JP2011205975A - Method for evaluating substance for inhibiting alcohol irritation - Google Patents
Method for evaluating substance for inhibiting alcohol irritation Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011205975A JP2011205975A JP2010077286A JP2010077286A JP2011205975A JP 2011205975 A JP2011205975 A JP 2011205975A JP 2010077286 A JP2010077286 A JP 2010077286A JP 2010077286 A JP2010077286 A JP 2010077286A JP 2011205975 A JP2011205975 A JP 2011205975A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- alcohol
- trpa1
- trpv1
- intensity ratio
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 307
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title abstract description 12
- 230000007794 irritation Effects 0.000 title abstract description 7
- 101000764872 Homo sapiens Transient receptor potential cation channel subfamily A member 1 Proteins 0.000 claims abstract description 140
- 102100026186 Transient receptor potential cation channel subfamily A member 1 Human genes 0.000 claims abstract description 130
- 102000003566 TRPV1 Human genes 0.000 claims abstract description 114
- 101150016206 Trpv1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 114
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 claims abstract description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 272
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 71
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 71
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 71
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 50
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 44
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 claims description 39
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 36
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 18
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 93
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 92
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 90
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- SZXQTJUDPRGNJN-UHFFFAOYSA-N dipropylene glycol Chemical compound OCCCOCCCO SZXQTJUDPRGNJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- YKPUWZUDDOIDPM-SOFGYWHQSA-N capsaicin Chemical compound COC1=CC(CNC(=O)CCCC\C=C\C(C)C)=CC=C1O YKPUWZUDDOIDPM-SOFGYWHQSA-N 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- 229940058015 1,3-butylene glycol Drugs 0.000 description 14
- BBMCTIGTTCKYKF-UHFFFAOYSA-N 1-heptanol Chemical compound CCCCCCCO BBMCTIGTTCKYKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 235000019437 butane-1,3-diol Nutrition 0.000 description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 10
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 10
- 102000052408 human TRPA1 Human genes 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 9
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N allyl isothiocyanate Chemical compound C=CCN=C=S ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960002504 capsaicin Drugs 0.000 description 8
- 235000017663 capsaicin Nutrition 0.000 description 8
- ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N hexan-1-ol Chemical compound CCCCCCO ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000003610 TRPM8 Human genes 0.000 description 7
- 102000003565 TRPV2 Human genes 0.000 description 7
- 101150111302 Trpm8 gene Proteins 0.000 description 7
- 101150077905 Trpv2 gene Proteins 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N (R)-camphor Chemical compound C1C[C@@]2(C)C(=O)C[C@@H]1C2(C)C DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000723346 Cinnamomum camphora Species 0.000 description 6
- GOOXRYWLNNXLFL-UHFFFAOYSA-H azane oxygen(2-) ruthenium(3+) ruthenium(4+) hexachloride Chemical compound N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.[O--].[O--].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Ru+3].[Ru+3].[Ru+4] GOOXRYWLNNXLFL-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 6
- 229960000846 camphor Drugs 0.000 description 6
- 229930008380 camphor Natural products 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- VPSRLGDRGCKUTK-UHFFFAOYSA-N fura-2-acetoxymethyl ester Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC(C(=C1)N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=CC2=C1OC(C=1OC(=CN=1)C(=O)OCOC(C)=O)=C2 VPSRLGDRGCKUTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DRCMAZOSEIMCHM-UHFFFAOYSA-N capsazepine Chemical compound C1C=2C=C(O)C(O)=CC=2CCCN1C(=S)NCCC1=CC=C(Cl)C=C1 DRCMAZOSEIMCHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 101000633069 Homo sapiens Transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 4
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 235000016720 allyl isothiocyanate Nutrition 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 102000045756 human TRPV1 Human genes 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N (+)-Neomenthol Chemical compound CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@@H]1O NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N 0.000 description 2
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N DL-menthol Natural products CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N decan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCO MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- -1 etc.) Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229940041616 menthol Drugs 0.000 description 2
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- ZWRUINPWMLAQRD-UHFFFAOYSA-N nonan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCO ZWRUINPWMLAQRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 102000042565 transient receptor (TC 1.A.4) family Human genes 0.000 description 2
- 108091053409 transient receptor (TC 1.A.4) family Proteins 0.000 description 2
- KJPRLNWUNMBNBZ-QPJJXVBHSA-N (E)-cinnamaldehyde Chemical compound O=C\C=C\C1=CC=CC=C1 KJPRLNWUNMBNBZ-QPJJXVBHSA-N 0.000 description 1
- 229940043375 1,5-pentanediol Drugs 0.000 description 1
- RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 1-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- JDLKFOPOAOFWQN-VIFPVBQESA-N Allicin Natural products C=CCS[S@](=O)CC=C JDLKFOPOAOFWQN-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N Fluo-3 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(Cl)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(Cl)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100047459 Homo sapiens TRPM8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000633089 Homo sapiens Transient receptor potential cation channel subfamily V member 2 Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000011753 Transient Receptor Potential Channels Human genes 0.000 description 1
- 108010037150 Transient Receptor Potential Channels Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- JDLKFOPOAOFWQN-UHFFFAOYSA-N allicin Chemical compound C=CCSS(=O)CC=C JDLKFOPOAOFWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010081 allicin Nutrition 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- RECUKUPTGUEGMW-UHFFFAOYSA-N carvacrol Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C)C(O)=C1 RECUKUPTGUEGMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHTWOMMSBMNRKP-UHFFFAOYSA-N carvacrol Natural products CC(=C)C1=CC=C(C)C(O)=C1 HHTWOMMSBMNRKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007746 carvacrol Nutrition 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940117916 cinnamic aldehyde Drugs 0.000 description 1
- KJPRLNWUNMBNBZ-UHFFFAOYSA-N cinnamic aldehyde Natural products O=CC=CC1=CC=CC=C1 KJPRLNWUNMBNBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229940113120 dipropylene glycol Drugs 0.000 description 1
- 210000003027 ear inner Anatomy 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940051250 hexylene glycol Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000045979 human TRPM8 Human genes 0.000 description 1
- 102000044790 human TRPV2 Human genes 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- WYXXLXHHWYNKJF-UHFFFAOYSA-N isocarvacrol Natural products CC(C)C1=CC=C(O)C(C)=C1 WYXXLXHHWYNKJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000000845 maltitol Substances 0.000 description 1
- VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N maltitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N 0.000 description 1
- 235000010449 maltitol Nutrition 0.000 description 1
- 229940035436 maltitol Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- WCVRQHFDJLLWFE-UHFFFAOYSA-N pentane-1,2-diol Chemical compound CCCC(O)CO WCVRQHFDJLLWFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229960004063 propylene glycol Drugs 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、アルコール刺激抑制物質の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒトの皮膚に用いられる化粧料などの皮膚外用剤の開発などに有用なアルコール刺激抑制物質の評価方法に関する。 The present invention relates to a method for evaluating an alcohol stimulation inhibitor. More particularly, the present invention relates to a method for evaluating an alcohol stimulation-inhibiting substance useful for developing a skin external preparation such as a cosmetic used for human skin.
ヒトの皮膚に用いられる化粧料などの皮膚外用剤には、必要により、爽快感や清涼感を付与するための清涼化剤や、皮膚の保湿のための保湿剤が配合されている。前記清涼化剤として、例えば、エタノールなどが用いられている。また、前記保湿剤として、ジプロピレングリコールなどの多価アルコールが用いられている。 Skin external preparations such as cosmetics used for human skin are blended with a refreshing agent for imparting a refreshing feeling and a refreshing feeling and a moisturizing agent for moisturizing the skin, if necessary. For example, ethanol or the like is used as the refreshing agent. In addition, a polyhydric alcohol such as dipropylene glycol is used as the humectant.
しかしながら、前記エタノールや多価アルコールなどのアルコールを配合した皮膚外用剤を用いた場合、使用者によっては皮膚に痛みや灼熱感などの不快な刺激を感じることがあるため、アルコールによる不快な刺激を抑制することが求められている。 However, when using an external preparation containing skin such as ethanol or polyhydric alcohol, some users may feel unpleasant irritation such as pain or burning on the skin. There is a need to suppress it.
ところで、一過性受容体電位チャネル（以下、「ＴＲＰチャネル」という）は、痛みを惹起する因子を受容する受容体として機能することが知られている。例えば、ＴＲＰチャネルの１つであるＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化が、パラベン類やアルカリ剤が配合された皮膚外用剤を用いたときに引き起こされる不快な刺激と関連していることが、本発明者らによって見出されている。また、前記パラベン類やアルカリ剤による刺激と前記ＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化との関連性を利用して、パラベン類やアルカリ剤による刺激を抑制する物質を評価することが提案されている（例えば、特許文献１および２参照）。
By the way, it is known that a transient receptor potential channel (hereinafter referred to as “TRP channel”) functions as a receptor that receives a factor that causes pain. For example, changes in intracellular calcium ion concentration via TRPA1, one of the TRP channels, are associated with unpleasant irritation caused by the use of topical skin preparations containing parabens and alkaline agents. Has been found by the present inventors. Further, it has been proposed to evaluate a substance that suppresses stimulation by parabens or alkaline agent by utilizing the relationship between stimulation by parabens or alkaline agent and change in intracellular calcium ion concentration via TRPA1. (For example, refer to
しかしながら、本発明者らは、現時点では、アルコールによる刺激とＴＲＰＡ１との関連性や当該関連性を利用して、アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で評価する方法を具体的に記載した文献を発見していない。 However, the present inventors specifically described a method for evaluating a substance that suppresses stimulation by alcohol by a simple operation by utilizing the relation between the stimulation by alcohol and TRPA1 and the relation. I have not found any literature.
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で評価することができるアルコール刺激抑制物質の評価方法を提供することを目的とする。 This invention is made | formed in view of the said prior art, and it aims at providing the evaluation method of the alcohol stimulus suppression substance which can evaluate the substance which suppresses the stimulus by alcohol by simple operation.
すなわち、本発明の要旨は、
（１）被験物質とアルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞と接触させ、アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびアルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とするアルコール刺激抑制物質の評価方法、
（２）前記生理学的事象が、アルコールとの接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である前記（１）に記載の評価方法、
（３）前記ＴＲＰＡ１発現細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である前記（１）または（２）に記載の評価方法、
（４）前記ＴＲＰＶ１発現細胞が、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の評価方法、
（５）前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞である前記（１）または（２）に記載の評価方法、ならびに
（６）前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞またはＮＩＨ３Ｔ３細胞である前記（３）〜（５）のいずれかに記載の評価方法
に関する。
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) A test substance and alcohol are brought into contact with a TRPA1-expressing cell and a TRPV1-expressing cell, or contacted with a TRPA1-TRPV1 co-expressing cell, and a physiological event caused by alcohol via TRPA1 and alcohol via TRPV1 A method for evaluating a substance that inhibits alcohol stimulation, characterized by measuring physiological events caused by
(2) The evaluation method according to (1), wherein the physiological event is a change in intracellular calcium ion concentration before and after contact with alcohol,
(3) The evaluation method according to (1) or (2), wherein the TRPA1-expressing cell is a cell into which a nucleic acid encoding TRPA1 has been introduced into a host cell.
