JP2016500007A - ブタインフルエンザヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ変異体 - Google Patents
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Abstract
インフルエンザヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ変異体を含む、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、方法、組成物、並びにワクチンが提供される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2012年11月16日に提出された米国特許出願第61/727,213号明細書に対する優先権を請求する。この仮出願の開示内容は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
本出願は、2012年11月16日に提出された米国特許出願第61/727,213号明細書に対する優先権を請求する。この仮出願の開示内容は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
ブタ由来のH1N1インフルエンザウイルスにより引き起こされた2009年インフルエンザ・パンデミックは、215の国々に広がり、検査確認された18,000人の死亡の原因となった(Garten et al.,2009,Science 325:197-201,31)。こうしたパンデミックの事象には、迅速なワクチンの製造が不可欠である。しかし、インフルエンザワクチンウイルス生産用の基質である孵化鶏卵におけるヒトインフルエンザウイルスの増殖は、一般的に、トリ受容体よりヒト受容体と結合するウイルスの優先性により阻害される。従って、通常、卵におけるワクチンウイルスの増殖を改善するために卵馴化が必要である(Gambaryan et al.,1989 p.175-218.In R.Krug(ed.),The Influenza Viruses.Plenum Press,New York;Robertson 1993 Reviews in Med.Virol.3:97-106;Robertson et al.,1987 Virol.160:31-37;Rogers et al.,1983 Nature 304:76-78)。2009年4月のH1N1パンデミックの発生時に、H1N1pdmワクチンの開発は、卵でのこのような貧弱なウイルス増殖によって阻害された(Robertson et al.,2011 Vaccine 29:1836-1843)。
ブタ由来のH1N1インフルエンザウイルスに対する生きた弱毒化インフルエンザウイルスワクチン(LAIV)を製造するために、HAタンパク質の3つの残基(K119E、A186D、D222G、全てH1番号付与)が置換された。これらの置換により、LAIVが得られ、これは、米国で市販される最初のH1N1pdmワクチンであった。LAIVは、2003年から米国で実施許諾を取得し、韓国及びカナダなどの他の国でも承認された(Ambrose et al.,2008 Influenza Other Respi Viruses 2:193-202)。各LAIVウイルスは、6:2再集合体であり、これは、温度感受性(ts)、低温適応(ca)及び弱毒化(att)表現型を付与するマスターウイルス由来の6つの内部タンパク質遺伝子セグメントと、野生型ウイルス由来の抗原性ヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)表面糖タンパク質セグメントとを含む(Murphy et al.,2002 Viral Immunol 15:295-323)。
2009年以後、A/California/7/2009(CA/09)様H1N1pdmウイルスが流行し、年1回のインフルエンザワクチンに存在するH1N1株として季節性H1N1ウイルスに代わって用いられている。現時点で流行しているH1N1ウイルスは、抗原がCA/09に類似しているが、新規のH1N1pdm株の間に、CA/09遺伝的多様性及びCA/09内亜群が確認されている(CDC communication)。さらに、動物モデルから得られたデータは、配列変異又は他のインフルエンザウイルスとの再集合によって、毒性がより高いH1N1pdmの出現が可能であることを明らかにした(Ilyshina et al.,2010 mBio 1:e00249-10;Schrauwen et al.,2011 Emerging Infectious Diseases 17;Ye et al.,2010 PLoS Pathog.6:e1001145)。従って、卵での高収率ウイルスの迅速な産生を促進することができるH1N1pdmウイルスにおける遺伝子シグネチャーをみいだすことが重要である。
インフルエンザHA表面タンパク質同様、NA表面糖タンパク質もウイルス複製に重要な役割を果たす。HAは、細胞表面上のシアル酸受容体に結合して、ウイルス付着及びウイルス侵入時の膜融合を媒介する(Skehel et al.,2000 Annu Rev Biochem.69:531-569)。NAは、細胞表面上の末端シアル酸の除去を触媒することにより、新たに集合したウイルスは感染細胞から放出され、拡散することができる(Colman et al.,1989 p.175-218.In R.Krug(ed.),The Influenza Viruses.Plenum Press,New York)。HA及びNAタンパク質はいずれもシアロシドを認識するが、相殺機能を有する。ゆえに、効率的なウイルス複製のためには、HAの受容体結合と、NAの受容体破壊特性との機能的均衡が重要である(Mitnaul et al.,2000 J Virol.74:6015-6020;Wagner et al.,2002 Rev.Med.Virol.12:159-166)。例えば、卵及びMDCK細胞におけるインフルエンザA/Fujian/411/2002(H3N2)の複製は、HAの受容体結合能力を増大するように2つのHA残基を置換するか、又はNAの酵素活性を低減するように2つのNA残基を置換するかのいずれかによって、改善できることがわかっている(Lu et al.,2005 J.Virol.79:6763-6771)。さらに、HA−NA均衡及びNA活性は、H1N1pdmウイルスの感染力に影響をもたらすことも報告されている(Lakdawala et al.,2011 PLoS Pathog.7:e1002443;Yen et al.,2011 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108:14264-14269)。グリカン結合及びNA活性アッセイを用いた、Xuらの報告は、HA及びNA活性の機能的均衡が、H1N1pdmウイルスの出現にとって重要であることを明らかにしている(Xu et al.,2012 Functional Balance of the Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Accompanies the Emergence of the 2009 H1N1 Influenza Pandemic.J.Virol.86:17 9221-9232;Epub ahead of print 20 June 2012 doi:10.1128/JVI.00697-12)。
Garten et al.,2009,Science 325:197-201,31
Gambaryan et al.,1989 p.175-218.In R.Krug(ed.),The Influenza Viruses.Plenum Press,New York
Robertson 1993 Reviews in Med.Virol.3:97-106
Robertson et al.,1987 Virol.160:31-37
Rogers et al.,1983 Nature 304:76-78
Robertson et al.,2011 Vaccine 29:1836-1843
Ambrose et al.,2008 Influenza Other Respi Viruses 2:193-202
Murphy et al.,2002 Viral Immunol 15:295-323
Ilyshina et al.,2010 mBio 1:e00249-10;
Schrauwen et al.,2011 Emerging Infectious Diseases 17
Ye et al.,2010 PLoS Pathog.6:e1001145
Skehel et al.,2000 Annu Rev Biochem.69:531-569
Colman et al.,1989 p.175-218.In R.Krug(ed.),The Influenza Viruses.Plenum Press,New York
Mitnaul et al.,2000 J Virol.74:6015-6020
Wagner et al.,2002 Rev.Med.Virol.12:159-166
Lu et al.,2005 J.Virol.79:6763-6771
Lakdawala et al.,2011 PLoS Pathog.7:e1002443;
Yen et al.,2011 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108:14264-14269
Xu et al.,2012 Functional Balance of the Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Accompanies the Emergence of the 2009 H1N1 Influenza Pandemic.J.Virol.86:17 9221-9232;
Epub ahead of print 20 June 2012 doi:10.1128/JVI.00697-12
本開示は、卵でのワクチンウイルスの増殖を改善する、H1N1ウイルスのHA及びNAの両方に、別の重要な残基を提供する。具体的には、本開示は、ウイルスの複製を改善する、HA球状頭部及びNA残基に複数の酸性残基を提供する。これらのアミノ酸置換は、ウイルスの抗原性に影響を与えないため、ワクチン製造に好適である。インフルエンザHA及びNAポリペプチドにおけるこうしたアミノ酸残基の同定は、将来の変異型H1N1pdm様ウイルスに対する高収率の再集合体ワクチンウイルスの産生において、ワクチン製造者に役立つに違いない。数々の他の恩恵はこの開示を見ることによって明らかとなろう。
本開示は、ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第1ゲノムセグメントを含む再集合インフルエンザウイルスを提供し、上記ヘマグルチニンポリペプチドは、配列番号1、配列番号3、又は配列番号4に示すアミノ酸配列を含む。
本開示はまた、アミノ酸残基125位、127位、及び209位(H1番号付与)に対応する1個又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基を、非天然アミノ酸残基に改変することにより、孵化卵におけるインフルエンザAウイルスの複製能力を増大する方法も提供する。
本開示はさらに、アミノ酸残基222位、241位、及び369位(N1番号付与)に対応する1個又は複数のノイラミニダーゼアミノ酸残基を、非天然アミノ酸残基に改変することにより、孵化卵におけるインフルエンザAウイルスの複製能力を増大する方法も提供する。
さらには、本開示は、単離ヘマグルチニンポリペプチド及び単離ノイラミニダーゼポリペプチドを提供する。単離ヘマグルチニンポリペプチドは、配列番号1、配列番号3、又は配列番号4に示すアミノ酸配列を含んでもよい。単離ノイラミニダーゼポリペプチドは、配列番号5、配列番号7、又は配列番号8に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
本明細書に明示及び記載する具体的実施内容は、例であり、本出願の範囲を何ら限定する意図はないことを理解すべきである。また、本明細書に記載の実施形態及び特徴の各々をあらゆる方法で組み合わせ得ることも理解すべきである。
本明細書で言及した公開特許、特許出願、ウェブサイト、会社名、及び科学文献は、各々が、参照により組み込まれていることが具体的かつ個別に示されているのと同じ範囲まで、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。本明細書に引用するいずれかの参照文献と本明細書の具体的教示内容の間に矛盾がある場合、これは、後者を優先して解決されるものとする。同様に、当分野で理解されている単語又はフレーズの定義と、本明細書に具体的に教示される単語又はフレーズの定義との間に矛盾がある場合にも、後者を優先して解決されるものとする。
本明細書で使用される場合、単数形「1つ(a)」、「1つ(an)」及び「その(the)」は、内容が明らかに別のことを指示していない限り、それらが指す用語の複数形も明確に包含する。
本明細書で使用される技術及び科学用語は、別に定義されない限り、本出願が関する分野の技術者により一般に理解される意味を有する。本明細書では、当業者には公知の様々な方法及び材料を参照にする。組換えDNA技術の一般的原理を記載する標準参照文献を以下に挙げる:Sambrook et al.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1989);Kaufman et al.,Eds.,“Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine,”CRC Press,Boca Raton(1995);及びMcPherson,Ed.,“Directed Mutagenesis:A Practical Approach,”IRL Press,Oxford(1991)。尚、これらの各々の開示内容は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
再集合体インフルエンザウイルス
一般に、インフルエンザウイルスは、天然に存在するもの、又は人による操作で産生されるもののいずれであろうと、セグメント化された一本鎖RNAゲノムを含む内部リボ核タンパク質コア及びマトリックスタンパク質によって覆われる外側リポタンパク質エンベロープから構成される。インフルエンザウイルスのゲノムは、免疫原生表面ヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)タンパク質をコードする線状(−)鎖リボ核酸(RNA)の8つのセグメントと、6つの内部コアポリペプチド:ヌクレオキャプシド核タンパク質(NP);マトリックスタンパク質(M);非構造タンパク質(NS);及び3つのRNAポリメラーゼ(PA、PB1、PB2)タンパク質から構成される。複製中、ゲノムウイルスRNAは、宿主細胞の核内の(+)鎖メッセンジャーRNA及び(−)鎖ゲノムcRNAに転写される。8つのゲノムセグメントの各々は、RNA以外にNP及びポリメラーゼ複合体(PB1、PB2及びPA)を含むリボ核タンパク質複合体にパッケージングされる。
一般に、インフルエンザウイルスは、天然に存在するもの、又は人による操作で産生されるもののいずれであろうと、セグメント化された一本鎖RNAゲノムを含む内部リボ核タンパク質コア及びマトリックスタンパク質によって覆われる外側リポタンパク質エンベロープから構成される。インフルエンザウイルスのゲノムは、免疫原生表面ヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)タンパク質をコードする線状(−)鎖リボ核酸(RNA)の8つのセグメントと、6つの内部コアポリペプチド:ヌクレオキャプシド核タンパク質(NP);マトリックスタンパク質(M);非構造タンパク質(NS);及び3つのRNAポリメラーゼ(PA、PB1、PB2)タンパク質から構成される。複製中、ゲノムウイルスRNAは、宿主細胞の核内の(+)鎖メッセンジャーRNA及び(−)鎖ゲノムcRNAに転写される。8つのゲノムセグメントの各々は、RNA以外にNP及びポリメラーゼ複合体(PB1、PB2及びPA)を含むリボ核タンパク質複合体にパッケージングされる。
A型及びB型インフルエンザは、典型的には、ヒト集団におけるインフルエンザの大流行を伴う。しかし、A型インフルエンザは、例えば、トリ、ブタ、及び他の動物などの他の種にも感染する。A型ウイルスは、そのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ表面糖タンパク質抗原内の相違に基づきサブタイプに分類される。A型ウイルスのヘマグルチニンは、16の既知サブタイプを有し、ノイラミニダーゼは、9つの既知サブタイプを有する。ヒトの場合、現時点で約4つの異なるヘマグルチニンと、2つの異なるノイラミニダーゼサブタイプ、例えば、H1、H2、H3、H5、N1、及びN2がわかっている。特に、インフルエンザAの2つの主要なサブタイプ、すなわちH1N1及びH3N2は、ヒトにおいて活性である。しかし、H1N2も近年懸念されてきている。インフルエンザBウイルスは、そのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼタンパク質に基づくサブタイプに区分されない。
再集合体インフルエンザは、典型的に、2つ以上の親ウイルス株又は供給源の遺伝子及び/又はポリペプチド成分を含むウイルスである。例えば、7:1再集合体インフルエンザウイルスは、第1親ウイルス由来の7つのウイルスゲノムセグメント(又は遺伝子セグメント)と、例えば、本明細書に記載するヘマグルチニン又はノイラミニダーゼをコードする単一相補的ウイルスゲノムセグメントとを含む。6:2再集合体は、6つのゲノムセグメント、最も一般的には第1親ウイルス由来の6つのウイルスゲノムセグメントと、1つ又は複数の異なる親ウイルスに由来する2つの相補的ウイルスゲノムセグメント、例えば、ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼゲノムセグメントとを含む。6:2再集合体が、第1の親ウイルスに由来する6つのウイルスゲノム、すなわち6つの内部ゲノムセグメントと、2つ以上の異なる親ウイルスに由来するヘマグルチニン及びノイラミニダーゼゲノムセグメントとを含む場合、これは、6:1:1再集合体ウイルスと称することもある。また、再集合体ウイルスは、本明細書に記載する状況に応じて、「キメラ」と呼ぶこともできる。
再集合体インフルエンザウイルスが、組換えインフルエンザウイルスである場合、これは、例えば、遺伝子クローン化操作及びリバースジェネティクス(reverse genetics)を用いて、人の介入により人工的又は合成的に(非天然に)改変されていてもよい。インフルエンザウイルスは、組換え核酸の発現により産生されるとき、組換え体であってもよい。
再集合体インフルエンザウイルスは、配列番号1のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有してもよい。ゲノムセグメントが、配列番号1のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードする場合、これは、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸残基、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有し得る。
再集合体インフルエンザウイルスは、配列番号3のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有してもよい。ゲノムセグメントが、配列番号3のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードする場合、これは、アミノ酸残基124位のロイシン、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基124位のロイシン、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有し得る。
再集合体インフルエンザウイルスは、配列番号4のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有してもよい。ゲノムセグメントが、配列番号4のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードする場合、これは、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有し得る。
再集合体インフルエンザウイルスが、配列番号1のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有する場合、これは、7:1再集合体インフルエンザウイルス、6:1:1再集合体インフルエンザウイルス又は6:2再集合体インフルエンザウイルスであってよい。これが、6:2再集合体インフルエンザウイルスである場合、再集合体インフルエンザウイルスは、配列番号5のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントをさらに有し得る。
再集合体インフルエンザウイルスが、配列番号3のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有する場合、これは、7:1再集合体インフルエンザウイルス、6:1:1再集合体インフルエンザウイルス又は6:2再集合体インフルエンザウイルスであってよい。これが、6:2再集合体インフルエンザウイルスである場合、再集合体インフルエンザウイルスは、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントをさらに有し得る。再集合体インフルエンザウイルスが、配列番号3のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントと、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントとを有する場合、配列番号3のアミノ酸配列は、アミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸とを有し得るか、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸とを有し得るか、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有し得る。
