JP2016125937A

JP2016125937A - Detection method and detection kit

Info

Publication number: JP2016125937A
Application number: JP2015000982A
Authority: JP
Inventors: 幸司宮崎; Koji Miyazaki; 敬三高野; Keizo Takano
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 2015-01-06
Filing date: 2015-01-06
Publication date: 2016-07-11
Anticipated expiration: 2035-01-06
Also published as: JP6481371B2

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a detection method that suppresses dissection of a ligand and analyte, and can detect the analyte with high sensitivity and high accuracy.SOLUTION: A detection method is configured to: prepare a detection device that contains a support body, and a first ligand anchored to one surface of the support body and capable of being specifically bonded to an analyte; provide a sample on the support body of the detection device to bind the analyte contained in the sample to the first ligand; provide a crosslinking agent serving as an organic compound having an aldehyde group on the support body; crosslink the first ligand and the analyte; and detect a signal deriving from the analyte bonded to the first ligand.SELECTED DRAWING: Figure 3

Description

本発明は、検出方法および検出キットに関する。 The present invention relates to a detection method and a detection kit.

臨床検査などにおいて、検体中のタンパク質やＤＮＡなどの微量のアナライト（被検出物質）を高感度かつ高精度に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量のアナライトを高感度かつ高精度に検出するための方法が求められている。 If it is possible to detect minute amounts of analytes (substances to be detected) such as proteins and DNA in specimens with high sensitivity and high accuracy in clinical examinations, it is possible to quickly grasp and treat patients. It becomes. Therefore, a method for detecting a very small amount of analyte with high sensitivity and high accuracy is required.

アナライトの検出方法として、イムノアッセイが知られている。一般的に、イムノアッセイでは、まずアナライトに特異的に結合しうる１次抗体（第１リガンド）が固定された支持体上に検体を提供する。これにより、アナライトおよび１次抗体が互いに結合する。次いで、１次抗体に結合しているアナライトを標識物質（例えば、蛍光物質や酵素、放射性同位元素など）で標識する。たとえば、１次抗体に結合しているアナライトに標識物質で標識された２次抗体（第２リガンド）を結合させる。最後に、アナライトを標識している標識物質に由来するシグナルを検出することで、アナライトを検出することができる。 As an analyte detection method, an immunoassay is known. In general, in an immunoassay, a specimen is first provided on a support on which a primary antibody (first ligand) that can specifically bind to an analyte is immobilized. Thereby, the analyte and the primary antibody bind to each other. Next, the analyte bound to the primary antibody is labeled with a labeling substance (for example, a fluorescent substance, an enzyme, a radioisotope, etc.). For example, a secondary antibody (second ligand) labeled with a labeling substance is bound to an analyte bound to the primary antibody. Finally, the analyte can be detected by detecting a signal derived from a labeling substance that labels the analyte.

また、標識物質として蛍光物質を用いるイムノアッセイにおいて、検出感度および検出精度を向上させる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。ＳＰＦＳでは、所定の条件で光を金属膜に照射すると、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じることを利用する。アナライトに特異的に結合できる第１リガンド（例えば１次抗体）を金属膜上に固定化して、アナライトを特異的に固定するための反応場を形成する。この反応場にアナライトを含む検体を提供すると、アナライトは反応場の第１リガンドに結合する。次いで、蛍光物質で標識された第２リガンド（例えば２次抗体）を反応場に提供すると、反応場の第１リガンドに結合したアナライトは蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、アナライトを標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、アナライトの存在またはその量を検出することができる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度でアナライトを検出することができる。ＳＰＦＳは、励起光と表面プラズモンとを結合（カップリング）させる手段により、プリズムカップリング（ＰＣ）−ＳＰＦＳと、格子カップリング（ＧＣ）−ＳＰＦＳとに大別される。ＰＣ−ＳＰＦＳでは、１つの面に金属膜を形成されたプリズムを使用する。この方法では、プリズムと金属膜の界面において励起光を全反射させることで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。一方、ＧＣ−ＳＰＦＳでは、回折格子を形成された金属膜を使用する。この方法では、回折格子に励起光を照射することで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。 In addition, as a method for improving detection sensitivity and detection accuracy in an immunoassay using a fluorescent substance as a labeling substance, surface plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy (hereinafter abbreviated as “SPFS”) is known. It has been. SPFS utilizes the fact that surface plasmon resonance (hereinafter abbreviated as “SPR”) occurs when a metal film is irradiated with light under a predetermined condition. A first ligand that can specifically bind to the analyte (for example, a primary antibody) is immobilized on the metal film to form a reaction field for specifically immobilizing the analyte. When a specimen containing an analyte is provided in the reaction field, the analyte binds to the first ligand in the reaction field. Next, when a second ligand (for example, a secondary antibody) labeled with a fluorescent substance is provided to the reaction field, the analyte bound to the first ligand in the reaction field is labeled with the fluorescent substance. When the metal film is irradiated with excitation light in this state, the fluorescent substance that labels the analyte is excited by the electric field enhanced by SPR and emits fluorescence. Therefore, the presence or amount of the analyte can be detected by detecting fluorescence. In SPFS, the fluorescent substance is excited by an electric field enhanced by SPR, so that the analyte can be detected with high sensitivity. SPFS is roughly classified into prism coupling (PC) -SPFS and lattice coupling (GC) -SPFS by means for coupling (coupling) excitation light and surface plasmons. In PC-SPFS, a prism having a metal film formed on one surface is used. In this method, the excitation light is totally reflected at the interface between the prism and the metal film, thereby coupling the excitation light and the surface plasmon. On the other hand, GC-SPFS uses a metal film on which a diffraction grating is formed. In this method, excitation light and surface plasmons are combined by irradiating the diffraction grating with excitation light.

