KR100568724B1 - Detection kit for cholangiocarcinoma by measuring the expression of cholangiocarcinoma-related genes - Google Patents
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Abstract
본 발명은 담관암 유전자 마커 및 이를 이용한 담관암 진단킷트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 간조직내에서 발생하는 담관암에 대한 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현 정도를 측정하여 간암과 차별적으로 발현하는 담관암을 진단하는데 매우 유용하게 사용될 수 있도록 개발된 담관암 진단방법 및 진단킷트에 관한 것이다. The present invention relates to a cholangiocarcinoma gene marker and a cholangiocarcinoma diagnostic kit using the same. More particularly, the cholangiocarcinoma which is differentially expressed from liver cancer by measuring the expression level of high and low expression genes for cholangiocarcinoma occurring in liver tissue is measured. The present invention relates to a method for diagnosing bile duct cancer and a diagnostic kit developed to be very useful for diagnosis.
담관암, 유전자 마커, 고발현, 저발현, 진단킷트Cholangiocarcinoma, Genetic marker, High expression, Low expression, Diagnostic kit
Description
도 1은 유전자 발굴 빈도를 분석한 것이고,1 is a frequency analysis of gene discovery,
도 2는 각종 시료에서 담관암 고발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적(competitive) RT-PCR 방법을 수행하여 나타낸 것이고,Figure 2 shows the degree of expression of bile duct cancer high expression gene in various samples by performing a competitive RT-PCR method,
도 3은 각종 시료에서 담관암 저발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적 RT-PCR 방법을 수행한 것이고,3 is a competitive RT-PCR method for the expression level of cholangiocarcinoma low expression genes in various samples,
도 4는 담관암 임상 시료에서 담관암 고발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적 RT-PCR 방법으로 확인한 것이며,Figure 4 shows the degree of expression of cholangiocarcinoma high expression gene in the bile duct cancer clinical sample by competitive RT-PCR method,
도 5는 담관암 임상 시료에서 담관암 저발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적 RT-PCR 방법으로 확인한 것이고, 5 shows the expression level of the bile duct cancer low expression genes in a bile duct cancer clinical sample by a competitive RT-PCR method.
도 6은 본 발명에서 확인한 담관암 고발현 유전자 중 ANXA1의 발현을 간암환자와 담관암 환자로부터 절제한 임상 조직시료에서 면역조직화학 염색법으로 확인한 결과이며, Figure 6 is a result of confirming the expression of ANXA1 in the bile duct cancer high expression gene confirmed in the present invention by immunohistochemical staining in clinical tissue samples resected from patients with liver cancer and cholangiocarcinoma,
도 7은 본 발명에서 확인한 담관암 고발현 유전자인 HSPCB의 발현을 임상 조 직시료에서 면역조직화학 염색법으로 확인한 결과이다. 7 is a result of confirming the expression of HSPCB, a cholangiocarcinoma gene expressed in the present invention by immunohistochemical staining in clinical tissue samples.
본 발명은 담관암 유전자 마커 및 이를 이용한 담관암 진단킷트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 간조직내에서 발생하는 담관암에 대한 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현 정도를 측정하여 간암과 차별적으로 발현하는 담관암을 진단하는데 매우 유용하게 사용될 수 있도록 개발된 담관암 진단방법 및 진단킷트에 관한 것이다. The present invention relates to a cholangiocarcinoma gene marker and a cholangiocarcinoma diagnostic kit using the same. More particularly, the cholangiocarcinoma which is differentially expressed from liver cancer by measuring the expression level of high and low expression genes for cholangiocarcinoma occurring in liver tissue is measured. The present invention relates to a method for diagnosing bile duct cancer and a diagnostic kit developed to be very useful for diagnosis.
담관암(cholangiocarcinoma)은 담관의 상피세포에서 발생하는 악성종양으로, 어느 부위의 담관에서 발생하느냐에 따라 간내담관암(intrahepatic cholangiocarcinoma)과 간외담관암(extrahepatic cholangiocarcinoma)의 두 종류로 나뉘며 간내담관암의 경우는 간에 생기는 암으로서 간세포암으로 분류되기도 한다. 특히, 담관암은 선조직으로부터 발생하는 선암(adenocarcinoma) 중 0.8% 정도에 해당하는 암으로서, 간조직 기원에서 발생하는 암 중 두 번째로 발병되는 질병이다[Gores, Hepatology 37: 961-969, 2003; Pascher 등, J. Hepatobiliary Pancreat.Surg. 10: 282-287, 2003; Busuttil와 Farmer, Liver Transpl. Surg. 2: SI-S18, 1996]. 현재 미국의 통계에 의하면, 백만명 중 8명이 담관암으로 발병되며, 전체 담관암 비율 중 3분의 1은 간내담관암이고 나머지는 간외담관암으로 보 고되고 있다[Patel, Hepatology 33: 1353-1357, 2001]. 그러나 담관암 환자의 원인 규명은 아직까지 확실히 규명되고 있지않다. 현재까지 밝혀진 주된 원인으로는 PSC(primary sclerosing cholangitis)외에도 간디스토마와 간흡충의 감염, 선천적인 담관낭종 그리고 담도결석등이 보고되고 있다[Khan 등, Gut, 51: VI1-VI9, 2002]. 일본에서는 간내담관암의 경우 HCV 바이러스의 감염이 종종 확인되고 있음을 보고한 바 있다[Okuda 등, J. Gastroenterol. Hepatol. 17: 1049-1055, 2002; Okuda 등, J. Gastroenterol. Hepatol. 17: 1056-1063, 2002]. 실제 담관암에 가장 영향을 주는 요인은 만성염증(chronic inflammation)이, 다른 장기에서와 같이 담관조직에서도 감염이 지속되면 이는 담관암으로 발전할 가능성이 커진다. 담관 조직에서의 만성 염증질환은 우선 담관세포와 염증세포에서 초기 염증관련 사이토카인의 분비를 유도하고, 이에 의해 NO 생성에 관여하는 iNOS(inducible form of nitric oxide synthase)의 발현이 증가되며, 그 결과 NO 증가와 활성으로 담관세포내의 DNA가 손상되며 결과적으로 암세포가 형성된다는 보고가 있다[Jaiswal 등, Cancer Res. 60: 184-190, 2000; Jaiswal 등, Am. J. Physiol. 281: G626-G634, 2001]. 또한, 담관암 생성과 밀접한 초기 염증관련 사이토카인으로는 인터루킨 6가 잘 알려져 있으며, 이는 iNOS 발현을 증가시켜 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 신호 체계를 통하여 담관세포의 증식에 관여한다고 보고되고 있다[Goydos 등, Ann. Surg. 227: 398-404, 1998; Park 등, Hepatology 30: 1128-1133, 1999]. 실제 담관암 발생시 담즙관 내부를 따라 담관암세포가 증식하는 경우가 있는데 이는 담즙관내로 유입되는 독성물질에 대한 방 어기작으로 담즙산을 이용하여 세포의 증식과 방어를 도모하는 것이다. 최근의 보도에 의하면, 담즙산은 담관세포의 EGFR(epidermal growth factor receptor)를 활성화시키고 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현을 증가시키며, COX-2 효소의 증가는 프로스타노이드(prostanoids)를 생성시켜 세포사멸(apoptosis)을 저해하고 혈관생성을 가속화시켜 결국 악성종양의 증식을 유도한다고 한다[Yoon 등, Cancer Res. 62: 6500-6505, 2002; Yoon 등, Gastroenterology 122: 985-993, 2002; Gupta 와 Dubois, NAt. Rev. Cancer 1: 11-21, 2001]. 만성 염증반응에 따른 담관암 발생 외에도 선천적 또는 후천적인 유전자내의 결함이나 변이에 의해 담관암이 발생되기도 한다. 담관암의 경우, 세포의 증식과 밀접한 관련이 있는 발암 유전자인 c-erB-2와 c-met 단백질의 과발현이 암화 기작과 관련있다고 보고되고 있으며, 인간 아스파르틸 베타-하이드록실라아제(aspartyl β-hydroxylase)의 과발현은 암 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다[Sirica 등, Semin. liver Dis. 22: 303-313, 2002; Endo 등, Hepatology 36: 439-450, 2002; Lavaissiere 등, J. Clin. Invest. 98: 1313-1323, 1996]. 또한 발암 억제 인자로 잘 알려져 있는 p14와 p16 그리고 p53 단백질의 유전적인 결함도 담관암에서 확인되고[Cong 등, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127: 187-192, 2001; Caca 등, Int. J, Cancer 97: 481-488, 2002; Taniai 등, Gastroenterology 123: 1090-1098, 2002; Tannapfel 등, J. Pathol. 197: 624-631, 2002], 세포부착 관련 물질인 E-캐더린(cadherin)의 유전적 결함이나 변이는 세포의 침윤과 전이에 결정적인 요인으로 보고되고 있으며, 담관암의 경우에도 E-캐더린의 유전적 결함이나 발현의 감소가 확인된 바 있다[Endo 등 , J. Pathol. 193: 310-317, 2001]. 이외에도 세포증식을 지속적으로 유지하는데 결정적인 기여를 하는 TERT(telomerase reverse transcriptase)의 과발현 또한 담관암에서 종종 확인되고 있으며 실제 담관암의 진단시 TERT의 활성과 함께 TERT의 mRNA를 검출하는 방법이 사용되기도 한다[Mathon 과 Lloyd, Nat. Rev. Cancer 1: 203-213, 2001; Itoi 등, Gastrointest. Endosc. 52: 380-386, 2000; Itoi 등, Int. J. Mol. Med. 7: 281-287, 2001]. 이와 같이 담관암의 발생과 진행은 몇몇 특정 유전자들의 역할들로 인해 이루어지는 것이 아니라 암의 악성화가 진행되면서 발생하는 세포내 다양한 신호전달과 조절기작에 관여하는 많은 유전자들의 복합적인 상호작용에 의한 것임을 알 수 있다. 또한, 간내담관암의 경우는 간암의 일종으로 구분되어 왔고 최근들어 진단 장비의 향상과 더불어 정확한 담관암 진단에 많은 도움을 주고 있으나 아직까지 특정한 담관암 진단 마커나 간암과 차별화 할 수 있는 진단 마커는 미비한 실정이다. 따라서, 몇몇 특정한 유전자들에 중점을 두고 담관암의 형성 기작을 연구하는 것 보다 간암 세포주와 담관암 세포주들 사이의 다량의 유전자 발현 정도를 비교 분석하여 담관암에 관련된 새로운 유전자들을 발굴하는 연구는 매우 중요한 의미가 있는 것이다. 이와 같이 암의 형성은 다양한 유전자들과 이들 유전자들의 발현 및 조절기작이 복합적으로 연관되어 진행되므로 최근 들어 다량의 유전자를 사용한 cDNA 마이크로어레이 방법으로 담관암 관련 유전자들의 발현율을 간암 조직과 비교하여 담관암의 새로운 진단이나 치료의 마커를 발굴하기 위한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다[Xiao 등, Am. J. Pathol. 159: 1415-1421, 2001]. 또한, 간내담관암을 간암 조직과 구별하기 위해, 혈청이나 면역조직염색방법으로 기존의 암의 진단 마커로 사용되고 있는 여러 혈청 암마커(serum tumor marker) 인자들을 간암조직과 담관암조직에서 비교 분석하여 CK19를 담관암 진단 마커로서의 가능성을 제시하고[Lau 등, Human Pathology 33: 1175-1181, 2002; Tickoo 등, Am. J. Surg. Pathol. 26: 989-997, 2002], CK19 이외에도 CA 19-9, CEA(carcinoembryonic antigen)와 CA-125 등이 담관암 환자들의 진단 마커로서 이용되고 있으나, 담관암 진단 마커로서의 특이성은 미비하다[Ramage 등, Gastroenterology 108: 865-869, 1995; Patel 등, Am. J. Gastroenterol. 95: 204-207, 2000; Hultcrantz 등, J. Hepatol. 30: 669-673, 1999]. 따라서 다량의 유전자들을 이용하여 간암과 구별할 수 있는 담관암 진단마커 또는 치료 타겟을 확보하는 일은 매우 의미있는 일이다. Cholangiocarcinoma is a malignant tumor of the epithelial cells of the bile ducts.It is divided into two types, intrahepatic cholangiocarcinoma and extrahepatic cholangiocarcinoma, depending on where the bile duct develops. It is also classified as a hepatocellular carcinoma. In particular, cholangiocarcinoma corresponds to about 0.8% of adenocarcinoma originating from adenocarcinoma, which is the second most common cancer of liver tissue origin [Gores, Hepatology 37: 961-969, 2003; Pascher et al., J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 10: 282-287, 2003; Busuttil and Farmer, Liver Transpl. Surg. 2: SI-S18, 1996]. Current US statistics show that eight out of every million people develop bile duct cancer, with one-third of the total bile duct cancer reported as hepatobiliary duct cancer and the remainder as extrahepatic bile duct cancer [Patel, Hepatology 33: 1353-1357, 2001]. However, the cause of bile duct cancer patients has not been elucidated yet. In addition to primary sclerosing cholangitis (PSC), the main causes to date have been reported to be infected with liver dystomies and hepatitis, congenital cholangiocytosis and biliary tract stones [Khan et al., Gut, 51: VI1-VI9, 2002]. In Japan, it has been reported that HCV virus infection is often confirmed in hepatobiliary duct cancer [Okuda et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 17: 1049-1055, 2002; Okuda et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 17: 1056-1063, 2002. In fact, the most influential factor in cholangiocarcinoma is chronic inflammation, which is likely to develop into cholangiocarcinoma if infection continues in the bile duct tissue as in other organs. Chronic inflammatory diseases in bile duct tissues first induce the secretion of early inflammatory cytokines from bile duct cells and inflammatory cells, thereby increasing the expression of iNOS (inducible form of nitric oxide synthase) involved in NO production. Increasing NO and activity leads to damage of DNA in bile duct cells, resulting in cancer cells [Jaiswal et al., Cancer Res. 60: 184-190, 2000; Jaiswal et al., Am. J. Physiol. 281: G626-G634, 2001]. In addition,
본 발명에서는 Park등이 간암으로부터 만든 SNU-354, SNU-368, SNU-387, SNU-475와 HLK1, HLK3, J-SHC 등의 간암 세포주와 Kim 등이 한국인 담관암으로부터 만든 Cho-CK, SCK, Choi-CK와 CK-K1 등의 담관암 세포주를 이용하여 간암과 담관암 세포에서 발현되는 유전자의 발현 빈도를 비교, 분석하고자 하였다[Park 등, Int. J. Cancer 62:276-282, 1995; Kim 등, Genes Chromosomes Cancer 30: 48-56, 2001]. 현재까지 간암 세포주와 담관암 세포주를 이용하여 세포주들간의 유전자 발현 빈도를 분석한 연구는 거의 이루어지지 않았으며 특히 한국인 간암환자와 담관암 환자의 세포로부터 얻은 세포주들이므로 더 의미가 있다고 판단된다. 여러 종류의 간암세포주들과 담관암 세포주들에서 최대한 유사한 발현 변화를 보이는 유전자들을 선정하여 담관암 마커로서의 가능성을 확인하였다. In the present invention, Park et al., SNU-354, SNU-368, SNU-387, SNU-475 and HLK1, HLK3, J-SHC, etc. made from liver cancer cell lines such as Kim and Cho-CK, SCK, The frequency of expression of genes expressed in liver cancer and cholangiocarcinoma cells was compared and analyzed using cholangiocarcinoma cell lines such as Choi-CK and CK-K1 [Park et al., Int. J. Cancer 62: 276-282, 1995; Kim et al., Genes Chromosomes Cancer 30: 48-56, 2001]. To date, very little research has been conducted to analyze the gene expression frequency between liver cancer cell line and cholangiocarcinoma cell line, especially since they are obtained from cells of Korean liver cancer patients and cholangiocarcinoma patients. Genes showing similar expression changes in various hepatocellular carcinoma cells and cholangiocarcinoma cell lines were selected to confirm their potential as markers for cholangiocarcinoma.
인간 게놈 프로젝트의 한 연구 분야로 수행되어 온 "EST(expressed sequence tag) 수집"은 특정 조직이나 세포주에서 cDNA 라이브러리를 제조하고 여기에서 임의적으로 선별한 cDNA 클론들의 염기서열을 분석함으로써 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자를 수집하는 프로젝트이다. 이러한 EST 수집 방법을 통하여 새로운 유전자의 발굴[Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991;Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Hillier 등, Genome Res. 6: 807-828, 1996; Marra 등, Nat. Genet. 21:191-194,1999], 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석[Okubo 등, Nat. Genet. 2: 173-179, 1992; Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991; Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Liew 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10645-10649, 1994; Mao 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8175-8180, 1998; Ryo 등, Nucleic Acids Res. 26: 2586-2592, 1998; Sterky 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335, 1998]이 가능하다고 보고되고 있다. 따라서, 특정 세포내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 담관암 관련 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 담관암의 진행에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이고 나아가 담관암의 진단이 가능하게 될 것이다. The collection of expressed sequence tags (ESTs), a field of research in the Human Genome Project, produces cDNA libraries from specific tissues or cell lines and analyzes the sequencing of randomly selected cDNA clones in specific tissues or cell lines. A project to collect genes that are expressed. Discovery of new genes through this EST collection method [Adams et al., Science 252: 1651-1656, 1991; Adams et al., Nature 377: (Suppl.) 3-174, 1995; Hillier et al., Genome Res. 6: 807-828, 1996; Marra et al., Nat. Genet. 21: 191-194,1999], analysis of expression patterns of genes expressed in specific tissues or cell lines, quantitative analysis [Okubo et al., Nat. Genet. 2: 173-179, 1992; Adams et al., Science 252: 1651-1656, 1991; Adams et al., Nature 377: (Suppl.) 3-174, 1995; Liew et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10645-10649, 1994; Mao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8175-8180, 1998; Ryo et al., Nucleic Acids Res. 26: 2586-2592, 1998; Sterky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335, 1998]. Therefore, by analyzing the frequency of expression of specific genes in specific cells, it is possible to discover genes related to bile duct cancer, thereby understanding the molecular mechanisms of the progression of bile duct cancer, and furthermore, the diagnosis of bile duct cancer will be possible.
본 발명에서는 12종의 담관암 고발현 유전자와 8종의 담관암 저발현 유전자가 발굴되었으며, 이들은 담관암과의 관련성은 아직까지 보고되지 않았으며, 현재 이들 유전자에 대해 알려진 내용은 다음과 같다. RPL3(ribosomal protein L3)는 유전자들의 해독(translation)에 관여하는 라이보좀(ribosome)의 구조단백질로 서 정확한 기능이 많이 알려져 있지 않으며 특정 암과의 관련성도 보고된 바 없다. HSPCA(heat shock 90kDa protein 1, alpha)와 HSPCB(heat shock 90 kDa protein 1, beta)는 열 충격 관련 단백질로서 여러 암세포에서 이들 단백질들의 발현이 증가된다는 보고는 많이 되어 있으나 담관암과의 관련성은 보고되고 있지 않다. PKM2(pyruvate kinase, muscle)는 당분해 경로의 효소로서 알려져 있으며 HIF-1(hypoxia-inducible factor 1)에 의해 발현이 증가하는 단백질로 잘 알려져 있으며 간암, 대장암 그리고 위암 등 여러 암조직에서 그 발현이 증가되는 것으로 보고되어 있다[Kress 등, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 124: 315-320, 1998]. AKR1C2(aldo-keto reductase family 1, member 2)는 간조직에 존재하는 스테로이드 호르몬과 안드로겐(androgen), 에스트로겐(estrogen) 그리고 프로게스틴 (progestin) 같은 성 호르몬을 불활성화시키는 효소로서 폐암, 유방암 및 전립선암에서 그 발현이 증가됨이 보고되어 있다[Palackal 등, J. Biol.Chem. 277: 24799-24808, 2002; Rizner 등, Chem. Biol. Interact. 143-144: 401-409, 2003; Wiebe 와 Lewis, BMC Cancer 3: 9, 2003]. HLA-A(major histocompatibility complex, class 1, A)는 암에 대한 면역반응을 조절하는 중심적인 역할을 수행하는 단백질로서 대개 여러 암 세포에서 그 발현이 감소하거나 유전자의 소실(loss)이 확인된 바 있으나 담관암과의 직접적인 관련은 보고된 바 없다[Redondo 등, Hum. Pathol. 34: 1283-1289, 2003]. TM4SF1(transmembrane 4 superfamily member 1)에 관한 연구는 거의 알려진 바가 없으며 IFI27(interferon, alpha-inducible protein 27)과 IFITM1(interferon induced transmembrane protein 1)은 인터페론-알파에 의해 발현이 증가되는 단백질로서 IFI27은 뼈 형성(bone formation)에 관련이 있음이 보고되어 있으나[Grewal 등, FASEB J. 14: 523-531, 2000] 담관암과의 관련성은 보고된바 없다. MIG-6(Mitogen-inducible gene-6)은 분열이 정지된 섬유아세포의 분열을 촉진하는 기능을 지닌 유전자로 클로닝이 되었으며[Wick 등, Exp. Cell. Res. 219: 527-535, 1995] 최근 들어 MIG-6 유전자가 여러 인간 암세포에서 과발현되어 있음이 확인되었는데 이는 NF-κB를 활성화시켜 결국 세포분열을 유도한다고 보고되고 있다[Tsunoda 등, Cancer Res. 62: 5668-5671, 2002]. 또한, MIG-6는 HIF-1에 의해 발현이 증가되는 새로운 유전자로 확인되기도 하였다[Saarikoski 등, FEBS Lett. 530: 186-190, 2002]. FER1L3(fer-1-like 3, myoferlin)은 근육발달부진의 증상과 밀접한 관련이 있는 핵막 단백질로서 그 기능은 아직까지 알려져 있지 않다[Davis 등, Human Molecular Genetics 9: 217-226, 2000]. In the present invention, 12 types of bile duct cancer high expression genes and 8 types of bile duct cancer low expression genes were discovered, and their association with bile duct cancer has not been reported so far, and the contents of these genes are known as follows. Ribosomal protein L3 (RPL3) is a structural protein of ribosomes involved in the translation of genes, the exact function of which is not known much, and has not been reported to be associated with a specific cancer. HSPCA (heat shock 90
이외에도 본 발명에서는 간암에 비교하여 담관암에서 발현이 감소하는 유전자들을 선별하여 담관암의 진단 마커로 사용하고자 한다. 저발현 유전자로는 라이보좀의 구조단백질 중 하나인 RPS8(ribosomal protein S8)이 있으며 정확한 기능에 관한 연구는 거의 이루어져 있지 않다. FTH1(ferritin, heavy polypeptide 1)은 철분을 저장하는 세포내 분자물질이며 최근에 전립선암세포에서 발현이 증가된다는 보고가 있다[Grzmil 등, Int. J. Oncol. 24: 97-105, 2004]. CFL1(cofilin 1)은 세포내 액틴 결합 단백질로서 액틴 어셈블리(actin assembly)를 조절하는 역할을 수행한다고 보고되고 있으나 다른 기능에 대한 연구는 거의 이루 어져 있지 않다[Gillett 등, Ann. Hum. Genet. 60: 201-211, 1996]. TALDO1(transaldorase 1)은 반응성 산소 중간매개체(reactive oxygen intermediates)로부터 세포를 방어하기 위한 환원성 물질의 생성에 관여하는 효소로서 간경변 환자에서 이 단백질의 결핍이 확인되기도 하였다[Banki 등, Genomics 45: 233-238, 1997; Verhoeven 등, Am. J. Hum. Genet. 68: 1086-1092, 2001]. KRT8(Keratin 8)은 세포 이동이나 세포 침윤에 관련이 있는 결합단백질로서 폐암에서는 발현이 증가되는 유전자로[Wikman 등, Oncogene 21: 5804-5813, 2002], 유방암에서는 발현이 감소되는 유전자로 보고되고 있다[Fuchs 등, Anticancer Res. 22: 3415-3419, 2002]. PSMB6(proteasome subunit, beta type, 6)은 활성화된 20S 프로테아좀(proteasome)의 생성을 위하여 프로테아좀 전구체를 구성하는 단백질로서 정확한 기능에 관한 연구는 미비하다[Nandi 등, EMBO J. 16: 5363-5375, 1997]. NQO1(NADPH dehydrogenase, quinone 1) 세포내 플라보단백질(flavoprotein)로서 간암조직에서 과발현되고 있다는 보고가 있다[Strassburg 등, Mol. Pharmacol. 61: 320-325, 2002]. S100A4는 칼슘결합단백질로서 세포의 전이와 침윤에 직접적인 연관이 있는 단백질이며 담관암의 경우 전이성 암에서 그 발현이 증가되고 있다는 보고가 있다[Katayama 등, Int. J. Mol. Med. 6: 539-542, 2000]. In addition, the present invention intends to select genes whose expression is reduced in bile duct cancer compared to liver cancer and use them as diagnostic markers of bile duct cancer. The low expression gene is one of ribosomal structural proteins, RPS8 (ribosomal protein S8), and little research has been done on its exact function. FTH1 (ferritin, heavy polypeptide 1) is an intracellular molecular substance that stores iron and has recently been reported to increase expression in prostate cancer cells [Grzmil et al., Int. J. Oncol. 24: 97-105, 2004. CFL1 (cofilin 1) is an intracellular actin binding protein that has been reported to play a role in regulating actin assembly, but little research has been done on other functions [Gillett et al., Ann. Hum. Genet. 60: 201-211, 1996. TALDO1 (transaldorase 1) is an enzyme involved in the production of reducible substances to protect cells from reactive oxygen intermediates and has also been identified as deficiency of this protein in cirrhosis patients [Banki et al., Genomics 45: 233- 238, 1997; Verhoeven et al., Am. J. Hum. Genet. 68: 1086-1092, 2001. KRT8 (Keratin 8) is a binding protein that is involved in cell migration or cell invasion and is a gene with increased expression in lung cancer [Wikman et al., Oncogene 21: 5804-5813, 2002], and a gene with decreased expression in breast cancer. Fuchs et al., Anticancer Res. 22: 3415-3419, 2002. PSMB6 (proteasome subunit, beta type, 6) is a protein constituting proteasome precursor for the production of activated 20S proteasome, and there is little research on its exact function [Nandi et al., EMBO J. 16: 5363-5375, 1997]. NQO1 (NADPH dehydrogenase, quinone 1) is an intracellular flavoprotein that is overexpressed in liver cancer tissues [Strassburg et al., Mol. Pharmacol. 61: 320-325, 2002. S100A4 is a calcium-binding protein that is directly related to the metastasis and invasion of cells. In the case of bile duct cancer, its expression is increased in metastatic cancer [Katayama et al., Int. J. Mol. Med. 6: 539-542, 2000.
이에, 본 발명자들은 담관암 세포주와 간암 세포주의 cDNA 라이브러리의 유전자 염기서열을 분석하고, 이들 유전자의 발굴 빈도를 바탕으로 하여 담관암 고발 현 또는 저발현 유전자를 찾아내고 경쟁적 RT-PCR 방법 및 면역조직화학 염색법을 이용하여 담관암 세포주와 담관암 임상 조직시료에서 담관암 고발현 유전자와 저발현 유전자를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors analyzed the gene sequences of the cDNA library of the bile duct cancer cell line and liver cancer cell line, and based on the frequency of discovery of these genes to find the high or low expression of bile duct cancer and competitive RT-PCR method and immunohistochemical staining method. By using the bile duct cancer cell line and cholangiocarcinoma clinical tissue samples to identify the bile duct cancer high expression gene and low expression gene was completed the present invention.
따라서, 본 발명은 담관암 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 담관암 진단방법을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for diagnosing cholangiocarcinoma using measurement of expression levels of genes specifically expressed in cholangiocarcinoma tissue.
또한, 본 발명은 담관암 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 담관암 진단킷트를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
In addition, another object of the present invention is to provide a bile duct cancer diagnostic kit using the expression level measurement of genes specifically expressed in bile duct cancer tissue.
본 발명은 담관암 특이적 유전자인 RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3, RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1 및 S100A4 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 담관암을 진단하는 담관암 진단방법 및 진단킷트를 그 특징으로 한다.The present invention relates to bile duct cancer specific genes RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3, RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1 and Characterized by a bile duct cancer diagnosis method and diagnostic kit for diagnosing bile duct cancer by measuring the expression level of at least one gene selected from S100A4.
이와 같은 본 발명을 보다 상세히 설명한다.This invention will be described in more detail.
본 발명은 담관암 특이적 고발현 유전자인 RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6 및 FER1L3으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자와, 담관암 특이적 저발현 유전자인 RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1 및 S100A4로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 담관암을 진단하는 담관암 진단킷트에 관한 것이다.One or more genes selected from the group consisting of bile duct cancer specific high expression genes RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6 and FER1L3, and bile duct cancer It relates to a bile duct cancer diagnostic kit for diagnosing bile duct cancer by measuring the expression level of one or more genes selected from the group consisting of specific low expression genes RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1, and S100A4.
본 발명의 담관암 마커 유전자는 담관암 조직에서 고발현되거나 저발현되는 유전자의 전장 및 그의 단편을 포함한다.Cholangiocarcinoma marker genes of the present invention include full-length and fragments of genes that are highly or low-expressed in cholangiocarcinoma tissue.
또한, 본 발명의 진단킷트는 담관암 특이적 고발현 유전자인 RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6 및 FER1L3으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머와 담관암 특이적 저발현 유전자인 RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1 및 S100A4로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함한다. In addition, the diagnostic kit of the present invention is one selected from the group consisting of RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, and FER1L3, which are bile duct cancer specific high expression genes. Forward and reverse primers of the above genes and at least one gene selected from the group consisting of bile duct cancer specific low expression genes RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1 and S100A4 .
또한, 본 발명의 진단킷트는 담관암 특이적 고발현 유전자인 RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6 및 FER1L3으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브와 담관암 특이적 저발현 유전자인 RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1 및 S100A4로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브를 포함한다. In addition, the diagnostic kit of the present invention is one selected from the group consisting of RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, and FER1L3, which are bile duct cancer specific high expression genes. And a probe complementary to at least one gene selected from the group consisting of RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1 and S100A4, which are complementary to the above genes and bile duct cancer specific low expression genes.
또한, 본 발명의 진단킷트는 담관암 특이적 고발현 유전자인 RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6 및 FER1L3으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체와 담관암 특이적 저발현 유전자인 RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1 및 S100A4으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체를 포함한다. In addition, the diagnostic kit of the present invention is one selected from the group consisting of RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, and FER1L3, which are bile duct cancer specific high expression genes. A protein encoded by one or more genes selected from the group consisting of an antibody recognizing a protein encoded by the above gene and RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1 and S100A4 Include antibodies that recognize.
또한, 상기 항체, 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있고, β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄가지변화를 측정하기 위하여 L4-PHA를 포함한다.In addition, the antibody, the substrate, a suitable buffer, a secondary antibody labeled with a chromophore or a fluorescent substance, a chromogenic substrate, etc. may be included, and L4-PHA to measure β1,6-N-acetylglucosamine sugar chain change. It includes.
상기에서 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 또는 OPD(o-Phenylenediamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)가 사용될 수 있다.The substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96 well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96 well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like. The enzyme may be used peroxidase, alkaline phosphatase (Alkaline Phosphatase), the fluorescent material may be used FITC, RITC, etc., the color substrate is ABTS (2, 2'-Azino-bis (3) -ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), or OPD (o-Phenylenediamine) or TMB (Tetramethyl Benzidine) can be used.
본 발명에서 확인된 담관암 마커 유전자의 서열정보는 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.Sequence information of the cholangiocarcinoma marker gene identified in the present invention is shown in Table 1 below.
본 발명에서는 7종의 간암 세포주(SNU475, SNU368, HLK1, SNU354,J-SHC, SNU387, HLK3)와 4종의 담관암 세포주(Cho-CK, SCK, Choi-CK, CK-K1)을 사용하여 총 13종의 cDNA 라이브러리를 제조하고, 이로부터 약 14,734개의 EST 염기 배열을 결정하고 담관암 세포주 시료와 간암 세포주 시료에서 각 유전자의 발굴 빈도를 분석하여, 담관암 세포주 시료에서 발굴 빈도가 높은 12종의 담관암 고발현 유전자(RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3)와 발굴 빈도가 낮은 8종의 담관암 저발현 유전자(RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1, S100A4)를 각각 선별하여 담관암 마커 유전자를 찾아내었다. In the present invention, seven types of liver cancer cell lines (SNU475, SNU368, HLK1, SNU354, J-SHC, SNU387, HLK3) and four types of cholangiocarcinoma cell lines (Cho-CK, SCK, Choi-CK, CK-K1) were used. Thirteen cDNA libraries were prepared, from which approximately 14,734 EST sequences were determined, and the frequency of excavation of each gene was analyzed in bile duct cancer cell line samples and liver cancer cell line samples. Expression genes (RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3) and 8 types of low bile duct cancer low expression genes (RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1, and S100A4) were selected to find bile duct cancer marker genes.
유전자 발굴빈도 분석에 사용된 담관암 및 간암 세포주 시료에서 본 발명의 12종의 담관암 고발현 유전자와 8종의 담관암 저발현 유전자의 발현량을 정량적 RT-PCR 방법에 의해 비교한 결과, 담관암 고발현 유전자는 담관암 세포주 시료에 서 고발현됨이 관찰되었고, 담관암 저발현 유전자는 간암 세포주 시료에서는 고발현되나 담관암 세포주 시료에서는 저발현됨이 관찰됨으로써 본 발명의 담관암 마커 유전자들과 담관암과의 관련성이 확인되었다. The bile duct cancer high expression genes were compared by the quantitative RT-PCR method in the expression levels of 12 bile duct cancer high expression genes and 8 bile duct cancer low expression genes of the present invention in the bile duct cancer and liver cancer cell line samples used for gene discovery frequency analysis. Was found to be highly expressed in bile duct cancer cell line samples, and the expression of bile duct cancer low expression genes was high in hepatocellular carcinoma cell samples, but low in bile duct cancer cell line samples. .
또한, 5명의 환자에서 채취한 5쌍(간경변 조직 및 담관암 조직)의 임상시료를 사용하여 12종의 담관암 고발현 유전자와 8종의 담관암 저발현 유전자들의 발현량을 비교한 결과, 5종의 담관암 고발현 유전자는 간경변 조직 임상시료에 비해 담관암 임상시료에서 고발현되는 경우가 많았고, 4종의 담관암 저발현 유전자는 담관암 임상시료에서 저발현되는 경향을 나타내었으나 개체간의 차별이 커서 앞으로도 많은 담관암 임상시료를 확보하여 임상적으로 담관암으로 진단된 조직에서 본 발명의 담관암 마커 유전자들의 유용성을 검증하는 과정이 요구된다. In addition, 5 pairs of bile duct cancer high expression genes and 8 types of bile duct cancer low expression genes were compared using 5 pairs (cirrhosis and cholangiocarcinoma tissue) clinical samples taken from 5 patients. Highly expressed genes were more frequently expressed in cholangiocarcinoma clinical samples than liver cirrhosis tissue samples, and four types of cholangiocarcinoma low expression genes tended to be low in the cholangiocarcinoma clinical samples. The process of verifying the usefulness of the cholangiocarcinoma marker genes of the present invention in tissues diagnosed with cholangiocarcinoma is required.
본 발명에서 제시한 담관암 진단마커 유전자의 임상적인 유용성을 검증하는 한 방법으로 간암환자와 담관암 환자의 조직시료에서 면역조직화학 염색법을 이용하여 진단마커 유전자 중 이미 항체가 확보되어 있는 ANXA1과 HSPCAB 항체로 발현을 확인한 결과, 두 종류 모두 정상 간조직, 간경화, 간암조직 및 정상 담즙관에서는 발현이 되지 않거나 매우 적게 발현되고 있음이 확인되었고, 반면에 간내 담관암이나 간외담관암에서는 발현이 현저히 증가됨이 확인되었다. As a method of verifying the clinical usefulness of the cholangiocarcinoma diagnostic marker gene of the present invention, an immunohistochemical staining method for liver cancer patients and cholangiocarcinoma patients using an immunohistochemical staining method is used for the ANXA1 and HSPCAB antibodies. As a result of the expression, it was confirmed that both types were not or very rarely expressed in normal liver tissue, liver cirrhosis, liver cancer tissue and normal bile duct, whereas expression was significantly increased in intrahepatic bile duct cancer or extrahepatic bile duct cancer.
따라서, 담관암 특이적 유전자인 RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3, RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1 및 S100A4 중에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현 정도를 측정함으로써 담관암을 진단할 수 있다. Thus, the bile duct cancer specific genes RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3, RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1 and S100 Cholangiocarcinoma can be diagnosed by measuring the expression level of one or more genes selected from among them.
또한, 본 발명에 따른 담관암 특이적 유전자들의 발현 정도를 측정하여 담관암을 진단하는 방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다: 즉,In addition, the method of diagnosing cholangiocarcinoma by measuring the expression level of cholangiocarcinoma specific genes according to the present invention will be described in detail as follows:
(a) 시험 담관암 조직에서 RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 담관암 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계;(a) Expression level or protein of one or more bile duct cancer high expression genes selected from the group consisting of RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3 in test bile duct cancer tissue Measuring the amount of;
(b) 비교 간암 조직에서 RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 담관암 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계;(b) Expression amount or protein of at least one cholangiocarcinoma high expression gene selected from the group consisting of RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3 in comparative liver cancer tissues Measuring the amount of;
(c) 시험 담관암 조직에서 RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1, S100A4로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 담관암 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계;(c) measuring the expression level or protein amount of at least one cholangiocarcinoma low expression gene selected from the group consisting of RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1, S100A4 in the test cholangiocarcinoma tissue;
(d) 비교 간암 조직에서 RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1, S100A4로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 담관암 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및(d) measuring the expression amount or protein amount of at least one cholangiocarcinoma low expression gene selected from the group consisting of RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1, S100A4 in comparative liver cancer tissue; And
(e) 상기 (a)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (b)에서 얻어진 측정값과 비교하고, 상기 (c)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (d)에서 얻어진 측정값과 비교하여 담관암 여부를 판정하는 단계를 포함한다. (e) comparing the measured value obtained by (a) with the measured value obtained by (b), and comparing the measured value obtained by (c) with the measured value obtained by (d) to determine whether bile duct cancer It includes a step.
본 발명의 20종의 마커 유전자의 발현양은 마커 유전자 또는 그 단편에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용한 공지의 방법을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 경쟁적 RT-PCR 방법으로 측정 할 수 있다. 이러한 프라이머는 20종 마커 유전자의 DNA 영역 중에서 단백질을 코딩하는 DNA 영역의 일부 또는 전부의 배열이 함유되고 적어도 15 bp 길이의 DNA이어야 한다. 예를 들어, 서열번호 7 내지 46에 기재된 프라이머들이 사용될 수 있다. 본 발명에서 상보적이란 적어도 15개의 연속 염기배열에서 완전히 상보적인 배열인 경우로 제한하지 않고 염기 서열상에서 70%, 바람직하게는 80% 이상의 상동성이 있으면 된다. The expression amount of 20 marker genes of the present invention can be measured by a known method using forward primers and reverse primers having base sequences complementary to marker genes or fragments thereof. For example, it can be measured by a competitive RT-PCR method. Such primers contain an array of some or all of the DNA region encoding the protein among the DNA regions of the 20 marker genes and must be at least 15 bp in length. For example, the primers set forth in SEQ ID NOs: 7-46 can be used. Complementary in the present invention is not limited to the case where the arrangement is completely complementary in at least 15 consecutive nucleotide sequences, it is only necessary to have a homology of 70%, preferably 80% or more on the base sequence.
또한, 본 발명의 20종의 마커 유전자의 발현량은 마커 유전자 또는 그 단편을 프로브로 사용한 공지의 혼성화(하이브리다이제이션) 반응을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 노던 하이브리다이제이션("Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52), 인시츄 하이브리다이제이션[Jacquemier 등, Bull Cancer 90: 31-8, 2003] 또는 마이크로어레이[Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003] 등의 방법으로 측정할 수 있다. 프로브는 20종 유전자의 염기 서열을 함유한 통상 200 ∼ 1000 bp이며, 바람직하게는 400 ∼ 800 bp의 길이를 가진다. 염기 서열은 20종 유전자의 염기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지면 된다. 본 발명의 마커 유전자의 프로브는 상기에서 제조된 20종의 마커 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용한 유전자 증폭법(PCR) 등의 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.In addition, the expression amount of 20 marker genes of the present invention can be measured through a known hybridization (hybridization) reaction using a marker gene or a fragment thereof as a probe. For example, Northern hybridization ("Molecular Cloning-A Laboratory Manual" Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52), in situ hybridization (Jacquemier et al., Bull Cancer 90: 31-8, 2003] or microarrays (Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003). The probe is usually 200 to 1000 bp containing the nucleotide sequences of 20 genes, and preferably has a length of 400 to 800 bp. The base sequence may have 70% or more similarity with that of 20 genes. The probe of the marker gene of the present invention can be prepared by conventional methods such as gene amplification (PCR) using forward primers and reverse primers of the 20 kinds of marker genes prepared above.
또한, 상기 20종의 담관암 마커 유전자의 발현량은 각 유전자에 의하여 코드되는 단백질의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. 상기 방법에서 단백질은 담 관암마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 통상적인 ELISA 및 면역침강법 등에 의해 정량화될 수 있다.In addition, the expression amount of the 20 types of bile duct cancer marker genes can be measured by measuring the amount of the protein encoded by each gene. In the above method, the protein may be quantified by conventional ELISA, immunoprecipitation method, etc., using an antibody that specifically binds bile duct cancer marker protein.
본 발명의 12종의 담관암 고발현 유전자와 8종의 담관암 저발현 유전자에 대한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 20종의 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩타이드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩타이드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클론날 항체[Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.12-11.13], 모노클론날 항체[Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.4-11.11] 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체(Methods in Enzymology 203, 99-121, 1991) 등의 특수항체도 포함된다. Antibodies to the 12 cholangiocarcinoma genes and 8 cholangiocarcinoma genes of low expression of the present invention can be obtained by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method to obtain a protein encoded by the marker gene. It can be prepared by the phosphorus method. This includes partial peptides that can be made from 20 proteins, and the partial peptides of the present invention include at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, more preferably 12 or more amino acids. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited and may be polyclonal antibody [Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.12-11.13], monoclonal antibodies [Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.4-11.11] or some of which are antigen-binding, are included in the antibodies of the invention and all immunoglobulin antibodies are included. Furthermore, the antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies (Methods in Enzymology 203, 99-121, 1991).
본 발명의 20종의 담관암 마커 유전자 또는 단백질은 단독으로 또는 조합하여 담관암 진단에 사용될 수 있다.The 20 cholangiocarcinoma marker genes or proteins of the present invention may be used alone or in combination to diagnose cholangiocarcinoma.
또한, 본 발명의 담관암 진단킷트는 상기 담관암 특이적 마커 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 또는 프로브 이외에 RNA 또는 폴리 (A)+ RNA 분리 시약을 더 포함할 수 있으며, 마이크로어레이를 통하여 발현양을 조사하는 경우에 는 20종 유전자의 고형지지체를 포함한다.In addition, the bile duct cancer diagnostic kit of the present invention may further comprise an RNA or poly (A) + RNA separation reagent in addition to the forward primer and reverse primer or probe of the bile duct cancer specific marker gene, and to investigate the expression amount through a microarray. The case includes solid supports of 20 genes.
또한, 20종의 담관암 마커 유전자는 발암 관련 유전자 또는 발암 억제 유전자일 가능성이 높으므로, 이러한 표적 유전자가 코딩하는 단백질에 결합하는 작은 분자의 화합물은 표적 단백질을 저해 또는 촉진하는 화합물의 후보가 될 수 있으며 이는 항암제, 치료제 등의 의약품으로 사용할 수 있다. In addition, since the 20 kinds of cholangiocarcinoma marker genes are likely to be carcinogenic or carcinogenic genes, small molecule compounds that bind to the proteins encoded by these target genes may be candidates for compounds that inhibit or promote the target proteins. It can be used as a medicine for anticancer drugs and treatments.
이런 화합물을 스크리닝하는 방법으로는, 상기 20종의 담관암 마커 유전자가 코딩하는 단백질을 어피니티칼럼에 고정시키고 이를 피검시료와 접촉시켜 정제하는 방법[Pandya 등, Virus Res 87: 135-143, 2002], 투하이브리드법을 이용하는 방법[Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989], 웨스턴 브로팅법["Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al. (1982) section 18.30-18.74], 하이스루풋스크리닝법 [Aviezer 등, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] 등 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있다. 스크리닝에 사용하는 피검시료로서는 세포 추출액, 유전자라이브러리의 발현산물, 합성저분자화합물, 합성펩타이드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다. As a method of screening such a compound, a method of fixing the proteins encoded by the 20 bile duct cancer marker genes in an affinity column and contacting them with a test sample is purified [Pandya et al., Virus Res 87: 135-143, 2002]. , Method of using the hybrid method [Fields, S and Song, O., Nature 340: 245-246, 1989], Western blotting ["Molecular Cloning-A Laboratory Manual" Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al. (1982) section 18.30-18.74], a high throughput screening method [Aviezer et al., J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] can be used. Test samples used for screening include, but are not limited to, cell extracts, expression products of gene libraries, synthetic low molecular weight compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited thereto.
실시예 1: 담관암 세포주와 간암 세포주로부터 총 RNA 분리Example 1 Total RNA Separation from Bile Duct Cancer Cell Line and Liver Cancer Cell Line
10% 소혈청(Fetal Bovine Serum)[Gibco BRL 사], 페니실린(10000 U/ml)과 스트렙토마이신(10 mg/㎖)을 첨가한 RPMI1640[Jeil Biotech 사] 배양액을 15 cm 디쉬에 30 ㎖씩 분주한 후 담관암 세포주인 ChoCK, SCK, CHoiCK, CKK1[전북대]와 간암 세포주인 SNU475, SNU368, SNU354, SNU387[한국세포주은행]과 HLK1, HLK3, JSHC[전북대]을 디쉬당 세포가 5 ×106이 되도록 접종하고 이를 37 ℃, 5% CO2가 존재하는 배양기에서 배양하였다. 30 ml aliquots of RPMI1640 [Jeil Biotech] medium supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (Gibco BRL), penicillin (10000 U / ml) and streptomycin (10 mg / ml) in 15 cm dishes. Cells per choke, ChoCK, SCK, CHoiCK, CKK1 [Cheonbuk National University] and liver cancer cell lines SNU475, SNU368, SNU354, SNU387 [Korea Cell Line Bank] and HLK1, HLK3, JSHC [Cheonbuk National University] were 5 × 10 6 cells per dish. Inoculated as much as possible and cultured in an incubator at 37 ° C. with 5% CO 2 .
세포의 총 RNA는 QIAGEN 킷트(RNeasy Maxi 킷트: cat#75162)를 사용하여 분리하였다. 우선, 부착 세포는 EDTA와 트립신을 이용해 회수한 후, 150 ㎕의 베타 머캅토에탄올(β-Mercaptoethanol)을 첨가한 15 ㎖의 킷트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 여기에 15 ㎖의 70% EtOH을 첨가하여 잘 섞은 후, 3000 g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척 과정을 수행 후, 1.2 ㎖의 RNase가 제거된 물을 첨가하여 총 RNA를 용출, 분리하였다. Total RNA of cells was isolated using QIAGEN kit (RNeasy Maxi kit: cat # 75162). First, adherent cells were recovered using EDTA and trypsin, and then lysed in 15 ml of in-kit digestion buffer with 150 μl of beta mercaptoethanol. 15 ml of 70% EtOH was added thereto and mixed well, followed by centrifugation at 3000 g for 5 minutes to attach total RNA to the membrane. After two washing procedures, total RNA was eluted and separated by adding 1.2 ml of RNase-free water.
실시예 2: EST 발굴 빈도에 의한 담관암 고발현 유전자와 저발현 유전자의 선별 Example 2 Screening of High and Low Expressing Cholangiocarcinoma Genes by Frequency of EST Excavation
본 발명자는 담관암에서 발현되는 유전자를 분석하기 위하여, 담관암 세포주와 간암 세포주에서 각종 cDNA 라이브러리를 구축하고, 이로부터 무작위로 클론을 선별, 분석함으로써 EST 발굴 빈도를 기초로 한 담관암 고발현 유전자와 저발현 유전자를 선별하고자 하였다.In order to analyze genes expressed in cholangiocarcinoma, the present inventors construct various cDNA libraries in cholangiocarcinoma cell line and liver cancer cell line, and randomly select and analyze clones from the cholangiocarcinoma high expressing genes and low expression based on the frequency of EST excavation. Genes were to be screened.
1) cDNA 라이브러리의 제조 1) Preparation of cDNA Library
상기 실시예 1에서 얻은 각 시료의 총 RNA 각 100 ㎍을 BAP 효소 반응액[100Mm Tris-Hcl(pH 7.0), RNA 2mM DTT, 80U Rnasin(promega사)]에서 3U의 BAP (Bacterial alkaline Phosphatase)[TakaRa사] 효소로 처리하고, 이어 TAP[Waco사] 효소 반응액[50 mM sodium acetate(pH 5.5), 1mM EDTA, 2mM DTT, 80U Rnasin (promega사)]에서 100 U의 TAP(Tabbaco acid pyrophosphatase) 효소를 반응시켰다. 그 후, 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 5mM MgCl2, 2mM DTT, 0.5mM ATP, 26% PEG, 100U Rnasin, 서열번호 1의 올리고리보뉴클레오티드 40 pmole, 250U RNA 리가제[TakaRa사]의 반응을 수행하여 합성한 올리고머를 인산기를 가지는 미분해 mRNA에만 첨가되도록 반응시켰다.100 μg of total RNA of each sample obtained in Example 1 was added to 3 U BAP (Bacterial alkaline Phosphatase) [BAP enzyme reaction solution [100 mM Tris-Hcl (pH 7.0),
이상의 반응을 처리한 총 RNA로부터 올리고텍스(oligotex) mRNA 정제 킷트 [QIAGEN사]를 사용하여 mRNA를 분리하고, dT17을 함유한 서열번호 2의 올리고머를 프라이머로 사용하여 1st cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 XL PCR 킷트 [Perkin Elmer사]를 사용하여 합성된 DNA 삽입체의 5'-말단(서열번호: 3)과 3'-말단의 올리고머(서열번호: 4)를 함유한 PCR 반응을 수행하여 소량 증폭시켰다. PCR 산물을 SfiI의 효소로 처리한 후 아가로스 젤 전기영동을 하여 1.3 kb 이상의 cDNA 단편을 분리하였다. 분리된 cDNA 단편은 TaKaRa 연결 킷트를 이용하여 DraIII 효소로 처리한 pCNS-D2 벡터에 연결시킨 후, 전기침공법(electroporation)에 의해 대장균 Top10F'[Invitrogen사] 균주에 형질전환시켜, cDNA 라이브러리를 제조하였다. MRNA was isolated from the total RNA treated with the above reaction using oligotex mRNA purification kit [QIAGEN] and 1 st cDNA was synthesized using oligomer of SEQ ID NO: 2 containing dT17 as a primer. The synthesized cDNA was subjected to PCR reaction containing the 5'-end (SEQ ID NO: 3) and 3'-end oligomer (SEQ ID NO: 4) of the DNA insert synthesized using the XL PCR kit (Perkin Elmer). And amplified in small amounts. The PCR product was treated with an enzyme of SfiI and subjected to agarose gel electrophoresis to separate cDNA fragments of 1.3 kb or more. The isolated cDNA fragment was linked to pCNS-D2 vector treated with DraIII enzyme using TaKaRa ligation kit and transformed into E. coli Top10F '[Invitrogen] strain by electroporation to prepare cDNA library. It was.
본 방법에 의해 5종의 담관암 세포주 cDNA 라이브러리와 8종의 간암 세포주 cDNA 라이브러리를 제조하였다[표 2]. Five bile duct cancer cell line cDNA libraries and eight liver cancer cell line cDNA libraries were prepared by this method [Table 2].
2) cDNA 염기서열의 결정 및 데이터 분석2) Determination of cDNA Sequence and Data Analysis
제작한 cDNA 라이브러리를 앰피실린(100 ㎍/㎖)이 함유된 LB 한천배지에 도말하여 다수의 cDNA 클론을 배양하였다. 얻어진 클론들의 염기서열을 분석하기 위하여 MWG 96웰 플라스미드 프렙 시스템(plasmid prep system)으로 플라스미드 DNA를 분리하고, 자동화염기서열 결정기인 ABI 3700으로 염기서열분석을 수행하였다. The prepared cDNA library was plated on LB agar medium containing ampicillin (100 µg / ml) to culture a number of cDNA clones. In order to analyze the nucleotide sequences of the clones, plasmid DNA was isolated by MWG 96-well plasmid prep system, and sequencing was performed by ABI 3700, an automated nucleotide sequencer.
결정된 DNA 데이터의 유사성 검색은 BLASTN을 사용하여 유니진(UniGene) 데이터베이스(Hs.seq.all, build#151)에서 수행하였다. Similarity search of the determined DNA data was performed in the UniGene database (Hs.seq.all, build # 151) using BLASTN.
총 13 종의 cDNA 라이브러리에서 약 29,040개의 EST 염기 배열을 결정하고 이의 분석을 유니진 데이터베이스에서 수행한 결과, 총 14,734종의 유전자가 발굴되었다. 각 라이브러리별 결정된 EST 수와 발굴된 유전자의 종류는 상기 표 2에 나타낸 바와 같다.About 29,040 EST sequences were determined from a total of 13 cDNA libraries, and their analysis was performed on the Unijin database. A total of 14,734 genes were identified. The number of ESTs determined for each library and the types of genes discovered are shown in Table 2 above.
3) 유전자 발굴 빈도 분석3) Analysis of gene discovery frequency
8종의 간암 세포주 cDNA 라이브러리를 대조군으로 하고 5종의 담관암 세포주 cDNA 라이브러리는 담관암 시료로 하여 크게 2가지로 분류하였다. 각 유전자의 발굴 빈도는 각각의 시료에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자 수의 비로 나타내었다. 또한, 각 라이브러리에서 각 유전자의 발굴 빈도는 각 라이브러리에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자의 수의 비로 계산하고 이를 색깔로서 나타내었다. Eight kinds of hepatocellular carcinoma cell line cDNA library were used as a control, and five types of bile duct cancer cell line cDNA libraries were classified into two types. The frequency of excavation of each gene was expressed as the ratio of the total number of genes excavated to the number of specific genes excavated in each sample. In addition, the frequency of excavation of each gene in each library was calculated by calculating the number of specific genes excavated in each library as the ratio of the total number of genes excavated and represented as color.
상기와 같은 분석에 의해 담관암 세포주 시료에서 발굴 빈도가 증가하는 12종의 고발현 유전자와 발굴 빈도가 감소하는 저발현 유전자 8종이 각각 선별되었다[도 1]. As a result of the above analysis, 12 high-expression genes with increased excavation frequency and 8 low-expression genes with reduced excavation frequency were selected from bile duct cancer cell line samples [FIG. 1].
실시예 3: RT-PCR 반응에 의한 선별된 표적 유전자의 발현량 분석Example 3 Analysis of Expression of Selected Target Genes by RT-PCR Response
담관암 세포주 시료와 간암 세포주 시료에서 유전자 발굴 빈도에 의해 선별 된 12종의 담관암 고발현 유전자와 8종의 담관암 저발현 유전자의 발현량을 경쟁적 RT-PCR 방법을 통해 정량적으로 분석하였다. The expression levels of 12 bile duct cancer high expression genes and 8 bile duct cancer low expression genes selected by the frequency of gene discovery in bile duct cancer cell and liver cancer cell line samples were quantitatively analyzed by competitive RT-PCR method.
1) 역전사 효소 반응1) Reverse Transcriptase Reaction
상기 실시예 1에서 분리한 총 11종의 총 RNA에서 각각 5 ㎍을 사용하여 다음 역전사 반응액에서 42 ℃, 60분간 반응시켜 총 11종의 1st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70 ℃ 가열 블럭(heating block)에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.A total of 11 kinds of 1 st cDNA were synthesized by reacting for 5 minutes at 42 ° C. for 60 minutes in the following reverse transcription reaction solution using 5 μg of the total 11 kinds of total RNA isolated in Example 1 above. Thereafter, cDNA synthesis was terminated by reacting for 15 minutes in a 70 ° C. heating block.
2) 경쟁적(competitive) PCR을 이용한 cDNA의 증폭 및 발현량 확인2) Confirmation of amplification and expression level of cDNA using competitive PCR
① 경쟁적 PCR을 위한 주형의 농도 보정① Correction of template concentration for competitive PCR
마커 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로 본 실험에서는 B2M 유전자를 사용하였다. 표준 유전자와 프라이머의 프라이밍 부분은 같으나, PCR 산물의 크기가 다른 경쟁 DNA(competitor)를 표준 유전자와 함께 PCR 반응을 수행하여, 시료간 표준 유전자의 발현양과 경쟁 DNA의 발현양이 같은 농도를 찾아, PCR에 사용되 는 각 주형의 농도가 동일하게 되도록 시료의 농도를 보정하였다. B2M gene was used in this experiment as a standard gene for quantifying the marker gene. Priming parts of standard genes and primers are identical, but PCR DNA reactions are performed with competing DNAs (competitors) having different sizes of PCR products with standard genes. The concentration of the sample was corrected so that the concentration of each template used for PCR was equal.
B2M 경쟁 DNA는 3 ㎕의 pCNS 벡터 DNA (2ng), 10 ㎕의 5 ×PCR premix[바이오니아 사], 1 ㎕의 정방향 프라이머(20 pmole: 서열번호 5), 1 ㎕의 역방향 프라이머(20 pmole: 서열번호 6), 35 ㎕의 증류수를 함유한 50 ㎕의 반응액에서 PCR 반응을 수행하여 제조하였다. 이때, PCR 반응의 조건은 94 ℃ 30초, 50 ℃ 1분으로 25회 수행하였으며, B2M 경쟁 DNA인 PCR 산물의 길이는 322 bp였다. B2M competition DNA consists of 3 μl of pCNS vector DNA (2 ng), 10 μl of 5 × PCR premix (Bionia), 1 μl of forward primer (20 pmole: SEQ ID NO: 5), 1 μl of reverse primer (20 pmole: sequence No. 6) was prepared by performing a PCR reaction in 50 µl of the reaction solution containing 35 µl of distilled water. At this time, the conditions of the PCR reaction was performed 25 times at 94 ℃ 30 seconds, 50
조제한 B2M 경쟁 DNA를 3/108, 7/108, 1/107, 3/107, 7/107
, 1/106, 3/106, 7/106 의 8단계로 희석한 후, 2 ㎕를 상기 1)의 역전사 효소 반응액(역전사 반응에 사용된 RNA의 10 ng에 해당되는 양)과 각각 혼합한 후, 4 ㎕의 5 ×Taq DNA 중합효소 혼합액, 2 ㎕의 B2M 프라이머(5 pmole/㎕)(서열번호 5 및 6), 8 ㎕의 증류수를 함유한 총 20 ㎕의 6개 PCR 반응액을 사용하여 경쟁적 PCR을 수행하였다. 이때 PCR 반응 조건은 94 ℃ 40초, 55 ℃ 1분, 72 ℃ 1분으로 25회씩 수행하였다. The prepared B2M competition DNA was diluted in 8 steps of 3/10 8 , 7/10 8 , 1/10 7 , 3/10 7 , 7/10 7 , 1/10 6 , 3/10 6 , 7/10 6 2 μl of the reverse transcriptase reaction solution (amount corresponding to 10 ng of RNA used for reverse transcription) and After mixing, 4 μl of 5 × Taq Competitive PCR was performed using a total of 20 μl of 6 PCR reactions containing a DNA polymerase mixture, 2 μl of B2M primer (5 pmole / μl) (SEQ ID NOs: 5 and 6), and 8 μl of distilled water. At this time, PCR reaction conditions were performed 25 times at 94 ℃ 40 seconds, 55
PCR 산물을 2% 아가로스 젤에 3 ㎕씩 로딩하여 100 V에서 30분 전기영동한 후, FrogTM 기계(젤 이미지 어낼리시스 시스템)[Core Bio 사]를 이용하여 젤 사진을 촬영하였다. 최종적으로 얻은 젤 밴드 이미지 파일(.tif)을 ToltalLab v1.0 프로그램[NonLinear Dynamix 사]을 이용하여, 두 밴드(B2M 경쟁 DNA에서는 322 bp, 원래 B2M유전자에서는 390 bp)의 감도가 비슷한 농도를 선별, 정량화 한 후, 각 시료의 농도를 보정하였다. PCR products were loaded on 3 μl of 2% agarose gel, followed by electrophoresis at 100 V for 30 minutes, and gel pictures were taken using a Frog ™ machine (Gel Image Analysis System) [Core Bio]. Finally, the gel band image file (.tif) obtained was screened using the ToltalLab v1.0 program (NonLinear Dynamix) to detect similar concentrations of two bands (322 bp for B2M competition DNA and 390 bp for the original B2M gene). After quantification, the concentration of each sample was corrected.
② PCR을 이용한 cDNA의 증폭② Amplification of cDNA by PCR
상기 ①에서 보정한 시료의 cDNA를 각 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 함유한 다음 표 4의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때, PCR 반응은 94 ℃ 1분, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 1분으로 25회씩 수행하였다. CDNA of the sample corrected in ① was amplified in the PCR reaction solution of Table 4 containing the forward primer and the reverse primer of each gene. At this time, the PCR reaction was performed 25 times at 94 ℃ 1 minute, 55 ℃ 30 seconds, 72
12종 담관암 고발현 유전자인 RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3과 8종의 담관암 저발현 유전자 RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1, S100A4의 프라이머는 단백질 코딩 영역 내부에서 디자인하였고, 각 프라이머의 길이는 16 ∼ 23 bp, GC 함량은 50 ∼ 70% 정도이다. 다음은 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.Twelve cholangiocarcinoma genes, RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3 and 8 cholangiocarcinoma low expression genes RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, The primers of KRT8, PSMB6, NQO1, S100A4 were designed inside the protein coding region. The length of each primer was 16-23 bp and the GC content was about 50-70%. Next is PCR The composition of the reaction solution is shown.
③ 경쟁적 PCR을 이용한 발현량 확인③ Confirmation of expression level using competitive PCR
PCR 반응에 의해 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액을 2%의 아가로스 젤에 100V로 30분간 전기영동한 후, PCR 산물을 상기 ①에서와 같이 ToltalLab v1.0 프로그램(NonLinear Dynamix Ltd.)을 이용하여 정량화하였다. In order to confirm the PCR product amplified by the PCR reaction, the PCR reaction solution was electrophoresed for 30 minutes at 100V on 2% agarose gel, and then the PCR product was subjected to the ToltalLab v1.0 program (NonLinear Dynamix Ltd.) as described above. Quantification using.
그 결과를 도 2와 도 3에 나타내었다. 도 2는 고발현 유전자를, 도 3은 저발현 유전자를 확인한 결과이며, X축은 각종 시료를 나타낸 것으로, L3, L4, L5, L9, L12, L13, L16은 간암 세포주들이며 L6, L8, L10, L14, L15는 담관암 세포주를 나타내며, Y축은 각종 시료에서 표적 유전자의 발현량을 나타낸 것으로, 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현량은 각각 간암 세포주에서 발현되는 발현량의 평균량에 대한 비율로서 나타낸 것이다. 각 유전자의 발현량은 각종 시료에서 발현되는 B2M의 발현량으로 나눈 값을 표기하였다. 담관암 세포주에서 발굴 빈도가 높은 고발현 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 담관암 세포주 시료에서 높았으며, 담관암 세포주에서 발굴 빈도가 낮은 저발현 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 간암 세포주에 비해 담관암 세포주 시료에서 낮게 나타났다. 즉, 12종의 담관암 후보 유전자인 RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3는 담관암 마커로서 유용함이 확인되었고 8종의 담관암 저발현 유전자 RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1, S100A4는 담관암 억제 마커로 사용 가능한 것이 확인되었다.The results are shown in FIGS. 2 and 3. Figure 2 is a high expression gene, Figure 3 is a result of confirming the low expression gene, X-axis shows a variety of samples, L3, L4, L5, L9, L12, L13, L16 are liver cancer cell lines L6, L8, L10, L14 and L15 represent cholangiocarcinoma cell lines, and the Y-axis represents the expression levels of target genes in various samples, and the expression levels of high and low expression genes are expressed as a ratio with respect to the average amount of expression expressed in liver cancer cell lines, respectively. will be. The expression amount of each gene was expressed by dividing the expression amount of B2M expressed in various samples. Competitive RT-PCR products of high-expression genes with high frequency of excretion in bile duct cancer cell lines were higher in bile duct cancer cell line samples. Competitive RT-PCR products of low-expression genes with low frequency of excretion in bile duct cancer cell lines were found in bile duct cancer cell line samples. Appeared lower. That is, 12 kinds of cholangiocarcinoma candidate genes, RPL3, ANXA1, HSPCA, PKM2, HSPCB, AKR1C2, HLA-A, TM4SF1, IFI27, IFITM1, MIG-6, FER1L3, were found to be useful as bile duct cancer markers and 8 types of bile duct cancers The genes RPS8, FTH1, CFL1, TALDO1, KRT8, PSMB6, NQO1, and S100A4 were found to be usable as inhibitors of cholangiocarcinoma.
실시예 4: 임상 시료에서 담관암 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현량 확인Example 4: Confirmation of expression level of bile duct cancer high and low expression genes in clinical samples
본 실험에서는 카톨릭 의과대학교와 전북대 의과대학에서 제공한 5명의 담관암 환자로부터 직접 채취한 시험 조직 및 간경변 조직 (각각 CC1 내지 CC5 및 LC1 내지 LC5)의 쌍으로 된 5종의 임상 시료에서, 12종의 담관암 고발현 유전자와 8종의 저발현 유전자의 발현량을 경쟁적 RT-PCR법을 사용하여 수행하였다.In this study, 12 clinical trials were performed on five clinical samples of pairs of test tissues and cirrhosis tissues (CC1 to CC5 and LC1 to LC5, respectively) taken directly from five patients with cholangiocarcinoma provided by Catholic Medical University and Chonbuk National University Medical School. Expression levels of bile duct cancer high expression genes and 8 low expression genes were performed using a competitive RT-PCR method.