再集合体インフルエンザウイルスが、配列番号4のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有する場合、これは、7:1再集合体インフルエンザウイルス、6:1:1再集合体インフルエンザウイルス又は6:2再集合体インフルエンザウイルスであってよい。これが、6:2再集合体インフルエンザウイルスである場合、再集合体インフルエンザウイルスは、配列番号8のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントをさらに有し得る。ゲノムセグメントが、配列番号8のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードする場合、アミノ酸残基222位は、アスパラギンであるか、又はアミノ酸残基241位はバリンであるか、又はアミノ酸残基369位はアスパラギンであるか、又はアミノ酸残基222位がアスパラギンであり、かつアミノ酸残基369位がアスパラギンであるか、又はアミノ酸残基241位がバリンであり、かつアミノ酸残基369位がアスパラギンであるか、又はアミノ酸残基222位がアスパラギンであり、アミノ酸残基241位がバリンであり、かつアミノ酸残基369位がアスパラギンであり得る。配列番号4のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントを有する再集合体インフルエンザウイルスが、6:1:1再集合体インフルエンザウイルスである場合、これは、配列番号5又は配列番号7のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントをさらに有し得る。
再集合体インフルエンザウイルスが、6:2再集合体インフルエンザウイルスであり、ヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントが、配列番号4のアミノ酸配列を含み、かつノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントが、配列番号8に示すアミノ酸配列を含む場合、ヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントは、配列番号4を含み得るが、ここで、アミノ酸残基125位はアスパラギン酸であり、アミノ酸残基127位はグルタミン酸であり、配列番号8のノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントは、アミノ酸222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン及びアミノ酸残基369位のアスパラギンを含む。あるいは、ヘマグルチニンポリペプチドをコードするゲノムセグメントは、配列番号4を含み得るが、ここで、アミノ酸残基125位はアスパラギン酸であり、かつアミノ酸残基127位はグルタミン酸であり、また、配列番号8のノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントは、アミノ酸残基369位のアスパラギンを含み得る。
例えば、7:1、6:2、6:1:1などの再集合体インフルエンザウイルスのいずれにおいても、6つの内部ゲノムセグメントは、ドナーウイルスなどのいずれか1つ又は複数のウイルスであってよい。ドナーウイルスは、当業者には一般に理解されている。ドナーウイルスの例として、A/Ann Arbor/6/60又はB/Ann Arbor/1/66、A/Puerto Rico/8/34、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55、又はB/England/2608/76が挙げられる。6つの内部ゲノムセグメントが、単一のドナーウイルス由来のものである場合、ドナーウイルスは、A/Ann Arbor/6/60又はB/Ann Arbor/1/66、A/Puerto Rico/8/34、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55、又はB/England/2608/76であってよい。
再集合体ウイルスのいずれも免疫原性組成物の形態にすることができる。免疫原性組成物は、抗原、すなわち配列番号1、配列番号3、若しくは配列番号4に示すアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むヘマグルチニンポリペプチドを含むインフルエンザウイルス、又は配列番号5、配列番号7、若しくは配列番号8に示すアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含むインフルエンザウイルスに対する個体の免疫応答を増大することができる組成物であってよい。免疫原性は、例えば、中和分泌抗体及び/又は血清抗体のレベル若しくは量を測定することにより、モニターすることができる。免疫原性組成物は、防御免疫応答を誘発する能力を有し得る。免疫原性組成物が、防御免疫応答を誘発する場合、該組成物は、配列番号1、配列番号3、若しくは配列番号4に示すアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むヘマグルチニンポリペプチドを含む野生型インフルエンザウイルス、又は配列番号5、配列番号7、若しくは配列番号8に示すアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含むインフルエンザウイルスへの感染によって引き起こされる症状を予防又は軽減し得る。
免疫原性組成物中の再集合体インフルエンザウイルスは、不活性化してもよい。例えば、ホルムアルデヒド及び/又はb−プロピオラクトンの使用により、インフルエンザウイルスを不活性化することができる。あるいは、免疫原性組成物中の再集合体インフルエンザウイルスを生弱毒化してもよい。このような生弱毒化再集合体インフルエンザウイルスは、例えば、低温適応、弱毒化、又は温度感受性などの特徴を呈示する。ウイルスに用いられる「温度感受性」、「低温適応」及び「弱毒化」という用語は、当分野において公知である。例えば、用語「温度感受性」(ts)は、例えば、インフルエンザA株の場合、ウイルスが、33℃と比較して39℃で100倍以上の力価の減少を示すこと、又はインフルエンザB株の場合、ウイルスが、33℃と比較して37℃で100倍以上の力価の減少を示すことを意味する。「低温適応」(ca)という用語は、ウイルスが、25℃で、33℃での増殖の100倍以内の増殖を示すことを意味し、また、「弱毒化」(att)という用語は、フェレットの上気道内でウイルスは複製するが、その肺組織内では検出限界以下であり、しかも、当該動物においてインフルエンザ様疾患を引き起こさないことを意味する。また、中間表現型を有するウイルス、すなわち、33℃での増殖と比較し、39℃(A株ウイルスの場合)若しくは37℃(B株ウイルスの場合)で100倍未満の力価減少を示すか、又は25℃で100倍超(例えば、200倍、500倍、1000倍、10,000倍以内)の増殖を示すウイルス、並びに/又はフェレットの上気道中での増殖と比較し、低減した肺での増殖(すなわち部分的弱毒)及び/若しくは当該動物において軽減されたインフルエンザ様疾患を示すウイルスも、本明細書に記載するHA及びNA配列と共に6:2又は6:1:1又は7:1再集合体インフルエンザウイルスを調製するのに好適であることが理解されよう。
ワクチン
インフルエンザワクチンの一例としてFLUMIST(MedImmune,LLC)があり、これは、小児及び成人をインフルエンザ疾患から防御する弱毒化生ワクチンである(Belshe et al.1998 N Engl J Med 338:1405−12;Nichol et al.1999 JAMA 282:137−44)。
インフルエンザワクチンの一例としてFLUMIST(MedImmune,LLC)があり、これは、小児及び成人をインフルエンザ疾患から防御する弱毒化生ワクチンである(Belshe et al.1998 N Engl J Med 338:1405−12;Nichol et al.1999 JAMA 282:137−44)。
FLUMISTワクチン株は、例えば、共通のマスタードナーウイルス(MDV)由来の6つの遺伝子セグメント、PB1、PB2、PA、NP、M及びNSと一緒に、ワクチンが対象とする野生型株(又は場合によっては、関連株)に由来するHA及びNA遺伝子セグメントを含有する。このように、本明細書に記載のHA及びNA配列は、様々なFLUMIST製剤に含有させることができる。FLUMISTのインフルエンザA株用のMDV(MDV−A)は、連続的に温度を低くしながら、一次ニワトリ腎組織培養物中での野生型A/Ann Arbor/6/60(A/AA/6/60)株の連続継代により作出された(Maassab 1967 Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213:612−4)。MDV−Aは、25℃で効率的に複製する(ca、低温適応)が、その増殖は、38及び39℃に限定される(ts、温度感受性)。さらに、このウイルスは、感染フェレットの肺では複製しない(att、弱毒化)。ts表現型は、その複製を気道の最も低温領域以外の領域に限定することにより、ヒトにおけるワクチンの弱毒化に寄与すると考えられる。
ワクチンの他の例として、不活性化ワクチンFLUZONE(登録商標)(Sanofi Pasteur)、FLUVIRIN(Novartis Vaccines)、FLUARIX(登録商標)(GlaxoSmithKline)、FLULAVAL(ID Biomedical Corporation of Quebec)、AFLURIA(登録商標)(CLS Biotherapies)が挙げられる。これらのワクチンは、本明細書に開示するものなどのHA及びNA配列を含むインフルエンザウイルスと、第2の(例えば、PR8)インフルエンザウイルスの6つの内部ゲノムセグメントとから製造される。不活性化インフルエンザワクチンは、スプリット又は全ウイルス形態のいずれでもよい。典型的に、不活性化インフルエンザワクチンは、スプリットウイルス形態である。
ワクチンは、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を増大するための1種又は複数のアジュバントを含有するように製剤化してもよい。好適なアジュバントとしては、以下:完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リソレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油又は炭化水素乳剤、カルメット・ゲラン桿菌(BCG)、コリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)、及び合成アジュバントQS−21、AS03、及びMF59が挙げられる。
また、ワクチンは1種又は複数の免疫刺激分子と一緒に製剤化するか、あるいはこれらと一緒に送達してもよい。免疫刺激分子としては、免疫刺激、免疫増強、及び炎症誘発活性を有する各種サイトカイン、リンホカイン及びケモカイン、例えば、インターロイキン(例:IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−12、IL−13);増殖因子(例:顆粒球(GM)−コロニー刺激因子(CSF));並びにその他の免疫刺激分子、例えば、マクロファージ炎症因子、Flt3リガンド、B7.1;B7.2などが挙げられる。
本明細書に記載する組換え及び再集合体ウイルス、免疫原性組成物、及びワクチンは、免疫学的に有効な量で、かつ適切な担体若しくは賦形剤を用いて予防的に投与することにより、HA及び/又はNA配列により決定される1つ又は複数のインフルエンザウイルス株に特異的な免疫応答を刺激することができる。典型的に、適切な担体若しくは賦形剤は、滅菌水、食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、非感染鶏卵からの尿膜液(すなわち、正常尿膜液又はNAF)、又はこれらの組み合わせなどの、薬学的に許容される担体若しくは賦形剤である。滅菌性、pH、等張性、及び安定性を確実にするこのような溶液の調製は、当分野で確立されたプロトコルに従って実施する。一般に、担体又は賦形剤は、アレルギー及びその他の不要な作用を最小限にし、かつ、例えば、皮下、筋内、鼻内などの具体的投与経路に適合するように選択する。
免疫学的に有効な量の組換え及び再集合体ウイルス、免疫原性組成物、又はワクチンの投与は、1つ又は複数のインフルエンザウイルス株に特異的な(すなわち、本明細書に記載のHA及び/又はNAインフルエンザ抗原に対して)免疫応答を刺激するのに十分な量でなければならない。1つ又は複数のインフルエンザ株に対する防御的免疫応答を誘発するための投薬量及び方法は、当業者には公知である。例えば、米国特許(USPN)第5,922,326号明細書;Wright et al.,1982 Infect.Immun.37:397−400;Kim et al.,1973 Pediatrics 52:56−63;及びWright et al.,1976 J.Pediatr.88:931−936を参照されたい。例えば、インフルエンザウイルスは、投与される用量当たり約1〜1000HID50(ヒト感染量)、すなわち105〜108pfu(プラーク形成単位)の範囲で提供される。典型的に、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食事、投与時間、及びその他の臨床的要因に基づき、上記の範囲内で用量を調節する。ワクチン製剤は、例えば、針及び注射器、又は無針注射器を用いた皮下若しくは筋内注射により、全身投与することができる。あるいは、ワクチン製剤は、点鼻薬、大粒子エアロゾル(約10μ超)、又は上気道への噴霧のいずれかにより、鼻内投与してもよい。鼻内投与の場合、弱毒化生ウイルスワクチンが往々にして好ましく、例えば、弱毒化、低温適応及び/又は温度感受性組換え体若しくは再集合体インフルエンザウイルスがある。前掲参照。単回用量による防御免疫応答の刺激が好ましいが、要望される予防効果を達成するために、同じ又は異なる経路により、追加用量を投与することができる。
単回用量による防御免疫応答の刺激が好ましいが、要望される予防効果を達成するために、同じ又は異なる経路により、追加用量を投与することができる。例えば、新生児及び乳児の場合には、十分な免疫レベルを誘発するために複数回の投与を必要とし得る。野生型インフルエンザ感染に対する十分なレベルの防御を維持するために必要に応じて、小児期を通じ、間隔を置いて投与を継続することができる。同様に、例えば、医療従事者、デイケア従事者、幼児の家族、高齢者、及び心肺機能が損傷した個体のような、繰り返すインフルエンザ感染又は重度のインフルエンザ感染に特に罹患しやすい成人も、防御免疫応答を確立及び/又は維持するために複数回の免疫が必要となり得る。誘発される免疫のレベルは、例えば、分泌及び血清抗体を中和する量、及び要望される防御レベルを誘発及び維持する上で必要に応じて調節される用量又は反復されるワクチン接種量を測定することにより、モニターすることができる。
ワクチンは、配列番号1、配列番号3、若しくは配列番号4のアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むヘマグルチニンポリペプチド及び/又は配列番号5、配列番号7、若しくは配列番号8のアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含むインフルエンザウイルスに加えて、2種以上の組換え及び/又は再集合体インフルエンザウイルス、すなわち、インフルエンザウイルスを含み得る。ワクチンは、H3 HA抗原を有する組換えインフルエンザAウイルスと、山形(Yamagata)又はビクトリア(Victoria)株HA抗原のいずれかを有する組換えインフルエンザBとをさらに含む三価ワクチンであってもよい。ワクチンは、四価ワクチンであってもよい。ワクチンが四価ワクチンである場合、これは、HA3 HA抗原を有する組換えインフルエンザAウイルス、山形(Yamagata)株HA抗原を有する組換えインフルエンザBウイルス、及びビクトリア(Victoria)株HA抗原を有する組換えインフルエンザBウイルスをさらに含み得る。
インフルエンザウイルスを作製する方法
組換え又は再集合体インフルエンザウイルスは、当分野では公知の複数の方法により容易に取得することができる。一方法では、1つ又は複数のベクターを、インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に導入する。1つ又は複数のベクターは、第1インフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントと、配列番号1又は配列番号3、又は配列番号4のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する第1ゲノムセグメントとに対応するヌクレオチド配列を含む。
組換え又は再集合体インフルエンザウイルスは、当分野では公知の複数の方法により容易に取得することができる。一方法では、1つ又は複数のベクターを、インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に導入する。1つ又は複数のベクターは、第1インフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントと、配列番号1又は配列番号3、又は配列番号4のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する第1ゲノムセグメントとに対応するヌクレオチド配列を含む。
第1ゲノムセグメントが、配列番号1のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する場合、これは、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸残基、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有し得る。さらに、ノイラミニダーゼポリペプチドを産生する第2ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列を導入してもよい。第2ゲノムセグメントは、配列番号5のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生しうる。
第1ゲノムセグメントが、配列番号3のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する場合、これは、アミノ酸残基124位のロイシン、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基124位のロイシン、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有し得る。さらに、ノイラミニダーゼポリペプチドを産生する第2ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列を導入してもよい。第2ゲノムセグメントは、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生しうる。
第1ゲノムセグメントが、配列番号4のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する場合、これは、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸残基、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有し得る。さらに、ノイラミニダーゼポリペプチドを産生する第2ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列を導入してもよい。第2ゲノムセグメントは、配列番号5、又は配列番号7、又は配列番号8のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生しうる。第2ゲノムセグメントが、配列番号8のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生する場合、アミノ酸残基222位は、アスパラギンであるか、又はアミノ酸残基241位はバリンであるか、又はアミノ酸残基369位はアスパラギンであるか、又はアミノ酸残基222がアスパラギンであり、かつアミノ酸残基369位がアスパラギンであるか、又はアミノ酸残基241がバリンであり、かつアミノ酸残基369位がアスパラギンであるか、又はアミノ酸残基222がアスパラギンであり、アミノ酸残基241位がバリンであり、かつアミノ酸残基369位がアスパラギンであってよい。
第1インフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列は、インフルエンザワクチンへの添加、又は科学的研究、又は開発目的のために有用な特性を提供する任意のインフルエンザ株のものであってよい。第1インフルエンザ株の望ましい特徴は、弱毒化病原性又は表現型、低温適応、温度感受性であってよい。第1インフルエンザ株の例として、A/Ann Arbor/6/60又はB/Ann Arbor/1/66、A/Puerto Rico/8/34、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55、又はB/England/2608/76が挙げられる。
インフルエンザウイルス産生のためのベクターは、例えば、細菌及び真核生物細胞中で機能的な1つ又は複数の複製起点、並びに任意選択で、プラスミド配列を含む細胞をスクリーニング若しくは選択するのに好都合なマーカを賦与するプラスミドベクターであってもよい。例えば、Neumann et al.,1999,PNAS.USA 96:9345−9350を参照されたい。
ベクターは、いずれの方向でも挿入cDNAからのウイルスゲノムセグメントの転写を開始することができる、すなわち、(+)鎖及び(−)鎖ウイルスRNA分子の両方を生成することができる二方向性発現ベクターであってもよい。二方向転写を実施するために、ウイルスゲノムセグメントの各々を、少なくとも2つの独立したプロモータを有する発現ベクターに挿入して、一本の鎖から、第1RNAポリメラーゼプロモータ(例えば、RNA pol Iプロモータ)によりウイルスゲノムRNAのコピーが転写され、第2RNAポリメラーゼプロモータ(例えば、RNA pol IIプロモータ)からウイルスmRNAが合成されるようにすることができる。従って、2つのプロモータは、少なくとも1つのクローン化部位(すなわち、制限酵素認識配列)、好ましくは、ウイルスゲノムRNAセグメントの挿入に好適な唯一のクローン化部位とフランキングして、反対配向に配列することができる。あるいは、(+)鎖mRNA及び(−)鎖ウイルスRNA(cRNAとして)が、ベクターの同じ鎖から転写される「アンビセンス」発現ベクターを使用することもできる。