このように、イムノアッセイでは、抗体およびアナライトが特異的に結合することを利用する。しかしながら、抗体とアナライトとの結合は可逆的であるため、アナライトが抗体から解離してしまうことがある。このため、アナライトおよび／または標識物質が支持体（金属膜）から遊離してしまい、アナライトを正確に検出できないという問題が生じる。特に、ＳＰＦＳでは、アナライトは、蛍光物質で標識された２次抗体を介して蛍光標識されている。このように、アナライトが、１次抗体および２次抗体によりサンドイッチされている場合、１次抗体からアナライトおよび／または２次抗体が解離することで蛍光物質が分散してしまい、正確な検出を行うことができなくなる可能性がより高くなる。 Thus, immunoassays take advantage of the specific binding of antibodies and analytes. However, since the binding between the antibody and the analyte is reversible, the analyte may dissociate from the antibody. For this reason, the analyte and / or the labeling substance is released from the support (metal film), which causes a problem that the analyte cannot be detected accurately. In particular, in SPFS, the analyte is fluorescently labeled through a secondary antibody labeled with a fluorescent substance. As described above, when the analyte is sandwiched between the primary antibody and the secondary antibody, the analyte and / or the secondary antibody is dissociated from the primary antibody, so that the fluorescent substance is dispersed and accurate detection is performed. Is more likely to be unable to be performed.

このような問題を解決する手段として、ＳＰＦＳにおいて、１次抗体（第１リガンド）、アナライトおよび２次抗体（第２リガンド）からなるサンドイッチ構造体の解離を抑制する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。特許文献１に記載の方法では、ナノ構造粒子と、当該ナノ構造粒子上に固定された、１次抗体（第１リガンド）および２次抗体（第２リガンド）に特異的に結合する第３リガンドとを有するナノ構造体を使用する。１次反応および２次反応を行ってサンドイッチ構造体を形成した後に、このナノ構造体を反応場に提供することで、ナノ構造体により、第２リガンド−第２リガンド間および第２リガンド−第１リガンド間を架橋させる。これにより、サンドイッチ構造体の解離を抑制することができる。 As a means for solving such a problem, a method for suppressing dissociation of a sandwich structure composed of a primary antibody (first ligand), an analyte, and a secondary antibody (second ligand) in SPFS has been proposed ( For example, see Patent Document 1). In the method described in Patent Document 1, a nanostructure particle and a third ligand that specifically binds to a primary antibody (first ligand) and a secondary antibody (second ligand) immobilized on the nanostructure particle Are used. After the primary reaction and the secondary reaction are performed to form a sandwich structure, the nanostructure is provided to the reaction field so that the nanostructure allows the second ligand-second ligand and the second ligand-second structure. Crosslink between 1 ligand. Thereby, dissociation of the sandwich structure can be suppressed.

特開２０１３−５３９０２号公報JP 2013-53902 A

しかしながら、特許文献１に記載の方法では、ナノ構造体の準備が煩雑であるという課題がある。すなわち、特許文献１に記載の方法では、第１リガンドおよび第２リガンドの種類に応じてこれらに特異的に結合しうる第３リガンドを準備しなければならない。また、この第３リガンドをナノ構造粒子に固定しなければならない。 However, the method described in Patent Document 1 has a problem that the preparation of the nanostructure is complicated. That is, in the method described in Patent Document 1, a third ligand capable of specifically binding to the first ligand and the second ligand must be prepared. In addition, this third ligand must be immobilized on the nanostructured particles.

