JP2016501544A - キラルアミンを合成するための操作された生体触媒および方法 - Google Patents

キラルアミンを合成するための操作された生体触媒および方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、アミンを生成するための操作されたトランスアミナーゼポリペプチド、それらの操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド、それらの操作されたトランスアミナーゼを発現することができる宿主細胞、およびそれらの操作されたトランスアミナーゼを使用して、有効な医薬品の生成において有用な化合物を調製する方法を提供する。本開示のトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓの野生型トランスアミナーゼと比較して高い溶媒安定性および熱安定性を有する以前に操作されたトランスアミナーゼポリペプチド（配列番号２のアミノ酸配列）と比べて、１つ以上の残基差異を有するように操作されている。

Description

この出願は、２０１２年１２月２１日に出願された同時係属の米国仮出願連続番号６１／７４５，２１９（これは、全ての目的のためにその全体が援用される）に対する優先権を主張する。
１．技術分野
本開示は、トランスアミナーゼ生体触媒、およびキラルアミンを調製するためにこの生体触媒を使用するプロセスに関する。
２．配列表、表またはコンピュータプログラムに対する言及
配列表の公式の写しは、「ＣＸ２−１２６ＵＳＰ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイル名、２０１２年１２月２１日という作成日および６０６，０９９キロバイトというサイズを有するＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して本明細書と同時に提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して出願される配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書中に援用される。
３．背景
トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１）は、スキーム１に示されるように、アミノドナー基質の第１級アミンからアミノアクセプター分子のカルボニル基へのアミノ基、電子対およびプロトンの転移を触媒する。
アミノアクセプター化合物（Ｉ）（所望のキラルアミン生成物（ＩＩＩ）の前駆体である）は、アミノドナー化合物（ＩＩ）と反応される。トランスアミナーゼは、アミノドナー（ＩＩ）のアミン基がアミノアクセプター（Ｉ）のケト基に転移するのを触媒する。この反応により、所望のキラルアミン生成物化合物（ＩＩＩ）、および副産物として、ケトン基を有する新しいアミノアクセプター化合物（ＩＶ）が生じる。
スキーム１の反応を触媒する能力を有する野生型トランスアミナーゼは、様々な微生物から単離されており、それらの微生物としては、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｏｃｅａｎｉｃｏｌａ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ ＨＴＣＣ２５１６、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＲＥＤ６５、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．ＭＥＤ９２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．（ＮＧＲ２３４株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａおよびＶｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｈｉｎら、２００１，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１７８２−１７８８を参照のこと）。これらの野生型トランスアミナーゼ遺伝子およびコードされるポリペプチドのいくつかは、配列決定されており、それらとしては、例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿００２２５７８１３．１，ＧＩ：２０７７３９４２０）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ １７１０ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＡ４７７３８．１，ＧＩ：７６５７８２６３）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｔｒｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９０２７１６．１，ＧＩ：１６３２５８０３２）およびＶｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥＡ３９１８３．１，ＧＩ：３２７２０７０６６）が挙げられる。クラスＥＣ２．６．１．１８およびＥＣ２．６．１−１９の２つの野生型トランスアミナーゼが、結晶化され、構造が特徴付けられた（例えば、Ｙｏｎａｈａら、１９８３，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４７（１０）：２２５７−２２６５を参照のこと）。
Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７由来の野生型トランスアミナーゼは、スキーム２の反応を触媒する補助因子としてピリドキサール−５’−リン酸を使用するω−アミノ酸：ピルビン酸トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１８）である。
Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ由来のこの野生型トランスアミナーゼは、カルボキシル基を有しない脂肪族アミノドナーに対しても触媒活性を示すと報告された。
キラルアミン化合物は、セファロスポリン誘導体またはピロリジン誘導体などの様々な医薬品を調製するための中間体またはシントンとして、製薬産業、農薬産業および化学産業において頻繁に使用される。キラルアミン化合物のこれらの多数の産業上の適用では、ただ１つの特定の光学活性型を使用することが必要とされ、例えば、（Ｒ）または（Ｓ）エナンチオマーだけが、生理的に活性である。トランスアミナーゼは、アミノ酸の鏡像異性体濃縮などにおける、光学的に純粋なキラルアミン化合物の立体選択的な合成のための潜在的な工業的用途を有する（例えば、Ｓｈｉｎら、２００１，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１７８２−１７８８；Ｉｗａｓａｋｉら、２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．２５：１８４３−１８４６；Ｉｗａｓａｋｉら、２００４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６９：４９９−５０５，Ｙｕｎら、２００４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：２５２９−２５３４；およびＨｗａｎｇら、２００４，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３４：４２９−４２６を参照のこと）。
トランスアミナーゼの用途の他の例としては、プレガバリンの中間体および前駆体の調製（例えば、ＷＯ２００８／１２７６４６）；シクロパミンアナログの酵素的アミノ基転移（例えば、ＷＯ２０１１／０１７５５１）；β−アミノ酸の立体特異的合成および鏡像異性体濃縮（例えば、ＷＯ２００５／００５６３３）；アミンの鏡像異性体濃縮（例えば、米国特許第４，９５０，６０６号；米国特許第５，３００，４３７号；および米国特許第５，１６９，７８０号）；ならびにアミノ酸および誘導体の生成（例えば、米国特許第５，３１６，９４３号；米国特許第４，５１８，６９２号；米国特許第４，８２６，７６６号；米国特許第６，１９７，５５８号；および米国特許第４，６００，６９２号）が挙げられる。
しかしながら、キラルアミン化合物を調製するための反応を触媒するために使用されるトランスアミナーゼは、工業的に有用なプロセス条件（例えば、溶媒、温度）に対する不安定性および限られた基質認識などの、商業的適用にとって望ましくない特性を有し得る。したがって、光学活性型のキラルアミン化合物を調製するための工業プロセスにおいて使用できる他のタイプのトランスアミナーゼ生体触媒が必要とされている。
国際公開第２００８／１２７６４６号 国際公開第２０１１／０１７５５１号 国際公開第２００５／００５６３３号
Ｓｈｉｎら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００１）６５：１７８２〜１７８８ Ｙｏｎａｈａら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）４７（１０）：２２５７〜２２６５
４．要旨
本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドを作製する方法、およびケトン基質からアミン生成物への生体触媒による変換にそれらのポリペプチドを使用する方法を提供する。本開示のトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓの野生型トランスアミナーゼと比較して高い溶媒安定性および熱安定性を有する以前に操作されたトランスアミナーゼポリペプチド（配列番号２のアミノ酸配列）と比べて、１つ以上の残基差異を有するように操作されている。それらのアミノ残基差異は、とりわけ、活性、立体選択性、安定性、発現および製品公差（ｐｒｏｄｕｃｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を含む、様々な酵素特性に影響する残基位置に配置されている。特に、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、スキーム３に示されるような、化合物（２）の例示的な大きなシクロパミンアナログケトン化合物から、化合物（１）の対応するキラルアミン生成物化合物への効率的な変換のために操作されている。
本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの進化した構造的特徴は、スキーム４に示されるような、式（ＩＩ）の一連の大きなケトン基質化合物（化合物（２）以外）（例えば、シクロパミンアナログ、ベラトラミンアナログおよびステロイドアナログ）から式（Ｉ）の対応するキラルアミン生成物化合物への変換も可能にする。
式中、上記化合物の環Ａ〜Ｄは、以下のとおり置換され得る：
環Ａは、２位と３位との間および／もしくは５位と６位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を必要に応じて含み、かつ／または２、３、４、５および６位においてハロ、ヒドロキシおよびメチルから選択される基で必要に応じて独立して置換される、６員の炭素環であり；
環Ｂは、５位と１０位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を必要に応じて含み、かつ／または９位および１０位のうちの１つ以上においてハロ、ヒドロキシおよびメチルから選択される基で必要に応じて独立して置換される、６員の炭素環であり；
環Ｃは、１０位においてハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択される基で必要に応じて置換される、５または６員の炭素環（すなわち、ｍ＝０または１）であり；
環Ｄは、１、２もしくは３つの不飽和Ｃ−Ｃ結合を必要に応じて含み、かつ／または以下のとおり：
１４位において、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、および１２位に架橋しているシクロプロピルから選択される基で；
１５位または１６位において、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニル、アミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換されるシクロアルキル、必要に応じて置換されるヘテロシクロアルキル、必要に応じて置換されるアリール、必要に応じて置換されるヘテロアリール、必要に応じて置換されるアリールオキシ、必要に応じて置換されるアリールアミノ、必要に応じて置換されるアリールチオ、必要に応じて置換されるアリールスルホニル、必要に応じて置換されるアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるアリールカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールアミノ、必要に応じて置換されるヘテロアリールチオ、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルホニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールカルボニルオキシ、アルキルアミノスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよびヘテロアリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される基で、
必要に応じて独立して置換される、５、６または７員の炭素環（すなわち、ｎ＝０、１または２）である。
したがって、本明細書中に開示される操作されたポリペプチドは、とりわけ、式（ＩＩ）のプロキラルな大きなケトン基質化合物から式（Ｉ）の対応するキラルアミン生成物化合物への変換において、高い活性、高い立体選択性、高い溶媒安定性および熱安定性ならびに高い製品公差を示す。
したがって、１つの態様において、本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供し、ここで、その操作されたポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性、ならびに配列番号２と比べて、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２３３、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２６、Ｘ４３４およびＸ４５０から選択される残基位置に１つ以上の残基差異を有するアミノ酸配列を含み、ここで、残基位置Ｘ２１、Ｘ５６、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ２３３、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３８３、Ｘ４１５、Ｘ４１７およびＸ４３４における残基差異は、Ｘ２１Ｈ、Ｘ５６Ａ／Ｃ、Ｘ８６Ｃ、Ｘ８８Ｈ／Ｙ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ／Ｐ、Ｘ１４７Ｈ／Ｖ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ２８６Ｃ／Ｈ、Ｘ３１２Ｎ、Ｘ３１６Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｔ、Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ、Ｘ４１７ＶおよびＸ４３４Ｔから選択される。いくつかの実施形態において、残基位置Ｘ１９、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ７３、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ３１７、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４２６およびＸ４５０における残基差異は、Ｘ１９Ｗ、Ｘ３４Ａ、Ｘ５３Ｍ、Ｘ７３Ｒ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６５Ｆ、Ｘ１７１Ｑ、Ｘ１７８Ｗ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２５９Ｖ、Ｘ２６８Ａ、Ｘ２７７Ａ、Ｘ３１７Ｌ、Ｘ３５８Ｋ、Ｘ３６６Ｈ、Ｘ３９９Ａ、Ｘ４１４Ｉ、Ｘ４２６ＲおよびＸ４５０Ｓから選択される。
トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドのいくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２と比べて、Ｘ３４Ａ、Ｘ５６Ａ、Ｘ８８Ｈ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ、Ｘ１４７Ｈ、Ｘ１５３Ｃ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ３１５Ｇ、Ｘ３１６Ｎ、Ｘ３８３ＩおよびＸ４５０Ｓから選択される少なくとも１つ以上の残基差異を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ／Ｌ、Ｘ８６Ｎ／Ｓ、Ｘ１５３Ａ、Ｘ２３３Ｔ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３ＶおよびＸ４１７Ｔから選択される１つ以上の残基差異をさらに含む。
トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドのいくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２と比べて、Ｘ３４Ａ、Ｘ５６Ａ、Ｘ５７Ｌ、Ｘ８６Ｓ、Ｘ８８Ａ；Ｘ１５３Ｃ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６３Ｆ、Ｘ３１５ＧおよびＸ４１７Ｔを含む残基差異の組み合わせを少なくとも含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、残基差異Ｘ３１６Ｎをさらに含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、残基差異Ｘ３１６Ｎ、ならびにＸ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ／Ｔ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓから選択される１つ以上の残基差異をさらに含む。
トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドのいくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２と比べて、残基差異Ｘ３４Ａ、Ｘ５６Ａ、Ｘ５７Ｌ、Ｘ８６Ｓ、Ｘ８８Ａ；Ｘ１５３Ｃ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６３Ｆ、Ｘ３１５Ｇ、Ｘ３１６ＮおよびＸ４１７Ｔを含み、（ａ）Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ３２３ＴおよびＸ３８３Ｖ；（ｂ）Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ、Ｘ２３３Ｔ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓ；（ｃ）Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓ；ならびに（ｄ）Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ１４７Ｈ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓから選択される残基差異の組み合わせをさらに含む。
トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドのいくつかの実施形態において、操作されたポリペプチドは、配列番号４のポリペプチドと比べて、少なくとも１．２倍高い安定性を有し、ここで、そのアミノ酸配列は、配列番号２と比べて、Ｘ３４Ｔ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ、Ｘ１４７Ｈ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ２３３Ｔ／Ｖ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ／ＶおよびＸ４５０Ｓから選択される１つ以上の残基差異を含む。
トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドのいくつかの実施形態において、操作されたポリペプチドは、化合物（２）を化合物（１）に変換する際に、配列番号４のポリペプチドと比べて少なくとも１．２倍高い活性を有し、ここで、そのアミノ酸配列は、配列番号２と比べて、Ｘ５６Ａ、Ｘ８６Ｓ、Ｘ８８Ｈ、Ｘ１５３Ｃ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４１７Ｔから選択される１つ以上の残基差異を含む。
トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドのいくつかの実施形態において、操作されたポリペプチドは、化合物（２）を化合物（１）に変換する際に、配列番号４のポリペプチドと比べて高いエナンチオ選択性を有し、ここで、そのアミノ酸配列は、配列番号２と比べて、Ｘ５７Ｆ、Ｘ１５３ＣおよびＸ３１６Ｎから選択される１つ以上の残基差異を含む。
トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドのいくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２と比べて、Ｘ１８Ａ、Ｘ１９Ｗ、Ｘ２１Ｈ、Ｘ３１Ｍ、Ｘ３４Ａ、Ｘ５３Ｍ、Ｘ５６Ａ／Ｃ、Ｘ５７Ｃ／Ｆ／Ｌ、Ｘ７３Ｒ、Ｘ８６Ｃ／Ｎ／Ｓ／Ｙ、Ｘ８８Ｈ／Ｙ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｃ／Ｌ／Ｐ、Ｘ１４６Ｌ、Ｘ１４７Ｈ／Ｋ／Ｖ、Ｘ１５３Ａ／Ｃ／Ｖ、Ｘ１５５Ａ／Ｖ、Ｘ１６３Ｌ、Ｘ１６５Ｆ、Ｘ１７１Ｑ、Ｘ１７８Ｗ、Ｘ１９０Ｋ、Ｘ２０６Ｋ、Ｘ２２８Ｇ、Ｘ２３３Ｔ／Ｖ、Ｘ２３５Ｐ、Ｘ２４４Ｔ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２５９Ｖ、Ｘ２６８Ａ、Ｘ２７７Ａ、Ｘ２８６Ｃ／Ｈ、Ｘ３１２Ｎ、Ｘ３１４Ｎ、Ｘ３１５Ｇ、Ｘ３１６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｘ３１７Ｌ、Ｘ３１９Ｎ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３５８Ｋ、Ｘ３６６Ｈ、Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｔ／Ｖ、Ｘ３９５Ｐ、Ｘ３９９Ａ、Ｘ４１４Ｉ、Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ、Ｘ４１７Ｔ／Ｖ、Ｘ４２４Ａ、Ｘ４２６Ｒ、Ｘ４２７Ｙ、Ｘ４３４ＴおよびＸ４５０Ｓから選択される残基差異をさらに含む。
トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドのいくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２と比べて、Ｘ９、Ｘ４５、Ｘ１７７、Ｘ２１１、Ｘ２９４、Ｘ３２４およびＸ３９１位に残基差異を含まない。
いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、他の残基位置にさらなる残基差異を有し得る。いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号２と比べて、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５または１〜５０個のさらなる残基差異を有し得る。いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個のさらなる残基差異を有し得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の残基差異をさらに有する。
様々な残基差異の組み合わせを含む残基差異を組み込んでおり、かつ改善された特性（例えば、好適な反応条件下において少なくとも９０％のジアステレオマー過剰率で化合物（２）を化合物（１）に変換することができる特性）を有する例示的な操作されたポリペプチドが、表２Ａおよび２Ｂならびに実施例に開示される。そのアミノ酸配列は、配列表に提供されており、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４を含む。
別の態様において、本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそのポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を提供する。例示的なポリヌクレオチド配列は、参照により本明細書中に援用される配列表に提供されており、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１および２０３を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを製造する方法も提供し、ここで、その方法は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞をそのポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを製造するための方法は、（ａ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２と比べて、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２３３、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２６、Ｘ４３４およびＸ４５０から選択される残基位置に１つ以上の残基差異を有する、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程（ここで、残基位置Ｘ２１、Ｘ５６、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ２３３、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３８３、Ｘ４１５、Ｘ４１７およびＸ４３４における残基差異は、Ｘ２１Ｈ、Ｘ５６Ａ／Ｃ、Ｘ８６Ｃ、Ｘ８８Ｈ／Ｙ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ／Ｐ、Ｘ１４７Ｈ／Ｖ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ２８６Ｃ／Ｈ、Ｘ３１２Ｎ、Ｘ３１６Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｔ、Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ、Ｘ４１７ＶおよびＸ４３４Ｔから選択される）；および（ｂ）そのポリヌクレオチドによってコードされるトランスアミナーゼポリペプチドを発現させる工程も含み得る。上で述べたように、残基位置Ｘ１９、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ７３、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ３１７、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４２６およびＸ４５０における残基差異は、Ｘ１９Ｗ、Ｘ３４Ａ、Ｘ５３Ｍ、Ｘ７３Ｒ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６５Ｆ、Ｘ１７１Ｑ、Ｘ１７８Ｗ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２５９Ｖ、Ｘ２６８Ａ、Ｘ２７７Ａ、Ｘ３１７Ｌ、Ｘ３５８Ｋ、Ｘ３６６Ｈ、Ｘ３９９Ａ、Ｘ４１４Ｉ、Ｘ４２６ＲおよびＸ４５０Ｓから選択され得る。詳細な説明においてさらに提供されるように、さらなるバリエーションが、上記ポリヌクレオチドの合成中に組み込まれることにより、発現されるアミノ酸配列に対応する差異を有する操作されたトランスアミナーゼが調製され得る。
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの構造的特徴により、化合物（２）以外のプロキラルな大きなケトン基質化合物から対応するアミン生成物化合物への変換が、必要に応じて、別のキラルアミノ生成物に対して一方のキラルアミン生成物が立体異性体過剰（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ）で、可能である。したがって、本開示の別の態様は、アミノドナー由来のアミノ基がアミノアクセプターに転移される反応を触媒するために、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用するプロセスであり、ここで、そのプロセスは、アミノドナー（例えば、イソプロピルアミン）の存在下の、アミノアクセプターからアミン化合物への変換に適した反応条件下において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをアミノアクセプター（例えば、ケトン基質化合物）と接触させる工程を含む。
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉ）のアミン化合物
（式中、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、上で定義されたとおりであるが、
ただし、式（Ｉ）の化合物は、化合物（１）
ではない）を調製するためのプロセスを提供し、ここで、その方法は、式（ＩＩ）のケトン基質化合物
（式中、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、上で定義されたとおりである）
を、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む。
式（Ｉ）のアミン化合物を調製するためのプロセスのいくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉａ）の化合物
（式中、
環ＡおよびＢは、以下
（ａ）５位と６位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｂ）５位と１０位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｃ）５位に、４位のメチル基に対してシスである水素；または
（ｄ）５位に、４位のメチル基に対してトランスである水素
のうちの１つを含み；
環Ｄは、１２位と１４位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を含み；
Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択され；
Ｒ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択され；
Ｒ３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニルおよびアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される）
を調製するためのプロセスを提供し、ここで、その方法は、式（ＩＩａ）のケトン基質化合物
（式中、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は、式（Ｉａ）の化合物に対して上で定義されたとおりである）
を、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む。
式（Ｉ）のアミン化合物を調製するためのプロセスのいくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉｂ）の化合物
（式中、
環ＡおよびＢは、以下：
（ａ）５位と６位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｂ）５位と１０位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｃ）５位に、４位のメチル基に対してシスである水素；または
（ｄ）５位に、４位のメチル基に対してトランスである水素
のうちの１つを含み；
環Ｄは、１２位と１４位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合または１２位と１４位との間に架橋シクロプロピルを含み；
Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択され；
Ｒ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択され；
Ｒ３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニルおよびアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される）
を調製するためのプロセスを提供し、ここで、その方法は、式（ＩＩｂ）のケトン基質化合物
（式中、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は、式（Ｉｂ）の化合物に対して上で定義されたとおりである）
を、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む。
式（Ｉ）のアミン化合物を調製するためのプロセスのいくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉｃ）の化合物
（式中、
環ＡおよびＢは、以下：
（ａ）５位と６位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｂ）５位と１０位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｃ）５位に、４位のメチル基に対してシスである水素；または
（ｄ）５位に、４位のメチル基に対してトランスである水素
のうちの１つを含み；
環Ｄは、芳香族であり；
Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択され；
Ｒ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択され；
Ｒ３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニルおよびアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される）
を調製するためのプロセスを提供し、ここで、その方法は、式（ＩＩｃ）のケトン基質化合物
（式中、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は、式（Ｉｃ）の化合物に対して上で定義されたとおりである）
を、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む。
式（Ｉ）のアミン化合物を調製するためのプロセスのいくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉｄ）の化合物
（式中、
環Ａは、２位と３位との間または５位と６位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を含み；
Ｒ１およびＲ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニル、アミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換されるシクロアルキル、必要に応じて置換されるヘテロシクロアルキル、必要に応じて置換されるアリール、必要に応じて置換されるヘテロアリール、必要に応じて置換されるアリールオキシ、必要に応じて置換されるアリールアミノ、必要に応じて置換されるアリールチオ、必要に応じて置換されるアリールスルホニル、必要に応じて置換されるアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるアリールカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールアミノ、必要に応じて置換されるヘテロアリールチオ、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルホニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールカルボニルオキシ、アルキルアミノスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよびヘテロアリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立して選択され；
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから独立して選択され；
Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素、ハロ、ヒドロキシおよびメチルから独立して選択される）
を調製するためのプロセスを提供し、ここで、その方法は、式（ＩＩｄ）のケトン基質化合物
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、式（Ｉｄ）の化合物に対して上で定義されたとおりである）
を、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む。
本開示のアミン化合物を調製するためのプロセスのいくつかの実施形態において、上記トランスアミナーゼの立体選択性は、式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（Ｉｃ）および式（Ｉｄ）のキラルアミン化合物のジアステレオマー過剰での調製を提供する。いくつかの実施形態において、そのプロセスは、式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（Ｉｃ）および式（Ｉｄ）のキラルアミン化合物の形成を、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるというジアステレオマー過剰率でもたらす。
本明細書中に提供されるように、操作されたトランスアミナーゼを使用するプロセスは、とりわけ、一連のアミンドナー、ｐＨ、温度、緩衝剤、溶媒系、基質負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）、ポリペプチド負荷、補助因子負荷、圧力および反応時間を含む、一連の好適な反応条件下で行われ得る。
いくつかの実施形態において、上記アミノ基転移プロセスに適した反応条件は、（ａ）約５ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌの基質負荷；（ｂ）約０．１〜５０ｇ／Ｌの操作されたトランスアミナーゼポリペプチド；（ｃ）約０．１〜４Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｄ）約０．１〜１０ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）補助因子；（ｅ）約６〜９のｐＨ；および（ｆ）約３０〜６０℃の温度を含み得る。
いくつかの実施形態において、上記アミノ基転移プロセスに適した反応条件は、（ａ）約１０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌの基質負荷；（ｂ）約０．５〜２０ｇ／Ｌの操作されたトランスアミナーゼポリペプチド；（ｃ）約０．１〜３Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｄ）約０．１〜１０ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）補助因子；（ｅ）約０．０５〜０．２０ＭのＴＥＡ緩衝液；（ｆ）約１％〜約４５％のＤＭＳＯ；（ｇ）約６〜９のｐＨ；および（ｈ）約３０〜６５℃の温度を含み得る。
いくつかの実施形態において、上記アミノ基転移プロセスに適した反応条件は、（ａ）約２０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの基質負荷；（ｂ）約１〜５ｇ／Ｌの操作されたトランスアミナーゼポリペプチド；（ｃ）約０．５〜２Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｄ）約０．２〜２ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）補助因子；（ｅ）約０．１ＭのＴＥＡ緩衝液；（ｆ）約２５％のＤＭＳＯ；（ｅ）約８のｐＨ；および（ｆ）約４５〜６０℃の温度を含み得る。
操作されたトランスアミナーゼの選択、生体触媒の調製、酵素基質の選択および上記プロセスを行うためのパラメータに関する指針は、以下の詳細な説明においてさらに説明される。
５．詳細な説明
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の対象物を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」に対する言及は、１つより多いポリペプチドを含む。
同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、相互交換可能であり、限定していると意図されていない。
様々な実施形態の説明が、用語「〜を含む」を使用する場合、当業者は、いくつかの具体的な場合において、ある実施形態が、語法「〜から本質的になる」または「〜からなる」を使用して代わりに説明され得ることを理解するだろうということがさらに理解されるべきである。
図面を含む前述の全般的な説明と以下の詳細な説明の両方が、例示的であって、単なる説明に過ぎず、本開示を限定するものでないことが理解されるべきである。
本明細書中で使用される項の見出しは、単に構成上の目的のものであって、説明される主題を限定すると解釈されるべきでない。
５．１ 省略形
遺伝的にコードされるアミノ酸に対して使用される省略形は、従来のものであり、以下のとおりである：
３文字の省略形が使用されるとき、明確に「Ｌ」もしくは「Ｄ」が前に付かないか、またはその省略形が使用される文脈から明らかでない限り、アミノ酸は、α−炭素（Ｃα）に関してＬ−配置またはＤ−配置であり得る。例えば、「Ａｌａ」は、α−炭素に関する配置を明記せずにアラニンを指し示すのに対し、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、それぞれＤ−アラニンおよびＬ−アラニンを指し示す。１文字省略形が使用されるとき、大文字は、α−炭素に関してＬ−配置のアミノ酸を指し示し、小文字は、α−炭素に関してＤ−配置のアミノ酸を指し示す。例えば、「Ａ」は、Ｌ−アラニンを指し示し、「ａ」は、Ｄ−アラニンを指し示す。ポリペプチド配列が、一続きの１文字省略形または３文字省略形（またはそれらの混合物）で示されるとき、それらの配列は、通常の慣行に従ってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）への方向で示される。
