JP2016140262A - Method for predicting risk of metastatic recurrence of hepatocellular carcinoma - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、肝細胞がんの転移性再発リスクを予測する方法や、かかる方法に用いるためのキットに関する。 The present invention relates to a method for predicting the risk of metastatic recurrence of hepatocellular carcinoma and a kit for use in such a method.
我が国では死亡原因の第１位はがんであり、その対策は国民の健康という観点から最重要課題となっている。肝細胞がん（hepatocellular carcinoma；ＨＣＣ、以下、「ＨＣＣ」ともいう）の発生率は世界で第６位であり、死亡率もがん関連死の第３位であることが報告されている。ＨＣＣは、その殆どがウイルス感染に起因する慢性肝炎や、慢性肝炎から進行した肝硬変を背景として発症することが知られており、ＨＣＣ患者の中で、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に陽性である人の割合は約７０％にのぼる（非特許文献１）。肝炎ウイルスがＨＣＣを引き起こすメカニズムの詳細は明らかにされていないが、ウイルスの持続感染が慢性肝炎や肝硬変等を引き起こす過程で、肝細胞のがん化が起こると考えられている。 In Japan, the number one cause of death is cancer, and countermeasures are the most important from the viewpoint of the health of the people. It has been reported that the incidence of hepatocellular carcinoma (HCC, hereinafter also referred to as “HCC”) is the sixth in the world, and the mortality rate is also the third most common cancer-related death. HCC is known to develop mainly against chronic hepatitis caused by viral infection and cirrhosis that has progressed from chronic hepatitis, and is positive for hepatitis C virus (HCV) among HCC patients. The proportion of people is about 70% (Non-patent Document 1). Although details of the mechanism by which hepatitis virus causes HCC have not been clarified, it is thought that hepatocyte canceration occurs in the process where persistent infection of the virus causes chronic hepatitis, cirrhosis, and the like.
現在のところ、ＨＣＣ治療法としては外科的な摘除手術が有効であるとされているが、術後５年以内の再発率は４０〜８０％ときわめて高く、しかも予後不良であることが知られている（非特許文献２）。この再発率の高さは、肝炎ウイルス感染を素地とするde novoによる再発（多中心性再発）に加えて、肝内転移による再発の２つが要因となっている。以上のように、ＨＣＣの治療には、高い再発の危険性が伴っており、特に肝内転移による術後早期の再発は予後不良で有り、外科的な摘除手術の治療後の再発を予測するためのバイオマーカーの開発は同時に転移抑制法の開発にもつながり、ＨＣＣ患者のＱＯＬ（quality of life）の観点から非常に重要であると共に、外科的な摘除手術の治療後は再発を怖れずに安心して暮らせる術後補助療法が求められている。 At present, surgical resection is said to be effective as a treatment for HCC, but the recurrence rate within 5 years after surgery is as high as 40 to 80%, and it is known that the prognosis is poor. (Non-Patent Document 2). This high recurrence rate is due to the recurrence due to intrahepatic metastasis in addition to the recurrence due to de novo based on hepatitis virus infection (multicentric recurrence). As described above, the treatment of HCC is associated with a high risk of recurrence, and in particular, early recurrence due to intrahepatic metastasis has a poor prognosis, and predicts recurrence after surgical removal surgery. The development of biomarkers for this purpose also leads to the development of metastasis suppression methods, which is very important from the viewpoint of quality of life (QOL) of HCC patients, and without fear of recurrence after surgical removal surgery There is a need for postoperative adjuvant therapy that allows people to live with peace of mind.
また、これまでにＤＮＡチップ法等の網羅的解析から、がん細胞での遺伝子発現プロファイルが構築され、がん特異的遺伝子が多数同定されてきた。そこで、がん特異的遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標として、がんに対する早期検出・分類・予後予測等の診断法が開発されている（特許文献１参照）。しかしながら、現在までに実用化されたものは、米国食品医薬品局に認可された、乳がんの再発リスクを７０の遺伝子の発現から予測するMammaPrint（登録商標：Agendia社製）にとどまっているのが現状である。また、これまでに本発明者らは、ＣＹＰ２Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１、ＥＳＲ１、ＧＬＹＡＴ、ＴＳＰＡＮ８、又はＮＱＯ１遺伝子のｍＲＮＡの発現の増減を検出することによるＨＣＣ発症リスクの判定方法（特許文献２参照）を提案して開発を進めているが、実用化には至っていない。 In addition, gene expression profiles in cancer cells have been constructed from a comprehensive analysis such as a DNA chip method, and many cancer-specific genes have been identified so far. Thus, diagnostic methods such as early detection, classification, and prognosis prediction for cancer have been developed using the mRNA expression level of a cancer-specific gene as an index (see Patent Document 1). However, only the MammaPrint (registered trademark: made by Agendia) that predicts the recurrence risk of breast cancer from the expression of 70 genes approved by the US Food and Drug Administration has been put into practical use to date. It is. In addition, the present inventors have previously determined a method for determining the risk of developing HCC by detecting an increase or decrease in mRNA expression of CYP2A6, SLC10A1, SLC22A1, ESR1, GLYAT, TSPAN8, or NQO1 gene (see Patent Document 2). Although it has been proposed and developed, it has not been put to practical use.
一方、がん組織における一部のがん細胞には、胚性幹細胞や体性幹細胞等の幹細胞に特徴的な性質である、自身と同じ細胞を作り出す自己複製能と多種類の細胞に分化できる多分化能とを有するがん幹細胞（cancer stem cells；ＣＳＣｓ）が存在し、かかるがん幹細胞が、自己複製能により自身と同じ細胞を維持しながら、多分化能によりがん組織における多数の分化したがん細胞を生み出していると考えられている。したがって、外科的な摘除手術等によってがん細胞を除いても、体内にごく少数のがん幹細胞が生き残っていれば再発が起こりうることになる。 On the other hand, some cancer cells in cancer tissue can differentiate into many types of cells with the self-replicating ability to produce the same cells as the self, which is a characteristic property of stem cells such as embryonic stem cells and somatic stem cells There are cancer stem cells (CSCs) having pluripotency, and such cancer stem cells maintain the same cells as themselves due to their self-replicating ability, while multiple differentiation in cancer tissues due to pluripotency. It is thought that it has produced cancer cells. Therefore, even if cancer cells are removed by surgical resection or the like, recurrence can occur if very few cancer stem cells survive in the body.
上記がん幹細胞はがん細胞のなかでごく少数しか含まれていないため、がん幹細胞の研究はあまり進んでいなかった。そこで本発明者らは、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、神経生存因子−１（ＮＳＦ−１）を添加した無血清培地を用いた消化器系がん幹細胞の増殖方法（特許文献３参照）を提案した。かかる方法を用いれば、がん幹細胞がほとんど含まれていないＳＫ−ＨＥＰ−１等の低分化型のＨＣＣ由来細胞株からＨＣＣ幹細胞を効率よく誘導・濃縮することや、ＨＣＣ幹細胞を長期間安定して増殖培養することが可能となり、ＨＣＣ幹細胞をターゲットとしたＨＣＣ治療薬の開発が期待されている。 Since the cancer stem cells contain only a small number of cancer cells, research on cancer stem cells has not progressed much. Therefore, the present inventors have developed a method for proliferating digestive cancer stem cells using a serum-free medium in which nerve survival factor-1 (NSF-1) is added to a basal medium for animal cell culture that does not contain serum (Patent Literature). 3) was proposed. By using such a method, HCC stem cells can be efficiently induced / concentrated from a poorly differentiated HCC-derived cell line such as SK-HEP-1 containing almost no cancer stem cells, and HCC stem cells can be stabilized for a long period of time. Thus, it is possible to proliferate and culture, and development of HCC therapeutic agents targeting HCC stem cells is expected.
ＨＣＣは再発率が高い疾患であり、また、de novoによる再発に比べて転移性再発は予後が悪いため、早期に転移性再発リスクを予測することが肝要である。そこで、本発明の課題は、ＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法や、かかる方法に用いるためのキットを提供することにある。 HCC is a disease with a high recurrence rate, and metastatic recurrence has a poor prognosis compared to de novo recurrence, so it is important to predict the risk of metastatic recurrence at an early stage. Therefore, an object of the present invention is to provide a method for predicting the risk of HCC metastatic recurrence and a kit for use in such a method.
これまでにがんの再発予測リスクの判定方法が実用化に至っていない背景として、がん細胞のみならず、がん細胞集団の中でも極少数であるがん幹細胞においても多様性（heterogeneity）が存在することが挙げられ、真に転移性再発の原因となる細胞に対する特異的特徴を明らかとする必要がある。上記、ＨＣＣ幹細胞の誘導・濃縮によって得られた肝転移能の亢進を示す細胞に共通し、また、術後肝内再発を来したヒト臨床検体においても共通する発現プロファイルは、ＨＣＣの再発予測リスクを予測する方法及びＨＣＣ治療薬開発において有用である。 The reason why the risk assessment method for cancer recurrence has not been put into practical use so far is that not only cancer cells but also cancer stem cells, which are a very small number of cancer cell populations, have diversity (heterogeneity). It is necessary to clarify specific features for cells that are truly responsible for metastatic recurrence. The expression profile common to the above-mentioned cells showing enhanced liver metastasis obtained by induction and concentration of HCC stem cells, and also common to human clinical specimens that have undergone postoperative intrahepatic recurrence is the risk of HCC recurrence prediction It is useful in the method for predicting the development of HCC and therapeutic agents for HCC.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けていく過程において、ＨＣＣ細胞株であるＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株と、該ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株を上記特許文献３記載の方法で培養して得られた細胞塊（sphere：ＨＣＣ幹細胞）を、それぞれＲａｇ欠損（Ragnull）マウスとＩＬ−２ｒγノックアウトマウスを交配して作製された免疫不全のＮＲＧマウス（Pearson, T. et al., Clin. Exp. Immunol 154: 270-284(2008)）に投与した試験により、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊はＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株と比較して肝転移能が亢進することを見いだした。そこで、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊に、転移性再発に関与する遺伝子が含まれていると考え、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊におけるｍＲＮＡ発現解析を行って比較したところ、ｍＲＮＡの発現量の増減が３倍以上となる遺伝子が１２５種類あることを確認した。さらに、摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者と摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者からの摘除標本（摘除した肝組織）におけるｍＲＮＡ発現解析を行うことで、上記１２５遺伝子のうち、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子が再発と相関があることを見いだした。また、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊におけるタンパク質発現解析を行って比較したところ、発現量の増減量が２倍以上となるタンパク質が５９種類あることを確認し、そのうちＲＡＢ２７Ｂが摘除標本においても再発と相関があることを見いだし、本発明を完成した。 In the process of continuing intensive research to solve the above-mentioned problems, the present inventors described the SK-HEP-1 cell line, which is an HCC cell line, and the SK-HEP-1 cell line described in Patent Document 3 above. The cell mass (sphere: HCC stem cells) obtained by culturing by the above method was used to cross-combine Rag-deficient (Ragnull) mice with IL-2rγ knockout mice, and immunodeficient NRG mice (Pearson, T. et al , Clin. Exp. Immunol 154: 270-284 (2008)), the floating cell mass derived from the SK-HEP-1 cell line has a liver metastasis ability compared to the SK-HEP-1 cell line. I found it to increase. Therefore, it is considered that the floating cell mass derived from the SK-HEP-1 cell line contains a gene involved in metastatic recurrence, and the floating cells derived from the SK-HEP-1 cell line and the SK-HEP-1 cell line When the mRNA expression analysis in the lump was performed and compared, it was confirmed that there were 125 genes whose increase or decrease in the expression level of mRNA was 3 times or more. Furthermore, by analyzing mRNA expression in excised specimens (extracted liver tissue) from patients with recurrent intrahepatic HCC within 1 year after excision surgery and patients with non-hepatic recurrent HCC for 2 years or more after excision surgery, The TM4SF19 gene, the HILPDA gene, the KISS1 gene, and the PAPPA gene were found to be correlated with recurrence. In addition, when protein expression analysis is performed and compared in the floating cell mass derived from the SK-HEP-1 cell line and the SK-HEP-1 cell line, there are 59 types of proteins in which the amount of increase / decrease in the expression level is twice or more. As a result, RAB27B was found to correlate with recurrence even in the excised specimen, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）被検者から採取した生体試料中のＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を指標として、肝細胞がんの転移性再発リスクを予測する方法。
（２）生体試料が、肝組織であることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（３）上記（１）又は（２）記載の方法に用いるためのキットであって、被検者から採取した生体試料中のＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とするキット。
（４）上記（１）又は（２）記載の方法に用いるためのキットであって、被検者から採取した生体試料中のＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はこれらの標識物を備えることを特徴とするキット。
That is, the present invention is as follows.
(1) With reference to the expression level of mRNA of TM4SF19 gene, HILPDA gene, KISS1 gene, PAPPA gene or RAB27B gene in a biological sample collected from a subject, or the expression level of the protein encoded by the mRNA, hepatocytes Of predicting the risk of metastatic recurrence of cancer.
(2) The method according to (1) above, wherein the biological sample is liver tissue.
(3) A kit for use in the method described in (1) or (2) above, wherein the mRNA of TM4SF19 gene, HILPDA gene, KISS1 gene, PAPPA gene or RAB27B gene in a biological sample collected from a subject A kit comprising a primer pair or a probe for detecting the expression level, or a label thereof.
(4) A kit for use in the method described in (1) or (2) above, wherein the mRNA of TM4SF19 gene, HILPDA gene, KISS1 gene, PAPPA gene or RAB27B gene in a biological sample collected from a subject is A kit comprising an antibody that specifically binds to an encoded protein, or a label thereof.
なお、上記本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法には医師による診断行為は含まれず、また上記ＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法のその他の態様としては、ＨＣＣの再発リスクの予測を補助する方法や、ＨＣＣの再発リスクを予測するためのデータを収集する方法を挙げることができる。 The method of predicting the metastatic recurrence risk of HCC of the present invention does not include a diagnostic action by a doctor, and as another aspect of the method of predicting the metastatic recurrence risk of HCC, the method of predicting the risk of recurrence of HCC may be used. Examples include a method for assisting prediction and a method for collecting data for predicting the risk of recurrence of HCC.
本発明によると、ＨＣＣ治療における術後のＨＣＣの転移性再発リスクを予測することが可能となり、ＨＣＣ治療の術後の治療方針を決定することができる。また、本発明によりＨＣＣの転移性再発リスクを予測することで、ＨＣＣの転移性再発の予防及び早期発見のために有用な情報を提供することができる。 According to the present invention, it becomes possible to predict the risk of metastatic recurrence of HCC after surgery in HCC treatment, and the postoperative treatment policy of HCC treatment can be determined. Further, by predicting the risk of HCC metastatic recurrence according to the present invention, it is possible to provide information useful for the prevention and early detection of HCC metastatic recurrence.
本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法としては、被検者から採取した生体試料中のＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子（別名：ＨＩＧ２遺伝子）、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子（以下、「本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子」ともいう）のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を指標として、ＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法であれば特に制限されず、ここで、本発明において「ＨＣＣの転移性再発」とは、肝炎ウイルス感染を素地とするde novoによる再発とは異なり、肝内転移巣や血液からの遺残がん細胞の再増殖によるＨＣＣの再発を意味し、主として摘除手術後１年若しくは２年以内の再発である。 As a method for predicting the risk of metastatic recurrence of HCC of the present invention, TM4SF19 gene, HIPDA gene (also known as HIG2 gene), KISS1 gene, PAPPA gene or RAB27B gene (hereinafter, “ It is not particularly limited as long as it is a method for predicting the risk of metastatic recurrence of HCC, using as an index the expression level of mRNA of the present HCC biomarker gene ”or the expression level of the protein encoded by the mRNA, In the present invention, “metastatic recurrence of HCC” means recurrence of HCC due to regrowth of residual cancer cells from intrahepatic metastases and blood, unlike recurrence due to de novo based on hepatitis virus infection. However, recurrence is mainly within one year or two years after the resection surgery.
また、本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法に用いるためのキットとしては、被検者から採取した生体試料中の本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキット（以下、「本件キット１」ともいう）や、被検者から採取した生体試料中の本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はこれらの標識物を備えたキット（以下、「本件キット２」ともいう）であれば特に制限されず、かかるキットを用いることで、ＨＣＣの転移性再発リスクを容易に予測することが可能となる。
The kit for use in the method for predicting the risk of metastatic recurrence of HCC of the present invention includes a primer pair for detecting the mRNA expression level of the present HCC biomarker gene in a biological sample collected from a subject. Alternatively, it is specific to the protein encoded by the mRNA of the subject HCC biomarker gene in a biological sample collected from a subject (hereinafter also referred to as “the
本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法、本件キット１及び本件キット２における本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子は、１種でも２種以上組み合わせてもよく、また、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子に、ＨＣＣの転移性再発リスクを予測可能な他の遺伝子を組み合わせてもよい。
The method of predicting the metastatic recurrence risk of HCC of the present invention, the present HCC biomarker genes in the
本発明において、生体試料としては、肝組織、細胞等の非液性試料や、血液、血清、唾液等の液性試料を例示することができ、肝組織であることを好適に例示することができ、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子、ＫＩＳＳ１遺伝子又はＰＡＰＰＡ遺伝子のｍＲＮＡの発現量や、前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を指標とする場合には、がん部肝組織であることが好ましく、ＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡの発現量や、ＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を指標とする場合には、非がん部肝組織であることが好ましい。なお、転移生再発は血行性転移でもあることから、上記細胞として血液中の循環がん細胞を用いてもよい。また、上記肝組織は、被検者より採取された後に、凍結処理が施された凍結組織であっても、病理組織学的処理が施された病理組織であってもよく、かかる病理組織としては、ホルマリン固定組織や、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等を例示することができる。 In the present invention, examples of the biological sample include non-liquid samples such as liver tissue and cells, and liquid samples such as blood, serum, and saliva, and preferably a liver tissue. When the expression level of mRNA of TM4SF19 gene, HIPPDA gene, KISS1 gene or PAPPA gene or the expression level of the protein encoded by the mRNA is used as an index, it is preferably a cancer liver tissue, and the RAB27B gene When using the expression level of mRNA or the expression level of the protein encoded by the mRNA of the RAB27B gene as an index, non-cancerous liver tissue is preferable. Since metastatic live recurrence is also hematogenous metastasis, circulating cancer cells in blood may be used as the cells. In addition, the liver tissue may be a frozen tissue that has been collected from the subject and then subjected to a freezing treatment, or may be a pathological tissue that has been subjected to a histopathological treatment. Can be exemplified by formalin-fixed tissue, formalin-fixed paraffin-embedded tissue and the like.
本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法におけるＨＣＣの転移性再発リスクの予測は、被検者から採取された生体試料中の本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を測定することによって行うことができる。例えば、事前に摘除手術後１年以上肝内無再発ＨＣＣ患者、好ましくは摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者と、摘除手術後２年以内肝内再発ＨＣＣ患者、好ましくは摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者それぞれ２検体以上、好ましくは４検体以上、より好ましくは５検体以上から採取された生体試料中の本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を測定し、かかる発現量の中央値又は平均値を算出し、前記中央値又は平均値を基にカットオフ値を定める。次いで被検者から採取された生体試料中の本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量を測定し、被検者から採取された生体試料中のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量と前記カットオフ値とを比較することで、被検者におけるＨＣＣの転移性再発リスクを予測することが可能である。 The prediction of the risk of metastatic recurrence of HCC in the method for predicting the risk of metastatic recurrence of HCC of the present invention is based on the expression level of the mRNA of the present HCC biomarker gene in the biological sample collected from the subject, This can be done by measuring the expression level of the encoded protein. For example, patients with non-hepatic recurrent HCC for 1 year or more after excision surgery, preferably patients with non-hepatic recurrence for 2 or more years after resection surgery, patients with recurrent HCC within 2 years after resection surgery, preferably after resection surgery The expression level of mRNA of the present HCC biomarker gene in a biological sample collected from 2 or more samples, preferably 4 samples or more, more preferably 5 samples or more, respectively, within one year, or the mRNA encodes The expression level of the protein is measured, the median value or the average value of the expression levels is calculated, and the cutoff value is determined based on the median value or the average value. Subsequently, the mRNA expression level of the present HCC biomarker gene in the biological sample collected from the subject or the expression level of the protein encoded by the mRNA is measured, and the mRNA level in the biological sample collected from the subject is measured. By comparing the expression level or the expression level of the protein encoded by the mRNA and the cut-off value, it is possible to predict the risk of HCC metastatic recurrence in the subject.
被検者から採取された生体試料中のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量がカットオフ値以上であれば、被検者のＨＣＣの転移性再発リスクが高い、或いは被検者におけるＨＣＣ治療の予後が悪い（予後不良）と予測することができる。一方、被検者から採取された生体試料中のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量がカットオフ値未満であれば、被検者のＨＣＣの転移性再発リスクが低い、或いは被検者におけるＨＣＣ治療の予後がよい（予後良好）と予測することができる。 If the expression level of mRNA in the biological sample collected from the subject or the expression level of the protein encoded by the mRNA is equal to or higher than the cut-off value, the subject has a high risk of metastatic recurrence of HCC, or the subject It can be predicted that the prognosis of HCC treatment in the examiner is poor (poor prognosis). On the other hand, if the expression level of mRNA in the biological sample collected from the subject or the expression level of the protein encoded by the mRNA is less than the cut-off value, the risk of metastatic recurrence of HCC in the subject is low, Alternatively, it can be predicted that the prognosis of HCC treatment in the subject is good (good prognosis).
この他、被検者から採取された生体試料中のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量、及び、摘除手術後１年以上肝内無再発ＨＣＣ患者、好ましくは摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者と、摘除手術後２年以内肝内再発ＨＣＣ患者、好ましくは摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者それぞれ２検体以上、好ましくは４検体以上、より好ましくは５検体以上から採取された生体試料中の本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量、又は前記ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現量とを組み合わせた判別式をロジスティック回帰分析等により構築して予測する方法を挙げることができる。 In addition, the expression level of mRNA in a biological sample collected from a subject, or the expression level of a protein encoded by the mRNA, and an HCC patient with no recurrence in the liver for 1 year or more after resection surgery, preferably after resection surgery Patients with HCC with no recurrence for 2 years or more, patients with HCC with recurrence within 2 years after surgery, preferably patients with 2 or more liver recurrence within 1 year after surgery, preferably 4 or more, more preferably Method of constructing and predicting a discriminant that combines the expression level of the mRNA of the present HCC biomarker gene in a biological sample collected from five or more specimens or the expression level of the protein encoded by the mRNA by logistic regression analysis or the like Can be mentioned.
なお、上記ＨＣＣの転移性再発リスクの予測方法において、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量の代わりに、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量と相関又は逆相関の関係にあるフリーＤＮＡ又はフリーＲＮＡの発現量を測定してもよい。 In the method for predicting the risk of metastatic recurrence of HCC, the expression level of the HCC biomarker gene mRNA or protein is correlated or inversely correlated with the expression level of the HCC biomarker gene mRNA or protein. You may measure the expression level of a certain free DNA or free RNA.
本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法において、遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出する方法としては、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、被検者から採取された生体試料中の全ＲＮＡを抽出・精製し、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法や、被検者から採取された生体試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、かかるｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲ法で検出する方法や、被検者から採取された生体試料中の全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ビオチン（biotin）やジゴキシゲニン（digoxigenin）等でｃＤＮＡをラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジン（avidin）やジゴキシゲニンを認識する抗体等で間接的にｃＤＮＡを標識した後、ガラス、シリコン、プラスチック等のハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化された、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｃＤＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法や、被検者から採取された生体試料中の全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ｃＤＮＡを制限酵素（ＭｓｐＩ、ＭｓｅＩ等）によって切断し、アダプター配列を結合した後、これらを鋳型ＤＮＡとしたＰＣＲを行い、それぞれのＰＣＲ産物をキャピラリー電気泳動により展開し、得られたＰＣＲ産物由来のピークを検証するＨｉＣＥＰ法等の方法を挙げることができる。なお、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡの配列情報は、例えば本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子名を基に、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースで検索することにより得ることができる。 In the method for predicting the risk of metastatic recurrence of HCC of the present invention, the method for detecting the expression level of mRNA of a gene is any method that can specifically detect part or all of the mRNA of the HCC biomarker gene. Any method may be used, specifically, a probe comprising a base sequence complementary to the mRNA of the present HCC biomarker gene by extracting and purifying total RNA in a biological sample collected from a subject. This method uses a Northern blotting method to detect the total RNA in cells in a biological sample collected from a subject, synthesizes cDNA using reverse transcriptase, Detected by quantitative PCR methods such as competitive PCR and real-time PCR using primer pairs that are amplified in Extract and purify total RNA from biological samples, synthesize cDNA using reverse transcriptase, label cDNA with biotin, digoxigenin, etc., and affinity for biotin labeled with a fluorescent substance The HCC biomarker gene immobilized on a support that can be used for hybridization such as glass, silicon, plastic, etc. after indirectly labeling cDNA with an antibody that recognizes high avidin (avidin) or digoxigenin A method of detecting with a microarray using a probe consisting of a base sequence complementary to the cDNA of, and extracting and purifying total RNA in a biological sample collected from a subject, and synthesizing cDNA using reverse transcriptase Thereafter, the cDNA is cleaved with a restriction enzyme (MspI, MseI, etc.), and adapter sequences are bound. A method such as HiCEP method for performing PCR using as a template DNA, developing each PCR product by capillary electrophoresis, and verifying the peak derived from the obtained PCR product can be mentioned. For example, the mRNA and cDNA sequence information of the HCC biomarker gene is searched from the NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) database based on the HCC biomarker gene name, for example. Can be obtained.
本発明のＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法において、タンパク質の発現量を検出する方法としては、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡがコードするタンパク質（以下、「本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質」という）の一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法や、本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法を挙げることができる。なお、本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質のアミノ酸配列情報は、例えば本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質名を基に、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースで検索することにより得ることができる。 In the method for predicting the risk of metastatic recurrence of HCC of the present invention, as a method for detecting the expression level of protein, a protein encoded by mRNA of the HCC biomarker gene (hereinafter referred to as “the HCC biomarker protein”) is used. Any method can be used as long as it can specifically or partially detect, specifically, an immunoassay using an antibody that specifically recognizes the HCC biomarker protein, And mass spectrometry for detecting peptides constituting the present HCC biomarker protein. The amino acid sequence information of the HCC biomarker protein can be obtained by searching the NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) database based on the name of the HCC biomarker protein, for example. Can be obtained.
本件キット１におけるプライマー対としては、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子から合成されるｃＤＮＡの上流及び下流の配列の一部とアニーリングしうる相補的なプライマー対であれば、プライマー配列の長さ、かかるｃＤＮＡとアニーリングする部位、増幅するｃＤＮＡの長さ等は、ＤＮＡの増幅効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。例えば、プライマー配列の長さとしては、１５〜３０塩基を選択することができ、また、増幅するｃＤＮＡの長さとしては、５０〜３００塩基を選択することができる。
As the primer pair in the
本件キット１におけるプローブとしては、本件ＨＣＣバイオマーカー遺伝子、又はかかる遺伝子から合成したｃＤＮＡの一部若しくは全部がハイブリダイゼーションするプローブであれば、プローブの長さ、かかるスプライシングバリアントとハイブリダイズする部位等は、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。また、本件キット１には、必要と目的に応じた緩衝液、ｐＨ調製剤、反応容器、ＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法を記載した説明書等をさらに備えたものであってもよい。
As a probe in the
本件キット２における抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等の抗体であってもよく、また、この中には、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）2等の抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。また、本件キット２には、本件ＨＣＣバイオマーカータンパク質のアミノ酸残基に結合した本件キット２における抗体を検出するための、蛍光物質、酵素等の標識物質をコンジュゲートした２次抗体を含めることや、本件キット２における抗体とは異なるエピトープと反応する少なくとも１種類の抗体を含めることができる。また、本件キット２には、必要と目的に応じた緩衝液、ｐＨ調製剤、反応容器、ＨＣＣの転移性再発リスクを予測する方法を記載した説明書等をさらに備えたものであってもよい。
The antibody in the
本件キット１におけるプライマー対の標識物やプローブの標識物としては、標識物質が結合した上記プライマー対や標識物質が結合した上記プローブであればよく、本件キット２における抗体の標識物としては、標識物質が結合した上記抗体であればよく、かかる標識物質としては、例えばビオチン、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein；ＧＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horse Radish Peroxidase;ＨＲＰ)、３２Ｐ等を具体的に挙げることができる。
The labeled product of the primer pair and the labeled product of the probe in the
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
［細胞塊の調製］
転移に関わるがん幹細胞様細胞を誘導するために、まずはＨＣＣ由来細胞株から浮遊細胞塊を調製した。
[Preparation of cell mass]
In order to induce cancer stem cell-like cells involved in metastasis, a suspension cell mass was first prepared from an HCC-derived cell line.
（無血清培地の作製）
ＳＫ−ＨＥＰ−１を培養して浮遊細胞塊を作製するための無血清培地として、以下の成分Ａ、Ｂ、及びＣからなるものを作製した。
（１）成分Ａ
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（シグマ−アルドリッチ社製社製） ８６ｍＬ
１Ｍ Ｈｅｐｅｓ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid） ９００μｌ
Antibiotic/antimycotic liquid（１００倍濃度） ９００μｌ
３０％グルコース １．７ｍｌ
（２）成分Ｂ
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（シグマ−アルドリッチ社製） ８．６ｍｌ
３０％グルコース（シグマ−アルドリッチ社製） ２００μｌ
トランスフェリン（シグマ−アルドリッチ社製） １０ｍｇ＋Ｈ2Ｏ ２００μｌ
インスリン（シグマ−アルドリッチ社製）２．５ｍｇ＋０．１Ｎ ＨＣｌ １００μｌ（先にインスリンを溶解）＋Ｈ2Ｏ ９００μｌ（溶解後に加える） 計１ｍｌ
プトレシン（Alexis Biochemicals社製） １９．３３ｍｇ
０．３ｍＭ 亜セレン酸ナトリウム（シグマ−アルドリッチ社製） １０μｌ
２ｍＭ プロゲステロン（シグマ−アルドリッチ社製） １μｌ
（３）成分Ｃ
２００μｇ／ｍｌ ヒトＥＧＦ（シグマ−アルドリッチ社製） １０μｌ
４μｇ／ｍｌ Ｂａｓｉｃ ＦＧＦ（和光純薬工業社製） ５００μｌ
１ｍｇ／ｍｌ ヘパリン（シグマ−アルドリッチ社製） ２００μｌ
１０μｇ／ｍｌ ＬＩＦ（ケミコン社製） １００μｌ
ＮＳＦ−１（５０倍濃度）（カンブレックス社製） ２ｍｌ（最終濃度；２％［ｗ／ｖ］）
６０ｍｇ／ｍｌ Ｎ−アセチルシステイン（N-acetylcysteine）（シグマ−アルドリッチ社製） １００μｌ
(Preparation of serum-free medium)
As a serum-free medium for culturing SK-HEP-1 to produce a floating cell mass, a medium comprising the following components A, B, and C was prepared.
(1) Component A
86 mL of DMEM / F12 (manufactured by Sigma-Aldrich)
1M Hepes (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) 900 μl
Antibiotic / antimycotic liquid (100 times concentration) 900μl
30% glucose 1.7 ml
(2) Component B
8.6 ml of DMEM / F12 medium (manufactured by Sigma-Aldrich)
30% glucose (Sigma-Aldrich) 200 μl
Transferrin (Sigma-Aldrich) 10 mg + H 2 O 200 μl
Insulin (Sigma-Aldrich) 2.5 mg + 0.1 N HCl 100 μl (Insulin dissolved first) + H 2 O 900 μl (added after dissolution) Total 1 ml
Putrescine (Alexis Biochemicals) 19.33mg
0.3 mM sodium selenite (manufactured by Sigma-Aldrich) 10 μl
2 mM progesterone (manufactured by Sigma-Aldrich) 1 μl
(3) Component C
200 μg / ml human EGF (Sigma-Aldrich) 10 μl
4 μg / ml Basic FGF (Wako Pure Chemical Industries) 500 μl
1 mg / ml heparin (manufactured by Sigma-Aldrich) 200 μl
10 μg / ml LIF (Chemicon) 100 μl
NSF-1 (50-fold concentration) (Cambrex) 2 ml (final concentration; 2% [w / v])
60 mg / ml N-acetylcysteine (manufactured by Sigma-Aldrich) 100 μl
なお、ここでは約１００ｍｌの無血清培地を作製する場合の組成を記載している。また、無血清培地は、成分Ａ、Ｂ及びＣをそれぞれ個別に作製した後、混合して作製した。 Here, the composition in the case of producing about 100 ml of serum-free medium is described. In addition, the serum-free medium was prepared by separately preparing components A, B, and C and then mixing them.
（ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の細胞塊の形成）
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株の生細胞数をトリパンブルー染色より計測し、１．０ｘ１０５個／ｍｌとなるように上記で作製した無血清培地に懸濁した後、ベントキャップタイプフラスコ（BDファルコン社製）、又は超低接着表面フラスコ カントネック ベントキャップ（Corning社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養した。培養後７日目には、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊を形成した。ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株、及び形成したＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊（ＳＫ−ｓｐｈｅｒｅ）を図１に示す。
(Formation of cell mass derived from SK-HEP-1 cell line)
The number of viable cells of the SK-HEP-1 cell line was measured by trypan blue staining, suspended in the serum-free medium prepared as described above so as to be 1.0 × 10 5 cells / ml, and then a vent cap type flask (BD Falcon). Or an ultra-low adhesion surface flask Canneck vent cap (Corning), and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . On the 7th day after the culture, a floating cell mass derived from the SK-HEP-1 cell line was formed. FIG. 1 shows the SK-HEP-1 cell line and the formed floating cell mass (SK-sphere) derived from the SK-HEP-1 cell line.
［ＤＮＡチップ法によるｍＲＮＡ発現解析］
（ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊におけるｍＲＮＡ発現解析）
ＤＮＡチップ法により、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊のｍＲＮＡ発現量を調べて比較した。
[MRNA expression analysis by DNA chip method]
(MRNA expression analysis in floating cell mass derived from SK-HEP-1 cell line and SK-HEP-1 cell line)
The mRNA expression levels of the floating cell mass derived from the SK-HEP-1 cell line and the SK-HEP-1 cell line were examined and compared by the DNA chip method.
まず、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊から、miRNeasy（QIAGEN社製）により全ＲＮＡの抽出・精製を行った。次にｃＲＮＡを３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ社製）を用いて、そのプロトコルに従ってＤＮＡチップ解析を行った。その後の統計学的解析は、GeneSpring GX（アジレント・テクノロジー社製）を用いて行った。選択基準（Fold-change＞３．０、Ｐ値＜０．０５）を基に、ＨＣＣ再発に関わる候補遺伝子を同定した。Ｐ値は、漸近計算した対応のないｔ−検定（unpaired t-test）とBenjamini-Hochberg FDR多重検定（multiple-testing correction）により算出した。 First, total RNA was extracted and purified by miRNeasy (manufactured by QIAGEN) from SK-HEP-1 cell line and floating cell mass derived from SK-HEP-1 cell line. Next, cRNA was subjected to DNA chip analysis using a 3D-Gene (registered trademark) all-genotype DNA chip (manufactured by Toray Industries, Inc.) according to the protocol. Subsequent statistical analysis was performed using GeneSpring GX (manufactured by Agilent Technologies). Based on the selection criteria (Fold-change> 3.0, P value <0.05), candidate genes involved in HCC recurrence were identified. P values were calculated by asymptotically calculated unpaired t-test and Benjamini-Hochberg FDR multiple-testing correction.
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊における各ｍＲＮＡの発現量をＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株における各ｍＲＮＡの発現量と比較したところ、ｍＲＮＡの発現量の増減が３倍以上となる遺伝子が１２５種類あることが確認された。 When the expression level of each mRNA in the floating cell mass derived from the SK-HEP-1 cell line is compared with the expression level of each mRNA in the SK-HEP-1 cell line, the increase or decrease in the expression level of the mRNA is 3 times or more. It was confirmed that there are 125 types.
（肝組織におけるｍＲＮＡ発現解析）
摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者（without IHR）及び摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者（with IHR）からの摘除標本におけるがん部肝組織、及び非がん部肝組織（non-Tumor）（それぞれｎ＝５）から、TRIzol Reagent（Life Technologies社製）とPureLink Micro-to-Midi Total RNA Purification Kit（Life Technologies社製）を用いて全ＲＮＡの抽出・精製及びｃＤＮＡ合成を行い、DNA Labeling Kits（Roche Applied Science社製）を用いてＣｙ３で上記ｃＤＮＡを蛍光標識した後、かかるｃＤＮＡをHuman Gene Expression 4x72K Arrays（Roche Diagnostics社製）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、Hybridization Kits（Roche Applied Science社製）及びNimbleGen Hybridization Systems（Roche Applied Science社製）を用いて４２℃にて１６時間の条件下で行った。蛍光シグナルのスキャニングは、GenePix 4000B（Molecular Devices社製）を用いて行い、取得した蛍光シグナルの画像解析は、NimbleScan Software（Roche Applied Science社製）を用いて行った。その後の統計学的解析は、GeneSpring GX（アジレント・テクノロジー社製)を用いて行った。
(MRNA expression analysis in liver tissue)
Cancer liver tissue and non-cancer liver tissue in resected specimens from HCC patients without recurrent liver (without IHR) and recurrent intrahepatic HCC patients within 1 year after resection surgery (with IHR) (Non-Tumor) (n = 5 for each), extraction and purification of total RNA and cDNA synthesis using TRIzol Reagent (Life Technologies) and PureLink Micro-to-Midi Total RNA Purification Kit (Life Technologies) The above cDNA was fluorescently labeled with Cy3 using DNA Labeling Kits (Roche Applied Science), and then hybridized with Human Gene Expression 4x72K Arrays (Roche Diagnostics). Hybridization was performed using Hybridization Kits (Roche Applied Science) and NimbleGen Hybridization Systems (Roche Applied Science) at 42 ° C. for 16 hours. Scanning of the fluorescent signal was performed using GenePix 4000B (manufactured by Molecular Devices), and image analysis of the acquired fluorescent signal was performed using NimbleScan Software (manufactured by Roche Applied Science). Subsequent statistical analysis was performed using GeneSpring GX (manufactured by Agilent Technologies).
摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者と摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者の摘除標本におけるがん部肝組織のｍＲＮＡの発現量を比較したところ、ｍＲＮＡの発現量の増減が２倍以上となる遺伝子が３１６６種類あることが確認された。このうち、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子は、上述のＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊におけるｍＲＮＡ発現解析によって得られた１２５種類のＨＣＣ再発に関わる候補遺伝子に含まれていた。４種類それぞれの遺伝子の摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者と摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者の摘除標本におけるがん部肝組織、及び非がん部肝組織におけるｍＲＮＡの発現量を図２に示す。図２において、縦軸はＤＮＡチップ解析から得られた発現量をGlobal normalization法により標準化した数値を任意の値（Arbitrary Unit）として示したものである。 When the expression level of mRNA in the liver tissue of a cancerous part of the resected specimens of HCC patients with recurrent intrahepatic recurrence within 1 year after resection surgery and patients with HCC without recurrence within 2 years after resection surgery was compared, It was confirmed that there were 3166 types of genes that more than doubled. Among these, KISS1 gene, TM4SF19 gene, PAPPA gene, and HILPDA gene are 125 types of HCC obtained by mRNA expression analysis in the above-mentioned SK-HEP-1 cell line and SK-HEP-1 cell line-derived floating cell mass. It was included in candidate genes involved in recurrence. MRNA of cancerous liver tissue and non-cancerous liver tissue in resected specimens of HCC patients with recurrent intrahepatic recurrence within 1 year after surgery for each of the four types of genes and patients with non-hepatic recurrence of HCC more than 2 years after surgery The expression level is shown in FIG. In FIG. 2, the vertical axis indicates the numerical value obtained by standardizing the expression level obtained from the DNA chip analysis by the Global normalization method as an arbitrary value (Arbitrary Unit).
図２に示すように、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子は、ＨＣＣ患者の非がん部肝組織や摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者の摘除標本におけるがん部肝組織と比較して摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者の摘除標本におけるがん部肝組織において発現量が多く、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、又はＨＩＬＰＤＡ遺伝子の発現量を調べることで、ＨＣＣの転移性再発を予測できることが明らかとなった。 As shown in FIG. 2, KISS1 gene, TM4SF19 gene, PAPPA gene, and HILPDA gene are found in the non-cancerous liver tissue of HCC patients and the cancerous liver in resection specimens of non-hepatic non-recurrent HCC patients for 2 years or more after resection surgery. By comparing the expression level of KISS1 gene, TM4SF19 gene, PAPPA gene, or HILPDA gene in the hepatic tissue of the cancerous part in the resected specimen of HCC patients with recurrent intrahepatic recurrence within 1 year after surgical removal It was revealed that metastatic recurrence of HCC can be predicted.
［定量ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現解析］
（ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊におけるｍＲＮＡ発現解析）
上述のＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、又はＨＩＬＰＤＡ遺伝子の４種類について、定量ＰＣＲによりＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊のｍＲＮＡ発現を調べて比較した。まず、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊を用いて、miRNeasy（QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを抽出・精製し、さらにPrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa Bio社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、LightCycler 480 Probe Master（Roche Diagnostics社製）、Universal ProbeLibrary（Roche Diagnostics社製）、及びLightCycler480 System II（Roche Diagnostics社製）を用いて定量ＰＣＲを行った。結果を図３に示す。図３において、縦軸の各ｍＲＮＡの発現量（mRNA level）はＧＡＰＤＨ及びＰＧＫ１を参照遺伝子として標準化した後に、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株からの発現量を基準（１．０）とした相対値である。
[MRNA expression analysis by quantitative PCR]
(MRNA expression analysis in floating cell mass derived from SK-HEP-1 cell line and SK-HEP-1 cell line)
Regarding the above four types of KISS1 gene, TM4SF19 gene, PAPPA gene, or HILPDA gene, mRNA expression of floating cell mass derived from SK-HEP-1 cell line and SK-HEP-1 cell line was examined by quantitative PCR and compared. . First, using the SK-HEP-1 cell line and the floating cell mass derived from the SK-HEP-1 cell line, total RNA was extracted and purified using miRNeasy (manufactured by QIAGEN), and then PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa) Bio was used to synthesize cDNA. Using the synthesized cDNA as a template, quantitative PCR was performed using LightCycler 480 Probe Master (Roche Diagnostics), Universal Probe Library (Roche Diagnostics), and LightCycler480 System II (Roche Diagnostics). The results are shown in FIG. In FIG. 3, the expression level (mRNA level) of each mRNA on the vertical axis is a relative value based on the expression level from the SK-HEP-1 cell line as a standard (1.0) after standardization using GAPDH and PGK1 as reference genes. It is.
図３に示すように、いずれの遺伝子もＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株と比べて肝転移能が高いＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊で発現量が高いことが定量ＰＣＲ法においても確認された。 As shown in FIG. 3, any gene is a floating cell mass derived from the SK-HEP-1 cell line having a higher liver metastasis ability than the SK-HEP-1 cell line, and the expression level is high in the quantitative PCR method. confirmed.
（肝組織におけるｍＲＮＡ発現解析１）
摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者（without IHR）及び摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者（with IHR）からの摘除標本において、それぞれ摘除した非がん部肝組織（non-Tumor）及びがん部肝組織（Tumor）（それぞれｎ＝６）から全ＲＮＡを抽出・精製し、上記と同様の方法で定量ＰＣＲを行ってＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、又はＨＩＬＰＤＡ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。結果を図４に示す。図４において、縦軸はＧＡＰＤＨ及びＰＧＫ１を参照遺伝子として標準化した後に、非がん部肝組織１２例の平均値を基準（１．０）とした相対値である。また、カラムの中の太線は中央値であり、fold chargeは平均値を用いて示している。
(MRNA expression analysis in liver tissue 1)
In non-hepatic recurrent HCC patients (without IHR) and recurrent intrahepatic recurrent HCC patients (with IHR) within 1 year after resection surgery Tumor) and tumor liver tissue (Tumor) (n = 6 for each), extracted and purified total RNA, and quantitative PCR was performed in the same manner as described above to express mRNA of KISS1 gene, TM4SF19 gene, or HILPDA gene The amount was measured. The results are shown in FIG. In FIG. 4, the vertical axis represents a relative value based on an average value of 12 cases of non-cancerous liver tissue as a standard (1.0) after standardizing GAPDH and PGK1 as reference genes. Further, the bold line in the column is the median value, and the fold charge is shown using an average value.
図４に示すように、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子は、摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者の摘除標本におけるがん部肝組織と比較して摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者の摘除標本におけるがん部肝組織において発現量が多く、がん部肝組織のＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、又はＨＩＬＰＤＡ遺伝子の発現量を調べることで、ＨＣＣの転移性再発を予測できることが確認された。 As shown in FIG. 4, KISS1 gene, TM4SF19 gene, and HILPDA gene are intrahepatic within 1 year after excision surgery compared with cancer liver tissue in resected specimens of non-hepatic HCC patients for 2 years or more after excision surgery. It is possible to predict metastatic recurrence of HCC by examining the expression level of KISS1 gene, TM4SF19 gene, or HILPDA gene in the liver tissue of the cancerous part in the excised specimen of recurrent HCC patients. confirmed.
（肝組織におけるｍＲＮＡ発現解析２）
高分化型ＨＣＣ（ＨＣＣ（Ｇ１））患者、中分化型ＨＣＣ（ＨＣＣ（Ｇ２））患者、低分化型ＨＣＣ（ＨＣＣ（Ｇ３））患者の摘除標本における非がん部肝組織（non-Tumor）及びがん部肝組織（Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３）から全ＲＮＡを抽出・精製し、上記と同様の方法で定量ＰＣＲを行ってＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。結果を図５に示す。図５において、縦軸はＧＡＰＤＨ及びＰＧＫ１を参照遺伝子として標準化した後に、非がん部肝組織１２例の平均値を基準（１．０）とした相対値である。また、カラムの中の太線は中央値である。
(MRNA expression analysis in liver tissue 2)
Non-tumor liver tissue (non-Tumor) in resected specimens of well-differentiated HCC (HCC (G1)) patients, moderately differentiated HCC (HCC (G2)) patients, and poorly differentiated HCC (HCC (G3)) patients Total RNA was extracted from the liver tissue (G1, G2, G3) of the cancer site and purified, and quantitative PCR was performed in the same manner as described above to measure the expression levels of KISS1 gene and TM4SF19 gene mRNA. The results are shown in FIG. In FIG. 5, the vertical axis represents a relative value based on the average value of 12 non-cancerous liver tissues after the standardization with GAPDH and PGK1 as reference genes. The thick line in the column is the median value.
図５に示すように、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子は、非がん部肝組織と比べて転移性再発の可能性が高い低分化型ＨＣＣ患者のがん部肝組織において発現量が多いことが明らかとなり、ＫＩＳＳ１遺伝子やＴＭ４ＳＦ１９遺伝子の発現量と転移性再発に相関があることが確認された。 As shown in FIG. 5, it is clear that the KISS1 gene and TM4SF19 gene are highly expressed in the cancerous liver tissue of poorly differentiated HCC patients with a high possibility of metastatic recurrence compared with the non-cancerous liver tissue. Thus, it was confirmed that there was a correlation between the expression level of the KISS1 gene and the TM4SF19 gene and metastatic recurrence.
（ｉＴＲＡＱ標識（登録商標）２Ｄ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析によるタンパク質発現解析）
ｉＴＲＡＱ標識２Ｄ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊のタンパク質発現量を調べて比較した。
(Protein expression analysis by iTRAQ label (registered trademark) 2D-LC-MS / MS analysis)
By iTRAQ-labeled 2D-LC-MS / MS analysis, the protein expression levels of floating cell mass derived from SK-HEP-1 cell line and SK-HEP-1 cell line were examined and compared.
まず、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株とＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊からタンパク質画分を調製し、トリプシン消化の後に安定同位体標識ｉＴＲＡＱ試薬（Applied Biosystems社製）で処理して、２Ｄ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を行った。得られたペプチド配列について、ＮＣＢＩのタンパク質データベースとタンパク質同定ソフトウェアProteinPlotを用いてタンパク質を同定した。 First, a protein fraction is prepared from the SK-HEP-1 cell line and the floating cell mass derived from the SK-HEP-1 cell line, treated with a stable isotope-labeled iTRAQ reagent (Applied Biosystems) after trypsin digestion. 2D-LC-MS / MS analysis was performed. About the obtained peptide sequence, protein was identified using the protein database of NCBI, and protein identification software ProteinPlot.
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊における各タンパク質の発現量をＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株における各タンパク質の発現量と比較したところ、５９種類のタンパク質において、発現量の増減が２倍以上であることが確認され、そのうち、ＲＡＢ２７ＢはＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株と比較してＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊において発現量が４．７倍であった。さらに実施例２におけるＤＮＡチップ法によるｍＲＮＡ発現解析により、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株と比較してＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株由来の浮遊細胞塊においてＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡの発現量は２．２倍であったことから、ＲＡＢ２７Ｂ遺伝子をＨＣＣ再発に関わる候補遺伝子とした。 When the expression level of each protein in the floating cell mass derived from the SK-HEP-1 cell line was compared with the expression level of each protein in the SK-HEP-1 cell line, the increase or decrease in the expression level was doubled in 59 types of proteins. Of these, it was confirmed that RAB27B was 4.7 times more expressed in floating cell mass derived from the SK-HEP-1 cell line than the SK-HEP-1 cell line. Furthermore, according to the mRNA expression analysis by the DNA chip method in Example 2, the expression amount of RAB27B gene mRNA in the floating cell mass derived from the SK-HEP-1 cell line was 2.2 times that of the SK-HEP-1 cell line. Therefore, the RAB27B gene was selected as a candidate gene involved in HCC recurrence.
（肝組織におけるＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡ発現解析）
摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者（without IHR）及び摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者（with IHR）からの摘除標本において、それぞれ摘除した非がん部肝組織（non-Tumor）及びがん部肝組織（Tumor）（それぞれｎ＝６）から全ＲＮＡを抽出・精製し、実施例３と同様の方法で定量ＰＣＲを行ってＲＡＢ２７Ｂ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。結果を図６に示す。図６において、縦軸はＧＡＰＤＨ及びＰＧＫ１を参照遺伝子として標準化した後に、非がん部肝組織１２例の平均値を基準（１．０）とした相対値である。また、カラムの中の太線は中央値であり、fold chargeは平均値を用いて示している。
(RNA expression analysis of RAB27B gene in liver tissue)
In non-hepatic recurrent HCC patients (without IHR) and recurrent intrahepatic recurrent HCC patients (with IHR) within 1 year after resection surgery Tumor) and cancerous liver tissue (Tumor) (each n = 6) were extracted and purified, and quantitative PCR was performed in the same manner as in Example 3 to measure the expression level of RAB27B gene mRNA. The results are shown in FIG. In FIG. 6, the vertical axis represents a relative value based on an average value of 12 non-cancerous liver tissues as a standard (1.0) after standardizing GAPDH and PGK1 as reference genes. Further, the bold line in the column is the median value, and the fold charge is shown using an average value.
図６に示すように、ＲＡＢ２７Ｂ遺伝子は、摘除手術後２年以上肝内無再発ＨＣＣ患者の摘除標本における非がん部肝組織と比較して摘除手術後１年以内肝内再発ＨＣＣ患者の摘除標本における非がん部肝組織において発現量が多く、非がん部肝組織のＲＡＢ２７Ｂ遺伝子の発現量を調べることで、ＨＣＣの転移性再発を予測できることが確認された。 As shown in FIG. 6, RAB27B gene was removed from patients with recurrent HCC within 1 year after resection surgery compared to non-cancerous liver tissue in resected specimens of non-hepatic recurrent HCC patients for 2 years or more after resection surgery. It was confirmed that metastatic recurrence of HCC can be predicted by examining the expression level of the RAB27B gene in the non-cancerous liver tissue in the specimen, and the expression level is high in the non-cancerous liver tissue.
以上の結果から、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子や、ＲＡＢ２７Ｂ遺伝子をコードするタンパク質はin vitro解析において転移能が高いＨＣＣ幹細胞において発現量が多く、さらにＨＣＣ再発や進展といった臨床所見を伴うヒト臨床検体においてもそれらの発現量と臨床所見との相関が確認された。したがって、ＫＩＳＳ１遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子、ＰＡＰＰＡ遺伝子、ＨＩＬＰＤＡ遺伝子又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子や、これら遺伝子をコードするタンパク質の発現量を調べることにより、ＨＣＣの転移性再発リスクを予測することができることが明らかとなった。本構成要素により予測されるＨＣＣの再発は、転移生再発の根源的原因と考えられるがん幹細胞の発生を予測するものであり、従来の門脈浸潤や門脈塞栓などよりも早い段階でのがんの悪性化を検出するものである。 From the above results, KISS1 gene, TM4SF19 gene, PAPPA gene, HIPPA gene or RAB27B gene, and the protein encoding RAB27B gene have a high expression level in HCC stem cells with high metastatic ability in in vitro analysis, and further, HCC recurrence and progress In human clinical specimens with clinical findings, the correlation between their expression level and clinical findings was confirmed. Therefore, it was revealed that the risk of metastatic recurrence of HCC can be predicted by examining the expression levels of the KISS1 gene, TM4SF19 gene, PAPPA gene, HIPPDA gene, RAB27B gene, and proteins encoding these genes. The recurrence of HCC predicted by this component predicts the occurrence of cancer stem cells that are considered to be the root cause of metastatic live recurrence, and is earlier than conventional portal vein invasion and portal vein embolism. It detects cancer malignancy.
本発明によると、ＨＣＣ治療における術後のＨＣＣの転移性再発リスクを予測することが可能となり、ＨＣＣ治療の術後の治療方針を決定する場合に利用可能である。 According to the present invention, it becomes possible to predict the risk of metastatic recurrence of HCC after surgery in HCC treatment, and it can be used when determining the postoperative treatment policy of HCC treatment.
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