本発明の目的は、リガンドおよびアナライトの解離をより容易に抑制し、高感度かつ高精度にアナライトを検出することができる検出方法および検出キットを提供することである。 An object of the present invention is to provide a detection method and a detection kit that can more easily suppress the dissociation of a ligand and an analyte and detect the analyte with high sensitivity and high accuracy.

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出方法は、支持体と、前記支持体の一方の表面上に固定された、アナライトに特異的に結合しうる第１リガンドとを含む検出デバイスを用いて、検体中のアナライトを検出する方法であって、検体を前記検出デバイスの前記支持体上に提供して、前記検体に含まれる前記アナライトを前記第１リガンドに結合させる工程と、アルデヒド基を有する有機化合物である架橋剤を前記支持体上に提供して、前記第１リガンドと前記アナライトとを架橋する工程と、を有する。 In order to solve the above-described problem, a detection method according to an embodiment of the present invention includes a support, and a first ligand immobilized on one surface of the support and capable of specifically binding to an analyte. A method for detecting an analyte in a sample using a detection device comprising: providing a sample on the support of the detection device, and using the analyte contained in the sample as the first ligand. And a step of providing a crosslinking agent, which is an organic compound having an aldehyde group, on the support to crosslink the first ligand and the analyte.

また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出キットは、検体中のアナライトを検出するための検出キットであって、支持体と、前記支持体の一方の表面上に固定された、アナライトに特異的に結合しうる第１リガンドとを含む検出デバイスと、アルデヒド基を有する有機化合物である架橋剤と、を有する。 In order to solve the above problems, a detection kit according to an embodiment of the present invention is a detection kit for detecting an analyte in a specimen, and includes a support and one surface of the support. And a cross-linking agent that is an organic compound having an aldehyde group, and a detection device that includes a first ligand that can specifically bind to the analyte.

本発明によれば、リガンドとアナライトとの結合力が弱くても、リガンドとアナライトとが解離することを従来技術よりも容易に抑制し、高感度かつ高精度にアナライトを検出することができる。 According to the present invention, even when the binding force between a ligand and an analyte is weak, dissociation between the ligand and the analyte is more easily suppressed than in the prior art, and the analyte can be detected with high sensitivity and high accuracy. Can do.

図１は、ＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of the SPFS apparatus. 図２は、ＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。FIG. 2 is a flowchart illustrating an example of an operation procedure of the SPFS apparatus. 図３は、本実施の形態に係る検出方法を説明するための模式図である。FIG. 3 is a schematic diagram for explaining the detection method according to the present embodiment.

以下、本発明の一実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、本発明に係る検出方法を、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）に適用した例について説明する。 Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. Here, an example in which the detection method according to the present invention is applied to surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) will be described.

（ＳＰＦＳ装置および検出デバイスの構成）
図１は、ＳＰＦＳ装置２００の構成を示す模式図である。ＳＰＦＳ装置２００は、光照射部２１０、反射光検出部２２０、蛍光検出部２３０、送液部２４０、搬送部２５０および制御部２６０を有する。ＳＰＦＳ装置２００は、搬送部２５０のチップホルダー２５２に検出チップ（検出デバイス）１００を装着した状態で使用される。そこで、検出デバイス１００について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置２００の各構成要素について説明する。 (Configuration of SPFS apparatus and detection device)
FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of the SPFS apparatus 200. The SPFS device 200 includes a light irradiation unit 210, a reflected light detection unit 220, a fluorescence detection unit 230, a liquid feeding unit 240, a transport unit 250, and a control unit 260. The SPFS device 200 is used in a state where the detection chip (detection device) 100 is mounted on the chip holder 252 of the transport unit 250. Therefore, the detection device 100 will be described first, and then each component of the SPFS apparatus 200 will be described.