遺伝的にコードするヌクレオシドに対して使用される省略形は、従来のものであり、以下のとおりである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。明確に描写されない限り、省略されたヌクレオチドは、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドであり得る。ヌクレオシドは、個別でまたは一括で、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドであると明記され得る。核酸配列が、一続きの１文字省略形として示されるとき、それらの配列は、通常の慣行に従って５’から３’への方向で示され、リン酸は示されない。
５．２ 定義
本開示について言及するとき、本明細書中の説明において使用される専門用語および科学用語は、別段明確に定義されない限り、当業者が通常理解している意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有するよう意図されている。
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、ユビキチン化など）に関係なく、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーのことを表すために本明細書中で交換可能に使用される。Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物が、この定義に含まれる。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、互いに共有結合的に連結された２つ以上のヌクレオシドのことを指す。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオシド（すなわち、ＲＮＡ）をもっぱら含み得るか、２’−デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）をもっぱら含み得るか、またはリボヌクレオシドと２’−デオキシリボヌクレオシドとの混合物をもっぱら含み得る。ヌクレオシドは、代表的には、標準的なホスホジエステル結合を介して互いに連結されるが、ポリヌクレオチドは、１つ以上の非標準的な結合を含むことがある。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または一本鎖領域と二本鎖領域の両方を含み得る。さらに、ポリヌクレオチドは、代表的には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）から構成されるが、１つ以上の改変された核酸塩基および／または合成の核酸塩基（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど）を含むことがある。好ましくは、そのような改変された核酸塩基または合成の核酸塩基は、コード核酸塩基である。
「アミノトランスフェラーゼ」および「トランスアミナーゼ」は、第１級アミン由来のアミノ基（ＮＨ２）をアクセプター分子のカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）に転移させる酵素的能力を有するポリペプチドのことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。本明細書中で使用されるトランスアミナーゼには、天然に存在する（野生型）トランスアミナーゼ、ならびにヒトの操作によって作製された天然に存在しない操作されたポリペプチドが含まれる。
「アミノアクセプター」および「アミンアクセプター」、「ケト基質」、「ケト」および「ケトン」は、ドナーアミンからアミノ基を受け取るカルボニル（ケトまたはケトン）化合物のことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、アミノアクセプターは、以下の一般式の分子
であり、ここで、ＲαおよびＲβの各々は、独立して見なされるとき、非置換であり得るかまたは１つ以上の酵素的に許容され得る基で置換され得る、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールである。Ｒαは、構造またはキラリティがＲβと同じであっても、異なってもよい。いくつかの実施形態において、ＲαおよびＲβは、一体となって、非置換であるか、置換されるか、または他の環に融合される、環を形成し得る。アミノアクセプターには、ケトカルボン酸およびアルカノン（ケトン）が含まれる。代表的なケトカルボン酸は、α−ケトカルボン酸（例えば、グリオキサル酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸など）ならびにこれらの酸の塩である。アミノアクセプターには、他の酵素または細胞全体のプロセスによってアミノアクセプターに変換される物質、例えば、フマル酸（オキサロ酢酸に変換され得る）、グルコース（ピルベートに変換され得る）、ラクテート、マレイン酸なども含まれる。使用され得るアミノアクセプターとしては、例として、これらに限定されないが、３，４−ジヒドロナフタレン−１（２Ｈ）−オン、１−フェニルブタン−２−オン、３，３−ジメチルブタン−２−オン、オクタン−２−オン、エチル３−オキソブタノエート、４−フェニルブタン−２−オン、１−（４−ブロモフェニル）エタノン、２−メチル−シクロヘキサノン（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｍｏｎｅ）、７−メトキシ−２−テトラロン、１−ヒドロキシブタン−２−オン、ピルビン酸、アセトフェノン、３’−ヒドロキシアセトフェノン、２−メトキシ−５−フルオロアセトフェノン、レブリン酸、１−フェニルプロパン−１−オン、１−（４−ブロモフェニル）プロパン−１−オン、１−（４−ニトロフェニル）プロパン−１−オン、１−フェニルプロパン−２−オン、２−オキソ−３−メチルブタン酸、１−（３−トリフルオロメチルフェニル）プロパン−１−オン、ヒドロキシプロパノン、メトキシオキシプロパノン、１−フェニルブタン−１−オン、１−（２，５−ジメトキシ−４−メチルフェニル）ブタン−２−オン、１−（４−ヒドロキシフェニル）ブタン−３−オン、２−アセチルナフタレン、フェニルピルビン酸、２−ケトグルタル酸および２−ケトコハク酸（可能であれば（Ｒ）と（Ｓ）の両方の単一の異性体を含む）が挙げられる。
「アミノドナー」または「アミンドナー」とは、アミノ基をアミノアクセプターに供与し、それにより、カルボニル種になるアミノ化合物のことを指す。いくつかの実施形態において、アミノドナーは、以下の一般式の分子
であり、ここで、ＲεおよびＲδの各々は、独立して見なされるとき、非置換であるかまたは１つ以上の酵素的に阻害しない基で置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールである。Ｒεは、構造またはキラリティがＲδと同じであっても、異なってもよい。いくつかの実施形態において、ＲεおよびＲδは、一体となって、非置換であるか、置換されるか、または他の環に融合される、環を形成し得る。使用され得る代表的なアミノドナーには、キラルアミノ酸およびアキラルアミノ酸ならびにキラルアミンおよびアキラルアミンが含まれる。使用され得るアミノドナーとしては、例として、これらに限定されないが、イソプロピルアミン（２−アミノプロパンとも称される）、α−フェネチルアミン（１−フェニルエタンアミンとも呼ばれる）およびそのエナンチオマー（Ｓ）−１−フェニルエタンアミンおよび（Ｒ）−１−フェニルエタンアミン、２−アミノ−４−フェニルブタン、グリシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸、グルタミン酸一ナトリウム、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ，Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｄ，Ｌ−オルニチン、β−アラニン、タウリン、ｎ−オクチルアミン、シクロヘキシルアミン、１，４−ブタンジアミン（プトレッシンとも称される）、１，６−ヘキサンジアミン、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ酪酸、チラミンおよびベンジルアミン、２−アミノブタン、２−アミノ−１−ブタノール、１−アミノ−１−フェニルエタン、１−アミノ−１−（２−メトキシ−５−フルオロフェニル）エタン、１−アミノ−１−フェニルプロパン、１−アミノ−１−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン、１−アミノ−１−（４−ブロモフェニル）プロパン、１−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）プロパン、１−フェニル−２−アミノプロパン、１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパン、２−アミノプロパノール、１−アミノ−ｌ−フェニルブタン、１−フェニル−２−アミノブタン、１−（２，５−ジメトキシ−４−メチルフェニル）−２−アミノブタン、１−フェニル−３−アミノブタン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−アミノブタン、１−アミノ−２−メチルシクロペンタン、１−アミノ−３−メチルシクロペンタン、１−アミノ−２−メチルシクロヘキサン、１−アミノ−１−（２−ナフチル）エタン、３−メチルシクロペンチルアミン、２−メチルシクロペンチルアミン、２−エチルシクロペンチルアミン、２−メチルシクロヘキシルアミン、３−メチルシクロヘキシルアミン、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、２−アミノ−５−メトキシテトラリンならびに１−アミノインダン（可能であれば（Ｒ）と（Ｓ）の両方の単一の異性体を含み、これらのアミンの可能なすべての塩を含む）が挙げられる。
「キラルアミン」とは、一般式Ｒα−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｒβのアミンのことを指し、本明細書中ではその最も広い意味で使用され、それは、水素原子に加えて、（ｉ）キラルな環構造を形成する二価の基、または（ｉｉ）構造もしくはキラリティが互いと異なる２つの置換基（水素以外）を有する第２級炭素原子に結合された第１級アミノ基の存在によって特徴付けられる、異なる官能基タイプおよび混合された官能基タイプの多種多様の脂肪族化合物および脂環式化合物を含む。キラルな環構造を形成する二価の基としては、例えば、２−メチルブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，４−ジイル、ヘキサン−１，４−ジイル、ヘキサン−１，５−ジイル、２−メチルペンタン−１，５−ジイルが挙げられる。第２級炭素原子上の２つの異なる置換基（上記のＲαおよびＲβ）もまた、非常に様々であり得、それらには、アルキル、アラルキル、アリール、ハロ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、シクロアルキル、カルボキシ、カルバルコキシ（ｃａｒｂａｌｋｏｘｙ）、カルバモイル、モノ−およびジ−（低級アルキル）置換カルバモイル、トリフルオロメチル、フェニル、ニトロ、アミノ、モノ−およびジ−（低級アルキル）置換アミノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルカルボキサミド、アリールカルボキサミドなど、ならびに前述のものによって置換されたアルキル、アラルキルまたはアリールが含まれる。
「ピリドキサール−リン酸」、「ＰＬＰ」、「ピリドキサール−５’−リン酸」、「ＰＹＰ」および「Ｐ５Ｐ」は、トランスアミナーゼ反応において補酵素として作用する化合物のことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、ピリドキサールリン酸は、ＣＡＳ番号［５４−４７−７］である構造１−（４’−ホルミル−３’−ヒドロキシ−２’−メチル−５’−ピリジル）メトキシホスホン酸によって定義される。ピリドキサール−５’−リン酸は、ピリドキソール（ビタミンＢ６としても知られる）のリン酸化および酸化によってインビボで生成され得る。トランスアミナーゼ酵素を使用するアミノ基転移反応において、アミノドナーのアミン基は、補酵素に転移されることにより、ケト副産物を生成する一方で、ピリドキサール−５’−リン酸は、ピリドキサミンリン酸に変換される。ピリドキサール−５’−リン酸は、異なるケト化合物（アミノアクセプター）との反応によって再生される。ピリドキサミンリン酸からアミノアクセプターへのアミン基の転移により、アミンが生成され、補酵素が再生される。いくつかの実施形態において、ピリドキサール−５’−リン酸は、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）およびそれらのリン酸化された対応物；ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）およびピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）を含むビタミンＢ６ファミリーの他のメンバーによって置き換えられ得る。
「コード配列」とは、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の一部のことを指す。
「天然に存在する」または「野生型」とは、天然に見られる形態のことを指す。例えば、天然に存在するまたは野生型のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然での供給源から単離され得る、ヒトの操作によって意図的に改変されていない、生物の中に存在する配列である。
「組換え」または「操作された」または「天然に存在しない」は、例えば、細胞、核酸またはポリペプチドに関して使用されるとき、他の形では天然に存在しないであろう様式で改変された、材料またはその材料の自然のもしくは天然の形態に対応する材料のことを指すか、またはそれと同一であるが、合成の材料からおよび／もしくは組換え手法を用いる操作によって生成されるかもしくは得られる。非限定的な例としては、とりわけ、天然（非組換え）の形態の細胞内で見られないかまたは異なるレベルで別途発現される天然の遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
「配列同一性のパーセンテージ」および「パーセンテージ相同性」は、ポリヌクレオチド間およびポリペプチド間の比較のことを指すために本明細書中で交換可能に使用され、最適にアラインメントされた２つの配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定されるものであり、ここで、その比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、それらの２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。上記パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定することにより、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算することにより、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算され得る。あるいは、上記パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとアラインメントされる位置の数を決定することにより、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算することにより、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算され得る。当業者は、２つの配列をアラインメントするために利用可能な確立されたアルゴリズムが数多く存在することを認識する。比較のための最適な配列のアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２のローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または目視検査（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を広く参照のこと）によって行われ得る。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９７７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３８９−３４０２にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントされたとき、マッチするかまたはいくつかの正値の閾値スコアＴを満たす、クエリー配列中の長さＷのショートワードを同定することによってスコアの高い配列対（ＨＳＰ）を同定する工程を含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見つけ出すための検索を開始するためのシード（ｓｅｅｄ）として作用する。次いで、このワードヒットを、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方の方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（マッチする残基対に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリング行列を使用して、累積スコアが計算される。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その達成された最大値から数量Ｘだけ低下したとき；１つ以上のスコアが負である残基アラインメントの累積に起因して、累積スコアが０以下になるとき；またはいずれかの配列の末端に到達したとき、停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、１１というワード長（Ｗ）、１０という期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３というワード長（Ｗ）、１０という期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列をデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）。配列アラインメントおよび％配列同一性の例示的な決定は、提供されるデフォルトのパラメータを使用して、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）内のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを使用し得る。
「参照配列」とは、配列比較のための基準として使用される規定の配列のことを指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、完全長の遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長またはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、またはその核酸もしくはポリペプチドの完全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは各々、（１）それらの２つの配列の間で類似している配列（すなわち、完全な配列の一部）を含み得、（２）それらの２つの配列の間で非常に異なる配列をさらに含み得るので、２つ（以上）のポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の配列比較は、配列が類似している局所的な領域を同定し、比較するために、代表的には、それらの２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較することによって行われる。いくつかの実施形態において、「参照配列」は、１次アミノ酸配列に基づき得、ここで、その参照配列は、その１次配列中に１つ以上の変更を有し得る配列である。例えば、「Ｘ３４に対応する残基にアラニンを有する配列番号２に基づく参照配列」またはＸ３４Ａとは、配列番号２のＸ３４における対応する残基（トレオニンである）がアラニンに変更された参照配列のことを指す。
「比較ウィンドウ」とは、少なくとも約２０個連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的なセグメントのことを指し、ここで、ある配列が、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得、比較ウィンドウ内の配列の一部が、それらの２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列と比べて２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。その比較ウィンドウは、２０個連続した残基より長い場合があり、必要に応じて、３０、４０、５０、１００またはそれより長いウィンドウを含む。
「実質的な同一性」とは、少なくとも２０残基位置の比較ウィンドウにわたって、しばしば、少なくとも３０〜５０残基のウィンドウにわたって、参照配列と比べて、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性および８９〜９５パーセントの配列同一性、より一般的には、少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のことを指し、ここで、その配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって参照配列の合計２０パーセント以下を占める欠失または付加を含む配列と参照配列を比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される具体的な実施形態において、用語「実質的な同一性」は、２つのポリペプチド配列が、デフォルトのギャップウェイトを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントされるとき、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれを超える配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的なアミノ酸置換によって異なる。
所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列のナンバリングの文脈において使用されるときの「〜に対応する」、「〜に関して」または「〜と比較して」は、その所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較されるときの特定の参照配列の残基のナンバリングのことを指す。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、その所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的な位置によってではなく、参照配列に関して指し示される。例えば、操作されたトランスアミナーゼのアミノ酸配列などの所与のアミノ酸配列は、それらの２つの配列間の残基のマッチを最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列とアラインメントされ得る。これらの場合、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列における残基のナンバリングは、それとアラインメントされた参照配列に関して行われる。
「アミノ酸差異」または「残基差異」とは、参照配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基と比較して、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の変更のことを指す。アミノ酸差異の位置は、通常、本明細書中で「Ｘｎ」と称され、ここで、ｎは、その残基差異が基づいている参照配列中の対応する位置のことを指す。例えば、「配列番号２と比べてＸ３４位における残基差異」とは、配列番号２の３４位に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の変更のことを指す。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが、３４位にトレオニンを有する場合、「配列番号２と比べてＸ３４位における残基差異」は、配列番号２の３４位に対応するポリペプチドの位置における、トレオニン以外の任意の残基のアミノ酸置換のことを指す。本明細書中のほとんどの場合において、ある位置における具体的なアミノ酸残基差異は、「ＸｎＹ」と示され、ここで、「Ｘｎ」は、上に記載されたような対応する位置を特定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドに見られるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチドと異なる残基）の１文字識別子である。いくつかの実施形態において、２つ以上のアミノ酸が、特定の残基位置に見られ得る場合、代替のアミノ酸が、ＸｎＹ／Ｚという形態で列挙され得、ここで、ＹおよびＺは、代わりのアミノ酸残基を表す。いくつかの場合において（例えば、表２Ａおよび２Ｂにおいて）、本開示は、従来の表記法「ＡｎＢ」によって表される具体的なアミノ酸差異も提供し、ここで、Ａは、参照配列中の残基の１文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチド配列中の残基置換の１文字識別子である。さらに、いくつかの場合において、本開示のポリペプチドは、参照配列と比較して変更された特定の位置のリストによって示される、参照配列と比較したときの１つ以上のアミノ酸残基差異を含み得る。
「保存的なアミノ酸置換」とは、ある残基が、類似の側鎖を有する異なる残基で置換されることを指し、ゆえに、代表的には、ポリペプチド中のアミノ酸が、同一または類似の規定のアミノ酸クラス内のアミノ酸で置換されることを含む。例として、これらに限定されないが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンで置換され得；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、セリンおよびトレオニンで置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジンで置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニンで置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換され；疎水性アミノ酸または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性アミノ酸または親水性アミノ酸で置換される。例示的な保存的置換を、下記の表１に提供する。
「非保存的置換」とは、著しく異なる側鎖特性を有するアミノ酸による、ポリペプチド中のアミノ酸の置換のことを指す。非保存的置換は、規定の群内ではなく、規定の群間のアミノ酸を使用し得、（ａ）その置換の領域内のペプチド骨格の構造（例えば、グリシンの代わりのプロリン）、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩に影響する。例として、これらに限定されないが、例示的な非保存的置換は、塩基性アミノ酸または脂肪族アミノ酸で置換される酸性アミノ酸；小さいアミノ酸で置換される芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換される親水性アミノ酸であり得る。
「欠失」とは、参照ポリペプチドからの１つ以上のアミノ酸の除去による、そのポリペプチドに対する改変のことを指す。欠失は、操作されたトランスアミナーゼ酵素の酵素活性を保持しつつおよび／または改善された特性を保持しつつ、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸または２０個以上のアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の１０％まで、またはそのアミノ酸の総数の２０％までの除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部の部分および／または末端の部分に向けられ得る。様々な実施形態において、欠失は、連続したセグメントを含み得るか、または不連続であり得る。
「挿入」とは、参照ポリペプチドからの１つ以上のアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変のことを指す。いくつかの実施形態において、改善された操作されたトランスアミナーゼ酵素は、天然に存在するトランスアミナーゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入、ならびに他の改善されたトランスアミナーゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部の部分、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端におけるものであり得る。本明細書中で使用される挿入には、当該分野で公知であるような融合タンパク質が含まれる。その挿入は、参照ポリペプチドにおいて、連続したアミノ酸のセグメントであり得るか、または１つ以上のアミノ酸によって分断され得る。
本明細書中で使用される「フラグメント」とは、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列がその配列中の対応する位置と同一である、ポリペプチドのことを指す。フラグメントは、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長またはそれを超えるアミノ酸長、および完全長トランスアミナーゼポリペプチド、例えば、配列番号２の操作された参照トランスアミナーゼポリペプチドの最大７０％、８０％、９０％、９５％、９８％および９９％であり得る。
「単離されたポリペプチド」とは、天然に伴う他の夾雑物、例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチドから実質的に分離されたポリペプチドのことを指す。この用語は、天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビトロ合成）から取り出されたかまたは精製されたポリペプチドを包含する。改善されたトランスアミナーゼ酵素は、細胞内に存在し得るか、細胞培地中に存在し得るか、または溶解産物もしくは単離された調製物などの様々な形態で調製され得る。したがって、いくつかの実施形態において、改善されたトランスアミナーゼ酵素は、単離されたポリペプチドであり得る。
「実質的に純粋なポリペプチド」とは、ポリペプチド種が、存在する優勢な種である（すなわち、モル濃度または重量に基づいて、それが、その組成物中の他の任意の個別の高分子種よりも豊富である）組成物のことを指し、通常、対象の種が、モル基準または％重量基準で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成するとき、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なトランスアミナーゼ組成物は、モル基準または％重量基準で、その組成物中に存在するすべての高分子種の約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上および約９８％以上を構成する。いくつかの実施形態において、対象の種は、本質的な均一性（すなわち、従来の検出方法では、組成物中に夾雑物種を検出できない）にまで精製され、ここで、その組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、高分子種と見なされない。いくつかの実施形態において、単離された改善されたトランスアミナーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
「立体選択性」とは、化学反応または酵素反応において、１つの立体異性体が別の立体異性体よりも優先的に形成されることを指す。立体選択性は、一方の立体異性体の形成が他方よりも好まれる場合、部分的であり得るか、またはただ１つの立体異性体が形成される場合、完全であり得る。立体異性体が、エナンチオマーであるとき、立体選択性は、両方の合計における一方のエナンチオマーの割合（代表的には、パーセンテージとして報告される）であるエナンチオ選択性と称される。それは、通常、式［主要なエナンチオマー−少数のエナンチオマー］／［主要なエナンチオマー＋少数のエナンチオマー］に従って計算される、鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）として当該分野において別の方法で（代表的には、パーセンテージとして）報告される。立体異性体が、ジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、２つのジアステレオマーの混合物中の一方のジアステレオマーの割合（代表的には、パーセンテージとして報告される）である、ジアステレオ選択性と称され、通常、その代わりにジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として報告される。鏡像体過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ）の一種である。
「高度に立体選択的」とは、基質、例えば、化合物（２）を、対応するキラルアミン生成物、例えば、化合物（１）に、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で変換することができる化学反応または酵素反応のことを指す。
「改善された酵素特性」とは、参照トランスアミナーゼと比べて任意の酵素特性の改善を示すトランスアミナーゼポリペプチドのことを指す。本明細書中に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの場合、その比較は、通常、野生型トランスアミナーゼ酵素に対して行われるが、いくつかの実施形態において、参照トランスアミナーゼは、別の操作されたトランスアミナーゼであり得る。改善が望ましい酵素特性としては、酵素活性（基質のパーセント変換に関して表現され得る）、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性プロファイル、補助因子の要件、阻害剤（例えば、基質阻害または生成物阻害）に対する不応性、および立体選択性（エナンチオ選択性を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
「高い酵素活性」とは、参照トランスアミナーゼ酵素と比べて、高い比活性（例えば、生成された生成物／時間／重量タンパク質）または基質から生成物への高いパーセント変換（例えば、特定の量のトランスアミナーゼを使用したときの特定の時間内での開始量の基質から生成物へのパーセント変換）によって表され得る、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの改善された特性のことを指す。酵素活性を決定する例示的な方法は、実施例に提供される。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔといった従来の酵素特性を含む、酵素活性に関する任意の特性が、影響され得、その変化が、高い酵素活性をもたらし得る。酵素活性の改善は、そのトランスアミナーゼポリペプチドが由来した天然に存在するトランスアミナーゼまたは別の操作されたトランスアミナーゼよりも、対応する野生型トランスアミナーゼ酵素の約１．２倍の酵素活性から、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍またはそれを超える酵素活性までであり得る。トランスアミナーゼ活性は、標準的なアッセイのいずれか１つによって（例えば、反応物または生成物の分光光度的な特性の変化をモニターすることによって）計測され得る。いくつかの実施形態において、生成された生成物の量は、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）などを用いた誘導体化後に、ＵＶ吸光度または蛍光検出と組み合わされた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離によって計測され得る。酵素活性の比較は、本明細書中で詳細にさらに記載されるように、規定の酵素調製物、所定の条件下での規定のアッセイおよび１つ以上の規定の基質を用いて行われる。通常、溶解産物を比較するとき、宿主細胞によって産生される酵素の量および溶解産物中に存在する酵素の量の変動を最小にするために、同一の発現系および同一の宿主細胞を使用して、細胞数およびアッセイされるタンパク質の量が決定される。
「変換」とは、基質から対応する生成物への酵素的変換のことを指す。「パーセント変換」とは、特定の条件下、ある時間内で生成物に変換される基質のパーセントのことを指す。したがって、トランスアミナーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質から生成物への「パーセント変換」として表現され得る。
「熱安定」とは、ある時間（例えば、０．５〜２４時間）にわたって高温（例えば、４０〜８０℃）に曝露された後に、野生型酵素と比べて類似の活性（例えば、６０％〜８０％超）を維持するトランスアミナーゼポリペプチドのことを指す。
「溶媒安定」とは、ある時間（例えば、０．５〜２４時間）にわたって様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）に曝露された後に、野生型酵素と比べて類似の活性（例えば、６０％〜８０％超）を維持するトランスアミナーゼポリペプチドのことを指す。
「熱安定および溶媒安定」とは、熱安定と溶媒安定の両方であるトランスアミナーゼポリペプチドのことを指す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、核酸ハイブリッドが安定である条件のことを指すために本明細書中で使用される。当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性は、そのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドに対するＴｍ値は、融解温度を予測するための公知の方法を用いて計算され得る（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６８：７６１−７７７；Ｂｏｌｔｏｎら、１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：１３９０；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３：８８９３−８８９７；Ｆｒｅｉｅｒら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｋｉｅｒｚｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：７８４０−７８４６；Ｒｙｃｈｌｉｋら、１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：６４０９−６４１２（ｅｒｒａｔｕｍ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：６９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）；Ｓｕｇｇｓら、１９８１，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ（Ｂｒｏｗｎら、ｅｄｓ．），ｐｐ．６８３−６９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＷｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６：２２７−２５９を参照のこと。すべての刊行物が参照により本明細書中に援用される）。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されるポリペプチドをコードし、規定の条件（例えば、中程度にストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件）下で、本開示の操作されたトランスアミナーゼ酵素をコードする配列の相補鎖にハイブリダイズする。
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われた後、様々であるがより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。用語「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」とは、標的ＤＮＡが、標的ポリヌクレオチドに対する約９０％超の同一性とともに、その標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する相補的な核酸に結合することを可能にする条件のことを指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、４２℃の５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションの後の、４２℃の０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでの洗浄に等価な条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」とは、規定のポリヌクレオチド配列に対する溶液条件下で測定されたときの熱融解温度Ｔｍからの約１０℃以下の条件のことを広く指す。いくつかの実施形態において、高ストリンジェンシー条件とは、６５℃の０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成するそれらの核酸配列だけのハイブリダイゼーションを可能にする条件のことを指す（すなわち、ハイブリッドが、６５℃の０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定でない場合、それは、本明細書中で企図されるような高ストリンジェンシー条件下では安定でないだろう）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃の５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳに等価な条件におけるハイブリダイゼーションの後の、６５℃の０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳでの洗浄によって提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃の０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ中でのハイブリダイズに等価な条件でのハイブリダイズおよび６５℃の０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣでの洗浄である。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件ならびに中程度にストリンジェントな条件は、上で引用された参考文献に記載されている。
