供給と関連していた。したがって、ＲＢＣＯＤにおけるバイオマスの最も低い収量は、過剰な窒素の場合のためであった。この観察は、ＲＢＣＯＤとしてＦＷＰを使用する際の過剰な窒素に関しては再現されなかった。本発明者らは、生物系においてすべての要因を制御することが困難であるとして、栄養素の部分的な制限に基づいて非ＰＨＡバイオマス成長を制限する厳しい制約が欠けているために、工業化プロセスの信頼性にとって最も多くのリスクを導入する過剰な栄養素の条件を考えた。しかしながら、それにもかかわらず、ＦＷＰ蓄積の場合について、ＰＨＡ生成の良好な生産性が、いくつかの場合では、過剰な栄養素を供給されたＲＢＣＯＤについてでさえうまく達成され得ることを観察することが実際的に重要であった。

すべてのことがＰＨＡ蓄積プロセスについて等しくても、それにもかかわらず、ＰＡＰにおけるいくらかの変動が、同じ供給源から来るバイオマスによって発現し得ることを観察することが重要であった（図５）。観察された相関は、ＲＢＣＯＤとしてアセテートを用いるバイオマスの発現した最大ＰＨＡに関して、及び、適用された栄養素均衡（（Ｎ／ＣＯＤ，Ｐ／ＣＯＤ）＝（１０，９）ｍｇ／ｇ）の複製された対照（基準）条件に関して注目された。ここで、Ａｓｈ_０は、初期バイオマスの無機質量を指し、ＰＨＡ_０は、初期バイオマスのＰＨＡを指し、Ｘａ_０は、初期活性バイオマスを指す。バイオマスの初期ＰＨＡ及び無機材料含有量の違いは、ＲＢＣＯＤとしてアセテートを用いる系列の実験の７セットに使用されたバイオマスの多かれ少なかれ「飢餓」ストレスを示唆した。したがって、混合培養物のためのＰＨＡ生成の生産性を最適化する方法及びプロセスのこれらの観察及び知見にもかかわらず、供給源からのバイオマス履歴も、ＰＨＡ生成プロセスにおける生産性の結果になんらかの変動を導入する可能性がある。

調査の主な目的は、４０〜７０ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳの間のＰＨＡを発現するバイオマスを与えられた混合培養物ＰＨＡ生成のための最適な栄養素範囲を確立することであった。改善されたプロセス生産性を達成するために必要な活性バイオマス生成をサポートするために、十分な栄養素が提供されるべきである。しかしながら、過剰な栄養の追加は、非ＰＨＡ蓄積バイオマス成長を過度に制限することになるプロセス制約の損失のため、及び、可能な限り最高のプロセス放流水品質基準を維持するために必要な基本要件のため、回避されるべきである。図６では、アセテートＲＢＣＯＤ系列（黒丸）から、及び、ＦＷＰ ＲＢＣＯＤ系列（黒丸）からの栄養素消費のデータが提示されている。四角記号は、適用されたＰ／ＣＯＤの関数としての消費されたパーセントＰのため、及び示されているように一定の適用されたＮ／ＣＯＤのためのものである。円形記号は、適用されたＮ／ＣＯＤの関数としての消費されたパーセントＮのため、及び示されているように一定の適用されたＰ／ＣＯＤのためのものである。

図６にまとめられた、適用された栄養素のパーセント消費のデータは、Ｎ／ＣＯＤが制限された（１０ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＣＯＤ）際の約２ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＣＯＤの最適なＰ／ＣＯＤを示唆した。過剰なＰ／ＣＯＤの場合について、これらのデータは、約１５ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＣＯＤを超えるＮ／ＣＯＤが過剰であったことを示した。

（図６のデータから示されるように）栄養素が制限又はほぼ制限されたレベルで供給される場合、本発明者らは、プロセスに供給される活性バイオマスの質量当たりに生成されるＰＨＡの質量の生産性により、フェドバッチＰＨＡ生成プロセスが需要時供給戦略に基づいて確実に動作することができることを見出した（図７及び図８）。栄養飢餓が適用される場合、バイオマスは、同様のＰＡＰを発現し得るが、任意の活性バイオマス成長の不在下で、ＰＨＡの生産性は、少なくなる。栄養飢餓の下では、ＰＨＡが発現すると、バイオマスは、呼吸にますます反応しなくなるので、より多くのＰＨＡ生成を得るために動作時間を延長する機会は、ほとんど又はまったくない。この場合には、追加されたＲＢＣＯＤは、一般に、混合液中に蓄積し始める。栄養過剰が適用される場合、本発明者らは、ＰＨＡ蓄積なしの活性バイオマス成長の発生がもはや制限されないリスクを観察した。栄養過剰のこの場合には、低ＰＡＰの発現、及び／又はＰＨＡ生成速度を超える活性バイオマス成長速度の発生は、ＰＨＡ生成プロセスが駆動され得る時間の長さを制限する。栄養素の制限された供給は、長い時間の蓄積を達成する条件を促進し、そこでは、バイオマスのＰＨＡ含有量は、比較的一定のままであるが、生成される材料の質量は、やがて次第に増加する。この場合には、プロセスがより長く動作状態に保たれていれば、プロセスの生産性は、増加する。動作の長さは、この場合には、ＢｉＰＰからのバイオマスの供給速度と、この、ここでは、タンクの利用可能な資源により加えられるストリームの値、及びＰＨＡ生成プロセスのためのＲＢＣＯＤ供給を管理する進行中の必要性とにより、工業的な実施において制限されるようになる可能性がある。

例２．パイロット規模での好ましい実施形態の実証
フェドバッチ蓄積プロセスにおける需要時供給によって増加するＰＨＡ生成潜在能力は、パイロット規模で実証された。選択されたＮ／ＣＯＤ及びＰ／ＣＯＤ基質比は、廃棄活性スラッジからのＰＨＡ生成のためのＲＢＣＯＤとしてアセテートを使用して適用された。バイオマスは、都市下水の生物学的処理の過程で、ＰＨＡ蓄積能力において富化された。