(4) The evaluation method according to any one of (1) to (3), wherein the TRPV1-expressing cell is a cell into which a nucleic acid encoding TRPV1 has been introduced into a host cell.
(5) The evaluation method according to (1) or (2), wherein the TRPA1-TRPV1 co-expressing cell is a cell in which a nucleic acid encoding TRPA1 and a nucleic acid encoding TRPV1 are introduced into a host cell so as to allow expression. And (6) The evaluation method according to any one of (3) to (5), wherein the host cell is a HEK293 cell, a CHO cell, a COS-7 cell, or a NIH3T3 cell.
本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法は、アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で評価することができるという優れた効果を奏する。 The method for evaluating an alcohol stimulation-inhibiting substance of the present invention has an excellent effect that a substance that suppresses stimulation by alcohol can be evaluated by a simple operation.
本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法は、被験物質とアルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞に接触させ、アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびアルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする。 In the method for evaluating an alcohol stimulation inhibitor of the present invention, a test substance and alcohol are brought into contact with a TRPA1-expressing cell and a TRPV1-expressing cell, respectively, or brought into contact with a TRPA1-TRPV1 co-expressing cell and caused by alcohol via TRPA1. Physiological events and physiological events caused by alcohol by TRPV1.
本発明者らは、アルコールを、ＴＲＰチャネルを発現する種々の細胞と接触させたとき、ＴＲＰチャネルのうち、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１両方が活性化するが、ＴＲＰＭ８およびＴＲＰＶ２のいずれもが活性化しないことを見出した。さらに、本発明者らは、被験物質の存在下において、アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびアルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、前記被験物質がアルコールによる皮膚などへの刺激を抑制する物質であるか否かを評価することができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。 We have shown that when alcohol is contacted with various cells that express TRP channels, both TRPA1 and TRPV1 are activated, but neither TRPM8 nor TRPV2 are activated. I found it. Furthermore, the present inventors measured the physiological event caused by alcohol via TRPA1 and the physiological event caused by alcohol via TRPV1 in the presence of the test substance, whereby the test substance is caused by alcohol. It has been found that it is possible to evaluate whether or not a substance suppresses irritation to the skin. The present invention is based on these findings.
以下、アルコールによる皮膚などへの刺激をアルコール刺激という。また、本明細書において、アルコール刺激抑制物質とは、前記アルコール刺激を抑制する物質をいう。 Hereinafter, stimulation of the skin and the like with alcohol is referred to as alcohol stimulation. Moreover, in this specification, an alcohol stimulus suppression substance means the substance which suppresses the said alcohol stimulus.
本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法は、被験物質とアルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞と接触させる点に１つの大きな特徴がある。本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法によれば、アルコールによってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象に対する被験物質の影響およびアルコールによってＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象に対する被験物質の影響を簡便な操作で測定することができるので、被験物質がアルコール刺激を抑制するか否かを簡便な操作で評価することができる。 The method for evaluating an alcohol stimulation-suppressing substance of the present invention has one major feature in that a test substance and alcohol are brought into contact with a TRPA1-expressing cell and a TRPV1-expressing cell, or a TRPA1-TRPV1 co-expressing cell. According to the method for evaluating an alcohol stimulation inhibitor of the present invention, the influence of a test substance on a physiological event caused by alcohol via TRPA1 and the influence of the test substance on a physiological event caused by alcohol via TRPV1 are simplified. Since it can measure by operation, it can be evaluated by simple operation whether a test substance suppresses alcohol stimulation.
また、本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法には、被験物質を評価する際に、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いているか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いている点にも１つの大きな特徴がある。このように、本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法によれば、実験動物などと比べて、低コストで、かつ取扱いが簡便な細胞を用いるので、前記アルコール刺激抑制物質を低コストで評価することができる。 In addition, the method for evaluating an alcohol stimulation inhibitor of the present invention uses a TRPA1-expressing cell and a TRPV1-expressing cell or a TRPA1-TRPV1-coexpressing cell when evaluating a test substance. There are two major features. Thus, according to the method for evaluating an alcohol stimulation-inhibiting substance of the present invention, the alcohol stimulation-inhibiting substance is evaluated at a low cost because cells that are low in cost and easy to handle are used compared to experimental animals and the like. be able to.
前記被験物質としては、特に限定されないが、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物などが挙げられる。前記被験物質は、そのまま用いてもよく、必要に応じて、溶媒に溶解させて用いてもよい。前記溶媒は、前記生理学的事象の測定に影響を与えない溶媒であることが好ましい。前記溶媒としては、例えば、生理的食塩水、水などが挙げられる。 Although it does not specifically limit as said test substance, For example, an inorganic compound, an organic compound, a plant extract, a microorganism culture, a microorganism extract, etc. are mentioned. The test substance may be used as it is, or may be used after being dissolved in a solvent, if necessary. The solvent is preferably a solvent that does not affect the measurement of the physiological event. Examples of the solvent include physiological saline and water.
本明細書において、前記アルコールとは、一価アルコールおよび多価アルコールをいう。 In the present specification, the alcohol refers to a monohydric alcohol and a polyhydric alcohol.
前記一価アルコールとしては、例えば、脂肪族一価アルコールなどが挙げられる。前記一価アルコールは、当該一価アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で的確に評価する観点から、好ましくは炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖の脂肪族一価アルコール、より好ましくは炭素数２〜８の直鎖または分岐鎖の脂肪族一価アルコールである。前記炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖の脂肪族一価アルコールとしては、例えば、エタノール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、ペンチルアルコール、ヘキシルアルコール、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、ノニルアルコール、デシルアルコールなどが挙げられる。 Examples of the monohydric alcohol include aliphatic monohydric alcohols. The monohydric alcohol is preferably a linear or branched aliphatic monohydric alcohol having 2 to 10 carbon atoms from the viewpoint of accurately evaluating a substance that suppresses stimulation by the monohydric alcohol with a simple operation. Is a linear or branched aliphatic monohydric alcohol having 2 to 8 carbon atoms. Examples of the linear or branched aliphatic monohydric alcohol having 2 to 10 carbon atoms include ethanol, propyl alcohol, butyl alcohol, pentyl alcohol, hexyl alcohol, heptyl alcohol, octyl alcohol, nonyl alcohol, and decyl alcohol. Can be mentioned.
前記多価アルコールとしては、例えば、皮膚外用剤に配合される多価アルコールなどが挙げられる。前記皮膚外用剤に配合される多価アルコールとしては、例えば、脂肪族多価アルコールなどが挙げられる。前記多価アルコールは、当該多価アルコールによる刺激を抑制する物質を簡便な操作で的確に評価する観点から、好ましくは炭素数２〜６の脂肪族二価アルコール、より好ましくは炭素数３〜６の脂肪族二価アルコールである。前記炭素数２〜６の脂肪族二価アルコールとしては、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ペンチレングリコール、ヘキシレングリコールなどが挙げられる。 As said polyhydric alcohol, the polyhydric alcohol mix | blended with a skin external preparation is mentioned, for example. As a polyhydric alcohol mix | blended with the said skin external preparation, an aliphatic polyhydric alcohol etc. are mentioned, for example. The polyhydric alcohol is preferably an aliphatic dihydric alcohol having 2 to 6 carbon atoms, more preferably 3 to 6 carbon atoms, from the viewpoint of accurately evaluating a substance that suppresses stimulation by the polyhydric alcohol by a simple operation. It is an aliphatic dihydric alcohol. Examples of the aliphatic dihydric alcohol having 2 to 6 carbon atoms include propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, pentylene glycol, hexylene glycol and the like.
前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、マスタード、シナモアルデヒド、アリルイソチオシアネート、カルバクロール、アリシンなどによる化学刺激、冷覚刺激（例えば、１７℃前後での刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。 The TRPA1-expressing cell is a cell that expresses a physiological function of TRPA1. Examples of physiological functions of TRPA1 include chemical stimulation by mustard, cinnamaldehyde, allyl isothiocyanate, carvacrol, allicin, etc., cold stimulation (for example, stimulation at around 17 ° C.), pain stimulation, mechanical stimulation, etc. Examples include permeation of cations such as sodium ions and calcium ions from the outside to the inside of the cells by stimulation.
前記ＴＲＰＡ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＡ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＡ１発現細胞」ともいう）が好ましい。 Examples of the TRPA1-expressing cells include wild-type cells expressing endogenous TRPA1, cells introduced into a host cell so that a nucleic acid encoding TRPA1 can be expressed, and the like. Among the above-mentioned TRPA1-expressing cells, from the viewpoint of measuring a physiological event caused through TRPA1 by a simple operation, a cell in which a nucleic acid encoding TRPA1 has been introduced into a host cell so that it can be expressed (hereinafter referred to as “exogenous” Also referred to as “TRPA1-expressing cells”).
前記ＴＲＰＶ１発現細胞は、ＴＲＰＶ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＶ１の生理学的機能としては、例えば、カプサイシン、カンフル、プロトンなどによる化学刺激、熱覚刺激（例えば、４３℃前後の刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。 The TRPV1-expressing cell is a cell that expresses a physiological function of TRPV1. The physiological functions of TRPV1 include, for example, chemical stimulation with capsaicin, camphor, proton, etc., thermal stimulation (for example, stimulation at around 43 ° C.), pain stimulation, mechanical stimulation, etc. For example, permeation of cations such as sodium ions and calcium ions.
前記ＴＲＰＶ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＶ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＶ１発現細胞」ともいう）が好ましい。 Examples of the TRPV1-expressing cells include wild-type cells expressing endogenous TRPV1, and cells introduced into a host cell so that a nucleic acid encoding TRPV1 can be expressed. Among the above-mentioned TRPV1-expressing cells, from the viewpoint of measuring a physiological event caused through TRPV1 by a simple operation, a cell in which a nucleic acid encoding TRPV1 has been introduced into a host cell so that it can be expressed (hereinafter referred to as “exogenous” Also referred to as “TRPV1-expressing cells”).
前記内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、内耳の細胞などが挙げられる。また、前記内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、脳の細胞、膀胱上皮の細胞などが挙げられる。 The wild-type cell expressing endogenous TRPA1 is not particularly limited, and examples thereof include sensory nerve cells and inner ear cells. The wild-type cells expressing the endogenous TRPV1 are not particularly limited, and examples thereof include sensory nerve cells, brain cells, and bladder epithelial cells.