「異種」ポリヌクレオチドとは、研究室の手法によって宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドのことを指し、それには、研究室の操作に供され、次いで、宿主細胞に再導入される、宿主細胞から取り出されたポリヌクレオチドが含まれる。
「コドンが最適化された」とは、コードされるタンパク質が目的の生物において効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを特定の生物において優先的に使用されるコドンに変更することを指す。ほとんどのアミノ酸が、「同義語」または「同義の」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点で遺伝暗号は縮重しているが、特定の生物のコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）は、ランダムではなく、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所与の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、低コピー数のタンパク質と比べて高度に発現されるタンパク質、および生物のゲノムの集合したタンパク質コード領域に関して、より高い場合がある。いくつかの実施形態において、トランスアミナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な生成のためにコドンが最適化される場合がある。
「好ましい、最適な、高い、コドン使用頻度の偏りのコドン」とは、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも高い頻度でタンパク質コード領域に使用されているコドンのことを交換可能に指す。それらの好ましいコドンは、単一の遺伝子、共通の機能または起源の遺伝子セット、高度に発現される遺伝子におけるコドン使用頻度、生物全体の集合したタンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連する生物の集合したタンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはそれらの組み合わせに関して、決定され得る。遺伝子発現のレベルとともに頻度が上昇するコドンは、概して、発現にとって最適なコドンである。具体的な生物におけるコドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的な同義語コドン使用頻度）およびコドン優先度を測定するための種々の方法が知られており、それらとしては、例えば、クラスター解析または対応分析およびある遺伝子において使用されるコドンの有効数を使用する多変量解析が挙げられる（ＧＣＧ ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ，Ｊｏｈｎ Ｐｅｄｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｊ．Ｏ，１９９８，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４：３７２−７３；Ｓｔｅｎｉｃｏら、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２２４３７−４６；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｆ．，１９９０，Ｇｅｎｅ ８７：２３−２９を参照のこと）。増加している生物リストに対するコドン使用頻度表が入手可能である（例えば、Ｗａｄａら、１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８；Ｎａｋａｍｕｒａら、２０００，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２；Ｄｕｒｅｔら、前出；Ｈｅｎａｕｔ ａｎｄ Ｄａｎｃｈｉｎ，“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，”１９９６，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、Ｅｄｓ．，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ｐ．２０４７−２０６６を参照のこと。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることができる任意の入手可能なヌクレオチド配列に依存し得る。これらのデータセットには、発現されるタンパク質をコードすると実際に知られている核酸配列（例えば、完全なタンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴＳ）またはゲノム配列の予測されるコード領域が含まれる（例えば、Ｍｏｕｎｔ，Ｄ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２５９−２８１；Ｔｉｗａｒｉら、１９９７，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：２６３−２７０を参照のこと）。
「調節配列」は、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有益なすべての構成要素を含むと本明細書中で定義される。各調節配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して天然であり得るか、または外来性であり得る。そのような調節配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。最低でも、調節配列は、プロモーターならびに転写および翻訳の停止シグナルを含む。調節配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と調節配列とのライゲーションを容易にする具体的な制限酵素認識部位を導入する目的でリンカーとともに提供され得る。
「作動可能に連結された」は、調節配列が、目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示するかまたは制御するように、その調節配列が、目的のポリヌクレオチドに対する位置に適切に配置された（すなわち、機能的な関係性で）配置として本明細書中で定義される。
「プロモーター配列」とは、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列のことを指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、変異体プロモーター、切断型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む、最適な宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞と相同または異種である細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得られることがある。
「好適な反応条件」とは、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドが、基質化合物を生成物化合物に変換することができる（例えば、化合物（２）から化合物（１）への変換）、生体触媒反応溶液中の条件（例えば、一連の酵素負荷、基質負荷、補助因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝剤、共溶媒など）のことを指す。例示的な「好適な反応条件」は、詳細な説明において提供され、実施例によって例示される。
「化合物負荷」または「酵素負荷」または「補助因子負荷」におけるような「負荷」とは、反応の開始時における反応混合物中のある成分の濃度または量のことを指す。
生体触媒によって媒介されるプロセスの文脈における「基質」とは、その生体触媒によって作用される化合物または分子のことを指す。例えば、本明細書中に開示されるプロセスにおける操作されたトランスアミナーゼ生体触媒に対する例示的な基質は、化合物（２）である。
生体触媒によって媒介されるプロセスの文脈における「生成物」とは、その生体触媒の作用の結果生じる化合物または分子のことを指す。例えば、本明細書中に開示されるプロセスにおける操作されたトランスアミナーゼ生体触媒の例示的な生成物は、化合物（１）である。
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」とは、１つ以上の炭素原子が、各々独立して、同じまたは異なるヘテロ原子またはヘテロ原子団で置き換えられた、本明細書中で定義されるようなアルキル、アルケニルおよびアルキニルのことを指す。炭素原子を置き換え得るヘテロ原子および／またはヘテロ原子団としては、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｏ−、−ＮＲγ−、−ＰＨ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）ＮＲγ−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲγ−など（それらの組み合わせを含む）が挙げられるが、これらに限定されず、ここで、各Ｒγは、独立して、水素、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよび他の好適な置換基から選択される。
「アリール」とは、単環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する６個以上１２個以下の炭素原子の不飽和の芳香族炭素環式基のことを指す。例示的なアリールとしては、フェニル、ピリジル、ナフチルなどが挙げられる。
「アリールアルキル」とは、好ましくは、アルキル部分に１個以上６個以下の炭素原子およびアリール部分に６個以上１２個以下の炭素原子を有する、アリールで置換されたアルキル、すなわち、アリール−アルキル基のことを指す。そのようなアリールアルキル基は、ベンジル、フェネチルなどによって例証される。
「アリールアルケニル」とは、好ましくは、アルケニル部分に２個以上６個以下の炭素原子およびアリール部分に６個以上１２個以下の炭素原子を有する、アリールで置換されたアルケニル、すなわち、アリール−アルケニル基のことを指す。
「アリールアルキニル」とは、好ましくは、アルキニル部分に２個以上６個以下の炭素原子およびアリール部分に６個以上１２個以下の炭素原子を有する、アリールで置換されたアルキニル、すなわち、アリール−アルキニル基のことを指す。
「シクロアルキル」とは、１〜３個のアルキル基で必要に応じて置換され得る単一の環式環または複数の縮合環を有する３個以上１２個以下の炭素原子の環式アルキル基のことを指す。例示的なシクロアルキル基としては、単一の環状構造（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル、１−メチルシクロプロピル、２−メチルシクロペンチル、２−メチルシクロオクチルなど）またはアダマンチルなどのような架橋環系を含む複数の環状構造が挙げられるが、これらに限定されない。
「シクロアルキルアルキル」とは、好ましくは、アルキル部分に１個以上６個以下の炭素原子およびシクロアルキル部分に３個以上１２個以下の炭素原子を有する、シクロアルキルで置換されたアルキル、すなわち、シクロアルキル−アルキル基のことを指す。そのようなシクロアルキルアルキル基は、シクロプロピルメチル、シクロヘキシルエチルなどによって例証される。
「シクロアルキルアルケニル」とは、好ましくは、アルケニル部分に２個以上６個以下の炭素原子およびシクロアルキル部分に３個以上１２個以下の炭素原子を有する、シクロアルキルで置換されたアルケニル、すなわち、シクロアルキル−アルケニル基のことを指す。
「シクロアルキルアルキニル」とは、好ましくは、アルキニル部分に２個以上６個以下の炭素原子およびシクロアルキル部分に３個以上１２個以下の炭素原子を有する、シクロアルキルで置換されたアルキニル、すなわち、シクロアルキル−アルキニル基のことを指す。
「アミノ」とは、基−ＮＨ２のことを指す。置換アミノとは、基−ＮＨＲη、ＮＲηＲηおよびＮＲηＲηＲηのことを指し、ここで、各Ｒηは、独立して、置換または非置換のアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから選択される。代表的なアミノ基としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ（ｍｅｔｈｙｌｙｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏ）、フラニル−オキシ−スルファミノ（ｓｕｌｆａｍｉｎｏ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
「アルキルアミノ」とは、−ＮＨＲζ基のことを指し、ここで、Ｒζは、アルキル、そのＮ−オキシド誘導体または保護された誘導体、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、ｉｓｏ−プロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、ｉｓｏ−ブチルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルアミノまたはメチルアミノ−Ｎ−オキシドなどである。
「アリールアミノ」とは、−ＮＨＲλ（Ｒλは、アリール基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「ヘテロアリールアミノ」とは、−ＮＨＲσ（Ｒσは、ヘテロアリール基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「アミノアルキル」とは、水素原子の１つ以上が、置換アミノ基を含むアミノ基で置き換えられた、アルキル基のことを指す。
「オキソ」とは、＝Ｏのことを指す。
「オキシ」とは、エーテルおよびエステルを含む、二価の基−Ｏ−のことを指し、それは、種々のオキシ基を形成する様々な置換基を有し得る。
「アルコキシ」または「アルキルオキシ」は、基−ＯＲζのことを指すために本明細書中で交換可能に使用され、ここで、Ｒζは、本明細書中で定義されるような必要に応じて置換されるアルキル基を含む、アルキル基である。
「アリールオキシ」とは、−ＯＲλ基（Ｒλは、アリール基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「ヘテロアリールオキシ」とは、−ＯＲσ（Ｒσは、ヘテロアリール基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「カルボキシ」とは、−ＣＯＯＨのことを指す。
「カルボキシアルキル」とは、カルボキシ基で置換されたアルキルのことを指す。
「カルボニル」とは、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステルおよびケトンを含む種々のカルボニル基を形成する種々の置換基を有し得る、−Ｃ（Ｏ）−のことを指す。
「アルキルカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）Ｒζ（Ｒζは、アルキル基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「アリールカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）Ｒλ（Ｒλは、アリール基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「ヘテロアリールカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）Ｒσ（Ｒσは、ヘテロアリール基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「アルキルオキシカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）ＯＲζ（Ｒζは、アルキル基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「アリールオキシカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）ＯＲλ（Ｒλは、アリール基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「ヘテロアリールオキシカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）ＯＲσ（Ｒσは、ヘテロアリール基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「アリールアルキルオキシカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）ＯＲρ（Ｒρは、アリール−アルキル基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「アルキルカルボニルオキシ」とは、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒζ（Ｒは、アルキル基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「アリールカルボニルオキシ」とは、−ＯＣ（Ｏ）Ｒλ（Ｒは、アリール基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「ヘテロアリールアルキルオキシカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）ＯＲω（Ｒωは、ヘテロアリールアルキル基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「ヘテロアリールカルボニルオキシ」とは、−ＯＣ（Ｏ）Ｒσ（Ｒσは、ヘテロアリール基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「アミノカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２のことを指す。置換アミノカルボニルとは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲηＲηのことを指し、ここで、アミノ基ＮＲηＲηは、本明細書中で定義されるとおりである。
「アミノカルボニルアルキル」とは、アミノカルボニル基で置換されたアルキルのことを指す。
「ハロゲン」または「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードのことを指す。
「ハロアルキル」とは、１つ以上のハロゲンで置換されたアルキル基のことを指す。したがって、用語「ハロアルキル」は、モノハロアルキル、ジハロアルキル、トリハロアルキルなど、ペルハロアルキルまでを含むと意味される。例えば、表現「（Ｃ１Ｃ２）ハロアルキル」には、１−フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、１−フルオロエチル、１，１−ジフルオロエチル、１，２−ジフルオロエチル、１，１，１トリフルオロエチル、ペルフルオロエチルなどが含まれる。
「ヒドロキシ」とは、−ＯＨのことを指す。
「ヒドロキシアルキル」とは、１つ以上のヒドロキシ基で置換されたアルキルのことを指す。
「シアノ」とは、−ＣＮのことを指す。
「ニトロ」とは、−ＮＯ２のことを指す。
「チオ」または「スルファニル」とは、−ＳＨのことを指す。置換チオまたは置換スルファニルとは、−Ｓ−Ｒηのことを指し、ここで、Ｒηは、アルキル、アリールまたは他の好適な置換基である。
「アルキルチオ」とは、−ＳＲζ（Ｒζは、アルキルである）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。代表的なアルキルチオ基としては、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「アリールチオ」とは、−ＳＲλ（Ｒλは、アリールである）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。代表的なアリールチオ基としては、フェニルチオ、（４−メチルフェニル）チオ、ピリジニルチオなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「ヘテロアリールチオ」とは、−ＳＲσ（Ｒσは、ヘテロアリールである）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「スルホニル」とは、−ＳＯ２−のことを指す。置換スルホニルとは、−ＳＯ２−Ｒηのことを指し、ここで、Ｒηは、アルキル、アリールまたは他の好適な置換基である。
「アルキルスルホニル」とは、−ＳＯ２−Ｒζ（Ｒζは、アルキルである）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。代表的なアルキルスルホニル基としては、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「アリールスルホニル（Ａｒｙｓｕｌｆｏｎｙｌ）」とは、−ＳＯ２−Ｒλ（Ｒλは、アリールである）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。代表的なアリールスルホニル基としては、フェニルスルホニル、（４−メチルフェニル）スルホニル、ピリジニルスルホニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「ヘテロアリールスルホニル」とは、−ＳＯ２−Ｒσ（Ｒσは、ヘテロアリール基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「スルフィニル」とは、−ＳＯ−のことを指す。置換スルフィニルとは、−ＳＯ−Ｒηのことを指し、ここで、Ｒηは、アルキル、アリールまたは他の好適な置換基である。
「アルキルスルフィニル」とは、−ＳＯ−Ｒζ（Ｒζは、アルキルである）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。代表的なアルキルスルフィニル基としては、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ｎ−プロピルスルフィニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「アリールスルフィニル（Ａｒｙｓｕｌｆｉｎｙｌ）」とは、−ＳＯ−Ｒλ（Ｒλは、アリールである）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。代表的なアリールスルフィニル基としては、フェニルスルフィニル、（４−メチルフェニル）スルフィニル、ピリジニルスルフィニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「ヘテロアリールスルフィニル」とは、−ＳＯ−Ｒσ（Ｒσは、ヘテロアリール基である）のことを指し、それは、必要に応じて置換され得る。
「アルキルアミノスルホニルアルキル」とは、アルキル−ＮＨ−ＳＯ２−基で置換されたアルキルのことを指す。
「アリールスルホニルアルキル」とは、アリール−ＳＯ２−基で置換されたアルキルのことを指す。
「ヘテロアリールスルホニルアルキル」とは、ヘテロアリール−ＳＯ２−基で置換されたアルキルのことを指す。
「アミノスルホニル」とは、−ＳＯ２ＮＨ２のことを指す。置換アミノスルホニルとは、−ＳＯ２ＮＲδＲδのことを指し、ここで、アミノ基−ＮＲηＲηは、本明細書中で定義されるとおりである。
「ヘテロアリール」とは、環内の１個以上１０個以下の炭素原子、ならびに酸素、窒素および硫黄から選択される１個以上４個以下のヘテロ原子の芳香族複素環式基のことを指す。そのようなヘテロアリール基は、単環（例えば、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有し得る。
「ヘテロアリールアルキル」とは、好ましくは、アルキル部分に１個以上６個以下の炭素原子およびヘテロアリール部分に５個以上１２個以下の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されたアルキル、すなわち、ヘテロアリール−アルキル基のことを指す。そのようなヘテロアリールアルキル基は、ピリジルメチルなどによって例証される。
「ヘテロアリールアルケニル」とは、好ましくは、アルケニル部分に２個以上６個以下の炭素原子およびヘテロアリール部分に５個以上１２個以下の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されたアルケニル、すなわち、ヘテロアリール−アルケニル基のことを指す。
「ヘテロアリールアルキニル」とは、好ましくは、アルキニル部分に２個以上６個以下の炭素原子およびヘテロアリール部分に５個以上１２個以下の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されたアルキニル、すなわち、ヘテロアリール−アルキニル基のことを指す。
「複素環」、「複素環式」および交換可能に「ヘテロシクロアルキル」とは、単環または複数の縮合環、２個以上１０個以下の炭素環原子および環内に窒素、硫黄または酸素から選択される１個以上４個以下のヘテロ環原子を有する飽和基または不飽和基のことを指す。そのような複素環式基は、単環（例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフランまたはキヌクリジニル）を有し得る。複素環の例としては、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「ヘテロシクロアルキルアルキル」とは、好ましくは、アルキル部分に１個以上６個以下の炭素原子およびヘテロシクロアルキル部分に３個以上１２個以下の環原子を有する、ヘテロシクロアルキルで置換されたアルキル、すなわち、ヘテロシクロアルキル−アルキル基のことを指す。
「ヘテロシクロアルキルアルケニル」とは、好ましくは、アルケニル部分に２個以上６個以下の炭素原子およびヘテロシクロアルキル部分に３個以上１２個以下の環原子を有する、ヘテロシクロアルキルで置換されたアルケニル、すなわち、ヘテロシクロアルキル−アルケニル基のことを指す。
「ヘテロシクロアルキルアルキニル」とは、好ましくは、アルキニル部分に２個以上６個以下の炭素原子およびヘテロシクロアルキル部分に３個以上１２個以下の環原子を有する、ヘテロシクロアルキルで置換されたアルキニル、すなわち、ヘテロシクロアルキル−アルキニル基のことを指す。
「脱離基」とは、通常、化学反応において別の原子または部分によって置き換えられることが可能な任意の原子または部分のことを指す。より詳細には、脱離基とは、求核剤（例えば、アミン、チオール、アルコールまたはシアニド）によって容易に置き換えられるおよび置換される原子または部分のことを指す。そのような脱離基は、周知であり、それらには、カルボキシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素）およびアルキルオキシ基が含まれる。脱離基の非限定的な特色および例は、例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ ｅｄ．，Ｆｒａｎｃｉｓ Ｃａｒｅｙ（１９９２），３２８−３３１頁；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ ｅｄ．，Ａｎｄｒｅｗ Ｓｔｒｅｉｔｗｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｃｌａｙｔｏｎ Ｈｅａｔｈｃｏｃｋ（１９８１），１６９−１７１頁；ならびにＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ ＭｃＭｕｒｒｙ，Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００），３９８頁および４０８頁に見られ；これらのすべてが参照により本明細書中に援用される。
別段特定されない限り、前述の基の中の水素によって占有される位置は、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ（ａｍｉｄｏｘｉｍｏ）、ヒドロキサモイル（ｈｙｄｒｏｘａｍｏｙｌ）、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、複素環、（複素環）オキシおよび（複素環）アルキルによって例証されるがこれらに限定されない置換基でさらに置換され得；好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄である。開殻の原子価（ｏｐｅｎ ｖａｌｅｎｃｅ）が、これらの置換基上に存在する場合、それらは、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよび／または複素環基でさらに置換され得ること、これらの開殻の原子価が、炭素上に存在する場合、それらは、ハロゲンおよび酸素、窒素または硫黄に結合された置換基によってさらに置換され得ること、ならびに複数のそのような開殻の原子価が存在する場合、これらの基はつなぎ合わされることにより、結合の直接的な形成または新しいヘテロ原子、好ましくは、酸素、窒素もしくは硫黄との結合の形成によって、環を形成し得ることが、理解される。水素を置換基で置き換えることが、許容できない不安定性を本開示の分子にもたらさず、その他の点で化学的に妥当であるならば、上記の置換を行うことができることがさらに理解される。
「随意の」または「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が、生じてもよいし生じなくてもよいこと、ならびにその記載が、その事象または状況が生じる場合およびその事象または状況が生じない場合を含むことを意味する。当業者は、１つ以上の随意の置換基を含むと記載される任意の分子に関して、立体的に実際的であるおよび／または合成的にあり得る化合物だけが含まれると意味されることを理解するだろう。「必要に応じて置換される」は、１つの用語の化学基または一連の化学基におけるその後のすべての修飾語について言及する。例えば、用語「必要に応じて置換されるアリールアルキル」において、その分子の「アルキル」部分および「アリール」部分は、置換されてもよいし置換されなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されるアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」の場合、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール基は、他のものとは無関係に、置換されてもよいし置換されなくてもよい。
「保護基」とは、ある分子の中の反応性の官能基に付着されたとき、官能基の反応性をマスクするか、減少させるかまたは妨げる原子の群のことを指す。代表的には、保護基は、合成の経過中に望むとおりに選択的に除去され得る。保護基の例は、Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，“Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）およびＨａｒｒｉｓｏｎら、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．１−８，１９７１−１９９６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹに見られる。保護基を有し得る官能基としては、ヒドロキシ、アミノおよびカルボキシ基が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なアミノ保護基としては、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（「ＣＢＺ」）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（「Ｂｏｃ」）、トリメチルシリル（「ＴＭＳ」）、２−トリメチルシリル−エタンスルホニル（「ＳＥＳ」）、トリチル基および置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（「ＦＭＯＣ」）、ニトロ−ベラトリルオキシカルボニル（「ＮＶＯＣ」）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される「ポリオール」とは、複数のヒドロキシ基を含む化合物のことを指す。ポリマーに関して、ポリオールは、ヒドロキシル官能基を有するポリマーを含む。例示的なポリマーポリオールとしては、例として、これらに限定されないが、ポリエーテルおよびポリエステル、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（テトラメチレン）グリコールおよびポリテトラヒドロフランが挙げられる。
５．３ 操作されたトランスアミナーゼポリペプチド
本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそれらのポリペプチドを使用するための方法を提供する。前述の説明は、ポリペプチドに関するものであるが、それが、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのことも説明していると理解されるべきである。
アミノトランスフェラーゼとしても知られるトランスアミナーゼは、アミノドナー基質の第１級アミンからアミノアクセプター分子のカルボニル基（例えば、ケトまたはアルデヒド基）へのアミノ基の転移を触媒する。トランスアミナーゼは、種々の微生物から同定されており、それらの微生物としては、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｏｃｅａｎｉｃｏｌａ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ ＨＴＣＣ２５１６、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＲＥＤ６５、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．ＭＥＤ９２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．（ＮＧＲ２３４株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＶｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｈｉｎら、２００１，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１７８２−１７８８を参照のこと）。
トランスアミナーゼは、そのトランスアミナーゼが立体特異的様式で反応を行うことができる能力、すなわち、一方のエナンチオマーを対応するケトンに優先的に変換し、それにより、他方のエナンチオマーが濃縮された混合物をもたらす能力を利用することによる、ラセミアミンのキラル分割にとって有用である（例えば、Ｋｏｓｅｌｅｗｓｋｉら、２００９，Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ．１１（２１）：４８１０−２を参照のこと）。また、ケトンから対応するアミンへの変換におけるトランスアミナーゼの立体選択性のおかげで、これらの酵素は、対応するケト化合物からの光学的に純粋なアミンの不斉合成において有用になる（例えば、Ｈｏｅｈｎｅら、“Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｒｏｕｔｅｓ ｔｏ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ａｍｉｎｅｓ，”Ｃｈｅｍ Ｃａｔ Ｃｈｅｍ １（１）：４２−５１；Ｚｕａ ａｎｄ Ｈｕａ，２００９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．４（１０）：１４２０−３１を参照のこと）。
Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ω−ＶｆＴ由来の野生型ω−トランスアミナーゼは、ある特定のキラルアミンの（Ｓ）−エナンチオマーに対して高いエナンチオ選択性を示し、キラル芳香族アミンに対して基質特異性を有する（例えば、Ｓｈｉｎ ａｎｄ Ｋｉｍ，２００２，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：２８４８−２８５３を参照のこと）。このω−ＶｆＴの高いエナンチオ選択性は、アミンのキラル分割に応用されている（例えば、Ｙｕｎら、２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：７７２−７７８；Ｓｈｉｎ ａｎｄ Ｋｉｍ，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５５：３４８−３５８；Ｍ．Ｈｃｈｎｅら、２００８，Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．３５０：８０２−８０７を参照のこと）。ω−ＶｆＴトランスアミナーゼは、プロキラルなケトン基質を使用する光学的に純粋なアミンの不斉合成にも使用されている。しかしながら、キラルアミンの不斉合成におけるこのトランスアミナーゼの使用は、逆反応の好ましくない平衡状態（例えば、Ｓｈｉｎ ａｎｄ Ｋｉｍ，１９９９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６５，２０６−２１１を参照のこと）；キラルアミン生成物による阻害（例えば、Ｓｈｉｎら、２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７３：１７９−１８７；Ｙｕｎ ａｎｄ Ｋｉｍ，２００８，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１１）：３０３０−３０３３を参照のこと）；芳香族基などの嵩高い側鎖を有するアミンアクセプターに対する低い活性（例えば、Ｓｈｉｎ ａｎｄ Ｋｉｍ，２００２，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：２８４８−２８５３を参照のこと）；および低い酵素安定性（例えば、Ｙｕｎ ａｎｄ Ｋｉｍ、前出を参照のこと）によって限定される。
Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓのω−ＶｆＴトランスアミナーゼに由来する改変体トランスアミナーゼは、脂肪族ケトンに対して高い抵抗性（例えば、Ｙｕｎら、２００５，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｉｏｂｉｏｌ．７１（８）：４２２０−４２２４を参照のこと）および広いアミノドナー基質特異性（例えば、Ｃｈｏら、２００８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．９９（２）：２７５−８４を参照のこと）を有すると報告されている。特許公報ＷＯ２０１００８１０５３およびＵＳ２０１００２０９９８１（これらの各々が、参照により本明細書中に援用される）には、温度および／または有機溶媒に対する高い安定性ならびに構造的に異なるアミノアクセプター分子に対する高い酵素活性を含む、キラルアミン化合物の合成において使用するための改善された特性を有するω−ＶｆＴに由来する操作されたトランスアミナーゼが記載されている。特許公報ＷＯ２０１１１５９９１０（参照により本明細書中に援用される）には、基質である３’−ヒドロキシアセトフェノンから生成物である（Ｓ）−３−（１−アミノエチル）−フェノールへのエナンチオ選択的な変換に対して最適化された、ω−ＶｆＴに由来する操作されたトランスアミナーゼが記載されている。
本開示は、特許公報ＷＯ２０１００８１０５３に開示されている以前に操作されたトランスアミナーゼに由来する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドに関する。本開示の操作されたトランスアミナーゼは、特に大きなアミノアクセプター化合物基質を対応するキラルアミン化合物生成物に変換することを可能にするアミノ酸残基置換によって操作されている。
著しいことに、本開示は、これらの特に大きなアミンアクセプター基質を用いて、酵素活性、エナンチオ選択性、安定性および生成物阻害に対する不応性を高め得る、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基位置および対応するアミノ酸残基置換を同定する。
例示的な大きな基質アミンアクセプターの化合物のプロキラルなケトン基から対応するキラルアミン生成物への変換に基づく活性アッセイを使用して、改善された機能特性についてのスクリーニングによって、構造に基づく合理的配列ライブラリー設計を使用する定向進化法によって操作することによる、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドにおける具体的な残基位置および置換の同定。詳細には、スキーム３に示されるような、化合物（２）のシクロパミンアナログ化合物のケトンから化合物（１）の対応するキラルアミン化合物への変換。
本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを、アミノドナーの存在下、好適な反応条件下、かつジアステレオマー（ｄｉａｓｔｅｒｉｏｍｅｒｉｃ）過剰で（すなわち、キラルアミン中心に反対のエナンチオマーを有する他のジアステレオマーを上回って）、例示的な基質化合物（２）のケトンを例示的な生成物化合物（１）の対応するキラルアミンに効率的に変換するように進化させた。
本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの具体的な構造的特徴および構造と機能の相関情報によってもまた、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドが、化合物（２）以外のプロキラルな大きなケトン基質化合物から化合物（１）以外のキラルアミン化合物への変換を行うことが可能になる。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、化合物（２）の構造アナログであるプロキラルな大きなケトン基質化合物を、化合物（１）の構造アナログである対応するキラルアミン生成物化合物に変換することができる。本開示によって提供される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用して触媒変換を起こすことができる大きなケトン基質構造アナログ化合物の範囲は、スキーム４に示される式（ＩＩ）の化合物から式（Ｉ）の化合物への変換によって例示される。
