JP2011140471A - Activity inhibitor and activity-inhibiting method for trpa1, and skin care preparation for external use - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＴＲＰＡ１の活性抑制剤および活性抑制方法ならびに皮膚外用剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒトの皮膚に用いられる皮膚外用剤などに有用であるＴＲＰＡ１の活性抑制剤およびＴＲＰＡ１の活性抑制方法ならびに皮膚外用剤に関する。 The present invention relates to a TRPA1 activity inhibitor, a method for inhibiting activity, and a skin external preparation. More specifically, the present invention relates to a TRPA1 activity inhibitor, a TRPA1 activity suppression method, and a skin external preparation that are useful for external skin preparations used for human skin.
パラベン類やアルカリ剤が配合された化粧料などの外用剤をヒトの皮膚に用いた場合、使用者によっては、皮膚に不快な刺激を感じることがある。前記パラベン類やアルカリ剤による不快な刺激は、一過性受容体電位チャネル（以下、「ＴＲＰチャネル」という）の１つであるＴＲＰＡ１の活性化と関連していることが、本発明者らによって見出されている（例えば、特許文献１〜３参照）。また、前記ＴＲＰＡ１は、細胞内のアルカリ化により活性化され、活性化されたＴＲＰＡ１を介して痛覚が引き起こされることが、本発明者らによって見出されている（例えば、非特許文献１参照）。
When external preparations such as cosmetics containing parabens and alkaline agents are used on human skin, some users may feel uncomfortable irritation to the skin. According to the present inventors, the unpleasant stimulation by the parabens and the alkaline agent is associated with the activation of TRPA1, which is one of transient receptor potential channels (hereinafter referred to as “TRP channels”). Have been found (see, for example,
一方、近年、使用者の安全意識の高まりから、このような不快な刺激を与えないか、または不快な刺激が少ない外用剤が好まれる傾向にある。そのため、前記外用剤による皮膚に対する不快な刺激を抑制する物質や方法の開発が求められている。 On the other hand, in recent years, there is a tendency that external preparations that do not give such unpleasant stimuli or have less unpleasant stimuli are preferred due to the heightened safety awareness of users. Therefore, development of the substance and method which suppress the unpleasant irritation | stimulation with respect to the skin by the said external preparation is called for.
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、ＴＲＰＡ１の活性化を効果的に抑制するＴＲＰＡ１の活性抑制剤を提供することを目的とする。また、本発明は、ＴＲＰＡ１の活性化を効果的に抑制するＴＲＰＡ１の活性抑制方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、皮膚に対する刺激性が低い皮膚外用剤を提供することを目的とする。 This invention is made | formed in view of the said prior art, and it aims at providing the activity inhibitor of TRPA1 which suppresses activation of TRPA1 effectively. Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting the activity of TRPA1 that effectively inhibits the activation of TRPA1. Furthermore, an object of this invention is to provide the skin external preparation with low irritation | stimulation with respect to skin.
すなわち、本発明の要旨は、
（１）ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制剤であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンを含有することを特徴とするＴＲＰＡ１の活性抑制剤、
（２）ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制剤であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が配合されていることを特徴とするＴＲＰＡ１の活性抑制剤、
（３）前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれた少なくとも１種である前記（２）に記載のＴＲＰＡ１の活性抑制剤、
（４）ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制方法であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンをＴＲＰＡ１と接触させることを特徴とするＴＲＰＡ１の活性抑制方法、ならびに
（５）アンモニアを含有する皮膚外用剤であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が配合されていることを特徴とする皮膚外用剤
に関する。
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) An activity inhibitor that suppresses the activity of TRPA1, which contains carbonate ions and / or bicarbonate ions,
(2) An activity inhibitor that suppresses the activity of TRPA1, which contains a substance that dissociates into carbonate ions and / or hydrogen carbonate ions,
(3) The activity inhibitor of TRPA1 according to (2), wherein the substance that dissociates into carbonate ions and / or bicarbonate ions is at least one selected from the group consisting of sodium carbonate and sodium bicarbonate,
(4) An activity suppression method for suppressing the activity of TRPA1, which comprises contacting carbonate ions and / or bicarbonate ions with TRPA1, and (5) topical skin containing ammonia An external preparation for skin, characterized in that it contains a substance that dissociates into carbonate ions and / or bicarbonate ions.
本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制剤は、ＴＲＰＡ１の活性化を効果的に抑制するという優れた効果を奏する。また、本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制方法は、ＴＲＰＡ１の活性化を効果的に抑制するという優れた効果を奏する。さらに、本発明の皮膚外用剤は、皮膚に対する刺激性が低いという優れた効果を奏する。 The TRPA1 activity inhibitor of the present invention has an excellent effect of effectively suppressing the activation of TRPA1. Moreover, the TRPA1 activity suppression method of the present invention has an excellent effect of effectively suppressing the activation of TRPA1. Furthermore, the skin external preparation of this invention has the outstanding effect that irritation | stimulation with respect to skin is low.
１．ＴＲＰＡ１の活性抑制剤
本発明は、１つの側面では、ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制剤であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンを含有することを特徴とするＴＲＰＡ１の活性抑制剤（以下、「活性抑制剤１」という）に関する。
1. TRPA1 activity inhibitor In one aspect, the present invention is an activity inhibitor that suppresses the activity of TRPA1 and contains a carbonate ion and / or bicarbonate ion (hereinafter referred to as a TRPA1 activity inhibitor) , "
本発明者らは、炭酸イオンに解離する物質を単独で細胞に接触させたときの細胞内ｐＨが、アンモニアを単独で細胞に接触させたときの細胞内ｐＨと比べて低くなるが、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質と、アンモニアとを混合し、得られた混合物を細胞と接触させたときには、アンモニアを単独で細胞と接触させたときと比べて、細胞内カルシウムイオン濃度が著しく低くなることから、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が、ＴＲＰＡ１の活性を抑制することを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。 The present inventors have found that the intracellular pH when a substance that dissociates into carbonate ions is brought into contact with cells alone is lower than the intracellular pH when ammonia is brought into contact with cells alone. When the substance that dissociates into bicarbonate ions and ammonia are mixed, and the resulting mixture is brought into contact with cells, the intracellular calcium ion concentration is higher than when ammonia is brought into contact with the cells alone. It was found that substances that dissociate into carbonate ions and / or bicarbonate ions suppress the activity of TRPA1 because they are significantly reduced. The present invention is based on these findings.