検出デバイス（検出チップ）１００は、入射面１１１、成膜面１１２および出射面１１３を有するプリズム１１０と、成膜面１１２上に形成された金属膜（支持体）１２０と、金属膜１２０の一方の表面上に固定されている第１リガンド１３０（後述する図３参照）と、金属膜１２０上に配置された流路蓋１４０とを含む。第１リガンド１３０は、アナライト１０に特異的に結合しうる。なお、詳細については後述するが、検出デバイス１００は、蛍光物質２０で標識された第２リガンド１５０と、架橋剤１６０とともに使用される。 The detection device (detection chip) 100 includes a prism 110 having an incident surface 111, a film formation surface 112, and an emission surface 113, a metal film (support) 120 formed on the film formation surface 112, and one of the metal films 120. The first ligand 130 (see FIG. 3 to be described later) fixed on the surface of the metal film 120 and the flow path lid 140 disposed on the metal film 120 are included. The first ligand 130 can specifically bind to the analyte 10. Although details will be described later, the detection device 100 is used together with the second ligand 150 labeled with the fluorescent substance 20 and the crosslinking agent 160.

プリズム１１０は、蛍光物質２０を励起するための励起光αに対して透明な誘電体からなる。前述のとおり、プリズム１１０は、入射面１１１、成膜面１１２および出射面１１３を有する。入射面１１１は、励起光αをプリズム１１０の内部に入射させる。成膜面１１２上には、金属膜１２０が配置されている。プリズム１１０の内部に入射した励起光αは、金属膜１２０の裏面で反射されて反射光βとなる。より具体的には、励起光αは、プリズム１１０と金属膜１２０との界面（成膜面１１２）で反射されて反射光βとなる。出射面１１３は、反射光βをプリズム１１０の外部に出射させる。 The prism 110 is made of a dielectric that is transparent to the excitation light α for exciting the fluorescent material 20. As described above, the prism 110 has the entrance surface 111, the film formation surface 112, and the exit surface 113. The incident surface 111 allows the excitation light α to enter the prism 110. A metal film 120 is disposed on the film formation surface 112. The excitation light α incident on the inside of the prism 110 is reflected on the back surface of the metal film 120 and becomes reflected light β. More specifically, the excitation light α is reflected at the interface (deposition surface 112) between the prism 110 and the metal film 120 to become reflected light β. The emission surface 113 emits the reflected light β to the outside of the prism 110.

プリズム１１０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム１１０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面１１２であり、一方の脚に対応する面が入射面１１１であり、他方の脚に対応する面が出射面１１３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面１１１と出射面１１３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム１１０内に滞留しにくくなる。 The shape of the prism 110 is not particularly limited. In the present embodiment, the shape of the prism 110 is a column having a trapezoidal bottom surface. The surface corresponding to one base of the trapezoid is the film formation surface 112, the surface corresponding to one leg is the incident surface 111, and the surface corresponding to the other leg is the emission surface 113. The trapezoid serving as the bottom surface is preferably an isosceles trapezoid. Thereby, the entrance surface 111 and the exit surface 113 are symmetric, and the S wave component of the excitation light α is less likely to stay in the prism 110.

入射面１１１は、励起光αが光源に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオードである場合、励起光αがレーザーダイオードに戻ると、レーザーダイオードの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面１１１に垂直に入射しないように、入射面１１１の角度が設定される。本実施の形態では、入射面１１１と成膜面１１２との角度および成膜面１１２と出射面１１３との角度は、いずれも約８０°である。ここで、「共鳴角」とは、金属膜１２０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面１１３から出射される反射光βの光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜１２０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、検出デバイス１００の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）δの光量が最大となるときの、入射角を意味する。 The incident surface 111 is formed so that the excitation light α does not return to the light source. When the light source of the excitation light α is a laser diode, when the excitation light α returns to the laser diode, the excitation state of the laser diode is disturbed, and the wavelength and output of the excitation light α are changed. Therefore, the angle of the incident surface 111 is set so that the excitation light α does not enter the incident surface 111 perpendicularly in the scanning range centered on the ideal enhancement angle. In the present embodiment, the angle between the incident surface 111 and the film formation surface 112 and the angle between the film formation surface 112 and the emission surface 113 are both about 80 °. Here, the “resonance angle” means the incident angle when the amount of the reflected light β emitted from the emission surface 113 is minimum when the incident angle of the excitation light α with respect to the metal film 120 is scanned. . The “enhancement angle” means scattered light having the same wavelength as the excitation light α emitted above the detection device 100 when the incident angle of the excitation light α with respect to the metal film 120 is scanned (hereinafter referred to as “plasmon scattered light”). It means the incident angle when the light quantity of δ is maximized.