前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸がいずれも発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞においては、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記アルコールによってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象をそれぞれ測定する観点から、それぞれ別々の発現プロモーターの制御下にあることが好ましい。発現プロモーターは、宿主細胞内でＴＲＰＡ１を発現させるのに適したプロモーターであればよい。発現プロモーターは、用いられる宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。 Examples of the TRPA1-TRPV1 co-expressing cells include cells in which a nucleic acid encoding TRPA1 and a nucleic acid encoding TRPV1 are both introduced into a host cell so that they can be expressed. In the TRPA1-TRPV1 co-expressing cells, the TRPA1-encoding nucleic acid and the TRPV1-encoding nucleic acid each measure a physiological event caused by the alcohol via TRPA1 and a physiological event caused by TRPV1. Therefore, it is preferable that each is under the control of a separate expression promoter. The expression promoter may be any promoter that is suitable for expressing TRPA1 in a host cell. The expression promoter can be appropriately selected depending on the type of host cell used.
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、染色体外要素として前記核酸が存在している細胞であってもよく、前記核酸が染色体に組み込まれている細胞であってもよい。 The exogenous TRPA1-expressing cell, exogenous TRPV1-expressing cell, and TRPA1-TRPV1 co-expressing cell may be a cell in which the nucleic acid is present as an extrachromosomal element, and is a cell in which the nucleic acid is integrated into a chromosome. There may be.
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。また、前記外因性ＴＲＰＶ１発現細胞は、ＴＲＰＶ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。 The exogenous TRPA1-expressing cell can be obtained, for example, by transforming a host cell with a recombinant vector carrying a nucleic acid encoding TRPA1. The exogenous TRPV1-expressing cell can be obtained by transforming a host cell with a recombinant vector holding a nucleic acid encoding TRPV1. The TRPA1-TRPV1 co-expressing cells can be obtained, for example, by transforming host cells with a recombinant vector carrying a nucleic acid encoding TRPA1 and a nucleic acid encoding TRPV1.
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。また、前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよい。 The nucleic acid encoding TRPA1 may be a nucleic acid encoding human TRPA1 or a nucleic acid encoding TRPA1 of another animal. The nucleic acid encoding TRPV1 may be a nucleic acid encoding human TRPV1, or a nucleic acid encoding TRPV1 of another animal.
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトに適用することができるアルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、好ましくはヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸である。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＡ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。 The nucleic acid encoding TRPA1 is preferably a nucleic acid encoding human TRPA1 from the viewpoint of accurately evaluating an alcohol stimulation inhibitor that can be applied to humans. Examples of the nucleic acid encoding TRPA1 include a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the base sequence of a nucleic acid encoding human TRPA1 registered in GenBank as accession number: NM_007332. If the polypeptide encoded by the nucleic acid expresses the physiological function, the nucleic acid encoding TRPA1 has one or several nucleotide residues in or at the end of the base sequence of the structural gene of TRPA1. It may be a mutant nucleic acid having a substitution, deletion or insertion.
また、前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、ヒトに適用することができるアルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、好ましくはヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸である。前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：３に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿０８０７０４．３としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＶ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。また、ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸とオルタナティブスプライシングを介して異なるスプライシングバリアントであってもよい。前記スプライシングバリアントとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８７２７．５、ＮＭ＿０８０７０５．３、ＮＭ＿０８０７０６．３などの塩基配列で示される核酸が挙げられる。 The nucleic acid encoding TRPV1 is preferably a nucleic acid encoding human TRPV1 from the viewpoint of accurately evaluating an alcohol stimulation inhibitor that can be applied to humans. Examples of the nucleic acid encoding TRPV1 include a nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a nucleotide sequence of a nucleic acid encoding human TRPV1 registered in GenBank as Accession Number: NM — 0807044.3. If the polypeptide encoded by the nucleic acid expresses the physiological function, the nucleic acid encoding TRPV1 has one or several nucleotide residues inside or at the end of the base sequence of the structural gene of TRPV1. It may be a mutant nucleic acid having a substitution, deletion or insertion. Further, the nucleic acid encoding TRPV1 may be a splicing variant that is different from the nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 through alternative splicing. Examples of the splicing variants include nucleic acids represented by base sequences such as GenBank accession numbers: NM — 018727.5, NM — 0800705.3, NM — 0807066.3.
ＴＲＰＡ１をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
As a mutant nucleic acid of a nucleic acid encoding TRPA1, for example,
(A) Sequence homology calculated by aligning the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under the conditions of Cost to open
(B) a polypeptide that encodes an amino acid sequence having a substitution, deletion or addition of one or several amino acid residues in SEQ ID NO: 2 and that expresses a function of allowing the encoded polypeptide to permeate at least a cation. A nucleic acid that is a peptide,
(C) a polypeptide that hybridizes with a nucleic acid complementary to the nucleic acid consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and the encoded polypeptide expresses a function of permeating cations. A certain nucleic acid etc. are mentioned.
また、ＴＲＰＶ１をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（ａ）配列番号：３に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｂ）配列番号：４において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｃ）配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
In addition, as a mutant nucleic acid of a nucleic acid encoding TRPV1, for example,
(A) Sequence homology calculated by aligning the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 under the conditions of Cost to open
(B) in SEQ ID NO: 4, encoding an amino acid sequence having substitution, deletion or addition of one or several amino acid residues, and the encoded polypeptide is a polypeptide that expresses at least the physiological function A nucleic acid,
(C) a nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid complementary to the nucleic acid consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 under stringent conditions, and the encoded polypeptide is a polypeptide that expresses the physiological function Etc.
なお、本明細書において、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸または配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸と、前記核酸に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられる。 In the present specification, the stringent conditions include, for example, a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a high level corresponding to the nucleic acid. The nucleic acid to be hybridized was mixed with a hybridization solution [composition: 6 × SSC (composition: 0.9 M sodium chloride, 0.09 M sodium citrate, adjusted to pH 7.0), 0.5 mass% sodium dodecyl sulfate, 5 X Denhardt's solution, 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA, 50% by volume formamide] at room temperature, more stringent conditions at 42 ° C. or higher, and further stringent conditions at 60 ° C. or higher for 10 hours. For example, 2 × SSC, 0.1 × S as a more stringent condition Examples of the conditions include washing under the ionic strength conditions of SC, room temperature, 42 ° C. or more as a more stringent condition, and conditions of washing at a temperature of 60 ° C. or more as a more stringent condition.
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：３に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：３に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。 The nucleic acid encoding TRPA1 was designed and synthesized based on, for example, a hybridization method using a probe prepared based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It can be obtained by a nucleic acid amplification method using a primer pair composed of two kinds of oligonucleotide primers. The nucleic acid encoding TRPV1 is designed and synthesized based on, for example, a hybridization method using a probe prepared based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a base sequence shown in SEQ ID NO: 3. It can be obtained by a nucleic acid amplification method using a primer pair composed of various oligonucleotide primers.
前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸および／またはＴＲＰＶ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。これらのなかでは、ヒトにおけるＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１の生理学的機能を十分に再現する観点から、好ましくは動物細胞である。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞などが挙げられる。サル細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＯＳ−７細胞などが挙げられる。マウス細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。ヒト細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。前記宿主細胞のなかでは、取扱いが容易であり、アルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましい。これらのなかでは、ＴＲＰチャネルがほとんど発現しておらず、外因性のＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１の活性化を容易にかつ選択的に測定することができる観点およびヒトへの適用に適したアルコール刺激抑制剤を的確に評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞が好ましい。 The host cell is not particularly limited as long as the nucleic acid encoding TRPA1 and / or the nucleic acid encoding TRPV1 can be efficiently expressed and can be cultured. For example, animal cells, bacterial cells, Examples include plant cells and insect cells. Among these, animal cells are preferable from the viewpoint of sufficiently reproducing the physiological functions of TRPA1 and / or TRPV1 in humans. Examples of animal cells include human cells, monkey cells, mouse cells, and the like. Although it does not specifically limit as a monkey cell, For example, a COS-7 cell etc. are mentioned. Although it does not specifically limit as a mouse cell, For example, a CHO cell, a NIH3T3 cell, etc. are mentioned. Although it does not specifically limit as a human cell, For example, HEK293 cell, Hela cell, etc. are mentioned. Among the host cells, HEK293 cells, CHO cells, COS-7 cells, and NIH3T3 cells are preferable from the viewpoint of easy handling and accurate evaluation of the alcohol stimulation inhibitor. Among these, the TRP channel is hardly expressed, the activation of exogenous TRPA1 and / or TRPV1 can be easily and selectively measured, and the suppression of alcohol stimulation suitable for human application From the viewpoint of accurately evaluating the agent, HEK293 cells are preferred.
前記組換えベクターは、ＴＲＰＡ１をコードする核酸および／またはＴＲＰＶ１をコードする核酸と慣用のベクターとを連結させることによって得られるベクターである。前記ベクターは、調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。前記ベクターは、形質転換後に、組換えベクターを保持する細胞を容易に選択する観点から、好ましくは選択マーカー遺伝子を有するベクターである。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。これらのベクターは、用いられる宿主細胞に応じて適宜選択することができる。なお、前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞および外因性ＴＲＰＶ１発現細胞を作製するための組換えベクターに用いられるベクターは、発現プロモーターを有していてもよい。 The recombinant vector is a vector obtained by linking a nucleic acid encoding TRPA1 and / or a nucleic acid encoding TRPV1 and a conventional vector. The vector may be a vector that can be easily prepared, can be efficiently introduced into a host cell, and can efficiently express TRPA1 and / or TRPV1 in the host cell. The vector is preferably a vector having a selection marker gene from the viewpoint of easily selecting cells carrying the recombinant vector after transformation. Examples of the vector include a plasmid vector and a virus vector. These vectors can be appropriately selected according to the host cell used. In addition, the vector used for the recombinant vector for producing the exogenous TRPA1-expressing cell and the exogenous TRPV1-expressing cell may have an expression promoter.
前記組換えベクターを用いた形質転換は、用いられる宿主細胞の種類に応じて、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などの形質転換方法によって行なうことができる。これらの形質転換方法は、例えば、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールドスプリングハーバープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕などの記載に準じて行なうことができる。形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどによって行なうことができる。 Transformation using the recombinant vector can be performed by a transformation method such as electroporation, lipofection, transfection, or particle gun depending on the type of host cell used. These transformation methods are based on, for example, the description of Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989). Can be done. Selection of exogenous TRPA1-expressing cells, exogenous TRPV1-expressing cells and TRPA1-TRPV1 co-expressing cells from the transformed cells depends on the selection marker gene, for example, when the recombinant vector used has a selectable marker gene It can be carried out by culturing in a selective medium.