前記活性抑制剤１によれば、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンを含有しているので、前記活性抑制剤１をＴＲＰＡ１と接触させることにより、ＴＲＰＡ１の活性を抑制することができる。
According to the
また、前記活性抑制剤１は、皮膚に対する不快な刺激との関連性があるＴＲＰＡ１の活性を有効に抑制するため、例えば、皮膚外用剤などに配合するための助剤として好適である。前記活性抑制剤１は、例えば、皮膚外用剤などに配合されることによって当該皮膚外用剤などによるヒトの皮膚に対する不快な刺激を抑制することが期待される。
Moreover, the
前記活性抑制剤１における炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンの濃度は、ＴＲＰＡ１の活性に対する抑制効果を十分に発揮させる観点から、０．００１質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、前記活性抑制剤の保存安定性の観点から、５質量％以下が好ましく、１質量％以下がより好ましい。
The concentration of carbonate ions and / or bicarbonate ions in the
本発明においては、前記炭酸イオンおよび炭酸水素イオンは、単独で用いられていてもよく、併用されていてもよい。炭酸イオンと炭酸水素イオンとが併用されている場合、前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンの濃度は、炭酸イオンと炭酸水素イオンとを合わせた濃度である。 In the present invention, the carbonate ion and the hydrogen carbonate ion may be used alone or in combination. When carbonate ions and hydrogen carbonate ions are used in combination, the concentration of the carbonate ions and / or hydrogen carbonate ions is a combined concentration of carbonate ions and hydrogen carbonate ions.
前記活性抑制剤１において、前記炭酸イオンおよび炭酸水素イオンは、例えば、水などの溶媒中で解離した状態で存在していてもよい。この場合、前記活性抑制剤１のｐＨは、前記溶媒中で炭酸イオンおよび炭酸水素イオンに解離した状態で存在させる観点から、２以上が好ましく、５以上がより好ましく、皮膚に対する負荷を抑制する観点から、１３以下が好ましく、１１以下がより好ましい。
In the
また、本発明の目的が妨げられない範囲内であれば、前記活性抑制剤１は、例えば、界面活性剤、アルコール、香料、キレート化剤などの他の成分を含有していてもよい。
Moreover, as long as the objective of this invention is not disturbed, the
前記ＴＲＰＡ１の活性としては、例えば、イオン流束の調節能（例えば、細胞外から細胞内への陽イオンの輸送能など）、膜電位の調節能（例えば、電流の発生能など）などが挙げられる。前記活性は、ＴＲＰＡ１アゴニストがＴＲＰＡ１に結合して当該ＴＲＰＡ１が活性化することによって発現する。 Examples of the activity of TRPA1 include ability to regulate ion flux (for example, ability to transport cations from outside the cell to the inside), ability to regulate membrane potential (eg, ability to generate current), and the like. It is done. The activity is expressed when a TRPA1 agonist binds to TRPA1 and activates the TRPA1.
前記陽イオンとしては、例えば、カルシウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。 Examples of the cation include calcium ion and sodium ion.
また、前記ＴＲＰＡ１アゴニストとしては、例えば、アンモニア、アリルイソチオシアナート、ブラジキニン、シンナムアルデヒド、アリシン、アクロレイン、メントールなどが挙げられる。 Examples of the TRPA1 agonist include ammonia, allyl isothiocyanate, bradykinin, cinnamaldehyde, allicin, acrolein, and menthol.
前記活性は、例えば、ＴＲＰＡ１アゴニストの結合に伴う細胞外から細胞内への陽イオンの流入を指標として用い、活性抑制剤とＴＲＰＡ１アゴニストとＴＲＰＡ１とを接触させたときの当該ＴＲＰＡ１を含む細胞内の陽イオン量に対するＴＲＰＡ１アゴニストとＴＲＰＡ１とを接触させたときの当該ＴＲＰＡ１を含む細胞内の陽イオン量の割合を算出し、活性抑制剤による陽イオン量の減少率を測定したり、あるいはＴＲＰＡ１アゴニストの結合に伴う細胞内における電流の増加量などを指標として用い、活性抑制剤とＴＲＰＡ１アゴニストとＴＲＰＡ１とを接触させたときの当該ＴＲＰＡ１を含む細胞内の電流に対するＴＲＰＡ１アゴニストとＴＲＰＡ１とを接触させたときの当該ＴＲＰＡ１を含む細胞内の電流の割合を算出し、活性抑制剤による電流の減少率を測定することによって調べることができる。 The activity is, for example, a cation inflow from outside the cell accompanying the binding of a TRPA1 agonist as an index, and an intracellular containing the TRPA1 when the activity inhibitor, TRPA1 agonist and TRPA1 are brought into contact with each other. Calculate the ratio of the amount of cation in the cell containing TRPA1 when the TRPA1 agonist and TRPA1 are brought into contact with the amount of cation, and measure the rate of decrease in the amount of cation by the activity inhibitor, When an increase in intracellular current associated with binding is used as an index, and when an activity inhibitor, TRPA1 agonist, and TRPA1 are brought into contact, TRPA1 agonist and TRPA1 are brought into contact with the current in the cell that contains the TRPA1. The ratio of the current in the cell containing the TRPA1 was calculated to suppress the activity. It can be examined by measuring the rate of decrease in current due agent.
また、前記活性抑制剤１によるＴＲＰＡ１の活性の抑制効果は、例えば、ＴＲＰＡ１を発現する細胞（以下、「ＴＲＰＡ１発現細胞」という）を用い、前記活性抑制剤１の存在下でＴＲＰＡ１アゴニストと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内ｐＨと当該活性抑制剤１の非存在下でＴＲＰＡ１アゴニストと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内ｐＨとの差異を比較すること、前記活性抑制剤１の存在下にＴＲＰＡ１アゴニストと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度と当該活性抑制剤１の非存在下でＴＲＰＡ１アゴニストと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度との差異を比較したり、あるいは前記活性抑制剤１の存在下でＴＲＰＡ１アゴニストと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内における電流と当該活性抑制剤１の非存在下でＴＲＰＡ１アゴニストと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内における電流との間の差異を比較することによって評価することができる。
In addition, the effect of inhibiting the activity of TRPA1 by the
前記細胞内ｐＨは、例えば、ｐＨ蛍光指示薬をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、細胞内ｐＨに応じたｐＨ蛍光指示薬の蛍光強度を調べる方法などによって測定することができる。前記ｐＨ蛍光指示薬としては、例えば、ｐＨに応じて蛍光特性が変化する試薬であればよく、例えば、ＢＣＥＣＦ−ＡＭなどが挙げられる。 The intracellular pH can be measured by, for example, a method of introducing a pH fluorescent indicator into a TRPA1-expressing cell and examining the fluorescence intensity of the pH fluorescent indicator according to the intracellular pH. The pH fluorescent indicator may be any reagent whose fluorescence characteristics change according to pH, for example, BCECF-AM.