スキーム４に示されるように、式（ＩＩ）の大きな基質ケトン化合物は、環Ａの１位に位置するキラルアミンに変換されるプロキラルなケトン基を有する４つの環を含む構造を有する。環ＡおよびＢは、２〜１０位の１つ以上において必要に応じて独立して置換される６員の炭素環であり；環Ｃは、１１位において必要に応じて置換される５または６員の炭素環（すなわち、ｍ＝０または１）であり；環Ｄは、１４、１５および１６位において必要に応じて独立して置換される５、６または７員の炭素環（すなわち、ｎ＝０、１または２）である。本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの構造的特徴は、式（ＩＩ）の化合物の環Ａの１位におけるケトンからキラルアミンへの立体選択的な変換における活性を維持しつつ、環Ｄの１４、１５および１６位において置換される大きな基を有する基質である式（ＩＩ）の化合物を収容することができる。理論に拘束されるものではないが、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの構造は、立体選択的なアミノ基転移に対する活性部位の適切な位置において環Ａの１位にケトンを維持しつつ、環Ｄの１４、１５および１６位において置換される大きな基が、その酵素の周りの溶媒に伸びることを可能にする。さらに、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの結合ポケットは、式（ＩＩ）の化合物の環Ａの１位におけるケトンからキラルアミンへの立体選択的な変換における活性を維持しつつ、環Ａ、ＢおよびＣ上のある特定の位置におけるより小さい基の置換を可能にする（下記でさらに説明されるように）。
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、式（ＩＩ）のケトン基質化合物を式（Ｉ）の対応するキラルアミン化合物に変換することができ、ここで、それらの化合物の環Ａ〜Ｄは、以下のとおり置換され得る：
環Ａは、２位と３位との間および／もしくは５位と６位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を必要に応じて含み、かつ／または２、３、４、５および６位においてハロ、ヒドロキシおよびメチルから選択される基で必要に応じて独立して置換される、６員の炭素環であり；
環Ｂは、５位と１０位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を必要に応じて含み、かつ／または９位および１０位のうちの１つ以上においてハロ、ヒドロキシおよびメチルから選択される基で必要に応じて独立して置換される、６員の炭素環であり；
環Ｃは、１０位においてハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択される基で必要に応じて置換される、５または６員の炭素環（すなわち、ｍ＝０または１）であり；
環Ｄは、１、２もしくは３つの不飽和Ｃ−Ｃ結合を必要に応じて含み、かつ／または以下のとおり：
１４位において、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、および１２位に架橋しているシクロプロピルから選択される基で；
１５位または１６位において、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニル、アミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換されるシクロアルキル、必要に応じて置換されるヘテロシクロアルキル、必要に応じて置換されるアリール、必要に応じて置換されるヘテロアリール、必要に応じて置換されるアリールオキシ、必要に応じて置換されるアリールアミノ、必要に応じて置換されるアリールチオ、必要に応じて置換されるアリールスルホニル、必要に応じて置換されるアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるアリールカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールアミノ、必要に応じて置換されるヘテロアリールチオ、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルホニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールカルボニルオキシ、アルキルアミノスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよびヘテロアリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される基で、
必要に応じて独立して置換される、５、６または７員の炭素環（すなわち、ｎ＝０、１または２）である。
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、式（ＩＩａ）の化合物（式中、環Ｃは、１１位において必要に応じて置換される５員の炭素環であり、環Ｄは、１６位において置換される７員の炭素環である）などのシクロパミンアナログ化合物である式（ＩＩ）のケトン基質化合物を変換することができ、そのケトン基質化合物は、スキーム５に示されるように、式（Ｉａ）のキラルアミン生成物に変換され得る：
式中、
環ＡおよびＢは、以下：
（ａ）５位と６位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｂ）５位と１０位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｃ）５位に、４位のメチル基に対してシスである水素；または
（ｄ）５位に、４位のメチル基に対してトランスである水素
のうちの１つを含み；
環Ｄは、１２位と１４位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を含み；
Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択され；
Ｒ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択され；
Ｒ３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニルおよびアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される。
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、式（ＩＩｂ）の化合物（式中、環Ｃは、５員の炭素環であり、環Ｄは、６員の炭素環である）などのシクロパミンアナログ化合物である式（ＩＩ）のケトン基質化合物を変換することができ、そのケトン基質化合物は、スキーム６に示されるように、式（Ｉｂ）のキラルアミン生成物に変換され得る：
式中、
環ＡおよびＢは、以下：
（ａ）５位と６位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｂ）５位と１０位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｃ）５位に、４位のメチル基に対してシスである水素；または
（ｄ）５位に、４位のメチル基に対してトランスである水素
のうちの１つを含み；
環Ｄは、１２位と１４位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合または１２位と１４位との間に架橋シクロプロピルを含み；
Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択され；
Ｒ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択され；
Ｒ３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニルおよびアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される。
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、式（ＩＩｃ）の化合物（式中、環Ｃは、５員の炭素環であり、環Ｄは、６員の炭素環である）などのベラトラミンアナログ化合物である式（ＩＩ）のケトン基質化合物を変換することができ、そのケトン基質化合物は、スキーム７に示されるように、式（Ｉｃ）のキラルアミン生成物に変換され得る：
式中、
環ＡおよびＢは、以下：
（ａ）５位と６位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｂ）５位と１０位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｃ）５位に、４位のメチル基に対してシスである水素；または
（ｄ）５位に、４位のメチル基に対してトランスである水素
のうちの１つを含み；
環Ｄは、芳香族であり；
Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択され；
Ｒ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択され；
Ｒ３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニルおよびアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される。
いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、式（ＩＩｄ）の化合物（式中、環Ｃは、６員の炭素環であり、環Ｄは、５員の炭素環である）などのステロイドアナログ化合物である式（ＩＩ）のケトン基質化合物を変換することができ、そのケトン基質化合物は、スキーム８に示されるように、式（Ｉｄ）のキラルアミン生成物に変換され得る：
式中、
環Ａは、２位と３位との間または５位と６位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を含み；
Ｒ１およびＲ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニル、アミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換されるシクロアルキル、必要に応じて置換されるヘテロシクロアルキル、必要に応じて置換されるアリール、必要に応じて置換されるヘテロアリール、必要に応じて置換されるアリールオキシ、必要に応じて置換されるアリールアミノ、必要に応じて置換されるアリールチオ、必要に応じて置換されるアリールスルホニル、必要に応じて置換されるアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるアリールカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールアミノ、必要に応じて置換されるヘテロアリールチオ、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルホニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールカルボニルオキシ、アルキルアミノスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよびヘテロアリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立して選択され；
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから独立して選択され；
Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素、ハロ、ヒドロキシおよびメチルから独立して選択される。
式（ＩＩ）の大きなケトン基質化合物から式（Ｉ）のキラルアミン生成物化合物への効率的な変換に適合された操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２の操作された参照トランスアミナーゼポリペプチドのアミノ酸配列と比べて、１つ以上の残基差異を有する。その残基差異は、酵素活性、酵素安定性および生成物のアミンによる阻害に対する抵抗性を含む酵素特性の増強に関連する。
いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、規定の時間において同じ量の酵素を用いたとき、野生型または配列番号４の操作された参照トランスアミナーゼと比べて、式（ＩＩ）の基質化合物（例えば、化合物（２））から式（Ｉ）のアミノ生成物化合物（例えば、化合物（１））への、ジアステレオマー過剰での変換において高い活性を示す。いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、好適な反応条件下において、配列番号４によって表される操作された参照ポリペプチドと比べて、少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍もしくは５０倍またはそれを超える活性を有する。
いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、野生型または操作された参照酵素と比べて、変換反応において使用される温度および／または溶媒に対して高い安定性を有する。いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、好適な反応条件下において、配列番号４の参照ポリペプチドと比べて、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれを超える安定性を有する。
いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、野生型または操作された参照酵素と比べて、化合物（１）の生成物キラルアミンによる阻害に対して高い不応性または抵抗性を有する。いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、下記でさらに説明されるように、好適な反応条件下において、配列番号４によって表されるポリペプチドと比べて、化合物（１）の生成物による阻害に対して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍またはそれを超える高い抵抗性を有する。
いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、好適な反応条件下において、化合物（２）の基質を化合物（１）に、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％超またはそれを超えるジアステレオマー過剰率で（すなわち、キラルアミン中心に反対のエナンチオマーを有する他のジアステレオ異性生成物化合物に対して過剰で）変換することができる。
いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、好適な反応条件下において、配列番号４の参照ポリペプチドと比較して、基質の存在について高い許容度で基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができる。したがって、いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、好適な反応条件下、約７２時間以下、約４８時間以下、約３６時間以下または約２４時間以下（２４ｈ ｌｅｓｓ）の反応時間において、少なくとも約１ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１２５ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ、約１７５ｇ／Ｌもしくは約２００ｇ／Ｌまたはそれを超える基質負荷濃度において、少なくとも約少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のパーセント変換で、基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができる。
上に記載された改善された特性の操作されたポリペプチドが上記変換を行う好適な反応条件は、下記および実施例においてさらに説明されるように、ポリペプチドの濃度もしくは量、基質、補助因子、緩衝剤、共溶媒、ｐＨならびに／または温度および反応時間を含む条件に関して決定され得る。
本開示は、化合物（２）の構造アナログである式（ＩＩ）のプロキラルな大きなケトン基質化合物を、化合物（１）の構造アナログである式（Ｉ）の対応するキラルアミン生成物化合物に変換することができる構造的特徴を有する２００個の例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供する。本開示は、本開示に添付されている配列表の電子ファイル（参照により本明細書中に援用される）に、その２００個の例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの配列構造を配列番号５〜２０４として提供する。奇数の配列識別子（すなわち、配列番号）は、偶数の配列番号によって提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。本開示は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの機能活性とともに具体的なアミノ酸配列の特徴と相関する配列の構造情報も、表２Ａおよび２Ｂに提供する。この構造と機能との相関関係の情報は、配列番号２の操作された参照ポリペプチドと比較したときの具体的なアミノ酸残基の差異および配列番号５〜２０４の２００個の例示的な操作されたトランスアミナーゼに対する実験的に決定された関連する活性データの形態で提供される。アミノ酸残基差異は、野生型ω−ＶｆＴポリペプチドの配列（アクセッション：ｇｉ｜３２７２０７０６６｜ｇｂ｜ＡＥＡ３９１８３．１｜）と比較して以下の１０個のアミノ酸残基差異を有する配列番号２の参照配列との比較に基づく：Ａ９Ｔ；Ｎ４５Ｈ；Ｗ５７Ｌ；Ｆ８６Ｓ；Ｖ１５３Ａ；Ｖ１７７Ｌ；Ｒ２１１Ｋ；Ｍ２９４Ｖ；Ｓ３２４Ｇ；およびＴ３９１Ａ。例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの各々の相対的なトランスアミナーゼ活性を、１次スクリーニングとして使用されたハイスループット（ＨＴＰ）アッセイにおいて、所定の時間および温度にわたって、配列番号４の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのトランスアミナーゼ活性と比較して、基本型である化合物（２）の大きな基質ケトンから化合物（１）のキラルアミン生成物への変換として決定した。活性の基準として使用された配列番号４の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２の参照配列と比較して以下の８つのアミノ酸残基差異を有する：Ｔ３４Ａ；Ｌ５６Ａ；Ｒ８８Ｈ；Ａ１５３Ｃ；Ａ１５５Ｖ；Ｋ１６３Ｆ；Ｅ３１５Ｇ；およびＬ４１７Ｔ。表２ＡにおけるＨＴＰ活性アッセイの値は、表および実施例において記述されるようなアッセイ反応条件に従って、１ウェルあたり約２００μＬの体積の９６ウェルプレート形式において、大腸菌の透明な細胞溶解産物を使用して決定された。
場合によっては、振とうフラスコ粉末（ｓｈａｋｅ−ｆｌａｓｋ ｐｏｗｄｅｒ）（ＳＦＰ）および／またはダウンストリームプロセス（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）（ＤＳＰ）粉末アッセイを、例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの特性を評価する二次スクリーニングとして使用した（その結果が、表２Ｂに提供される）。このＳＦＰおよびＤＳＰの形態は、操作されたポリペプチドのより精製された粉末調製物を提供する。例えば、ＳＦＰ調製物中の操作されたトランスアミナーゼは、その調製物中におよそ３０％の総タンパク質であるが、ＤＳＰ調製物中の操作されたトランスアミナーゼは、およそ８０％の総タンパク質である。安定性の評価は、２つの異なる温度、５５℃および６０℃における活性を比較することによって行われた。
アミノ酸配列の観察、ならびに表２Ａおよび２Ｂの２００個の例示的な操作されたポリペプチドに対する結果から、配列番号４と比べて、以下の残基位置：Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ５７、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６３、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ１９０、Ｘ２０６、Ｘ２２８、Ｘ２３３、Ｘ２３５、Ｘ２４４、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１４、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３１９、Ｘ３２３、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９５、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２４、Ｘ４２６、Ｘ４２７、Ｘ４３４およびＸ４５０における１つ以上の残基差異に関連する高い活性、エナンチオ選択性および／または安定性の改善された特性。改善された特性に関連するこれらの位置の各々における具体的なアミノ酸差異は：Ｘ１８Ａ；Ｘ１９Ｗ；Ｘ２１Ｈ；Ｘ３１Ｍ；Ｘ５３Ｍ；Ｘ５６Ａ／Ｃ；Ｘ５７Ｃ／Ｆ；Ｘ７３Ｒ；Ｘ８６Ｃ／Ｎ；Ｘ８８Ｈ／Ｙ；Ｘ１０７Ｇ；Ｘ１１３Ｃ／Ｌ／Ｐ；Ｘ１４６Ｌ；Ｘ１４７Ｈ／Ｋ／Ｖ；Ｘ１５３Ｖ；Ｘ１５５Ａ；Ｘ１６３Ｌ；Ｘ１６５Ｆ；Ｘ１７１Ｑ；Ｘ１７８Ｗ；Ｘ１９０Ｋ；Ｘ２０６Ｋ；Ｘ２２８Ｇ；Ｘ２３３Ｔ／Ｖ；Ｘ２３５Ｐ；Ｘ２４４Ｔ；Ｘ２５１Ｖ；Ｘ２５９Ｖ；Ｘ２６８Ａ；Ｘ２７７Ａ；Ｘ２８６Ｃ／Ｈ；Ｘ３１２Ｎ；Ｘ３１４Ｎ；Ｘ３１６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｎ／Ｓ／Ｔ；Ｘ３１７Ｌ；Ｘ３１９Ｎ；Ｘ３２３Ｔ；Ｘ３５８Ｋ；Ｘ３６６Ｈ；Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｔ／Ｖ；Ｘ３９５Ｐ；Ｘ３９９Ａ；Ｘ４１４Ｉ；Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ；Ｘ４１７Ｖ；Ｘ４２４Ａ；Ｘ４２６Ｒ；Ｘ４２７Ｙ；Ｘ４３４Ｔ；およびＸ４５０Ｓを含む。
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号４によって表される操作されたトランスアミナーゼと比べて、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２３３、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３２３、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２６、Ｘ４３４およびＸ４５０から選択される残基位置に残基差異を有するアミノ酸配列を含み、ここで、残基位置Ｘ２１、Ｘ５６、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ２３３、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３２３、Ｘ３８３、Ｘ４１５、Ｘ４１７およびＸ４３４における残基差異は、Ｘ２１Ｈ、Ｘ５６Ａ／Ｃ、Ｘ８６Ｃ、Ｘ８８Ｈ／Ｙ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ／Ｐ、Ｘ１３３Ａ、Ｘ１４７Ｈ／Ｖ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ２８６Ｃ／Ｈ、Ｘ３１２Ｎ、Ｘ３１６Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｘ３２３Ａ、Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｔ、Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ、Ｘ４１７ＶおよびＸ４３４Ｔから選択される。
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号４によって表される操作されたトランスアミナーゼと比べて、Ｘ１９、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ７３、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ３１７、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４２６およびＸ４５０から選択される残基位置に残基差異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｘ１９、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ７３、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ３１７、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４２６およびＸ４５０位における具体的なアミノ酸差異は、Ｘ１９Ｗ、Ｘ３４Ａ、Ｘ５３Ｍ、Ｘ７３Ｒ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６５Ｆ、Ｘ１７１Ｑ、Ｘ１７８Ｗ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２５９Ｖ、Ｘ２６８Ａ、Ｘ２７７Ａ、Ｘ３１７Ｌ、Ｘ３５８Ｋ、Ｘ３６６Ｈ、Ｘ３９９Ａ、Ｘ４１４Ｉ、Ｘ４２６ＲおよびＸ４５０Ｓから選択される。
配列番号４と比べたときの上記の残基位置における残基差異に関連する具体的な酵素特性としては、とりわけ、酵素活性および安定性が挙げられる。高い酵素安定性に関連する残基差異は、具体的な残基差異であるＸ３４Ｔ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ、Ｘ１４７Ｈ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ２３３Ｔ／Ｖ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ／ＶおよびＸ４５０Ｓを含む、残基位置Ｘ３４、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ２３３、Ｘ３２３、Ｘ３８３およびＸ４５０における残基差異に関連する。式（ＩＩ）の大きなケトン基質から式（Ｉ）の対応するキラルアミン化合物への変換における高い活性に関連する残基差異は、具体的な残基差異であるＸ５６Ａ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ８８Ｈ、Ｘ１５３Ｃ、Ｘ３１６Ｎ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４１７Ｔを含む、残基位置Ｘ５６、Ｘ５７、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１５３、Ｘ３１６、Ｘ４１５およびＸ４１７における残基差異に関連する。化合物（２）などの式（ＩＩ）の化合物から化合物（１）などの式（Ｉ）の化合物への変換に対する高い％ｅｅに明確に関連する残基差異としては、Ｘ５７Ｆ、Ｘ１５３ＣおよびＸ３１６Ｎが挙げられる。
当業者によって認識されるように、表２Ａおよび２Ｂに開示された残基差異は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの活性および／またはエナンチオ選択性に対して有意な悪影響を及ぼさず、それは、化合物（２）から化合物（１）への変換に対するトランスアミナーゼ活性およびエナンチオ選択性（８５％ｄ．ｅ．以上）を維持する。上記ポリペプチドのほぼすべてが、９５％ｄｅ以上のエナンチオ選択性を有する。したがって、当業者は、本明細書中に開示される残基位置における残基差異が、個別にまたは様々な組み合わせで使用されることにより、式（ＩＩ）の大きなケトン基質化合物を式（Ｉ）のキラルアミン化合物に変換する際のトランスアミナーゼ活性、立体選択性および安定性をとりわけ含む所望の機能特性を有する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドが生成され得ることを理解するだろう。
本明細書中に提供される指針に照らすと、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４の例示的な操作されたポリペプチドのいずれかが、例えば、表２Ａおよび２Ｂの中の他のポリペプチドからの様々なアミノ酸差異と本明細書中に記載される他の残基位置との新しい組み合わせを付加することによるその後の進化のラウンドによって、他の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを合成するための開始時のアミノ酸配列として使用され得ることがさらに企図される。さらなる改善は、それより前の進化のラウンドを通じて変更されないまま維持された残基位置にアミノ酸差異を含めることによってもたらされ得る。
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、トランスアミナーゼ活性、および必要に応じて、ケトン基質化合物（２）をキラルアミン生成物化合物（１）に変換する際の、配列番号４の参照ポリペプチドと比べて改善された特性を有する操作されたポリペプチドを提供し、ここで、そのポリペプチドは、参照配列である配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号２と比べて、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２３３、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３２３、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２６、Ｘ４３４およびＸ４５０から選択される残基位置に１つ以上の残基差異を有するアミノ酸配列を含み、ここで、残基位置Ｘ２１、Ｘ５６、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ２３３、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３２３、Ｘ３８３、Ｘ４１５、Ｘ４１７およびＸ４３４における残基差異は、Ｘ２１Ｈ、Ｘ５６Ａ／Ｃ、Ｘ８６Ｃ、Ｘ８８Ｈ／Ｙ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ／Ｐ、Ｘ１３３Ａ、Ｘ１４７Ｈ／Ｖ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ２８６Ｃ／Ｈ、Ｘ３１２Ｎ、Ｘ３１６Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｘ３２３Ａ、Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｔ、Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ、Ｘ４１７ＶおよびＸ４３４Ｔから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ１９、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ７３、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ３１７、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４２６およびＸ４５０位における具体的なアミノ酸差異は、Ｘ１９Ｗ、Ｘ３４Ａ、Ｘ５３Ｍ、Ｘ７３Ｒ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６５Ｆ、Ｘ１７１Ｑ、Ｘ１７８Ｗ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２５９Ｖ、Ｘ２６８Ａ、Ｘ２７７Ａ、Ｘ３１７Ｌ、Ｘ３５８Ｋ、Ｘ３６６Ｈ、Ｘ３９９Ａ、Ｘ４１４Ｉ、Ｘ４２６ＲおよびＸ４５０Ｓから選択される。いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、本明細書中に記載される改善されたエナンチオ選択性、例えば、≧９０％ｄｅで、基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができる。
いくつかの実施形態において、本開示のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択される参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性、ならびに配列番号２と比べて、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２３３、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３２３、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２６、Ｘ４３４およびＸ４５０から選択される残基位置に１つ以上の残基差異を有するアミノ酸配列を含み、ここで、残基位置Ｘ２１、Ｘ５６、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ２３３、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３２３、Ｘ３８３、Ｘ４１５、Ｘ４１７およびＸ４３４における残基差異は、Ｘ２１Ｈ、Ｘ５６Ａ／Ｃ、Ｘ８６Ｃ、Ｘ８８Ｈ／Ｙ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ／Ｐ、Ｘ１３３Ａ、Ｘ１４７Ｈ／Ｖ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ２８６Ｃ／Ｈ、Ｘ３１２Ｎ、Ｘ３１６Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｘ３２３Ａ、Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｔ、Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ、Ｘ４１７ＶおよびＸ４３４Ｔから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ１９、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ７３、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ３１７、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４２６およびＸ４５０位における具体的なアミノ酸差異は、Ｘ１９Ｗ、Ｘ３４Ａ、Ｘ５３Ｍ、Ｘ７３Ｒ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６５Ｆ、Ｘ１７１Ｑ、Ｘ１７８Ｗ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２５９Ｖ、Ｘ２６８Ａ、Ｘ２７７Ａ、Ｘ３１７Ｌ、Ｘ３５８Ｋ、Ｘ３６６Ｈ、Ｘ３９９Ａ、Ｘ４１４Ｉ、Ｘ４２６ＲおよびＸ４５０Ｓから選択される。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号４、８、２６、３６、４０、７８、１００、１０２、１４８、１５６、１６０、１７０、１７２、１８０および１９８から選択される。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号４である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１００である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１４８である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１５６である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１６０である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１８０である。
いくつかの実施形態において、本開示のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択される参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性、ならびに配列番号２と比べて、少なくとも以下の残基差異の組み合わせ、Ｘ３４Ａ、Ｘ５６Ａ、Ｘ５７Ｌ、Ｘ８６Ｓ、Ｘ８８Ａ；Ｘ１５３Ｃ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６３Ｆ、Ｘ３１５ＧおよびＸ４１７Ｔを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、（ａ）Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ３１６Ｎ、Ｘ３２３ＴおよびＸ３８３Ｖ；（ｂ）Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ、Ｘ２３３Ｔ、Ｘ３１６Ｎ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓ；（ｃ）Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ３１６Ｎ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓ；ならびに（ｄ）Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ１４７Ｈ、Ｘ３１６Ｎ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓから選択される残基差異の組み合わせをさらに含む。
当業者によって認識されるように、いくつかの実施形態において、選択される上記の１つまたは組み合わせの残基差異は、コア配列（または特徴）として、操作されたトランスアミナーゼにおいて保存され得、他の残基位置におけるさらなる残基差異が、そのコア配列に組み込まれることにより、改善された特性を有するさらなる操作されたトランスアミナーゼポリペプチドが生成され得る。したがって、上記の残基差異の１つまたはサブセットを含む任意の操作されたトランスアミナーゼに対して、本開示は、それらの残基差異の１つまたはサブセットおよび本明細書中に開示される他の残基位置におけるさらなる１つ以上の残基差異を含む他の操作されたトランスアミナーゼを企図することが理解されるべきである。例として、これらに限定されないが、残基位置Ｘ３１６に残基差異を含む操作されたトランスアミナーゼは、他の残基位置、例えば、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２３３、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１７、Ｘ３２３、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２６、Ｘ４３４およびＸ４５０に１つ以上の残基差異をさらに組み込み得る。別の例は、残基位置Ｘ５６に残基差異を含む操作されたトランスアミナーゼであり、それは、他の残基位置、例えば、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２３３、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３２３、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２６、Ｘ４３４およびＸ４５０に１つ以上の残基差異をさらに含み得る。前述の実施形態の各々について、操作されたトランスアミナーゼは、Ｘ１８Ａ；Ｘ１９Ｗ；Ｘ２１Ｈ；Ｘ３１Ｍ；Ｘ５３Ｍ；Ｘ５６Ａ／Ｃ；Ｘ５７Ｃ／Ｆ；Ｘ７３Ｒ；Ｘ８６Ｃ／Ｎ；Ｘ８８Ｈ／Ｙ；Ｘ１０７Ｇ；Ｘ１１３Ｃ／Ｌ／Ｐ；Ｘ１４６Ｌ；Ｘ１４７Ｈ／Ｋ／Ｖ；Ｘ１５３Ｖ；Ｘ１５５Ａ；Ｘ１６３Ｌ；Ｘ１６５Ｆ；Ｘ１７１Ｑ；Ｘ１７８Ｗ；Ｘ１９０Ｋ；Ｘ２０６Ｋ；Ｘ２２８Ｇ；Ｘ２３３Ｔ／Ｖ；Ｘ２３５Ｐ；Ｘ２４４Ｔ；Ｘ２５１Ｖ；Ｘ２５９Ｖ；Ｘ２６８Ａ；Ｘ２７７Ａ；Ｘ２８６Ｃ／Ｈ；Ｘ３１２Ｎ；Ｘ３１４Ｎ；Ｘ３１６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｎ／Ｓ／Ｔ；Ｘ３１７Ｌ；Ｘ３１９Ｎ；Ｘ３２３Ｔ；Ｘ３５８Ｋ；Ｘ３６６Ｈ；Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｔ／Ｖ；Ｘ３９５Ｐ；Ｘ３９９Ａ；Ｘ４１４Ｉ；Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ；Ｘ４１７Ｖ；Ｘ４２４Ａ；Ｘ４２６Ｒ；Ｘ４２７Ｙ；Ｘ４３４Ｔ；およびＸ４５０Ｓから選択されるさらなる残基差異をさらに含み得る。
いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号４の参照ポリペプチドの活性と比較して、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれを超える活性で、基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができる。いくつかの実施形態において、配列番号４の参照ポリペプチドの活性と比較して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれを超える活性で基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができる操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号４と比べて、Ｘ３４Ｔ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ、Ｘ１４７Ｈ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ２３３Ｔ／Ｖ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ／ＶおよびＸ４５０Ｓから選択される１つ以上の残基差異を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、配列番号４と比較して少なくとも１．２倍の活性で基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができる操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７８、８２、８４、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号４の操作された参照トランスアミナーゼと比べて、変換反応において使用される温度および／または溶媒に対して高い安定性を有する。いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、同じアッセイ条件下の５５℃における活性と比べた６０℃における相対的な活性によって計測されるとき、配列番号４の参照ポリペプチドよりも少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれを超える安定性を有する。いくつかの実施形態において、配列番号４のポリペプチドと比べて少なくとも１．２倍高い安定性を有する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２と比べて、Ｘ３４Ｔ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ、Ｘ１４７Ｈ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ２３３Ｔ／Ｖ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ／ＶおよびＸ４５０Ｓから選択される１つ以上の残基差異を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、表２Ｂの反応条件Ｂ、ＣまたはＤのもと、少なくとも約２０ｇ／Ｌの基質負荷、２４時間以下で、化合物（２）の少なくとも９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上を化合物（１）に変換することができる。いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、５５℃において少なくとも約２０ｇ／Ｌの基質負荷、２４時間以下で、化合物（２）の少なくとも９０％以上を化合物（１）に変換することができる。いくつかの実施形態において、５５℃の条件下、少なくとも約２０ｇ／Ｌの基質負荷、２４時間以下で、化合物（２）の少なくとも９０％以上を化合物（１）に変換することができる操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号８、２６、４０、１４８、１５６、１６０、１７０、１７２および１８０から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、例えば、基質化合物（２）から生成物化合物（１）への変換において、トランスアミナーゼ活性を有する本開示の操作されたポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択される配列を含むアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたトランスアミナーゼは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４のうちの１つに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性、ならびに配列番号２と比べて、表２Ａおよび２Ｂに提供されるような、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４のいずれか１つに存在するアミノ酸残基差異を有するアミノ酸配列を含む。