得られた細胞が、ＴＲＰＡ１を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１〜１０ｍＭパラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＡ１を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、パラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。また、得られた細胞が、ＴＲＰＶ１を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１００ｎＭ〜１０μＭカプサイシンと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＶ１を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、カプサイシンと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。 Confirmation that the obtained cells are cells expressing TRPA1, for example, by contacting the cells with 1 to 10 mM paraoxybenzoic acid methyl ester, and by measuring the intracellular calcium ion concentration described later, This can be done by measuring the intracellular calcium ion concentration of the cells. When the cell expresses TRPA1, the intracellular calcium ion concentration of the cell after contact is higher than the intracellular calcium ion concentration of the cell not contacted with paraoxybenzoic acid methyl ester. Confirmation that the obtained cell is a cell expressing TRPV1 can be performed by, for example, contacting the cell with 100 nM to 10 μM capsaicin, and measuring the intracellular calcium ion concentration as described later. Can be carried out by measuring the intracellular calcium ion concentration. When the cell expresses TRPV1, the intracellular calcium ion concentration of the cell after contact is higher than the intracellular calcium ion concentration of the cell not contacted with capsaicin.
被験物質と、アルコールと、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞との接触は、例えば、各細胞の培養に適した培地中で、被験物質と、アルコールと、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞とをインキュベーションすること、被験物質と、アルコールと、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞との混合物をインキュベーションすることなどによって行なわれる。なお、ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いる場合、アルコールによってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象およびＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象をそれぞれ測定するタイミングに合わせて、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１をそれぞれ別々に発現させるようにする。 Contact between the test substance, alcohol, and TRPA1-expressing cells, TRPV1-expressing cells, or TRPA1-TRPV1 co-expressing cells can be performed, for example, in a medium suitable for culturing each cell, the test substance, alcohol, and TRPA1-expressing cells, It is carried out by incubating a TRPV1-expressing cell or a TRPA1-TRPV1-coexpressing cell, incubating a test substance, alcohol, a mixture of a TRPA1-expressing cell, a TRPV1-expressing cell, or a TRPA1-TRPV1-coexpressing cell, or the like. When TRPA1-TRPV1 co-expressing cells are used, TRPA1 and TRPV1 are expressed separately in accordance with the timing of measuring the physiological event caused by alcohol and the physiological event caused by TRPV1, respectively. I will let you.
前記培地としては、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞が生育するのに適した成分〔例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質など）、血清（例えば、ウシ胎仔血清など）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなど〕を含む培地であればよい。前記培地は、慣用の基本培地に前記成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。基本培地としては、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地などが挙げられる。かかる培地は、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、用いられる細胞がＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞である場合、培地として、１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。 Examples of the medium include components suitable for growth of TRPA1-expressing cells, TRPV1-expressing cells, or TRPA1-TRPV1 co-expressing cells [for example, glucose, amino acids, peptone, vitamins, cell growth promoting factors (for example, cell growth factors, hormones). , Binding protein, cell adhesion factor, lipid, etc.), serum (eg, fetal bovine serum, etc.), calcium chloride, magnesium chloride, etc. The medium may be a medium obtained by supplementing a conventional basic medium with the above components, or a commercially available medium. The basic medium is not particularly limited, and examples thereof include MEM medium, DMEM medium, and RPMI 1640 medium. Such a medium can be appropriately selected according to the type of cell. For example, when the cells to be used are cells obtained from HEK293 cells, a 10% by mass fetal bovine serum-containing DMEM medium or the like is used as the medium.
ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞の各使用量は、試験データの信頼性の観点から、１視野（データ解析範囲）あたり、それぞれ１×１０1細胞以上が好ましく、１×１０2細胞以上がより好ましく、細胞の間隔を確保し、細胞が密になりすぎないようにする観点から、３×１０２細胞以下が好ましく、２×１０２細胞以下がより好ましい。 Each use amount of TRPA1-expressing cells, TRPV1-expressing cells and TRPA1-TRPV1 co-expressing cells is preferably 1 × 10 1 cells or more per visual field (data analysis range) from the viewpoint of the reliability of test data. 10 2 cells or more are more preferable, and 3 × 10 2 cells or less are preferable and 2 × 10 2 cells or less are more preferable from the viewpoint of securing the cell spacing and preventing the cells from becoming too dense.
前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させる被験物質の量は、被験物質の種類に応じて適宜設定することができる。 The amount of the test substance to be brought into contact with the TRPA1-expressing cell, the TRPV1-expressing cell, and the TRPA1-TRPV1 co-expressing cell can be appropriately set according to the type of the test substance.
前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させるアルコールの量は、例えば、当該アルコールが炭素数２〜６の脂肪族一価アルコールまたは炭素数２〜６の多価アルコールである場合、通常、皮膚外用剤に配合される量のアルコールによる刺激を再現し、アルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、細胞１×１０2個あたり、１００ｍＭ以上であることが好ましく、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１以外の因子による応答を抑制する観点から、５Ｍ以下であることが好ましく、２Ｍ以下であることがより好ましく、１Ｍ以下であることがさらに好ましい。 The amount of alcohol to be brought into contact with the TRPA1-expressing cell, TRPV1-expressing cell and TRPA1-TRPV1 co-expressing cell is, for example, an aliphatic monohydric alcohol having 2 to 6 carbon atoms or a polyhydric alcohol having 2 to 6 carbon atoms. In general, from the viewpoint of reproducing the stimulation by the amount of alcohol blended in the external preparation for skin and accurately evaluating the alcohol stimulation inhibitor, it is preferably 100 mM or more per 1 × 10 2 cells. From the viewpoint of suppressing the response due to factors other than TRPA1 and TRPV1, it is preferably 5M or less, more preferably 2M or less, and even more preferably 1M or less.
また、前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させるアルコールの量は、例えば、当該アルコールが炭素数７〜８の脂肪族一価アルコールである場合、アルコール刺激抑制物質を的確に評価する観点から、細胞１×１０2個あたり、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、０．５ｍＭ以上であることがより好ましく、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１以外の因子による応答を抑制する観点から、５ｍＭ以下であることが好ましく、２ｍＭ以下であることがより好ましい。 The amount of alcohol to be contacted with the TRPA1-expressing cell, TRPV1-expressing cell, and TRPA1-TRPV1 co-expressing cell is, for example, when the alcohol is an aliphatic monohydric alcohol having 7 to 8 carbon atoms, From the viewpoint of accurately evaluating the above, it is preferably 0.1 mM or more, more preferably 0.5 mM or more per 1 × 10 2 cells, and from the viewpoint of suppressing a response caused by factors other than TRPA1 and TRPV1. It is preferably 5 mM or less, and more preferably 2 mM or less.
さらに、前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させるアルコールの量は、例えば、当該アルコールが炭素数９〜１０の脂肪族一価アルコールである場合、細胞とアルコールとの接触時に用いられる培地への炭素数９〜１０の脂肪族一価アルコールの溶解度などにより異なるので一概には決定することができない。 Furthermore, the amount of alcohol to be brought into contact with the TRPA1-expressing cell, TRPV1-expressing cell, and TRPA1-TRPV1 co-expressing cell is, for example, when the alcohol is an aliphatic monohydric alcohol having 9 to 10 carbon atoms, Since it differs depending on the solubility of the aliphatic monohydric alcohol having 9 to 10 carbon atoms in the medium used at the time of contact, it cannot be determined in general.
なお、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、それぞれ、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持するために、必要に応じて、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を、各細胞に適した条件下で、予めインキュベーションしておいてもよい。 The TRPA1-expressing cell, the TRPV1-expressing cell, and the TRPA1-TRPV1 co-expressing cell are each converted into a TRPA1-expressing cell, a TRPV1-expressing cell, if necessary, in order to maintain the cell in a state suitable for measuring the physiological event. The expression cells and the TRPA1-TRPV1 co-expression cells may be pre-incubated under conditions suitable for each cell.
前記インキュベーションは、用いられる細胞の種類に応じた方法によって行なうことができる。かかる方法としては、例えば、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法などが挙げられる。また、インキュベーション温度、インキュベーション時間、二酸化炭素濃度などの条件は、用いられる細胞に応じて適宜設定される。例えば、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞として、ＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞を用いる場合、かかる細胞は、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持する観点から、通常、５体積％二酸化炭素を含む雰囲気中で、３６〜３８℃、好ましくは３６．５〜３７．５℃でインキュベーションすればよい。 The incubation can be performed by a method according to the type of cell used. Examples of such methods include monolayer stationary culture, suspension culture, rotational culture, and three-dimensional carrier culture. In addition, conditions such as incubation temperature, incubation time, and carbon dioxide concentration are appropriately set according to the cells used. For example, when cells obtained from HEK293 cells are used as TRPA1-expressing cells, TRPV1-expressing cells and TRPA1-TRPV1-co-expressing cells, such cells maintain the cells in a state suitable for measuring said physiological event. From the viewpoint, the incubation is usually performed at 36 to 38 ° C., preferably 36.5 to 37.5 ° C. in an atmosphere containing 5% by volume of carbon dioxide.
前記生理学的事象としては、アルコールとの接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化、アルコールとの接触前後の一定電位下での電流の変化、これらの組み合わせなどが挙げられる。本発明においては、簡便な操作で、かつ高感度で測定することができる観点から、前記生理学的事象は、好ましくはアルコールとの接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である。 Examples of the physiological event include changes in intracellular calcium ion concentration before and after contact with alcohol, changes in current at a constant potential before and after contact with alcohol, and combinations thereof. In the present invention, the physiological event is preferably a change in intracellular calcium ion concentration before and after contact with alcohol, from the viewpoint of simple measurement and high sensitivity.
前記一定の電位での電流の測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。 Examples of the method for measuring the current at the constant potential include a patch clamp method.
ここで、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いた場合、被験物質がアルコール刺激抑制物質であることの判断基準としては、例えば、アルコールと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における一定の電位下での電流と比べて、被験物質とアルコールとを接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が小さくなっており、かつアルコールと接触させたＴＲＰＶ１発現細胞における一定の電位下での電流と比べて、被験物質とアルコールとを接触させたＴＲＰＶ１発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が小さくなっていること、すなわち、被験物質によって、アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる一定の電位下での電流の増加およびアルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる一定の電位下での電流の増加が抑制されていることなどが挙げられる。 Here, when the TRPA1-expressing cell and the TRPV1-expressing cell are used, as a criterion for determining that the test substance is an alcohol stimulation-inhibiting substance, for example, a current at a constant potential in a TRPA1-expressing cell brought into contact with alcohol In comparison, the current under the same potential as the potential in the TRPA1-expressing cells in contact with the test substance and alcohol is small, and compared with the current under a constant potential in the TRPV1-expressing cells in contact with alcohol. Thus, the current under the same potential as that in the TRPV1-expressing cell in which the test substance is brought into contact with the alcohol is reduced, that is, under a constant potential caused by the test substance through the TRPA1. Caused by the increase in current and alcohol via TRPV1 Increase in the constant current under a potential is like that is suppressed that.