材料及び方法
２つのフェドバッチ蓄積が、呼吸測定（ＷＯ２０１１／０７０５４４Ａ２）に基づいて制御される需要時供給で、Ｎ及びＰの追加あり及びなしで、ＲＢＣＯＤ供給源としてアセテートを使用して行われた（８３〜１００ｇ−ＣＯＤ／Ｌフィードストック、ＮａＯＨにより５に調整されたｐＨ）。栄養素追加ありの蓄積では、ＮＨ_４Ｃｌ及びＫＨ_２ＰＯ_４が、１００：１．２：０．０７のＣＯＤ：Ｎ：Ｐ比を有するフィードに追加された（ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤ=１２、ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤ=０．７）。目標Ｎ／ＣＯＤ及びＰ／ＣＯＤ値は、増加したＰＨＡ生産性を得るために例１で決定された範囲内であり、反応器中の濃度を刺激する目標呼吸は、８０〜１１０ｍｇ−ＣＯＤ／Ｌの範囲であった。

約１ｇ−ＶＳＳ／Ｌの初期活性スラッジバイオマスレベルを有する４００Ｌ蓄積反応器が使用された。活性スラッジは、増加したＰＨＡ蓄積潜在能力のための好気的饗宴−飢餓選択の確立された条件（ＷＯ２０１２／０２３１１４Ａ１）の下で都市下水を処理するパイロット規模の反応器から供給された。ＰＨＡ生成プロセス中にとられたグラブサンプルからの水質分析は、例１で説明したのと同様に実行された。

両方の蓄積は、２５℃で行われ、２０時間持続した。２つの実験における可溶性の全体のＮの初期レベルは、正確に同じではなかった。Ｎ及びＰの追加なしでのＮ濃度は、最初に１３ｍｇ−Ｎ／Ｌであり、Ｎ及びＰの追加ありでの開始濃度は、６ｍｇ−Ｎ／Ｌであった。

結果及び考察
テストにおける利用可能なＮ（最初に存在する及び／又は追加された）は、それぞれの蓄積の過程でバイオマスによって同化された（除去効率≧９２％）。パイロット規模での原理のこの実証の結果は、表４にまとめられている。好ましい実施形態の範囲で供給された栄養素、及び、ＰＨＡ蓄積の需要時供給方法の適用は、Ｐ飢餓の基準条件に対して２０時間の生成プロセスにわたる特定のＰＨＡ生成において８５パーセントの増加をもたらした。

例３．商業的実施のための実施形態
限定はしないが、知見の実施態様の実際的な表現を、図７に図式的に提供する。図７を参照すると、廃水処理プロセス（２）は、流入液（１）を受け、放流水質（３）に関する必要な基準を満たすために、水質を改善する。バイオマスは、プロセスにおいて生成され、バイオマスは、プロセスから分離され（４）、それによって、混合液からの過剰な水が、放流水質と同様の制約で排出される（５）。希釈水（６）を脱水バイオマスに混合することができ、（２）から回収されたバイオマスは、フェドバッチＰＨＡ蓄積プロセス（７）に配置される。

水処理施設からのバイオマスは、ＰＨＡ蓄積のための能力において有意な潜在能力で富化される。富化の技術分野において教示する実施形態の例は、ＵＳ２０１０／０２００４９８、ＷＯ２０１１／０７０５４４Ａ２、ＷＯ２０１１／０７３７４４Ａ１、ＷＯ２０１２／０２２９９８Ａ１、及びＷＯ２０１２／０２３１１４Ａ１において見出すことができる。富化は、ＰＨＡとしてその乾燥重量（ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ）の少なくとも４０％、好ましくは５０％超を含むＰＨＡが豊富なバイオマス（８）の結果により、（２）から（７）に配置されたバイオマスがＰＨＡを蓄積することを可能にする。（７）のプロセス実施形態の例は、ＷＯ２０１２／０２２９９８Ａ１に見出すことができる。ＰＨＡが豊富なバイオマス（８）は、ＷＯ２０１２／０２２９９８Ａ１によって教示されるように、バイオマス中のＰＨＡの熱安定性を確実にするために、さらに処理することができる。ＰＨＡ蓄積プロセス（７）からの放流水（９）は、排出のための水質基準を、放流水（３）及び（５）についてと同様に満たす、又は満たすようにされなければならない。

ＣＯＤ及び／又は栄養素（Ｎ及びＰ）を蓄積プロセス（７）に供給するいくつかの流入液ストリームのうちのいずれか１つが存在することができる。流入水ストリームのいくつか又はすべては、フィードのＲＢＣＯＤ含有物の品質を改善するか、さもなければ、供給源の栄養素含有量を調整する（増加させる、又は減少させる）手段として、なんらかの前処理（１３及び１４）を必要とすることができる。平均して、栄養素が２〜１５ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤ及び０．５〜３ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲でＲＢＣＯＤによって供給されるように、流入水ストリームは、ＲＢＣＯＤの基質の（７）への供給に到達するために、必要に応じて（１５）混合することができる。いくつかの実施形態は、さらに、プロセス水質、バイオマス生成量、及びバイオマスＰＨＡ含有量を測定し、それによって、流入液ストリーム及び／又はプロセス全体の混合、及び供給の速度を調整するために制御戦略のためのフィードバックを提供するために、１つ又は複数の方法及び／又はデバイスを含むことができる。例えば、蓄積プロセスは、バイオマス呼吸、バイオマス濃度、及びバイオマスのＰＨＡ含有量の発達を反映する時間的な傾向を提供するオフライン及び／又はオンライン測定を含む。この情報に基づいて、プロセス監視（１０）に対するプロセス制御応答（１１）は、プロセスのための需要時供給ＲＢＣＯＤ取り込み速度を確立し、２〜１５ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤ及び０．５〜３ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲内のフィード内の栄養素バランスを調整するために使用される。

例４．バイオマス呼吸の刺激及び維持
単純な実験室での練習として、呼吸刺激の原理は、実施の実験で実証された。限定はしないが、都市下水を処理するパイロット規模の生物学的窒素除去プロセスからの活性スラッジが用いられた。バイオマスは、最近実証されているように（Ａｎｔｅｒｒｌｅｕ他、２０１３．Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＤＯｌ−１０．１０１６／ｊ．ｎｂｔ．２０１３．１１．００８）、嫌気的饗宴と好気的飢餓を使用して、選択の饗宴−飢餓戦略に基づく有意なＰＨＡ蓄積潜在能力を示すために富化された。活性スラッジは、好気的飢餓サイクルの終わりに、パイロットプロセスから回収された。