前記カルシウムイオン濃度は、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、細胞内のカルシウムイオンに前記蛍光カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を調べる方法などによって測定することができる。前記蛍光カルシウム指示薬としては、カルシウムイオンと結合し蛍光カルシウム指示薬の量によってその蛍光特性が変化するのであれば特に限定されないが、例えば、ＦＵＲＡ ２、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられる。
The calcium ion concentration can be determined by, for example, introducing a fluorescent reagent based on a calcium chelator (hereinafter also referred to as “fluorescent calcium indicator”) into a TRPA1-expressing cell, binding the fluorescent calcium indicator to intracellular calcium ions, It can be measured by, for example, a method of examining the fluorescence intensity of a fluorescent calcium indicator bonded to ions. The fluorescent calcium indicator is not particularly limited as long as it binds to calcium ions and its fluorescence characteristics change depending on the amount of the fluorescent calcium indicator, and examples thereof include
また、前記電流は、例えば、パッチクランプ法などによって測定することができる。 The current can be measured by, for example, a patch clamp method.
本発明は、別の側面では、ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制剤であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が配合されていることを特徴とするＴＲＰＡ１の活性抑制剤（以下、「活性抑制剤２」という）に関する。
In another aspect, the present invention relates to an activity inhibitor of TRPA1, which is an activity inhibitor that suppresses the activity of TRPA1 and contains a substance that dissociates into carbonate ions and / or bicarbonate ions ( Hereinafter, it is referred to as “
前記活性抑制剤２をＴＲＰＡ１と接触させたとき、前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質から解離された炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンは、ＴＲＰＡ１と接触する。そのため、前記活性抑制剤２によれば、ＴＲＰＡ１の活性を効果的に抑制することができる。したがって、前記活性抑制剤２は、前記活性抑制剤１と同様に、例えば、皮膚外用剤などに配合するための助剤として好適である。また、前記活性抑制剤２は、例えば、皮膚外用剤などに配合されることによって当該皮膚外用剤などによるヒトの皮膚に対する不快な刺激を抑制することが期待される。
When the
前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質は、ＴＲＰＡ１と接触させる際に、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離していればよい。前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質としては、例えば、炭酸塩、炭酸水素塩などが挙げられる。前記炭酸塩としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸アンモニウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。また、前記炭酸水素塩としては、例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウムなどが挙げられる。これらのなかでは、水などの溶媒中で炭酸イオンおよび炭酸水素イオンに解離した状態で存在させる観点および前記活性抑制剤２の保存安定性の観点から、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれた少なくとも１種が好ましい。
The substance that dissociates into carbonate ions and / or bicarbonate ions may be dissociated into carbonate ions and / or bicarbonate ions when brought into contact with TRPA1. Examples of the substance that dissociates into carbonate ions and / or bicarbonate ions include carbonates and bicarbonates. Examples of the carbonate include sodium carbonate, potassium carbonate, ammonium carbonate, calcium carbonate, magnesium carbonate and the like. Examples of the hydrogen carbonate include sodium hydrogen carbonate, ammonium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate, and calcium hydrogen carbonate. Among these, from the viewpoint of being dissociated into carbonate ions and hydrogen carbonate ions in a solvent such as water and from the viewpoint of the storage stability of the
前記炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムは、例えば、本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制剤を皮膚外用剤などに配合する場合には、皮膚への負荷を効果的に抑制する点で好適である。 For example, when the activity inhibitor of TRPA1 of the present invention is added to an external preparation for skin, the sodium carbonate and sodium hydrogen carbonate are suitable in that the load on the skin is effectively suppressed.
前記活性抑制剤２における前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質の濃度は、ＴＲＰＡ１の活性に対する抑制効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは０．００５質量％以上、より好ましくは０．０５質量％以上となり、前記活性抑制剤２の保存安定性の観点から、好ましくは１０質量％以下が、より好ましく２質量％以下となるように配合されることが望ましい。
The concentration of the substance dissociated into carbonate ions and / or bicarbonate ions in the
前記活性抑制剤２において、前記炭酸イオンおよび炭酸水素イオンに解離する物質は、水などの溶媒中に溶解した状態で存在していればよい。溶媒が水である場合、前記活性抑制剤２のｐＨは、前記水中で炭酸イオンおよび炭酸水素イオンに解離した状態で存在させる観点から、２以上が好ましく、５以上がより好ましく、皮膚に対する負荷を抑制する観点から、１３以下が好ましく、１１以下がより好ましい。
In the
なお、前記活性抑制剤２には、本発明の目的がを妨げられない範囲内であれば、例えば、界面活性剤、アルコール、香料、キレート化剤などの他の成分が配合されていてもよい。
The
前記活性抑制剤２によるＴＲＰＡ１の活性の抑制効果は、前記活性抑制剤１によるＴＲＰＡ１の活性の抑制効果と同様の手法によって評価することができる。
The effect of inhibiting the activity of TRPA1 by the
２．ＴＲＰＡ１の活性抑制方法
本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制方法は、ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制方法であり、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンをＴＲＰＡ１と接触させることを特徴とする。
2. TRPA1 activity suppression method The TRPA1 activity suppression method of the present invention is an activity suppression method for suppressing the activity of TRPA1, and is characterized by bringing carbonate ions and / or bicarbonate ions into contact with TRPA1.
本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制方法によれば、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンを用いるので、例えば、ヒトの皮膚をに存在する感覚神経に含まれるＴＲＰＡ１、口腔などの粘膜下に存在する感覚神経に含まれるＴＲＰＡ１などの活性を効果的に抑制することができる。 According to the TRPA1 activity suppression method of the present invention, since carbonate ions and / or bicarbonate ions are used, for example, TRPA1 contained in sensory nerves existing in human skin, sensory nerves existing under mucous membranes such as oral cavity The activity of TRPA1 and the like contained in can be effectively suppressed.
本発明においては、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンの供給源として、前述したＴＲＰＡ１の活性抑制剤を用いて、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンをＴＲＰＡ１と接触させることができる。 In the present invention, carbonate ions and / or bicarbonate ions can be brought into contact with TRPA1 using the above-described activity inhibitor of TRPA1 as a source of carbonate ions and / or bicarbonate ions.
炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンとＴＲＰＡ１との接触は、ＴＲＰＡ１を含む部位、例えば、ヒトの皮膚を構成する細胞にＴＲＰＡ１の活性抑制剤を供給することによって行なうことができる。 Contact of carbonate ions and / or bicarbonate ions with TRPA1 can be carried out by supplying a TRPA1 activity inhibitor to a site containing TRPA1, for example, cells constituting human skin.
前記ＴＲＰＡ１と接触させる炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンの量は、ＴＲＰＡ１の活性の抑制効果を十分に発揮させ、かつ皮膚への負荷を抑制することができる範囲で適宜設定することができる。 The amount of carbonate ions and / or bicarbonate ions brought into contact with the TRPA1 can be appropriately set within a range in which the effect of suppressing the activity of TRPA1 can be sufficiently exerted and the load on the skin can be suppressed.
なお、ＴＲＰＡ１を含む部位、例えば、ヒトの皮膚における細胞にＴＲＰＡ１の活性抑制剤を供給する場合、当該ＴＲＰＡ１の活性抑制剤の供給時に加えて、ヒトの皮膚への前記ＴＲＰＡ１の活性抑制剤に含まれる炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンの浸透を促進する助剤をさらにヒトの皮膚における細胞に供給してもよい。 In addition, when supplying an activity inhibitor of TRPA1 to a site containing TRPA1, for example, cells in human skin, in addition to the activity inhibitor of TRPA1, the activity inhibitor of TRPA1 to human skin is included. An auxiliary agent that promotes penetration of carbonate ions and / or bicarbonate ions may be further supplied to cells in human skin.
本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制方法によるＴＲＰＡ１の活性の抑制効果は、前記活性抑制剤１または活性抑制剤２によるＴＲＰＡ１の活性の抑制効果と同様の手法によって評価することができる。
The effect of suppressing the activity of TRPA1 by the method for suppressing the activity of TRPA1 of the present invention can be evaluated by the same method as the effect of suppressing the activity of TRPA1 by the
本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制方法は、例えば、皮膚と接触したときに不快な刺激を与える皮膚外用剤を使用する時に行なうことにより、皮膚における細胞に含まれるＴＲＰＡ１の活性を抑制するので、皮膚などで引き起こされる不快な刺激を低減することができる。 The TRPA1 activity-suppressing method of the present invention suppresses the activity of TRPA1 contained in cells in the skin by using, for example, an external preparation for skin that gives unpleasant irritation when coming into contact with the skin. The unpleasant irritation caused by can be reduced.
３．皮膚外用剤
本発明の皮膚外用剤は、アンモニアを含有する皮膚外用剤であり、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が配合されていることを特徴とする。
3. Skin external preparation The skin external preparation of the present invention is a skin external preparation containing ammonia, and is characterized in that it contains a substance that dissociates into carbonate ions and / or bicarbonate ions.
本発明の皮膚外用剤は、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が配合されているので、当該皮膚外用剤に含まれるアンモニアによってＴＲＰＡ１の活性化が抑制され、皮膚に引き起こされる不快な刺激を低減することができる。 Since the external preparation for skin of the present invention contains a substance that dissociates into carbonate ions and / or bicarbonate ions, the activation of TRPA1 is suppressed by ammonia contained in the external preparation for skin, which is an unpleasant cause caused to the skin. Stimulation can be reduced.
なお、本明細書において、「皮膚外用剤」とは、皮膚に直接適用されるものをいう。前記皮膚外用剤としては、例えば、皮膚脱色剤（ボディーブリーチング剤）などが挙げられる。 In the present specification, the “external preparation for skin” refers to those applied directly to the skin. Examples of the external preparation for skin include skin bleaching agents (body bleaching agents) and the like.
本発明の皮膚外用剤におけるアンモニアの含有量は、アンモニアによる効果を十分に発現させる観点から、０．１質量％以上が好ましく、０．５質量％以上がより好ましく、皮膚に対する負荷を抑制する観点から、２０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましい。 The content of ammonia in the external preparation for skin of the present invention is preferably 0.1% by mass or more, more preferably 0.5% by mass or more, from the viewpoint of sufficiently exhibiting the effect of ammonia, and the viewpoint of suppressing the load on the skin. Therefore, 20 mass% or less is preferable and 10 mass% or less is more preferable.
本発明の皮膚外用剤において、前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質は、ＴＲＰＡ１と接触させる際に、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離していればよい。前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質としては、前記活性抑制剤に用いられる物質と同様の物質が挙げられる。前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質のなかでは、アンモニアによる皮膚への負荷を効果的に抑制する観点から、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれた少なくとも１種が好ましい。 In the external preparation for skin of the present invention, the substance that dissociates into carbonate ions and / or bicarbonate ions may be dissociated into carbonate ions and / or bicarbonate ions when brought into contact with TRPA1. Examples of the substance that dissociates into carbonate ions and / or hydrogen carbonate ions include the same substances as those used for the activity inhibitor. Among the substances that dissociate into carbonate ions and / or bicarbonate ions, at least one selected from the group consisting of sodium carbonate and sodium bicarbonate is preferable from the viewpoint of effectively suppressing the load on the skin due to ammonia. .
アンモニアに対する前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質の量は、アンモニア１００質量部に対して、アンモニアによる皮膚への負荷を抑制する効果を十分に得る観点から、１質量部以上が好ましく、１０質量部以上がより好ましく、皮膚外用剤の安定性の観点から、１０００質量部以下が好ましく、２００質量部以下がより好ましい。 The amount of the substance dissociated into the carbonate ion and / or hydrogen carbonate ion with respect to ammonia is preferably 1 part by mass or more with respect to 100 parts by mass of ammonia from the viewpoint of sufficiently obtaining the effect of suppressing the load on the skin due to ammonia. 10 mass parts or more are more preferable, and 1000 mass parts or less are preferable from a viewpoint of stability of a skin external preparation, and 200 mass parts or less are more preferable.
本発明の皮膚外用剤には、本発明の目的が妨げられない範囲で、例えば、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、キレート化剤、油、アルコール、ｐＨ調整剤、香料、色素、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ビタミン、アミノ酸、水などの他の成分が配合されていてもよい。 The topical skin preparation of the present invention includes, for example, surfactants, moisturizers, thickeners, preservatives, antioxidants, chelating agents, oils, alcohols, and pH adjustments, as long as the object of the present invention is not hindered. Other components such as an agent, a fragrance, a pigment, an ultraviolet absorber, an ultraviolet scattering agent, a vitamin, an amino acid, and water may be blended.
以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to the examples.
（実施例１〜４）
炭酸アンモニウムの濃度が１ｍＭ（実施例１）、５ｍＭ（実施例２）、１０ｍＭ（実施例３）または５０ｍＭ（実施例４）となるように、炭酸アンモニウムを２５℃で精製水に溶解させた。その後、得られた水溶液のｐＨを、それぞれ、ｐＨ調整剤として塩酸を用いて７．４に調整して、活性抑制剤を得た。
(Examples 1-4)
Ammonium carbonate was dissolved in purified water at 25 ° C. so that the concentration of ammonium carbonate was 1 mM (Example 1), 5 mM (Example 2), 10 mM (Example 3), or 50 mM (Example 4). Thereafter, the pH of each of the obtained aqueous solutions was adjusted to 7.4 using hydrochloric acid as a pH adjuster to obtain an activity inhibitor.
（比較例１〜４）
アンモニアの濃度が１ｍＭ（比較例１）、５ｍＭ（比較例２）、１０ｍＭ（比較例３）または５０ｍＭ（比較例４）であるアンモニア水溶液（ｐＨ７．４）を調製し、試料を得た。
(Comparative Examples 1-4)
An aqueous ammonia solution (pH 7.4) having an ammonia concentration of 1 mM (Comparative Example 1), 5 mM (Comparative Example 2), 10 mM (Comparative Example 3) or 50 mM (Comparative Example 4) was prepared to obtain a sample.
（比較例５〜８）
塩化アンモニウムの濃度が１ｍＭ（比較例５）、５ｍＭ（比較例６）、１０ｍＭ（比較例７）または５０ｍＭ（比較例８）となるように、塩化アンモニウムを２５℃で精製水に溶解させた。その後、得られた水溶液のｐＨを７．４に調整して、試料を得た。
(Comparative Examples 5 to 8)
Ammonium chloride was dissolved in purified water at 25 ° C. so that the concentration of ammonium chloride was 1 mM (Comparative Example 5), 5 mM (Comparative Example 6), 10 mM (Comparative Example 7), or 50 mM (Comparative Example 8). Thereafter, the pH of the obtained aqueous solution was adjusted to 7.4 to obtain a sample.
（試験例１）
（１）ＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞の調製
１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地に、ＨＥＫ２９３細胞を最終濃度が４×１０7細胞／ｍＬとなるように懸濁し、細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液に、ｐＨ蛍光指示薬〔シグマアルドリッチ社製、商品名：ＢＣＥＣＦ−ＡＭ〕を最終濃度が１μＭとなるように添加し、混合物を得た。その後、得られた混合物を３７℃で１時間インキュベーションすることにより、ＨＥＫ２９３細胞にｐＨ蛍光指示薬を導入した。得られた細胞を標準緩衝液（組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４に調整）で洗浄し、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞を得た。
(Test Example 1)
(1) Preparation of BCECF-AM-introduced cells HEK293 cells were suspended in a DMEM medium containing 10% by mass fetal bovine serum so that the final concentration was 4 × 10 7 cells / mL to obtain a cell suspension. A pH fluorescent indicator [manufactured by Sigma Aldrich, trade name: BCECF-AM] was added to the obtained cell suspension so that the final concentration was 1 μM to obtain a mixture. Thereafter, the resulting mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour to introduce pH fluorescent indicator into HEK293 cells. The obtained cells were washed with a standard buffer (composition: 140 mM sodium chloride, 5 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 2 mM calcium chloride, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, adjusted to pH 7.4) to obtain BCECF-AM-introduced cells. .
（２）細胞内ｐＨの測定
前記ＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞を、最終濃度が３×１０7細胞／ｍＬとなるように前記標準緩衝液に懸濁し、細胞浮遊液を得た。前記細胞浮遊液を還流槽付の蛍光測定用装置の還流槽に入れ、３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、実施例１〜４の活性抑制剤または比較例１〜８の試料を前記細胞浮遊液に添加し、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞と実施例１〜４の活性抑制剤または比較例１〜８の試料とを接触させた。その後、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞中のＢＣＥＣＦ−ＡＭに基づく励起波長４４０ｎｍにおける蛍光強度と、前記ＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞中のＢＣＥＣＦ−ＡＭに基づく励起波長４９５ｎｍにおける蛍光強度とを測定した。
(2) Measurement of intracellular pH The BCECF-AM-introduced cells were suspended in the standard buffer so as to have a final concentration of 3 × 10 7 cells / mL to obtain a cell suspension. The cell suspension is put into a reflux tank of a fluorescence measuring apparatus with a reflux tank, preincubated for 10 minutes at 37 ° C., and then the activity inhibitor of Examples 1 to 4 or the samples of Comparative Examples 1 to 8 are suspended in the cell. The BCECF-AM-introduced cells were brought into contact with the activity inhibitor of Examples 1 to 4 or the samples of Comparative Examples 1 to 8. Thereafter, the fluorescence intensity at the excitation wavelength of 440 nm based on BCECF-AM in the BCECF-AM-introduced cell and the fluorescence intensity at the excitation wavelength of 495 nm based on BCECF-AM in the BCECF-AM-introduced cell were measured.
なお、前記還流槽付の蛍光測定用装置として、ＣＣＤカメラを取り付けた倒立顕微鏡〔オリンパス（株）製、商品名：ＢＸ−７１〕に還流槽を設け、かつシリンジから還流槽を通って試薬を還流するようにした装置を用いた。 As the fluorescence measuring apparatus with a reflux tank, a reflux tank is provided in an inverted microscope (Olympus Co., Ltd., trade name: BX-71) equipped with a CCD camera, and the reagent is passed from the syringe through the reflux tank. An apparatus adapted to reflux was used.
前記蛍光強度の測定は、実施例１〜４の活性抑制剤または比較例１〜８の試料と接触させたＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞中のＢＣＥＣＦ−ＡＭに由来する励起波長４４０ｎｍにおける蛍光および励起波長４９５ｎｍにおける蛍光を前記ＣＣＤカメラで取り込み、取り込まれた蛍光を、画像処理解析ソフト〔スキャナリティックスインコーポレーティド（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）製、商品名：ＩＰＬａｂ Ｖｅｒ．５．０〕で解析することにより行なった。 The fluorescence intensity was measured by the fluorescence at the excitation wavelength of 440 nm derived from BCECF-AM in the BCECF-AM-introduced cells brought into contact with the activity inhibitor of Examples 1 to 4 or the samples of Comparative Examples 1 to 8 and the excitation wavelength of 495 nm. Was captured by the CCD camera, and the captured fluorescence was captured by an image processing analysis software (manufactured by Scannerlytics Inc., trade name: IPLab Ver.). 5.0].
また、細胞内ｐＨは、予め標準ｐＨ溶液を用いて作成した検量線と前記蛍光強度とを用いて算出した。なお、前記標準ｐＨ溶液として、緩衝液（組成：１００ｍＭグルコン酸カリウム、２０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭ塩化マグネシウム、２００μＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、２０μＭナイジェリシンナトリウム、ｐＨ６．０、７．０、８．０または８．５に調整）を用いた。 The intracellular pH was calculated using a calibration curve prepared beforehand using a standard pH solution and the fluorescence intensity. As the standard pH solution, a buffer solution (composition: 100 mM potassium gluconate, 20 mM potassium chloride, 10 mM sodium chloride, 10 mM HEPES, 2 mM magnesium chloride, 200 μM calcium chloride, 10 mM glucose, 20 μM nigericin sodium, pH 6.0, 7. Adjusted to 0, 8.0 or 8.5).
試験例１において、実施例１〜４の各活性抑制剤中における炭酸アンモニウムの濃度、比較例１〜４の各試料中におけるアンモニアの濃度または比較例５〜８の各試料中における塩化アンモニウムの濃度と、細胞内ｐＨとの関係を調べた結果を図１に示す。図１中、白三角は実施例１〜４の活性抑制剤（炭酸アンモニウム）と接触させたときのＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞の細胞内ｐＨ、黒丸は比較例１〜４の試料（アンモニア）と接触させたときのＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞の細胞内ｐＨ、白丸は比較例５〜８の試料（塩化アンモニウム）と接触させたときのＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞の細胞内ｐＨをそれぞれ示す。 In Test Example 1, the concentration of ammonium carbonate in each activity inhibitor of Examples 1 to 4, the concentration of ammonia in each sample of Comparative Examples 1 to 4, or the concentration of ammonium chloride in each sample of Comparative Examples 5 to 8 FIG. 1 shows the result of examining the relationship between the pH and intracellular pH. In FIG. 1, white triangles indicate the intracellular pH of BCECF-AM-introduced cells when contacted with the activity inhibitor (ammonium carbonate) of Examples 1 to 4, and black circles indicate contact with the samples of Comparative Examples 1 to 4 (ammonia). Intracellular pH of BCECF-AM-introduced cells and white circles indicate the intracellular pH of BCECF-AM-introduced cells when contacted with the samples of Comparative Examples 5 to 8 (ammonium chloride), respectively.
図１に示された結果から、実施例１〜４それぞれの活性抑制剤（炭酸アンモニウム）と接触させたＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞の細胞内ｐＨは、比較例１〜４の試料（アンモニウム）と接触させたＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞および塩化アンモニウムと接触させたＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞それぞれの細胞内ｐＨと比べて低くなる傾向にあることがわかる。 From the results shown in FIG. 1, the intracellular pH of the BCECF-AM-introduced cells brought into contact with the respective activity inhibitors (ammonium carbonate) of Examples 1 to 4 is in contact with the samples of Comparative Examples 1 to 4 (ammonium). It can be seen that the intracellular pH of the BCECF-AM-introduced cells and the BCECF-AM-introduced cells contacted with ammonium chloride tend to be lower than the intracellular pH.
（製造例１）
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド）を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μＬとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μＬと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）２００μＬとを混合し、混合物ＩＩを得た。
(Production Example 1)
A cDNA encoding human TRPA1 (a polynucleotide at positions 63 to 3888 of the nucleotide sequence shown in GenBank accession number: NM_007332) is a vector for mammalian cells [manufactured by Invitrogen, trade name: pcDNA3.1 (+)]. To obtain a human TRPA1 expression vector. 1 μg of the obtained human TRPA1 expression vector was mixed with 6 μL of a gene introduction reagent [manufactured by Invitrogen, trade name: PLUS Reagent, catalog number: 11514-015] to obtain a mixture I. In addition, 4 μL of cationic lipid for gene transfer [manufactured by Invitrogen, trade name: Lipofectamine (registered trademark), catalog number: 18324-012] and serum use reduction medium [manufactured by Invitrogen, trade name: OPTI-MEM (registered) (Trademark) I Reduced-Serum Medium (Cat. No. 11058021) 200 μL was mixed to obtain a mixture II.
また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０5細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。 Further, in a DMEM medium containing 10% by mass FBS on a petri dish having a diameter of 35 mm maintained at 37 ° C. in an atmosphere of 5% by volume of carbon dioxide, 5 × 10 5 cells of HEK293 cells were changed to 70% confluency. Cultured.
得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。 By adding the mixture I and the mixture II to the obtained cell culture, the human TRPA1 expression vector was introduced into HEK293 cells to obtain TRPA1-expressing cells.
（実施例５〜７）
炭酸水素ナトリウムの濃度が１０ｍＭ（実施例５）、５ｍＭ（実施例６）または１０ｍＭ（実施例７）となるように、当該炭酸水素ナトリウムを２５℃で精製水に溶解させた。その後、得られた溶液のｐＨを、それぞれ、ｐＨ調整剤として塩酸を用いて７．４に調整して、活性抑制剤を得た。
(Examples 5-7)
The sodium bicarbonate was dissolved in purified water at 25 ° C. so that the concentration of sodium bicarbonate was 10 mM (Example 5), 5 mM (Example 6), or 10 mM (Example 7). Thereafter, the pH of each of the obtained solutions was adjusted to 7.4 using hydrochloric acid as a pH adjuster to obtain an activity inhibitor.
（試験例２）
前記試験例１の結果から、炭酸アンモニウムは、アンモニアおよび塩化アンモニウムと比べて細胞内ｐＨを上昇させる度合いが小さいため、細胞内のアルカリ化によって活性化されるＴＲＰＡ１の活性への影響が低いと考えられる。そこで、炭酸アンモニウムと同様に炭酸イオンに解離する炭酸水素ナトリウムを用い、ＴＲＰＡ１の活性への影響を調べた。
(Test Example 2)
From the results of Test Example 1, ammonium carbonate is considered to have a low effect on the activity of TRPA1 activated by intracellular alkalinization because it has a lower degree of increase in intracellular pH than ammonia and ammonium chloride. It is done. Therefore, the effect on the activity of TRPA1 was examined using sodium hydrogen carbonate that dissociates into carbonate ions as in the case of ammonium carbonate.
（１）ＴＲＰＡ１発現細胞へのＦＵＲＡ ２−ＡＭの導入
前記製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中で、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入した。
(1) Introduction of FURA 2-AM into TRPA1-expressing cells The TRPA1-expressing cells obtained in Production Example 1 were treated with FURA 2-AM (manufactured by Invitrogen), a reagent for measuring intracellular calcium ions, at a final concentration of 5 μM. FURA 2-AM was introduced into the TRPA1-expressing cells by incubation at room temperature for 60 minutes in a 10% by mass fetal bovine serum-containing DMEM medium.
（２）ＴＲＰＡ１の活性の測定
前記（１）においてＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入したＴＲＰＡ１発現細胞をのせたカバーグラスを蛍光測定用装置の還流槽に入れた。その後、前記還流槽中のＴＲＰＡ１発現細胞を緩衝液〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。
(2) Measurement of activity of TRPA1 The cover glass on which the TRPA1-expressing cells into which FURA 2-AM had been introduced in (1) was placed was placed in the reflux tank of the fluorescence measurement apparatus. Thereafter, the TRPA1-expressing cells in the reflux tank were washed with a buffer [composition: 140 mM sodium chloride, 5 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 2 mM calcium chloride, 10 mM glucose, 10 mM hepes hydrochloride buffer (pH 7.4)].
また、アンモニアの濃度が１０ｍＭとなるように、アンモニアと実施例５、実施例６または実施例７の活性抑制剤とを混合した。つぎに、得られた混合物を前記還流槽に入れ、前記活性抑制剤とアンモニアとＴＲＰＡ１発現細胞に含まれるＴＲＰＡ１とを接触させた。なお、還流槽内の溶液のｐＨを７．４となるように調整した。 Moreover, ammonia and the activity inhibitor of Example 5, Example 6, or Example 7 were mixed so that the density | concentration of ammonia might be 10 mM. Next, the obtained mixture was put into the reflux tank, and the activity inhibitor, ammonia, and TRPA1 contained in the TRPA1-expressing cells were brought into contact with each other. The pH of the solution in the reflux tank was adjusted to 7.4.
その後、前記還流槽において、ＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく励起波長３４０ｎｍにおける蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）およびＴＲＰＡ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく励起波長３８０ｎｍにおける蛍光の強度（以下、「蛍光強度380nm」という）を測定した。測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比活性抑制剤を算出した。前記Δ蛍光強度比活性抑制剤は、（活性抑制剤を用いたときの蛍光強度340nm／活性抑制剤を用いたときの蛍光強度380nm−前記緩衝液を用いたときの蛍光強度340nm／前記緩衝液を用いたときの蛍光強度380nm）に基づいて算出した。 Thereafter, in the reflux tank, fluorescence intensity at an excitation wavelength of 340 nm (hereinafter referred to as “fluorescence intensity 340 nm ”) based on FURA 2-AM introduced into TRPA1-expressing cells and bound to intracellular calcium ions, and TRPA1-expressing cells. Fluorescence intensity (hereinafter referred to as “fluorescence intensity 380 nm ”) at an excitation wavelength of 380 nm based on FURA 2-AM introduced in FIG. From the measured fluorescence intensity of 340 nm and fluorescence intensity of 380 nm , the Δfluorescence intensity specific activity inhibitor was calculated. The Δ fluorescence intensity ratio activity inhibitor is (fluorescence intensity 340 nm when an activity inhibitor is used / fluorescence intensity 380 nm when an activity inhibitor is used−fluorescence intensity 340 nm when using the buffer solution / the buffer solution The fluorescence intensity was calculated based on the fluorescence intensity of 380 nm .
また、前記活性抑制剤に代えて、ＴＲＰＡ１に対する既知のアゴニストであるアリルイソチオシアナート（２０μＭアリルイソチオシアナート水溶液）を用いたことを除き、前記活性抑制剤を用いた場合と同様にして、Δ蛍光強度比AITCを算出した。前記Δ蛍光強度比AITCは、（アリルイソチオシアナートを用いたときの蛍光強度340nm／アリルイソチオシアナートを用いたときの蛍光強度380nm−前記緩衝液を用いたときの蛍光強度340nm／前記緩衝液を用いたときの蛍光強度380nm）に基づいて算出した。算出されたΔ蛍光強度比活性抑制剤とΔ蛍光強度比AITCとから、Δ蛍光強度比活性抑制剤／Δ蛍光強度比AITCを算出した。 Further, in place of the activity inhibitor, allyl isothiocyanate (20 μM allyl isothiocyanate aqueous solution), which is a known agonist for TRPA1, was used, in the same manner as in the case of using the activity inhibitor, Δ The fluorescence intensity ratio AITC was calculated. The Δ fluorescence intensity ratio AITC is (fluorescence intensity 340 nm when allyl isothiocyanate is used / fluorescence intensity 380 nm when allyl isothiocyanate is used−fluorescence intensity 340 nm when using the buffer / the buffer solution The fluorescence intensity was calculated based on the fluorescence intensity of 380 nm . From the calculated Δ fluorescence intensity ratio activity inhibitor and Δ fluorescence intensity ratio AITC , the Δ fluorescence intensity ratio activity inhibitor / Δ fluorescence intensity ratio AITC was calculated.