また、ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いた場合、被験物質がアルコール刺激抑制物質であることの判断基準としては、ＴＲＰＡ１を発現させるとともにアルコールと接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における一定の電位下での電流と比べて、ＴＲＰＡ１を発現させるとともに被験物質とアルコールとを接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が小さくなっており、かつＴＲＰＶ１を発現させるとともにアルコールと接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における一定の電位下での電流と比べて、ＴＲＰＶ１を発現させるとともに被験物質とアルコールとを接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が小さくなっていることなどが挙げられる。 In addition, when a TRPA1-TRPV1 co-expressing cell is used, as a criterion for determining that the test substance is an alcohol stimulation-inhibiting substance, TRPA1-TRPV1 co-expressing cell in which TRPA1 is expressed and contacted with alcohol is used at a certain potential. Compared with the current in the cell, the current at the same potential as that in the TRPA1-TRPV1 co-expressing cell in which TRPA1 is expressed and the test substance and alcohol are brought into contact is reduced, and TRPV1 is expressed and alcohol Compared to the current at a constant potential in the TRPA1-TRPV1 co-expressing cell contacted with the TRPA1-TRPV1 co-expressing cell, the TRPA1-TRPV1 co-expressing cell in which the TRPV1 is expressed and the test substance and alcohol are contacted The current of the And the like.
細胞内カルシウムイオン濃度は、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、細胞内のカルシウムイオンに前記蛍光カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を調べる方法などを用いて算出することができる。前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンと結合した当該蛍光カルシウム指示薬の量によってその蛍光特性が変化する試薬であればよく、特に限定されないが、例えば、ＦＵＲＡ ２、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられる。
The intracellular calcium ion concentration is, for example, by introducing a fluorescent reagent based on a calcium chelator (hereinafter also referred to as “fluorescent calcium indicator”) into a TRPA1-expressing cell, and binding the fluorescent calcium indicator to intracellular calcium ions, It can be calculated using a method for examining the fluorescence intensity of a fluorescent calcium indicator bonded to calcium ions. The fluorescent calcium indicator is not particularly limited as long as it is a reagent whose fluorescence characteristics change depending on the amount of the fluorescent calcium indicator bound to calcium ions, for example,
なお、蛍光カルシウム指示薬が２種類の励起波長を有する場合、より精度を高める観点から、各励起波長における蛍光強度から蛍光強度比を算出することが好ましい。例えば、蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭの励起波長は、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍである。この場合、ＴＲＰＡ１またはＴＲＰＶ１のアゴニストと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度に対する被験物質およびアルコールと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度の変化は、式（Ｉ）： In addition, when a fluorescent calcium indicator has two types of excitation wavelengths, it is preferable to calculate a fluorescence intensity ratio from the fluorescence intensity in each excitation wavelength from a viewpoint of improving accuracy. For example, the excitation wavelengths of FURA 2-AM, a fluorescent calcium indicator, are 340 nm and 380 nm. In this case, the change in the intracellular calcium ion concentration when contacted with the test substance and alcohol with respect to the intracellular calcium ion concentration when contacted with an agonist of TRPA1 or TRPV1 is represented by the formula (I):
に基づいて、変化率（％）を算出することにより調べることができる。なお、前記Δ蛍光強度比Aは、式（ＩＩ）： Can be examined by calculating the rate of change (%). The Δ fluorescence intensity ratio A is expressed by the formula (II):
に基づいて算出することができる。また、前記Δ蛍光強度比Bは、式（ＩＩＩ）： Can be calculated based on Further, the Δ fluorescence intensity ratio B is represented by the formula (III):
に基づいて算出することができる。なお、本明細書において、「蛍光強度340nm」は励起波長３４０ｎｍにおける蛍光強度を示し、「蛍光強度380nm」は励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度を示す。 Can be calculated based on In this specification, “fluorescence intensity 340 nm ” indicates fluorescence intensity at an excitation wavelength of 340 nm, and “fluorescence intensity 380 nm ” indicates fluorescence intensity at an excitation wavelength of 380 nm.
ここで、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いた場合、被験物質がアルコール刺激抑制物質であることの判断基準としては、例えば、アルコールに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度と比べて、被験物質とアルコールとに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度が低くなっており、かつアルコールに接触させたＴＲＰＶ１発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度と比べて、被験物質とアルコールとに接触させたＴＲＰＶ１発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度が低くなっていること、すなわち、被験物質によって、アルコールによってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウム濃度の増加およびアルコールによってＴＲＰＶ１を介して引き起こされる細胞内カルシウム濃度の増加が抑制されていることなどが挙げられる。 Here, when the TRPA1-expressing cell and the TRPV1-expressing cell are used, as a criterion for determining that the test substance is an alcohol stimulation inhibitor, for example, compared with the intracellular calcium ion concentration in the TRPA1-expressing cell brought into contact with alcohol The intracellular calcium ion concentration in the TRPA1-expressing cells brought into contact with the test substance and alcohol is low, and compared with the intracellular calcium ion concentration in the TRPV1-expressing cells contacted with the alcohol, Intracellular calcium ion concentration in the contacted TRPV1-expressing cells is low, that is, the increase in intracellular calcium concentration caused by alcohol through TRPA1 by the test substance and TRPV1 induced by alcohol. The increase in intracellular calcium concentration caused is suppressed, and the like.
また、ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いた場合、被験物質がアルコール刺激抑制物質であることの判断基準としては、
（ａ）ＴＲＰＡ１を発現させるとともに、アルコールに接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度と比べて、ＴＲＰＡ１を発現させるとともに、被験物質とアルコールとに接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度が低くなっていること、
（ｂ）ＴＲＰＶ１を発現させるとともに、アルコールに接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度と比べて、ＴＲＰＶ１を発現させるとともに、被験物質とアルコールとに接触させたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度が低くなっていること
などが挙げられる。
In addition, when a TRPA1-TRPV1 co-expressing cell is used, as a criterion for determining that the test substance is an alcohol stimulation inhibitor,
(A) TRPA1 is expressed and compared with the intracellular calcium ion concentration in TRPA1-TRPV1 co-expressing cells contacted with alcohol, TRPA1 is expressed, and TRPA1-TRPV1 is co-expressed with test substance and alcohol The intracellular calcium ion concentration in the cell is low,
(B) TRPA1-TRPV1 co-expressed with TRPV1 expressed and compared with intracellular calcium ion concentration in TRPA1-TRPV1 co-expressed cells brought into contact with alcohol and TRPV1-TRPV1 co-expressed with test substance and alcohol For example, the intracellular calcium ion concentration in the cell is low.
本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法により、アルコール刺激抑制物質であることが判明した被験物質は、例えば、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールを配合した化粧品、皮膚外用剤などにより皮膚などで引き起こされる感覚刺激を抑制する成分として用いることができる。したがって、本発明のアルコール刺激抑制物質の評価方法によれば、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールによって皮膚トラブルを生じやすい人に適した化粧品、皮膚外用剤などの成分の評価およびスクリーニングが可能になる。 The test substance that has been found to be an alcohol stimulation inhibitor by the method for evaluating an alcohol stimulation inhibitor of the present invention is, for example, a cosmetic or skin external preparation containing ethanol or a polyhydric alcohol having 2 to 6 carbon atoms. It can be used as a component that suppresses sensory stimulation caused by the above. Therefore, according to the method for evaluating an alcohol stimulation-inhibiting substance of the present invention, evaluation and screening of components such as cosmetics and skin external preparations suitable for people who are likely to cause skin troubles with ethanol or a polyhydric alcohol having 2 to 6 carbon atoms. It becomes possible.
以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to the examples.
（製造例１）
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μｌとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μｌと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）２００μｌとを混合し、混合物ＩＩを得た。
(Production Example 1)
A cDNA encoding human TRPA1 [polynucleotide at positions 63 to 3888 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (GenBank accession number: NM_007332)] is a vector for mammalian cells (trade name: pcDNA3, manufactured by Invitrogen). .1 (+)] to obtain a human TRPA1 expression vector. 1 μg of the obtained human TRPA1 expression vector was mixed with 6 μl of a gene introduction reagent [manufactured by Invitrogen, trade name: PLUS Reagent, catalog number: 11514-015] to obtain a mixture I. In addition, 4 μl of cationic lipid for gene introduction [manufactured by Invitrogen, trade name: Lipofectamine (registered trademark), catalog number: 18324-012] and medium for reducing serum use [trade name: OPTI-MEM (manufactured by Invitrogen), registered (Trademark) I Reduced-Serum Medium (Cat. No. 11058021) 200 μl was mixed to obtain a mixture II.
また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。 Further, in a DMEM medium containing 10% by mass FBS on a petri dish having a diameter of 35 mm maintained at 37 ° C. in an atmosphere of 5% by volume of carbon dioxide, 5 × 10 5 cells of HEK293 cells were changed to 70% confluency. Cultured.
得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。 By adding the mixture I and the mixture II to the obtained cell culture, the human TRPA1 expression vector was introduced into HEK293 cells to obtain TRPA1-expressing cells.
（製造例２）
製造例１において、ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡの代わりにヒトＴＲＰＶ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ＿０８０７０４．３）に示される塩基配列の２７６位〜２７９５位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例１と同様にしてＴＲＰＶ１発現細胞を得た。
(Production Example 2)
In Production Example 1, cDNA encoding human TRPV1 instead of cDNA encoding human TRPA1 [Polynucleotide at positions 276 to 2795 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (GenBank accession number: MN — 0807044.3)] A TRPV1-expressing cell was obtained in the same manner as in Production Example 1 except that was used.
（製造例３）
製造例１において、ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡの代わりにヒトＴＲＰＭ８をコードするｃＤＮＡ〔ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２４０８０．４に示される塩基配列の４１位〜３３５５位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例１と同様にしてＴＲＰＭ８発現細胞を得た。
(Production Example 3)
Except that in Production Example 1, cDNA encoding human TRPM8 [GenBank accession number: polynucleotide at positions 41 to 3355 of the nucleotide sequence shown in NM_024080.4] was used instead of cDNA encoding human TRPA1. In the same manner as in Production Example 1, TRPM8-expressing cells were obtained.
（製造例４）
製造例１において、ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡの代わりにヒトＴＲＰＶ２をコードするｃＤＮＡ〔ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１６１１３．３に示される塩基配列の３６８位〜２６６２位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例１と同様にしてＴＲＰＶ２発現細胞を得た。
(Production Example 4)
Except that, in Production Example 1, cDNA encoding human TRPV2 (GenBank accession number: polynucleotide at positions 368 to 2662 of the nucleotide sequence shown in NM_016113.3) was used instead of cDNA encoding human TRPA1. In the same manner as in Production Example 1, TRPV2-expressing cells were obtained.
（実施例１）
（１）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
前記製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
Example 1
(1) Evaluation with TRPA1-expressing cells The TRPA1-expressing cells obtained in Production Example 1 are 10% by mass fetal fetus containing FURA 2-AM (manufactured by Invitrogen), a reagent for measuring intracellular calcium ions, at a final concentration of 5 μM. By incubating in serum-containing DMEM medium at room temperature for 60 minutes, FURA 2-AM was introduced into the TRPA1-expressing cells to obtain FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells.
得られたＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。 The obtained FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells were placed in each chamber of a fluorescence measuring apparatus with a circulating constant temperature chamber [manufactured by Hamamatsu Photonics, Inc., trade name: ARGUS-50]. Thereafter, FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells in the chamber were mixed with solvent A [composition: 140 mM sodium chloride, 5 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 2 mM calcium chloride, 10 mM glucose, 10 mM hepes hydrochloride buffer (pH 7.4)]. Washed with.
つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、試料として、アルコール水溶液を還流し、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞とアルコール水溶液とを混合した。なお、前記アルコール水溶液として、２００ｍＭエタノール水溶液、５００ｍＭエタノール水溶液、１Ｍエタノール水溶液、５Ｍエタノール水溶液、２００ｍＭジプロピレングリコール水溶液、５００ｍＭジプロピレングリコール水溶液、１Ｍジプロピレングリコール水溶液、２００ｍＭプロピレングリコール水溶液、５００ｍＭプロピレングリコール水溶液、１Ｍプロピレングリコール水溶液、２００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液、５００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液または１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた。
Next, an alcohol aqueous solution was refluxed as a sample into the chamber containing the washed FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells, and the FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells and the alcohol aqueous solution were mixed. As the alcohol aqueous solution, 200 mM ethanol aqueous solution, 500 mM ethanol aqueous solution, 1 M ethanol aqueous solution, 5 M ethanol aqueous solution, 200 mM dipropylene glycol aqueous solution, 500 mM dipropylene glycol aqueous solution, 1 M dipropylene glycol aqueous solution, 200 mM propylene glycol aqueous solution, 500 mM propylene glycol aqueous solution. A 1M aqueous propylene glycol solution, a 200
その後、チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度380nm」という）を測定した。 Thereafter, fluorescence intensity based on FURA 2-AM (hereinafter referred to as “fluorescence intensity 340 nm ”) introduced into a TRPA1-expressing cell at an excitation wavelength of 340 nm and bound to intracellular calcium ions in the chamber and TRPA1 at an excitation wavelength of 380 nm. The intensity of fluorescence based on FURA 2-AM introduced into the expression cells (hereinafter referred to as “fluorescence intensity 380 nm ”) was measured.
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比アルコールを算出した。前記Δ蛍光強度比アルコールは、下記式（ＩＶ）： From the measured fluorescence intensity of 340 nm and fluorescence intensity of 380 nm , Δfluorescence intensity ratio alcohol was calculated. The Δ fluorescence intensity ratio alcohol is represented by the following formula (IV):
に基づいて算出した。 Calculated based on
また、アルコール水溶液の代わりにＴＲＰＡ１に対する既知のアゴニストであるアリルイソチオシアナート（２０μＭアリルイソチオシアナート水溶液）を用いたことを除き、前記アルコール水溶液を用いた場合と同様にしてΔ蛍光強度比アゴニストを算出した。前記Δ蛍光強度比アゴニストは、下記式（Ｖ）： In addition, a Δ fluorescence intensity ratio agonist was used in the same manner as in the case of using the aqueous alcohol solution except that allyl isothiocyanate (20 μM allyl isothiocyanate aqueous solution), which is a known agonist for TRPA1, was used instead of the aqueous alcohol solution. Calculated. The Δ fluorescence intensity ratio agonist is represented by the following formula (V):
に基づいて算出した。 Calculated based on
算出されたΔ蛍光強度比アルコールとΔ蛍光強度比アゴニストとから、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。 From the calculated Δ fluorescence intensity ratio alcohol and Δ fluorescence intensity ratio agonist , a Δ fluorescence intensity ratio alcohol / Δ fluorescence intensity ratio agonist was calculated.
実施例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図１に示す。 In Example 1, a graph showing the relationship between each sample and the value of the Δfluorescence intensity ratio alcohol / Δfluorescence intensity ratio agonist is shown in FIG.
図１において、試料番号１は２００ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は５００ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は５Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は２００ｍＭジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は５００ｍＭジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１Ｍジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は２００ｍＭプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号９は５００ｍＭプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１０は１Ｍプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１１は２００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１２は５００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号１３は１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
In FIG. 1,
図１に示された結果から、エタノール水溶液（試料番号１〜４）、ジプロピレングリコール水溶液（試料番号５〜７）、プロピレングリコール水溶液（試料番号８〜１０）および１，３−ブチレングリコール水溶液（試料番号１１〜１３）のいずれのアルコール水溶液を用いた場合であっても、アルコール水溶液におけるアルコールの濃度に依存して、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが大きくなっていることがわかる。これらの結果から、ＴＲＰＡ１を活性化させて細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることが知られているアリルイソチオシアナートと同様に、エタノール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコールおよび１，３−ブチレングリコールは、ＴＲＰＡ１を濃度依存的に活性化させ、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることがわかる。
From the results shown in FIG. 1, an aqueous ethanol solution (
（２）ＴＲＰＶ１発現細胞による評価
前記（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに製造例２で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＶ１に対する既知のアゴニストであるカプサイシン（１μＭカプサイシン水溶液）を用いたことを除き、前記（１）と同様にして、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
(2) Evaluation with TRPV1-expressing cells In (1), the TRPV1-expressing cells obtained in Production Example 2 are used instead of the TRPA1-expressing cells obtained in Production Example 1, and the agonist is a known agonist for TRPV1. A Δfluorescence intensity ratio alcohol / Δfluorescence intensity ratio agonist was calculated in the same manner as (1) except that capsaicin (1 μM capsaicin aqueous solution) was used.
実施例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図２に示す。 In Example 1, the graph which shows the relationship between each sample and the value of Δfluorescence intensity ratio alcohol / Δfluorescence intensity ratio agonist is shown in FIG.
図２において、試料番号１は２００ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は５００ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は５Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は２００ｍＭジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は５００ｍＭジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１Ｍジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は２００ｍＭプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号９は５００ｍＭプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１０は１Ｍプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１１は２００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１２は５００ｍＭ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号１３は１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
In FIG. 2,
図２に示された結果から、エタノール水溶液（試料番号１〜４）、ジプロピレングリコール水溶液（試料番号５〜７）、プロピレングリコール水溶液（試料番号８〜１０）および１，３−ブチレングリコール水溶液（試料番号１１〜１３）のいずれのアルコール水溶液を用いた場合であっても、濃度に依存して、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが大きくなっていることがわかる。これらの結果から、ＴＲＰＶ１を活性化させて細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることが知られているカプサイシンと同様に、エタノール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコールおよび１，３−ブチレングリコールは、ＴＲＰＶ１を濃度依存的に活性化させ、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることがわかる。
From the results shown in FIG. 2, an ethanol aqueous solution (
（比較例１）
実施例１の（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに、製造例３で得られたＴＲＰＭ８発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＭ８に対する既知のアゴニストであるメントール（１ｍＭメントール水溶液）を用いたことを除き、前記（１）と同様にしてΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
(Comparative Example 1)
In Example 1 (1), instead of the TRPA1-expressing cell obtained in Production Example 1, the TRPM8-expressing cell obtained in Production Example 3 was used, and as an agonist, menthol (1 mM menthol) which is a known agonist for TRPM8 A Δfluorescence intensity ratio alcohol / Δfluorescence intensity ratio agonist was calculated in the same manner as in (1) except that (aqueous solution) was used.
比較例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図３に示す。 In Comparative Example 1, a graph showing the relationship between each sample and the value of Δfluorescence intensity ratio alcohol / Δfluorescence intensity ratio agonist is shown in FIG.
図３において、試料番号１は１Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１Ｍジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１Ｍプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
In FIG. 3,
図３に示された結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれにおけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト（図１および２）と比べて、ＴＲＰＭ８発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストは、エタノール水溶液、ジプロピレングリコール水溶液、プロピレングリコール水溶液および１，３−ブチレングリコール水溶液のいずれのアルコール水溶液を用いた場合であっても、著しく小さいことがわかる。これらの結果から、エタノール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコールおよび１，３−ブチレングリコールは、ＴＲＰＭ８をほとんど活性化させず、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させないことがわかる。 From the results shown in FIG. 3, as compared to TRPA1 expressing cells and TRPV1 expressing cells delta fluorescence intensity ratio alcohol / delta fluorescence intensity ratio agonists in each (Fig. 1 and 2), delta fluorescence intensity ratio alcohol / delta in TRPM8-expressing cells It can be seen that the fluorescence intensity ratio agonist is remarkably small even when any alcohol aqueous solution of ethanol aqueous solution, dipropylene glycol aqueous solution, propylene glycol aqueous solution and 1,3-butylene glycol aqueous solution is used. From these results, it can be seen that ethanol, dipropylene glycol, propylene glycol and 1,3-butylene glycol hardly activate TRPM8 and do not increase the intracellular calcium ion concentration.
（比較例２）
実施例１の（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに、製造例４で得られたＴＲＰＶ２発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＶ２に対する既知のアゴニストであるリソフォスファチジルコリン（３０μＭリソフォスファチジルコリン水溶液）を用いたことを除き、前記実施例１の（１）と同様にして、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
(Comparative Example 2)
In Example 1 (1), instead of the TRPA1-expressing cell obtained in Production Example 1, the TRPV2-expressing cell obtained in Production Example 4 was used, and lysophosphatidyl, which is a known agonist for TRPV2, was used as an agonist. A Δfluorescence intensity ratio alcohol / Δfluorescence intensity ratio agonist was calculated in the same manner as in Example 1 (1) except that choline (30 μM lysophosphatidylcholine aqueous solution) was used.
比較例２において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図４に示す。 In Comparative Example 2, a graph showing the relationship between each sample and the value of Δfluorescence intensity ratio alcohol / Δfluorescence intensity ratio agonist is shown in FIG.
図４において、試料番号１は１Ｍエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１Ｍジプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１Ｍプロピレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１Ｍ１，３−ブチレングリコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
In FIG. 4,
図４に示された結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれにおけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト（図１および２）と比べて、ＴＲＰＶ２発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストは、エタノール水溶液、ジプロピレングリコール水溶液、プロピレングリコール水溶液および１，３−ブチレングリコール水溶液のいずれのアルコール水溶液を用いた場合であっても、著しく小さいことがわかる。これらの結果から、エタノール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコールおよび１，３−ブチレングリコールは、ＴＲＰＶ２をほとんど活性化させず、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させないことがわかる。 From the results shown in FIG. 4, as compared to TRPA1 expressing cells and TRPV1 expressing cells delta fluorescence intensity ratio alcohol / delta fluorescence intensity ratio agonists in each (Fig. 1 and 2), delta fluorescence intensity ratio alcohol / delta in TRPV2 expressing cells It can be seen that the fluorescence intensity ratio agonist is remarkably small even when any alcohol aqueous solution of ethanol aqueous solution, dipropylene glycol aqueous solution, propylene glycol aqueous solution and 1,3-butylene glycol aqueous solution is used. From these results, it can be seen that ethanol, dipropylene glycol, propylene glycol and 1,3-butylene glycol hardly activate TRPV2, and do not increase the intracellular calcium ion concentration.
