JP2016152789A - Evaluation methods of test substance and hypotonic stimulation inhibitors - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、被験物質の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、化粧料などの外用剤の開発などに有用な被験物質の評価方法および低浸透圧刺激抑制剤に関する。 The present invention relates to a test substance evaluation method. More specifically, the present invention relates to a test substance evaluation method and a hypoosmotic stimulus inhibitor useful for development of external preparations such as cosmetics.
化粧料などの外用剤を使用する際に、当該外用剤が誤って眼、口などに混入した場合、不快な感覚刺激が引き起こされることがある。前記不快な感覚刺激は、細胞内液の浸透圧に比べて外用剤の浸透圧が低い場合、細胞外の水などの溶媒が細胞内へ移動して細胞が膨張することによって引き起こされると考えられている。 When using an external preparation such as cosmetics, if the external preparation is mistakenly mixed into the eyes, mouth, etc., unpleasant sensory stimulation may be caused. When the osmotic pressure of the external preparation is lower than the osmotic pressure of the intracellular fluid, the unpleasant sensory stimulus is considered to be caused by the expansion of the cell by the movement of a solvent such as extracellular water into the cell. ing.
近年、使用者の安全意識の高まりに伴い、不快な感覚刺激を与えない外用剤が好まれる傾向にあることから、前記外用剤は、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧によって引き起こされる感覚刺激を与えないか、または当該感覚刺激が少ないことが望ましい。したがって、前記低浸透圧によって引き起こされる感覚刺激を抑制する低浸透圧刺激抑制作用を有する物質が求められている。 In recent years, with the increase in safety awareness of users, external preparations that do not give unpleasant sensory stimulation tend to be preferred, so that the external preparations have low osmotic pressure that is lower than the osmotic pressure of intracellular fluids. It is desirable not to apply sensory stimulation caused by pressure or to reduce the sensory stimulation. Therefore, there is a demand for a substance having a low osmotic pressure suppression effect that suppresses sensory stimulation caused by the low osmotic pressure.
被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価する場合、例えば、ヒトに眼、口などにおける感覚刺激を抑制するかどうかを評価させる方法などを行なうことが考えられる。しかし、前記方法は、ヒトに多大な負荷がかかり、しかも評価結果がヒトによって左右されることから、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を再現性よく的確に評価することが困難であるという欠点を有する。 When evaluating the low osmotic pressure suppression effect of the test substance, for example, a method of allowing a human to evaluate whether or not to suppress sensory stimulation in the eyes, mouth, etc. can be considered. However, the above method takes a great burden on humans, and the evaluation results depend on humans. Therefore, it is difficult to accurately evaluate the hypoosmotic stimulus suppressing action of the test substance with good reproducibility. Has drawbacks.
ところで、一過性受容体電位チャネルの１つであるＴＲＰＡ１は、パラベン類、アルカリ剤などによって活性化し、活性化されたＴＲＰＡ１を介して不快な刺激を引き起こすことが、本発明者らによって見出されている（例えば、特許文献１〜４参照）。 By the way, the present inventors have found that TRPA1, which is one of the transient receptor potential channels, is activated by parabens, alkaline agents and the like, and causes unpleasant stimulation via the activated TRPA1. (For example, see Patent Documents 1 to 4).
しかしながら、本発明者らは、現時点では、低浸透圧液によって生じる不快な感覚刺激とＴＲＰＡ１との関連性や、前記関連性を利用して、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価する方法を具体的に記載した文献を発見していない。 However, at the present time, the present inventors evaluate the low osmotic pressure stimulus-suppressing action of the test substance using the relation between the unpleasant sensory stimulus generated by the low osmotic pressure liquid and TRPA1 and the relation. We have not found any literature specifically describing the method.
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を再現性よく的確に評価することができる、被験物質の評価方法および低浸透圧液によって生じる不快な感覚刺激を効果的に抑制することができる低浸透圧刺激抑制剤を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above-described prior art, and is caused by a test substance evaluation method and a low osmotic pressure solution capable of accurately and accurately evaluating the low osmotic pressure suppression effect of a test substance. An object of the present invention is to provide a hypoosmotic stimulus inhibitor capable of effectively suppressing unpleasant sensory stimulation.
すなわち、本発明の要旨は、
（１）被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価する被験物質の評価方法であって、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液と前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価することを特徴とする被験物質の評価方法、
（２）前記低浸透圧液が、前記細胞内液の浸透圧よりも４０〜２００ｍＯｓｍ低い浸透圧を有する前記（１）に記載の方法、
（３）前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象が、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる前記ＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加である前記（１）または（２）に記載の方法、ならびに
（４）細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によって引き起こされる感覚刺激を抑制するための低浸透圧刺激抑制剤であって、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の被験物質の評価方法により、低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価された物質を有効成分として含有することを特徴とする低浸透圧刺激抑制剤
に関する。
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) A test substance evaluation method for evaluating a hypoosmotic stimulus suppressing action of a test substance, wherein the test substance has a low osmotic pressure having an osmotic pressure lower than the osmotic pressure of an intracellular fluid of a TRPA1-expressing cell. And the TRPA1-expressing cells are contacted to measure a physiological event caused by the low osmotic pressure solution via TRPA1, and based on the physiological event, the hypoosmotic pressure suppression action of the test substance is evaluated. A method for evaluating a test substance,
(2) The method according to (1), wherein the low osmotic pressure liquid has an osmotic pressure 40 to 200 mOsm lower than the osmotic pressure of the intracellular fluid,
(3) The physiological event triggered by TRPA1 by the hypotonic solution is an increase in calcium ion concentration in the TRPA1-expressing cell caused by TRPA1 by the hypotonic solution or (1) or The method according to (2), and (4) a hypoosmotic stimulus inhibitor for suppressing sensory stimulation caused by a hypotonic solution having an osmotic pressure lower than the osmotic pressure of intracellular fluid, A hypoosmotic stimulus inhibitor characterized by containing, as an active ingredient, a substance evaluated as having a hypoosmotic stimulus inhibiting action by the test substance evaluation method according to any one of (1) to (3) About.
本発明の被験物質の評価方法は、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を再現性よく的確に評価することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の低浸透圧刺激抑制剤は、低浸透圧液によって生じる不快な感覚刺激を効果的に抑制することができるという優れた効果を奏する。 The test substance evaluation method of the present invention has an excellent effect that the hypoosmotic stimulus suppressing action of the test substance can be accurately evaluated with good reproducibility. Moreover, the low osmotic pressure stimulus suppressant of the present invention has an excellent effect of being able to effectively suppress unpleasant sensory stimulation caused by the low osmotic pressure solution.
１．被験物質の評価方法
本発明の被験物質の評価方法は、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価する被験物質の評価方法であって、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液と前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ（すなわち、低浸透圧液中で前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ）、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価することを特徴とする。
1. Test substance evaluation method The test substance evaluation method of the present invention is a test substance evaluation method for evaluating the hypoosmotic stimulus suppressing action of a test substance, which is lower than the osmotic pressure of an intracellular fluid of a TRPA1-expressing cell. A low osmotic pressure solution having osmotic pressure, the test substance and the TRPA1-expressing cells are contacted (that is, the test substance and the TRPA1-expressing cells are contacted in the low osmotic pressure liquid), It is characterized in that a physiological event caused through TRPA1 is measured, and based on the physiological event, the hypoosmotic stimulus suppressing action of the test substance is evaluated.
なお、本明細書において、「低浸透圧刺激抑制作用」とは、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によって引き起こされる感覚刺激を抑制する作用をいう。以下、「細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によって引き起こされる感覚刺激」を「低浸透圧刺激」ともいう。 In the present specification, the “low osmotic pressure stimulus suppressing action” refers to an action of suppressing sensory stimulation caused by a low osmotic pressure liquid having an osmotic pressure lower than that of intracellular fluid. Hereinafter, “sensory stimulation caused by a low osmotic pressure solution having an osmotic pressure lower than that of intracellular fluid” is also referred to as “low osmotic pressure stimulation”.
本発明の被験物質の評価方法は、前記低浸透圧液と前記被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞とを、前記低浸透圧液と前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物の浸透圧が細胞内液の浸透圧よりも低くなるように調整して接触させ、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価するという操作が行なわれている点に１つの大きな特徴を有する。前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１が活性化されることおよび前記ＴＲＰＡ１発現細胞において、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象は、低浸透圧刺激と関連していることが本発明者らによって見出されている。したがって、前記被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用は、前記低浸透圧液と前記被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときにＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象と関連している。したがって、本発明の被験物質の評価方法によれば、前記操作が行なわれているので、被験者を用いなくてもよいことから、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を的確に評価することができる。また、本発明の被験物質の評価方法によれば、前記被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価する際に、前記ＴＲＰＡ１発現細胞を用い、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定しているので、同一条件下に同時に何回も並行して評価を行なうことができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法によれば、評価結果にバラつきが生じやすい被験者に評価させる方法と比べ、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を再現性よく評価することができる。 According to the test substance evaluation method of the present invention, the osmotic pressure of the mixture containing the low osmotic pressure liquid, the test substance and the TRPA1-expressing cell, and the low osmotic pressure liquid, the test substance and the TRPA1-expressing cell is intracellular. The osmotic pressure of the test substance is measured based on the physiological event by measuring the physiological event caused by the low osmotic pressure solution via TRPA1 and adjusting the contact to be lower than the osmotic pressure of the fluid. One significant feature is that the operation of evaluating the stimulus suppression action is performed. It is the present invention that TRPA1 is activated by the hypotonic solution and that a physiological event caused by TRPA1 in the TRPA1-expressing cell is associated with hypoosmotic stimulation. Have been found by those. Therefore, the hypoosmotic stimulus suppressing action of the test substance is related to a physiological event caused through TRPA1 when the hypoosmotic solution is brought into contact with the test substance and a TRPA1-expressing cell. Therefore, according to the test substance evaluation method of the present invention, since the above-described operation is performed, it is not necessary to use a subject, and therefore it is possible to accurately evaluate the hypoosmotic stimulus suppressing action of the test substance. it can. In addition, according to the test substance evaluation method of the present invention, when the hypoosmotic stimulus suppression action of the test substance is evaluated, the TRPA1-expressing cells are used, and the test substance is caused by the low osmotic pressure solution via TRPA1. Since the physiological event is measured, the evaluation can be performed several times in parallel under the same conditions. Therefore, according to the test substance evaluation method of the present invention, the low osmotic pressure suppression effect of the test substance can be evaluated with high reproducibility as compared with the method of allowing a test subject to easily evaluate the evaluation result.