なお、対照として、実施例５〜７の活性抑制剤の代わりに精製水（比較例９）を用いたことを除き、実施例５〜７の活性抑制剤を用いた場合と同様にして、Δ蛍光強度比精製水（精製水を用いたときの蛍光強度340nm／精製水を用いたときの蛍光強度380nm）を算出した。算出されたΔ蛍光強度比精製水とΔ蛍光強度比AITCとから、Δ蛍光強度比精製水／Δ蛍光強度比AITCを算出した。 As a control, ΔP was used in the same manner as in the case of using the activity inhibitor of Examples 5 to 7 except that purified water (Comparative Example 9) was used instead of the activity inhibitor of Examples 5 to 7. Fluorescence intensity ratio purified water (fluorescence intensity 340 nm when using purified water / fluorescence intensity 380 nm when using purified water) was calculated. From the calculated Δ fluorescence intensity ratio purified water and Δ fluorescence intensity ratio AITC , the Δ fluorescence intensity ratio purified water / Δ fluorescence intensity ratio AITC was calculated.
試験例２において、炭酸水素ナトリウムの濃度とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比活性抑制剤または精製水／Δ蛍光強度比AITCとの関係を調べた結果を図２に示す。 FIG. 2 shows the results of examining the relationship between the concentration of sodium hydrogen carbonate and the Δfluorescence intensity ratio activity inhibitor or purified water / Δfluorescence intensity ratio AITC in TRPA1-expressing cells in Test Example 2.
図２において、「Δ蛍光強度比活性抑制剤または精製水／Δ蛍光強度比AITC」は、Δ蛍光強度比活性抑制剤／Δ蛍光強度比AITCおよびΔ蛍光強度比精製水／Δ蛍光強度比AITCの総称を示す。また、図２において、試験番号１は活性抑制剤の代わりに精製水（比較例９）を用いたときのΔ蛍光強度比精製水／Δ蛍光強度比AITC、試験番号２は実施例５の活性抑制剤を用いたときのΔ蛍光強度比活性抑制剤／Δ蛍光強度比AITC、試験番号３は実施例６の活性抑制剤を用いたときのΔ蛍光強度比活性抑制剤／Δ蛍光強度比AITC、試験番号４は実施例７の活性抑制剤を用いたときのΔ蛍光強度比活性抑制剤／Δ蛍光強度比AITCを示す。
In FIG. 2, “Δ fluorescence intensity ratio activity inhibitor or purified water / Δ fluorescence intensity ratio AITC ” are Δ fluorescence intensity ratio activity inhibitor / Δ fluorescence intensity ratio AITC and Δ fluorescence intensity ratio purified water / Δfluorescence intensity ratio AITC. The generic name of is shown. In FIG. 2,
図２に示された結果から、実施例５〜７の活性抑制剤を用いたときのΔ蛍光強度比活性抑制剤／Δ蛍光強度比AITCが、精製水（比較例９）を用いたときのΔ蛍光強度比精製水／Δ蛍光強度比AITCと比べて著しく小さくなっているため、炭酸水素ナトリウムをＴＲＰＡ１に接触させた場合、アンモニアによるＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の増加が抑制されることがわかる。したがって、これらの結果から、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンにより、ＴＲＰＡ１の活性を抑制することができることがわかる。 From the results shown in FIG. 2, the Δfluorescence intensity ratio activity inhibitor / Δfluorescence intensity ratio AITC when using the activity inhibitors of Examples 5 to 7 was obtained when purified water (Comparative Example 9) was used. Since Δfluorescence intensity ratio purified water / Δfluorescence intensity ratio AITC is significantly smaller, when sodium bicarbonate is brought into contact with TRPA1, an increase in intracellular calcium ion concentration via TRPA1 due to ammonia is suppressed. I understand that. Therefore, these results show that the activity of TRPA1 can be suppressed by carbonate ions and / or bicarbonate ions.
以上の結果より、炭酸アンモニウムや炭酸水素ナトリウムなどのように炭酸イオンに解離する物質により、ＴＲＰＡ１アゴニストによるＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の増加が抑制されるため、炭酸アンモニウムや炭酸水素ナトリウムなどのように炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質は、ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制剤として当該ＴＲＰＡ１に作用することがわかる。また、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンにより、ＴＲＰＡ１の活性を抑制することができることがわかる。 From the above results, substances that dissociate into carbonate ions, such as ammonium carbonate and sodium bicarbonate, suppress the increase in intracellular calcium ion concentration via TRPA1 by TRPA1 agonists, so that ammonium carbonate, sodium bicarbonate, etc. It can be seen that substances that dissociate into carbonate ions and / or hydrogen carbonate ions act on TRPA1 as an activity inhibitor that suppresses the activity of TRPA1. Moreover, it turns out that the activity of TRPA1 can be suppressed by carbonate ions and / or bicarbonate ions.
（処方例）
以下、本発明に係る皮膚外用剤の処方例を示す。
処方例１ ボディーブリーチング剤
アンモニア １質量％
炭酸水素ナトリウム
（炭酸イオンおよび炭酸水素イオン換算量） １質量％
セタノール ４質量％
ポリオキシエチレン（２０）硬化ヒマシ油 ２質量％
ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル ２質量％
塩化セチルトリメチルアンモニウム １質量％
１，３−ブチレングリコール ３質量％
過酸化水素 ３質量％
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１質量％
精製水 残部
(Prescription example)
Hereinafter, the formulation example of the external preparation for skin which concerns on this invention is shown.
Formulation Example 1 Body
Sodium bicarbonate (carbonate ion and bicarbonate ion equivalent) 1% by mass
Polyoxyethylene (20) hydrogenated
Polyoxyethylene (20)
1% by mass of cetyltrimethylammonium chloride
1,3-
Dipotassium glycyrrhizinate 0.1% by mass
Purified water balance
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