以上説明したように、エタノールおよび炭素数２〜６の多価アルコールは、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１の両方を活性化させるが、ＴＲＰＭ８およびＴＲＰＶ２を活性化させないことがわかる。したがって、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞の両方を用いて、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象と、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールによりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象とを測定することにより、エタノールおよび炭素数２〜６の多価アルコールによる刺激を抑制する物質を評価することができることが示唆される。 As described above, it can be seen that ethanol and polyhydric alcohol having 2 to 6 carbon atoms activate both TRPA1 and TRPV1, but not TRPM8 and TRPV2. Therefore, using both TRPA1-expressing cells and TRPV1-expressing cells, physiological events caused by TRPA1 by ethanol or C2-6 polyhydric alcohols and ethanol or C2-6 polyhydric alcohols It is suggested that a substance that suppresses stimulation by ethanol and a polyhydric alcohol having 2 to 6 carbon atoms can be evaluated by measuring a physiological event caused through TRPV1.
（実施例２）
実施例１の（１）において、前記溶媒Ａで洗浄した後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、アルコール水溶液の代わりに、被験物質と１Ｍジプロピレングリコール水溶液との混合物を還流したことを除き、実施例１の（１）と同様にして蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。なお、前記被験物質として、ＴＲＰチャネルに対する既知のアンタゴニストであるルテニウムレッド〔シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製〕、ＴＲＰＡ１に対してブロッカーとして作用し、かつＴＲＰＶ１を活性化させる物質であるカンファー〔シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製〕、ＴＲＰＶ１に対するアンタゴニストであるカプサゼピン〔シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製〕およびマルチトール〔（株）林原生物化学研究所製〕を用いた。各混合物中における被験物質の濃度は、それぞれ、ルテニウムレッドが１０μＭ、カンファーが５ｍＭ、カプサゼピンが１０μＭ、マンニトールが５ｍＭとした。測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比ａを算出した。前記Δ蛍光強度比ａは、下記式（ＶＩ）：
(Example 2)
In Example 1 (1), the mixture of the test substance and 1M aqueous dipropylene glycol solution was refluxed into the chamber containing the FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells after washing with the solvent A instead of the aqueous alcohol solution. Except for the above, the fluorescence intensity 340 nm and the fluorescence intensity 380 nm were measured in the same manner as in Example 1 (1). As the test substance, ruthenium red (manufactured by Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.) which is a known antagonist for the TRP channel, camphor [Sigma Aldrich Japan, which acts as a blocker for TRPA1 and activates TRPV1. Manufactured by Co., Ltd.], capsazepine (manufactured by Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.) and maltitol (manufactured by Hayashibara Biochemical Research Institute, Inc.) which are antagonists to TRPV1 were used. The concentration of the test substance in each mixture was 10 μM for ruthenium red, 5 mM for camphor, 10 μM for capsazepine, and 5 mM for mannitol, respectively. From the measured fluorescence intensity 340 nm and fluorescence intensity 380 nm , Δfluorescence intensity ratio a was calculated. The Δ fluorescence intensity ratio a is expressed by the following formula (VI):
に基づいて算出した。 Calculated based on
また、実施例１の（１）において、前記溶媒Ａで洗浄した後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、アルコール水溶液の代わりに、１Ｍジプロピレングリコール水溶液を還流したことを除き、実施例１の（１）と同様にして、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比ｂを算出した。前記Δ蛍光強度比ｂは、下記式（ＶＩＩ）： Further, in Example 1 (1), except that the 1 M dipropylene glycol aqueous solution was refluxed in place of the alcohol aqueous solution into the chamber containing the FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells after washing with the solvent A. In the same manner as in Example 1 (1), a fluorescence intensity of 340 nm and a fluorescence intensity of 380 nm were measured. The Δfluorescence intensity ratio b was calculated from the measured fluorescence intensity 340 nm and fluorescence intensity 380 nm . The Δ fluorescence intensity ratio b is expressed by the following formula (VII):
に基づいて算出した。 Calculated based on
算出されたΔ蛍光強度比ａおよびΔ蛍光強度比ｂを用い、ジプロピレングリコールによるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する被験物質による抑制率を、式（ＶＩＩＩ）： Using the calculated Δ fluorescence intensity ratio a and Δ fluorescence intensity ratio b , the inhibition rate by the test substance against the increase in the calcium ion concentration in the TRPA1-expressing cells by dipropylene glycol is expressed by the formula (VIII):
に基づき算出した。実施例２において、各試料と抑制率との関係を示すグラフを図５に示す。 Calculated based on In Example 2, the graph which shows the relationship between each sample and the suppression rate is shown in FIG.
図５において、試料番号１はルテニウムレッドを用いた場合の抑制率、試料番号２はカンファーを用いた場合の抑制率、試料番号３はカプサゼピンを用いた場合の抑制率、試料番号４はマンニトールを用いた場合の抑制率を示す。
In FIG. 5,
一方、前記ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞を用いたことを除き、前記と同様にして、Δ蛍光強度比ａおよびΔ蛍光強度比ｂそれぞれを算出した。算出されたΔ蛍光強度比ａおよびΔ蛍光強度比ｂを用い、ジプロピレングリコールによるＴＲＰＶ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する被験物質による抑制率を、前記式（ＶＩＩＩ）に基づき算出した。実施例２において、各試料と抑制率との関係を示すグラフを図６に示す。 On the other hand, Δ fluorescence intensity ratio a and Δ fluorescence intensity ratio b were calculated in the same manner as described above except that FURA 2-AM-introduced TRPV1-expressing cells were used instead of the FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells. did. Using the calculated Δ fluorescence intensity ratio a and Δ fluorescence intensity ratio b , the inhibition rate by the test substance against the increase in the calcium ion concentration in the TRPV1-expressing cells by dipropylene glycol was calculated based on the above formula (VIII). In Example 2, the graph which shows the relationship between each sample and the suppression rate is shown in FIG.
図６において、試料番号１はルテニウムレッドを用いた場合の抑制率、試料番号２はカンファーを用いた場合の抑制率、試料番号３はカプサゼピンを用いた場合の抑制率、試料番号４はマンニトールを用いた場合の抑制率を示す。
In FIG. 6,
図５および図６に示された結果から、ルテニウムレッドを用いた場合、ジプロピレングリコールによるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する抑制率およびジプロピレングリコールによるＴＲＰＶ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する抑制率がいずれも４０％以上となっていることがわかる。これに対して、カンファー、カプサゼピンまたはマンニトールを用いた場合には、ジプロピレングリコールによるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する抑制率およびジプロピレングリコールによるＴＲＰＶ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する抑制率のいずれかまたは両者が２０％以下となっていることがわかる。 From the results shown in FIG. 5 and FIG. 6, when ruthenium red was used, the inhibition rate against the increase in the calcium ion concentration in the TRPA1-expressing cells by dipropylene glycol and the calcium ion concentration in the TRPV1-expressing cells by dipropylene glycol It can be seen that the inhibition rate against the increase is 40% or more. In contrast, when camphor, capsazepine or mannitol was used, the inhibition rate against the increase in the calcium ion concentration in TRPA1-expressing cells by dipropylene glycol and the increase in the calcium ion concentration in TRPV1-expressing cells by dipropylene glycol It can be seen that either or both of the inhibition rates are 20% or less.
したがって、これらの結果から、被験物質のうち、ルテニウムレッドは、エタノールまたは炭素数２〜６の多価アルコールによる刺激に対して最も高い抑制効果を示すことが示唆される。 Therefore, from these results, it is suggested that among the test substances, ruthenium red exhibits the highest inhibitory effect against stimulation by ethanol or a C2-C6 polyhydric alcohol.
以上の結果から、被験物質と、エタノールまたは多価アルコールとを、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させ、該エタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、簡便な操作で、当該被験物質がアルコール刺激抑制物質であるか否かを評価することができることがわかる。また、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いることの代わりに、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１を共発現するＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いた場合であっても、エタノールまたは多価アルコールによりＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象を測定することができるため、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞を用いる場合と同様に、簡便な操作で、当該被験物質がアルコール刺激抑制物質であるか否かを評価することができることがわかる。 Based on the above results, the test substance and ethanol or polyhydric alcohol are brought into contact with the TRPA1-expressing cell and TRPV1-expressing cell, respectively, and physiological events caused by the ethanol or polyhydric alcohol via TRPA1 and TRPV1 are measured. Thus, it can be seen that it is possible to evaluate whether or not the test substance is an alcohol stimulation suppressing substance by a simple operation. Further, instead of using a TRPA1-expressing cell and a TRPV1-expressing cell, even when a TRPA1-TRPV1 co-expressing cell that co-expresses TRPA1 and TRPV1 is used, each of TRPA1 and TRPV1 is mediated by ethanol or polyhydric alcohol. Therefore, it is possible to evaluate whether or not the test substance is a substance that suppresses alcohol stimulation by a simple operation as in the case of using TRPA1-expressing cells and TRPV1-expressing cells. You can see that
（試験例１）
（１）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
実施例１の（１）において、前記溶媒Ａで洗浄した後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、アルコール水溶液として、１ｍＭメタノール水溶液、１ｍＭエタノール水溶液、１ｍＭプロパノール水溶液、１ｍＭブタノール水溶液、１ｍＭペンチルアルコール水溶液、１ｍＭヘキシルアルコール水溶液、１ｍＭヘプチルアルコール水溶液または１ｍＭオクチルアルコール水溶液を還流したことを除き、実施例１の（１）と同様にしてΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。なお、１ｍＭヘプチルアルコール水溶液は、前記溶媒Ａによって、１Ｍヘプチルアルコールエタノール水溶液を１／１０００倍のヘプチルアルコール濃度となるように希釈した溶液である。また、１ｍＭオクチルアルコール水溶液は、前記溶媒Ａによって、１Ｍオクチルアルコール水溶液を１／１０００倍のオクチルアルコール濃度となるように希釈した溶液である。
(Test Example 1)
(1) Evaluation with TRPA1-expressing cells In (1) of Example 1, a 1 mM methanol aqueous solution and 1 mM ethanol aqueous solution were used as an alcohol aqueous solution in a chamber containing the FURA 2-AM-introduced TRPA1 expressing cells after washing with the solvent A. 1 mM propanol aqueous solution, 1 mM butanol aqueous solution, 1 mM pentyl alcohol aqueous solution, 1 mM hexyl alcohol aqueous solution, 1 mM heptyl alcohol aqueous solution, or 1 mM octyl alcohol aqueous solution was refluxed in the same manner as in (1) of Example 1 except for the Δ fluorescence intensity ratio. The alcohol / Δfluorescence intensity ratio agonist was calculated. The 1 mM heptyl alcohol aqueous solution is a solution obtained by diluting the 1 M heptyl alcohol ethanol aqueous solution with the solvent A so that the heptyl alcohol concentration becomes 1/1000 times. The 1 mM octyl alcohol aqueous solution is a solution obtained by diluting the 1 M octyl alcohol aqueous solution with the solvent A so that the octyl alcohol concentration becomes 1/1000 times.