前記被験物質としては、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記被験物質は、そのまま用いてもよく、必要に応じて、溶媒に溶解させて用いてもよい。前記溶媒は、ＴＲＰＡ１発現細胞の生育、ＴＲＰＡ１の生理学的機能の発現に影響を与えない溶媒であるのが望ましい。被験物質を溶解させる溶媒としては、例えば、エタノール、生理的食塩水、水などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 Examples of the test substance include inorganic compounds, organic compounds, plant extracts, microbial cultures, microbial extracts, and the like, but the present invention is not limited to such examples. The test substance may be used as it is, or may be used after being dissolved in a solvent, if necessary. The solvent is preferably a solvent that does not affect the growth of TRPA1-expressing cells and the physiological function of TRPA1. Examples of the solvent for dissolving the test substance include ethanol, physiological saline, and water, but the present invention is not limited to such examples.
本明細書において、特に断りのない限り、浸透圧〔ｍＯｓｍ（イオン量換算）〕は、式（Ｉ）： In this specification, unless otherwise specified, the osmotic pressure [mOsm (in terms of ion amount)] is represented by the formula (I):
〔浸透圧（ｍＯｓｍ）〕
＝〔電解質イオン量〕＋〔浸透圧調整剤量〕 （Ｉ）
[Osmotic pressure (mOsm)]
= [Amount of electrolyte ion] + [Amount of osmotic pressure adjusting agent] (I)
（式中、「電解質イオン量」は浸透圧に影響を与える電解質を構成する電解質アニオンおよび電解質カチオンそれぞれのモル数の和、「浸透圧調整剤量」は浸透圧調整剤のモル数を示す）
に基づいて算出される。
(In the formula, “electrolyte ion amount” is the sum of moles of electrolyte anions and electrolyte cations that constitute the electrolyte that affects osmotic pressure, and “osmotic pressure regulator amount” indicates the number of moles of osmotic pressure regulator.)
Is calculated based on
前記電解質としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどのハロゲン化アルカリ金属、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどのハロゲン化アルカリ土類金属などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 Examples of the electrolyte include alkali metal halides such as sodium chloride and potassium chloride, and alkaline earth metal halides such as calcium chloride and magnesium chloride, but the present invention is limited only to such examples. is not.
前記浸透圧調整剤としては、例えば、マンニトール、グルコース、スクロースなどの糖などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 Examples of the osmotic pressure adjusting agent include sugars such as mannitol, glucose, and sucrose, but the present invention is not limited to such examples.
細胞内液の浸透圧（以下、「浸透圧Ａ」ともいう）と、低浸透圧液の浸透圧（以下、「浸透圧Ｂ」ともいう）との差（浸透圧Ａ−浸透圧Ｂ）は、低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象をより確実に発生させ、低浸透圧刺激抑制作用の評価を容易に、かつ的確に行なう観点から、好ましくは４０ｍＯｓｍ（９０８ｈＰａ）以上、より好ましくは８０ｍＯｓｍ（１８１６ｈＰａ）以上であり、ＴＲＰＡ１に依存しない細胞の応答を抑制する観点から、好ましくは２００ｍＯｓｍ（４５４０ｈＰａ）以下、より好ましくは１６０ｍＯｓｍ（３６３２ｈＰａ）以下である。前記浸透圧Ｂは、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧などによって異なるので、一概には決定することができないことから、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧などに応じて適宜設定することが好ましい。例えば、ヒトの細胞の細胞内液の浸透圧は、通常、２８０〜３２０ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：６３５６〜７２６４ｈＰａ）、好ましくは３１２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：７０８２ｈＰａ）である。したがって、ＴＲＰＡ１発現細胞がヒトの細胞に由来する場合、前記低浸透圧液の浸透圧は、ＴＲＰＡ１に依存しない細胞の応答を抑制する観点から、好ましくは１００ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：２２７０ｈＰａ）以上、より好ましくは１４０ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：３１７８ｈＰａ）以上であり、低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象をより確実に発生させ、低浸透圧刺激抑制作用の評価を容易に、かつ的確に行なう観点から、好ましくは２６０ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：５９０２ｈＰａ）以下、より好ましくは２４０ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：５４４８ｈＰａ）以下である。 The difference (osmotic pressure A−osmotic pressure B) between the osmotic pressure of the intracellular fluid (hereinafter also referred to as “osmotic pressure A”) and the osmotic pressure of the low osmotic pressure liquid (hereinafter also referred to as “osmotic pressure B”) is From the viewpoint of more reliably generating a physiological event caused by TRPA1 by the low osmotic pressure solution and evaluating the low osmotic pressure stimulus suppressing action easily and accurately, preferably 40 mOsm (908 hPa) or more It is preferably 80 mOsm (1816 hPa) or more, and preferably 200 mOsm (4540 hPa) or less, more preferably 160 mOsm (3632 hPa) or less from the viewpoint of suppressing the response of cells not dependent on TRPA1. Since the osmotic pressure B varies depending on the osmotic pressure of the intracellular fluid of the TRPA1-expressing cell and cannot be determined unconditionally, it should be appropriately set according to the osmotic pressure of the intracellular fluid of the TRPA1-expressing cell. Is preferred. For example, the osmotic pressure of the intracellular fluid of human cells is usually 280 to 320 mOsm (osmotic pressure at 25 ° C .: 6356 to 7264 hPa), preferably 312 mOsm (osmotic pressure at 25 ° C .: 7082 hPa). Accordingly, when the TRPA1-expressing cells are derived from human cells, the osmotic pressure of the low osmotic pressure solution is preferably 100 mOsm (osmotic pressure at 25 ° C .: 2270 hPa) from the viewpoint of suppressing the response of cells not dependent on TRPA1. As described above, more preferably 140 mOsm (osmotic pressure at 25 ° C .: 3178 hPa) or more, a physiological event caused by TRPA1 by a low osmotic pressure solution is more reliably generated, and the evaluation of the hypoosmotic stimulus suppressing action is performed. From the viewpoint of carrying out easily and accurately, it is preferably 260 mOsm (osmotic pressure at 25 ° C .: 5902 hPa) or less, more preferably 240 mOsm (osmotic pressure at 25 ° C .: 5448 hPa) or less.
前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、一過性受容体電位チャネル（ＴＲＰチャネル）の１つであるＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、ＴＲＰＡ１アゴニストによる化学刺激、冷覚刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのカルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能；前記刺激による細胞における膜電位の調節能などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記ＴＲＰＡ１のアゴニストとしては、例えば、メントール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、アルカリ剤（例えば、アンモニア、モノエタノールアミン、水酸化カリウムなど）、アリルイソチオシアネート、メチルパラベン、アリシン、イシリン、過酸化水素、ブラジキニン、アクロレイン、香油成分（例えば、シトラール、オイゲノール、シンナムアルデヒドなど）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 The TRPA1-expressing cell is a cell that expresses a physiological function of TRPA1, which is one of transient receptor potential channels (TRP channels). The physiological functions of TRPA1 include, for example, the ability to transport cations such as calcium ions and sodium ions from the outside to the cells by stimulation such as chemical stimulation, cold sense stimulation, and mechanical stimulation by a TRPA1 agonist; Examples include the ability to regulate membrane potential in cells, but the present invention is not limited to such examples. Examples of the agonist of TRPA1 include menthol, ethanol, 1,3-butylene glycol, propylene glycol, alkaline agents (eg, ammonia, monoethanolamine, potassium hydroxide, etc.), allyl isothiocyanate, methyl paraben, allicin, icilin, Examples include hydrogen peroxide, bradykinin, acrolein, and perfume oil components (eg, citral, eugenol, cinnamaldehyde, etc.), but the present invention is not limited to such examples.
前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、内因性ＴＲＰＡ１を発現している内因性ＴＲＰＡ１発現細胞であってもよく、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている外因性ＴＲＰＡ１発現細胞であってもよい。前記ＴＲＰＡ１発現細胞のなかでは、低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で的確に測定することができる観点から、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞が好ましい。 The TRPA1-expressing cell may be an endogenous TRPA1-expressing cell expressing endogenous TRPA1, or an exogenous TRPA1-expressing cell into which a TRPA1-encoding nucleic acid has been introduced into a host cell so that it can be expressed. Good. Among the TRPA1-expressing cells, exogenous TRPA1-expressing cells are preferable from the viewpoint that a physiological event caused by TRPA1 by a low osmotic pressure solution can be accurately measured with a simple operation.