これ以外に、ベクターは、一方向発現ベクターであってもよく、この場合、ウイルスcDNAをpol Iプロモータと終結配列(内部転写単位)との間に挿入する。この内部転写単位は、RNAポリメラーゼII(pol II)プロモータとポリアデニル化部位(外部転写単位)によりフランキングされている。一方向系では、pol I及びpol IIプロモータは、cDNAの上流にあり、プラス鎖キャップなしcRNA(pol Iプロモータから)及びプラス鎖キャップ付きmRNA(pol IIプロモータからを産生する。例えば、Hoffmann及びWebster,2000,J.Gen.Virol.81:2843−2847を参照。
他の系では、pol I及びpol IIプロモータにより転写されるウイルス配列を様々な発現ベクターから転写することができる。これらの実施形態では、pol Iプロモータの制御下でウイルスゲノムセグメントの各々をコードするベクター(「vRNA発現ベクター)及びpol IIプロモータの制御下で1つ又は複数のウイルスポリペプチド、例えば、インフルエンザPA、PB1、PB2、及びNPポリペプチドをコードするベクター(「タンパク質発現ベクター」)を用いることができる。
ヌクレオチド配列を含む1つ又は複数のベクターの導入は、当分野において公知の任意の方法又は技術により実施してよい。例えば、ベクターは、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、及びパーティクル・ガン送達により導入することができる。また、例えば、以下も参照されたい:Loeffler and Behr,1993,Meth.Enzymol.217:599−618;Cohen et al.,1993,Meth.Enzymol.217:618−644;Clin.Pharma.Ther.29:69−92(1985),Sambrook,et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989 and Ausubel et al.ed.Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,N.Y.,N.Y.(1987−2001)。
ヌクレオチド配列を含む1つ又は複数のベクターの導入は、脂質又はリポソームを使用して実施してもよい。脂質又はリポソームは、DNA若しくはRNAに結合して、疎水性被覆送達ビヒクルを提供する脂肪粒子若しくは脂質の混合物を含む。好適なリポソームは、卵などの天然の供給源、植物又は動物源由来のリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン若しくはホスファチジルイノシトールなどの従来の合成又は天然リン脂質リポソーム材料のいずれを含んでもよい。また、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジコリン、並びに対応する合成ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルグリセロールなどの合成リン脂質を用いてもよい。また、ベクターと結合させることができる脂質又はリポソームは、市販のものも当業者には入手可能である。当業者には公知の市販されている脂質又はリポソームトランスフェクション試薬の例としては、LIPOFECTAMINE(Invitrogen)、GENEJUICE(Novagen)、GENEJAMMER(登録商標)(Stratagene)、FUGENE HD(Roche)、MEGAFECTIN(Qbiogene)、SUPERFECT(Qiagen)、及びEFFECTENE(Qiagen)が挙げられる。
さらに、ヌクレオチド配列を含む1つ又は複数のベクターの導入は、圧縮ポリヌクレオチド複合体又はナノスフィアを形成することにより実施してもよい。圧縮ポリヌクレオチド複合体は、米国特許第5,972,901号明細書、第6,008,336号明細書、及び第6,077,835号明細書に記載されている。ナノスフィアについては、米国特許第5,718,905号明細書及び第6,207,195号明細書に記載されている。核酸を複合体化するこれらの圧縮ポリヌクレオチド複合体又はナノスフィアは、ポリマーカチオンを使用する。典型的なポリマーカチオンとしては、ゼラチン、ポリ−L−リシン、及びキトサンが挙げられる。あるいは、ベクターのポリヌクレオチドをDEAE−デキストランと複合体化すること、又はリン酸カルシウム共沈、又は塩化カルシウム共沈などの技術を用いてトランスフェクトすることもできる。ヌクレオチド配列を含む1つ又は複数のベクターの導入は、宿主細胞のクロモソームに組み込まれるヌクレオチド配列をもたらす場合もあれば、もたらさない場合もある。
1つ又は複数のベクターを導入する宿主細胞の集団は、インフルエンザウイルスの複製を支持することができる任意のものである。これらの宿主細胞の多くは、当業者には公知であり、MDCK細胞、BHK細胞、PCK細胞、MDBK細胞、COS細胞、ベロ(Vero)アフリカミドリザル腎細胞;PERC.6細胞(組換えDNA技術を用いて、不死化した単一ヒト網膜由来細胞から得られる);ニワトリ胚由来のEBx幹細胞系統(Sigma Aldrich)が挙げられる。宿主細胞の集団は、細胞の組み合わせ又は混合物、例えば、293細胞(例えば、293T細胞)、又はCOS細胞(例えば、COS1、COS7細胞)と、MDCK又はVERO又はPERC.6細胞との組み合わせを指す場合もある。
1つ又は複数のベクターを含む宿主細胞の集団を培養した後、インフルエンザウイルスを回収する。宿主細胞の培養は、インフルエンザウイルス産生を促進することがわかっている複数の適切な培養条件のいずれかによって実施することができる。例えば、培養は、35℃以下の温度で実施してよく、これは、約32℃〜35℃、又は32℃〜34℃、又は約33℃、又は約32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、若しくは38℃であってよい。
典型的に、培養物は、サーモスタットなどの温度調節装置を用いて一定温度で、制御された湿度及びCO2下、細胞培養インキュベータなどのシステム内に維持する。細胞の集団は、中性緩衝pH(例えば、7.0〜7.2のpH)を維持するのに好適な制御湿度及びCO2下、血清(例えば、10%ウシ胎仔血清)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)などの標準的な市販の培地において、又は無血清培地で培養してよい。任意選択で、培地は、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなどの細菌増殖防止のための抗生物質、及び/又はL−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸などの追加栄養素、好ましい増殖特性を促進するための追加補充物、例えば、トリプシン、βメルカプトエタノールなどを含有する。in vitroでのインフルエンザウイルスの産生において特に興味深い組織培養手順に関してさらに詳細なものとして、例えば、Merten et al.1996 Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation.In Cohen及びShafferman(eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccinesが挙げられ、これらは、全体を本明細書に組み込むものとする。さらに、本発明に合わせた上記手順の改変は、常用の実験により容易に決定される。
宿主細胞の培養集団からのインフルエンザウイルスの回収は、当業者には周知であり、当業者により理解される複数の方法のいずれかによって実施することができる。例えば、粗培地を採取し、清澄化した後、濃縮してよい。インフルエンザウイルスを回収するために当業者が使用する一般的技法としては、濾過、超濾過、硫酸バリウムへの吸着及び溶離、並びに遠心分離がある。例えば、初めに、培養物からの粗培地は、例えば、1000〜2000×gの遠心分離を、細胞屑及び他の大きな粒状物質を除去するのに十分な時間、例えば、10〜30分にわたって実施することより清澄化することができる。あるいは、0.8μm酢酸セルロースフィルターにより培地を濾過して、インタクトな細胞及び他の大きな粒状物質を除去することもできる。次に、任意選択で、清澄化した培地上清を、例えば、15,000×gで約3〜5時間にわたり遠心分離して、インフルエンザウイルスをペレット化する。STE(0.01M Tris−HCl;0.15M NaCl;0.0001M EDTA)又はpH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの適切なバッファー中にウイルスペレットを再懸濁させた後、ショ糖(60%〜12%)又は酒石酸カリウム(50%〜10%)での密度勾配遠心分離によりウイルスを濃縮させる。連続又はステップ勾配(例えば、4つの12%ステップで12%〜60%のショ糖勾配)のいずれかが好適である。勾配は、ウイルスが、回収のための可視帯に濃縮するのに十分な速度で、かつ時十分な時間にわたり遠心分離してよい。これに代わり、及び一部のラージスケールの商業用途の場合、連続モードで運転するゾーン遠心分離ロータを用いて、密度勾配からウイルスを水ひしてもよい。組織培養物からのインフルエンザウイルスの調製を通じて当業者を指導するのに十分な追加的詳細事項は、例えば、以下の文献に提供されている:Furminger.Vaccine Production,in Nicholson et al.(eds)Textbook of Influenza pp.324−332;Merten et al.(1996)Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation,in Cohen & Shafferman(eds)Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp.141−151、及び米国特許第5,690,937号明細書。必要に応じて、回収したウイルスは、安定剤としてショ糖−リン酸−グルタミン酸(SPG)の存在下、−80℃で保存することができる。
インフルエンザAの複製能力を増大する方法
アミノ酸残基125位、127位、及び209位(H1番号付与)に対応する1個又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することにより、孵化卵でのインフルエンザAウイルスの複製能力を増大することができる。改変は、125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換、又は127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と127位のアミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換、127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換を含み得る。
アミノ酸残基125位、127位、及び209位(H1番号付与)に対応する1個又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することにより、孵化卵でのインフルエンザAウイルスの複製能力を増大することができる。改変は、125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換、又は127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と127位のアミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、又は125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換、127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換を含み得る。
また、アミノ酸残基222位、241位、及び369位(N1番号付与)に対応する1個又は複数のノイラミニダーゼアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することにより、孵化卵でのインフルエンザAウイルスの複製能力を増大することができる。改変は、222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又は241位アミノ酸残基のバリンによる置換、又は369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又は222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、241位のアミノ酸残基のバリンによる置換、又は222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又は241位アミノ酸残基のバリンによる置換と、369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又は222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、241位アミノ酸残基のバリンによる置換と、369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換とを含み得る。
さらに、孵化卵でのインフルエンザAウイルスの複製能力は、アミノ酸残基222位、241位、及び369位に対応する1個又は複数のノイラミニダーゼアミノ酸残基と組み合わせて、アミノ酸残基125位、127位、及び209位に対応する1個又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することにより増大することもできる。改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける241位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン及び369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン及び241位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける241位のバリン及び369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギ、241位のバリン、及び369位のアスパラギンによる置換を含み得る。
改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける241位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン及び369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン及び241位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける241位のバリン及び369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン、241位のバリン及び369位のアスパラギンによる置換を含み得る。
改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける241位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン及び369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン及び241位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける241位のバリン及び369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン、241位のバリン及び369位のアスパラギンによる置換を含み得る。
改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける241位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン及び369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン及び241位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける241位のバリンによる置換及び369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン、241位のバリン及び369位のアスパラギンによる置換を含み得る。
改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける241位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン及び369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン及び241位のバリンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける241位のバリンによる置換及び369位のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける222位のアスパラギン、241位のバリン及び369位のアスパラギンによる置換を含み得る。
改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換、127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおける369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換を含み得る。
改変は、ヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基222のアスパラギン、241位のバリン及び369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基222のアスパラギン、241位のバリン及び369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基222のアスパラギン、241位のバリン及び369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基222のアスパラギン、241位のバリン及び369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基222のアスパラギン、241位のバリン及び369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基222のアスパラギン、241位のバリン及び369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、又はヘマグルチニンポリペプチドにおける125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換、127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、ノイラミニダーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基222のアスパラギン、241位のバリン及び369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換を含み得る。
ヘマグルチニン及び/又はノイラミニダーゼポリペプチドにおける1つ又は複数の改変の結果もたらされる複製能力の増大により、親インフルエンザウイルス(例えば、ヘマグルチニン及び/又はノイラミニダーゼポリペプチドにおける1つ又は複数の改変の導入前のインフルエンザウイルス)と比較して、孵化鶏卵中でより高い力価まで増殖するインフルエンザウイルスが得られる。ヘマグルチニン及び/又はノイラミニダーゼポリペプチドにおける1つ又は複数の改変は、親インフルエンザウイルスと比較して、複製能力を少なくとも約10%、又は少なくとも約20%、又は少なくとも約30%、又は少なくとも約40%、又は少なくとも約50%、又は少なくとも約60%、又は少なくとも約70%、又は少なくとも約80%、又は少なくとも約90%、又は少なくとも約100%、又は少なくとも約200%、又は少なくとも約300%、又は少なくとも約400%、又は少なくとも約500%増大させ得る。
ヘマグルチニン及び/又はノイラミニダーゼポリペプチドにおける1つ又は複数の改変は、親インフルエンザウイルスと比較してインフルエンザウイルスの複製能力を少なくとも2倍増大させ得るか、又は親インフルエンザウイルスと比較してインフルエンザウイルスの複製能力を少なくとも4倍若しくは少なくとも8倍、少なくとも10倍、又は親インフルエンザウイルスと比較して少なくとも100倍増大させ得る。
ヘマグルチニン及び/又はノイラミニダーゼポリペプチドにおける1つ又は複数の改変は、インフルエンザウイルスの複製能力を、孵化卵中で少なくとも約7.5log10FFU/ml、又は孵化卵中で少なくとも約8log10FFU/ml、又は孵化卵中で少なくとも約8.1log10FFU/ml、又は孵化卵中で少なくとも約8.2log10FFU/ml、又は孵化卵中で少なくとも約8.3log10FFU/ml、又は孵化卵中で少なくとも約8.4log10FFU/ml、又は孵化卵中で少なくとも約8.5log10FFU/ml、又は孵化卵中で少なくとも約9log10FFU/ml増大させ得る。
アミノ酸残基125位、127位、及び209位(H1番号付与)に対応する1個又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基並びに/又はアミノ酸残基222、241、及び369(N1番号付与)に対応する1個又は複数のノイラミニダーゼアミノ酸残基の改変は、1個又は複数の天然のアミノ酸残基を本明細書に記載のような非天然アミノ酸残基で置換することにより実施することができる。1つ又は複数のアミノ酸置換は、当業者には公知の任意の操作技術又は一連の操作技術により実施してよい。このような操作に含まれ得る手順のための詳細なプロトコルは例えば、以下の文献に記載されているように、増幅、クローン化、突然変異誘発、形質転換などであってよい:Ausubel et al.Current Protocols in Molecular Biology(2000まで増補)John Wiley & Sons,New York(“Ausubel”);Sambrook et al.Molecular Cloning − A Laboratory Manual(2nd Ed.),Vol.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989(“Sambrook”)、並びにBerger及びKimmel Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology volume 152 Academic Press,Inc.,San Diego,CA(“Berger”)。
例えば、ヘマグルチニン及び/又はノイラミニダーゼポリペプチドにおける選定したアミノ酸残基の置換は、例えば、部位特異的突然変異誘発により達成することができる。部位特異的突然変異誘発は、Ausubel、Sambrook、及びBerger(前掲)に記載する公知の方法により実施することができる。部位特異的突然変異誘発を実施するための多数のキットも市販されており、例えば、Chameleon Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,La Jolla)があり、これらを製造者の指示に従い用いることにより、例えば、1つ又は複数のアミノ酸置換を、インフルエンザAヘマグルチニン及び/又はノイラミニダーゼポリペプチドをコードするゲノムセグメントに導入することができる。
ヘマグルチニン及び/又はノイラミニダーゼポリペプチドにアミノ酸置換を導入するのに使用することができる他の操作技術としては、in vitro増幅、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Q−レプリカーゼ増幅、及びその他のRNAポリメラーゼ媒介技術(例えば、NASBA)などが挙げられ、これらは、以下の文献にみいだされる:Mullis et al.(1987)米国特許第4,683,202号明細書;PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Innis et al.eds)Academic Press Inc.San Diego,CA(1990)(“Innis”);Arnheim及びLevinson(1990)C&EN 36;The Journal Of NIH Research 1991 3:81;Kwoh et al.1989 Proc Natl Acad Sci USA 86,1173;Guatelli et al.1990 Proc Natl Acad Sci USA 87:1874;Lomell et al.1989 J Clin Chem 35:1826;Landegren et al.1988 Science 241:1077;Van Brunt 1990 Biotechnology 8:291;Wu及びWallace 1989 Gene 4:560;Barringer et al.1990 Gene 89:117、並びにSooknanan及びMalek 1995 Biotechnology 13:563。核酸をクローン化するのに有用な別の方法として、Wallace et al.米国特許第5,426,039号明細書がある。PCRにより大きな核酸を増幅する改善された方法が、Cheng et al.1994 Nature 369:684及び本明細書に記載の参照文献にまとめられている。
ヘマグルチニン及び/又はノイラミニダーゼポリペプチドにアミノ酸置換を導入する操作技術に用いることができるポリヌクレオチドは、例えば、モノヌクレオチド−及び/又はトリヌクレオチドベースのホスホロアミダイトカップリング化学などの様々な固相方法を用いて合成することができるオリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、核酸配列は、延長ポリヌクレオチド鎖の活性化モノマー及び/又は三量体の連続的添加により合成することができる。例えば、Caruthers,M.H.et al.1992 Meth Enzymol 211:3を参照されたい。また、オリゴヌクレオチドは、様々な商業的供給源、例えば、The Midland Certified Reagent Company(Midland,TX)、The Great American Gene Company(Salt Lake City,UT)、ExpressGen,Inc.(Chicago,IL)、Operon Technologies,Inc.(Huntsville,AL)、及びその他多数のいずれから注文してもよい。
ヘマグルチニンのアミノ酸位置は、H1番号付与に基づく。ノイラミニダーゼのアミノ酸位置は、N1番号付与に基づく。ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ番号付与計画は、当業者には公知である。当業者は、H1アミノ酸残基の位置の知識に基づき、H1〜H16インフルエンザAヘマグルチニンポリペプチドのいずれかにおけるアミノ酸残基の位置を容易に決定することができるだろう。同様に、当業者は、N1アミノ酸残基の位置の知識に基づき、インフルエンザAN1〜N9ノイラミニダーゼポリペプチドのいずれかにおけるアミノ酸残基の位置を容易に決定することができるだろう。1個又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基が改変されるインフルエンザAウイルスは、H1、H2、H3、H5、H6、H7、又はH9インフルエンザAウイルスであってよい。
ポリペプチド
ヘマグルチニンポリペプチドは、配列番号1、3及び4に示すポリペプチドの全部又は任意の部分を含む。ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号1に示すアミノ酸配列の全部又は一部を含む場合、これは、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸残基、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有し得る。ヘマグルチニンポリペプチドは、単離されたものでもよいし、あるいは、それが天然に存在する環境で、通常それに伴う、又はそれと相互作用する成分を実質的に含有しないものであってもよい。
ヘマグルチニンポリペプチドは、配列番号1、3及び4に示すポリペプチドの全部又は任意の部分を含む。ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号1に示すアミノ酸配列の全部又は一部を含む場合、これは、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸残基、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有し得る。ヘマグルチニンポリペプチドは、単離されたものでもよいし、あるいは、それが天然に存在する環境で、通常それに伴う、又はそれと相互作用する成分を実質的に含有しないものであってもよい。
ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号3に示すアミノ酸配列の全部又は一部を含む場合、これは、アミノ酸残基124位のロイシン、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基124位のロイシン、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有し得る。ヘマグルチニンポリペプチドは、単離されたものでもよいし、あるいは、それが天然に存在する環境で、通常それに伴う、又はそれと相互作用する成分を実質的に含有しないものであってもよい。
ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号4に示すアミノ酸配列の全部又は一部を含む場合、これは、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸残基、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有し得る。ヘマグルチニンポリペプチドは、単離されたものでもよいし、あるいは、それが天然に存在する環境で、通常それに伴う、又はそれと相互作用する成分を実質的に含有しないものであってもよい。
ノイラミニダーゼポリペプチドは、配列番号5〜8に示すポリペプチドの全部又は任意の部分を含む。ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号8のアミノ酸配列の全部又は一部を含む場合、アミノ酸残基222位は、アスパラギンであるか、又はアミノ酸残基241位はバリンであるか、又はアミノ酸残基369位はアスパラギンであってもよく、又はアミノ酸残基222がアスパラギンであり、かつアミノ酸残基369位がアスパラギンであってもよく、又はアミノ酸残基241位がバリンであり、かつアミノ酸残基369位がアスパラギンであってもよく、又はアミノ酸残基222がアスパラギンであり、アミノ酸残基241位がバリンであり、しかもアミノ酸残基369位がアスパラギンであってもよい。ノイラミニダーゼポリペプチドは、単離されたものでもよいし、あるいは、それが天然に存在する環境で、通常それに伴う、又はそれと相互作用する成分を実質的に含有しないものであってもよい。
ポリペプチドは、宿主細胞系統又は株の形質導入を行い、適切な細胞密度まで宿主細胞を増殖させてから、細胞を所定期間にわたりさらに培養した後、産生させることができる。次に、発現したポリペプチド、例えば、HA及び/又はNAポリペプチドを培地から回収することができる。あるいは、宿主細胞を遠心分離により回収し、物理若しくは化学的手段により破砕した後、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持することもできる。真核生物又は微生物細胞をタンパク質の発現に使用した後、任意の好都合な方法で破砕することができ、このような方法として、凍結融解サイクル、音波処理、機械的破砕、若しくは細胞溶解剤の使用、又は当業者には周知の他の方法がある。
発現ポリペプチドを回収し、当分野において公知の複数の方法のいずれかによって組換え細胞培養物から精製してもよく、このような方法として、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー(例えば、当業者には周知のタグ付け系のいずれかを用いて)、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。必要に応じて、成熟タンパク質の構成の完成にタンパク質リフォールディングステップを用いることができる。また、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を最終精製ステップで使用することができる。本明細書に記載する標準的方法以外にも、様々な精製方法が当分野では公知であり、例えば、以下の文献に記載されているものが挙げられる:Sandana(1997)Bioseparation of Proteins,Academic Press,Inc.;及びBollag et al.(1996)Protein Methods,2nd Edition Wiley−Liss,NY;Walker(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press,NJ,Harris and Angal(1990)Protein Purification Applications:A Practical Approach IRL Press at Oxford,Oxford,England;Harris and Angal Protein Purification Methods:A Practical Approach IRL Press at Oxford,Oxford,England;Scopes(1993)Protein Purification:Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag,NY;Janson and Ryden(1998)Protein Purification:Principles,High Resolution Methods and Applications,Second Edition Wiley−VCH,NY;並びにWalker(1998)Protein Protocols on CD−ROM Humana Press,NJ。
ポリペプチドは、単独で、又は他のポリペプチドと組み合わせて組成物にしてもよい。1種又は複数のポリペプチドが、投与に好適な組成物に含まれる場合、これらは、生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤と一緒に、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローション、又は懸濁液の形態に製剤化してよい(例えば、以下を参照:Hardman,et al.(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw−Hill,New York,N.Y.;Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,及びWilkins,New York,N.Y.;Avis,et al.(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY;Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY;Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY;Weiner及びKotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.)。
ポリペプチドを組み合わせる場合、組み合わせは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、又はそれ以上のヘマグルチニン及び/又はノイラミニダーゼポリペプチドを含んでよい。組成物は、配列番号5のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドと一緒に配列番号1のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドとを含み得る。組み合わせは、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸を有する配列番号1と、配列番号5のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸を有する配列番号1と、配列番号5のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号1と、配列番号5のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基127位のグルタミン酸を有する配列番号1と、配列番号5のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号1と、配列番号5のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号1と、配列番号5のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号1と、配列番号5のアミノ酸配列を有するノイラミニダーゼポリペプチドとを含み得る。
組成物は、配列番号3のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドと、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含み得る。組み合わせは、アミノ酸残基124位のロイシンを有する配列番号3と、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸を有する配列番号3と、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸を有する配列番号3と、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号3と、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基124位のロイシン及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号3と、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号3と、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号3と、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基124位のロイシン、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号3と、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含むか、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号3と、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含み得る。
組成物は、配列番号4のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドと、配列番号5又は配列番号6、又は配列番号8のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドとを含み得る。組み合わせは、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸を有する配列番号4と、配列番号5を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号5を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号5を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基127位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号5を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号5を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号5を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号5を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含み得る。
組成物は、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸を有する配列番号4と、配列番号6を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸残基を有する配列番号4と、配列番号6を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号6を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基127位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号6を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号6を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号6を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号6を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含み得る。
組成物は、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸を有する配列番号4と、配列番号8を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号8を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号8を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基127位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号8を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号8を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基127位のグルタミン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号8を含むノイラミニダーゼポリペプチド、又はアミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸を有する配列番号4と、配列番号8を含むノイラミニダーゼポリペプチドを含み得る。配列番号8のノイラミニダーゼポリペプチドは、222位のアスパラギン、又は241位のバリン、又は369位のアスパラギン、又は222位のアスパラギン及び369位のアスパラギン、又は241位のバリン及び369位のアスパラギン、又は222位のアスパラギン、241位のバリン及び369位のアスパラギンを有し得る。
ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドは、配列番号1、3、及び4に示すヘマグルチニンポリペプチドのいずれか又は配列番号5〜8に示すノイラミニダーゼポリペプチドのいずれかの全部若しくは一部をコードし得る。ポリヌクレオチドの例として、配列番号9〜16に示す配列の全部若しくは一部を含むものが挙げられる。ポリヌクレオチドは、DNA、RNA、又はDNA若しくはRNA分子の他の合成若しくは改変形態であってよい。ポリヌクレオチドは、ベクター中に含まれてもよい。
ポリヌクレオチドは、配列番号1、3、及び4に示すヘマグルチニンポリペプチドのいずれか又は配列番号5〜8に示すノイラミニダーゼポリペプチドのいずれかの全部若しくは一部をコードし得る。ポリヌクレオチドの例として、配列番号9〜16に示す配列の全部若しくは一部を含むものが挙げられる。ポリヌクレオチドは、DNA、RNA、又はDNA若しくはRNA分子の他の合成若しくは改変形態であってよい。ポリヌクレオチドは、ベクター中に含まれてもよい。
ベクターは、核酸を増殖することができる、及び/又は生物、細胞、若しくは細胞成分間で輸送することができる手段であってよい。ベクターとしては、自律的に複製するか、又は宿主細胞の染色体に組み込むことができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポソン、人工染色体などが挙げられる。ベクターはまた、ネイキッドRNAポリヌクレオチド、ネイキッドDNAポリヌクレオチド、同一鎖内のDNA及びRNAの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリ−リシン結合DNA若しくはRNA、ペプチド結合DNA若しくはRNA、リポソーム結合DNAなどであってもよく、これは自律的に複合しない。ベクターが、発現ベクターである場合、これは、そこに組み込まれた核酸の発現、及び複製を促進する能力を有し得る。ベクター又は発現ベクターを宿主細胞に組み込んでもよい。
ベクターが、発現ベクターであり、しかも発現ベクターが細菌細胞への導入のために選択されたものであれば、発現ベクターは、BLUESCRIPT(Stratagene)などの多機能大腸菌(E.coli)クローン化及び発現ベクター、又はpINベクター(Van Heeke & Schuster 1989 J Biol Chem 264:5503−5509);pETベクター(Novagen,Madison WI);又は他のこうした公知の発現ベクターであってよい。同様に、酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)では、α因子、アルコールオキシダーゼ及びPGHなどの構成又は誘導性プロモータを含有する複数のベクターを所望の発現産物の産生のために用いることができる。詳しくは、Ausubel,infra,及びGrant et al.,1987 Methods in Enzymology 153:516−544を参照されたい。
宿主細胞
宿主細胞は、任意の数の公知、かつ一般に実施されている技術を用いて、ベクターで形質導入、形質転換又はトランスフェクトされたものでよい。一般的に、宿主細胞は、大腸菌(E.coli)、ストレプトミセス(Streptomyces)、及びネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)などの細菌細胞;サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア酵母(Pichia pastoris)、及びアカパンカビ(Neurospora crassa)などの真菌細胞;ショウジョウバエ(Drosophila)及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)などの昆虫細胞;又は COS、Vero、PerC、CHO、BHK、MDCK、293、293T、及びCOS7細胞などの哺乳動物細胞であってよい。
宿主細胞は、任意の数の公知、かつ一般に実施されている技術を用いて、ベクターで形質導入、形質転換又はトランスフェクトされたものでよい。一般的に、宿主細胞は、大腸菌(E.coli)、ストレプトミセス(Streptomyces)、及びネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)などの細菌細胞;サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア酵母(Pichia pastoris)、及びアカパンカビ(Neurospora crassa)などの真菌細胞;ショウジョウバエ(Drosophila)及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)などの昆虫細胞;又は COS、Vero、PerC、CHO、BHK、MDCK、293、293T、及びCOS7細胞などの哺乳動物細胞であってよい。
ベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞は、プロモータを活性化し、形質転換体を選定するために、又は例えば、ウイルスの産生によって、挿入ポリヌクレオチド配列を増幅するために、必要に応じて改変された従来の栄養培地中に培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、典型的に、発現用に選択された特定の宿主細胞と一緒に、以前より用いられているものであり、当業者には明らかであり、本明細書に引用する以下を含む参照文献にもみいだされよう:例えば、Freshney(1994)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,3rd edition,Wiley−Liss,New York及びそこに引用される参照文献。他の有用な参照文献としては、例えば、以下のものが挙げられる:Paul(1975)Cell and Tissue Culture,5th ed.,Livingston,Edinburgh;Adams(1980)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Cell Culture for Biochemists,Work and Burdon(eds.)Elsevier,Amsterdam。in vitroでのインフルエンザウイルスの産生で特に興味深い組織培養手順に関してさらに詳細なものとしては、例えば、Merten et al.(1996)Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation.in Cohen and Shafferman(eds.)Novel Strategies in Design and Production of Vaccinesが挙げられ、これは、その全体をあらゆる目的のために本明細書に組み込むものとする。さらに、本発明に合わせたこのような手順の改変は、常用の実験により容易に決定され、当業者には周知であろう。
キット及び試薬
キットは、本明細書に記載の核酸、ポリペプチド、抗体、又は本明細書に記載の細胞系統(例えば、配列番号1、及び3〜8のいずれかの全部若しくは一部を含むインフルエンザHA及び/又はNA分子を含むか、これと一緒に)の1つ又は複数を含み得る。キットは、例えば、抗体、プローブセット、例えば、好適な容器にパッケージされたcDNAマイクロアレイのような診断用核酸又はポリヌクレオチド、あるいは、1つ又は複数の発現ベクターなどの他の核酸を含み得る。キットは、例えば、発現産物を標識するための基質、標識、プライマーなどの1種又は複数の別の試薬、チューブ及び/又は他の付属品、サンプルを採取するための試薬、バッファー、ハイブリダイゼーションチャンバ、カバースリップなどをさらに含んでもよい。キットは、任意選択で、発見のためにキット構成要素を用いた好ましい方法又は診断セットの適用を詳述する指示セット又はユーザマニュアルをさらに含んでもよい。
キットは、本明細書に記載の核酸、ポリペプチド、抗体、又は本明細書に記載の細胞系統(例えば、配列番号1、及び3〜8のいずれかの全部若しくは一部を含むインフルエンザHA及び/又はNA分子を含むか、これと一緒に)の1つ又は複数を含み得る。キットは、例えば、抗体、プローブセット、例えば、好適な容器にパッケージされたcDNAマイクロアレイのような診断用核酸又はポリヌクレオチド、あるいは、1つ又は複数の発現ベクターなどの他の核酸を含み得る。キットは、例えば、発現産物を標識するための基質、標識、プライマーなどの1種又は複数の別の試薬、チューブ及び/又は他の付属品、サンプルを採取するための試薬、バッファー、ハイブリダイゼーションチャンバ、カバースリップなどをさらに含んでもよい。キットは、任意選択で、発見のためにキット構成要素を用いた好ましい方法又は診断セットの適用を詳述する指示セット又はユーザマニュアルをさらに含んでもよい。
指示に従って用いる場合、例えば、病態又は病状を評価するため、細胞若しくは生物の病態又は病状の進行に対する薬剤又は他の治療介入の効果を評価するため、あるいは、ワクチンとして使用するなどのために、キットを用いることができる。
キットは、適切なパッケージング材料、容器、及び指示材料と共に、1つ又は複数の翻訳系(例えば、宿主細胞)を含んでもよい。さらに、キットは、配列番号1、及び3〜8のHA及び/又はNA配列のいずれかの全部若しくは一部を含む弱毒化生ワクチン(例えば、FluMist)などの様々なワクチンを含んでもよい。
実施形態
実施形態A1.ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第1ゲノムセグメントを含む組換えインフルエンザウイルスであって、ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号1、配列番号3、又は配列番号4に示すアミノ酸配列を含む、組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A1.ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第1ゲノムセグメントを含む組換えインフルエンザウイルスであって、ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号1、配列番号3、又は配列番号4に示すアミノ酸配列を含む、組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A2.ヘマグルチニンが、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む、実施形態A1の組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A3.配列番号1に示すヘマグルチニンが、以下:
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態A2の組換えインフルエンザウイルス。
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態A2の組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A4.ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第2ゲノムセグメントをさらに含み、ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号5に示すアミノ酸配列を含む、実施形態A2又はA3のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A5.ヘマグルチニンが、配列番号3に示すアミノ酸配列を含む、実施形態A1の組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A6.配列番号3に示すヘマグルチニンポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基124位のロイシン;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシン、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態A5の組換えインフルエンザウイルス。
アミノ酸残基124位のロイシン;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシン、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態A5の組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A7.配列番号3に示すヘマグルチニンポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態A6の組換えインフルエンザウイルス。
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態A6の組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A8.ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第2ゲノムセグメントをさらに含み、ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号6に示すアミノ酸配列を含む、実施形態A5〜A7のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A9.ヘマグルチニンが、配列番号4に示すアミノ酸配列を含む、実施形態A1の組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A10.配列番号4に示すヘマグルチニンが、以下:
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態A9の組換えインフルエンザウイルス。
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態A9の組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A11.ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第2ゲノムセグメントをさらに含み、ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号5、配列番号7、又は配列番号8に示すアミノ酸配列を含む、実施形態A9又はA10のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A12.ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号8に示すアミノ酸配列を含む、実施形態A11の組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A13.配列番号8に示すノイラミニダーゼポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基222位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリン;又は
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、実施形態A12の組換えインフルエンザウイルス。
アミノ酸残基222位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリン;又は
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、実施形態A12の組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A14.配列番号8に示すノイラミニダーゼポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、実施形態A13の組換えインフルエンザウイルス。
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、実施形態A13の組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A15.配列番号8に示すノイラミニダーゼポリペプチドが、アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギンを含み;かつ
配列番号4に示すヘマグルチニンポリペプチドが、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸を含む、実施形態A14の組換えインフルエンザウイルス。
配列番号4に示すヘマグルチニンポリペプチドが、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸を含む、実施形態A14の組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A16.弱毒化、温度感受性、及び低温適応の1つ又は複数の表現型特徴を有するインフルエンザウイルスの6つの内部ゲノムセグメントをさらに含む、実施形態A1〜A15のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A17.6つの内部ゲノムセグメントが、インフルエンザウイルスA/Ann Arbor/6/60由来のものである、実施形態A16の組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A18.A/Puerto Rico/8/34の6つの内部ゲノムセグメントをさらに含む、実施形態A1〜A15のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A19.不活性化されている実施形態A1〜18のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A20.生弱毒化されている実施形態A1〜17のいずれかの組換えインフルエンザウイルス。
実施形態A21.実施形態A19又はA20の組換えインフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
実施形態A22.実施形態A21の免疫原性組成物を含むワクチン。
実施形態A23.少なくとも1種の他の組換えインフルエンザウイルスをさらに含む、実施形態A22のワクチン。
実施形態A24.H3N2インフルエンザA株HA及びNA抗原を含む組換えインフルエンザウイルス、山形(Yamagata)インフルエンザB株HA及びNA抗原を含む組換えインフルエンザウイルス、並びにビクトリア(Victoria)インフルエンザB株HA及びNA抗原を含む組換えインフルエンザウイルスをさらに含む、実施形態A22のワクチン。
実施形態B1.実施形態A2の組換えインフルエンザウイルスを製造する方法であって、以下:
(a)インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に複数のベクターを導入するが、これら複数のベクターは、第1インフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列と、配列番号1のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する第1ゲノムセグメントとを含む、ステップ;
(b)宿主細胞の集団を培養するステップ;及び
(c)インフルエンザウイルスを回収するステップ
を含む方法。
(a)インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に複数のベクターを導入するが、これら複数のベクターは、第1インフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列と、配列番号1のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する第1ゲノムセグメントとを含む、ステップ;
(b)宿主細胞の集団を培養するステップ;及び
(c)インフルエンザウイルスを回収するステップ
を含む方法。
実施形態B2.配列番号1のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態B1の方法。
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態B1の方法。
実施形態B3.ステップ(a)で、配列番号5のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生する第2ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列をさらに導入することを含む、実施形態B1又はB2の方法。
実施形態B4.実施形態A5の組換えインフルエンザウイルスを産生する方法であって、以下:
(a)インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に複数のベクターを導入するが、これら複数のベクターは、第1インフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列と、配列番号3のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する第1ゲノムセグメントとを含む、ステップ;
(b)宿主細胞の集団を培養するステップ;及び
(c)インフルエンザウイルスを回収するステップ
を含む方法。
(a)インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に複数のベクターを導入するが、これら複数のベクターは、第1インフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列と、配列番号3のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する第1ゲノムセグメントとを含む、ステップ;
(b)宿主細胞の集団を培養するステップ;及び
(c)インフルエンザウイルスを回収するステップ
を含む方法。
実施形態B5.配列番号3のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基124位のロイシン;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシン、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態B4の方法。
アミノ酸残基124位のロイシン;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシン、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態B4の方法。
実施形態B6.配列番号3に示すヘマグルチニンポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態B5の方法。
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態B5の方法。
実施形態B7.ステップ(a)で、配列番号6のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生する第2ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列をさらに導入することを含む、実施形態B4〜B6のいずれかの方法。
実施形態B8.実施形態A9の組換えインフルエンザウイルスを産生する方法であって、以下:
(a)インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に複数のベクターを導入するが、これら複数のベクターは、第1インフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列と、配列番号4のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する第1ゲノムセグメントとを含む、ステップ;
(b)宿主細胞の集団を培養するステップ;及び
(c)インフルエンザウイルスを回収するステップ
を含む方法。
(a)インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に複数のベクターを導入するが、これら複数のベクターは、第1インフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列と、配列番号4のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドを産生する第1ゲノムセグメントとを含む、ステップ;
(b)宿主細胞の集団を培養するステップ;及び
(c)インフルエンザウイルスを回収するステップ
を含む方法。
実施形態B9.配列番号4のアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態B8の方法。
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態B8の方法。
実施形態B10.ステップ(a)で、配列番号5、又は配列番号7、又は配列番号8のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドを産生する第2ゲノムセグメントに対応するヌクレオチド配列をさらに導入することを含む、実施形態B8又はB9の方法。
実施形態B11.ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号8のアミノ酸配列を含む、実施形態B10の方法。
実施形態B12.配列番号8に示すノイラミニダーゼポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基222位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリン;又は
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、実施形態B11の方法。
アミノ酸残基222位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリン;又は
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、実施形態B11の方法。
実施形態B13.配列番号8に示すノイラミニダーゼポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、実施形態B12の方法。
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、実施形態B12の方法。
実施形態B14.配列番号8に示すノイラミニダーゼポリペプチドが、アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギンを含み;かつ
配列番号4に示すヘマグルチニンポリペプチドが、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン残基酸を含む、実施形態B13の方法。
配列番号4に示すヘマグルチニンポリペプチドが、アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン残基酸を含む、実施形態B13の方法。
実施形態C1.孵化卵においてインフルエンザAウイルスの複製能力を増大させる方法であって、
アミノ酸残基125位、127位、及び209位(H1番号付与)に対応する1つ又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することを含み:
これにより、インフルエンザウイルスの複製能力を増大させる方法。
アミノ酸残基125位、127位、及び209位(H1番号付与)に対応する1つ又は複数のヘマグルチニンアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することを含み:
これにより、インフルエンザウイルスの複製能力を増大させる方法。
実施形態C2.改変が、以下:
125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換;又は
127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換;又は
209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換;又は
125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換;又は
125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換;又は
127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換;又は
125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換、127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換
を含む、実施形態C1の方法。
125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換;又は
127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換;又は
209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換;又は
125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換;又は
125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換と、209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換;又は
127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換と、209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換;又は
125位アミノ酸残基のアスパラギン酸による置換、127位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換、及び209位アミノ酸残基のグルタミン酸による置換
を含む、実施形態C1の方法。
実施形態C3.アミノ酸残基222位、241位、又は369位(N1番号付与)に対応する1つ又は複数のノイラミニダーゼアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することをさらに含み、改変が、以下:
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
241位アミノ酸残基のバリンによる置換;又は
369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、241位アミノ酸残基のバリンによる置換;又は
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
241位アミノ酸残基のバリンによる置換と、369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、241位アミノ酸残基のバリンによる置換、及び369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換
を含む、実施形態C1又はC2の方法。
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
241位アミノ酸残基のバリンによる置換;又は
369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、241位アミノ酸残基のバリンによる置換;又は
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
241位アミノ酸残基のバリンによる置換と、369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、241位アミノ酸残基のバリンによる置換、及び369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換
を含む、実施形態C1又はC2の方法。
実施形態C4.インフルエンザAウイルスが、インフルエンザH1N1ウイルスである、実施形態C1〜C3のいずれかの方法。
実施形態C5.実施形態C1〜C4のいずれか1つの方法により産生されるインフルエンザAウイルス。
実施形態C6.不活性化されている、実施形態C5のインフルエンザAウイルス。
実施形態C7.生弱毒化されている、実施形態C5のインフルエンザAウイルス。
実施形態C9.実施形態C6又はC7のインフルエンザAウイルスを含む、免疫原性組成物。
実施形態C10.実施形態C9の免疫原性組成物を含むワクチン。
実施形態D1.孵化卵においてインフルエンザAウイルスの複製能力を増大させる方法であって、
アミノ酸残基222位、241位、又は369位(N1番号付与)に対応する1つ又は複数のノイラミニダーゼアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することを含み、改変が、以下:
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
241位アミノ酸残基のバリンによる置換;又は
369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、241位アミノ酸残基のバリンによる置換;又は
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
241位アミノ酸残基のバリンによる置換と、369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、241位アミノ酸残基のバリンによる置換、及び369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換
を含み、
これにより、インフルエンザウイルスの複製能力を増大させる方法。
アミノ酸残基222位、241位、又は369位(N1番号付与)に対応する1つ又は複数のノイラミニダーゼアミノ酸残基を非天然の酸性アミノ酸残基に改変することを含み、改変が、以下:
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
241位アミノ酸残基のバリンによる置換;又は
369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、241位アミノ酸残基のバリンによる置換;又は
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換と、369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
241位アミノ酸残基のバリンによる置換と、369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換;又は
222位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換、241位アミノ酸残基のバリンによる置換、及び369位アミノ酸残基のアスパラギンによる置換
を含み、
これにより、インフルエンザウイルスの複製能力を増大させる方法。
実施形態D2.インフルエンザAウイルスが、インフルエンザH1N1ウイルスである、実施形態D1の方法。
実施形態D3.実施形態D1又はD2のいずれか1つの方法により産生されるインフルエンザAウイルス。
実施形態D4.不活性化されている、実施形態D3のインフルエンザAウイルス。
実施形態D5.生弱毒化されている、実施形態D4のインフルエンザAウイルス。
実施形態D6.実施形態D4又はD5のインフルエンザAウイルスを含む、免疫原性組成物。
実施形態D7.実施形態D6の免疫原性組成物を含むワクチン。
実施形態E1.配列番号1、配列番号3、又は配列番号4に示すアミノ酸配列を含む、単離ヘマグルチニンポリペプチド。
実施形態E2.配列番号1に示すアミノ酸配列を含む、実施形態E1の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
実施形態E3.配列番号1に示すアミノ酸配列が、以下:
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態E2の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態E2の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
実施形態E4.配列番号3に示すアミノ酸配列を含む、実施形態E1の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
実施形態E5.配列番号3に示すアミノ酸配列が、以下:
アミノ酸残基124位のロイシン;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシン、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態E4の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
アミノ酸残基124位のロイシン;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシン、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態E4の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
実施形態E6.配列番号4のアミノ酸配列を含む、実施形態E1の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
実施形態E7.配列番号4のアミノ酸配列が、以下:
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態E6の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、実施形態E6の単離ヘマグルチニンポリペプチド。
実施形態E8.実施形態E1〜E7のいずれかのヘマグルチニンポリペプチドをコードする、単離ヘマグルチニンポリペプチド。
実施形態E9.実施形態E8のポリヌクレオチドを含むベクター。
実施形態E10.実施形態E9のベクターを含む細胞。
実施形態E11.実施形態E1〜E7のいずれかのヘマグルチニンポリペプチドを含む組成物。
実施形態E12.免疫原性である、実施形態E11の組成物。
実施形態E13.実施形態E8の単離ポリヌクレオチド、実施形態E9のベクター、又は実施形態10の細胞のいずれかを含む組成物。
実施形態E14.ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに含む、実施形態E11又はE12のいずれかの組成物。
実施形態E15.ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号5、配列番号7、又は配列番号8のアミノ酸配列を含む、実施形態E14の組成物。
実施形態E16.ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号8のアミノ酸配列を含む、実施形態E15の組成物。
実施形態E17.配列番号8のノイラミニダーゼポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基222位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリン;又は
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、実施形態E16の組成物。
アミノ酸残基222位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリン;又は
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、実施形態E16の組成物。
実施形態F1.配列番号5、配列番号7、又は配列番号8のアミノ酸配列を含む、単離ノイラミニダーゼポリペプチド。
実施形態F2.配列番号8に示すアミノ酸配列を含む、実施形態F1の単離ノイラミニダーゼポリペプチド。
実施形態F3.配列番号8のノイラミニダーゼポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基222位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリン;又は
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、実施形態F2の単離ノイラミニダーゼポリペプチド。
アミノ酸残基222位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリン;又は
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、実施形態F2の単離ノイラミニダーゼポリペプチド。
実施形態F4.実施形態F1〜F3のいずれかのノイラミニダーゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
実施形態F5.実施形態F4のポリヌクレオチドを含むベクター。
実施形態F6.実施形態F5のベクターを含む細胞。
実施形態F7.実施形態F1〜F3のいずれかのノイラミニダーゼポリペプチド、実施形態4のポリヌクレオチド、実施形態F5のベクター又は実施形態F6の細胞を含む組成物。
以下の実施例を参照にしながら、本発明を説明する。これらの実施例は、あくまで例示を目的として提供されるものであり、本発明がこれらの実施例に限定されると決して解釈すべきではなく、むしろ本明細書に記載する教示によって明らかになるあらゆる改変を包含すると解釈すべきである。
1.材料及び方法
野生型ウイルス:卵増殖野生型H1N1pdmウイルスA/Brisbane/10/2010及びA/New Hampshire/2/2010は、親切にも米国疾病管理予防センター(Centers for Disease Control and Prevention)(米国)により提供された。畜産業従業者から感染したヒトインフルエンザに罹患したフェレットの鼻洗浄液からA/Gilroy/231/2011を単離した。Madin Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞(European Collection of Cell Cultures)及び孵化鶏卵(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)の両方で、全てのウイルスを増殖させた。
野生型ウイルス:卵増殖野生型H1N1pdmウイルスA/Brisbane/10/2010及びA/New Hampshire/2/2010は、親切にも米国疾病管理予防センター(Centers for Disease Control and Prevention)(米国)により提供された。畜産業従業者から感染したヒトインフルエンザに罹患したフェレットの鼻洗浄液からA/Gilroy/231/2011を単離した。Madin Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞(European Collection of Cell Cultures)及び孵化鶏卵(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)の両方で、全てのウイルスを増殖させた。
リバースジェネティクスによる組換えウイルスの作製:wtH1N1pdmウイルスのHA及びNA遺伝子セグメントをRT−PCRにより増幅し、pAD3000ベクターにクローン化した(Hoffmann et al.,2000 Proc Natl Acad Sci U S A.97:6108−13)。QuikChange(登録商標)Site−Directed Mutagenesisキットを用いて、部位特異的突然変異誘発を実施することにより、HA及びNA遺伝子に特定の変異を導入した(Agilent Technologies Santa Clara,CA)。以前記載されているように、プラスミドレスキューにより、6:2再集合体ワクチンウイルスを作製した(Jin et al.,2003 Virology 306:18−24)。手短には、H1N1ウイルスのHA及びNAタンパク質遺伝子セグメントと、低温適応A/Ann Arbor/6/60(AA ca、H2N2)ウイルスの6つの内部タンパク質遺伝子セグメントをコードする8つのcDNAプラスミドを、同時培養した293T及びMDCK細胞に同時トランスフェクトすることにより、6:2再集合体候補ワクチンウイルスを作製した。細胞上清からのレスキューウイルスを10〜11日齢の孵化鶏卵の尿膜腔中で増殖させた。vRNAから増幅したRT−PCRcDNAを配列決定することにより、ウイルスのHA及びNA配列を確認した。
ウイルス力価測定:MDCK細胞での蛍光フォーカスアッセイにより、感染ウイルス力価を測定し、log10FFU(蛍光フォーカス単位)/mlとして表した。以前記載されている(Lu et al.,2005 J.Virol.79:6763−6771)ようなプラークアッセイにより、ウイルスプラーク形態を調べた。卵における6:2再集合体ウイルスの複製を比較するために、卵に103FFU/卵のウイルスを接種し、33℃で3日間インキュベートした。FFAアッセイ及びプラークアッセイの両方のために、尿膜液を採取した。
ウイルス増殖動態及びウイルスタンパク質発現:組換え6:2再集合体の増殖動態をMDCK細胞で決定した。MDCK細胞に、5又は0.005の感染多重度(MOI)でウイルスを接種した。吸着から1時間後、感染細胞をPBSで洗浄し、1g/mlのTPCK−トリプシン(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を含有する最少必須培地(MEM)と一緒にインキュベートし、33℃でインキュベートした。細胞培養上清を様々な時点で回収し、FFAアッセイによりウイルス力価を決定した。
感染細胞中に産生されたウイルスタンパク質及び細胞培養上清中に放出されたビリオンをウエスタンブロットにより分析した。前述のように、MOI:5で、MDCK細胞を感染させた。感染から8時間及び16時間後、細胞培養物上清を回収し、細胞屑を14,000rpmの微量遠心機で5分間の遠心分離により分離した。感染細胞を回収し、RIPAバッファー(20mM TrisCl[pH7.5]、150mM NaCl、1%TritonX−100、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、プロテアーゼインヒビターカクテル)で溶解させた。等量の細胞溶解物及び細胞上清を、変性条件下、Novex(登録商標)12%Tris−グリシンゲル(Invitrogen,Carlsbad,CA)上で電気泳動させた。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、インフルエンザ特異的抗体と一緒にブロッティングした。
免疫蛍光アッセイのために、0.005のMOIで、MDCK細胞をウイルスに感染させた。感染から15時間又は48時間後、感染細胞を10%ホルマリンで20分固定した後、氷冷メタノールを用いた5分の処理を実施した。次に、細胞を1:40希釈のヤギ抗インフルエンザAウイルスポリクローナル抗体(Millipore,Bedford,MA)と一緒に、室温で1時間インキュベートした後、1:100希釈のFITC結合ウサギ抗ヤギIgG抗体(Millipore,Bedford,MA)と一緒に30分インキュベートした。蛍光顕微鏡により、染色した細胞を検定した。
HAIアッセイによる血清抗体検出:Simonsen Laboratories(Gilroy,CA)からの8〜10週齢雄及び雌フェレット(n=3匹/群)に0.2ml用量当たり7.0log10FFUを鼻内接種した。感染から14日後、フェレット血清サンプルを採取した。HAIアッセイを用いて、相同性及び異種ウイルスに対する感染後フェレット血清中の抗体レベルを決定した。受容体破壊酵素(RDE,Denka Seiken Co.,日本国東京)で処理した25μlの連続希釈血清サンプルを96ウェルV字底マイクロプレート中で4HA単位の表示ウイルス(25μl)と混合した。室温で30分インキュベートした後、50μlの0.5%ニワトリ赤血球(cRBC)を各ウェルに添加し、さらに45分インキュベートした。HAI力価は、ウイルス血球凝集を阻害した最も高い血清希釈度の逆数として定義した。
2.H1N1pdmワクチン株は、孵化鶏卵中で増殖が異なった
3つの最近のH1N1pdm株、A/Brisbane/10/2010(Bris/10)、A/New Hampshire/2/2010(NH/10)及びA/Gilroy/231/2011(Gil/11)は、A/California/7/2009(CA/09)と比較して、HA及びNA遺伝子セグメントの両方で配列がまちまちであった。卵馴化による配列変異が、119、124、127、191、209及び222などの複数のHA位置で認められた(表1、以下)。これらウイルスのLAIVワクチン候補の増殖を評価するために、マスタードナーウイルスA/Ann Arbor/6/60ca由来の6つの内部タンパク質遺伝子セグメントと、野生型(wt)H1N1pdmウイルス由来のHA及びNA遺伝子を含有する6:2低温適応(ca)再集合体ウイルスを、8プラスミドリバースジェネティクス系を用いて作製した。レスキューしたウイルスを孵化鶏卵中で増幅し、感染ウイルス力価を蛍光フォーカスアッセイ(FFA)アッセイにより決定した。MDCK細胞でのプラークアッセイによりプラーク形態を検定した(図1)。Bris/10wtのHA遺伝子は異種であった(表1)。CA/09とは対照的に、Bris/10caは、8.5log10FFU/mlの力価まで効率的に増殖し、MDCK細胞中に大きなプラークを形成した。HAに卵馴化変異を有する3つのHA変異体(P124L/L191I、P124L/K209E及びD127E/K209E)をNH/10wtウイルスからクローン化した。それぞれのNH/10ca変異体は、卵において様々な力価まで増殖し、異なるプラーク形態を有した。P124L/L191I変異体は、卵において低い力価を有し、MDCK細胞中でごく小さいプラークを形成した。P124L/K209E及びD127E/K209Ecaウイルスはいずれも大きなプラークを形成し、D127E/K209E変異体は、8.2log10FFU/mlの力価に達したが、これは、K209E置換が、概して効率的なウイルス増殖に寄与したことを示している。元のHA配列又は卵馴化変異を有するHA(D222N)を含むGil/11 6:2caウイルスは、プラスミドトランスフェクト細胞から回収することができなかった。相応して、D127E/K209Eを含むBris/10wt及びNH/10wt単離物は効率的に増殖したのに対し、Gil/11wtは、MDCK細胞及び卵の両方で増殖が乏しかった(データは示していない)が、これは、HA及びNA遺伝子がウイルス複製を制御したことを示している。これらの高及び低増殖ウイルスの配列比較により、125位、127位及び209位のHA残基が、卵におけるウイルス増殖に重要であり得ることが判明した。
3つの最近のH1N1pdm株、A/Brisbane/10/2010(Bris/10)、A/New Hampshire/2/2010(NH/10)及びA/Gilroy/231/2011(Gil/11)は、A/California/7/2009(CA/09)と比較して、HA及びNA遺伝子セグメントの両方で配列がまちまちであった。卵馴化による配列変異が、119、124、127、191、209及び222などの複数のHA位置で認められた(表1、以下)。これらウイルスのLAIVワクチン候補の増殖を評価するために、マスタードナーウイルスA/Ann Arbor/6/60ca由来の6つの内部タンパク質遺伝子セグメントと、野生型(wt)H1N1pdmウイルス由来のHA及びNA遺伝子を含有する6:2低温適応(ca)再集合体ウイルスを、8プラスミドリバースジェネティクス系を用いて作製した。レスキューしたウイルスを孵化鶏卵中で増幅し、感染ウイルス力価を蛍光フォーカスアッセイ(FFA)アッセイにより決定した。MDCK細胞でのプラークアッセイによりプラーク形態を検定した(図1)。Bris/10wtのHA遺伝子は異種であった(表1)。CA/09とは対照的に、Bris/10caは、8.5log10FFU/mlの力価まで効率的に増殖し、MDCK細胞中に大きなプラークを形成した。HAに卵馴化変異を有する3つのHA変異体(P124L/L191I、P124L/K209E及びD127E/K209E)をNH/10wtウイルスからクローン化した。それぞれのNH/10ca変異体は、卵において様々な力価まで増殖し、異なるプラーク形態を有した。P124L/L191I変異体は、卵において低い力価を有し、MDCK細胞中でごく小さいプラークを形成した。P124L/K209E及びD127E/K209Ecaウイルスはいずれも大きなプラークを形成し、D127E/K209E変異体は、8.2log10FFU/mlの力価に達したが、これは、K209E置換が、概して効率的なウイルス増殖に寄与したことを示している。元のHA配列又は卵馴化変異を有するHA(D222N)を含むGil/11 6:2caウイルスは、プラスミドトランスフェクト細胞から回収することができなかった。相応して、D127E/K209Eを含むBris/10wt及びNH/10wt単離物は効率的に増殖したのに対し、Gil/11wtは、MDCK細胞及び卵の両方で増殖が乏しかった(データは示していない)が、これは、HA及びNA遺伝子がウイルス複製を制御したことを示している。これらの高及び低増殖ウイルスの配列比較により、125位、127位及び209位のHA残基が、卵におけるウイルス増殖に重要であり得ることが判明した。
3.ワクチンウイルスの高い増殖を支持するHA残基の特定
元のHA配列を含む組換えCA/09caウイルスは、プラスミドDNAトランスフェクト細胞から回収されないことが事前に判明していた。受容体結合ドメインにおけるHA D222G置換により、ウイルスの回収が可能になったが、ウイルス力価は低かった。K119E及びA186D置換により、ウイルス増殖が大幅に改善し、約8.5log10FFU/mlの力価に到達した(Chen et al.,2010 J.Virol.84:44−51)。新しく特定したアミノ酸置換(N125D、D127E及びK209E)が、卵でのH1N1pdmワクチンウイルスの増殖を有利にしたことを確認するために、特定した突然変異の各々を元のCA/09HAのcDNAに個別又は組み合わせて導入した。6:2ca再集合体ウイルスをレスキューし、卵におけるその増殖について調べた(図2)。単一突然変異(N125D、D127E又はK209E)は全て、卵におけるウイルス増殖を有意に改善した。さらに、N125Dを含むウイルスは、MDCK細胞中に大きなプラークを形成した。二重突然変異は、ウイルス複製をさらに改善し、約8.3log10FFU/mlの最高力価に達したが、これは、ウイルス力価及びプラークサイズにおいてBris/10と同等であった(図1)。従って、K119E及びA186Dに加えて、本発明者らが事前に特定したHAでの置換、すなわちN125D、D127E及びK209E置換も、ワクチンウイルス増殖を大幅に促進した。
元のHA配列を含む組換えCA/09caウイルスは、プラスミドDNAトランスフェクト細胞から回収されないことが事前に判明していた。受容体結合ドメインにおけるHA D222G置換により、ウイルスの回収が可能になったが、ウイルス力価は低かった。K119E及びA186D置換により、ウイルス増殖が大幅に改善し、約8.5log10FFU/mlの力価に到達した(Chen et al.,2010 J.Virol.84:44−51)。新しく特定したアミノ酸置換(N125D、D127E及びK209E)が、卵でのH1N1pdmワクチンウイルスの増殖を有利にしたことを確認するために、特定した突然変異の各々を元のCA/09HAのcDNAに個別又は組み合わせて導入した。6:2ca再集合体ウイルスをレスキューし、卵におけるその増殖について調べた(図2)。単一突然変異(N125D、D127E又はK209E)は全て、卵におけるウイルス増殖を有意に改善した。さらに、N125Dを含むウイルスは、MDCK細胞中に大きなプラークを形成した。二重突然変異は、ウイルス複製をさらに改善し、約8.3log10FFU/mlの最高力価に達したが、これは、ウイルス力価及びプラークサイズにおいてBris/10と同等であった(図1)。従って、K119E及びA186Dに加えて、本発明者らが事前に特定したHAでの置換、すなわちN125D、D127E及びK209E置換も、ワクチンウイルス増殖を大幅に促進した。
4.Gil/11の高い増殖のためにHA及びNAの両方が必要であった
HAの125位、127位及び209位での置換が、卵におけるGil/11caウイルス増殖も改善することができるかどうかを決定するために、単一又は二重HA突然変異をGil/11caウイルスに導入した(図3A、左列)。全てのHA変異体をレスキューしたが、これらは全て、ごく小さいか、又は小さいプラークを形成し(図3B、上パネル)、感染力価も6.5〜7.7log10FFU/mlと低かった。これらのデータは、HAの変異が、Gil/11caウイルスの増殖を完全に改善することはできないことを示唆していた。
HAの125位、127位及び209位での置換が、卵におけるGil/11caウイルス増殖も改善することができるかどうかを決定するために、単一又は二重HA突然変異をGil/11caウイルスに導入した(図3A、左列)。全てのHA変異体をレスキューしたが、これらは全て、ごく小さいか、又は小さいプラークを形成し(図3B、上パネル)、感染力価も6.5〜7.7log10FFU/mlと低かった。これらのデータは、HAの変異が、Gil/11caウイルスの増殖を完全に改善することはできないことを示唆していた。
NAタンパク質のウイルス増殖に対する考えられる寄与を評価するために、これらGil/11caHA変異体のNAセグメントを、リバースジェネティクスによりBris/10NAで置換し、Bris/10からのNAセグメントを含む、回収したGil/11caHA変異体を卵におけるそれらの増殖について調べた。CA/09NAによるGil/11HAの置換によって、ウイルス増殖が同様に改善した(データは示していない)。HAにおけるN125D/D127E二重突然変異及びBris/10NAを含有するGil/11ca変異体は、卵において最高力価(8.2log10FFU/ml)まで増殖し、大きなプラークを形成した。これらのデータは、HA及びNAタンパク質の両方が、卵及びMDCK細胞におけるウイルス増殖に寄与することを明らかにするものであり、また、Gil/11ウイルスのHA受容体結合及びNA受容体切断機能が、宿主細胞でのウイルス複製から十分に均衡していないことを意味した。
MUN基質を用いて、Gil/11及びBris/10NA酵素活性に有意な差が検出されなかったことは注目に値する(データは示していない)。
5.卵におけるGil/11caウイルスの効率的な増殖に寄与するNA残基の特定
配列比較により、Gil/11が、CA/09及びBris/10のNAと比較して、44位、222位、241位、369位及び443位(N1番号付与)に5つのユニークなNA残基を有することがわかった(表2)。これらのNAアミノ酸置換のいずれかが、Gil/11caの低い増殖の原因であるのかどうかを確認するために、S44N、S222N、I241V、K369N及びM443I置換をGil/11(HA中のN125D/D127)caウイルスに導入した。図4に示すように、S222N、I241V及びK369N(それぞれ、N2番号221、241、及び369に対応する)は、卵におけるウイルス増殖を改善した。K369N置換が最も重要であり、これは、ウイルス力価を0.5log10FFU/ml増加し、ウイルスプラークサイズを改善した。S44N及びM443I置換は、ウイルス増殖に影響を与えなかった(データは示していない)。二重突然変異は、単一突然変異と比較して、ウイルス増殖に追加的作用を及ぼさなかった。しかし、NA残基222、241及び369に変異を有する三重NA突然変異体は、最高力価が8.3log10FFU/mlで、しかも大きなプラーク形態を有し、Brisbane NAを有するウイルスと同等であった。従って、HAタンパク質だけではなく、NAも、Gil/11caの乏しい増殖の原因であった。
配列比較により、Gil/11が、CA/09及びBris/10のNAと比較して、44位、222位、241位、369位及び443位(N1番号付与)に5つのユニークなNA残基を有することがわかった(表2)。これらのNAアミノ酸置換のいずれかが、Gil/11caの低い増殖の原因であるのかどうかを確認するために、S44N、S222N、I241V、K369N及びM443I置換をGil/11(HA中のN125D/D127)caウイルスに導入した。図4に示すように、S222N、I241V及びK369N(それぞれ、N2番号221、241、及び369に対応する)は、卵におけるウイルス増殖を改善した。K369N置換が最も重要であり、これは、ウイルス力価を0.5log10FFU/ml増加し、ウイルスプラークサイズを改善した。S44N及びM443I置換は、ウイルス増殖に影響を与えなかった(データは示していない)。二重突然変異は、単一突然変異と比較して、ウイルス増殖に追加的作用を及ぼさなかった。しかし、NA残基222、241及び369に変異を有する三重NA突然変異体は、最高力価が8.3log10FFU/mlで、しかも大きなプラーク形態を有し、Brisbane NAを有するウイルスと同等であった。従って、HAタンパク質だけではなく、NAも、Gil/11caの乏しい増殖の原因であった。
6.ウイルス免疫原性及び抗原性に対するHA残基の作用
上記の高増殖ca変異体におけるHA変異が、ウイルス抗原性及び免疫原性に影響を与えるかどうかを評価するために、Bris/10、HAにD127E/K209Eを含むNH/10(NH/10 v1)並びにHA中のN125D/D127E及びBris/10 NAを含むGil/11(Gil/11 v1)caウイルスをフェレットにおけるその免疫原性及び抗原性について調べた。フェレットに、前述のワクチン候補7.0log10FFUを接種し、第14日にフェレットの血清を採取した。相同性及び異種H1N1pdmウイルスに対する抗体力価をHAIアッセイにより評価した(表3)。Bris/10、NH/10及びGil/11caウイルスは全て、免疫原性であり、相同性ウイルスに対して高いHAI抗体力価(912〜2048)を誘導した。既存のCA/09LAIVと同様に、これらは全て、H1N1pdm wtウイルス及び異種ウイルスと交差反応した(HAI力価は、相同性力価と比較して4倍以内であった)。例えば、HA N125/D127E含有ウイルス(Bris/10及びGil/11)で免疫したフェレット血清は、HA D127E/K209E(NH/10v1及びGil/11v2)又はHA P124L/L191I(NH/10v2)を含有するウイルスと良好に交差反応した。従って、Gil/11及びNH/10両方のHAにおけるN125D/D127E又はD127E/K209E置換は、ウイルス抗原性を改変しなかったが、これらの新しい株、Bris/10、NH/10及びGil/11は、H1N1pdmワクチンとして作用することができる。
上記の高増殖ca変異体におけるHA変異が、ウイルス抗原性及び免疫原性に影響を与えるかどうかを評価するために、Bris/10、HAにD127E/K209Eを含むNH/10(NH/10 v1)並びにHA中のN125D/D127E及びBris/10 NAを含むGil/11(Gil/11 v1)caウイルスをフェレットにおけるその免疫原性及び抗原性について調べた。フェレットに、前述のワクチン候補7.0log10FFUを接種し、第14日にフェレットの血清を採取した。相同性及び異種H1N1pdmウイルスに対する抗体力価をHAIアッセイにより評価した(表3)。Bris/10、NH/10及びGil/11caウイルスは全て、免疫原性であり、相同性ウイルスに対して高いHAI抗体力価(912〜2048)を誘導した。既存のCA/09LAIVと同様に、これらは全て、H1N1pdm wtウイルス及び異種ウイルスと交差反応した(HAI力価は、相同性力価と比較して4倍以内であった)。例えば、HA N125/D127E含有ウイルス(Bris/10及びGil/11)で免疫したフェレット血清は、HA D127E/K209E(NH/10v1及びGil/11v2)又はHA P124L/L191I(NH/10v2)を含有するウイルスと良好に交差反応した。従って、Gil/11及びNH/10両方のHAにおけるN125D/D127E又はD127E/K209E置換は、ウイルス抗原性を改変しなかったが、これらの新しい株、Bris/10、NH/10及びGil/11は、H1N1pdmワクチンとして作用することができる。
7.HA及びNA置換は、感染細胞からのウイルス放出を促進することにより、ウイルス増殖を改善する
ワクチンウイルス増殖を改善するもので、特定されたHAアミノ酸は全て、酸性アミノ酸置換(K119E、A186D、N125D、及びK209E)を含有した。ウイルス複製に対するこれら残基の影響を調べるために、酸性残基変異を含む、又は含まないウイルスのペアを、MDCK細胞におけるそれらの増殖動態について比較した。低増殖ウイルスCA09−D127E(125N)対高増殖ウイルスCA09−N125D/D127E(125D)を図5Aに示す。125Nウイルスは、高MOI及び低MOIの両方で、125Dウイルスより低い複製動態を呈示したが、これは、125Nウイルスの多周期複製が損なわれたことを示している。MOI:5(16hpi)又はMOI:0.005(48hpi)での125Dウイルスのピーク力価は、125Nウイルスより約2log高かった。
ワクチンウイルス増殖を改善するもので、特定されたHAアミノ酸は全て、酸性アミノ酸置換(K119E、A186D、N125D、及びK209E)を含有した。ウイルス複製に対するこれら残基の影響を調べるために、酸性残基変異を含む、又は含まないウイルスのペアを、MDCK細胞におけるそれらの増殖動態について比較した。低増殖ウイルスCA09−D127E(125N)対高増殖ウイルスCA09−N125D/D127E(125D)を図5Aに示す。125Nウイルスは、高MOI及び低MOIの両方で、125Dウイルスより低い複製動態を呈示したが、これは、125Nウイルスの多周期複製が損なわれたことを示している。MOI:5(16hpi)又はMOI:0.005(48hpi)での125Dウイルスのピーク力価は、125Nウイルスより約2log高かった。
様々な時点での感染細胞及び培養上清中のウイルスタンパク質レベルをウエスタンブロットにより調べた(図5B)。125N及び125Dウイルスは、感染から8〜16時間後、感染細胞中に同等量のウイルスタンパク質を産生した。しかし、ウイルスタンパク質レベルにより検出されるように、125Nウイルスに感染した細胞の上清中に放出されたウイルス粒子の量は、高増殖125Dウイルスよりはるかに低かった。データから、低増殖ウイルスは、細胞に侵入して、RNA転写及びタンパク質合成を効率的に開始することができるが、感染細胞からのウイルス放出が効率的ではないため、貧弱なウイルス拡散又は多周期複製となることがわかった。これらは、MDCK細胞における小さなウイルスプラーク、並びに卵及びMDCK細胞での低力価に表されている。
低MOIでのウイルス拡散における2つのウイルスの差異を免疫蛍光により確認した(図5C)。MOI:0.005で、いずれのウイルスについても感染から15時間後に、同等の割合の細胞が感染した。感染から48時間後、大部分の細胞が125Dウイルスに感染した;しかし、わずかな割合の細胞しか125Nウイルスに感染しなかった。CA/09(D222G)とCA/09(D222G)−K119E/A186Dなどの他のウイルスペアでも同様の結果が得られ、HAでの酸性残基変異が、細胞からのウイルスの放出を容易にしたことを示している。
MDCK細胞におけるウイルス複製に対するNAの作用を調べるために、Gil/11NA又はBris/10NAを含有するGil/11caウイルスも、感染細胞におけるウイルスタンパク質発現について比較した(図6)。同様に、2つのウイルスは、感染細胞において同様のタンパク質発現を示したが、Gil/11NAを含むウイルスは、Bris/10NAを含むウイルスと比較して、非効率なウイルス拡散を有した。
8.ウイルス増殖を改善するHA及びNA置換の構造的状況
全体として、HA N125D/D127E及びD127E/K209E馴化部位が、A/Brisbane/10/2010及びA/New Hampshire/2/2010インフルエンザ株の高増殖の原因であることが明らかになった。異種CA/09caウイルスHAへの上記置換の導入は、その貧弱な増殖を回復させることができた。HA残基125は、抗原性Saドメインに位置し、受容体結合部位(RBS)に隣接している(図7A)。HA N125Dを含有するA/Brisbane/10/2010様ウイルスは、卵において高い増殖を示した。H1 HA N125D置換を有するA/Brisbane/10/2010様ウイルスは、Southern Hemisphereからの臨床分離株において2010年4月下旬に初めて検出された(Barr et al.,2010 Euro Surveill.15:pii:19692,26)。Brisbane様株は、より初期のA/California/09株と抗原性は大きく変わらなかったが、これらは、ワクチンブレイクスルー感染に関連しており、複数の死亡症例で認められている(Barr et al.,2010 Euro Surveill.15:pii:19692;Strengell et al.,2011 PLoS One 6:e25848)。A/New Hampshire/2/2010におけるD127E又はK209E置換は、卵馴化から起こった。HA 127及び209の変異は、他の流行H1インフルエンザAウイルスにおいて、又はマウスでの馴化後に検出されている(Chen et al.,2011 Virology 412:401−410;Robertson et al.,2011 Vaccine 29:1836−1843)。これらの残基は、球状頭部の表面上に位置する(図7A)。D127Eを含むHAを有するマウス馴化A/CA/04は、マウスにおいてより毒性の高い表現型に関連していることが判明した(Ye et al.,2010 PLoS Pathog.6:e1001145)。209残基は、HA三量体において隣接するモノマー中のRBSから比較的離れている。不活性化インフルエンザワクチン用のいくつかの高収率再集合体において、K209T置換が報告されているが、単一のK209T置換は、ワクチン収率を大きく改善しなかった(Robertson et al.,2011 Vaccine 29:1836−1843)。
全体として、HA N125D/D127E及びD127E/K209E馴化部位が、A/Brisbane/10/2010及びA/New Hampshire/2/2010インフルエンザ株の高増殖の原因であることが明らかになった。異種CA/09caウイルスHAへの上記置換の導入は、その貧弱な増殖を回復させることができた。HA残基125は、抗原性Saドメインに位置し、受容体結合部位(RBS)に隣接している(図7A)。HA N125Dを含有するA/Brisbane/10/2010様ウイルスは、卵において高い増殖を示した。H1 HA N125D置換を有するA/Brisbane/10/2010様ウイルスは、Southern Hemisphereからの臨床分離株において2010年4月下旬に初めて検出された(Barr et al.,2010 Euro Surveill.15:pii:19692,26)。Brisbane様株は、より初期のA/California/09株と抗原性は大きく変わらなかったが、これらは、ワクチンブレイクスルー感染に関連しており、複数の死亡症例で認められている(Barr et al.,2010 Euro Surveill.15:pii:19692;Strengell et al.,2011 PLoS One 6:e25848)。A/New Hampshire/2/2010におけるD127E又はK209E置換は、卵馴化から起こった。HA 127及び209の変異は、他の流行H1インフルエンザAウイルスにおいて、又はマウスでの馴化後に検出されている(Chen et al.,2011 Virology 412:401−410;Robertson et al.,2011 Vaccine 29:1836−1843)。これらの残基は、球状頭部の表面上に位置する(図7A)。D127Eを含むHAを有するマウス馴化A/CA/04は、マウスにおいてより毒性の高い表現型に関連していることが判明した(Ye et al.,2010 PLoS Pathog.6:e1001145)。209残基は、HA三量体において隣接するモノマー中のRBSから比較的離れている。不活性化インフルエンザワクチン用のいくつかの高収率再集合体において、K209T置換が報告されているが、単一のK209T置換は、ワクチン収率を大きく改善しなかった(Robertson et al.,2011 Vaccine 29:1836−1843)。
卵でのワクチンウイルス増殖に寄与したNAにおける遺伝子シグネチャーは、S222N、I241V、K369Nを個別に、又は組み合わせて含んだ。A/Gilroy/231/2011は、HA及びNAタンパク質が改変されると特に良好に増殖した。222、241及び369位のアミノ酸(それぞれ、N2番号221、240及び372に対応する)は、Gil/11の貧弱な増殖の主な原因であった。これらの3つの残基は全て、NA触媒部位周辺に位置する(図7B)。369残基は、保存的触媒部位R371に近接しており、369及び222の両方が、抗原性表面上に位置する(Colman et al.,1989 P.175−218.In R.Krug(ed.),The Influenza Viruses.Plenum Press,New York;Li et al.,2010 Nat Struct Mol Biol.17:1266−1268)。Gil/11NAのK369及びI241は、以前のヒト季節性H1N1株に保存され、最新型2011/2012H1N1pdm株は、K369及びI241を含有しており、これは、新型H1N1pdm株のNAが、ヒトに適応している可能性があることを示唆している(Soundararajan et al.,2009 Nat Biotechnol.:6)。
9.論考
特定の理論に束縛されるわけではないが、受容体結合部位周辺のHA残基置換は、卵又はMDCK細胞における受容体結合に有利に働き、HAでの酸性表面変異は、感染細胞からのウイルス増殖をさらに促進して、効率的な多周期複製を開始すると考えられる。以前の研究(Chen et al.,2010 J. Virol.84:44−51)と、本発明に記載する実施例とを合わせると、HAにおけるD222G、A186D、N125D、D127E及びK209Eのアミノ酸置換は、卵又はMDCK細胞におけるウイルス増殖を大幅に改善することが明らかである。これらの置換の大部分は、酸性残基置換である。これらの陰荷電残基は、ウエスタンブロット及び免疫蛍光アッセイによって立証されるように、陰荷電シアル酸受容体又は細胞膜の反発を引き起こし、ウイルスの侵入及びウイルスのタンパク質合成に影響することなく、MDCK細胞からのウイルス粒子放出を増加する。
特定の理論に束縛されるわけではないが、受容体結合部位周辺のHA残基置換は、卵又はMDCK細胞における受容体結合に有利に働き、HAでの酸性表面変異は、感染細胞からのウイルス増殖をさらに促進して、効率的な多周期複製を開始すると考えられる。以前の研究(Chen et al.,2010 J. Virol.84:44−51)と、本発明に記載する実施例とを合わせると、HAにおけるD222G、A186D、N125D、D127E及びK209Eのアミノ酸置換は、卵又はMDCK細胞におけるウイルス増殖を大幅に改善することが明らかである。これらの置換の大部分は、酸性残基置換である。これらの陰荷電残基は、ウエスタンブロット及び免疫蛍光アッセイによって立証されるように、陰荷電シアル酸受容体又は細胞膜の反発を引き起こし、ウイルスの侵入及びウイルスのタンパク質合成に影響することなく、MDCK細胞からのウイルス粒子放出を増加する。
また、卵馴化によるHAの変異が、ウイルスとα2,3−連結シアル酸の結合を増大させ、卵におけるウイルス増殖を改善したこと(Nicolson et al.,2012 Vaccine 30:745−751;Robertson et al.,2011 Vaccine 29:1836−1843;Suphaphiphat et al.,2011 Virol J.7:157);D222G変異が、ウイルスとα2,3−連結シアル酸の結合を増大させたこと(Chen et al.,2010 J.Virol.84:44−51;Chutinimitkul et al.,2010 J.Virol.84:11802−11813)も仮定されている。しかし、再シアル化赤血球を用いた受容体結合アッセイにより、N125D、D127E及びK209E変異を有するウイルスは、ほとんどが、他のグリカン結合受容体と一致するα2,6−連結シアル酸受容体と結合したままである(データは示していない)ことが判明した(Bradley et al,2011,Virology 413:169−182;Chen et al.,2011 Virology 412:401−410;Xu et al.,2012 J Virol.86:982−990)。恐らく、既存のin vitro方法では、これらの変異により起こった受容体結合の差を検出することができなかったのであろう。
以上、本発明を、明瞭化及び理解を目的としてある程度詳細に説明してきたが、本開示を読めば、本発明の範囲を逸脱することなく、形態及び詳細事項に様々な変更を実施できることが当業者には明らかであろう。例えば、上に記載した全ての技術及び装置は、多様に組み合わせて用いてもよい。本出願に引用する刊行物、特許、特許出願、又はその他の文献は、あたかも個々の刊行物、特許、特許出願、又はその他の文献が各々、あらゆる目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同じ程度まで、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれるものとする。
配列表
配列番号1は、A/California/07/09由来のHAポリペプチドのアミノ酸配列を示す。ここで、125位のX=N又はD;127位のX=D又はE;209位のX=K又はE。
配列番号1は、A/California/07/09由来のHAポリペプチドのアミノ酸配列を示す。ここで、125位のX=N又はD;127位のX=D又はE;209位のX=K又はE。
配列番号2は、A/Brisbane/10/10由来のHAポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号3は、A/New Hampshire/2/10由来のHAポリペプチドのアミノ酸配列を示す。ここで、124位のX=P又はL;125位のX=N又はD;209位のX=K又はE。
配列番号4は、A/Gilroy/231/11由来のHAポリペプチドのアミノ酸配列を示す。ここで、125位のX=N又はD;127位のX=D又はE;209位のX=K又はE。
配列番号5は、A/California/07/09由来のNAポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号6は、A/New Hampshire/2/10由来のNAポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号7は、A/Brisbane/10/10由来のNAポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号8は、A/Gilroy/231/11由来のNAポリペプチドのアミノ酸配列を示す。ここで、222位のX=S又はN;241位のX=I又はV;369位のX=K又はN。
配列番号9は、A/CA/07/09由来のHAポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号10は、A/Brisbane/10/10由来のHAをコードする核酸配列を示す。
配列番号11は、A/New Hampshire/2/10由来のHAポリペプチドをコードする核酸配列を示す。
配列番号12は、A/Gilroy/231/11由来のHAポリペプチドをコードする核酸配列を示す。
配列番号13は、A/Brisbane/10/10由来のNAポリペプチドをコードする核酸配列を示す。
配列番号14は、A/New Hampshire/2/10由来のNAポリペプチドをコードする核酸配列を示す。
配列番号15は、A/Gilroy_/231/11由来のNAポリペプチドをコードする核酸配列を示す。
配列番号16は、A/California/07/09由来のNAポリペプチドをコードする核酸配列を示す。
配列
A/California/07/09HA
(配列番号1、ここで、125位のX=N;127位のX=D;209位のX=K)
A/Brisbane/10/10HA(配列番号2)
A/New Hampshire/2/10HA
(配列番号3、ここで、124位のX=P;125位のX=N;209位のX=K)
A/Gilroy/231/11HA
(配列番号4、ここで、125位のX=N;127位のX=D;209位のX=K)
A/California/07/09NA(配列番号5)
A/New Hampshire/2/10NA(配列番号6)
A/Brisbane/10/10NA(配列番号7)
A/Gilroy/231/11NA
(配列番号8、ここで、222位のX=S;241位のX=I;369位のX=K)
A/CA/07/09HA(配列番号9)
A/Brisbane/10/10HA(配列番号10)
A/NewHampshire/2/10HA(配列番号11)
A/Gilroy/231/11HA(配列番号12)
A/Brisbane/10/10NA(配列番号13)
A/NewHampshire/2/10_NA(配列番号14)
A/Gilroy/231/11HA(配列番号15)
A/California/07/09_NA(配列番号16)
A/California/07/09HA
(配列番号1、ここで、125位のX=N;127位のX=D;209位のX=K)
(配列番号3、ここで、124位のX=P;125位のX=N;209位のX=K)
(配列番号4、ここで、125位のX=N;127位のX=D;209位のX=K)
(配列番号8、ここで、222位のX=S;241位のX=I;369位のX=K)
Claims (21)
- ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第1ゲノムセグメントを含む組換え再集合体インフルエンザウイルスであって、前記ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号1、配列番号3、又は配列番号4に示すアミノ酸配列を含む、組換え再集合体インフルエンザウイルス。
- ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第1ゲノムセグメントを含む組換え再集合体インフルエンザウイルスであって、前記ヘマグルチニンポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基124位のロイシン;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシン、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、組換え再集合体インフルエンザウイルス。 - ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第2ゲノムセグメントをさらに含み、前記ノイラミニダーゼポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基222位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリン;又は
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、請求項1又は2に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。 - 弱毒化、温度感受性、及び低温適応の1つ又は複数の表現型特徴を有するインフルエンザウイルスの6つの内部ゲノムセグメントをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
- 前記ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号1に示す前記アミノ酸配列を含み、
アミノ酸残基125位が、アスパラギン酸であり;かつ
アミノ酸残基127位が、グルタミン酸であり;かつ
アミノ酸残基209位が、グルタミン酸である
請求項1〜4のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。 - 前記ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号3に示す前記アミノ酸配列を含み、
アミノ酸残基125位が、アスパラギン酸であり;かつ
アミノ酸残基127位が、グルタミン酸であり;かつ
アミノ酸残基209位が、グルタミン酸である、
請求項1〜4のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。 - 前記ヘマグルチニンポリペプチドが、配列番号4に示す前記アミノ酸配列を含み、
アミノ酸残基125位が、アスパラギン酸であり;かつ
アミノ酸残基127位が、グルタミン酸であり;かつ
アミノ酸残基209位が、グルタミン酸である、
請求項1〜4のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。 - 前記ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号8に示すアミノ酸配列を含み、
アミノ酸残基222位が、アスパラギンであり;かつ
アミノ酸残基241位が、バリンであり;かつ
アミノ酸残基369位が、アスパラギンである、
請求項1〜7のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。 - 前記6つの内部ゲノムセグメントが、インフルエンザウイルスA/Ann Arbor/6/60由来のものである、請求項5〜8のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
- 前記6つの内部ゲノムセグメントが、インフルエンザウイルスA/Puerto Rico/8/34由来のものである、請求項5〜8のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
- 前記再集合体インフルエンザウイルスが、不活性化されている、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
- 前記再集合体インフルエンザウイルスが、生弱毒化されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組換え再集合体インフルエンザウイルス。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の組換えインフルエンザウイルスを含む、免疫原性組成物。
- H3N2インフルエンザA株HA及びNA抗原を含む組換えインフルエンザウイルス、山形(Yamagata)インフルエンザB株HA及びNA抗原を含む組換えインフルエンザウイルス、並びにビクトリア(Victoria)インフルエンザB株HA及びNA抗原を含む組換えインフルエンザウイルスを含む、請求項13に記載の免疫原性組成物。
- 組換えインフルエンザウイルスを製造する方法であって、以下:
(a)インフルエンザウイルスの複製を支持することができる宿主細胞の集団に複数のベクターを導入するが、これら複数のベクターは、第1インフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントと、配列番号1、配列番号3、又は配列番号4に示すアミノ酸配列を含むヘマグルチニンポリペプチドをコードする第1ゲノムセグメントとを含む、ステップ;
(b)前記宿主細胞の集団を培養して、前記組換え再集合体インフルエンザウイルスを増幅するステップ;及び
(c)前記宿主細胞の集団から前記組換え再集合体インフルエンザウイルスを回収するステップ
を含む方法。 - 前記配列番号1のアミノ酸配列を含む前記ヘマグルチニンポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、請求項15に記載の方法。 - 前記配列番号3のアミノ酸配列を含む前記ヘマグルチニンポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基124位のロイシン;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシンとアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基124位のロイシン、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、請求項15に記載の方法。 - 配列番号4の前記アミノ酸配列を含む前記ヘマグルチニンポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基127位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基127位のグルタミン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸とアミノ酸残基209位のグルタミン酸;又は
アミノ酸残基125位のアスパラギン酸、アミノ酸残基127位のグルタミン酸、及びアミノ酸残基209位のグルタミン酸
を含む、請求項15に記載の方法。 - ステップ(a)の前記複数のベクターが、配列番号5、又は配列番号7、又は配列番号8のアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第2ゲノムセグメントを含む、請求項15〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ノイラミニダーゼポリペプチドが、配列番号8の前記アミノ酸を含む、請求項19に記載の方法。
- 配列番号8に示す前記ノイラミニダーゼポリペプチドが、以下:
アミノ酸残基222位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリン;又は
アミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基241位のバリンとアミノ酸残基369位のアスパラギン;又は
アミノ酸残基222位のアスパラギン、アミノ酸残基241位のバリン、及びアミノ酸残基369位のアスパラギン
を含む、請求項20に記載の方法。
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