上で特定された残基位置に加えて、本明細書中に開示される任意の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２と比較して、他の残基位置、すなわち、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ５７、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６３、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ１９０、Ｘ２０６、Ｘ２２８、Ｘ２３３、Ｘ２３５、Ｘ２４４、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１４、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３１９、Ｘ３２３、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９５、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２４、Ｘ４２６、Ｘ４２７、Ｘ４３４およびＸ４５０以外の残基位置に他の残基差異をさらに含み得る。これらの他の残基位置における残基差異は、トランスアミナーゼ反応（例えば、化合物（２）から化合物（１）への変換）を行うポリペプチドの能力に悪影響を及ぼさずに、そのアミノ酸配列にさらなるバリエーションを提供する。したがって、いくつかの実施形態において、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのうちのいずれか１つのアミノ酸残基差異に加えて、その配列は、他のアミノ酸残基位置に、配列番号２と比べて、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５または１〜５０個の残基差異をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、参照配列と比べたときのアミノ酸残基差異の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個の残基位置であり得る。これらの他の位置における残基差異は、保存的な変更または非保存的な変更を含み得る。いくつかの実施形態において、それらの残基差異は、Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓの野生型トランスアミナーゼポリペプチドまたは配列番号２の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比べて、保存的置換および非保存的置換を含み得る。
野生型Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓまたは配列番号２の参照配列と比較して他の位置におけるアミノ酸残基差異および酵素機能に対するこれらの差異の影響は、特許公報ＷＯ２０１００８１０５３、ＵＳ２０１００２０９９８１およびＷＯ２０１１１５９９１０；Ｙｕｎら、２００５，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｉｏｂｉｏｌ．，７１（８）：４２２０−４２２４）；およびＣｈｏら、２００８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．９９（２）：２７５−８４（これらのすべてが、参照により本明細書中に援用される）に、他の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドに対して記載されている。したがって、いくつかの実施形態において、配列番号２の配列と比べたアミノ酸差異のうちの１つ以上が、Ｘ４；Ｘ６；Ｘ１２；Ｘ１８；Ｘ３０；Ｘ４４；Ｘ５６；Ｘ８１；Ｘ８２；Ｘ８５；Ｘ９５；Ｘ１１２；Ｘ１２２；Ｘ１２７；Ｘ１３０；Ｘ１５７；Ｘ１６４；Ｘ１６６；Ｘ１６７；Ｘ１７４；Ｘ１８１；Ｘ２０８；Ｘ２２８；Ｘ２５３；Ｘ２５６；Ｘ２７２；Ｘ２８５；Ｘ２８６；Ｘ２９３；Ｘ２９７；Ｘ３０２；Ｘ３１１；Ｘ３１２；Ｘ３１６；Ｘ３１７；Ｘ３１９；Ｘ３２０；Ｘ３２１；Ｘ３３２；Ｘ３８５；Ｘ４０７；Ｘ４０８；Ｘ４０９；Ｘ４１５；Ｘ４１８；Ｘ４３１；Ｘ４３４；Ｘ４３８；Ｘ４４４；およびＸ４４６から選択される残基位置において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドにも導入され得る。特に、前述の位置におけるアミノ酸残基は、以下から選択され得る：Ｘ４Ｒ／Ｑ／Ｌ；Ｘ６Ｒ／Ｉ／Ｎ；Ｘ１２Ａ／Ｇ／Ｋ；Ｘ１８Ａ／Ｖ／Ｌ／Ｉ；Ｘ３０Ａ；Ｘ４４Ａ；Ｘ５６Ｖ；Ｘ８１Ｄ；Ｘ８２Ｈ；Ｘ８５Ａ／Ｓ／Ｖ／Ｔ／Ｎ／Ｃ／Ｇ；Ｘ９５Ｔ；Ｘ１１２Ｉ；Ｘ１２２Ｅ；Ｘ１２７Ｌ；Ｘ１３０Ｇ／Ｍ／Ａ／Ｖ／Ｌ／Ｉ；Ｘ１５７Ｔ；Ｘ１６４Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｇ／Ｍ／Ａ／Ｖ／Ｌ／Ｉ；Ｘ１６６Ｓ；Ｘ１６７Ｋ／Ｒ；Ｘ１７４Ｅ／Ｄ；Ｘ１８１Ｒ；Ｘ２０８Ｉ；Ｘ２２８Ｇ／Ｔ；Ｘ２５３Ｍ；Ｘ２５６Ａ；Ｘ２７２Ａ；Ｘ２８５Ｈ；Ｘ２８６Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ；Ｘ２９３Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ；Ｘ２９７Ａ；Ｘ３０２Ｋ；Ｘ３１１Ｖ；Ｘ３１２Ｄ／Ｅ；Ｘ３１６Ｋ／Ｈ／Ｐ；Ｘ３１７Ｌ／Ｍ／Ｙ；Ｘ３１９Ｑ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｖ；Ｘ３２０Ａ／Ｋ；Ｘ３２１Ｌ／Ｍ／Ｉ；Ｘ３３２Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ；Ｘ３８５Ｒ；Ｘ４０７Ｓ；Ｘ４０８Ａ；Ｘ４０９Ｇ；Ｘ４１５Ｍ／Ｌ；Ｘ４１８Ｖ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ；Ｘ４３１Ｄ；Ｘ４３４Ｖ；Ｘ４３８Ｌ；Ｘ４４４Ｖ；およびＸ４４６Ｖ。これらの残基位置におけるアミノ酸残基の選択の指針および望ましい酵素特性に対するそれらの影響は、引用される参考文献に見られる。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書中に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの機能活性および／または改善された特性を保持する、その操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの任意のフラグメントを含む操作されたトランスアミナーゼポリペプチドも提供する。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、例えば、好適な反応条件下で化合物（２）を化合物（１）に変換する際に、トランスアミナーゼ活性を有する、ポリペプチドフラグメントを提供し、ここで、そのフラグメントは、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチド（例えば、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択される例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチド）の完全長アミノ酸配列の少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。
いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、本明細書中に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチド（例えば、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４の例示的な操作されたポリペプチド）のうちのいずれか１つの欠失を含むアミノ酸配列を有し得る。したがって、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの各実施形態およびすべての実施形態に対して、アミノ酸配列は、トランスアミナーゼポリペプチドの１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、６つ以上のアミノ酸、８つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸または２０個以上のアミノ酸、アミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の２０％まで、またはアミノ酸の総数の３０％までの欠失を含み得、ここで、本明細書中に記載される操作されたトランスアミナーゼの関連する機能活性および／または改善された特性は、維持される。いくつかの実施形態において、欠失は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５または１〜５０個のアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態において、欠失の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態において、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基の欠失を含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、本明細書中に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチド（例えば、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４の例示的な操作されたポリペプチド）のうちのいずれか１つと比べて挿入を含むアミノ酸配列を有し得る。したがって、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドの各実施形態およびすべての実施形態に対して、挿入は、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、６つ以上のアミノ酸、８つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、３０個以上のアミノ酸、４０個以上のアミノ酸または５０個以上のアミノ酸を含み得、ここで、本明細書中に記載される操作されたトランスアミナーゼの関連する機能活性および／または改善された特性は、維持される。それらの挿入は、トランスアミナーゼポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端または内部の部分への挿入であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択される配列、ならびに必要に応じて、１つまたはいくつか（例えば、最大３、４、５個または最大１０個）のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を含むアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、必要に応じて、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５または１〜５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態において、それらの置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
いくつかの実施形態において、本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供し、そのポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択される配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、ただし、そのアミノ酸配列は、特許出願公開公報ＷＯ２０１００８１０５３、ＵＳ２０１００２０９９８１およびＷＯ２０１１１５９９１０；Ｙｕｎら、２００５，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｉｏｂｉｏｌ．，７１（８）：４２２０−４２２４）；ならびにＣｈｏら、２００８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．９９（２）：２７５−８４（これらのすべてが、参照により本明細書中に援用される）に開示されている例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのアミノ酸配列のいずれとも同一でない（つまり、それらを除外する）。
上記の実施形態において、操作されたポリペプチドに適した反応条件は、表２Ａおよび２Ｂ、実施例ならびに本明細書中の他の箇所に記載されているものであり得る。
いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが、他のポリペプチド（例えば、例として、これらに限定されないが、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例えば、金属への結合のためのＨｉｓタグ）および細胞局在化シグナル（例えば、分泌シグナル））に融合された、融合ポリペプチドの形態であり得る。したがって、本明細書中に記載される操作されたポリペプチドは、他のポリペプチドへの融合を伴ってまたは伴わずに、使用され得る。
本明細書中に記載されるポリペプチドが、遺伝的にコードされるアミノ酸に限定されないことが理解されるべきである。遺伝的にコードされるアミノ酸に加えて、本明細書中に記載されるポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸および／またはコードされない合成のアミノ酸を全体的にまたは部分的から構成され得る。本明細書中に記載されるポリペプチドを構成し得る一般的に遭遇するある特定のコードされないアミノ酸としては、遺伝的にコードされるアミノ酸のＤ−立体異性体（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒ）；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓｔｙｒｙｌｋａｌａｎｉｎｅ）（ｓＡｌａ）；アウトリルアラニン（ａｕｔｈｒｙｌａｌａｎｉｎｅ）（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（ｐｈｅｎｙｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリジン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈｏｍｏｇｌｕｔａｎｉｃ ａｃｉｄ）（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載されるポリペプチドを構成し得るさらなるコードされないアミノ酸は、当業者に明らかだろう（例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ＣＲＣ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ａｔ ｐｐ．３−７０およびそれらの中で引用されている参考文献（これらのすべてが、参照により援用される）に提供されている様々なアミノ酸を参照のこと）。これらのアミノ酸は、Ｌ−配置またはＤ−配置であり得る。
当業者は、側鎖保護基を有するアミノ酸または残基もまた、本明細書中に記載されるポリペプチドを構成し得ることを認識するだろう。そのような保護されたアミノ酸（この場合、芳香族のカテゴリーに属する）の非限定的な例（保護基が括弧内に列挙される）としては：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中に記載されるポリペプチドを構成し得る立体構造的に制約される非コードアミノ酸としては、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ−配置）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、固体支持体（例えば、膜、樹脂、固体キャリアまたは他の固相材料）上に提供され得る。固体支持体は、有機ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド）ならびにそのコポリマーおよびグラフトから構成され得る。固体支持体は、無機でもあり得る（例えば、ガラス、シリカ、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金属、例えば、金または白金）。固体支持体の形状は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤するまたは膨潤しない特徴を有し得る。固体支持体は、ウェル、くぼみの形態、または他の容器、うつわ、特徴もしくは場所で形成され得る。
いくつかの実施形態において、本開示のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４の参照ポリペプチドと比較して改善された活性、立体選択性および／または他の改善された特性を保持するように、固体支持体上に固定化され得る。そのような実施形態において、固定化されたポリペプチドは、式（ＩＩ）の基質化合物または他の好適な基質から、式（Ｉ）の生成物化合物または対応する生成物（例えば、本明細書中に記載されるスキーム４〜８に示されているような）への生体触媒変換を促進することができ、その反応が完了した後、容易に保持され（例えば、ポリペプチドが固定化されているビーズを保持することによって）、次いで、その後の反応において再使用されるかまたは再利用される。そのような固定化された酵素プロセスは、さらなる効率およびコスト低減を可能にする。したがって、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用する任意の方法が、固体支持体上に結合されたまたは固定化された同じ操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用して行われ得ることがさらに企図される。
酵素の固定化の方法は、当該分野で周知である。操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、非共有結合的にまたは共有結合的に結合され得る。酵素を固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）に結合体化するためおよび固定化するための様々な方法が、当該分野で周知であり、それらは、例えば、Ｙｉら、“Ｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ω−ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７ ｏｎ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｂｅａｄｓ，”Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２（５）：８９５−８９８（２００７年５月）；Ｍａｒｔｉｎら、“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ（Ｓ）−ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｏｒ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７６（４）：８４３−８５１（２００７年９月）；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉら、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ω−ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｏｌ−ｇｅｌ／ｃｅｌｉｔｅ ｍａｔｒｉｘ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，６３：３９−４４（２０１０年４月）；Ｔｒｕｐｐｏら、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＣＡＬ−Ｂ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｋｅｙ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｏ Ｏｄａｎａｃａｔｉｂ，”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｐ２００１５７ｃ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２００８）；Ｍａｔｅｏら、“Ｅｐｏｘｙ ｓｅｐａｂｅａｄｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｅｐｏｘｙ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｖｉａ ｖｅｒｙ ｉｎｔｅｎｓｅ ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ １８（３）：６２９−３４（２００２）；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４）（これらの各開示は、参照により本明細書中に援用される）に記載されている。本開示の操作されたトランスアミナーゼを固定化するために有用な固体支持体としては、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、オクタデシル官能基を有するスチレン／ＤＶＢコポリマーまたはポリメタクリレートを含む、ビーズまたは樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の操作されたトランスアミナーゼを固定化するために有用な例示的な固体支持体としては、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ ＣおよびＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）（以下の異なるタイプのＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、操作されたポリペプチドは、様々な形態、例えば、単離された調製物、実質的に精製された酵素、その酵素をコードする遺伝子で形質転換された細胞全体、ならびに／またはそのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解産物として、存在し得る。それらの酵素は、下記でさらに論じられるように、凍結乾燥され得るか、噴霧乾燥され得るか、沈殿され得るか、または粗ペーストの形態で存在し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるポリペプチドは、キットの形態で提供され得る。それらのキット内の酵素は、個別にまたは複数の酵素として存在し得る。それらのキットは、酵素反応を行うための試薬、酵素の活性を評価するための基質、ならびに生成物を検出するための試薬をさらに備え得る。それらのキットは、試薬ディスペンサーおよびそれらのキットを使用するための指示書も備え得る。
いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、位置的に異なる場所にそれらのポリペプチドが配置されたアレイの形態で固体支持体上に提供され得る。そのアレイは、上記ポリペプチドによる変換について種々の基質化合物を試験するために使用され得る。複数の支持体が、アレイ上に、ロボットによる試薬の送達のためにまたは検出方法および／もしくは検出機器によってアドレス可能な様々な場所に、配置され得る。基材、例えば、膜、ビーズ、ガラスなどに結合体化するための様々な方法が、とりわけ、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；（２００８）およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４）（これらの開示は、参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
いくつかの実施形態において、本開示のキットは、本明細書中に開示される複数の異なる操作されたケトレダクターゼポリペプチドをアドレス可能な異なる位置に含むアレイを備え、ここで、その異なるポリペプチドは、参照配列の異なる改変体であり、その各々が、少なくとも１つの異なる改善された酵素特性を有する。複数の操作されたポリペプチドを含むそのようなアレイおよびそれらを使用する方法は、ＷＯ２００９００８９０８に記載されている。
５．４ 操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞
別の態様において、本開示は、本明細書中に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。それらのポリヌクレオチドは、遺伝子発現を調節する１つ以上の異種制御配列に作動可能に連結されることにより、そのポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドが作製され得る。操作されたトランスアミナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物は、適切な宿主細胞に導入されることにより、対応するトランスアミナーゼポリペプチドが発現され得る。
当業者に明らかであるように、タンパク質配列の利用可能性および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識は、主題のポリペプチドをコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの説明を提供する。同じアミノ酸が代替のコドンまたは同義語コドンによってコードされる遺伝暗号の縮重により、そのすべてが改善されたトランスアミナーゼ酵素をコードする極めて多数の核酸を作製することが可能になる。したがって、特定のアミノ酸配列に関する知識を有していれば、当業者は、そのタンパク質のアミノ酸配列を変化させずに１つ以上のコドンの配列を単純に改変することによって、任意の数の異なる核酸を作製することができるだろう。この点において、本開示は、可能性のあるコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするようにすることができるであろうポリヌクレオチドの可能性のある各バリエーションおよびすべてのバリエーションを明確に企図し、そのようなバリエーションのすべてが、表２Ａおよび２Ｂに提示され、参照により本明細書中に援用される配列表に配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４として開示されるアミノ酸配列を含む本明細書中に記載される任意のポリペプチドに対して明確に開示されたと見なされるべきである。
様々な実施形態において、コドンは、好ましくは、そのタンパク質が産生されている宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌における発現のために使用され；酵母において使用される好ましいコドンは、酵母における発現のために使用され；哺乳動物において使用される好ましいコドンは、哺乳動物細胞における発現のために使用される。いくつかの実施形態において、天然の配列が好ましいコドンを含み得るので、また、好ましいコドンを使用することが、すべてのアミノ酸残基にとって必要でないことがあるので、すべてのコドンが、トランスアミナーゼのコドン使用頻度を最適化するために置き換えられる必要があるわけではない。その結果として、トランスアミナーゼ酵素をコードするコドンが最適化されたポリヌクレオチドは、完全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％超に好ましいコドンを含み得る。
いくつかの実施形態において、上に記載されたように、上記ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示される特性（例えば、基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換する能力）とともにトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ここで、そのポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択される参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性、ならびに配列番号２の参照ポリペプチドと比べて、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２３３、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３２３、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２６、Ｘ４３４およびＸ４５０から選択される残基位置に１つ以上の残基差異を有するアミノ酸配列を含み、ここで、残基位置Ｘ２１、Ｘ５６、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ２３３、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３２３、Ｘ３８３、Ｘ４１５、Ｘ４１７およびＸ４３４における残基差異は、Ｘ２１Ｈ、Ｘ５６Ａ／Ｃ、Ｘ８６Ｃ、Ｘ８８Ｈ／Ｙ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ／Ｐ、Ｘ１３３Ａ、Ｘ１４７Ｈ／Ｖ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ２８６Ｃ／Ｈ、Ｘ３１２Ｎ、Ｘ３１６Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｘ３２３Ａ、Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｔ、Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ、Ｘ４１７ＶおよびＸ４３４Ｔから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ１９、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ７３、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ３１７、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４２６およびＸ４５０位における具体的なアミノ酸差異は、Ｘ１９Ｗ、Ｘ３４Ａ、Ｘ５３Ｍ、Ｘ７３Ｒ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６５Ｆ、Ｘ１７１Ｑ、Ｘ１７８Ｗ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２５９Ｖ、Ｘ２６８Ａ、Ｘ２７７Ａ、Ｘ３１７Ｌ、Ｘ３５８Ｋ、Ｘ３６６Ｈ、Ｘ３９９Ａ、Ｘ４１４Ｉ、Ｘ４２６ＲおよびＸ４５０Ｓから選択される。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号４、８、２６、３６、４０、７８、１００、１０２、１４８、１５６、１６０、１７０、１７２、１８０および１９８から選択される。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号４である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１００である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１４８である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１５６である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１６０である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１８０である。
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示される特性とともにトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ここで、そのポリペプチドは、参照配列の配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに配列番号２と比べて、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２３３、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３２３、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２６、Ｘ４３４およびＸ４５０から選択される残基位置に１つ以上の残基差異を有するアミノ酸配列を含み、ここで、残基位置Ｘ２１、Ｘ５６、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ２３３、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３２３、Ｘ３８３、Ｘ４１５、Ｘ４１７およびＸ４３４における残基差異は、Ｘ２１Ｈ、Ｘ５６Ａ／Ｃ、Ｘ８６Ｃ、Ｘ８８Ｈ／Ｙ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ／Ｐ、Ｘ１３３Ａ、Ｘ１４７Ｈ／Ｖ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ２８６Ｃ／Ｈ、Ｘ３１２Ｎ、Ｘ３１６Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｘ３２３Ａ、Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｔ、Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ、Ｘ４１７ＶおよびＸ４３４Ｔから選択される。
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ここで、そのポリペプチドは、参照配列の配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、および配列番号２と比べて、少なくとも以下の残基差異の組み合わせ：Ｘ３４Ａ、Ｘ５６Ａ、Ｘ５７Ｌ、Ｘ８６Ｓ、Ｘ８８Ａ；Ｘ１５３Ｃ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６３Ｆ、Ｘ３１５ＧおよびＸ４１７Ｔを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号２と比べて、（ａ）Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ３１６Ｎ、Ｘ３２３ＴおよびＸ３８３Ｖ；（ｂ）Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ、Ｘ２３３Ｔ、Ｘ３１６Ｎ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓ；（ｃ）Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ３１６Ｎ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓ；ならびに（ｄ）Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ１４７Ｈ、Ｘ３１６Ｎ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓから選択される残基差異の組み合わせをさらに含むポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ここで、そのポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４のうちのいずれか１つから選択される参照ポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、ただし、そのアミノ酸配列は、配列番号２と比べて、表２Ａおよび２Ｂに列挙されたような配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４のポリペプチド配列のうちのいずれか１つに含められる残基差異セットのうちのいずれか１つを含む。
いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１および２０３から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１および２０３から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補鎖に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、本明細書中に記載される改善された特性のうちの１つ以上とともにトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号２と比べて、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２３３、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３２３、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２６、Ｘ４３４およびＸ４５０から選択される残基位置に１つ以上の残基差異を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼポリペプチドをコードし、ここで、残基位置Ｘ２１、Ｘ５６、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ２３３、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３２３、Ｘ３８３、Ｘ４１５、Ｘ４１７およびＸ４３４における残基差異は、Ｘ２１Ｈ、Ｘ５６Ａ／Ｃ、Ｘ８６Ｃ、Ｘ８８Ｈ／Ｙ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ／Ｐ、Ｘ１３３Ａ、Ｘ１４７Ｈ／Ｖ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ２８６Ｃ／Ｈ、Ｘ３１２Ｎ、Ｘ３１６Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｘ３２３Ａ、Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｔ、Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ、Ｘ４１７ＶおよびＸ４３４Ｔから選択される。
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするが、操作されたトランスアミナーゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対して、ヌクレオチドレベルで約８０％以上の配列同一性、約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれを超える配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１および２０３から選択される。
本明細書中の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、そのポリペプチドの発現をもたらすように、種々の方法で操作され得る。いくつかの実施形態において、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を制御する１つ以上の調節配列が存在する発現ベクターとして提供され得る。発現ベクターに応じて、ベクターに挿入する前に、単離されたポリヌクレオチドを操作することが、望ましい場合があるか、または必要である場合がある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための手法は、当該分野で周知である。指針は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９８，２００６年改訂、に提供されている。
いくつかの実施形態において、調節配列には、とりわけ、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが含まれる。好適なプロモーターは、使用される宿主細胞に基づいて選択され得る。細菌宿主細胞の場合、本開示の核酸構築物の転写の指示に適したプロモーターとしては、大腸菌のｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子ならびに原核生物のベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）から得られるプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）が挙げられる。糸状菌宿主細胞に対する例示的なプロモーターとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの酸安定性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのトリオースホスフェートイソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのアセトアミダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）に対する遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの中性アルファ−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのトリオースホスフェートイソメラーゼに対する遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）ならびにそれらの変異体プロモーター、切断型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられる。例示的な酵母細胞プロモーターは、出芽酵母のエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、出芽酵母のガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、出芽酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）および出芽酵母の３−ホスホグリセリン酸キナーゼに対する遺伝子に由来し得る遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞に対する他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８によって記載されている。
調節配列は、転写を終結するための、宿主細胞によって認識される配列である好適な転写ターミネーター配列でもあり得る。そのターミネーター配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞において機能的である任意のターミネーターが、本発明において使用され得る。例えば、糸状菌宿主細胞に対する例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのアルファ−グルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのトリプシン様プロテアーゼに対する遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞に対する例示的なターミネーターは、出芽酵母のエノラーゼ、出芽酵母のシトクロムＣ（ＣＹＣ１）および出芽酵母のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素に対する遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞に対する他の有用なターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２，前出によって記載されている。
調節配列は、宿主細胞による翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である好適なリーダー配列でもあり得る。そのリーダー配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞において機能的である任意のリーダー配列が、使用され得る。糸状菌宿主細胞に対する例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのトリオースホスフェートイソメラーゼに対する遺伝子から得られる。酵母宿主細胞に対する好適なリーダーは、出芽酵母のエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、出芽酵母の３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、出芽酵母のアルファ−因子および出芽酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）に対する遺伝子から得られる。
調節配列は、核酸配列の３’末端に作動可能に連結される配列であり、かつ転写されたとき、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列である、ポリアデニル化配列でもあり得る。最適な宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列が、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞に対する例示的なポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのトリプシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのアルファ−グルコシダーゼに対する遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞に対する有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ １５：５９８３−５９９０によって記載されている。
調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向づける、シグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み枠で天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を本質的に含み得る。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来のシグナルペプチドコード領域を含み得る。発現されたポリペプチドを最適な宿主細胞の分泌経路に方向づける任意のシグナルペプチドコード領域が、操作されたポリペプチドの発現のために使用され得る。細菌宿主細胞に対する効果的なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ１１８３７のマルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのアルファ−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのベータ−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのｐｒｓＡに対する遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ５７：１０９−１３７によって記載されている。糸状菌宿主細胞に対する効果的なシグナルペプチドコード領域は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓのセルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａのリパーゼに対する遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域であり得る。酵母宿主細胞に対する有用なシグナルペプチドは、出芽酵母のアルファ−因子および出芽酵母のインベルターゼに対する遺伝子に由来し得る。
調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に配置されたアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもあり得る。結果として生じるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または場合によってはチモーゲン）と称される。プロポリペプチドは、そのプロポリペプチド由来のプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断によって、成熟した活性なポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、出芽酵母のアルファ−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａのラクターゼ（ＷＯ９５／３３８３６）に対する遺伝子から得られることがある。シグナルペプチド領域とプロペプチド領域の両方が、ポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域が、ポリペプチドのアミノ末端の隣に配置され、シグナルペプチド領域が、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に配置される。
宿主細胞の増殖に関連してポリペプチドの発現の制御を可能にする制御配列を付加することが望ましい場合もある。制御系の例は、化学的刺激または物理的刺激（制御化合物の存在を含む）に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにするものである。原核生物宿主細胞において、好適な制御配列としては、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞において、好適な制御系としては、例として、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌において、好適な制御配列としては、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
別の態様において、本開示は、導入される宿主タイプに応じた、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター、および１つ以上の発現制御領域（例えば、プロモーターおよびターミネーター、複製起点など）にも関する。上に記載された様々な核酸配列および調節配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列を好都合な制限酵素認識部位に挿入または置換することを可能にする１つ以上のそのような部位を含み得る組換え発現ベクターを生成するように、共につなぎ合わされ得る。あるいは、本開示の核酸配列は、核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を、発現にとって適切なベクターに挿入することによって、発現され得る。発現ベクターを作製する際、コード配列は、コード配列が、発現にとって適切な調節配列と作動可能に連結されるように、ベクター内に配置される。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に便利に供され得る任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらし得る。ベクターの選択は、代表的には、ベクターが導入される宿主細胞とベクターの適合性に依存し得る。ベクターは、直鎖状または閉環状のプラスミドであり得る。
発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の実体、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体として存在するベクターであり得、その複製は、染色体の複製とは無関係である。そのベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含み得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体とともに複製されるベクターであり得る。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または２つ以上のベクターもしくはプラスミド（それらが合わせて、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含む）あるいはトランスポゾンが、使用され得る。
発現ベクターは、好ましくは、形質転換された細胞を容易に選択することを可能にする１つ以上の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その産物が、殺生物剤抵抗性またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養素要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌の選択マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性（実施例１）またはテトラサイクリン耐性）を付与するマーカーである。酵母宿主細胞に対する好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞において使用するための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞において使用するための実施形態は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子を含む。
別の態様において、本開示は、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、そのポリヌクレオチドは、宿主細胞においてトランスアミナーゼ酵素を発現するための１つ以上の調節配列に作動可能に連結される。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現において使用するための宿主細胞は、当該分野で周知であり、それらとしては、細菌細胞（例えば、大腸菌、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞（例えば、出芽酵母またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８）））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；および植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な宿主細胞は、大腸菌Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１である。
したがって、別の態様において、本開示は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを製造する方法を提供し、ここで、その方法は、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を、そのポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程を含み得る。その方法は、本明細書中に記載されるような発現されたトランスアミナーゼポリペプチドを単離する工程または精製する工程をさらに含み得る。
上に記載された宿主細胞に対する適切な培養培地および増殖条件は、当該分野で周知である。上記トランスアミナーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当該分野で公知の様々な方法によって細胞に導入され得る。手法としては、とりわけ、エレクトロポレーション、遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が挙げられる。
本明細書中の実施形態の場合、操作されたポリペプチドおよび対応するポリヌクレオチドは、当業者が使用する方法を用いて得ることができる。Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓの野生型ポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列は、Ｓｈｉｎら、２００３，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６１（５−６）：４６３−４７１に記載されており、改善された安定性および基質認識特性を有する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを作製する方法は、参照により本明細書中に援用される特許出願公開公報ＷＯ２０１００８１０５３およびＵＳ２０１００２０９９８１に開示されている。
本明細書中に開示される特性を有する操作されたトランスアミナーゼは、上で論じたように、天然に存在するまたは操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを変異誘発および／または定向進化法に供することによって、得ることができる。例示的な定向進化技術は、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号に記載されているような、変異誘発および／またはＤＮＡシャフリングである。使用され得る他の定向進化手順としては、とりわけ、付着伸長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、インビトロ組換え（Ｚｈａｏら、１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８−２６１）、変異誘発ＰＣＲ（Ｃａｌｄｗｅｌｌら、１９９４，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．３：Ｓ１３６−Ｓ１４０）およびカセット変異誘発（Ｂｌａｃｋら、１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：３５２５−３５２９）が挙げられる。本明細書中の目的にとって有用な変異誘発および定向進化法は、以下の参考文献にも記載されている：Ｌｉｎｇら、１９９７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−７８；Ｄａｌｅら、１９９６，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−７４；Ｓｍｉｔｈ，１９８５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；Ｋｒａｍｅｒら、１９８４，Ｃｅｌｌ，３８：８７９−８８７；Ｗｅｌｌｓら、１９８５，Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、１９９９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ３：２８４−２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：２５９−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５：４３６−４３８；Ｚｈａｎｇら、１９９７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：４５−４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：３１５−３１９；Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１；Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号。すべての刊行物が、参照により本明細書中に援用される。
変異誘発処理後に得られたクローンは、所望の改善された酵素特性を有する操作されたトランスアミナーゼについてスクリーニングされ得る。例えば、所望の改善された酵素特性が、熱安定性である場合、酵素活性は、酵素調製物を規定の温度に供した後に、熱処理の後に残っている酵素活性の量を計測して、計測され得る。次いで、トランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むクローンが、単離され、配列決定されることにより、ヌクレオチド配列の変化（もしあれば）が同定され、宿主細胞において酵素を発現するために使用される。発現ライブラリーからの酵素活性の計測は、標準的な生化学手法（例えば、生成物アミンの、例えば、ＯＰＡを用いた、誘導体化後のＨＰＬＣ解析）を用いて行われ得る。
操作されたポリペプチドの配列が、公知である場合、その酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成法に従って、標準的な固相法によって調製され得る。いくつかの実施形態において、最大約１００塩基のフラグメントは、個々に合成され、次いで、つなぎ合わせる（例えば、酵素的もしくは化学的なライゲーション（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ）法、またはポリメラーゼに媒介される方法によって）ことにより、任意の所望の連続した配列が形成され得る。例えば、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、通常、自動化された合成方法で実施されるように、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１，Ｔｅｔ Ｌｅｔｔ ２２：１８５９−６９によって記載された従来のホスホルアミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら、１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１−０５によって記載された方法を使用する、化学合成によって、調製され得る。ホスホルアミダイト法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置において、合成され、精製され、アニールされ、ライゲートされ、適切なベクターにクローニングされる。
したがって、いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、かつ配列番号２と比べて、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２３３、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３２３、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２６、Ｘ４３４およびＸ４５０から選択される残基位置に１つ以上の残基差異を有するポリヌクレオチドを合成する工程（ここで、残基位置Ｘ２１、Ｘ５６、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ２３３、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３２３、Ｘ３８３、Ｘ４１５、Ｘ４１７およびＸ４３４における残基差異は、Ｘ２１Ｈ、Ｘ５６Ａ／Ｃ、Ｘ８６Ｃ、Ｘ８８Ｈ／Ｙ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ／Ｐ、Ｘ１３３Ａ、Ｘ１４７Ｈ／Ｖ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ２８６Ｃ／Ｈ、Ｘ３１２Ｎ、Ｘ３１６Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｘ３２３Ａ、Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｔ、Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ、Ｘ４１７ＶおよびＸ４３４Ｔから選択される）；および（ｂ）そのポリヌクレオチドによってコードされるトランスアミナーゼポリペプチドを発現させる工程を含み得る。その方法のいくつかの実施形態において、残基位置Ｘ１９、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ７３、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ３１７、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４２６およびＸ４５０における残基差異は、Ｘ１９Ｗ、Ｘ３４Ａ、Ｘ５３Ｍ、Ｘ７３Ｒ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６５Ｆ、Ｘ１７１Ｑ、Ｘ１７８Ｗ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２５９Ｖ、Ｘ２６８Ａ、Ｘ２７７Ａ、Ｘ３１７Ｌ、Ｘ３５８Ｋ、Ｘ３６６Ｈ、Ｘ３９９Ａ、Ｘ４１４Ｉ、Ｘ４２６ＲおよびＸ４５０Ｓから選択される。
上記方法のいくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、必要に応じて、１つまたはいくつか（例えば、最大３、４、５個または最大１０個）のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有し得る。いくつかの実施形態において、そのアミノ酸配列は、必要に応じて、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５または１〜５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態において、そのアミノ酸配列は、必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態において、そのアミノ酸配列は、必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態において、それらの置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
発現される操作されたトランスアミナーゼは、本明細書中に記載される任意のアッセイ条件による化合物（２）から化合物（１）への変換において、所望の改善された特性、例えば、活性、エナンチオ選択性、安定性および製品公差について計測され得る。
いくつかの実施形態において、宿主細胞において発現された任意の操作されたトランスアミナーゼ酵素は、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含むタンパク質精製のための周知の手法のうちのいずれか１つ以上を使用して、細胞およびまたは培養培地から回収され得る。大腸菌などの細菌からタンパク質を溶解するためおよび高効率で抽出するために適した溶液は、表２Ａおよび実施例に提供され、商業的にも入手可能であり、例えば、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ（商標）である。
トランスアミナーゼポリペプチドを単離するためのクロマトグラフ法としては、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、正味の電荷、疎水性、親水性、分子量、分子の形状などのような因子に部分的に依存し、それらは、当業者に明らかだろう。
いくつかの実施形態において、アフィニティー法が、改善されたトランスアミナーゼ酵素を単離するために使用され得る。アフィニティークロマトグラフィー精製の場合、トランスアミナーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が、使用され得る。抗体を作製するために、ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない様々な宿主動物を、注射によって、トランスアミナーゼポリペプチドまたはそのフラグメントで免疫化し得る。そのトランスアミナーゼポリペプチドまたはフラグメントは、側鎖官能基または側鎖官能基に付着されたリンカーを用いて、ＢＳＡなどの好適なキャリアに付着され得る。
５．７ 操作されたトランスアミナーゼ酵素を使用する方法
上で述べたように、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において、例示的な基質化合物（２）のケトンを例示的な生成物化合物（１）の対応するキラルアミンにジアステレオマー過剰で効率的に変換するように進化させた。操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの構造的特徴は、化合物（２）以外のプロキラルな大きなケトン基質化合物から対応するキラルアミン化合物への立体異性体過剰での変換も可能にする。したがって、別の態様において、本開示は、アミノ基転移反応を行うために、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用するプロセスを提供し、ここで、アミノドナー由来のアミノ基は、アミノアクセプター、例えば、ケトン基質化合物に転移されることにより、アミン化合物が生成される。通常、アミノ基転移反応を行うためのプロセスは、アミノアクセプターからアミン化合物への変換に適した反応条件下において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをアミノアクセプター（例えば、ケトン基質化合物）およびアミノドナー（例えば、イソプロピルアミン）と接触させるかまたはインキュベートする工程を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉ）のアミン化合物
（式中、
環Ａは、２位と３位との間および／もしくは５位と６位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を必要に応じて含み、かつ／または２、３、４、５および６位においてハロ、ヒドロキシおよびメチルから選択される基で必要に応じて独立して置換される、６員の炭素環であり；
環Ｂは、５位と１０位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を必要に応じて含み、かつ／または９位および１０位のうちの１つ以上においてハロ、ヒドロキシおよびメチルから選択される基で必要に応じて独立して置換される、６員の炭素環であり；
環Ｃは、１０位においてハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択される基で必要に応じて置換される、５または６員の炭素環（すなわち、ｍ＝０または１）であり；
環Ｄは、１、２もしくは３つの不飽和Ｃ−Ｃ結合を必要に応じて含み、かつ／または以下のとおり：
１４位において、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、および１２位に架橋しているシクロプロピルから選択される基で；
１５位または１６位において、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニル、アミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換されるシクロアルキル、必要に応じて置換されるヘテロシクロアルキル、必要に応じて置換されるアリール、必要に応じて置換されるヘテロアリール、必要に応じて置換されるアリールオキシ、必要に応じて置換されるアリールアミノ、必要に応じて置換されるアリールチオ、必要に応じて置換されるアリールスルホニル、必要に応じて置換されるアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるアリールカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールアミノ、必要に応じて置換されるヘテロアリールチオ、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルホニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールカルボニルオキシ、アルキルアミノスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよびヘテロアリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される基で；
必要に応じて独立して置換される、５、６または７員の炭素環（すなわち、ｎ＝０、１または２）であるが、
ただし、式（Ｉ）の化合物は、化合物（１）
ではない）
を調製するためのプロセスを提供し、ここで、その方法は、式（ＩＩ）のケトン基質化合物
（式中、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、式（Ｉ）の化合物に対して上で定義されたとおりである）
を、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む。
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、式（ＩＩａ）のシクロパミンアナログ化合物（式中、環Ｃは、１１位において必要に応じて置換される５員の炭素環であり、環Ｄは、１６位において置換される７員の炭素環である）を変換することができ、そのシクロパミンアナログ化合物は、スキーム５におけるように、式（Ｉａ）のアミン生成物化合物に変換され得る。
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉａ）のアミン化合物
（式中、
環ＡおよびＢは、以下：
（ａ）５位と６位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｂ）５位と１０位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｃ）５位に、４位のメチル基に対してシスである水素；または
（ｄ）５位に、４位のメチル基に対してトランスである水素
のうちの１つを含み；
環Ｄは、１２位と１４位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を含み；
Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択され；
Ｒ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択され；
Ｒ３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニルおよびアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択されるが；
ただし、式（Ｉ）の化合物は、化合物（１）
ではない）
を調製するためのプロセスを提供し、ここで、その方法は、式（ＩＩａ）のケトン基質化合物
（式中、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は、式（Ｉａ）の化合物に対して上で定義されたとおりである）
を、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む。
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、スキーム６に示されているように、式（ＩＩｂ）のシクロパミンアナログ化合物（式中、環Ｃは、５員の炭素環であり、環Ｄは、６員の炭素環である）を式（Ｉｂ）のキラルアミン生成物化合物に変換することができる：
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉｂ）のアミン化合物
（式中、
環ＡおよびＢは、以下：
（ａ）５位と６位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｂ）５位と１０位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｃ）５位に、４位のメチル基に対してシスである水素；または
（ｄ）５位に、４位のメチル基に対してトランスである水素
のうちの１つを含み；
環Ｄは、１２位と１４位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合または１２位と１４位との間に架橋シクロプロピルを含み；
Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択され；
Ｒ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択され；
Ｒ３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニルおよびアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される）
を調製するためのプロセスを提供し、ここで、その方法は、式（ＩＩｂ）のケトン基質化合物
（式中、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は、式（Ｉｂ）の化合物に対して上で定義されたとおりである）
を、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む。
いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、参照により本明細書中に援用される２０１１年２月１０日に公開されたＷＯ２０１１０１７５５１Ａ１に開示されているシクロパミンアナログ化合物のいずれかを調製するために使用され得る。
数多くの他のシクロパミンアナログ化合物（式（Ｉａ）および（Ｉｂ）によって包含される化合物以外）が、当該分野で公知である。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、公知のベラトラミンアナログ化合物のいずれかを調製する生体触媒プロセスにおいて使用され得ることが企図される。
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、スキーム７に示されているように、式（ＩＩｃ）のベラトラミンアナログ化合物（式中、環Ｃは、５員の炭素環であり、環Ｄは、６員の炭素環である）を式（Ｉｃ）のキラルアミン生成物化合物に変換することができる：
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉｃ）のアミン化合物
（式中、
環ＡおよびＢは、以下：
（ａ）５位と６位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｂ）５位と１０位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
（ｃ）５位に、４位のメチル基に対してシスである水素；または
（ｄ）５位に、４位のメチル基に対してトランスである水素
のうちの１つを含み；
環Ｄは、芳香族であり；
Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択され；
Ｒ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択され；
Ｒ３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニルおよびアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される）
を調製するためのプロセスを提供し、ここで、その方法は、式（ＩＩｃ）のケトン基質化合物
（式中、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３は、式（Ｉｃ）の化合物に対して上で定義されたとおりである）
を、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む。
数多くの他のベラトラミンアナログ化合物（式（Ｉｃ）によって包含される化合物以外）が、当該分野で公知である。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、公知のベラトラミンアナログ化合物のいずれかを調製する生体触媒プロセスにおいて使用され得ることが企図される。
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、スキーム８に示されているように、式（ＩＩｄ）のステロイドアナログ化合物（式中、環Ｃは、６員の炭素環であり、環Ｄは、５員の炭素環である）を式（Ｉｄ）のキラルアミン生成物に変換することができる：
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉｄ）のアミン化合物
（式中、
環Ａは、２位と３位との間または５位と６位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を含み；
Ｒ１およびＲ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニル、アミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換されるシクロアルキル、必要に応じて置換されるヘテロシクロアルキル、必要に応じて置換されるアリール、必要に応じて置換されるヘテロアリール、必要に応じて置換されるアリールオキシ、必要に応じて置換されるアリールアミノ、必要に応じて置換されるアリールチオ、必要に応じて置換されるアリールスルホニル、必要に応じて置換されるアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるアリールカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールアミノ、必要に応じて置換されるヘテロアリールチオ、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルホニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールカルボニルオキシ、アルキルアミノスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよびヘテロアリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立して選択され；
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから独立して選択され；
Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素、ハロ、ヒドロキシおよびメチルから独立して選択される）
を調製するためのプロセスを提供し、ここで、その方法は、式（ＩＩｄ）のケトン基質化合物
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、式（Ｉｄ）の化合物に対して上で定義されたとおりである）
を、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む。
式（Ｉｄ）のアミン化合物を調製するためのプロセスのいくつかの実施形態において、そのプロセスは、表３に示されるものから選択される式（ＩＩｄ）のケトン基質化合物を使用して行われ得る。
表３に示されるものを含む式（ＩＩｄ）の化合物に加えて、当該分野で公知のステロイドアナログ化合物が数多く存在する。本開示は、１位にキラルアミン基を有する対応するステロイドアナログ化合物を調製するプロセスにおいて、ケトン基質として、環Ａの１位にケトン基を有する任意のステロイドアナログ化合物が、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドとともに使用され得ることを企図する。