前記内因性ＴＲＰＡ１発現細胞としては、例えば、感覚神経細胞、内耳細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記内因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、ヒトにおける被験物質の低浸透圧刺激抑制作用を的確に評価する観点から、好ましくはヒト由来の細胞である。 Examples of the endogenous TRPA1-expressing cells include sensory neurons and inner ear cells, but the present invention is not limited to such examples. The endogenous TRPA1-expressing cell is preferably a human-derived cell from the viewpoint of accurately evaluating the hypoosmotic stimulus-suppressing action of a test substance in humans.
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、宿主細胞に導入された前記核酸が、染色体外要素として存在している細胞であってもよく、宿主細胞に導入された前記核酸が組み込みにより染色体に組み込まれている細胞であってもよい。 The exogenous TRPA1-expressing cell may be a cell in which the nucleic acid introduced into the host cell exists as an extrachromosomal element, and the nucleic acid introduced into the host cell is integrated into the chromosome by integration. It may be a cell.
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などの形質転換方法によって、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターなどにより宿主細胞を形質転換することにより得られる。 The exogenous TRPA1-expressing cell is transformed into a host cell with a recombinant vector carrying a nucleic acid encoding TRPA1 by a transformation method such as electroporation, lipofection, transfection, or particle gun. Can be obtained.
ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。ヒトにおける被験物質の低浸透圧刺激抑制作用を的確に評価する観点から、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、好ましくはヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸である。ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列である。なお、ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＡ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づき作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づき設計され、合成された２種のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などにより得られる。 The nucleic acid encoding TRPA1 may be a nucleic acid encoding human TRPA1 or a nucleic acid encoding TRPA1 of another animal. From the viewpoint of accurately evaluating the hypoosmotic stimulus suppressing action of a test substance in humans, the nucleic acid encoding TRPA1 is preferably a nucleic acid encoding human TRPA1. Examples of the nucleic acid encoding TRPA1 include a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a base sequence of a nucleic acid encoding human TRPA1 registered in GenBank as accession number NM_007332. In addition, the nucleic acid encoding TRPA1 is one or several nucleotide residues at the inside or the end of the base sequence of the structural gene of TRPA1 if the polypeptide encoded by the nucleic acid expresses the physiological function. Mutant nucleic acids having the following substitutions, deletions or insertions may be used. The nucleic acid encoding the TRPA1 is, for example, a hybridization method using a probe prepared based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, two kinds designed and synthesized based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It can be obtained by a nucleic acid amplification method using a primer pair consisting of oligonucleotide primers.
変異型核酸としては、例えば、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件（デフォルト値）下、評価対象の配列をアライメントして算出される配列相同性の値が、ＴＲＰＡ１が有する生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されない。
Examples of the mutant nucleic acid include (A) the conditions of Cost to open gap 11, Cost to extended gap 1, expect value 10, and wordsize 11 (default) for the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 by the BLAST algorithm. Value), the sequence homology value calculated by aligning the sequences to be evaluated is preferably 80% or more, more preferably 90% or more from the viewpoint of sufficiently exerting the physiological function of TRPA1. A nucleic acid comprising a base sequence and the encoded polypeptide is a polypeptide that expresses at least a function of permeating cations;
(B) In SEQ ID NO: 2, encodes an amino acid sequence having a substitution, deletion or addition of one or several amino acid residues, and the encoded polypeptide at least expresses a function of permeating cations A nucleic acid which is a polypeptide,
(C) A polypeptide that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid complementary to the nucleic acid consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and expresses at least a function of allowing a cation to permeate. Although a certain nucleic acid etc. are mentioned, this invention is not limited only to this illustration.
なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件」は、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸によりコードされるポリペプチドの生理学的機能と同等またはそれ以上の生理学的機能を有するポリペプチドをコードする核酸を得る観点から、好ましくは配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸と、配列番号：１に対する配列相同性が少なくとも８０％である塩基配列からなる核酸とが特異的にハイブリダイゼーションする条件である。前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸とハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５重量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中、室温以上、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温以上、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 In the present specification, “stringent conditions” means a polypeptide having a physiological function equivalent to or higher than the physiological function of a polypeptide encoded by a nucleic acid consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. From the viewpoint of obtaining a nucleic acid that encodes, preferably a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid consisting of a base sequence having a sequence homology of at least 80% to SEQ ID NO: 1 Conditions for hybridization. Examples of the stringent conditions include a hybridization solution [composition: 6 × SSC (composition: 0.9 M sodium chloride, composition), and a nucleic acid having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid to be hybridized. 0.09M sodium citrate, pH 7.0), 0.5 wt% sodium dodecyl sulfate, 5 × Denhardt's solution, 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA, 50 vol% formamide] Incubate for 10 hours at a temperature of 42 ° C. or higher and 60 ° C. or more as a stringent condition, and then, for example, 2 × SSC, 0.1 × SSC as a more stringent condition, at room temperature As described above, more stringent conditions are 42 ° C. Although the conditions which perform washing | cleaning at the temperature of 60 degreeC or more etc. are mentioned as a non-critical condition, this invention is not limited only to this illustration.
組換えベクターは、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸を、慣用のベクターと連結させることにより得られる。前記ベクターは、調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＡ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。ベクターは、形質転換後の細胞のなかからの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞の選択が容易であることから、好ましくは選択マーカー遺伝子を有するベクターである。また、ベクターは、必要により、ＴＲＰＡ１を連結させるための部位の上流に、宿主細胞内でＴＲＰＡ１を発現させるに適した発現プロモーターを有していてもよい。ベクターとしては、例えば、大腸菌のプラスミドベクター、酵母のプラスミドベクターなどのプラスミドベクター；レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 A recombinant vector can be obtained by ligating the nucleic acid encoding TRPA1 with a conventional vector. The vector may be any vector as long as it is easy to prepare, can be efficiently introduced into a host cell, and TRPA1 can be efficiently expressed in the host cell. The vector is preferably a vector having a selectable marker gene because the exogenous TRPA1-expressing cells can be easily selected from the transformed cells. Moreover, the vector may have an expression promoter suitable for expressing TRPA1 in the host cell upstream of the site for linking TRPA1 as necessary. Examples of the vector include plasmid vectors such as Escherichia coli plasmid vectors and yeast plasmid vectors; and viral vectors such as retrovirus vectors, but the present invention is not limited to such examples.
前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの宿主細胞のなかでは、ヒトにおける被験物質の低浸透圧刺激抑制作用を的確に評価する観点から、好ましくは動物細胞である。前記動物細胞としては、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などのヒト細胞；ＣＯＳ−７細胞などのサル細胞；ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などのマウス細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの動物細胞のなかでは、ヒトにおける被験物質の低浸透圧刺激抑制作用を的確に評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましく、ＨＥＫ２９３細胞がより好ましい。 The host cell may be any one as long as the nucleic acid encoding TRPA1 is efficiently expressed and can be easily cultured, and examples thereof include animal cells, bacterial cells, plant cells, insect cells, and the like. Is not limited to such examples. Among these host cells, animal cells are preferred from the viewpoint of accurately evaluating the hypoosmotic stimulus suppressing action of a test substance in humans. Examples of the animal cells include human cells such as HEK293 cells and Hela cells; monkey cells such as COS-7 cells; mouse cells such as CHO cells and NIH3T3 cells. It is not limited. Among these animal cells, HEK293 cells, CHO cells, COS-7 cells, and NIH3T3 cells are preferable, and HEK293 cells are more preferable from the viewpoint of accurately evaluating the hypoosmotic stimulus suppressing action of a test substance in humans.
形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどにより行なうことができる。また、得られた細胞が外因性ＴＲＰＡ１発現細胞であることの確認は、例えば、細胞を、１〜１０ｍＭパラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することにより行なうことができる。細胞が外因性ＴＲＰＡ１発現細胞である場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、パラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも大きくなる。 Selection of exogenous TRPA1-expressing cells from the transformed cells can be performed, for example, by culturing in a selective medium corresponding to the selection marker gene when the recombinant vector used has a selection marker gene. . In addition, confirmation that the obtained cell is an exogenous TRPA1-expressing cell can be confirmed by, for example, contacting the cell with 1 to 10 mM paraoxybenzoic acid methyl ester, and measuring the intracellular calcium ion concentration described below after the contact. This can be done by measuring the intracellular calcium ion concentration of the cells. When the cell is an exogenous TRPA1-expressing cell, the intracellular calcium ion concentration of the cell after contact is larger than the intracellular calcium ion concentration of the cell not contacted with paraoxybenzoic acid methyl ester.
前記低浸透圧液は、例えば、精製水と電解質とイオン強度に関係しない浸透圧調整剤とを混合することなどによって得ることができる。 The low osmotic pressure liquid can be obtained, for example, by mixing purified water, an electrolyte, and an osmotic pressure adjusting agent not related to ionic strength.
前記被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際して、被験物質の量は、被験物質の種類、ＴＲＰＡ１発現細胞の数などによって異なるので、一概には決定することができないことから、被験物質の種類、ＴＲＰＡ１発現細胞の数などに応じて適宜決定することが望ましい。 When the test substance is contacted with the TRPA1-expressing cells, the amount of the test substance varies depending on the type of the test substance, the number of TRPA1-expressing cells, and the like. It is desirable to determine appropriately according to the number of expression cells.
前記被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際して、１ｃｍ２あたりのＴＲＰＡ１発現細胞の数は、試験データの信頼性の観点から、好ましくは１×１０3細胞以上、より好ましくは１×１０４細胞以上であり、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１の生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは１×１０5細胞以下、より好ましくは５×１０4細胞以下である。 From the viewpoint of the reliability of test data, the number of TRPA1 expressing cells per 1 cm 2 is preferably 1 × 10 3 cells or more, more preferably 1 × 10 4 cells or more when contacting the test substance with TRPA1 expressing cells. From the viewpoint of sufficiently exerting the physiological function of TRPA1 in cells expressing TRPA1, it is preferably 1 × 10 5 cells or less, more preferably 5 × 10 4 cells or less.