試験例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を示すグラフを図７に示す。 In Test Example 1, a graph showing the relationship between each sample and the Δfluorescence intensity ratio alcohol / Δfluorescence intensity ratio agonist is shown in FIG.
図７において、試料番号１は１ｍＭメタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１ｍＭプロピルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１ｍＭブチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は１ｍＭペンチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は１ｍＭヘキシルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１ｍＭヘプチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は１ｍＭオクチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
In FIG. 7,
図７に示された結果から、炭素数７〜８のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合（試料番号７〜８）、炭素数の増加に伴って、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが大きくなっており、しかも、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが０を大きく超えていることがわかる。
From the results shown in FIG. 7, when a 1 mM alcohol aqueous solution containing alcohol having 7 to 8 carbon atoms was used (
したがって、これらの結果から、炭素数７〜８のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合、ＴＲＰＡ１発現細胞に接触させるアルコールの量が１ｍＭであっても、当該アルコールによるＴＲＰＡ１の活性化を良好に検出することができることがわかる。 Therefore, from these results, when a 1 mM alcohol aqueous solution containing an alcohol having 7 to 8 carbon atoms is used, even if the amount of alcohol brought into contact with the TRPA1-expressing cell is 1 mM, the activation of TRPA1 by the alcohol is improved. It can be seen that it can be detected.
（２）ＴＲＰＶ１発現細胞による評価
前記（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに製造例２で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＶ１に対する既知のアゴニストであるカプサイシン（１μＭカプサイシン水溶液）を用いたことを除き、前記（１）と同様にして、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
(2) Evaluation with TRPV1-expressing cells In (1), the TRPV1-expressing cells obtained in Production Example 2 are used instead of the TRPA1-expressing cells obtained in Production Example 1, and the agonist is a known agonist for TRPV1. A Δfluorescence intensity ratio alcohol / Δfluorescence intensity ratio agonist was calculated in the same manner as (1) except that capsaicin (1 μM capsaicin aqueous solution) was used.
試験例１において、各試料とΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を示すグラフを図８に示す。 In Test Example 1, a graph showing the relationship between each sample and the Δfluorescence intensity ratio alcohol / Δfluorescence intensity ratio agonist is shown in FIG.
図８において、試料番号１は１ｍＭメタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１ｍＭエタノール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１ｍＭプロピルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１ｍＭブチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は１ｍＭペンチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は１ｍＭヘキシルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１ｍＭヘプチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は１ｍＭオクチルアルコール水溶液を用いた場合のΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
In FIG. 8,
図８に示された結果から、炭素数１〜６のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合（試料番号１〜６）、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストがほぼ０であり、当該アルコールによるＴＲＰＡ１の活性化を検出することが困難であることがわかる。これに対して、炭素数７〜８のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合（試料番号７〜８）、炭素数の増加に伴って、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが大きくなっており、しかも、Δ蛍光強度比アルコール／Δ蛍光強度比アゴニストが０を大きく超えていることがわかる。
From the results shown in FIG. 8, when a 1 mM alcohol aqueous solution containing alcohol having 1 to 6 carbon atoms was used (
したがって、これらの結果から、炭素数７〜８のアルコールを含む１ｍＭアルコール水溶液を用いた場合、ＴＲＰＶ１発現細胞に接触させるアルコールの量が１ｍＭであっても、当該アルコールによるＴＲＰＶ１の活性化を良好に検出することができることがわかる。 Therefore, from these results, when a 1 mM alcohol aqueous solution containing an alcohol having 7 to 8 carbon atoms is used, even if the amount of alcohol brought into contact with the TRPV1-expressing cell is 1 mM, the activation of TRPV1 by the alcohol is improved. It can be seen that it can be detected.
以上説明したように、炭素数７〜８のアルコールは、低濃度で用いた場合であっても、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１の両方を活性化させることがわかる。なお、炭素数９〜１０のアルコールも、炭素数７〜８のアルコールの場合と同様の傾向を示した。したがって、炭素数７以上のアルコールによる刺激を抑制する物質の評価は、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させる当該アルコールの量が少なくても、高感度で行なうことができることが示唆される。 As described above, it can be seen that the alcohol having 7 to 8 carbon atoms activates both TRPA1 and TRPV1 even when used at a low concentration. In addition, the C9-10 alcohol also showed the same tendency as the case of a C7-8 alcohol. Therefore, it is suggested that evaluation of a substance that suppresses stimulation by alcohol having 7 or more carbon atoms can be performed with high sensitivity even if the amount of the alcohol brought into contact with each of the TRPA1-expressing cell and the TRPV1-expressing cell is small.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010077286A JP5669421B2 (en) | 2010-03-30 | 2010-03-30 | Evaluation method of alcohol stimulation inhibitor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010077286A JP5669421B2 (en) | 2010-03-30 | 2010-03-30 | Evaluation method of alcohol stimulation inhibitor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011205975A true JP2011205975A (en) | 2011-10-20 |
| JP5669421B2 JP5669421B2 (en) | 2015-02-12 |
Family
ID=44937815
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010077286A Active JP5669421B2 (en) | 2010-03-30 | 2010-03-30 | Evaluation method of alcohol stimulation inhibitor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5669421B2 (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011205977A (en) * | 2010-03-30 | 2011-10-20 | Mandom Corp | Method for evaluating feeling of coolness by test sample |
| JP2016079103A (en) * | 2014-10-10 | 2016-05-16 | 花王株式会社 | Agent for alleviating feeling of stimulation |
| JP2016152789A (en) * | 2015-02-20 | 2016-08-25 | 株式会社マンダム | Evaluation methods of test substance and hypotonic stimulation inhibitors |
| US9427415B2 (en) * | 2014-04-01 | 2016-08-30 | The Procter & Gamble Company | Methods and compositions for modifying sensorial perception |
| US11879215B2 (en) | 2016-10-25 | 2024-01-23 | The Procter & Gamble Company | Fibrous structures |
| US11970818B2 (en) | 2021-11-08 | 2024-04-30 | The Procter & Gamble Company | Fibrous structures |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008079528A (en) * | 2006-09-27 | 2008-04-10 | Mandom Corp | Method of screening substance for suppressing irritation due to parabens |
| JP2009082053A (en) * | 2007-09-28 | 2009-04-23 | Mandom Corp | Method of evaluation |
| JP2010047588A (en) * | 1998-11-12 | 2010-03-04 | Eiken Chem Co Ltd | Gene encoding new transmembrane protein |
-
2010
- 2010-03-30 JP JP2010077286A patent/JP5669421B2/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010047588A (en) * | 1998-11-12 | 2010-03-04 | Eiken Chem Co Ltd | Gene encoding new transmembrane protein |
| JP2008079528A (en) * | 2006-09-27 | 2008-04-10 | Mandom Corp | Method of screening substance for suppressing irritation due to parabens |
| JP2009082053A (en) * | 2007-09-28 | 2009-04-23 | Mandom Corp | Method of evaluation |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6013034778; 生化学 第８１巻第１１号, 2009, ｐｐ．９６２-９８３ * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011205977A (en) * | 2010-03-30 | 2011-10-20 | Mandom Corp | Method for evaluating feeling of coolness by test sample |
| US9427415B2 (en) * | 2014-04-01 | 2016-08-30 | The Procter & Gamble Company | Methods and compositions for modifying sensorial perception |
| JP2016079103A (en) * | 2014-10-10 | 2016-05-16 | 花王株式会社 | Agent for alleviating feeling of stimulation |
| JP2016152789A (en) * | 2015-02-20 | 2016-08-25 | 株式会社マンダム | Evaluation methods of test substance and hypotonic stimulation inhibitors |
| US11879215B2 (en) | 2016-10-25 | 2024-01-23 | The Procter & Gamble Company | Fibrous structures |
| US11970818B2 (en) | 2021-11-08 | 2024-04-30 | The Procter & Gamble Company | Fibrous structures |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5669421B2 (en) | 2015-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102373074B1 (en) | Inhibitors of human ezh2, and methods of use thereof | |
| JP5669421B2 (en) | Evaluation method of alcohol stimulation inhibitor | |
| EP2492686B1 (en) | Screening method utilizing thalidomide-targeting factor | |
| EP3356412B1 (en) | Targeting metastasis stem cells through a fatty acid receptor (cd36) | |
| KR20100065189A (en) | Insulin-like growth factor binding protein 7 for treatment of cancer | |
| JP4917858B2 (en) | Screening method for substances that suppress irritation of parabens | |
| Palida et al. | PKMζ, but not PKCλ, is rapidly synthesized and degraded at the neuronal synapse | |
| Ali et al. | Correlative SICM-FCM reveals changes in morphology and kinetics of endocytic pits induced by disease-associated mutations in dynamin | |
| JP2021006530A (en) | Stem cell modulation ii | |
| JP5328190B2 (en) | Method for evaluating TRPA1 activator | |
| Paninka et al. | Down-regulation of Kir2. 6 channel by c-termini mutation D252N and its association with the susceptibility to Thyrotoxic Periodic Paralysis | |
| JP5229777B2 (en) | Evaluation method | |
| JP6824689B2 (en) | Screening method for dermis stain preventive / ameliorating agent and / or macrophage attractant | |
| JP6061448B2 (en) | Test substance evaluation method | |
| JP5548498B2 (en) | Method for evaluating external preparation for skin | |
| JP5806806B2 (en) | Evaluation method of cool feeling by test sample | |
| JP6508969B2 (en) | Evaluation method of test substance | |
| JP6576203B2 (en) | Test substance evaluation method | |
| JP5859359B2 (en) | Evaluation method of cooling effect by test sample | |
| WO2021020505A1 (en) | Pharmaceutical composition for treating cancer | |
| US20140213528A1 (en) | Fibrosuppressant Biotherapeutics | |
| JP2011140471A (en) | Activity inhibitor and activity-inhibiting method for trpa1, and skin care preparation for external use | |
| JP2016202112A (en) | Method of evaluating smell using olfactory receptor | |
| Timmel et al. | Cavin 1 function does not follow caveolar morphology | |
| JPWO2008126517A1 (en) | Novel SLC17 type transporter protein and its use in mammals |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120924 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140318 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140515 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141202 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141216 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5669421 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |