JP2016503434A - ケモカイン−サイトカイン融合タンパク質およびその利用 - Google Patents

Abstract

増進されたサイトカイン活性と増進されたケモカイン活性を有する、融合タンパク質の提供。本発明の融合タンパク質は、ケモカインまたはその受容体結合ドメインであるケモカインポリペプチドと、インターロイキン、ＴＮＦ−スーパーファミリーサイトカイン、またはその受容体結合ドメインであり、前記ケモカインポリペプチドに結合されたサイトカインポリペプチドを含み、そのうち、前記ケモカインポリペプチドと前記サイトカインポリペプチドが共通標的細胞を有し、前記融合タンパク質が、前記ケモカインポリペプチドと比較して、より増進されたケモカイン活性と、前記サイトカインポリペプチドと比較して、より増進されたサイトカイン活性を有する。

Description

本発明は、ケモカインとそれに結合されたサイトカインを含み、そのうちケモカインとサイトカインが共通標的細胞を有する融合タンパク質に関し、特に、増進されたサイトカイン活性と増進されたケモカイン活性を有する、融合タンパク質に関する。

サイトカインは、外部から刺激を受けた細胞が分泌するプロテインの一群である（細胞膜上に発現するサイトカインは非常に少ない）。細胞によって産生されたサイトカインは付近のまたは血液循環を通じて非常に低濃度で標的細胞に影響を生じることができる。サイトカイン標的細胞の成長、分化、活性化の促進などの幅広い機能を持つ。多くのサイトカインが免疫細胞を標的として、免疫反応で役割を果たすことができる。構造と機能の違いに基づき、サイトカインは概ねケモカイン、インターロイキン、成長因子、トランスフォーミング成長因子、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン等に分けることができる。

ケモカインは白血球を遊走させることができるサイトカインの一群で、通常正電荷を帯び、粒子が小さい分泌タンパク質である。主な機能は組織の損傷や病原体感染を有する領域に免疫細胞を遊走させ、続いてその特定の部位で白血球が食作用を生じたり、病原体に対する炎症反応を起こしたりすることができるようにすることである。ケモカインによって遊走される白血球には、先天免疫の好中球、単球／マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、樹枝状細胞、その他白血球、および適応免疫のＴリンパ球（Ｔ細胞）またはＢリンパ球（Ｂ細胞）を含むことができる。従って、ケモカインは生体の免疫系で非常に重要な役割を果たす。ほとんどのケモカインは、ジスルフィド結合を形成して構造を安定化している４つの良く保存されたシステイン残基（Ｃ）を有する。最初の２つのＣ間のアミノ酸数の違いおよび最初のＣがあるか否かに基づき、それらはＣＸＣ（またはα）、ＣＣ（またはβ）、Ｃ（またはγ）、ＣＸ_３Ｃの４つのサブファミリーに分類できる。ストローマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）は、ケモカインのＣＸＣサブファミリーに分類され、ＣＸＣリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）としても知られており、哺乳動物のヒト、マウス、猫、および両生類のゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ゼブラフィッシュを含む多くの種で観察され、異なる種の間で変化は小さく、よく保存されている（Ｓｈｉｒｏｚｕ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２８、４９５〜５００）。マウスとヒトにおいてＳＤＦ−１遺伝子から転写されるｍＲＮＡは異なるスプライシングを経るため、ＳＤＦ−１の２つのアイソフォーム、ＳＤＦ−１αとＳＤＦ−１βを観察することができる。ＳＤＦ−１の分布は非常に広く、リンパ組織、腎臓、肺、肝臓、脳、筋肉などで検出することができる（Ｓｈｉｒｏｚｕ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２８、４９５〜５００）。ＳＤＦ−１受容体ＣＸＣＲ４は器官に一貫して存在するだけでなく、造血幹細胞、内皮細胞、樹枝状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞でも見られるため、これらの細胞はＳＤＦ−１による影響を受け、ケモカインの濃度が高い部位に移動する（Ｂｌｅｕｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３８２：８２９〜８３３；Ｏｂｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３８２：８３３〜８３５；Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２９、１４３〜１５２）。インターロイキン−８（ＩＬ−８）もケモカインのＣＸＣサブファミリーに分類される（ＣＸＣＬ８としても知られている）。ヒトにおける最初の発見後、豚や牛、鶏などの経済動物でも発見された。ＩＬ−８は低濃度で単球、マクロファージ、リンパ球、好中球などを含め複数の免疫細胞を遊走させることができる。

ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属し、腫瘍壊死と白血球細胞の分化、増殖、アポトーシスを促進する作用を有するサイトカインである。ＣＤ４０Ｌは膜貫通タンパク質として合成される。たとえば、ヒトＣＤ４０Ｌは、タンパク質が計２６１個のアミノ酸を有し、その構造はアミノ末端から２２個のアミノ酸で構成される細胞内ドメイン、それに続く２４個のアミノ酸で構成される膜貫通ドメイン、そして、２１５個のカルボキシ末端アミノ酸で構成される細胞外ドメイン（Ｅｘｃ）から成り、そのうちＥｘｃドメインはそのカルボキシ末端にすべてのＴＮＦスーパーファミリータンパク質のために確保されたＴＮＦホモロジー（ＴＮＦｈ）ドメインを有する。ＣＤ４０Ｌは主に膜貫通タンパク質の形式で活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞の表面に存在し、またＣＤ８^＋Ｔ細胞、好塩基球、好酸球、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、血小板、さらにはＣＤ４０発現細胞の表面にも存在する。

ＣＤ４０Ｌの受容体であるＣＤ４０は、Ｂ細胞、樹枝状細胞、マクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に分布する。生理学的に、これらの抗原提示細胞はヘルパーＴ細胞によって発現されるＣＤ４０Ｌにより活性化され、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）分子とＢ７分子の発現を促進し、抗体提示をアシストすることができる。ＣＤ４０Ｌは標的細胞上のＣＤ４０に結合することでシグナル伝達経路を活性化する。前述の抗体提示の促進に加え、Ｂ細胞への効果として、ＣＤ４０ＬはＢ細胞増殖、免疫グロブリンアイソタイプスイッチング、抗体分泌、メモリーＢ細胞の分化、またはアポトーシスの防止を促進することができ、マクロファージへの効果として、ＣＤ４０Ｌはその活性、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）またはケモカインの分泌を活性化するインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の産生、あるいはマクロファージの抗菌作用を促進する一酸化窒素（ＮＯ）の産生を高めることができ、樹枝状細胞への効果として、その成熟と活性化を促進し、成熟した樹枝状細胞に大量のＭＨＣ−ＩＩ分子を発現させて抗体提示を促進するだけでなく、ＴＮＦ−αとＩＬ−８、マクロファージ炎症性蛋白質１a（ＭＩＰ−１a）等のケモカインも分泌させることができる。

ＣＤ４０Ｌをワクチンアジュバントまたは治療に適用する多くの研究があり、例えば、カモＢ型肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ）ワクチン用アジュバント（Ｇａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３、９５８〜９６５）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＤＮＡワクチン（Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０、１７６２〜１７７２）、またはヒト自己免疫疾患の治療（Ｈｏｗａｒｄ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ３７、４１１〜４１８）等がある。

ＩＬ−２はヘマトポエチンファミリーに属し、このファミリーには数々の細胞成長関連ホルモンやその他サイトカイン等が含まれる。ＩＬ−２の機能には、Ｔ細胞の成熟と分化の調整、Ｂ細胞の増殖と抗体分泌の促進、ナチュラルキラー細胞の細胞毒性促進、単球とマクロファージの活性化等が含まれる。またＩＬ−２は、Ｔ細胞とＢ細胞のＭＨＣ発現継続を刺激でき、さらにナチュラルキラー細胞によるＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などを含む複数の異なるサイトカイン産生も促進することができる。研究によると、ＩＬ−２は抗腫瘍およびワクチン強化効果も備えている。

しかしながら、関連分野では活性が増進されたサイトカインとケモカインが必要とされている。

Ｓｈｉｒｏｚｕ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２８、４９５〜５００ Ｂｌｅｕｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３８２：８２９〜８３３ Ｏｂｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３８２：８３３〜８３５ Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２９、１４３〜１５２ Ｇａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３、９５８〜９６５ Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０、１７６２〜１７７２ Ｈｏｗａｒｄ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ３７、４１１〜４１８

本発明において、ケモカインと、前記ケモカインに結合されたサイトカインから構成される融合タンパク質が、増進されたサイトカイン活性とケモカイン活性を備えていることが予期せず発見された。