前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象としては、例えば、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内の電流の増加などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 Physiological events caused by the low osmotic fluid via TRPA1 include, for example, an increase in calcium ion concentration in TRPA1-expressing cells caused by the low osmotic fluid via TRPA1, and TRPA1 caused by the low osmotic fluid. The increase in the current in the TRPA1-expressing cell caused by the above is exemplified, but the present invention is not limited only to such illustration.
本発明においては、簡便な操作で、かつ高感度で測定することができる観点から、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象は、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加であることが好ましい。 In the present invention, from the viewpoint that measurement can be performed with a simple operation and high sensitivity, a physiological event caused by the low osmotic pressure solution via TRPA1 is caused by the low osmotic pressure solution via TRPA1. Preferably, the calcium ion concentration in the TRPA1-expressing cell is increased.
前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象として、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加を用いる場合、前記低浸透圧刺激抑制作用は、例えば、被験物質の接触前後のＴＲＰＡ１発現細胞における前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化を調べることなどによって評価することができる。具体的には、前記低浸透圧刺激抑制作用は、
（Ａ１） 前記低浸透圧液と被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、前記ＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度〔「カルシウムイオン濃度（Ａ）」という〕を測定するステップ、
（Ａ２） 前記低浸透圧液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、前記ＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度〔「カルシウムイオン濃度（Ｂ）」という〕を測定するステップ、および
（Ａ３） 前記ステップ（Ａ１）で得られたカルシウムイオン濃度（Ａ）と前記ステップ（Ａ２）で得られたカルシウムイオン濃度（Ｂ）とを比較するステップ
を行なうことによって評価することができる。前記ステップ（Ａ３）において、カルシウムイオン濃度（Ｂ）と比べてカルシウムイオン濃度（Ａ）が減少している場合、当該被験物質は、低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価することができる。なお、かかる評価を行なう際には、前記低浸透圧刺激抑制作用の評価をより的確に行なう観点から、低浸透圧液に起因する感覚刺激を引き起こさない対照（陰性対照）とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときの前記ＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度をさらに用いてもよい。また、前記カルシウムイオン濃度（Ａ）とカルシウムイオン濃度（Ｂ）との間の差の絶対値が大きいほど、当該被験物質は、高い低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価することができる。
When the increase in the calcium ion concentration in TRPA1-expressing cells caused by the low osmotic pressure fluid is caused by TRPA1 as a physiological event caused by the low osmotic pressure fluid, the hypoosmotic pressure suppression action Can be evaluated, for example, by examining changes in intracellular calcium ion concentration caused by TRPA1 by the low osmotic pressure in the TRPA1-expressing cells before and after contact with the test substance. Specifically, the hypoosmotic stimulus suppression action is
(A1) contacting the low osmotic pressure solution, the test substance, and a TRPA1-expressing cell, and measuring a calcium ion concentration in the TRPA1-expressing cell [referred to as “calcium ion concentration (A)”];
(A2) contacting the low osmotic pressure solution with a TRPA1-expressing cell and measuring a calcium ion concentration in the TRPA1-expressing cell [referred to as “calcium ion concentration (B)”]; and (A3) the step (A1) ) Can be evaluated by performing a step of comparing the calcium ion concentration (A) obtained in step (A) with the calcium ion concentration (B) obtained in step (A2). In the step (A3), when the calcium ion concentration (A) is decreased as compared with the calcium ion concentration (B), the test substance can be evaluated as having a hypoosmotic stimulus suppressing action. When performing such evaluation, from the viewpoint of more accurately evaluating the hypoosmotic stimulus suppression action, a control (negative control) that does not cause sensory stimulation caused by the hypotonic solution and a TRPA1-expressing cell are used. You may further use the calcium ion density | concentration in the said TRPA1 expression cell when making it contact. Moreover, it can be evaluated that the said test substance has a high hypoosmotic pressure suppression effect, so that the absolute value of the difference between the said calcium ion concentration (A) and a calcium ion concentration (B) is large.
前記カルシウムイオン濃度は、例えば、カルシウムイオンと特異的に結合するカルシウム指示薬をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、当該ＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオンに前記カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬を定量する方法などによって測定することができる。 The calcium ion concentration is obtained by, for example, introducing a calcium indicator that specifically binds to calcium ions into a TRPA1-expressing cell, binding the calcium indicator to calcium ions in the TRPA1-expressing cell, and It can be measured by a quantitative method.
前記カルシウム指示薬は、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬を簡便な操作で定量することができることから、カルシウムイオンとの結合前後の変化を光学的特性の変化などによって検出することができる試薬であることが好ましい。前記光学的特性の変化としては、例えば、蛍光強度の変化、吸光度の変化などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものでない。前記カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記カルシウム指示薬のなかでは、測定が容易であり、かつＴＲＰＡ１発現細胞内に存在する夾雑物質の動態との区別化が容易である観点から、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬が好ましい。前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、ＦＵＲＡ ２、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記蛍光カルシウム指示薬は、１種類の励起波長を有していてもよく、２種類以上の励起波長を有していてもよい。前記カルシウム指示薬が前記蛍光カルシウム指示薬である場合、当該蛍光マグネシウム指示薬は、蛍光強度の測定が容易であり、しかも被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用の評価の精度をより高めることができることから、２種類の励起波長を有する蛍光マグネシウム指示薬が好ましい。 Since the calcium indicator can be quantified with simple operations, the calcium indicator bound to calcium ions can be a reagent that can detect changes before and after binding with calcium ions by changes in optical properties, etc. preferable. Examples of the change in the optical characteristics include a change in fluorescence intensity and a change in absorbance. However, the present invention is not limited to such examples. Examples of the calcium indicator include fluorescent calcium indicators whose fluorescence intensity changes before and after binding with calcium ions, but the present invention is not limited to such examples. Among the calcium indicators, fluorescent calcium whose fluorescence intensity changes before and after binding with calcium ions from the viewpoint of easy measurement and easy differentiation from the dynamics of contaminants present in TRPA1-expressing cells. Indicators are preferred. Examples of the fluorescent calcium indicator include FURA 2, FURA 2-AM, and Fluo-3, but the present invention is not limited to such examples. The fluorescent calcium indicator may have one type of excitation wavelength or two or more types of excitation wavelengths. When the calcium indicator is the fluorescent calcium indicator, the fluorescent magnesium indicator is easy to measure the fluorescence intensity, and can further improve the accuracy of the evaluation of the hypoosmotic stimulus suppression action of the test substance, A fluorescent magnesium indicator having two types of excitation wavelengths is preferred.
カルシウムイオン濃度の測定に際し、１種類の励起波長を有する蛍光マグネシウム指示薬を用いる場合、当該励起波長における蛍光強度に基づき、低浸透圧刺激抑制作用を評価することができる。また、カルシウムイオン濃度の測定に際し、２種類以上の励起波長を有する蛍光マグネシウム指示薬を用いる場合、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用の評価の精度をより高める観点から、当該２種類以上の励起波長から選ばれた２種類の励起波長（第１励起波長および第２励起波長）を選択し、第１励起波長および第２励起波長それぞれにおける蛍光強度から算出された蛍光強度比に基づき、低浸透圧刺激抑制作用を評価することができる。 When a fluorescent magnesium indicator having one kind of excitation wavelength is used in measuring the calcium ion concentration, the low osmotic pressure stimulus suppressing action can be evaluated based on the fluorescence intensity at the excitation wavelength. In the case of using a fluorescent magnesium indicator having two or more types of excitation wavelengths when measuring the calcium ion concentration, the two or more types of excitations are used from the viewpoint of further improving the accuracy of the evaluation of the hypoosmotic stimulus suppression action of the test substance. Two types of excitation wavelengths (first excitation wavelength and second excitation wavelength) selected from the wavelengths are selected, and based on the fluorescence intensity ratio calculated from the fluorescence intensity at each of the first excitation wavelength and the second excitation wavelength, low penetration The pressure-stimulation inhibitory action can be evaluated.
カルシウムイオン濃度の測定に際し、例えば、２種類の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭを用いる場合、第１励起波長における蛍光強度（以下、「第１蛍光強度」ともいう）として３４０ｎｍにおける蛍光強度および第２励起波長における蛍光強度（以下、「第２蛍光強度」ともいう）として３８０ｎｍにおける蛍光強度を用いることができる。この場合、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用は、例えば、式（ＩＩ）： When measuring the calcium ion concentration, for example, when FURA 2-AM, which is a fluorescent calcium indicator having two types of excitation wavelengths, is used, the fluorescence intensity at the first excitation wavelength (hereinafter also referred to as “first fluorescence intensity”) is 340 nm. Fluorescence intensity at 380 nm can be used as the fluorescence intensity at the second excitation wavelength and the fluorescence intensity at the second excitation wavelength (hereinafter also referred to as “second fluorescence intensity”). In this case, the test substance has a low osmotic pressure suppression action, for example, the formula (II):
〔式中、「蛍光強度比Ａ」は式（ＩＩＩ）： [Wherein “fluorescence intensity ratio A” is defined by the formula (III):
に基づいて算出された蛍光強度比、「蛍光強度比Ｂ」は式（ＩＶ）： Fluorescence intensity ratio calculated based on “Fluorescence intensity ratio B” is expressed by the formula (IV):
に基づいて算出された蛍光強度比、「蛍光強度比Ｃ」は式（Ｖ）： The fluorescence intensity ratio calculated on the basis of “fluorescence intensity ratio C” is expressed by the formula (V):
に基づいて算出された蛍光強度比を示す。〕
に基づいて算出された抑制率などを用いて評価することができる。前記抑制率が５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上である場合、被験物質は、低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価することができる。また、前記抑制率が高いほど、前記被験物質は、高い低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価することができる。
The fluorescence intensity ratio calculated based on ]
It is possible to evaluate using the suppression rate calculated based on the above. When the inhibition rate is 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 20% or more, the test substance can be evaluated as having a low osmotic pressure stimulus suppressing action. Moreover, it can be evaluated that the said test substance has a high hypoosmotic pressure suppression effect, so that the said suppression rate is high.
前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象として、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内の電流の増加を用いる場合、前記低浸透圧刺激抑制作用は、例えば、
（Ｂ１） 前記低浸透圧液と被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、前記ＴＲＰＡ１発現細胞内における一定電位下での電流〔「電流（Ａ）」という〕を測定するステップ、
（Ｂ２） ＴＲＰＡ１発現細胞とＴＲＰＡ１アゴニストとを接触させ、前記ＴＲＰＡ１発現細胞内における前記（１）における電位と同じ電位下での電流〔「電流（Ｂ）」という〕を測定するステップ、および
（Ｂ３） 前記ステップ（Ｂ１）で得られた電流（Ａ）と前記ステップ（Ｂ２）で得られた電流（Ｂ）とを比較するステップ
を行なうことによって評価することができる。前記ステップ（Ｂ３）において、電流（Ｂ）と比べて電流（Ａ）が小さい場合、当該被験物質は、前記低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価することができる。また、前記電流（Ａ）と電流（Ｂ）との間の差が大きいほど、当該被験物質は、高い低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価することができる。前記電流は、例えば、パッチクランプ法などによって測定することができる。
When an increase in the current in a TRPA1-expressing cell caused by the hypoosmotic fluid through TRPA1 is used as a physiological event caused by the hypotonic fluid through TRPA1, the hypoosmotic stimulus suppression action is: For example,
(B1) contacting the low osmotic pressure solution, the test substance, and the TRPA1-expressing cell, and measuring a current (referred to as “current (A)”) at a constant potential in the TRPA1-expressing cell;
(B2) contacting a TRPA1-expressing cell with a TRPA1 agonist, and measuring a current [referred to as “current (B)”] under the same potential as in (1) in the TRPA1-expressing cell; and (B3 It can be evaluated by performing a step of comparing the current (A) obtained in step (B1) with the current (B) obtained in step (B2). In the step (B3), when the current (A) is smaller than the current (B), the test substance can be evaluated as having the low osmotic pressure stimulus suppressing action. Moreover, it can be evaluated that the said to-be-tested substance has a high hypoosmotic pressure suppression effect, so that the difference between the said electric current (A) and an electric current (B) is large. The current can be measured by, for example, a patch clamp method.
以上説明したように、本発明の被験物質の評価方法によれば、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を再現性よく的確に評価することができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法は、眼、口などに誤って混入する可能性のある外用剤の開発などに用いられることが期待されるものである。 As described above, according to the test substance evaluation method of the present invention, it is possible to accurately evaluate the hypoosmotic stimulus suppression action of the test substance with good reproducibility. Therefore, the test substance evaluation method of the present invention is expected to be used for the development of external preparations that may be erroneously mixed in the eyes, mouth and the like.
２．低浸透圧刺激抑制剤
本発明の低浸透圧刺激抑制剤は、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によって引き起こされる感覚刺激を抑制するための低浸透圧刺激抑制剤であって、前記被験物質の評価方法により、低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価された物質（以下、「低浸透圧刺激抑制物質」ともいう）を有効成分として含有することを特徴とする。
2. Low osmotic stimulus inhibitor The low osmotic stimulus suppressant of the present invention is a low osmotic stimulus inhibitor for suppressing sensory stimulation caused by a low osmotic pressure solution having an osmotic pressure lower than that of intracellular fluid. And a substance that is evaluated as having a low osmotic pressure suppression action (hereinafter also referred to as “low osmotic pressure suppression substance”) as an active ingredient by the test substance evaluation method. .
本発明の低浸透圧刺激抑制剤は、前記低浸透圧刺激抑制物質を含有しているので、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧刺激を抑制することができる。 Since the low osmotic pressure stimulus-suppressing agent of the present invention contains the low osmotic pressure stimulus-inhibiting substance, low osmotic pressure stimulus having an osmotic pressure lower than the osmotic pressure of the intracellular fluid can be suppressed.
前記低浸透圧刺激抑制物質としては、例えば、ルテニウムレッド、カンファーおよびユーカリプトールなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 Examples of the low osmotic pressure suppression substance include ruthenium red, camphor, and eucalyptol, but the present invention is not limited to such examples.
本発明の低浸透圧刺激抑制剤における前記低浸透圧刺激抑制物質の含有量は、低浸透圧刺激抑制物質の種類、低浸透圧刺激抑制剤の用途などによって異なるので、一概には決定することができないことから、低浸透圧刺激抑制物質の種類、低浸透圧刺激抑制剤の用途などに応じて適宜決定することが好ましい。 The content of the low osmotic stimulus inhibitor in the low osmotic stimulus suppressant of the present invention varies depending on the type of the low osmotic stimulus inhibitor, the use of the low osmotic stimulus suppressant, etc. Therefore, it is preferable to determine appropriately according to the kind of the low osmotic pressure stimulus inhibiting substance, the use of the low osmotic pressure stimulus inhibiting agent, and the like.
本発明の低浸透圧刺激抑制剤は、本発明の目的が妨げられない範囲内で、例えば、水、ｐＨ調整剤、キレート化剤、安定化剤などの他の成分を含有していてもよい。なお、本発明の低浸透圧刺激抑制剤が前記成分を含有する場合、本発明の目的が妨げられない範囲で、本発明の低浸透圧刺激抑制剤中において、前記低浸透圧刺激抑制物質と前記成分とが複合体を形成していてもよい。 The low osmotic pressure stimulus suppressant of the present invention may contain, for example, other components such as water, a pH adjuster, a chelating agent, and a stabilizer within the range in which the object of the present invention is not hindered. . In addition, when the low osmotic pressure stimulus suppressant of the present invention contains the above-described component, the low osmotic pressure stimulus suppressant and The component may form a complex.
本発明の低浸透圧刺激抑制剤は、低浸透圧刺激抑制作用を有することから、眼、口などに誤って混入する可能性のある外用剤、低浸透圧を有する外用剤などに配合することができる。 Since the low osmotic pressure stimulus suppressant of the present invention has a low osmotic pressure stimulus suppressive action, it is incorporated into an external preparation that may be mistakenly mixed into the eye, mouth, etc., an external preparation having a low osmotic pressure, and the like. Can do.
本発明の低浸透圧刺激抑制剤を外用剤に配合する場合、外用剤の剤形は、外用剤の用途などに応じて適宜選択することができる。外用剤の剤形としては、例えば、ローション、クリーム、フォーム、乳液、ジェル、パック、粉剤、エアゾール剤、貼付剤などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記外用剤としては、例えば、ボディーローション、デオドラント化粧料（例えば、デオドラントローション、デオドラントジェル、デオドラントスプレー、デオドラントロールオン、デオドラントペーパーなど）、化粧水、乳液、スキンケアクリーム、トニック、スティック化粧料、リップ、皮膚脱色剤（ボディーブリーチング剤）、洗浄料（例えば、ボディーシャンプー、クレンジング剤、洗顔剤、固形石鹸など）、シート化粧料（例えば、拭き取り用シート、シートパック剤など）、貼付剤（例えば、パップ剤など）、髭剃り用化粧料（例えば、シェービングジェルなど）、洗髪用化粧料（例えば、シャンプー、リンスなど）、育毛剤、ヘアカラー、ヘアブリーチ、パーマ液、ヘアスタイリング剤（例えば、ヘアトニックなど）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 When blending the low osmotic pressure stimulus suppressant of the present invention in an external preparation, the dosage form of the external preparation can be appropriately selected depending on the use of the external preparation. Examples of the dosage form of the external preparation include lotions, creams, foams, emulsions, gels, packs, powders, aerosols, patches and the like, but the present invention is not limited to such examples. Examples of the external preparation include body lotion, deodorant cosmetics (for example, deodorant lotion, deodorant gel, deodorant spray, deodorant roll-on, deodorant paper, etc.), lotion, emulsion, skin care cream, tonic, stick cosmetic, lip, Skin bleaching agent (body bleaching agent), cleansing agent (eg, body shampoo, cleansing agent, facial cleanser, bar soap, etc.), sheet cosmetic (eg, wipe sheet, sheet pack etc.), patch (eg, Cosmetics for shaving (eg shaving gel), hair-washing cosmetics (eg shampoo, rinse, etc.), hair restorers, hair color, hair bleach, perm solution, hair styling agents (eg hair Etc.) But are lower, the present invention is not limited only to those exemplified.
前記外用剤における前記低浸透圧刺激抑制剤の含有量は、前記低浸透圧刺激抑制物質の種類、外用剤の用途などによって異なることから、一概には決定することができないので、前記低浸透圧刺激抑制物質の種類、外用剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。 Since the content of the low osmotic pressure stimulus suppressant in the external preparation varies depending on the kind of the low osmotic pressure stimulus suppressant, the use of the external preparation, etc., it cannot be generally determined. It is preferable to set appropriately according to the kind of the stimulus suppressing substance, the use of the external preparation, and the like.
また、前記外用剤には、前記低浸透圧刺激抑制剤の他に、本発明の目的が妨げられない範囲で、例えば、高級アルコール、ロウ、炭化水素油、脂肪酸、油脂、エステル油、シリコーン油などの油剤；陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などの界面活性剤；多価アルコール、糖、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体などの保湿剤；増粘剤、酸化防止剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、香料、色素、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ビタミン、アミノ酸、防腐剤、水などの成分が配合されていてもよい。 In addition to the low osmotic pressure stimulus suppressant, the external preparation includes, for example, higher alcohols, waxes, hydrocarbon oils, fatty acids, fats and oils, ester oils, silicone oils, as long as the object of the present invention is not hindered. Oil agents such as: Anionic surfactants, cationic surfactants, nonionic surfactants, amphoteric surfactants, etc .; moisturizing polyhydric alcohols, sugars, hyaluronic acid, hyaluronic acid derivatives, etc. Agents; components such as thickeners, antioxidants, chelating agents, pH adjusters, fragrances, dyes, UV absorbers, UV scattering agents, vitamins, amino acids, preservatives, and water may be blended.
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、バスソリューションの浸透圧（イオン量換算）は、式（Ｉ）にしたがって算出された値である。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to such examples. In the following, the osmotic pressure (in terms of ion amount) of the bath solution is a value calculated according to the formula (I).
（製造例１）
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μＬとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μＬと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）〕２００μＬとを混合し、混合物ＩＩを得た。
(Production Example 1)
A cDNA encoding human TRPA1 [polynucleotide at positions 63 to 3888 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (GenBank accession number: NM_007332)] is a vector for mammalian cells (trade name: pcDNA3, manufactured by Invitrogen). .1 (+)] to obtain a human TRPA1 expression vector. 1 μg of the obtained human TRPA1 expression vector was mixed with 6 μL of a gene introduction reagent [manufactured by Invitrogen, trade name: PLUS Reagent, catalog number: 11514-015] to obtain a mixture I. In addition, 4 μL of cationic lipid for gene transfer [manufactured by Invitrogen, trade name: Lipofectamine (registered trademark), catalog number: 18324-012] and serum use reduction medium [manufactured by Invitrogen, trade name: OPTI-MEM (registered) (Trademark) I Reduced-Serum Medium (Cat. No .: 11058021)] 200 μL was mixed to obtain Mixture II.
また、５体積％二酸化炭素雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。 Further, 5 × 10 5 cells of HEK293 cells were cultured in a DMEM medium containing 10% by mass FBS on a petri dish having a diameter of 35 mm maintained at 37 ° C. in a 5% by volume carbon dioxide atmosphere until 70% confluency. did.
得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。 By adding the mixture I and the mixture II to the obtained cell culture, the human TRPA1 expression vector was introduced into HEK293 cells to obtain TRPA1-expressing cells.
（製造例２）
塩化ナトリウム、マンニトール、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、グルコースおよび２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸緩衝液（以下、「ＨＥＰＥＳ緩衝液」ともいう）（ｐＨ７．４）を、下記組成：６０ｍＭ塩化ナトリウム、１６０ｍＭマンニトール、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液となるように混合し、細胞内液の浸透圧と同じ浸透圧を有するバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：３１２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：７０８２ｈＰａ）〕を得た。
(Production Example 2)
Sodium chloride, mannitol, potassium chloride, magnesium chloride, calcium chloride, glucose and 2- [4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethanesulfonic acid buffer (hereinafter also referred to as “HEPES buffer”) ( pH 7.4) is mixed to the following composition: 60 mM sodium chloride, 160 mM mannitol, 5 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 2 mM calcium chloride, 10 mM glucose and 10 mM HEPES buffer, and the same osmotic pressure as the intracellular fluid A bath solution having osmotic pressure [osmotic pressure (ion amount conversion): 312 mOsm (osmotic pressure at 25 ° C .: 7082 hPa)] was obtained.
（製造例３）
製造例２において、マンニトールの濃度を１６０ｍＭに設定する代わりに、マンニトールの濃度を８０ｍＭに設定したことを除き、製造例２と同様の操作を行ない、細胞内液の浸透圧との差が８０ｍＯｓｍ（１８１６ｈＰａ）であるバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：２３２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：５２６６ｈＰａ）〕を得た。
(Production Example 3)
In Production Example 2, instead of setting the mannitol concentration to 160 mM, the same operation as in Production Example 2 was performed except that the mannitol concentration was set to 80 mM, and the difference from the osmotic pressure of the intracellular fluid was 80 mOsm ( 1816 hPa) bath solution [osmotic pressure (ion amount conversion): 232 mOsm (osmotic pressure at 25 ° C .: 5266 hPa)].
（製造例４）
製造例２において、マンニトールの濃度を１６０ｍＭに設定する代わりに、マンニトールの濃度を４０ｍＭに設定したことを除き、製造例２と同様の操作を行ない、細胞内液の浸透圧との差が１２０ｍＯｓｍ（２７２４ｈＰａ）であるバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：１９２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：４３５８ｈＰａ）〕を得た。
(Production Example 4)
In Production Example 2, instead of setting the mannitol concentration to 160 mM, the same operation as in Production Example 2 was performed except that the mannitol concentration was set to 40 mM, and the difference from the osmotic pressure of the intracellular fluid was 120 mOsm ( 2724 hPa) bath solution [osmotic pressure (ion amount conversion): 192 mOsm (osmotic pressure at 25 ° C .: 4358 hPa)].
（製造例５）
製造例２において、マンニトールの濃度を１６０ｍＭに設定する代わりに、マンニトールの濃度を０ｍＭに設定したことを除き、製造例２と同様の操作を行ない、細胞内液の浸透圧との差が１６０ｍＯｓｍ（３６３２ｈＰａ）であるバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：１５２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：３４５０ｈＰａ）〕を得た。
(Production Example 5)
In Production Example 2, instead of setting the mannitol concentration to 160 mM, the same operation as in Production Example 2 was performed except that the mannitol concentration was set to 0 mM, and the difference from the osmotic pressure of the intracellular fluid was 160 mOsm ( 3632 hPa), a bath solution [osmotic pressure (ion amount conversion): 152 mOsm (osmotic pressure at 25 ° C .: 3450 hPa)].
（試験例１）
（１）低浸透圧刺激と細胞面積上昇率との関係の評価
製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞（５×１０４細胞）を循環チャンバー〔ワーナーインストゥルメンツ製、商品名：ＲＣ−２６〕に入れた。その後、チャンバー中のＴＲＰＡ１発現細胞を、浸透圧（イオン量換算）：３１２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：７０８２ｈＰａ）を有する標準バスソリューション〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。洗浄後のＴＲＰＡ１発現細胞をデジタルカメラで撮影した。得られた画像と、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊ〔アメリカ国立衛生研究所のウェブページｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／にて提供〕とを用い、細胞内液と同じ浸透圧を有する浸透圧液を接触させたときの細胞の面積（以下、「細胞面積Ａ0」ともいう）を求めた。
(Test Example 1)
(1) Evaluation of relationship between low osmotic pressure stimulation and cell area increase rate The TRPA1-expressing cells (5 × 10 4 cells) obtained in Production Example 1 were used as a circulation chamber [trade name: RC-26, manufactured by Warner Instruments]. ]. Thereafter, the TRPA1-expressing cells in the chamber were converted into standard bath solutions having osmotic pressure (in terms of ion amount): 312 mOsm (osmotic pressure at 25 ° C .: 7082 hPa) [composition: 140 mM sodium chloride, 5 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 2 mM. Calcium chloride, 10 mM glucose and 10 mM HEPES buffer (pH 7.4)]. The TRPA1-expressing cells after washing were photographed with a digital camera. The obtained image and image processing software Image J [National Institutes of Health web page http: // imagej. nih. The cell area when the osmotic solution having the same osmotic pressure as the intracellular fluid was brought into contact (hereinafter also referred to as “cell area A 0 ”) was determined using “provided by gov / ij /”.
つぎに、洗浄後のＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、製造例２、製造例３、または製造例５で得られたバスソリューションを添加した。前記バスソリューションの添加後の細胞をデジタルカメラで撮影した。得られた画像と、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊとを用い、細胞内液よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液を接触させたときの細胞の面積（以下、「細胞面積Ａ1」ともいう）を求めた。 Next, the bath solution obtained in Production Example 2, Production Example 3 or Production Example 5 was added to the chamber containing the washed TRPA1-expressing cells. The cells after the addition of the bath solution were photographed with a digital camera. Using the obtained image and image processing software Image J, the area of the cell when contacted with a low osmotic pressure solution having a lower osmotic pressure than the intracellular fluid (hereinafter also referred to as “cell area A 1 ”) Asked.
つぎに、細胞面積Ａ0および細胞面積Ａ1を用い、式（ＶＩ）：
細胞面積上昇率
＝（細胞面積Ａ1−細胞面積Ａ0）／細胞面積Ａ0 （ＶＩ）
Next, using cell area A 0 and cell area A 1 , formula (VI):
Cell area increase rate = (cell area A 1 −cell area A 0 ) / cell area A 0 (VI)
に基づいて細胞面積上昇率を求めた。 Based on the above, the cell area increase rate was determined.
試験例１において、細胞内液の浸透圧との差と細胞面積上昇率との関係を調べた結果を図１に示す。 The results of examining the relationship between the difference between the osmotic pressure of the intracellular fluid and the cell area increase rate in Test Example 1 are shown in FIG.
図１に示された結果から、細胞内液の浸透圧との差が大きいほど、細胞面積上昇率が高いことがわかる。 From the results shown in FIG. 1, it can be seen that the larger the difference from the osmotic pressure of the intracellular fluid, the higher the cell area increase rate.
（２）低浸透圧刺激とＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１活性化度との関係の評価
製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を標準バスソリューション〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕にて洗浄した。つぎに、ＴＲＰＡ１発現細胞を製造例２、製造例３、製造例４または製造例５で得られたバスソリューションに曝露した。曝露後１分間経過後に、溶液Ｂ〔組成：１４０ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭグリコールエーテルジアミン四酢酸および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕を含む電極の先端を前記ＴＲＰＡ１発現細胞に接触させ、電流記録ソフトウェア〔モルキュラーデバイス社製、商品名：ｐＣＬＡＭＰ１０〕と電流記録装置〔モルキュラーデバイス社製、商品名：Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ〕とを用い、電圧を６０ｍＶに固定したときの電流変化を測定した。
(2) Evaluation of relationship between hypotonic stimulation and TRPA1 activation level in TRPA1-expressing cells TRPA1-expressing cells obtained in Production Example 1 were treated with a standard bath solution [composition: 140 mM sodium chloride, 5 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 2 mM calcium chloride, 10 mM glucose and 10 mM HEPES buffer (pH 7.4)]. Next, the TRPA1-expressing cells were exposed to the bath solution obtained in Production Example 2, Production Example 3, Production Example 4 or Production Example 5. One minute after exposure, the tip of an electrode containing solution B [composition: 140 mM potassium chloride, 5 mM glycol etherdiaminetetraacetic acid and 10 mM HEPES buffer (pH 7.4)] was brought into contact with the TRPA1-expressing cells, and current recording software was used. Using [Molecular Device, product name: pCLAMP10] and a current recording device [Molecular Device, product name: Axopatch 200B Amplifier], changes in current were measured when the voltage was fixed at 60 mV.
算出された開口確率（Ｐｏ）と、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１の数とを用い、式（ＶＩＩ）： Using the calculated opening probability (Po) and the number of TRPA1 in the TRPA1-expressing cells, the formula (VII):
ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）
＝ＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１の数（Ｎ）×開口確率（Ｐｏ）
（ＶＩＩ）
TRPA1 activation degree (NPo)
= Number of TRPA1 in TRPA1-expressing cells (N) × opening probability (Po)
(VII)
にしたがって、ＴＲＰＡ１活性化度を求めた。 Thus, the degree of TRPA1 activation was determined.
試験例１において、細胞内液の浸透圧との差とＴＲＰＡ１活性化度との関係を調べた結果を図２に示す。 FIG. 2 shows the results of examining the relationship between the difference between the osmotic pressure of the intracellular fluid and the degree of TRPA1 activation in Test Example 1.
図２に示された結果から、細胞内液の浸透圧との差が大きいほど、ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）が大きいことがわかる。これらの結果から、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧により、ＴＲＰＡ１発現細胞のＴＲＰＡ１がより活性化されることがわかる。したがって、これらの結果から、ヒトにおいて、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によってＴＲＰＡ１の活性が増強されることにより、痛覚が引き起こされることが示唆される。また、これらの結果から、例えば、ヒトの眼に低浸透圧液が接触したときにヒトが知覚する眼刺激感は、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によってＴＲＰＡ１の活性が増強されることにより、引き起こされることが示唆される。 From the results shown in FIG. 2, it can be seen that the greater the difference from the osmotic pressure of the intracellular fluid, the greater the degree of TRPA1 activation (NPo). From these results, it can be seen that TRPA1 of TRPA1-expressing cells is more activated by an osmotic pressure lower than that of intracellular fluid. Therefore, these results suggest that in humans, the activity of TRPA1 is enhanced by a hypotonic solution having an osmotic pressure lower than the osmotic pressure of intracellular fluid, thereby causing pain sensation. Further, from these results, for example, the eye irritation sense perceived by the human when the low osmotic pressure solution contacts the human eye is caused by TRPA1 by the low osmotic pressure solution having an osmotic pressure lower than the osmotic pressure of the intracellular fluid. It is suggested that this is caused by an increase in the activity of.
（３）細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１活性化度の変化との関係の評価
試験例１（１）において、製造例２、製造例３または製造例５で得られたバスソリューションを用いる代わりに、種々の浸透圧を有するバスソリューションを用いたことを除き、試験例１（１）と同様の操作を行ない、細胞面積上昇率を求めた。また、試験例１（２）において、製造例２、製造例３、製造例４または製造例５で得られたバスソリューションを用いる代わりに、前記種々の浸透圧を有するバスソリューションを用いたことを除き、試験例１（２）と同様の操作を行ない、ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）を求めた。つぎに、各バスソリューションを用いたときの細胞面積上昇率と、ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）とを、ｘ軸が細胞面積上昇率であり、ｙ軸がＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）である２次元座標上にプロットした。
(3) Evaluation of relationship between cell area increase rate and change in TRPA1 activation level In Test Example 1 (1), instead of using the bus solution obtained in Production Example 2, Production Example 3 or Production Example 5, various The same procedure as in Test Example 1 (1) was performed except that a bath solution having an osmotic pressure was used, and the cell area increase rate was determined. In Test Example 1 (2), instead of using the bus solution obtained in Manufacturing Example 2, Manufacturing Example 3, Manufacturing Example 4 or Manufacturing Example 5, the bus solution having the various osmotic pressures was used. Except for the above, the same operation as in Test Example 1 (2) was performed, and the TRPA1 activation degree (NPo) was determined. Next, the cell area increase rate and TRPA1 activation degree (NPo) when each bath solution is used, the x axis is the cell area increase rate, and the y axis is the TRPA1 activation degree (NPo) 2 Plotted on dimensional coordinates.
また、前記において、種々の浸透圧を有するバスソリューションを用いる代わりに、１μＭＴＲＰＡ１アゴニスト（アリルイソチオシアネート）を含有し、かつ種々の浸透圧を有するバスソリューションを用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、細胞面積上昇率およびＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）を求めた。つぎに、各バスソリューションを用いたときの細胞面積上昇率と、ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）とを、ｘ軸が細胞面積上昇率であり、ｙ軸がＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）である２次元座標上にプロットした。 In addition, in the above, the same operation as described above except that instead of using a bath solution having various osmotic pressures, a bath solution containing 1 μMTRPA1 agonist (allyl isothiocyanate) and having various osmotic pressures was used. The cell area increase rate and the TRPA1 activation degree (NPo) were determined. Next, the cell area increase rate and TRPA1 activation degree (NPo) when each bath solution is used, the x axis is the cell area increase rate, and the y axis is the TRPA1 activation degree (NPo) 2 Plotted on dimensional coordinates.
試験例１において、低浸透圧液に接触させたときの細胞面積上昇率と低浸透圧液に接触させたときのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との関係を調べた結果を図３(Ａ)、ＴＲＰＡ１アゴニストの存在下での細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１アゴニストの存在下でのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との関係を調べた結果を図３（Ｂ）に示す。図中、Ｒは相関係数を示す。 FIG. 3A shows the results of examining the relationship between the cell area increase rate when contacted with a low osmotic pressure solution and the degree of TRPA1 activation (NPo) when contacted with a low osmotic pressure solution in Test Example 1. FIG. 3B shows the results of examining the relationship between the cell area increase rate in the presence of the TRPA1 agonist and the degree of TRPA1 activation (NPo) in the presence of the TRPA1 agonist. In the figure, R indicates a correlation coefficient.
図３（Ａ）および（Ｂ）に示された結果から、低浸透圧液に接触させたときの細胞面積上昇率と低浸透圧液に接触させたときのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との間およびＴＲＰＡ１アゴニストの存在下での細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１アゴニストの存在下でのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との間の両方において、相関係数Ｒが０．５１であることがわかる。したがって、これらの結果から、低浸透圧液に接触させたときの細胞面積上昇率と低浸透圧液に接触させたときのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との間には、ＴＲＰＡ１アゴニストの存在下での細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１アゴニストの存在下でのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との間の場合と同様に正の相関がみられることがわかる。これらの結果から、低浸透圧液による細胞の膨張と、細胞内カルシウム濃度の増加とが関連していることがわかる。したがって、これらの結果から、低浸透圧液によって細胞が膨張することにより、ＴＲＰＡ１の活性が増大することが示唆される。 From the results shown in FIGS. 3 (A) and (B), the cell area increase rate when contacted with the low osmotic pressure solution and the TRPA1 activation degree (NPo) when contacted with the low osmotic pressure solution are shown. It can be seen that the correlation coefficient R is 0.51 both between the cell area increase rate in the presence of the TRPA1 agonist and the degree of TRPA1 activation (NPo) in the presence of the TRPA1 agonist. Therefore, from these results, the presence of a TRPA1 agonist is found between the rate of increase in cell area when contacted with a low osmotic pressure solution and the degree of TRPA1 activation (NPo) when contacted with a low osmotic pressure solution. It can be seen that there is a positive correlation in the same manner as in the case of the cell area increase rate with TRPA1 and the degree of TRPA1 activation (NPo) in the presence of the TRPA1 agonist. From these results, it can be seen that the expansion of the cells by the low osmotic pressure solution is associated with the increase of the intracellular calcium concentration. Therefore, these results suggest that the activity of TRPA1 is increased when the cells are expanded by the hypotonic solution.
（製造例６）
製造例４で得られたバスソリューションに、被験物質として、ＴＲＰＡ１のアンタゴニストであるルテニウムレッドをその濃度が１０μＭとなるように添加し、被験試料を得た。
(Production Example 6)
As a test substance, ruthenium red, which is an antagonist of TRPA1, was added to the bath solution obtained in Production Example 4 so that its concentration was 10 μM to obtain a test sample.
（製造例７）
製造例４で得られたバスソリューションに、被験物質として、ＴＲＰＡ１のアンタゴニストであるカンファーをその濃度が５ｍＭとなるように添加し、被験試料を得た。
(Production Example 7)
To the bath solution obtained in Production Example 4, camphor, which is an antagonist of TRPA1, was added as a test substance so that its concentration became 5 mM, and a test sample was obtained.
（製造例８）
製造例４で得られたバスソリューションに、被験物質として、ＴＲＰＡ１のアンタゴニストであるユーカリプトールをその濃度が５ｍＭとなるように添加し、被験試料を得た。
(Production Example 8)
To the bath solution obtained in Production Example 4, eucalyptol, which is an antagonist of TRPA1, was added as a test substance so that its concentration was 5 mM, and a test sample was obtained.
（製造例９）
製造例４で得られたバスソリューションに、被験物質として、ＴＲＰＡ１の活性との関連性がないグリセロールをその濃度が５ｍＭとなるように添加し、被験試料を得た。
(Production Example 9)
To the bath solution obtained in Production Example 4, glycerol having no relation to the activity of TRPA1 was added as a test substance so that the concentration thereof was 5 mM, and a test sample was obtained.
（製造例１０）
製造例４で得られたバスソリューションに、被験物質として、ＴＲＰＡ１の活性との関連性がないマルチトールをその濃度が５ｍＭとなるように添加し、被験試料を得た。
(Production Example 10)
Maltitol, which is not related to the activity of TRPA1, was added to the bath solution obtained in Production Example 4 so that its concentration was 5 mM, and a test sample was obtained.
（実施例１）
製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
Example 1
The TRPA1-expressing cells obtained in Production Example 1 were cultured at room temperature in a DMEM medium containing 10% by weight fetal calf serum containing FURA 2-AM (manufactured by Invitrogen), a reagent for measuring intracellular calcium ions, at a final concentration of 5 μM. By incubating for a minute, FURA 2-AM was introduced into the TRPA1-expressing cells to obtain FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells.
得られたＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、標準バスソリューション〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。 The obtained FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells were placed in each chamber of a fluorescence measuring apparatus with a circulating constant temperature chamber [manufactured by Hamamatsu Photonics, Inc., trade name: ARGUS-50]. Thereafter, FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells in the chamber were treated with a standard bath solution [composition: 140 mM sodium chloride, 5 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 2 mM calcium chloride, 10 mM glucose and 10 mM HEPES buffer (pH 7.4)]. Washed with.
つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、製造例６、製造例７、製造例８、製造例９または製造例１０で得られた被験試料を添加した。なお、製造例６、製造例７、製造例８、製造例９または製造例１０で得られた被験試料とＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物の浸透圧（イオン量換算）は１９２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：４３５８ｈＰａ）であった。 Next, the test sample obtained in Production Example 6, Production Example 7, Production Example 8, Production Example 9 or Production Example 10 was added to the chamber containing the FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells after washing. In addition, the osmotic pressure (ion amount conversion) of the mixture containing the test sample obtained in Production Example 6, Production Example 7, Production Example 8, Production Example 9 or Production Example 10 and the TRPA1-expressing cells was 192 mOsm (at 25 ° C. Osmotic pressure: 4358 hPa).
その後、チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度３４０ｎｍ」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＭ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度３８０ｎｍ」という）を測定した。つぎに、測定された蛍光強度３４０ｎｍおよび蛍光強度３８０ｎｍを用い、式（Ｖ）に基づいて蛍光強度比Ｃを求めた。また、前記において、前記被験試料の代わりに、低浸透圧液としての製造例４で得られたバスソリューションを用いたこと、および式（Ｖ）を用いる代わりに、式（ＩＩＩ）を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、蛍光強度比Ａを求めた。さらに、前記において、前記被験試料を用いる代わりに、対照としての標準バスソリューションを用いたこと、および式（Ｖ）を用いる代わりに、式（ＩＶ）を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、蛍光強度比Ｂを求めた。前記蛍光強度比Ａ〜Ｃを用い、式（ＩＩ）に基づいて、抑制率を求めた。 Thereafter, fluorescence intensity based on FURA 2-AM (hereinafter referred to as “fluorescence intensity 340 nm ”) introduced into a TRPA1-expressing cell at an excitation wavelength of 340 nm and bound to intracellular calcium ions in the chamber and TRPM1 at an excitation wavelength of 380 nm. The intensity of fluorescence based on FURA 2-AM introduced into the expression cells (hereinafter referred to as “fluorescence intensity 380 nm ”) was measured. Next, using the measured fluorescence intensity of 340 nm and fluorescence intensity of 380 nm , the fluorescence intensity ratio C was determined based on the formula (V). Further, in the above, the bath solution obtained in Production Example 4 as a low osmotic pressure solution was used instead of the test sample, and the formula (III) was used instead of the formula (V). The fluorescence intensity ratio A was determined by performing the same operation as described above. Further, in the above, the same operation as described above, except that instead of using the test sample, a standard bath solution as a control was used, and instead of using formula (V), formula (IV) was used. The fluorescence intensity ratio B was determined. The suppression rate was calculated | required based on Formula (II) using the said fluorescence intensity ratio AC.
実施例１において、各被験試料と抑制率との関係を調べた結果を図４に示す。図中、レーン１は製造例６で得られた被験試料を用いたときの抑制率、レーン２は製造例７で得られた被験試料を用いたときの抑制率、レーン３は製造例８で得られた被験試料を用いたときの抑制率、レーン４は製造例９で得られた被験試料を用いたときの抑制率、レーン５は製造例１０で得られた被験試料を用いたときの抑制率を示す。 The results of examining the relationship between each test sample and the inhibition rate in Example 1 are shown in FIG. In the figure, lane 1 is the inhibition rate when the test sample obtained in Production Example 6 is used, lane 2 is the inhibition rate when the test sample obtained in Production Example 7 is used, and lane 3 is Production Example 8. Inhibition rate when using the obtained test sample, Lane 4 is the inhibition rate when using the test sample obtained in Production Example 9, and Lane 5 is when using the test sample obtained in Production Example 10. Indicates the inhibition rate.
図４に示された結果から、ＴＲＰＡ１の活性を抑制するアンタゴニストであるルテニウムレッドを含有する被験試料（レーン１）、カンファーを含有する被験試料（レーン２）、ユーカリプトールを含有する被験試料（レーン３）を用いたときの抑制率は、３０％以上であることがわかる。これらの結果から、ルテニウムレッド、カンファーおよびユーカリプトールは、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によって引き起こされるＴＲＰＡ１を介する細胞内カルシウム濃度の増加を抑制することがわかる。したがって、ルテニウムレッド、カンファーおよびユーカリプトールは、低浸透圧刺激抑制作用を有することがわかる。 From the results shown in FIG. 4, a test sample (lane 1) containing ruthenium red, which is an antagonist that suppresses the activity of TRPA1, a test sample containing camphor (lane 2), and a test sample containing eucalyptol (lane 2). It can be seen that the inhibition rate when using lane 3) is 30% or more. These results indicate that ruthenium red, camphor and eucalyptol inhibit the increase in intracellular calcium concentration via TRPA1 caused by hypotonic solutions having a lower osmotic pressure than that of intracellular fluids. . Therefore, it can be seen that ruthenium red, camphor and eucalyptol have a low osmotic pressure suppression effect.
これに対し、ＴＲＰＡ１の活性とは関係がない物質であるグリセロールを含有する被験試料（レーン４）およびマルチトールを含有する被験試料（レーン５）を用いたときの抑制率は、１０％未満であることがわかる。これらの結果から、グリセロールおよびマルチトールは、細胞内液の浸透圧よりも低い低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウム濃度の増加を抑制しないことがわかる。したがって、グリセロールおよびマルチトールは、低浸透圧刺激抑制作用を有しないことがわかる。 In contrast, the inhibition rate when a test sample containing glycerol (lane 4) and a test sample containing maltitol (lane 5), which are substances not related to the activity of TRPA1, was less than 10%. I know that there is. From these results, it can be seen that glycerol and maltitol do not suppress the increase in intracellular calcium concentration caused by TRPA1 by a hypotonic solution lower than the osmotic pressure of intracellular fluid. Therefore, it can be seen that glycerol and maltitol do not have a low osmotic pressure suppression effect.
したがって、以上の結果から、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液と、被験物質と、ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、ＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定する方法は、被験者を用いなくてもよいことから、評価結果にバラつきが生じやすい被験者に評価させる方法と比べ、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を再現性よく的確に評価することができることがわかる。 Therefore, based on the above results, a low osmotic pressure solution having an osmotic pressure lower than the osmotic pressure of the intracellular fluid, a test substance, and a TRPA1-expressing cell are brought into contact with each other, and a physiological event caused through TRPA1 is measured. Since the method does not require the use of a test subject, the low osmotic pressure suppression effect of the test substance can be accurately evaluated with good reproducibility compared to the method of allowing a test subject to easily evaluate the evaluation results. Recognize.
また、前記において、低浸透圧刺激抑制作用を有すると判定された被験物質は、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液による刺激を抑制するので、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によって引き起こされる痛みを抑制する低浸透圧刺激抑制剤の有効成分として有用であることが示唆される。 Further, in the above, since the test substance determined to have a low osmotic pressure stimulus suppressing action suppresses stimulation by a low osmotic pressure solution having an osmotic pressure lower than the osmotic pressure of the intracellular fluid, This suggests that it is useful as an active ingredient of a hypoosmotic stimulus inhibitor that suppresses pain caused by a hypotonic solution having an osmotic pressure lower than the pressure.
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