非エアレーションの１００ｍｌ容器において、５ｇ−ＶＳＳ／Ｌの濃度のバイオマスは、１００ｍｇ−ＣＯＤ／Ｌの呼吸刺激ＲＢＣＯＤ濃度に到達するように、アセテートと共に投与された。容器の溶存酸素量は、ごくわずかであり、内容物は、呼吸刺激の時間を表す１分間混合された。

この刺激の周期の後、バイオマスは、バイオマスを含まず、７００ｍｌの量の希釈水を含む、よく混合された維持反応器に移された。希釈水は、溶存酸素（ＤＯ）で予め飽和され、バイオマス呼吸速度は、溶存酸素の減少時における線形傾向から評価された。溶存酸素が約５ｍｇ−Ｏ_２／Ｌに減少した後、希釈容器へのエアレーションが導入された。溶存酸素は、一般に、飽和値未満の定常状態値に増加する。溶存酸素のその後の突然の増加は、追加されたＲＢＣＯＤの完全な消費を示した。ＲＢＣＯＤは、８倍に希釈されたが、刺激ゾーン接触濃縮によって確立された呼吸レベルは、約１２ｍｇ−ＣＯＤ／Ｌへの基質希釈後、維持された。

基質が消費され、溶存酸素が、初期の飽和値に近い定常状態のＤＯ濃度に再び増加した後、アセテートの第２のパルスがバイオマスに加えられた。このとき、同じ質量のＣＯＤが加えられるが、この質量は、このとき維持容器内にあったバイオマスに加えられた。この基質の第２のアリコートを加える直前に、維持容器のエアレーションは、止められたので、呼吸速度は、以前のように基質消費の期間と同様に監視することができた。同じ質量の基質を維持ゾーンに加えることによって、はるかにより低い、公称では１２ｍｇ／Ｌの「刺激濃度」が確立された。

この例では、１００ｍｇ−ＣＯＤ／Ｌにおける非好気的呼吸刺激は、０．２４ｍｇ−Ｏ_２／Ｌ／分の呼吸速度をもたらした。刺激容器内でのより高い濃度との接触時間の利益なしに同じ質量の基質を加えることによっては、同じバイオマスの呼吸は、０．１８ｍｇ−Ｏ_２／Ｌ／分のみであった。したがって、３０％より高い呼吸速度が、刺激容器の使用によってバイオマスにおいて達成され、このより高い呼吸速度は、維持ゾーン又は反応器内の大幅により低いＲＢＣＯＤ濃度の環境内で維持することができた。

簡単な実験の第２のセットでは、５０〜６０パーセント（ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳ）の間の公称ＰＨＡ蓄積潜在能力を有するバイオマスの呼吸は、２００−ｍｇ−ＣＯＤ／Ｌの刺激ＲＢＣＯＤ濃度に達するようなアセテートのインパルス追加によって、内因性の呼吸速度のレベルから饗宴呼吸のレベルに刺激された。バイオマス刺激容器は、約１８００ｍｇ−ＶＳＳ／ＬのＶＳＳ濃度でよく混合された１リットルの混合液を含んでいた。容器内の石の拡散器に接続された小型の水槽ポンプが、エアレーションのために使用された。

実験は、以下のように進み、すなわち、溶存酸素は、７〜８ｍｇ−Ｏ_２／Ｌの間にされ、その後、エアレーションが止められ、溶存酸素濃度が監視され、ＤＯ値が１０秒毎に記録された。バイオマスの内因性呼吸により溶存酸素が６未満に低下した後の選択された時点で、アセテートが反応器中にパルス状に追加され、呼吸応答が、溶存酸素消費の速度の増加の開始によって監視された。溶存酸素が２ｍｇ−Ｏ_２／Ｌ未満に低下した後、エアレーションがオンにされ、溶存酸素レベルは、レベルが基質消費を示す７〜８ｍｇ−Ｏ_２／Ｌの間の定常状態値に再び増加した後、内因性レベルの呼吸に戻るまで追跡された。呼吸刺激の手順は、次いで、２回繰り返され、全実験手順が再現された。

溶存酸素の傾向は、溶存酸素プローブの経験的に決定された一次遅れ定数について補正され、内因性から刺激された呼吸速度への傾きの傾向は、最小二乗回帰分析によってフィッティングされた。これらのデータから、容器への基質のインパルス追加の時点から刺激された呼吸を示す時点までの遅延時間が推定された。基質濃度の突然の上昇による増加した呼吸のバイオマス刺激の応答時間は、比較的短く、容器内の均一な基質濃度に到達するために必要な混合時間スケールの考慮なしで、１２±３秒であると推定された。したがって、蓄積プロセスの好ましい実施形態における刺激ゾーン内のより高いＲＢＣＯＤ濃度によってバイオマスが影響されるために必要な最短時間は、控えめに、１分程度の時間スケールであると考えられた。

制御システムの実施形態
上述したように、本明細書に記載の方法又はプロセスは、ＲＢＣＯＤに対するリン及び窒素の比をある範囲内に維持することを伴う。一実施形態では、平均して、ＲＢＣＯＤに対する窒素の比は、一般的に、２〜１５ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲内に維持され、ＲＢＣＯＤに対するリンの比は、０．５〜３ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲内に維持される。図１１は、フェドバッチ反応器の１つ又は複数のタンクに向けられ、ＰＨＡ蓄積システムの一部を形成するフィードストリームの構成（特に、窒素、リン、及びＲＢＣＯＤ）を制御するように設計された制御システム１００を示す。図１１に示す制御システムは、１つの例示的な制御システムである。他のものが存在する。加えて、図１２は、フェドバッチ反応器に向けられているフィードストリーム中への窒素、リン、及びＲＢＣＯＤの混合を制御するための１つの例示的な論理制御を説明する論理制御図である。制御システム１００と同様に、図１２の制御論理図２００は、そのような論理制御手法の１つの例示的な実施形態にすぎない。

図１１を参照すると、制御システム１００がそこに示されている。制御システム１００は、ＰＨＡ蓄積プロセスに向けられたＲＢＣＯＤ、Ｎ、及びＰの量を制御するように設計される。上述したように、本発明の方法は、ＲＢＣＯＤに対する窒素及びリンの比をある範囲内に制御することが、蓄積プロセスに供給されるバイオマスからのＰＨＡの生成の質量を増すことを伴う。

制御システム１００は、符号２０によって全体的に示す一連のセンサを含む。センサは、プロセスにオフラインとオンラインの両方で行うことができる測定を具体化するが、一般的には、検出からのデータは、蓄積プロセスのタイムフレーム（典型的には、数分又は数十分）に対して短いタイムフレーム内で提供される。センサ２０は、ＰＨＡ蓄積プロセスの一部を形成するフェドバッチ反応器内のプロセス変数のレベルを感知するように適合される。加えて、制御システム２０は、センサ２０からデータ入力を受信し、制御動作を決定するためのコントローラ４０を含む。コントローラ４０には、一連の栄養素源１２に動作可能に接続された一連のインジェクタが関連付けられる。一実施形態では、栄養素源１２は、１つ又は複数のリンの供給源と、１つ又は複数の窒素の供給源と、１つ又は複数のＲＢＣＯＤの供給源とを含む。プロセスへの少なくとも２つの独立した供給源が存在し、それによって、各供給源は、ＲＢＣＯＤ、Ｎ、又はＰの濃度に関して少なくとも１つの方法で区別される。

センサ２０は、ＰＨＡ蓄積システムのフェドバッチ反応器内に配置されたバイオマスの濃度、及びバイオマス中のＰＨＡのレベルを検出するためのセンサ２２を含む。センサ２４は、フェドバッチ反応器内の混合液のＣＯＤ又はＲＢＣＯＤレベルを検出するために用いられる。センサ２６は、混合液中の窒素レベルを検出するように機能し、センサ２８は、混合液中のリンレベルを検出するように機能する。センサ２０は、一般的に、これらのプロセス変数を連続的に監視することができる。一実施形態では、１つ又は複数のセンサは、赤外線検出のような分光法を取り入れることができる。センサ２２、２４、２６、及び２８からの信号は、それぞれ、導体２３、２５、２７、及び２９を経て、コントローラ４０に導かれる。この例示的な実施形態は、反応器内で生じる測定を示しているが、当業者は、この例示的な例の実施形態又は精緻化が存在し、そこでは、濃度のような他の変数も、フィードにおいて測定することができ、コントローラロジックへの入力として使用することができることを認識する。

コントローラ４０は、当業者には公知の入力信号条件付き機能を含む。さらに、コントローラは、ＲＢＣＯＤに対するＮの比及びＲＢＣＯＤに対するＰの比を制御する目的のためにインジェクタ１５に伝達されるコマンドを形成するロジックを実現するように動作する。コントローラ４０は、また、フェドバッチ反応器内で生じるプロセスが、ＰＨＡが豊富なバイオマスを回収することを必要とする条件を作成するときを決定し、そうでなければプロセスを終了又は一時停止するためのロジックを実現する。一般的に、これらの条件は、概してバイオマス生成の速度に対するバイオマス中のＰＨＡの生成の速度、並びに、増分コスト及び利益、及び／又はフェドバッチ反応器内のＰＨＡ蓄積プロセスを継続するための実際的な制限の考慮に基づく。

ここで、インジェクタ１５及び栄養素源１２を備えるシステムの部分に移ると、各栄養素源は、対応するインジェクタ１５と流体連通することが理解される。栄養素源１２は、様々な栄養素源を含むことができる。好ましい一実施形態では、栄養素源１２は、ＲＢＣＯＤ、窒素、及びリンを組み合わせて含む。供給源１２は、ＲＢＣＯＤ、窒素、及びリンを含む混合物を含むこともできる。必要であれば、例えば、窒素は、塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）などの独立した供給源として提供することができ、リンは、リン酸カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）などの別の独立した供給源として提供することができる。ＲＢＣＯＤは、例えば、原又は前処理された（発酵された）廃水、窒素及びリンの無視できる生物学的に利用可能な形態で揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）を含む溶液として供給することができる。供給源１２は、また、選択された残留物、プロセス、又は、栄養素（窒素及びリン）並びにＲＢＣＯＤの混合物を含む廃水流であり得る。インジェクション（１５）の選択されたバランスによって、ＲＢＣＯＤ：Ｎ：Ｐの比の範囲は、蓄積中に確立することができる。一例では、供給源１２Ａは、内部に含まれた選択された栄養素の流れを、パイプ１１Ａを介してインジェクタ１５Ａに提供する。インジェクタ１５Ａは、供給源１２Ａからの選択された栄養素をフェドバッチ反応器内に注入するように命令される。この場合には、図１１に示すように、栄養素は、パイプ１７Ａを介してパイプ１７に導かれ、そこで、栄養素は、パイプ１７を介して反応器内に導かれるために、コントローラ４０によって指示された任意の他の栄養素と混合される。最後に、ＲＢＣＯＤを含む混合された栄養素は、パイプ１７を介して反応器内に導かれる。

最後に、コントローラ４０は、一実施形態では、上記で説明したように、ＲＢＣＯＤに対するリンの特定の比、及びＲＢＣＯＤに対する窒素の特定の比を達成するように、決定された量のリン、窒素、及び／又はＲＢＣＯＤを供給するようにプログラムされる。一般的には、コントローラは、供給源の水質の初期条件（ＲＢＣＯＤ、窒素、リン、及び他の栄養素のレベル）に基づいて最適な混合を確立することができ、並びに／又は、蓄積中、蓄積混合液における検出された（３０）水質基準の傾向（ＲＢＣＯＤ、窒素、リン、及び他の栄養素のレベル）、若しくはプロセス（４０）におけるバイオマス及びＰＨＡ生成の傾向に基づいて、蓄積中、供給源（１２）の動的な混合を提供することができる。

ここで図１２を参照すると、論理制御図２００がそこに示されている。ロジック２００は、図１１中に示すコントローラ４０内に、当業者には公知のいくつかの形態で実装され得る。ロジック２００は、プロセスを変化させるためにバイオマスのＰＨＡ含有量が観測されている方法に基づいて制御の流れを決定するバイオマスＰＨＡ含有量比較器２１２及び２１４を備える。ロジック２００は、バッチにおけるバイオマスからのＣＯＤ需要がどのように変化しているかに基づいて制御の流れを決定する化学的酸素需要量（ＣＯＤ）消費比較器２１６、２２２、及び２２８も含む。ロジック２００は、予め定められた経済的又は他の動作条件に基づいてプロセスを終了するかどうかを判断することができる経済的基準比較器２２６も含む。例えば、経験に基づいて、バイオマスの特定のタイプ及び反応器のサイズに関して、プロセスを、例えば２４時間を越えて続行することは、不経済であることが観測され得る。一例では、比較器２２６は、総経過処理時間が２４時間に達した、又はそれを超えたとき、プロセスを停止することになる。さらに、それぞれ、制御が各ブロックに進んだときのコントローラ４０によって命令された実施の制御動作を示す制御動作ブロック２１８、２２０、２２４、２３０、及び２３２が、論理２００内に構成される。

ＰＨＡ蓄積プロセスの開始により、ブロック２０１が開始されると、コントローラ４０は、測定及び制御のサイクルを繰り返す際に本例のロジックを実行することができる。各サイクルでは、以下に説明するように、ＲＢＣＯＤ：Ｎ又はＲＢＣＯＤ：Ｐの比を、上下に、一般的には特定の栄養素制限の所望の範囲内に調整しながら、バイオマスのＣＯＤ需要を維持するために、反応器内への様々な栄養素含有材料の注入速度がどれくらいであるべきかが判断される。したがって、任意の制御サイクルでは、システム中への栄養素の流れのいずれか又はすべてを増加させる、一定に保持する、又は減少させると判断することができる。各測定及び制御サイクルの開始は、ブロック２１０の、バイオマス中のＰＨＡの含有量、及びバッチにおけるＣＯＤ消費速度に基づくＣＯＤ需要量の測定により生じる。ＣＯＤ消費速度は、維持ゾーン内のＣＯＤの測定と組み合わせた、既知の供給速度の組み合わせ情報から導出することができる。前記量は、時系列、ＰＨＡ含有量値の時系列、及びＣＯＤ需要量値の時系列として、コントローラ４０内に存在する、又はコントローラ４０とインターフェースするメモリに記憶することができる。第１のサイクルの後、ブロック２１０にも示すように、ＰＨＡ含有量の変化、及びＣＯＤ需要量の変化を、コントローラによって計算することができる。これらの計算は、時間に対する２つの時系列の傾きを推定することを含むことが理解される。ＰＨＡ含有量の正の傾きは、増加するＰＨＡ蓄積状態を示し、ＣＯＤ需要量の正の傾きは、バイオマスによるＲＢＣＯＤの需要量を示す。同様に、ゼロの傾きは、それぞれ、ＰＨＡ含有量及びＣＯＤ需要量の一定の又は安定した値を示し、負の傾きは、減少している値を示す。傾きは、定常動作中の一連の先行サイクルにわたって平均することによって決定することができることがさらに理解される。

各サイクルでは、次いで、ブロック２１０でＰＨＡ含有量及びＣＯＤ需要量を測定した後、比較器ステップ２１２は、ＰＨＡ含有量が増加しているか否かを判断する。ＰＨＡが増加している（正の傾き）と思われる場合、制御は、比較器２１６に進み、そこで、ＣＯＤ需要量が減少しているかどうかについての判断が行われる。ＣＯＤ需要量が減少している（負の傾き）場合、より多くの栄養素を注入し、ＣＯＤ供給速度を調整するために、インジェクタ１５へのコマンドがコントローラ４０によって発せられ、制御は、次の測定及び制御サイクルのためのブロック２１０に戻る。栄養素を増加させる判断は、所望のＲＢＣＯＤ：Ｎ：Ｐの比及び測定されたＣＯＤ、Ｎ、及びＰを維持することに基づいて行うことができる。すなわち、例えば、ＮがＣＯＤ及びＰに対して低すぎる場合、インジェクタ１５Ａ〜１５Ｄの中のＮ含有材料を注入するために割り当てられたインジェクタが、コントローラ４０によって命令されることになる。別の例として、ＣＯＤ及びＰが、各々Ｎに対して低い場合、ＲＢＣＯＤ及びＰを注入するために割り当てられたインジェクタが、コントローラ４０によって活性化されることになる。このとき、Ｎ含有材料、Ｐ含有材料、及びＲＢＣＯＤ含有材料の配列のいずれかが、おそらくは、ＲＢＣＯＤ：Ｎ：Ｐの比を所望の範囲と一致させように混合され、注入されることが理解される。

ここでブロック２１８に進むと、比較結果が、ＣＯＤ需要量が減少していない（正でない）という結果であった場合、コマンドは、ブロック２２０に進み、そこでは、コントローラ４０は、栄養素注入の変化がないことを要求され、栄養素注入速度を一定に保持するか、又は、ＲＢＣＯＤ：Ｎ：Ｐ比を所望の範囲内にするために、１つ若しくは複数の栄養素注入速度が減少されるべきであるのかのいずれかを判断する。制御は、次いで、次の測定及び制御サイクルのためのブロック２１０に戻る。

ここで、比較器２１２に進むと、比較の結果が、ＰＨＡ含有量が増加していない（傾きが正でない）場合、ＰＨＡが一定（ゼロの傾き）又は減少している（負の傾き）であるかどうかを判断するために、制御は、ＰＨＡ比較器２１４に進む。ＰＨＡ含有量の連続のゼロの傾きの場合には、制御は、ＣＯＤ需要量が減少している（負の傾き）かどうかを判断するための比較器２２８に進む。ＣＯＤ需要量が減少している場合、制御は、これまで説明してきたように、コントローラ４０が１つ又は複数の栄養素の注入速度の増加を指示することを示すブロック２３２に進み、制御は、次いで、次の測定及び制御サイクルのためのブロック２１０に進む。他方では、ブロック２２８で、ＣＯＤ需要量が減少していない（ＣＯＤの傾きが負ではない）と判断した場合、これまで説明してきたように、栄養素注入を変化させないことがコントローラ４０によって指示されるか、ＲＢＣＯＤ：Ｎ：Ｐの比を所望の範囲内にするために、１つ又は複数の栄養素の注入速度が減少させられる。制御は、次いで、次の測定及び制御サイクルのためのブロック２１０に進む。

再び比較器２１４に進むと、この場合では、傾きが負である（ＰＨＡ含有量が減少している）ことを意味する、ＰＨＡ含有量が一定でないと判断された場合、制御は、ＣＯＤ消費速度がどのように変化しているのかにアクセスするためのＣＯＤ需要量比較器２２２に進む。ＣＯＤ需要量が減少しているとは思われない場合、栄養素の過剰は、本当であり、ＲＢＣＯＤ：Ｎ：Ｐの比を範囲内にするために、１つ又は複数の栄養素の注入速度は、減少される。制御は、次いで、経済的基準比較器２２６に進む。この時点で、特定の経済的又は他の動作条件が満たされているかどうかに基づいて、制御は、次の測定及び制御サイクルのためのブロック２１０に戻るか、プロセスを停止させるブロック２０２に進む。

ＣＯＤ需要量比較器２２２に向かうと、ＣＯＤ需要量が増加していると思われる場合、制御は、プロセスを停止させるブロック２０２に進む。すなわち、増加したＣＯＤ消費速度を伴う減少するＰＨＡ含有量レベルは、ＰＨＡの生成に関する収穫逓減点に達していることを示すことができる。

工業的実施形態
図１０に向かうと、本明細書に記載の方法の例示的な工業的実施形態が提供されている。フェドバッチプロセスの開始時に、混合液中のバイオマスの新鮮なバッチが、３０Ａを介して維持ゾーン５０Ｂ内に送達される。混合液中のバイオマスの少なくとも小部分は、ポンプ１０Ａによって、通路３０Ｂを通って、刺激ゾーン５０Ａ内に循環される。いくつかの実施形態では、刺激ゾーン５０Ａは、タンクであってもよい。いくつかの実施形態では、刺激ゾーンのボリュームは、維持ゾーンのボリューム内に組み込まれてもよいが、物理的構造によって、維持ゾーンから分離される。他の実施形態では、刺激ゾーン５０Ａは、バイオマスのための上昇した（刺激する）濃度のＲＢＣＯＤとの接触ゾーンを提供するチューブ内の混合ゾーンであってもよい。さらに他の実施形態では、刺激ゾーンは、刺激ゾーンに配置されたバイオマスが少なくとも２０秒の水力学的滞留時間を可能にするのに十分なボリュームのものである。

ＲＢＣＯＤ、生物学的に利用可能なＮ、及び生物学的に利用可能なＰを含むストリームを含む様々な栄養素供給源１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、及び図１２Ｄは、混合ステーション１７で、調整されたフィードを形成するために、一緒に混合される。コントローラ４０は、インジェクタ１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、及び１５Ｄを介して混合物に加えられる各供給源１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄの量を制御する。コントローラ４０は、刺激ゾーン５０Ａ及び維持ゾーン５０Ｂからの測定値から得られたデータ２０Ａ及び／又は２０Ｂを分析することによって、インジェクタ１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、及び１５Ｄから混合する量を決定する。そのようなデータは、とりわけ、そこからＲＢＣＯＤ、Ｎ、及び／又はＰの濃度、並びに、バイオマス及びＰＨＡ生成速度の傾向を決定することができる測定値を含む。センサ２０Ａ及び２０Ｂからのデータは、バイオマス呼吸速度を測定するのに十分なデータを含むこともできる。コントローラ４０は、次いで、調整されたフィード中のＮ：ＲＢＣＯＤが２〜１５ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤの間になり、調整されたフィード中のＰ：ＲＢＣＯＤが０．５〜３ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤの間になるように、インジェクタ１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、及び１５Ｄを調整し、ＲＢＣＯＤの供給速度を確立する。

混合ステーション１７で混合した後、調整されたフィードのストリームは、刺激ゾーン５０Ａ内で、バイオマスを含む混合液の画分と混合される。画分は、次いで、維持ゾーン５０Ｂ中にリサイクルされる。バイオマス中の混合液は、維持ゾーン５０Ｂ内の平均ＲＢＣＯＤ濃度が刺激ゾーン５０Ａ内の平均ＲＢＣＯＤ濃度の半分未満になるような速度でリサイクルされる。１７からの流入基質供給速度、及びリサイクル速度は、センサ２０Ａ及び／又は２０Ｂからのデータに基づいて決定することができる。いくつかの実施形態では、リサイクル速度は、とりわけコントローラ４０によって制御することができる。

混合液中のバイオマスは、ポンプ１０Ｂを介して維持ゾーンから除去し、沈降タンク又はクラリファイア５０Ｃに送ることができる。タンクは、バイオマスが沈降することを可能にし、除去することができる放流水３０Ｄを生成する。沈降したバイオマスは、ポンプ１０Ｃによって沈降タンク５０Ｃから除去し、チューブ３０Ｃを介して維持ゾーンに再循環させることができ、及び／又は回収する（３０Ｅ）ことができる。

いくつかの実施形態は、コントローラ４０、センサ２０Ａ及び２０Ｂ、供給源１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄ、インジェクタ１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、及び１５Ｄ、並びに混合ステーション１７を、ＷＯ２０１１−０７０５４４Ａ２に記載のシステムと組み合わせることができることに留意されたい。したがって、ＷＯ２０１１／０７０５４４Ａ２は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

注意：以下の変換係数が使用された：酢酸１ｇ＝ＣＯＤ１．０６６７ｇ；３−ＨＢ１ｇ＝ＣＯＤ１．６７ｇ；ＶＳＳ１ｇ＝ＣＯＤ１．４５ｇ；Ｘａ１ｇ＝ＣＯＤ１．４５ｇ、ここで、Ｘａは、非ＰＨＡのＶＳＳ（Ｘａ＝ＶＳＳ−ＰＨＡ）。Ｘ_ａ０は、フェドバッチ蓄積プロセスによって提供された初期の活性バイオマスを指す。Ｓは、基質としてのＲＢＣＯＤを指す。

Claims (32)

1. 開放混合培養物からＰＨＡリッチなバイオマスを生産する需要時供給フェドバッチ方法であって、
   バイオマスを含む混合液を、少なくとも１つのバイオマス刺激ゾーンと少なくとも１つのバイオマス維持ゾーンとを含むフェドバッチ反応器に導くことと、
   生物利用可能な窒素（Ｎ）及びリン（Ｐ）とともに容易に生分解可能な化学的酸素要求量（ＲＢＣＯＤ）を含むフィードを与えることと、
   ＲＢＣＯＤに対するＮの平均の比率が２から１５ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲に入る調整されたフィードを得るように、ＲＢＣＯＤ濃度に対する前記生物利用可能なＮの濃度を調整することと、
   ＲＢＣＯＤに対するＰの平均の比率が０．５から３ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲に入る調整されたフィードを得るように、ＲＢＣＯＤ濃度に対する前記生物利用可能なＰの濃度を調整することと、
   前記反応器内の前記バイオマスの少なくとも一分画についてのバイオマス呼吸速度を、前記バイオマスが平均して当該バイオマスの現存最大呼吸速度の５０％よりも大きくなるように刺激されるように、前記バイオマスの前記一分画を前記刺激ゾーンにおいて前記調整されたフィードにさらすことにより、間欠的にかつ繰り返し刺激することと、
   前記刺激ゾーンにおいて前記バイオマスの前記一分画を前記調整されたフィードにさらした後に、前記刺激ゾーンから、平均ＲＢＣＯＤ濃度が前記刺激ゾーンにおける平均ＲＢＣＯＤ濃度の半分よりも小さい前記維持ゾーンへと、バイオマスの前記一分画の少なくとも一部を移送することと、
   高い呼吸速度に達するためにバイオマスの分画が繰り返し前記刺激ゾーンへと供給された前記調整されたフィードにさらされ、前記バイオマスはそうではなければ前記維持ゾーンにおけるより低いＲＢＣＯＤ濃度に維持されるように、前記刺激ゾーンと前記維持ゾーンとの間でバイオマスを含む前記混合液を行ったり来たり循環させることと、
   を含むことを特徴とする方法。
2. 前記バイオマスの呼吸速度により創出された需要に比例する速度で前記調整されたフィードを前記刺激ゾーンに供給することを更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記フィードは、前記刺激ゾーンに供給されるフィードにおいて、ＲＢＣＯＤに対する窒素を選択された濃度で提供するために、少なくとも２つの異なる供給源から混合されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 前記フィードは、前記刺激ゾーンに供給されるフィードにおいて、ＲＢＣＯＤに対して、リンを選択された濃度で提供するために、少なくとも２つの異なる供給源から混合されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. 前記フェドバッチ反応器における、及び／又は前記フェドバッチ反応器に供給されるリン、窒素、及び／又はＲＢＣＯＤの濃度を測定することと、かつ前記測定された濃度に応じて、前記刺激ゾーンに供給されるフィードにおける窒素、リン、及び／又はＲＢＣＯＤの濃度を調整することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. 前記フェドバッチ反応器におけるバイオマスについて、前記バイオマスのＰＨＡ含有量及び／又はバイオマスのＰＨＡ含有量の変化の時間速度を測定することと、前記測定した含有量又は含有量の経時変化に応じて、前記刺激ゾーンに供給されたフィードにおいて確立された窒素、リン、及び／又はＲＢＣＯＤの濃度を調整することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. 前記フェドバッチ反応器におけるバイオマスについて、前記バイオマスの呼吸速度及び／又はバイオマスの呼吸速度の変化の時間速度を測定することと、前記測定した呼吸速度又は呼吸速度の経時変化に応じて、前記刺激ゾーンに供給されたフィードにおいて確立された窒素、リン、及び／又はＲＢＣＯＤの濃度を調整することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
8. 前記フェドバッチ反応器におけるバイオマスについて、ＣＯＤの消費速度及び／又はＣＯＤの消費速度の変化の時間速度を測定することと、前記測定したＣＯＤの消費速度又はＣＯＤの消費速度の経時変化に応じて、前記刺激ゾーンに供給されたフィードにおいて確立された窒素、リン、及び／又はＲＢＣＯＤの濃度を調整することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
9. 請求項６〜８に記載の方法の少なくとも２つの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記フェドバッチ反応器は、少なくとも２つのタンクを含み、少なくとも１つのタンクは前記刺激ゾーンを含み、少なくとも１つのタンクは前記維持ゾーンを含み、前記フェドバッチ反応器へのフィードは、前記刺激ゾーンを含むタンクへ導かれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
11. 前記刺激ゾーンのボリュームは、前記刺激ゾーンに配置されたバイオマスが少なくとも２０秒の水力学的滞留時間を提供するのに十分なボリュームであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
12. 前記刺激ゾーンのボリュームは、前記維持ゾーンのボリューム内に組み込まれるが、前記刺激ゾーンのボリュームは物理的構造によって少なくとも部分的に前記維持ゾーンから分離されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
13. 生物学的廃水処理システムにおいて、廃水流を生物学的に処理することと、前記廃水流から前記混合液とバイオマスを分離し、前記フェドバッチ反応器に混合液とバイオマスを導くことを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
14. 前記バイオマスを含む混合液を継続的に、前記刺激ゾーンと前記維持ゾーンの間に前後に循環させ、バイオマスのＰＨＡ含有量が、平均して０．４０ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳより高くなるまで、前記ＲＢＣＯＤに対するリン及び窒素の比率を前記範囲内に継続的に維持することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
15. フェドバッチ操作中に、かつバッチプロセスの終了前に、前記プロセスから前記バイオマスの少なくとも一分画を収集することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
16. いったん前記バイオマスのＰＨＡ含有量が０．４０ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳより高くなった時に、フェドバッチ操作中に前記プロセスから前記バイオマスの少なくとも一分画を収集し始めることを含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. バイオマスが平均して現存最大呼吸速度の７０％よりも大きくなるように刺激されるように、バイオマス呼吸速度を刺激することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
18. 前記バイオマスは、前記フェドバッチ反応器に導かれる前に生物学的廃水処理プロセスから収集され、収集されたバイオマスのＰＨＡ含有量は、乾燥バイオマス重量の１０％より少ないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
19. 前記混合液を前記フェドバッチ反応器に導く前に、前記混合液を前処理することを含み、前処理は、前記フェドバッチ反応器に導かれる混合液における、リン及び窒素の濃度を低下させるように、混合液を濃化することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
20. 前記混合液の濃化後に、前記混合液におけるリン及び窒素の濃度をさらに低下させるために、前記混合液に希釈液を添加することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
21. 開放混合培養物からＰＨＡリッチなバイオマスを生産する需要時供給フェドバッチ方法であって、
    バイオマスを含む混合液を、少なくとも１つのバイオマス刺激ゾーンと少なくとも１つのバイオマス維持ゾーンとを含むフェドバッチ反応器に導くことと、
    生物利用可能なＮ及びＰとともにＲＢＣＯＤを含むフィードを前記フェドバッチ反応器に導くことと、
    前記フィードを前記フェドバッチ反応器に導き、かつ前記刺激ゾーンにおいて、前記バイオマスを比較的に高い濃度のＲＢＣＯＤにさらすことにより、前記バイオマスの少なくとも一部の呼吸速度を間欠的にかつ繰り返し刺激することと、
    前記刺激ゾーンにおいて、前記バイオマスが前記比較的に高い濃度のＲＢＣＯＤにさらされた後に、前記バイオマスが比較的に低い濃度のＲＢＣＯＤにさらされる前記維持ゾーンへと前記バイオマスを移送し、
    前記刺激ゾーンと前記維持ゾーンとの間で前記バイオマスを行ったり来たり循環させることと、
    ＲＢＣＯＤに対するＮの比率とＲＢＣＯＤに対するＰの比率を制御することにより、前記フェドバッチ反応器に導かれた前記フィードにおけるＲＢＣＯＤ濃度に対するＮ及びＰの濃度を制御することと、
    を含むことを特徴とする方法。
22. ＲＢＣＯＤに対するＮの平均の比率が２〜１５ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲に入る調整されたフィードを得るように、ＲＢＣＯＤ濃度に対する生物利用可能なＮの濃度と、及びＲＢＣＯＤに対するＰの平均の比率が０．５〜３ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲に入る調整されたフィードを得るように、ＲＢＣＯＤ濃度に対する生物利用可能なＰの濃度とを調整することによって、前記フィードにおけるＲＢＣＯＤに対するＮ及びＰの濃度を制御することを含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
23. 前記フェドバッチ反応器における前記混合液におけるＮの濃度及びＰの濃度を測定することと、予め決定された範囲内で選択された比率を得るように、前記フィードにおけるＲＢＣＯＤに対するＮの比率又はＲＢＣＯＤに対するＰの比率を調整することと、を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
24. 前記フェドバッチ反応器におけるバイオマスのＰＨＡ含有量、バイオマスの呼吸速度、及びＣＯＤ消費速度の変化のうちの少なくとも１つを推測する信号を測定することと、前記信号の１つ以上に基づいて、予め決定された範囲内で選択された比率を得るように、前記フィードにおけるＲＢＣＯＤに対するＮの比率又はＲＢＣＯＤに対するＰの比率を調整することと、を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
25. 前記フェドバッチ反応器における前記混合液又は前記フィードにおけるＮ、Ｐ、及びＲＢＣＯＤを測定するためにセンサが使用され、前記センサはデータをコントローラに導くように動作可能であり、前記データはＰ、Ｎ、及びＲＢＣＯＤのうちの少なくとも１つの濃度を表すものであり、前記コントローラは、ＲＢＣＯＤに対するＮの比率及びＲＢＣＯＤに対するＰの比率を、当該比率が平均して予め選択された範囲に入るように制御することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
26. バイオマスのＰＨＡ含有量、バイオマスの呼吸速度、及びＣＯＤの消費速度のうちの少なくとも１つの比例する変化を測定又は推測するためにセンサが使用され、前記センサはデータをコントローラに導くように動作可能であり、前記データはフィード供給におけるＰ、Ｎ、及びＲＢＣＯＤのうちの少なくとも１つの濃度を表すものであり、前記コントローラは、ＲＢＣＯＤに対するＮの比率及びＲＢＣＯＤに対するＰの比率を、当該比率が平均的に予め選択された範囲に入るように制御することを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
27. ＲＢＣＯＤに対するＮの平均の比率が２〜１５ｍｇ−Ｎ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲に入る調整されたフィードを得るようにＲＢＣＯＤの濃度に対する生物利用可能なＮの濃度を調整することにより、前記フィードにおけるＲＢＣＯＤに対するＮの濃度を制御することを含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
28. ＲＢＣＯＤに対するＰの平均の比率が０．５〜３ｍｇ−Ｐ／ｇ−ＲＢＣＯＤの範囲に入るフィードを得るようにＲＢＣＯＤの濃度に対する生物利用可能なＰの濃度を調整することにより、前記フィードにおけるＲＢＣＯＤに対するＰの濃度を制御することを含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
29. 前記フェドバッチ反応器中の前記バイオマスについて、バイオマスのＰＨＡ含有量とバイオマスのＰＨＡ含有量の変化の時間速度との少なくとも一方を測定することと、前記測定した含有量又は時間による含有量の変化に応じて、前記刺激ゾーンに供給される前記フィードにおいて確立された窒素、リン、及びＲＢＣＯＤのうちの少なくとも１つの濃度を調整することと、を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
30. 前記フェドバッチ反応器中の前記バイオマスについて、バイオマスの呼吸速度とバイオマスの呼吸速度の変化の時間速度との少なくとも一方を測定することと、前記測定した呼吸速度又は時間による呼吸速度の変化に応じて、前記刺激ゾーンに供給される前記フィードにおける窒素、リン、又はＲＢＣＯＤの濃度を調整することと、を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
31. 前記バイオマスを含む混合液を継続的に、前記刺激ゾーンと前記維持ゾーンの間に前後に循環させ、バイオマスのＰＨＡ含有量が、平均して０．４０ｇ−ＰＨＡ／ｇ−ＶＳＳより高くなるまで、前記ＲＢＣＯＤに対するリン及び窒素の比率を前記範囲内に継続的に維持することを含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
32. バイオマスが平均して現存最大呼吸速度の７０％よりも大きくなるように刺激されるように、バイオマス呼吸速度を刺激することを特徴とする、請求項２１に記載の方法。

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