本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの立体選択性を考慮すると、いくつかの実施形態において、上記プロセスは、式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（Ｉｃ）および式（Ｉｄ）のキラルアミン化合物をジアステレオマー過剰で形成する。いくつかの実施形態において、上記プロセスは、式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（Ｉｃ）および式（Ｉｄ）のキラルアミン化合物を、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるジアステレオマー過剰率で形成する。
前述のプロセスの場合、本明細書中に記載される任意の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドが、使用され得る。例として、限定されないが、いくつかの実施形態において、上記プロセスは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択される参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性、ならびに配列番号２と比べて、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２３３、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３２３、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２６、Ｘ４３４およびＸ４５０から選択される残基位置に１つ以上の残基差異を有するアミノ酸配列を含む本開示のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを使用し得、ここで、残基位置Ｘ２１、Ｘ５６、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ２３３、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３２３、Ｘ３８３、Ｘ４１５、Ｘ４１７およびＸ４３４における残基差異は、Ｘ２１Ｈ、Ｘ５６Ａ／Ｃ、Ｘ８６Ｃ、Ｘ８８Ｈ／Ｙ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ／Ｐ、Ｘ１３３Ａ、Ｘ１４７Ｈ／Ｖ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ２８６Ｃ／Ｈ、Ｘ３１２Ｎ、Ｘ３１６Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｘ３２３Ａ、Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｔ、Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ、Ｘ４１７ＶおよびＸ４３４Ｔから選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ１９、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ７３、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ３１７、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４２６およびＸ４５０位における具体的なアミノ酸差異は、Ｘ１９Ｗ、Ｘ３４Ａ、Ｘ５３Ｍ、Ｘ７３Ｒ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６５Ｆ、Ｘ１７１Ｑ、Ｘ１７８Ｗ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２５９Ｖ、Ｘ２６８Ａ、Ｘ２７７Ａ、Ｘ３１７Ｌ、Ｘ３５８Ｋ、Ｘ３６６Ｈ、Ｘ３９９Ａ、Ｘ４１４Ｉ、Ｘ４２６ＲおよびＸ４５０Ｓから選択される。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号４、８、２６、３６、４０、７８、１００、１０２、１４８、１５６、１６０、１７０、１７２、１８０および１９８から選択される。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号４である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１００である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１４８である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１５６である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１６０である。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号１８０である。
いくつかの実施形態において、本明細書中のプロセスを行うことができる例示的なトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの選択および使用に関する指針は、本明細書中の説明、例えば、表２Ａおよび２Ｂならびに実施例に提供される。
本明細書中の実施形態および実施例において例示される実施形態において、使用され得る好適な反応条件の様々な範囲としては、アミノドナー、ｐＨ、温度、緩衝剤、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、補助因子負荷、圧力および反応時間の範囲が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用して、基質化合物を生成物化合物に生体触媒変換するためのプロセスを行うのにさらに適した反応条件は、本明細書中に提供される指針に照らして、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと基質化合物とを、濃度、ｐＨ、温度、溶媒条件の実験的反応条件下で接触させ、生成物化合物を検出することを含むがこれらに限定されない通例の実験によって容易に最適化され得る。
本明細書中のいくつかの実施形態において、トランスアミナーゼポリペプチドは、アミノドナーを使用して、生成物化合物を形成する。いくつかの実施形態において、反応条件のアミノドナーは、イソプロピルアミン（本明細書中で「ＩＰＭ」とも称される）、プトレッシン、Ｌ−リジン、α−フェネチルアミン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニンもしくはＤ，Ｌ−アラニンまたはＤ，Ｌ−オルニチンから選択され得る。いくつかの実施形態において、アミノドナーは、ＩＰＭ、プトレッシン、Ｌ−リジン、Ｄ−またはＬ−アラニンから選択される。いくつかの実施形態において、アミノドナーは、ＩＰＭである。いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、少なくとも約０．１〜約３Ｍ、０．２〜約２．５Ｍ、約０．５〜約２Ｍまたは約１〜約２Ｍの濃度で存在するアミノドナー、特に、ＩＰＭを含む。いくつかの実施形態において、アミノドナーは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、１、１．５、２、２．５または３Ｍの濃度で存在する。より高い濃度のアミノドナー、例えば、ＩＰＭを使用することにより、平衡状態をアミン生成物の形成にシフトさせることができる。
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用する好適な反応条件は、代表的には、補助因子も含む。本明細書中のトランスアミナーゼ酵素に有用な補助因子としては、ピリドキサール−５’−リン酸（ピリドキサール−リン酸、ＰＬＰ、Ｐ５Ｐとしても知られる）、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）、ならびにそれらのリン酸化された対応物であるピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）およびピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、補助因子ＰＬＰは、天然には細胞抽出物中に存在し、補充される必要はない。上記プロセスのいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、例えば、部分的に精製されたまたは精製されたトランスアミナーゼ酵素を使用するとき、酵素反応混合物に加えられる外来性の補助因子を含む。いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の、ＰＬＰ、ＰＮ、ＰＬ、ＰＭ、ＰＮＰおよびＰＭＰから選択される補助因子の存在を含み得る。いくつかの実施形態において、反応条件は、約０．１ｇ／Ｌ以下、０．２ｇ／Ｌ以下、０．５ｇ／Ｌ以下、１ｇ／Ｌ以下、２．５ｇ／Ｌ以下、５ｇ／Ｌ以下または１０ｇ／Ｌ以下のＰＬＰ濃度を含む。いくつかの実施形態において、補助因子は、反応の開始時に加えられ得、かつ／またはさらなる補助因子が、反応中に加えられる。
反応混合物中の基質化合物は、例えば、生成物化合物の所望の量、酵素活性に対する基質濃度の影響、反応条件下での酵素の安定性、および基質から生成物へのパーセント変換を考慮して、変動させることができる。いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、少なくとも約０．５〜約２００ｇ／Ｌ、１〜約２００ｇ／Ｌ、約５〜約１５０ｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｇ／Ｌ、約２０〜約１００ｇ／Ｌまたは約５０〜約１００ｇ／Ｌの基質化合物負荷を含む。いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌもしくは少なくとも約２００ｇ／Ｌ、またはなおもそれより多い基質化合物負荷を含む。本明細書中に提供される基質負荷に対する値は、化合物（２）の分子量に基づくが、しかしながら、等価なモル量の化合物（２）の様々な水和物および塩もまた、そのプロセスにおいて使用され得ることも企図される。さらに、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）の化合物を含む式（ＩＩ）のケトン基質化合物もまた、化合物（２）に対して使用される量に照らして、適切な量で使用され得る。
本明細書中に記載される反応を行う際に、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、精製された酵素、その酵素をコードする遺伝子で形質転換された細胞全体ならびに／またはそのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解産物の形態で、反応混合物に加えられ得る。操作されたトランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子で形質転換された細胞全体またはその細胞抽出物、溶解産物および単離された酵素は、固体（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）または半固体（例えば、粗ペースト）を含む種々の異なる形態で使用され得る。細胞抽出物または細胞溶解産物は、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理など）に続く脱塩手順の後の凍結乾燥（例えば、限外濾過、透析など）によって、部分的に精製され得る。いずれの細胞調製物も、公知の架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）を使用する架橋または固相（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃなど）への固定化によって安定化され得る。
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする遺伝子は、宿主細胞に別々に、または同じ宿主細胞に共に形質転換され得る。例えば、いくつかの実施形態において、１セットの宿主細胞が、１つの操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換され得、別のセットが、別の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換され得る。形質転換された両方のセットの細胞が、細胞全体の形態で、またはそれらに由来する溶解産物もしくは抽出物の形態で、反応混合物において共に使用され得る。他の実施形態において、宿主細胞は、複数の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換され得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリペプチドは、分泌されるポリペプチドの形態で発現され得、その分泌されるポリペプチドを含む培養培地が、トランスアミナーゼ反応のために使用され得る。
本明細書中に開示される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの活性および／または立体選択性の増強は、より低い濃度の操作されたポリペプチドを用いてより高いパーセンテージ変換が達成され得るプロセスをもたらす。そのプロセスのいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、約０．０１〜約５０ｇ／Ｌ；約０．０５〜約５０ｇ／Ｌ；約０．１〜約４０ｇ／Ｌ；約１〜約４０ｇ／Ｌ；約２〜約４０ｇ／Ｌ；約５〜約４０ｇ／Ｌ；約５〜約３０ｇ／Ｌ；約０．１〜約１０ｇ／Ｌ；約０．５〜約１０ｇ／Ｌ；約１〜約１０ｇ／Ｌ；約０．１〜約５ｇ／Ｌ；約０．５〜約５ｇ／Ｌ；または約０．１〜約２ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド濃度を含む。いくつかの実施形態において、トランスアミナーゼポリペプチドは、約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０ｇ／Ｌの濃度である。
アミノ基転移反応の経過中、反応混合物のｐＨは、変化し得る。反応混合物のｐＨは、所望のｐＨでまたは所望のｐＨ範囲内で維持され得る。これは、反応の前および／または反応の経過中に酸または塩基を加えることによって行われ得る。あるいは、ｐＨは、緩衝剤を使用することによって調節され得る。したがって、いくつかの実施形態において、反応条件は、緩衝剤を含む。所望のｐＨ範囲を維持するのに好適な緩衝剤は、当該分野で公知であり、それらとしては、例として、これらに限定されないが、ホウ酸塩、炭酸塩、リン酸塩、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）などが挙げられる。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、ホウ酸塩である。上記プロセスのいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、ＴＥＡの緩衝溶液を含み、ここで、そのＴＥＡの濃度は、約０．０１〜約０．４Ｍ、０．０５〜約０．４Ｍ、０．１〜約０．３Ｍまたは約０．１〜約０．２Ｍである。いくつかの実施形態において、反応条件は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．３または０．４ＭのＴＥＡ濃度を含む。いくつかの実施形態において、反応条件は、好適な溶媒として、緩衝剤が存在しない水を含む。
上記プロセスの実施形態において、反応条件は、好適なｐＨを含み得る。所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲は、酸もしくは塩基、適切な緩衝剤または緩衝剤と酸もしくは塩基の添加との組み合わせを使用することによって維持され得る。反応混合物のｐＨは、反応の前および／または反応の経過中に調節され得る。いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、約６〜約１２の溶液ｐＨ、約６〜約１０のｐＨ、約６〜約８のｐＨ、約７〜約１０のｐＨ、約７〜約９のｐＨまたは約７〜約８のｐＨを含む。いくつかの実施形態において、反応条件は、約６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５または１２の溶液ｐＨを含む。
本明細書中のプロセスの実施形態において、例えば、より高い温度における高い反応速度、および反応時間中の酵素の活性を考慮して、好適な温度が、その反応条件のために使用され得る。例えば、本開示の操作されたポリペプチドは、天然に存在するトランスアミナーゼポリペプチド、例えば、配列番号２の野生型ポリペプチドと比較して高い安定性を有し、そのおかげで、高い変換率および改善された基質溶解度の特徴のために、より高い温度において、操作されたポリペプチドを使用することが可能である。したがって、いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、約１０℃〜約７０℃、約１０℃〜約６５℃、約１５℃〜約６０℃、約２０℃〜約６０℃、約２０℃〜約５５℃、約３０℃〜約５５℃または約４０℃〜約５０℃の温度を含む。いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃または７０℃の温度を含む。いくつかの実施形態において、酵素反応中の温度は、反応の経過全体にわたってある温度で維持され得るか、または反応の経過中に温度プロファイルに対して調整され得る。
本明細書中のプロセスは、通常、溶媒中で行われる。好適な溶媒としては、水、水性の緩衝溶液、有機溶媒、ポリマー溶媒および／または共溶媒系（通常、水性溶媒、有機溶媒および／またはポリマー溶媒を含む）が挙げられる。水性溶媒（水または水性共溶媒系）は、ｐＨが緩衝され得るか、または緩衝されないものであり得る。いくつかの実施形態において、上記プロセスは、通常、有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、イオン性溶媒または極性溶媒（例えば、１エチル４メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１ブチル３メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１ブチル３メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、グリセロール、ポリエチレングリコールなど）を含む水性共溶媒系において行われる。いくつかの実施形態において、その共溶媒は、極性溶媒（例えば、ポリオール、ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯまたは低級アルコール）であり得る。水性共溶媒系の非水性共溶媒成分は、水性成分と混和性であり、単一の液相を提供し得るか、または水性成分と部分的に混和性もしくは不混和性であり、２つの液相を提供し得る。例示的な水性共溶媒系は、水、ならびに有機溶媒、極性溶媒およびポリオール溶媒から選択される１つ以上の共溶媒を含み得る。通常、水性共溶媒系の共溶媒成分は、それが、反応条件下においてトランスアミナーゼ酵素を不利に不活性化しないように選択される。適切な共溶媒系は、本明細書中に記載されるアッセイなどの酵素活性アッセイを使用して、候補溶媒系において目的の規定の基質を用いて特定の操作されたトランスアミナーゼ酵素の酵素活性を計測することによって、容易に特定され得る。
上記プロセスのいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、水性共溶媒を含み、ここで、その共溶媒は、約１％〜約８０％（ｖ／ｖ）、約１〜約７０％（ｖ／ｖ）、約２％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約５％〜約４０％（ｖ／ｖ）、１０％〜約４０％（ｖ／ｖ）、１０％〜約３０％（ｖ／ｖ）または約１０％〜約２０％（ｖ／ｖ）でＤＭＳＯを含む。上記プロセスのいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％（ｖ／ｖ）でＤＭＳＯを含む水性共溶媒を含む。上記プロセスのいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、約１５％（ｖ／ｖ）〜約４５％（ｖ／ｖ）、約２０％（ｖ／ｖ）〜約３０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ、およびいくつかの実施形態では、約２５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ濃度を含む水性共溶媒を含む。
上記プロセスのいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、水性共溶媒を含み、ここで、その共溶媒は、ポリマーポリオール溶媒を含み得る。好適なポリオール溶媒の例としては、例として、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、トリエチレングリコールジメチルエーテルおよびポリプロピレングリコールが挙げられる。いくつかの実施形態において、水性共溶媒は、種々の分子量で入手可能なポリエチレングリコールを含む。より低い分子量のポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ２００〜ＰＥＧ６００）が、特に有用である。したがって、いくつかの実施形態において、水性共溶媒は、約１％〜約４０％ｖ／ｖ；約１％〜約４０％ｖ／ｖ；約２％〜約４０％ｖ／ｖ；約５％〜約４０％ｖ／ｖ；２％〜約３０％ｖ／ｖ；５％〜約３０％ｖ／ｖ；１〜約２０％ｖ／ｖ；約２％〜約２０％ｖ／ｖ；約５％〜約２０％ｖ／ｖ；約１％〜約１０％ｖ／ｖ；約２％〜約１０％ｖ／ｖのＰＥＧ２００を含み得る。いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、約１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％；２５％；３０％；３５％；３５％または約４０％ｖ／ｖでＰＥＧ２００を含む水性共溶媒を含む。
アミノ基転移反応において使用される反応物の量は、通常、所望の生成物の量、および同時に、使用されるトランスアミナーゼ基質の量に応じて変動する。当業者は、これらの量を所望の生成レベルおよび生成規模に合わせるために、それらの量を変動させる方法を容易に理解するだろう。
いくつかの実施形態において、反応物の添加の順序は、重大ではない。反応物は、共に同時に溶媒（例えば、単相の溶媒、二相の水性共溶媒系など）に加えられてもよいし、あるいは、反応物のいくつかが、別々に加えられ、いくつかが、異なる時点において共に加えられてもよい。例えば、補助因子、トランスアミナーゼおよびトランスアミナーゼ基質が、最初に溶媒に加えられ得る。
固体反応物（例えば、酵素、塩、基質化合物など）は、粉末（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）、溶液、エマルジョン、懸濁物などを含む種々の異なる形態で、反応に提供され得る。反応物は、当業者に公知の方法および装置を用いて、容易に凍結乾燥され得るか、または噴霧乾燥され得る。例えば、タンパク質溶液は、少量のアリコートで−８０℃において凍結され、次いで、予冷された凍結乾燥チャンバーに入れた後、真空が適用され得る。
改善された混合効率のために、水性共溶媒系が使用されるとき、トランスアミナーゼおよび補助因子が、最初に水相に加えられ、混合され得る。次いで、有機相が加えられ、混合された後、トランスアミナーゼ基質が加えられ得る。あるいは、トランスアミナーゼ基質は、有機相において予め混合された後、水相に加えられてもよい。
アミノ基転移反応は、通常、ケトン基質からアミン生成物へのさらなる変換が、反応時間に伴って有意に変化しなくなるまで、例えば、基質の１０％未満しか変換されないか、または基質の５％未満しか変換されなくなるまで、進められる。いくつかの実施形態において、反応は、基質ケトンを生成物アミンに完全にまたはほぼ完全に変換するまで、進められる。基質から生成物への変換は、基質および／または生成物を検出することによって、公知の方法を用いてモニターされ得る。好適な方法としては、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどが挙げられる。反応混合物において生成されるキラルアミン生成物の変換収率は、通常、約５０％超であり、約６０％超でもあり得、約７０％超でもあり得、約８０％超でもあり得、９０％超でもあり得、約９７％超でもあり得る。いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを好適な反応条件下で使用して式（Ｉ）の化合物を調製するための方法は、約４８時間以下、約３６時間以下、約２４時間以下またはなおもそれ以下の時間において、ケトン基質、例えば、式（ＩＩ）の化合物からアミン生成物化合物、例えば、式（Ｉ）の化合物への少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える変換をもたらす。
上記プロセスのいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌまたはそれを超える基質負荷を含み、ここで、そのプロセスは、約４８時間以下、約３６時間以下または約２４時間以下において、基質化合物から生成物化合物への少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える変換をもたらす。
好適な反応条件下で式（Ｉ）のキラルアミン化合物を調製するためのプロセスにおいて使用されるときの本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％ｄ．ｅ．の、キラルアミンのジアステレオマー過剰率をもたらす。
上記プロセスのさらなる実施形態において、好適な反応条件は、後にポリペプチドと接触される反応溶液に対する最初の基質負荷を含み得る。次いで、この反応溶液に、少なくとも約１ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約２ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約６ｇ／Ｌ／ｈまたはそれを超える速度で、時間にわたっての連続添加として、さらなる基質化合物がさらに補充された。したがって、これらの好適な反応条件によると、ポリペプチドは、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌまたは４０ｇ／Ｌという最初の基質負荷を有する溶液に加えられる。次いで、このポリペプチドの添加の後、さらなる基質が、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌまたはそれを超えるといういっそう多い最終的な基質負荷に達するまで、その溶液に約２ｇ／Ｌ／ｈ、４ｇ／Ｌ／ｈまたは６ｇ／Ｌ／ｈという速度で連続添加される。したがって、上記プロセスのいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌまたは４０ｇ／Ｌという最初の基質負荷を有する溶液への上記ポリペプチドの添加に続く、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌまたはそれを超えるという最終的な基質負荷に達するまでの、約２ｇ／Ｌ／ｈ、４ｇ／Ｌ／ｈまたは６ｇ／Ｌ／ｈという速度でのその溶液へのさらなる基質の添加を含む。この基質補充の反応条件は、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるというケトン基質からアミン生成物への高い変換率を維持しつつ、より多い基質負荷が達成されることを可能にする。このプロセスのいくつかの実施形態において、加えられるさらなる基質は、少なくとも約０．５Ｍ、少なくとも約１．０Ｍ、少なくとも約２．５Ｍ、少なくとも約５．０Ｍ、少なくとも約７．５Ｍ、少なくとも約１０．０Ｍの濃度で、イソプロピルアミンまたは酢酸イソプロピルアミンを含む溶液中に存在する。
上記プロセスのいくつかの実施形態において、アミノ基転移反応は、以下の好適な反応条件（ａ）約５ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌの基質負荷；（ｂ）約０．１〜５０ｇ／Ｌの操作されたトランスアミナーゼポリペプチド；（ｃ）約０．１〜４Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｄ）約０．１〜１０ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）補助因子；（ｅ）約６〜９のｐＨ；および（ｆ）約３０〜６０℃の温度を含み得る。
上記プロセスのいくつかの実施形態において、アミノ基転移反応は、以下の好適な反応条件：（ａ）約１０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌの基質負荷；（ｂ）約０．５〜２０ｇ／Ｌの操作されたトランスアミナーゼポリペプチド；（ｃ）約０．１〜３Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｄ）約０．１〜１０ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）補助因子；（ｅ）約０．０５〜０．２０ＭのＴＥＡ緩衝液；（ｆ）約１％〜約４５％のＤＭＳＯ；（ｇ）約６〜９のｐＨ；および（ｈ）約３０〜６５℃の温度を含み得る。
上記プロセスのいくつかの実施形態において、アミノ基転移反応は、以下の好適な反応条件：（ａ）約２０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの基質負荷；（ｂ）約１〜５ｇ／Ｌの操作されたトランスアミナーゼポリペプチド；（ｃ）約０．５〜２Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｄ）約０．２〜２ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）補助因子；（ｅ）約０．１ＭのＴＥＡ緩衝液；（ｆ）約２５％のＤＭＳＯ；（ｅ）約８のｐＨ；および（ｆ）約４５〜６０℃の温度を含み得る。
いくつかの実施形態において、さらなる反応成分または行われるさらなる手法が、反応条件に付け加えられる。これらは、酵素を安定化するためもしくは酵素の不活性化を防ぐため、生成物阻害を減少させるため、および／または反応の平衡状態を生成物アミンの形成にシフトさせるために措置を講じることを含み得る。
したがって、キラルアミンなどのアミンを調製するためのプロセスのいくつかの実施形態において、さらなる量のアミノアクセプターが、加えられ得（飽和するまで）、かつ／または形成されたアミノアクセプター（ケトン）が、反応混合物から連続的に取り出され得る。例えば、溶媒ブリッジ（ｓｏｌｖｅｎｔ ｂｒｉｄｇｅ）または二相の共溶媒系を使用することにより、アミン生成物を抽出溶液に移動させ、それにより、アミン生成物による阻害を減少させることができ、また、平衡状態を生成物形成にシフトさせることができる（例えば、Ｙｕｎ ａｎｄ Ｋｉｍ，２００８，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１１）：３０３０−３０３３を参照のこと）。
上記プロセスのいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、トランスアミナーゼ酵素の不活性化を制限するように作用し得る、還元型の補助因子であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の存在を含む（例えば、ｖａｎ Ｏｐｈｅｍら、１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（９）：２８７９−８８を参照のこと）。ＮＡＤＨが存在するそのような実施形態において、補助因子再生系（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）およびグルコースデヒドロゲナーゼまたはギ酸デヒドロゲナーゼおよびホルメート）が、反応媒質中でＮＡＤＨを再生するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、アミノ基がアミノ基アクセプターに転移されるときにアミノ基ドナーから形成されるカルボニル副産物の除去をさらに含み得る。そのようなその場での除去は、正反応が優位を占め、次いで、より多くの基質が生成物に変換されるように、逆反応の速度を低下させることができる。カルボニル副産物の除去は、いくつかの方法で行われ得る。アミノ基ドナーが、アラニンなどのアミノ酸である場合、カルボニル副産物であるケト酸は、過酸化物との反応によって除去され得る（例えば、参照により本明細書中に援用されるＵＳ２００８／０２１３８４５を参照のこと）。使用され得る過酸化物としては、とりわけ、過酸化水素；ペルオキシ酸（過酸）（例えば、過酢酸（ＣＨ３ＣＯ３Ｈ）、トリフルオロ過酢酸およびメタクロロペルオキシ安息香酸）；有機過酸化物（例えば、ｔ−ブチル過酸化物（（ＣＨ３）３ＣＯＯＨ））；または他の選択的酸化剤（例えば、過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム、ＭｎＯ２、ＫＭｎＯ４、四酸化ルテニウムおよび関連する化合物）が挙げられる。あるいは、ピルベートの除去は、乳酸デヒドロゲナーゼを使用して、平衡状態を生成物アミンにシフトさせることによる、ラクテートへの還元によって達成され得る（例えば、Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉら、２００８，Ａｄｖ．Ｓｙｎ．Ｃａｔａｌ．３５０：２７６１−２７６６を参照のこと）。ピルベートの除去は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（例えば、Ｈｏｅｈｎｅら、２００８，Ｃｈｅｍ ＢｉｏＣｈｅｍ ９：３６３−３６５を参照のこと）またはアセト乳酸シンターゼ（例えば、Ｙｕｎ ａｎｄ Ｋｉｍ，前出を参照のこと）を使用することによる、脱炭酸によっても達成され得る。
あるいは、アミノ酸がアミノ基ドナーとして使用される実施形態において、ケト酸カルボニル副産物は、アンモニアなどのアミンドナーの存在下で、適切なデヒドロゲナーゼ酵素、例えば、アミノ酸デヒドロゲナーゼを使用する、アンモニアおよびＮＡＤＨとの反応によってアミノ酸に再利用され得、それにより、アミノ基ドナーが補充される。
いくつかの実施形態において、アミノドナーの選択によって、水より高い蒸気圧を有するカルボニル副産物（例えば、揮発性の有機カルボニル化合物などの低沸点の副生成物）がもたらされる場合、そのカルボニル副産物は、反応溶液を非反応性ガスとともに噴霧することによって、または真空を適用して反応の圧力を低下させ、気相中に存在するカルボニル副産物を除去することによって、除去され得る。非反応性ガスは、反応成分と反応しない任意のガスである。様々な非反応性ガスとしては、窒素ガスおよび貴ガス（例えば、不活性ガス）が挙げられる。いくつかの実施形態において、非反応性ガスは、窒素ガスである。いくつかの実施形態において、上記プロセスにおいて使用されるアミノドナーは、アミノ基アクセプターにアミノ基を転移する際にカルボニル副産物であるアセトンを形成するイソプロピルアミン（ＩＰＭ）である。このアセトンは、窒素ガスとともに噴霧することによって、または反応溶液に真空を適用して、冷却器または他の冷却トラップなどのアセトントラップによってアセトンを気相から除去することによって、除去され得る。あるいは、アセトンは、トランスアミナーゼを使用してイソプロパノールに還元することによって除去され得る。
カルボニル副産物が除去される上記プロセスのいくつかの実施形態において、対応するアミノ基ドナーは、アミノ基ドナーを補充するためおよび／または反応のｐＨを維持するために、アミノ基転移反応中に加えられ得る。アミノ基ドナーの補充は、平衡状態を生成物形成にシフトさせ、それにより、基質から生成物への変換も増加させる。したがって、アミノ基ドナーがイソプロピルアミンであり、アセトン生成物がその場で除去される、いくつかの実施形態において、イソプロピルアミンは、アセトン除去中に失われたアミノ基ドナーを補充するためおよび反応のｐＨを維持するために、その溶液に加えられ得る。
さらなる実施形態において、基質化合物を生成物化合物に変換するための上に記載された任意のプロセスが、生成物化合物の抽出、単離、精製および結晶化から選択される１つ以上の工程も含み得る。上で開示された方法によって生成された生体触媒反応混合物から生成物アミンを抽出するため、単離するため、精製するためおよび／または結晶化するための方法、手法およびプロトコルは、当業者に公知であり、かつ／または通例の実験によって到達される。さらに、例示的な方法が、下記の実施例に提供される。
本開示の様々な特徴および実施形態が、例示的であって限定すると意図されない、以下の代表的な実施例において例示される。
６．実施例
実施例１：操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの合成、最適化およびスクリーニング
遺伝子の合成および最適化：Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７由来の４５３アミノ酸の野生型ω−トランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥＡ３９１８３．１，ＧＩ：３２７２０７０６６）を予めコドン最適化し、合成した。このコドン最適化されたＶ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ野生型トランスアミナーゼ遺伝子の配列は、参照により本明細書中に援用される２０１１年１２月２２日に公開されたＷＯ２０１１１５９９１０Ａ２において配列番号１として開示された。このコドン最適化された遺伝子を、ｐＣＫ１１０９００ベクター系（例えば、参照により本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００６０１９５９４７号を参照のこと）にクローニングし、続いて、大腸菌Ｗ３１１０ｆｈｕＡにおいて発現させた。大腸菌Ｗ３１１０は、ｌａｃプロモーターの支配下において、そのトランスアミナーゼポリペプチドを細胞内タンパク質として発現する。配列番号１の配列を有する本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするものであり、ＷＯ２０１１１５９９１０Ａ２のコドン最適化されたＶ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ野生型トランスアミナーゼ遺伝子の定向進化によって得られた。配列番号２の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥＡ３９１８３．１，ＧＩ：３２７２０７０６６の野生型Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓトランスアミナーゼポリペプチド配列と比べて、１０個のアミノ酸残基差異（Ａ９Ｔ；Ｎ４５Ｈ；Ｗ５７Ｌ；Ｆ８６Ｓ；Ｖ１５３Ａ；Ｖ１７７Ｌ；Ｒ２１１Ｋ；Ｍ２９４Ｖ；Ｓ３２４Ｇ；およびＴ３９１Ａ）を有する。配列番号１の配列を有する本開示のポリヌクレオチド（配列番号２の操作されたポリペプチドをコードする）をさらに最適化することにより、配列番号４の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする配列番号３を得た。配列番号４の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２と比べて、以下の８つのアミノ酸残基差異を有する：Ｔ３４Ａ；Ｌ５６Ａ；Ｒ８８Ｈ；Ａ１５３Ｃ；Ａ１５５Ｖ；Ｋ１６３Ｆ；Ｅ３１５Ｇ；およびＬ４１７Ｔ。遺伝子合成の後にヒットをスクリーニングし、配列決定することによって、改変体ライブラリーを繰り返し作製することによる標準的な定向進化の方法を用いるさらなる最適化のための最初の骨格として、配列番号３の配列を有する本開示のポリヌクレオチド（配列番号４の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする）を使用し、配列番号４のポリペプチドと比較して増強された酵素特性を有する、化合物（２）を化合物（１）に変換することができる操作されたトランスアミナーゼをコードする遺伝子を作製した。得られた操作されたトランスアミナーゼポリペプチド配列および具体的な変異および相対的な活性は、表２Ａおよび配列表に列挙されている。
実施例２：操作されたトランスアミナーゼの産生
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを、ｌａｃプロモーターの支配下で発現される細胞内タンパク質として、宿主大腸菌Ｗ３１１０において産生させた。そのポリペプチドは、主に、サイトゾルの可溶性の活性な酵素として蓄積する。振とうフラスコ法を用いることにより、本明細書中に開示される活性アッセイまたは生体触媒プロセスにおいて使用され得る操作されたポリペプチドの粉末を生成した。
ハイスループットでの増殖および発現。細胞を拾い、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含むＬＢ培地中で一晩、３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％湿度の培養条件下で増殖させる。一晩増殖物の２０μＬアリコートを、３０μｇ／ｍＬ ＣＡＭ、１ｍＭ ＩＰＴＧを含む３８０μＬの２×ＹＴ増殖培地を含む深ウェルプレートに移し、３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％湿度で約１８時間インキュベートする。継代培養ＴＢ培地は、ＴＢ培地（３８０μＬ／ウェル）、３０μｇ／ｍＬ ＣＡＭおよび１ｍＭ ＩＰＴＧから構成される。細胞培養物を、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、培地を廃棄する。細胞ペレットを、２５０または４００μＬの溶解緩衝液（４００μｇ／ｍＬ ＰＭＢＳおよび５００μｇ／ｍＬリゾチームを含む０．１Ｍのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）緩衝液，ｐＨ９．０）に再懸濁し、溶解産物を、下記に記載されるようなＨＴＰアッセイにおいて使用する。
振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）の生成。振とうフラスコ法を用いることにより、二次スクリーニングアッセイまたは本明細書中に開示される生体触媒プロセスにおいて使用される、操作されたトランスアミナーゼポリペプチド粉末を生成した。振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）は、およそ３０％の総タンパク質を含み、従って、ＨＴＰアッセイにおいて使用される細胞溶解産物と比べて、操作された酵素のより精製された調製物を提供する。目的の操作されたトランスアミナーゼをコードするプラスミドを含む大腸菌のシングルコロニーを、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含む５０ｍＬのＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉブロスに接種する。２５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃の恒温器内で一晩（少なくとも１６時間）、細胞を増殖させる。その培養物を、１リットルのフラスコ内で、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む２５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（１２ｇ／Ｌバクト−トリプトン、２４ｇ／Ｌ酵母エキス、４ｍＬ／Ｌグリセロール、６５ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ７．０、１ｍＭ ＭｇＳＯ４）中に、０．２という６００ｎｍの光学濃度（ＯＤ６００）に希釈し、３０℃で増殖させる。培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８になったら、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（「ＩＰＴＧ」）を１ｍＭという最終濃度まで加えることによって、トランスアミナーゼ遺伝子の発現を誘導する。次いで、インキュベーションを一晩（少なくとも１６時間）続ける。遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）によって細胞を回収し、上清を廃棄する。細胞ペレットを、等体積の冷（４℃）１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液，ｐＨ７．０に再懸濁し、上記のように遠心分離によって回収する。洗浄された細胞を２体積の冷トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液に再懸濁し、４℃で維持しつつ、１２，０００ｐｓｉでフレンチプレスに２回通した。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４５分、４℃）によって細胞残屑を除去する。透明の溶解産物上清を集め、−２０℃で保管する。凍結された透明の溶解産物の凍結乾燥により、粗トランスアミナーゼポリペプチドの乾燥した振とうフラスコ粉末が得られる。あるいは、細胞ペレット（洗浄の前または後）は、４℃または−８０℃で保存され得る。
ダウンストリームプロセス（ＤＳＰ）粉末の生成：ＤＳＰ粉末は、およそ８０％の総タンパク質を含み、従って、ハイスループットアッセイにおいて使用される細胞溶解産物と比べて、操作されたトランスアミナーゼ酵素のより精製された調製物を提供する。ＤＳＰ粉末を生成するための、操作されたトランスアミナーゼのより大きなスケール（約１００〜１２０ｇ）の発酵が、標準的なバイオプロセス法に従って、短時間培養の後、流加培養プロセスとして行われ得る。簡潔には、ＩＰＴＧを１ｍＭという最終濃度まで加えることによって、トランスアミナーゼの発現を誘導する。発酵の後、細胞を回収し、１００ｍＭトリエタノールアミン−Ｈ２ＳＯ４緩衝液に再懸濁し、次いで、均質化によって機械的に破砕する。細胞残屑および核酸を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて凝集させ、懸濁物を遠心分離によって清澄化する。得られた透明の上清を、タンジェンシャルクロスフロー限外濾過膜を用いて濃縮することにより、塩および水を除去する。次いで、濃縮され、部分的に精製された酵素濃縮物は、凍結乾燥機において乾燥され、包装され得る（例えば、ポリエチレン容器内に）。
実施例３：式（ＩＩ）の大きなケトン基質化合物から式（Ｉ）のキラルアミン化合物への変換についてのトランスアミナーゼのハイスループット（ＨＴＰ）スクリーニング
細胞溶解産物のＨＴＰスクリーニングを用いることにより、大きなケトン基質（例えば、化合物（２））からキラルアミン生成物（例えば、化合物（１））への変換についての、改善された特性を有する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの一次選択を誘導した。
溶解産物を調製するために、細胞を、上に記載されたように９６ウェルプレートにおいて増殖させ、２００μＬ（配列番号４〜１４４の場合のＨＴＰアッセイ）または２５０μＬ（配列番号１４６〜２０４の場合のＨＴＰアッセイ）の溶解緩衝液（１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、０．５ｍｇ／ｍＬポリミキシンＢスルフェート、１ｍＭ ＰＬＰ、０．１Ｍトリエタノールアミン（ＴＥＡ），ｐＨ７．０）を各ウェルに分注することによって、溶解産物を調製した。プレートを密封し、２時間振盪し、次いで、４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離することにより、細胞残屑をペレットにした。
配列番号４〜１４４のポリペプチドの活性についてのＨＴＰアッセイ：基質原液（ＤＭＳＯに溶解された８０ｇ／Ｌ化合物（２））の５０μＬアリコートを、イソプロピルアミン（ＩＰＭ）／ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ９中の、３．３３Ｍ ＩＰＭおよび１．６７ｇ／Ｌ ＰＬＰ）の６０μＬの予め混合された原液および３５μＬの０．１ＭのＴＥＡ緩衝液ｐＨ９．０とともに、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。５５μＬの細胞溶解産物／ウェルを加えることによって、反応を開始した。プレートを密封し、６０℃で２４時間振盪しながらインキュベートした。２４時間後、プレートを４０００ｒｐｍ、１８℃で３分間遠心分離した。４００μＬのアセトニトリルで反応をクエンチし、実施例４に記載されるようにＨＰＬＣによってサンプルを調べた。
配列番号１４６〜２０４のポリペプチドの活性についてのＨＴＰアッセイ：基質原液（ＤＭＳＯに溶解された８０ｇ／Ｌ化合物（２））の５０μＬアリコートを、イソプロピルアミン（ＩＰＭ）／ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ９中の、３．３３Ｍ ＩＰＭおよび１．６７ｇ／Ｌ ＰＬＰ）の６０μＬの予め混合された原液および６０μＬの０．１ＭのＴＥＡ緩衝液ｐＨ９．０とともに、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。３０μＬの細胞溶解産物／ウェルを加えることによって、反応を開始した。プレートを密封し、６０℃で２４時間振盪しながらインキュベートした。２４時間後、プレートを４０００ｒｐｍ、１８℃で３分間遠心分離した。４００μＬのアセトニトリルで反応をクエンチした。プレートを、室温において５分間さらに振盪し、次いで、４０００ｒｐｍ、１８℃で１５分間、さらに遠心分離することにより、すべての残屑をペレットにした。実施例４に記載されるようにＨＰＬＣによってサンプルを調べた。
配列番号１４６〜２０４のポリペプチドによって生成された化合物（１）の％ｄｅについてのＨＴＰアッセイ：基質原液（ＤＭＳＯに溶解された４０ｇ／Ｌ化合物（２））の５０μＬアリコートを、イソプロピルアミン（ＩＰＭ）／ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ９中の、３．３３Ｍ ＩＰＭおよび１．６７ｇ／Ｌ ＰＬＰ）の６０μＬの予め混合された原液とともに、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。９０μＬの細胞溶解産物／ウェルを加えることによって、反応を開始した。プレートを密封し、２５０ｒｐｍ、６０℃で４８時間振盪しながらインキュベートした。４８時間後、プレートを４０００ｒｐｍ、１８℃で３分間遠心分離した。４００μＬのアセトニトリルで反応をクエンチした。プレートを、室温において５分間さらに振盪することにより、確実にすべての基質および生成物を溶解させた。プレートを４０００ｒｐｍ、１８℃で１５分間遠心分離することにより、すべての残屑をペレットにした。実施例４に記載されるようにＨＰＬＣによってサンプルを調べた。
実施例４：分析手順
ＨＴＰ反応の活性のＨＰＬＣ解析：実施例３におけるようなクエンチされたＨＴＰ反応の２０μＬアリコートを取り、１：１アセトニトリル：水および０．３７％（ｖ／ｖ）濃ＨＣｌを含む１８０μＬの希釈剤溶液に加えることによって、活性をＨＰＬＣ解析するためのサンプルを調製した。それらのサンプルを、以下の条件のＨＰＬＣ解析に供した。
化合物（２）から化合物（１）への変換を、以下のとおり、得られたクロマトグラムから決定した：
変換（％）＝生成物面積／（生成物面積＋基質面積）×１００％ 。
生成物のキラル純度（％ｄｅ）についてのＨＰＬＣ解析：実施例３におけるようなクエンチされたＨＴＰ反応の４０μＬアリコートを取り、１：１アセトニトリル：水および０．８４％（ｖ／ｖ）濃ＨＣｌを含む１６０μＬの希釈剤溶液に加えることによって、化合物（１）のキラル純度またはジアステレオマー過剰率をＨＰＬＣ解析するためのサンプルを調製した。それらのサンプルを、以下の条件のＨＰＬＣ解析に供した。
実施例５：１０ｍＬスケールで式（ＩＩ）の大きなケトン基質化合物を式（Ｉ）のキラルアミン化合物に変換するためのプロセス
配列番号４、８、２６、３６、４０、７８、１００、１０２、１４８、１５６、１６０、１７０、１７２、１８０および１９８の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのＳＦＰ調製物を、化合物（２）の大きなケトン基質からキラルアミン化合物（１）への変換の１０ｍＬスケールの反応において使用した。これらの反応から、どれくらいのこれらの生体触媒が式（Ｉ）の化合物を調製するために使用され得るかが実証される。１０ｍＬスケールでの反応を、以下のとおり行った。十字形の磁気撹拌子を備えた２０ｍＬのガラスバイアルに、４ｍＬの１００ｍＭ ＴＥＡ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた。そのバイアルに、２ｍＬの５Ｍ ＩＰＭ・ＨＣｌ原液を加えた後、１ｍＬの５ｍＭ ＰＬＰ原液を加えた。その溶液のｐＨは、約８．０だった。その混合物を、５００ｒｐｍで撹拌した（磁気撹拌）。２００ｍｇの化合物（２）のケトン基質を２．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、次いで、そのバイアルに加えた。１．０Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用して、その混合物のｐＨを８．０に調整した。最後に、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのＤＳＰ調製物の４０ｇ／Ｌ原液の０．５ｍＬアリコートを加えることにより、反応を開始した。成分の最終濃度は、２０ｇ／Ｌの化合物（２）；０．５ｇ／Ｌ ＰＬＰ；１Ｍ ＩＰＭ；２５％ｖ／ｖＤＭＳＯ；２ｇ／Ｌトランスアミナーゼポリペプチド調製物；および１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ７．０だった。次いで、この混合物を５５℃のホットプレート上で撹拌した。
１０μＬのサンプルを、異なる時点において採取し、２００μＬのアセトニトリル：水（１：１）で希釈した。そのサンプルに１μＬの濃ＨＣｌを加え、それを２０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。これらのサンプルをＨＰＬＣによって解析することにより、反応の時間経過をモニターした。２４時間後、反応混合物を１０ｍＬのアセトニトリルでクエンチし、その混合物をＨＰＬＣによって解析することにより、化合物（２）から生成物化合物（１）への最終的な％変換を得た。２４時間後の化合物（２）から生成物化合物（１）への％変換に対する結果は、表２Ｂに示されている。
本願において引用されたすべての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、各個別の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、すべての目的のために参照により援用されると個別に示されたのと同程度に、すべての目的のために、それらの全体が参照により援用される。
様々な具体的な実施形態が、例示され、説明されてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われ得ることが認識されるだろう。

Claims (55)

  1. 配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性、ならびに配列番号２と比べて、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ５６、Ｘ７３、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１４７、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２３３、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３１７、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３８３、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４１５、Ｘ４１７、Ｘ４２６、Ｘ４３４およびＸ４５０から選択される残基位置に１つ以上の残基差異を有するアミノ酸配列を含む、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドであって、ここで、残基位置Ｘ２１、Ｘ５６、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ１０７、Ｘ１１３、Ｘ１３３、Ｘ１４７、Ｘ２３３、Ｘ２８６、Ｘ３１２、Ｘ３１６、Ｘ３８３、Ｘ４１５、Ｘ４１７およびＸ４３４における前記残基差異は、Ｘ２１Ｈ、Ｘ５６Ａ／Ｃ、Ｘ８６Ｃ、Ｘ８８Ｈ／Ｙ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ／Ｐ、Ｘ１４７Ｈ／Ｖ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ２８６Ｃ／Ｈ、Ｘ３１２Ｎ、Ｘ３１６Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｔ、Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ、Ｘ４１７ＶおよびＸ４３４Ｔから選択される、操作されたポリペプチド。
  2. 前記残基位置Ｘ１９、Ｘ３４、Ｘ５３、Ｘ７３、Ｘ１５５、Ｘ１６５、Ｘ１７１、Ｘ１７８、Ｘ２５１、Ｘ２５９、Ｘ２６８、Ｘ２７７、Ｘ３１７、Ｘ３５８、Ｘ３６６、Ｘ３９９、Ｘ４１４、Ｘ４２６およびＸ４５０における前記残基差異が、Ｘ１９Ｗ、Ｘ３４Ａ、Ｘ５３Ｍ、Ｘ７３Ｒ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６５Ｆ、Ｘ１７１Ｑ、Ｘ１７８Ｗ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２５９Ｖ、Ｘ２６８Ａ、Ｘ２７７Ａ、Ｘ３１７Ｌ、Ｘ３５８Ｋ、Ｘ３６６Ｈ、Ｘ３９９Ａ、Ｘ４１４Ｉ、Ｘ４２６ＲおよびＸ４５０Ｓから選択される、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  3. 前記アミノ酸配列が、配列番号２と比べて、Ｘ３４Ａ、Ｘ５６Ａ、Ｘ８８Ｈ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ、Ｘ１４７Ｈ、Ｘ１５３Ｃ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ３１５Ｇ、Ｘ３１６Ｎ、Ｘ３８３ＩおよびＸ４５０Ｓから選択される少なくとも１つ以上の残基差異を含む、請求項１または２に記載の操作されたポリペプチド。
  4. 前記アミノ酸配列が、配列番号２と比べて、Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ／Ｌ、Ｘ８６Ｎ／Ｓ、Ｘ１５３Ａ、Ｘ２３３Ｔ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３ＶおよびＸ４１７Ｔから選択される１つ以上の残基差異をさらに含む、請求項１、２または３に記載の操作されたポリペプチド。
  5. 前記アミノ酸配列が、配列番号２と比べて、Ｘ３４Ａ、Ｘ５６Ａ、Ｘ５７Ｌ、Ｘ８６Ｓ、Ｘ８８Ａ；Ｘ１５３Ｃ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１６３Ｆ、Ｘ３１５ＧおよびＸ４１７Ｔを含む残基差異の組み合わせを少なくとも含む、請求項４に記載の操作されたポリペプチド。
  6. 前記アミノ酸配列が、配列番号２と比べて、Ｘ３１６Ｎの残基差異をさらに含む、請求項５に記載の操作されたポリペプチド。
  7. 前記アミノ酸配列が、配列番号２と比べて、Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ／Ｔ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓから選択される残基差異をさらに含む、請求項６に記載の操作されたポリペプチド。
  8. 前記アミノ酸配列が、配列番号２と比べて、以下：
    Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ３２３ＴおよびＸ３８３Ｖ；
    Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ、Ｘ２３３Ｔ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓ；
    Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ２３３Ｖ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓ；ならびに
    Ｘ３１Ｍ、Ｘ５７Ｆ、Ｘ１４７Ｈ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４５０Ｓ
    から選択される残基差異の組み合わせをさらに含む、請求項７に記載の操作されたポリペプチド。
  9. 前記トランスアミナーゼが、配列番号４のポリペプチドと比べて、少なくとも１．２倍高い安定性を有し、前記アミノ酸配列が、配列番号２と比べて、Ｘ３４Ｔ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｌ、Ｘ１４７Ｈ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ２３３Ｔ／Ｖ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３８３Ｉ／ＶおよびＸ４５０Ｓから選択される１つ以上の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  10. 前記トランスアミナーゼが、化合物（２）を化合物（１）に変換する際に、配列番号４のポリペプチドと比べて少なくとも１．２倍高い活性を有し、前記アミノ酸配列が、配列番号２と比べて、Ｘ５６Ａ、Ｘ８６Ｓ、Ｘ８８Ｈ、Ｘ１５３Ｃ、Ｘ４１５ＨおよびＸ４１７Ｔから選択される１つ以上の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  11. 前記トランスアミナーゼが、化合物（２）を化合物（１）に変換する際に、配列番号４のポリペプチドと比べて高いエナンチオ選択性を有し、前記アミノ酸配列は、配列番号２と比べて、Ｘ５７Ｆ、Ｘ１５３ＣおよびＸ３１６Ｎから選択される１つ以上の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  12. 前記アミノ酸配列が、配列番号２と比べて、Ｘ１８Ａ、Ｘ１９Ｗ、Ｘ２１Ｈ、Ｘ３１Ｍ、Ｘ３４Ａ、Ｘ５３Ｍ、Ｘ５６Ａ／Ｃ、Ｘ５７Ｃ／Ｆ／Ｌ、Ｘ７３Ｒ、Ｘ８６Ｃ／Ｎ／Ｓ／Ｙ、Ｘ８８Ｈ／Ｙ、Ｘ１０７Ｇ、Ｘ１１３Ｃ／Ｌ／Ｐ、Ｘ１４６Ｌ、Ｘ１４７Ｈ／Ｋ／Ｖ、Ｘ１５３Ａ／Ｃ／Ｖ、Ｘ１５５Ａ／Ｖ、Ｘ１６３Ｌ、Ｘ１６５Ｆ、Ｘ１７１Ｑ、Ｘ１７８Ｗ、Ｘ１９０Ｋ、Ｘ２０６Ｋ、Ｘ２２８Ｇ、Ｘ２３３Ｔ／Ｖ、Ｘ２３５Ｐ、Ｘ２４４Ｔ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２５９Ｖ、Ｘ２６８Ａ、Ｘ２７７Ａ、Ｘ２８６Ｃ／Ｈ、Ｘ３１２Ｎ、Ｘ３１４Ｎ、Ｘ３１５Ｇ、Ｘ３１６Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｎ／Ｓ／Ｔ、Ｘ３１７Ｌ、Ｘ３１９Ｎ、Ｘ３２３Ｔ、Ｘ３５８Ｋ、Ｘ３６６Ｈ、Ｘ３８３Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｔ／Ｖ、Ｘ３９５Ｐ、Ｘ３９９Ａ、Ｘ４１４Ｉ、Ｘ４１５Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｖ、Ｘ４１７Ｔ／Ｖ、Ｘ４２４Ａ、Ｘ４２６Ｒ、Ｘ４２７Ｙ、Ｘ４３４ＴおよびＸ４５０Ｓから選択される残基差異をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の操作されたポリペプチド。
  13. 前記アミノ酸配列が、配列番号２と比べて、Ｘ９、Ｘ４５、Ｘ１７７、Ｘ２１１、Ｘ２９４、Ｘ３２４およびＸ３９１位に残基差異を含まない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の操作されたポリペプチド。
  14. 前記アミノ酸配列が、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２および２０４から選択される配列を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  15. 前記ポリペプチドが、固体支持体上に固定化されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の操作されたポリペプチド。
  16. 前記固体支持体が、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、オクタデシル官能基を有するスチレン／ＤＶＢコポリマーまたはポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂である、請求項１５に記載の操作されたポリペプチド。
  17. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  18. 配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１および２０３から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  19. 請求項１７または１８に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  20. 調節配列を含む、請求項１９に記載の発現ベクター。
  21. 請求項１７もしくは１８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１９もしくは２０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  22. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の操作されたポリペプチドを調製する方法であって、前記方法は、請求項２１に記載の宿主細胞を前記ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程を含む、方法。
  23. 前記操作されたポリペプチドを単離する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 式（Ｉ）：
    のアミン化合物を調製するためのプロセスであって、式中、
    環Ａは、２位と３位との間および／もしくは５位と６位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を必要に応じて含み、かつ／または２、３、４、５および６位においてハロ、ヒドロキシおよびメチルから選択される基で必要に応じて独立して置換される、６員の炭素環であり；
    環Ｂは、５位と１０位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を必要に応じて含み、かつ／または９位および１０位のうちの１つ以上においてハロ、ヒドロキシおよびメチルから選択される基で必要に応じて独立して置換される、６員の炭素環であり；
    環Ｃは、１０位においてハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択される基で必要に応じて置換される、５または６員の炭素環（すなわち、ｍ＝０または１）であり；
    環Ｄは、１、２もしくは３つの不飽和Ｃ−Ｃ結合を必要に応じて含み、かつ／または以下のとおり：
    １４位において、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、および１２位に架橋しているシクロプロピルから選択される基で；
    １５位または１６位において、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニル、アミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換されるシクロアルキル、必要に応じて置換されるヘテロシクロアルキル、必要に応じて置換されるアリール、必要に応じて置換されるヘテロアリール、必要に応じて置換されるアリールオキシ、必要に応じて置換されるアリールアミノ、必要に応じて置換されるアリールチオ、必要に応じて置換されるアリールスルホニル、必要に応じて置換されるアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるアリールカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールアミノ、必要に応じて置換されるヘテロアリールチオ、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルホニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールカルボニルオキシ、アルキルアミノスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよびヘテロアリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される基で、
    必要に応じて独立して置換される、５、６または７員の炭素環（すなわち、ｎ＝０、１または２）であるが；
    ただし、式（Ｉ）の化合物は、化合物（１）：
    ではなく、
    前記方法は、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤが、式（Ｉ）の化合物に対して上で定義されたとおりである、式（ＩＩ）：
    のケトン基質化合物を、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む、プロセス。
  25. 式（Ｉ）のアミン化合物が、式（Ｉａ）：
    の化合物である、請求項２４に記載のプロセスであって、式中、
    環ＡおよびＢは、以下：
    （ａ）５位と６位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
    （ｂ）５位と１０位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
    （ｃ）５位に、４位のメチル基に対してシスである水素；または
    （ｄ）５位に、４位のメチル基に対してトランスである水素
    のうちの１つを含み；
    環Ｄは、１２位と１４位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を含み；
    Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択され；
    Ｒ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択され；
    Ｒ３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニルおよびアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され；
    前記方法は、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３が、式（Ｉａ）の化合物に対して上で定義されたとおりである、式（ＩＩａ）：
    のケトン基質化合物を、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む、プロセス。
  26. 式（Ｉ）のアミン化合物が、式（Ｉｂ）：
    の化合物である、請求項２４に記載のプロセスであって、式中、
    環ＡおよびＢは、以下：
    （ａ）５位と６位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
    （ｂ）５位と１０位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
    （ｃ）５位に、４位のメチル基に対してシスである水素；または
    （ｄ）５位に、４位のメチル基に対してトランスである水素
    のうちの１つを含み；
    環Ｄは、１２位と１４位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合、または１２位と１４位との間に架橋シクロプロピルを含み；
    Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択され；
    Ｒ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択され；
    Ｒ３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニルおよびアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され；
    前記方法は、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３が、式（Ｉｂ）の化合物に対して上で定義されたとおりである、式（ＩＩｂ）：
    のケトン基質化合物を、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む、プロセス。
  27. 式（Ｉ）のアミン化合物が、式（Ｉｃ）：
    の化合物である、請求項２４に記載のプロセスであって、式中、
    環ＡおよびＢは、以下：
    （ａ）５位と６位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
    （ｂ）５位と１０位との間に、不飽和Ｃ−Ｃ結合；
    （ｃ）５位に、４位のメチル基に対してシスである水素；または
    （ｄ）５位に、４位のメチル基に対してトランスである水素
    のうちの１つを含み；
    環Ｄは、芳香族であり；
    Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、メチル、エチルおよびカルボニルから選択され；
    Ｒ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択され；
    Ｒ３は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニルおよびアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され；
    前記方法は、環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤならびにＲ１、Ｒ２およびＲ３が、式（Ｉｃ）の化合物に対して上で定義されたとおりである、式（ＩＩｃ）：
    のケトン基質化合物を、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む、プロセス。
  28. 式（Ｉ）のアミン化合物が、式（Ｉｄ）：
    の化合物である、請求項２４に記載のプロセスであって、式中、
    環Ａは、２位と３位との間または５位と６位との間に不飽和Ｃ−Ｃ結合を含み；
    Ｒ１およびＲ２は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）ジアルキルアミノ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、必要に応じて置換される（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるアミノカルボニル、アミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、必要に応じて置換されるシクロアルキル、必要に応じて置換されるヘテロシクロアルキル、必要に応じて置換されるアリール、必要に応じて置換されるヘテロアリール、必要に応じて置換されるアリールオキシ、必要に応じて置換されるアリールアミノ、必要に応じて置換されるアリールチオ、必要に応じて置換されるアリールスルホニル、必要に応じて置換されるアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるアリールカルボニルオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシ、必要に応じて置換されるヘテロアリールアミノ、必要に応じて置換されるヘテロアリールチオ、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルホニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールスルフィニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールオキシカルボニル、必要に応じて置換されるヘテロアリールカルボニルオキシ、アルキルアミノスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよびヘテロアリールスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立して選択され；
    Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、チオ、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ４）アルケニルおよび直鎖または分枝鎖の（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから独立して選択され；
    Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素、ハロ、ヒドロキシおよびメチルから独立して選択され；
    前記方法は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が、式（Ｉｄ）の化合物に対して上で定義されたとおりである、式（ＩＩｄ）：
    のケトン基質化合物を、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと、アミノドナーの存在下の好適な反応条件下において接触させる工程を含む、プロセス。
  29. 式（ＩＩ）の基質化合物が、約０．５〜約２００ｇ／Ｌ、１〜約２００ｇ／Ｌ、５〜約１５０ｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｇ／Ｌまたは約２０〜約１００ｇ／Ｌの負荷である、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載のプロセス。
  30. 式（ＩＩ）の基質化合物が、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌまたは２００ｇ／Ｌの負荷である、請求項２９に記載のプロセス。
  31. 前記アミノドナーが、イソプロピルアミン、Ｌ−リジン、α−フェネチルアミン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニンまたはＤ，Ｌ−アラニンまたはＤ，Ｌ−オルニチンからなる群より選択される、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載のプロセス。
  32. 前記アミノドナーが、イソプロピルアミン（ＩＰＭ）である、請求項３１に記載のプロセス。
  33. 前記イソプロピルアミンが、約０．１〜約３Ｍ、０．２〜約２．５Ｍ、約０．５〜約２Ｍまたは約１〜約２Ｍの濃度である、請求項３２に記載のプロセス。
  34. 前記イソプロピルアミンが、約０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍまたは３Ｍの濃度である、請求項３３に記載のプロセス。
  35. 前記好適な反応条件が、緩衝剤を含む、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載のプロセス。
  36. 前記緩衝剤が、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）およびＴｒｉｓから選択される、請求項３５に記載のプロセス。
  37. 前記緩衝剤が、ＴＥＡを含み、前記ＴＥＡの濃度は、約０．０１〜約０．４Ｍ、約０．０５〜約０．４Ｍ、約０．１〜約０．３Ｍまたは約０．１〜約０．２Ｍである、請求項３６に記載のプロセス。
  38. 前記ＴＥＡの濃度が、約０．０１Ｍ、０．０２Ｍ、０．０３Ｍ、０．０４Ｍ、０．０５Ｍ、０．０７Ｍ、０．１Ｍ、０．１２Ｍ、０．１４Ｍ、０．１６Ｍ、０．１８Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍまたは０．４Ｍである、請求項３７に記載のプロセス。
  39. 前記好適な反応条件が、約６〜約１２のｐＨ、約６〜約１０のｐＨ、約６〜約８のｐＨ、約７〜約１０のｐＨ、約７〜約９のｐＨまたは約７〜約８のｐＨを含む、請求項２４〜３８のいずれか１項に記載のプロセス。
  40. 前記好適な反応条件が、約６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０．１０．５、１１、１１．５または１２のｐＨを含む、請求項３９に記載のプロセス。
  41. 前記好適な反応条件が、約１０℃〜約７０℃、約１０℃〜約６５℃、約１５℃〜約６０℃、約２０℃〜約６０℃、約２０℃〜約５５℃、約３０℃〜約５５℃または約５０℃〜約６０℃の温度を含む、請求項２４〜４０のいずれか１項に記載のプロセス。
  42. 前記好適な反応条件が、少なくとも約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃または７０℃の温度を含む、請求項４１に記載のプロセス。
  43. 前記好適な反応条件が、ピリドキサール補助因子であるピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）を約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌまたは約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度で含む、請求項２４〜４２のいずれか１項に記載のプロセス。
  44. 前記好適な反応条件が、約０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／ＬのＰＬＰ濃度を含む、請求項４３に記載のプロセス。
  45. 前記好適な反応条件が、共溶媒を含む、請求項２４〜４４のいずれか１項に記載のプロセス。
  46. 前記共溶媒が、極性共溶媒を含む、請求項４５に記載のプロセス。
  47. 前記共溶媒が、ポリオール、ＤＭＳＯまたは低級アルコールから選択される、請求項４６に記載のプロセス。
  48. 前記共溶媒が、ＤＭＳＯである、請求項４７に記載のプロセス。
  49. 前記ＤＭＳＯが、約１％〜約４０％ｖ／ｖ；約２％〜約３０％ｖ／ｖ；または約５％〜約２５％ｖ／ｖの濃度で存在する、請求項４４に記載のプロセス。
  50. 前記ＤＭＳＯが、約１％ｖ／ｖ、２％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、１５％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ、２５％ｖ／ｖ、３０％ｖ／ｖ、３５％ｖ／ｖ、３５％ｖ／ｖまたは４０％ｖ／ｖの濃度で存在する、請求項４９に記載のプロセス。
  51. 前記トランスアミナーゼポリペプチドが、約０．０１〜約５０ｇ／Ｌ、約０．０５〜約５０ｇ／Ｌ、約０．１〜約４０ｇ／Ｌ、約１〜約４０ｇ／Ｌ、約２〜約４０ｇ／Ｌ、約５〜約４０ｇ／Ｌ、約５〜約３０ｇ／Ｌ、約０．１〜約１０ｇ／Ｌ、約０．５〜約１０ｇ／Ｌ、約１〜約１０ｇ／Ｌ、約０．１〜約５ｇ／Ｌ、約０．５〜約５ｇ／Ｌまたは約０．１〜約２ｇ／Ｌの濃度である、請求項２４〜５０に記載のプロセス。
  52. 前記トランスアミナーゼポリペプチドが、約０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌまたは５０ｇ／Ｌの濃度である、請求項５１に記載のプロセス。
  53. 前記好適な反応条件が、以下：
    （ａ）約５ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌの基質負荷；
    （ｂ）約０．１〜５０ｇ／Ｌの操作されたトランスアミナーゼポリペプチド；
    （ｃ）約０．１〜４Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；
    （ｄ）約０．１〜１０ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）補助因子；
    （ｅ）約６〜９のｐＨ；および
    （ｆ）約３０〜６５℃の温度
    を含む、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載のプロセス。
  54. 前記好適な反応条件が、以下：
    （ａ）約１０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌの基質負荷；
    （ｂ）約０．５〜２０ｇ／Ｌの操作されたトランスアミナーゼポリペプチド；
    （ｃ）約０．１〜３Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；
    （ｄ）約０．１〜１０ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）補助因子；
    （ｅ）約０．０５〜０．２０Ｍのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）緩衝液；
    （ｆ）約１％〜約４５％のＤＭＳＯ；
    （ｇ）約６〜９のｐＨ；および
    （ｈ）約３０〜６５℃の温度
    を含む、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載のプロセス。
  55. 前記好適な反応条件が、以下：
    （ａ）約２０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの基質負荷；
    （ｂ）約１〜５ｇ／Ｌの操作されたトランスアミナーゼポリペプチド；
    （ｃ）約０．５〜２Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；
    （ｄ）約０．２〜２ｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）補助因子；
    （ｅ）約０．１ＭのＴＥＡ緩衝液；
    （ｆ）約２５％のＤＭＳＯ；
    （ｅ）約８のｐＨ；および
    （ｆ）約４５〜６０℃の温度
    を含む、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載のプロセス。
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