1) 총 RNA 분리 및 역전사 효소 반응 1) Total RNA Isolation and Reverse Transcriptase Reaction
상기 실시예 1에서와 같은 방법으로 10종의 총 RNA를 분리하고, 상기 실시예 3-1)에서와 같이 각 시료의 총 RNA 5㎍을 사용하여 42 ℃, 60분간 역전사 반응을 수행함으로써 총 10종의 1st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70 ℃ 가열 블럭에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.10 total RNAs were isolated in the same manner as in Example 1, and reverse transcription reaction was performed at 42 ° C. for 60 minutes using 5 μg of total RNA of each sample as in Example 3-1). 1 st cDNA of the species was synthesized. Then, cDNA synthesis was terminated by reacting for 15 minutes in a 70 degreeC heating block.
2) 경쟁적 PCR을 이용한 각 유전자의 발현량 확인2) Confirmation of expression level of each gene using competitive PCR
경쟁적 PCR을 위한 주형의 농도 보정은 상기 실시예 3-2)-①에서와 동일한 방법으로 PCR에 사용되는 각 주형의 농도가 동일하게 되도록 시료의 농도를 보정하였다. 보정한 시료의 역전사 반응액을 2 ㎕씩 주형으로 이용하여 각 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 함유한 총 15 ㎕의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때 PCR 반응은 94 ℃ 30초, 55 ℃ 1분, 72 ℃ 1분을 25회씩 수행하였다. 사용된 프라이머는 상기 표 5에서 표시된 것과 같다. 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액 전부를 2%의 아가로스 젤에 100 V로 30분으로 전기영동한 후, PCR 산물을 상기 실시예 3-3)-①에서와 같이 ToltalLab v1.0 프로그램(NonLinear Dynamix Ltd.)을 이용하여 정량화하였다. Concentration correction of the template for the competitive PCR was corrected so that the concentration of each template used in the PCR in the same manner as in Example 3-2) -① was the concentration of the sample. A total of 15 μl of PCR containing the forward and reverse primers of each gene was used as the template for reverse transcription of the corrected sample. Amplified in the reaction solution. At this time, the PCR reaction was performed 25 times at 94 ℃ 30 seconds, 55
그 결과는 도 4와 5에 나타내었다. 도 4는 고발현 유전자를, 도 5는 저발현 유전자를 확인한 결과로서, 담관암 고발현 유전자인 ANXA1, HSPCB, HLA-A, TM4SF1, IFITM1 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 동일 환자에서 채취한 간경변 조직에서보다 시험 조직에서 높은 경우가 더 많았으며, 담관암 저발현 유전자인 RPS8, TALDO1, KRT8, PSMB6 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 시험 조직에서보다 간경변 조직에서 더 높게 나타나는 경향이 확인되었다.The results are shown in FIGS. 4 and 5. FIG. 4 shows the high expression gene and FIG. 5 shows the low expression gene. The competitive RT-PCR products of the bile duct cancer high expression genes ANXA1, HSPCB, HLA-A, TM4SF1, and IFITM1 genes were collected from the same patient. The test tissues were higher in the test tissues than in the tissues, and the competitive RT-PCR products of the RPS8, TALDO1, KRT8, and PSMB6 genes, which were low in bile duct cancer, were found to be higher in cirrhosis tissues than in the test tissues.
실시예 5: 담관암 조직 시료에서 담관암 고발현 유전자의 면역조직화학 염색법을 이용한 발현 확인Example 5: Confirmation of expression of bile duct cancer high expression gene by immunohistochemical staining in bile duct cancer tissue samples
본 실험에서는 을지의과대학교에서 제공한 담관암 환자와 간암 환자로부터 적출한 조직을 고정하여 총 20종의 담관암 진단마커 유전자 중 현재까지 확보되어 있는 두 종의 ANXA1 과 HSPCB에 대한 항체를 이용하여 정상 간 조직, 간경변 조직, 간암 조직, 정상 담즙관 및 담관암 조직에서의 발현을 비교, 분석하였다. In this experiment, tissues extracted from bile duct cancer patients and liver cancer patients provided by Eulji University of Medicine were fixed and normal liver tissues were obtained by using antibodies against two kinds of ANXA1 and HSPCB. , Liver cirrhosis tissue, liver cancer tissue, normal bile duct and bile duct cancer tissue expression was compared and analyzed.
우선 종양 환자로부터 적출한 조직을 10% 중성 포르말린(formalin) 완충용액으로 고정한 후 녹아 있는 상태의 파라핀에 포매하였다. 파라핀으로 포매시킨 조직을 마이크로톰(microtome)으로 얇게 박절한 후 상기 절편을 유리 슬라이드 위에 고정하여 자일렌(xylene)과 히스토클리어(histoclear) 용매로 파리핀을 제거하였다. 상기 절편을 1 M 트리스 완충용액으로 세척한 후 1차 항체로 1 M 트리스 완충용액으로 200배 희석한 담관암 고발현 유전자인 ANXA1과 HSPCB에 대한 항체를 40 ℃에서 20분 동안 처리하였다. 반응하지 않은 항체를 1 M 트리스 완충용액으로 완전히 세척하여 제거한 후 2차 항체로 바이오틴(biotin)이 결합된 아비딘-양고추냉이 퍼옥시다아제(avidin-horseradish peroxidase) 용액[Immunotech사]을 40 ℃에서 10분 동안 처리하였다. 다시 반응하지 않은 2차 항체를 완전히 세척하여 제거한 후 상기 절편을 퍼옥시다아제 기질용액인 0.05% H2O2를 포함한 3-아민-9-에틸카바졸(3-amine-9-ethylcarbazole) 용액에 반응시켜 메이어 헤마톡실린(Meyer's hematoxylin)으로 상호 염색시키고 슬라이드를 봉합한 뒤 광학 현미경으로 확인하였다[도 6 및 도 7]. First, tissues extracted from tumor patients were fixed in 10% neutral formalin buffer and embedded in dissolved paraffin. Paraffin-embedded tissue was thinly sliced with a microtome and the sections were then fixed on a glass slide to remove paraffin with xylene and histoclear solvents. The fragments were washed with 1 M Tris buffer and then treated with ANXA1 and HSPCB, the bile duct cancer high expression genes, diluted 200-fold with 1 M Tris buffer as the primary antibody at 40 ° C. for 20 minutes. The unreacted antibody was completely washed with 1 M Tris buffer solution and then removed, and then the avidin-horseradish peroxidase solution [Immunotech Co., Ltd.] conjugated with biotin as a secondary antibody was used at 40 ° C. Treatment was for minutes. After washing and removing the secondary antibody that did not react again, the fragment was reacted with a 3-amine-9-ethylcarbazole solution containing 0.05% H 2 O 2 , a peroxidase substrate solution. Cross-stained with Meyer's hematoxylin and the slides were sutured and confirmed by light microscopy [FIGS. 6 and 7].
도 6은 ANXA1 단백질의 발현을 담관암 조직시료에서 확인한 것으로 정상 간세포와 간암세포 그리고 정상 담즙관 세포에서는 ANXA1 단백질이 거의 발현되지 않 는 것으로 확인되었으며, 간내 담관암과 간외 담관암 세포에서는 세포막 (cellular membrane) 단백질로서 그 발현이 현저히 증가되고 있음이 확인되었다. 도 7은 HSPCB 단백질의 발현을 담관암 조직시료에서 확인한 것으로 간경변 (Liver cirrhosis, LC) 조직과 간암세포 그리고 정상 담즙관(Normal bile duct, NB)에서 HSPCB 단백질의 발현이 현저히 낮음이 확인되었고, 반면에 담관암세포에서는 과발현됨이 확인되었다. 이외에 전이성 담관암의 경우도 HSPCB 단백질이 과발현됨이 확인되었고 십이지장 조직을 이루는 정상 십이지장 점막세포(Normal duodenal mucosa, ND)에서는 다른 조직에서와 마찬가지로 발현이 현저히 낮았다. Figure 6 confirms the expression of ANXA1 protein in cholangiocarcinoma tissue samples, it was confirmed that almost no ANXA1 protein in normal hepatocytes, hepatic cancer cells and normal bile duct cells, cellular membrane protein in hepatic bile duct cancer and extrahepatic bile duct cancer cells. It was confirmed that the expression was significantly increased. Figure 7 confirmed the expression of HSPCB protein in cholangiocarcinoma tissue samples, it was confirmed that the expression of HSPCB protein in liver cirrhosis (LC) tissue, liver cancer cells and normal bile duct (NB) significantly lower, whereas Overexpression was confirmed in bile duct cancer cells. In addition, HSPCB protein was overexpressed in metastatic cholangiocarcinoma, and normal duodenal mucosa (ND), which forms duodenal tissue, was significantly lower in expression than other tissues.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 담관암 진단에 유용한 마커로 담관암 세포주에서 12종의 담관암 고발현 유전자와 8종의 담관암 저발현 유전자을 제공하며, 상기 종양 마커 유전자들은 환자 조직에서 신속하고 민감하게 정량하여 담관암을 비롯한 다양한 암환자들의 종양의 악성화를 효과적으로 진단하는데 사용될 수 있다. As described above, the present invention provides 12 types of cholangiocarcinoma genes and 8 types of cholangiocarcinoma genes in cholangiocarcinoma cell lines, which are useful markers for the diagnosis of cholangiocarcinoma, and the tumor marker genes are rapidly and sensitively quantified in patient tissues. It can be used to effectively diagnose tumor malignancy of various cancer patients including cholangiocarcinoma.
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