従って、本発明の目的は、増進されたサイトカイン活性と増進されたケモカイン活性を有する、融合タンパク質を提供することにある。

本発明は、ケモカインまたはその受容体結合ドメインであるケモカインポリペプチドと、インターロイキン、ＴＮＦ−スーパーファミリーサイトカイン、またはその受容体結合ドメインであり、前記ケモカインポリペプチドに結合された、サイトカインポリペプチドを含み、そのうち、前記ケモカインポリペプチドと前記サイトカインポリペプチドが共通標的細胞を有する、融合タンパク質を提供する。前記融合タンパク質は、前記ケモカインポリペプチドと比較して、より増進されたケモカイン活性と、前記サイトカインポリペプチドと比較して、より増進されたサイトカイン活性を有する。

本発明によると、前記ケモカインはＣＸＣケモカイン、ＣＣケモカイン、Ｃケモカイン、およびケモカインＣＸ_３Ｃであり、好ましくはＣＸＣケモカインである。本発明の一実施態様によると、前記ケモカインは、ストローマ細胞由来因子（ＳＤＦ−１）またはＩＬ−８とすることができる。

本発明によると、前記サイトカインポリペプチドは、インターロイキン、ＴＮＦ−スーパーファミリーサイトカイン、またはその受容体結合ドメインである。本発明の一実施態様において、前記サイトカインポリペプチドは、ＩＬ−２、ＣＤ４０リガンド、またはその受容体結合ドメインである。

別の一様態によれば、本発明は、本発明の融合タンパク質をエンコードする単離された核酸分子を提供する。

さらに別の一様態によれば、本発明は、本発明の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。

また、本発明は、本発明の発現ベクターまたは本発明の核酸分子を含む宿主細胞も提供する。

本発明の多様な実施態様の詳細について以下で説明する。実施態様の詳細な説明および請求項から本発明のその他の特徴が明らかになるであろう。

更なる詳細な説明なく、上述の説明に基づき、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者が本発明をその最大の範囲で利用することが可能であると考えられる。以下の詳細な説明は例を挙げたものであり、他の開示を一切限定するものではないと理解されるべきである。

本発明の前述の概要および以下の詳細な説明は、添付の図面を組み合わせることでより理解できるであろう。

鶏ＣＤ４０Ｌとその誘導タンパク質、ＣＤ４０Ｌ_ＥｘｃおよびＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈの概略図である。 発現された鶏組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット分析の結果を示す図である。レーン１：ＩＬ８ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ、予期される大きさ５２ｋＤａ；レーン２：ＩＬ８ＩＬ２、予期される大きさ４４ｋＤａ；レーン３：ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ、予期される大きさ３８ｋＤａ；レーン４：ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈ、予期される大きさ４４ｋＤａ；レーン５：ＳＤＦ１ＩＬ２、予期される大きさ２６ｋＤａ。 精製単一タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット分析の結果を示す図である。レーン１：タグ融合タンパク質、予期される大きさ２１ｋＤａ；レーン２：ＩＬ−８、予期される大きさ１３ｋＤａ；レーン３：ＳＤＦ−１、予期される大きさ１１ｋＤａ；レーン４：ＩＬ−２、予期される大きさ３２ｋＤａ；レーン５：ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ、予期される大きさ４２ｋＤａ；レーン６：ＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈ、予期される大きさ３３ｋＤａ。 ＩＬ−８誘導タンパク質によるＰＢＭＣの走化性を示す図である。寒天外のケモカインによって遊走された細胞は、寒天の中央から周囲に向かって移動する。細胞は低拡大率では濁りのように見える。周囲により多くの細胞があるということは細胞走化性の程度がより高いことを示す。２μＭで、ＩＬ８ＣＤ４０Ｌ_ＥｘｃまたはＩＬ８ＩＬ２の走化性程度は、単一のＩＬ−８タンパク質より有意に高かった。 ＳＤＦ−１誘導タンパク質によるＰＢＭＣの走化性を示す図である。２μＭで、ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ、ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈ、またはＳＤＦ１ＩＬ２の走化性程度は、単一のＳＤＦ−１タンパク質より有意に高かった。 マクロファージを活性化させてＮＯを産生させるＣＤ４０Ｌ誘導タンパク質の活性を示す図である。Ａ：ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ；Ｂ：ＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈ；Ｃ：ＩＬ８ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ；Ｄ：ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ；Ｅ：ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈ；対照群：陽性対照群としてＬＰＳ（４μｇ／ｍｌ）、陰性対照群として標識タンパク質（２５０ｎＭ）と培養液。＊は単一のタンパク質と比較して有意に高い活性を表す（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）。 ＩＬ−２融合タンパク質のリンパ球増殖促進に対する試験結果を示す図である。刺激指数（ＳＩ）＝試験群のＯＤ／ＲＰＭＩ １６４０のみで培養されたもののＯＤ。０．６２５−１６０ｎＭの濃度で、ＳＤＦ１ＩＬ２融合タンパク質のＳＩ値はＩＬ−２単独の群より有意に高かった（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１）。 ニューカッスル病（ＮＤ）ワクチンのアジュバントとしてのＩＬ−２融合タンパク質が細胞免疫反応を有意に促進できることを示す図である。ＩＬ−２融合タンパク質アジュバントとＮＤワクチンの投与を受けた群の鶏は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）抗原の再刺激でＮＤワクチン群よりも有意に高いメモリーリンパ球の増殖を示した。 伝染性気管支炎（ＩＢ）ワクチンのアジュバントとしての融合タンパク質が細胞免疫反応を有意に促進できることを示す図である。伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）に対して抗原再刺激試験が実施された。ＩＬ−２融合タンパク質アジュバントとＩＢワクチンの投与を受けた群の鶏は、ＩＢワクチン群よりも有意に（ｐ＜０．０１）高いメモリーリンパ球の増殖を示した。ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ融合タンパク質アジュバントとＩＢワクチンの投与を受けた群の鶏は、ＩＢワクチン群よりも有意に（ｐ＜０．０５）高いメモリーリンパ球の増殖を示した。

別途定義がある場合を除き、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が一般的に理解する意味を持つ。

本明細書で使用される単数形（「一」および「その」、「これ」など）は、文脈から明確にそうでないことが示されている場合を除き、複数の指示対象を指す。

本明細書で使用される用語「ケモカインポリペプチド」とは、ケモカインまたはその受容体結合ドメインであるポリペプチドを指し、そのうち、ケモカインはＣＸＣケモカイン、ＣＣケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ_３Ｃケモカインを含むが、これらに限らない。

本明細書で使用される用語「サイトカインポリペプチド」は、サイトカインまたはその受容体結合ドメインであるポリペプチドを指し、そのうち、サイトカインはインターロイキンとＴＮＦ−スーパーファミリーのサイトカインを含むが、これらに限らない。

本明細書で使用される用語「ケモカイン活性」とは、ケモカインが体内で具備する、または発揮できる活性を指し、多様な免疫細胞（単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹枝状細胞、好中球等を含む）の走化性を含むがこれに限らない。

本明細書で使用される用語「サイトカイン活性」とは、サイトカインが生物体内で具備する、または発揮できる活性を指し、Ｂ細胞の増殖促進、免疫グロブリンクラススイッチおよび抗体分泌;メモリーＢ細胞の分化、またはそれらのアポトーシス防止；Ｉ型ヘルパーＴ細胞の活性化またはケモカイン分泌のためのマクロファージのインターロイキン−１２分泌促進；微生物に対する防御能力強化のためのマクロファージによる一酸化窒素産生の促進；樹枝状細胞の成熟および活性化の促進；Ｔ細胞の成熟および分化の調整；ナチュラルキラー細胞の細胞毒性と、多様な異なるサイトカイン産生の促進；単球およびマクロファージの活性化；Ｔ細胞およびＢ細胞の刺激による連続的なＭＨＣ発現等を含むがこれらに限らない。

本発明の提供する融合タンパク質は、ケモカインまたはその受容体結合ドメインであるケモカインポリペプチドと、インターロイキン、ＴＮＦ−スーパーファミリーサイトカインまたはその受容体結合ドメインであり、ケモカインポリペプチドに結合された、サイトカインポリペプチドを含み、そのうち、前記ケモカインポリペプチドと前記サイトカインポリペプチドが共通標的細胞を有し、前記融合タンパク質が、前記ケモカインポリペプチドと比較して、より増進されたケモカイン活性と、前記サイトカインポリペプチドと比較して、より増進されたサイトカイン活性を有する。

本発明の好ましい実施態様において、前記ケモカインポリペプチドと前記サイトカインポリペプチドはペプチドリンカーにより結合される。２つのタンパク質を結合させ、それらの元の構成と機能を維持するために、適切なペプチドリンカーを２つのタンパク質の間に追加して、タンパク質フォールド時の相互干渉を減少することができる。そのようなペプチドリンカーは、一定程度のフレキシビリティと疎水性を備えた、フレキシブルなペプチドリンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_ｎ（通常ｎは６未満）または疎水性の螺旋状ペプチドリンカー（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ）_ｎ（通常ｎは６未満）でとすることができる。

本発明の一実施態様において、前記ケモカインはＣＸＣケモカインである。特定の実施態様において、前記ケモカインはストローマ細胞由来因子（ＳＤＦ−１）である。別の特定の実施態様において、前記ケモカインはＩＬ−８である。

本発明の特定の実施態様において、前記ケモカインポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、およびそのホモログとそのアナログから選択されるアミノ酸配列を有する。

本発明の特定の実施態様において、前記サイトカインはＩＬ−２、ＣＤ４０リガンド(ＣＤ４０Ｌ）またはその受容体結合ドメインである。

本発明の特定の実施態様において、前記サイトカインポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、そのホモログおよびアナログから選択されるアミノ酸配列を有する。

本発明の特定の実施態様において、本発明の融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４２、４４、４６、４８から選択されるアミノ酸配列を有する。

別の一態様によれば、本発明は本発明の融合タンパク質をエンコードする単離された核酸分子を提供する。

本発明の特定の実施態様において、前記単離された核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、およびそのホモログとアナログから選択される、ケモカインポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含む。

本発明の特定の実施態様において、前記単離された核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、およびそのホモログとアナログから選択される、ケモカインポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含む。

本発明の特定の実施態様において、前記単離された核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４１、４３、４５、４７から選択される配列を有する。

さらに別の一態様において、本発明は、本発明の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。

本発明はまた、本発明の発現ベクターまたは本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。

以下の実施例は本発明を例示するものであり、限定するものではない。

原核発現ベクターの構築

以前に鶏ＳＤＦ−１、ＩＬ−８、ＣＤ４０Ｌ誘導タンパク質、ＩＬ−２向けに構築された発現ベクター（Ｐｅｉ−Ｓｈａｎ Ｗｕ、国立中興大学獣医微生物学研究所、２００８年修士論文、鶏ＣＤ４０Ｌおよびケモカインに関する研究；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ.、Ｔａｉｗａｎ Ｖｅｔ Ｊ ３１：３８〜４５）が組み換えポリメラーゼ連鎖反応用テンプレートとして使用された。そのうち、鶏ＣＤ４０Ｌ（ｃｈＣＤ４０Ｌ）誘導タンパク質は、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ）またはＣＤ４０ＬのＴＮＦホモロジードメイン（ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ）を含む（図１参照）。複合タンパク質または融合タンパク質ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ、ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈ、ＳＤＦ１ＩＬ２、ＩＬ８ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ、ＩＬ８ＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈ、ＩＬ８ＩＬ２等の遺伝子配列がそこから拡張された。

方法を次に簡潔に説明する。各遺伝子配列に基づいて２つの特異的プライマー対が設計された。１対目のプライマーの順方向プライマーはＥｃｏＲ Ｉ制限酵素部位と融合タンパク質のフロントＮ末端の遺伝子配列を有し、逆方向プライマーは螺旋ペプチドリンカーと融合タンパク質フロントＣ末端の遺伝子配列を有する。このプライマー対は融合タンパク質のフロント部とペプチドリンカーをエンコードするＤＮＡ断片を特異的に増幅できる。２対目の順方向プライマーは、螺旋ペプチドリンカーと融合タンパク質のリアＮ末端の遺伝子配列を有し、逆方向プライマーはＸｈｏ Ｉ制限酵素部位と融合タンパク質のリアＣ末端の遺伝子配列を有する。このプライマー対はペプチドリンカーと融合タンパク質のリア部をエンコードするＤＮＡ断片を特異的に増幅することができる。この２つのプライマー対のＰＣＲ産物をテンプレートとして、１対目のプライマーの順方向プライマーと、２対目のプライマーの逆方向プライマーを使用して追加のＰＣＲが実行され、２つの断片が螺旋ペプチドリンカーの部分的に重なり合う配列によって接続された。得られた産物は螺旋ペプチドリンカー遺伝子を内部に含む融合遺伝子配列である。

上述の産物をＥｃｏＲ ＩとＸｈｏ Ｉで処理した後、ＥｃｏＲ ＩとＸｈｏ Ｉで処理されたｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄ、ドイツ）でライゲーションがＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１６℃で１６時間実施された。構築された原核発現ベクターはそれぞれｐＥＴＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ、ｐＥＴＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈ、ｐＥＴＳＤＦ１ＩＬ２、ｐＥＴＩＬ８ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ、ｐＥＴＩＬ８ＩＬ２と命名された。

組換えタンパク質の発現

構築された原核発現ベクターがＥ．ｃｏｌｉ発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）に転換され、組換えタンパク質の発現誘発に０．５ｍＭ ＩＰＴＧが使用され、遠心分離と培養液の除去により細菌体が収集された、続いて、すべての細菌体が結合バッファ中に再懸濁され、細菌体の溶解に高圧細胞溶解装置（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅｒｍｏ ＩＥＣ、Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｈｅｉｇｈｔ、米国マサチューセッツ州）を使用して、浮遊物中の可溶性タンパク質が高速遠心後ニッケルイオンアフィニティカラムを使用して精製された。

遠心後ペレット底部にある不溶性タンパク質が、タンパク質をアンフォールディングするために８Ｍで処理され、水溶液中に溶解された後、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心にかけられ、尿素をゆっくりと除くため浮遊物の透析が実施され、タンパク質が元の構造にリフォールドされた。最後にこのタンパク質が１０％のグリセロール（Ｈ７．３）を含む燐酸緩衝液中に溶解され、０．２２μｍ膜で濾過され、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、米国イリノイ州ロックフォード）で濃度が判定された後、−２０℃で保管された。単離されたタンパク質がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を使用して正確な融合タンパク質であることが特定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット（一次抗体が抗Ｈｉｓ抗体であり、二次抗体がＡＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、発色試薬ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）分析によると、発現された鶏組み換え融合タンパク質ＩＬ８ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ、ＩＬ８ＩＬ２、ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ、ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈ、ＳＤＦ１ＩＬ２等は予期されたとおりの分子量を有し、それぞれ５２ｋＤａ、４４ｋＤａ、３８ｋＤａ、４４ｋＤａ、２６ｋＤａであった（図２参照）。さらに、単一タンパク質が用意され、上述の方法で対照として単離された（Ｐｅｉ−Ｓｈａｎ Ｗｕ、国立中興大学獣医微生物学研究所、２００８年修士論文、鶏ＣＤ４０Ｌおよびケモカインに関する研究；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ.、Ｔａｉｗａｎ Ｖｅｔ Ｊ ３１：３８〜４５）。

走化活性アッセイ

ケモカイン（ＳＤＦ−１、またはＩＬ−８）とＣＤ４０Ｌ誘導タンパク質またはＩＬ−２融合ケモカインの走化活性が評価された。末梢血単核細胞がＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）を使用して単離され、ＰＢＳで２回洗浄後、ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）で１０％ＦＢＳに懸濁され、その後０．６％液体寒天に添加されてよく混合され、最終濃度０．３％の寒天を得た。その後２μｌ／ウェルの混合物が４８ウェルプレートのウェル中央に滴下され、５分間冷蔵庫内に置いて寒天を固化させ、細胞を寒天内に固定した。その後各ウェルに試験対象の各濃度のタンパク質を含む２５０μｌの培養液が添加され、オーバーナイトの培養後観察された。

各タンパク質が走化活性を示す最小有効濃度（ＭＥＣ）に基づき、ＭＥＣ値が小さいほど走化活性が高いことを表し、ＩＬ−８とＣＤ４０Ｌ誘導タンパク質またはＩＬ−２（ＩＬ８ＣＤ４０Ｌ_ＥｘｃまたはＩＬ８ＩＬ２）の融合は、ＭＥＣ値がより小さく、より高い走化活性を示した。融合タンパク質はＩＬ−８よりも走化活性が高い（表１参照）。ＳＤＦ−１とＣＤ４０Ｌ誘導タンパク質またはＩＬ−２（ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_ＥｘｃまたはＳＤＦ１ＩＬ２）の融合は、ＭＥＣ値がより小さく、より高い走化活性を示した。融合タンパク質はＳＤＦ−１よりも走化活性が高い（表１参照）。より高濃度のタンパク質で走化作用が高くなっている。同じ濃度で、ＩＬ８ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ（最高の走化活性）またはＩＬ８ＩＬ２（２番目に高い走化活性）の走化程度は単一のＩＬ８タンパク質より明確に高かった（図４参照）。また同じ濃度で、ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ、ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈまたはＳＤＦ１ＩＬ２の走化程度は単なる混合物または単一のＳＤＦ−１タンパク質より明確に高かった（図５参照）。

ＣＤ４０Ｌ誘導タンパク質によるマクロファージの一酸化窒素（ＮＯ）産生活性化の分析

マクロファージのＮＯ産生を活性化できるＣＤ４０Ｌの性質に基づき、ＣＤ４０Ｌ誘導タンパク質と融合されたケモカインのＣＤ４０Ｌ活性が評価された。末梢血単核細胞が単離され、ＰＢＳで２回洗浄後、１０％ＦＢＳと１２５ｎｇ／ｍｌの鶏ＩＬ−２および２×ｌ０^６細胞／ｍｌの４μｇ／ｍｌのＬＰＳを含むＲＰＭＩ １６４０で懸濁された。２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌの細胞が加えられた。１ｍｌの新鮮な培養液（同様に１２５ｎｇ／ｍｌの鶏ＩＬ−２および４μｇ／ｍｌのＬＰＳを含む）が２日後に添加された。５日のシミュレーション完了後、単球がマクロファージに分化された。ＰＢＳで３回洗浄して懸濁細胞を除去した後、異なる濃度のＣＤ４０Ｌ誘導タンパク質または融合タンパク質が添加され、培養液、ベクターにより発現されたタグ融合タンパク質と４μｇ／ｍｌのＬＰＳが添加された培養液がそれぞれ陰性対照群および陽性対照群とされた。４８時間の培養後、５０μｌの培養液が取り出され、市販のキット（Ｇｒｉｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国ウィスコンシン州）を使用して（ＮＯからの）亜硝酸濃度が測定された。

ＩＬ８ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｅ融合タンパク質は、ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｅ単独を添加した群より有意に高い活性を示した（５〜３０ｎＭ、ｐ＜０．０５；１８０ｎＭ、ｐ＜０．０１）。融合タンパク質ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃの効果はＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ単一タンパク質よりも有意に高かった（５ｎＭ、ｐ＜０．０１；３０〜１８０ｎＭ、ｐ＜０．０５）。ＳＤＦ−１とＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈの組み合わせについて、同様の結果が得られ、ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈ融合タンパク質は単一のＣＤ４０Ｌ_ＴＮＦｈタンパク質よりも有意に高い効果があった（５ｎＭと１８０ｎＭ、ｐ＜０．０１；０．８ｎＭと３０ｎＭ、ｐ＜０．０５）（図６参照）。

ＩＬ２融合タンパク質のリンパ球増殖促進に対する活性

リンパ球増殖の促進に対するＩＬ２の活性に基づき、ＩＬ−２と融合されたケモカインのＩＬ−２活性が評価された。細胞内酸性ホスファターゼの活性は細胞数に比例していることを利用して、発色基質ｐ-ニトロフェニルリン酸（ｐＮｐｐ）が使用された。末梢血単核細胞が単離された後、異なる濃度のタンパク質、１０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ（陽性対照群）または１０ｎＭのタグ融合タンパク質（陰性対照群）を添加した１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０で、９６ウェルプレートを使用して２×１０^５／ウェルで培養された。３日の培養後、培養物が３０００ｒｐｍの遠心に１０分間かけられ、培養液が除去されて、１００μｌの発色試薬（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、Ｈ５．５、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ ｐＮｐｐ）が各ウェルに添加され、３７℃で２時間インキュベーションされた。１０μｌの１Ｎ ＮａＯＨが添加され、反応が終了された。４０５ｎＭの波長で吸光度が測定され、刺激指数（ＳＩ）の計算に使用された。そのうち、ＳＩ＝実験群のＯＤ／ＲＰＭＩ １６４０培養のみのＯＤである。結果は、０．６２５−１６０ｎＭでのＳＤＦ１ＩＬ２融合タンパク質がＩＬ−２よりも有意に高い増殖促進の活性を示したことを表している（０．６２５ｎＭ、ｐ＜０．０５；１．２５−８０ｎＭ、ｐ＜０．００１；１６０ｎＭ、ｐ＜０．０１）。これらの結果は、ＩＬ−２活性がケモカインと融合後有意に向上されたことを示している（図７参照）。

ワクチン誘導免疫反応を促進するニューカッスル病（ＮＤ）ワクチンアジュバントとしての融合タンパク質

ＩＬ−２融合タンパク質が鳥ニューカッスル病（ＮＤ）ワクチンのアジュバントとして使用され、鶏に投与された。ワクチンの投与後、リンパ球の培養用に鶏から血液を採取して、不活性化ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）が抗原として添加され、抗原再刺激アッセイが実施された。陽性対照群として１０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡが培養液に添加された。鶏の各群のＮＤＶ抗原を認識できるメモリーリンパ球の増殖が比較された。増殖状態の判定方法は実施例５の説明と同じである。増殖率＝（試験群のＯＤ／ＲＰＭＩ １６４０培養のみのＯＤ）×１００％である。ＮＤワクチンのみでワクチン投与を受けた群と比較して、ＮＤワクチンアジュバントとしてのＩＬ−２融合タンパク質（ＳＤＦ１ＩＬ２＋ＮＤワクチン）でワクチン投与を受けた群は、抗原再刺激において抗原特異的なメモリーリンパ球の有意な増殖の増加があった（図８参照）。

ワクチン誘導免疫反応を促進する鳥伝染性管支炎（ＩＢ）ワクチンのアジュバントとしての融合タンパク質

ＩＬ−２融合タンパク質またはＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ融合タンパク質が鳥伝染性気管支炎（ＩＢ）ワクチンのアジュバントとして使用された。ワクチンの投与後、リンパ球の培養用に鶏から血液を採取して、不活性化伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）が抗原として添加され、抗原再刺激アッセイが実施された。鶏の各群のＩＢＶ抗原を認識できるメモリーリンパ球の増殖が比較された。増殖状態の判定方法は実施例５の説明と同じである。増殖率＝（試験群のＯＤ／ＲＰＭＩ １６４０培養のみのＯＤ）×１００％である。ＩＢワクチンのみでワクチン投与を受けた群と比較して、ＩＢワクチンアジュバントとしてのＩＬ−２融合タンパク質（ＳＤＦ１ＩＬ２＋ＩＢワクチン）（ｐ＜０．０１）でワクチン投与を受けた群、またはＩＢワクチンアジュバントとしてのＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ融合タンパク質（ＳＤＦ１ＣＤ４０Ｌ_Ｅｘｃ＋ＩＢワクチン）（ｐ＜０．０５）でワクチン投与を受けた群は、抗原再刺激において抗原特異的なメモリーリンパ球の有意な増殖の増加があった（図９参照）。

当業者は上述の実施態様に対して発明の広範な概念から逸脱することなく変更を加えることができることを理解するであろう。従って、本発明は開示された特定の実施態様に限定されず、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の要旨と範囲内の変更を含むことを意図していると理解される。

Claims (16)

1. 融合タンパク質であって、
   ケモカインまたはその受容体結合ドメインであるケモカインポリペプチドと、
   インターロイキン、ＴＮＦ−スーパーファミリーサイトカイン、またはその受容体結合ドメインである、前記ケモカインポリペプチドに結合されたサイトカインポリペプチドと、
   を含み、そのうち、前記ケモカインポリペプチドと前記サイトカインポリペプチドが共通標的細胞を有し、前記融合タンパク質が前記ケモカインポリペプチドと比較して向上されたケモカイン活性と、前記サイトカインポリペプチドと比較して向上されたサイトカイン活性を有することを特徴とする、融合タンパク質。
2. 前記ケモカインポリペプチドと前記サイトカインポリペプチドが、ペプチドリンカーにより結合されることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記ケモカインが、ＣＸＣケモカイン、ＣＣケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ_３Ｃケモカインから構成される群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
4. 前記ケモカインが、ＣＸＣケモカインであることを特徴とする、請求項３に記載の融合タンパク質。
5. 前記ケモカインが、ストローマ細胞由来因子またはＩＬ−８であることを特徴とする、請求項４に記載の融合タンパク質。
6. 前記ケモカインポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、およびそのホモログとそのアナログから選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
7. 前記サイトカインポリペプチドが、ＩＬ−２、ＣＤ４０リガンドまたはその受容体結合ドメインであることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
8. 前記サイトカインポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、およびそのホモログとそのアナログから選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
9. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４２、４４、４６、４８から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
10. 請求項１乃至５のいずれかに記載の融合タンパク質をエンコードすることを特徴とする、単離された核酸分子。
11. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、およびそのホモログとそのアナログから選択される、ケモカインポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
12. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、およびそのホモログとそのアナログから選択される、ケモカインポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
13. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４１、４３、４５、４７から選択された配列を有することを特徴とする、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
14. 請求項１０乃至１３のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とする、発現ベクター。
15. 請求項１０乃至１３のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とする、宿主細胞。
16. 請求項１４に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする、宿主細胞。