なお、検出デバイス１００の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム１１０の屈折率や、金属膜１２０の屈折率、金属膜１２０の膜厚、金属膜１２０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜１２０上に固定されたアナライト１０によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。 It should be noted that the resonance angle (and the enhancement angle in the vicinity thereof) is generally determined by the design of the detection device 100. The design factors are the refractive index of the prism 110, the refractive index of the metal film 120, the film thickness of the metal film 120, the extinction coefficient of the metal film 120, the wavelength of the excitation light α, and the like. The resonance angle and the enhancement angle are shifted by the analyte 10 fixed on the metal film 120, but the amount is less than several degrees.

プリズム１１０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム１１０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム１１０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。プリズム１１０の製造方法の例には、射出成形法が含まれる。 The prism 110 has a considerable amount of birefringence. Examples of the material of the prism 110 include resin and glass. The material of the prism 110 is preferably a resin having a refractive index of 1.4 to 1.6 and a small birefringence. Examples of the manufacturing method of the prism 110 include an injection molding method.

金属膜（支持体）１２０は、プリズム１１０の成膜面１１２上に配置されている。これにより、成膜面１１２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜１２０中の自由電子との間で表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じ、金属膜１２０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。本実施の形態では、金属膜１２０は、成膜面１１２の全面に形成されている。 The metal film (support) 120 is disposed on the film formation surface 112 of the prism 110. As a result, surface plasmon resonance (hereinafter abbreviated as “SPR”) occurs between the photon of the excitation light α incident on the film formation surface 112 under the total reflection condition and the free electrons in the metal film 120. Local field light (generally also called “evanescent light” or “near field light”) can be generated on the surface of the metal film 120. In the present embodiment, the metal film 120 is formed on the entire film formation surface 112.

金属膜１２０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜１２０の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウム、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜１２０は、金薄膜である。金属膜１２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜１２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜１２０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。 The material of the metal film 120 is not particularly limited as long as it is a metal that can cause surface plasmon resonance. Examples of the material of the metal film 120 include gold, silver, copper, aluminum, and alloys thereof. In the present embodiment, the metal film 120 is a gold thin film. The method for forming the metal film 120 is not particularly limited. Examples of the method for forming the metal film 120 include sputtering, vapor deposition, and plating. The thickness of the metal film 120 is not particularly limited, but is preferably in the range of 30 to 70 nm.

第１リガンド１３０は、アナライト１０に特異的に結合することができる分子であり、金属膜１２０の一方の表面上に固定されている。これにより、アナライト１０と第１リガンド１３０とが互いに接触したときに、アナライト１０が第１リガンド１３０に固定される。第１リガンド１３０の種類は、アナライト１０に特異的に結合することができ、かつ架橋剤１６０により架橋されうるものであれば特に限定されない。第１リガンド１３０の例には、アナライト１０と相互作用を持つ親和性分子として、抗体や酵素、アビジン、ストレプトアビジンなどのタンパク質、アミノ酸、脂質、これらの修飾分子、およびこれらの複合体が含まれる。なお、乾燥による変性を防止する観点から、第１リガンド１３０は、検出デバイス１００の未使用時において保護層により保存されていてもよい。 The first ligand 130 is a molecule that can specifically bind to the analyte 10, and is immobilized on one surface of the metal film 120. Thereby, the analyte 10 is fixed to the first ligand 130 when the analyte 10 and the first ligand 130 come into contact with each other. The type of the first ligand 130 is not particularly limited as long as it can specifically bind to the analyte 10 and can be crosslinked by the crosslinking agent 160. Examples of the first ligand 130 include antibodies, enzymes, proteins such as avidin and streptavidin, amino acids, lipids, modified molecules thereof, and complexes thereof as affinity molecules that interact with the analyte 10 It is. From the viewpoint of preventing denaturation due to drying, the first ligand 130 may be stored in a protective layer when the detection device 100 is not used.

第１リガンド１３０を金属膜１２０上に固定化する方法は、特に限定されない。たとえば、金属膜１２０の上に、第１リガンド１３０を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、第１リガンド１３０に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を金属膜１２０に固定化し、この高分子に第１リガンド１３０を結合させてもよい。 The method for immobilizing the first ligand 130 on the metal film 120 is not particularly limited. For example, a self-assembled monomolecular film (hereinafter referred to as “SAM”) or a polymer film bonded with the first ligand 130 may be formed on the metal film 120. Examples of SAMs include films formed with substituted aliphatic thiols such as HOOC— (CH ₂ ) ₁₁ —SH. Examples of the material constituting the polymer film include polyethylene glycol and MPC polymer. Alternatively, a polymer having a reactive group that can be bound to the first ligand 130 (or a functional group that can be converted to a reactive group) is immobilized on the metal film 120, and the first ligand 130 is bound to the polymer. Good.

流路蓋１４０は、金属膜１２０上に配置されている。金属膜１２０がプリズム１１０の成膜面１１２の一部にのみ形成されている場合、流路蓋１４０は、成膜面１１２上に配置されていてもよい。本実施の形態では、流路蓋１４０は、金属膜１２０の上に配置されている。流路蓋１４０の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋１４０は、金属膜１２０（およびプリズム１１０）と共に、液体を収容し、かつ液体が流れる流路１４１を形成する。また、反応場は、流路１４１に露出するように配置されている。すなわち、金属膜１２０に固定化されている第１リガンド１３０も、流路１４１内に露出している。流路１４１の両端は、流路蓋１４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路１４１内へ液体が提供されると、液体は第１リガンド１３０に接触する。 The channel lid 140 is disposed on the metal film 120. When the metal film 120 is formed only on a part of the film formation surface 112 of the prism 110, the channel lid 140 may be disposed on the film formation surface 112. In the present embodiment, the flow path lid 140 is disposed on the metal film 120. A channel groove is formed on the back surface of the channel lid 140, and the channel lid 140, together with the metal film 120 (and the prism 110), forms a channel 141 that contains the liquid and flows. The reaction field is arranged so as to be exposed to the flow channel 141. That is, the first ligand 130 immobilized on the metal film 120 is also exposed in the channel 141. Both ends of the channel 141 are respectively connected to an inlet and an outlet (not shown) formed on the upper surface of the channel lid 140. When liquid is provided into the channel 141, the liquid contacts the first ligand 130.

流路蓋１４０は、金属膜１２０上から放出される蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋１４０の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光γおよびプラズモン散乱光δを外部に取り出す部分が蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明であれば、流路蓋１４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋１４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜１２０またはプリズム１１０に接合されている。 The channel lid 140 is preferably made of a material that is transparent to the fluorescence γ emitted from the metal film 120 and the plasmon scattered light δ. An example of the material of the channel lid 140 includes a resin. As long as the portion from which the fluorescent γ and the plasmon scattered light δ are extracted is transparent to the fluorescent γ and the plasmon scattered light δ, the other portion of the channel lid 140 may be formed of an opaque material. The channel lid 140 is bonded to the metal film 120 or the prism 110 by, for example, adhesion using a double-sided tape or an adhesive, laser welding, ultrasonic welding, or pressure bonding using a clamp member.

なお、検出デバイス１００は、流路蓋１４０の代わりに、貫通孔を有する枠体と、枠体に積層される天板とを有していてもよい。この場合、流路１４１は、金属膜１２０が形成されたプリズム１１０に対して、枠体および天板をこの順で積層することで形成される。金属膜１２０の表面は、流路１４１の底面となる。枠体の貫通孔の内面は、流路１４１の側面となる。天板の一方の面（内側の面）は、流路１４１の天面となる。 The detection device 100 may include a frame having a through hole and a top plate stacked on the frame instead of the flow path lid 140. In this case, the channel 141 is formed by laminating the frame body and the top plate in this order on the prism 110 on which the metal film 120 is formed. The surface of the metal film 120 becomes the bottom surface of the channel 141. The inner surface of the through hole of the frame body becomes the side surface of the flow channel 141. One surface (inner surface) of the top plate is the top surface of the channel 141.

なお、金属膜１２０の表面において、第１リガンド１３０が固定されている領域を反応場という。反応場では、後述のとおり、第１リガンド１３０およびアナライト１０の結合（１次反応）や、アナライト１０および第２リガンド１５０の結合（２次反応）、架橋剤１６０による第１リガンド１３０およびアナライト１０の架橋（架橋反応）などが行われる。 A region where the first ligand 130 is fixed on the surface of the metal film 120 is referred to as a reaction field. In the reaction field, as described later, the binding of the first ligand 130 and the analyte 10 (primary reaction), the binding of the analyte 10 and the second ligand 150 (secondary reaction), the first ligand 130 by the cross-linking agent 160, and The analyte 10 is subjected to crosslinking (crosslinking reaction) or the like.

次に、アナライト１０を検出するためのＳＰＦＳ装置２００について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置２００は、励起光照射部２１０、反射光検出部２２０、蛍光検出部２３０、送液部２４０、搬送部２５０および制御部２６０を有する。 Next, the SPFS apparatus 200 for detecting the analyte 10 will be described. As described above, the SPFS device 200 includes the excitation light irradiation unit 210, the reflected light detection unit 220, the fluorescence detection unit 230, the liquid feeding unit 240, the transport unit 250, and the control unit 260.

励起光照射部２１０は、チップホルダー２５２に保持された検出デバイス１００のプリズム１１０の入射面１１１に向けて励起光αを照射する。より具体的には、励起光照射部２１０は、検出デバイス１００のプリズム１１０側から第１リガンド１３０が固定されている領域（反応場）に対応する金属膜１２０の裏面に、励起光αを全反射角度となるように出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム１１０を介して金属膜１２０にＳＰＲが生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜１２０の表面上に生じさせる光である。 The excitation light irradiation unit 210 irradiates the excitation light α toward the incident surface 111 of the prism 110 of the detection device 100 held by the chip holder 252. More specifically, the excitation light irradiation unit 210 applies the excitation light α to the back surface of the metal film 120 corresponding to the region (reaction field) where the first ligand 130 is fixed from the prism 110 side of the detection device 100. The light is emitted so as to have a reflection angle. Here, the “excitation light” is light that directly or indirectly excites the fluorescent material. For example, the excitation light α is light that generates localized field light on the surface of the metal film 120 that excites the fluorescent material when the metal film 120 is irradiated through the prism 110 at an angle at which SPR occurs.

励起光照射部２１０は、光源２１１、第１角度調整部２１２および光源制御部２１３を有する。励起光照射部２１０は、さらにコリメートレンズや励起光フィルターなどを有していてもよい。 The excitation light irradiation unit 210 includes a light source 211, a first angle adjustment unit 212, and a light source control unit 213. The excitation light irradiation unit 210 may further include a collimating lens, an excitation light filter, and the like.

光源２１１は、検出デバイス１００の金属膜１２０に向けて励起光αを出射する。光源２１１の種類は、特に限定されない。光源２１１の種類の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。本実施の形態では、光源２１１は、レーザーダイオードである。また、照射スポットのサイズとしては、例えば１ｍｍφ程度であることが好ましい。 The light source 211 emits excitation light α toward the metal film 120 of the detection device 100. The type of the light source 211 is not particularly limited. Examples of types of light sources 211 include light emitting diodes, mercury lamps, and other laser light sources. In the present embodiment, the light source 211 is a laser diode. The size of the irradiation spot is preferably about 1 mmφ, for example.

第１角度調整部２１２は、プリズム１１０と金属膜１２０との界面（成膜面１１２）に対する励起光αの入射角を調整する。第１角度調整部２１２は、励起光αを金属膜１２０の所定の位置（第１リガンド１３０が配置されている領域に対応する金属膜１２０の裏側）に所定の入射角で照射させるために、励起光αの光軸とチップホルダーとを相対的に回転させる。本実施の形態では、第１角度調整部２１２は、光源２１１を励起光αの光軸と直交する軸を中心として回転させる。このとき、入射角を走査しても金属膜１２０（成膜面１１２）上での照射位置がほとんど移動しないように、回転軸の位置を設定する。たとえば、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面１１２上の照射位置とプリズム１１０の入射面１１１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。 The first angle adjustment unit 212 adjusts the incident angle of the excitation light α with respect to the interface (deposition surface 112) between the prism 110 and the metal film 120. The first angle adjustment unit 212 irradiates the excitation light α to a predetermined position of the metal film 120 (the back side of the metal film 120 corresponding to the region where the first ligand 130 is disposed) at a predetermined incident angle. The optical axis of the excitation light α and the chip holder are relatively rotated. In the present embodiment, the first angle adjustment unit 212 rotates the light source 211 around an axis orthogonal to the optical axis of the excitation light α. At this time, the position of the rotation axis is set so that the irradiation position on the metal film 120 (deposition surface 112) hardly moves even when the incident angle is scanned. For example, the position of the rotation center is set near the intersection of the optical axes of the two excitation lights α at both ends of the scanning range of the incident angle (between the irradiation position on the film formation surface 112 and the incident surface 111 of the prism 110). Thus, the deviation of the irradiation position can be minimized.

光源制御部２１３は、光源２１１を動作させる各種機器を制御して、光源２１１からの励起光αの出射を制御する。光源制御部２１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。 The light source control unit 213 controls various devices that operate the light source 211 to control the emission of the excitation light α from the light source 211. The light source control unit 213 includes, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.

反射光検出部２２０は、共鳴角の測定などを行うために、検出デバイス１００への励起光αの照射によって生じた反射光βの光量を測定する。反射光検出部２２０は、第１受光センサー２２１、第２角度調整部２２２および第１センサー制御部２２３を含む。 The reflected light detection unit 220 measures the amount of reflected light β generated by irradiating the detection device 100 with the excitation light α in order to measure the resonance angle. The reflected light detection unit 220 includes a first light receiving sensor 221, a second angle adjustment unit 222, and a first sensor control unit 223.

第１受光センサー２２１は、反射光βが入射する位置に配置され、反射光βの光量を測定する。第１受光センサー２２１の種類は、特に限定されない。たとえば、第１受光センサー２２１は、フォトダイオード（ＰＤ）である。 The first light receiving sensor 221 is disposed at a position where the reflected light β is incident, and measures the amount of the reflected light β. The type of the first light receiving sensor 221 is not particularly limited. For example, the first light receiving sensor 221 is a photodiode (PD).

第２角度調整部２２２は、金属膜１２０に対する励起光αの入射角に応じて、第２受光センサー２２１の位置（角度）を調整する。第２角度調整部２２２は、反射光βが第１受光センサー２２１に入射するように、第１受光センサー２２１とチップホルダー２５２とを相対的に回転させる。 The second angle adjustment unit 222 adjusts the position (angle) of the second light receiving sensor 221 according to the incident angle of the excitation light α with respect to the metal film 120. The second angle adjusting unit 222 relatively rotates the first light receiving sensor 221 and the chip holder 252 so that the reflected light β enters the first light receiving sensor 221.

第１センサー制御部２２３は、第１受光センサー２２１の出力値の検出や、検出した出力値による第１受光センサー２２１の感度の管理、適切な出力値を得るための第１受光センサー２２１の感度の変更、などを制御する。第１センサー制御部２２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。 The first sensor control unit 223 detects the output value of the first light receiving sensor 221, manages the sensitivity of the first light receiving sensor 221 based on the detected output value, and the sensitivity of the first light receiving sensor 221 for obtaining an appropriate output value. Control changes, etc. The first sensor control unit 223 includes, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.

蛍光検出部２３０は、励起光照射部２１０が金属膜１２０へ励起光αを照射したときに、アナライト１０を標識する蛍光物質２０から放出される蛍光γを検出する。蛍光検出部２３０は第１レンズ２３１、光学フィルター２３２、第２レンズ２３３、第２受光センサー２３４、第２センサー制御部２３５および位置切替機構２３６を有する。蛍光検出部２３０は、さらに集光レンズ群や開口絞り、蛍光フィルターなどを有していてもよい。 The fluorescence detection unit 230 detects the fluorescence γ emitted from the fluorescent material 20 that labels the analyte 10 when the excitation light irradiation unit 210 irradiates the excitation light α to the metal film 120. The fluorescence detection unit 230 includes a first lens 231, an optical filter 232, a second lens 233, a second light receiving sensor 234, a second sensor control unit 235, and a position switching mechanism 236. The fluorescence detection unit 230 may further include a condenser lens group, an aperture stop, a fluorescence filter, and the like.

第１レンズ２３１は、例えば、集光レンズであり、金属膜１２０上から出射される光を集光する。第２レンズ２３３は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ２３１で集光された光を第２受光センサー２３４の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター２３２は、両レンズの間に配置されている。 The first lens 231 is, for example, a condensing lens, and condenses light emitted from the metal film 120. The second lens 233 is, for example, an imaging lens, and forms an image of the light collected by the first lens 231 on the light receiving surface of the second light receiving sensor 234. The optical path between both lenses is a substantially parallel optical path. The optical filter 232 is disposed between both lenses.

光学フィルター２３２は、蛍光成分のみを第２受光センサー２３４に導き、高いＳＮ比で蛍光γを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光δ）を除去する。光学フィルター２３２の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター２３２は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。 The optical filter 232 guides only the fluorescence component to the second light receiving sensor 234, and removes the excitation light component (plasmon scattered light δ) in order to detect the fluorescence γ with a high S / N ratio. Examples of the optical filter 232 include an excitation light reflection filter, a short wavelength cut filter, and a band pass filter. The optical filter 232 is, for example, a filter including a multilayer film that reflects a predetermined light component, or a color glass filter that absorbs a predetermined light component.

第２受光センサー２３４は、金属膜１２０上に存在する蛍光物質２０から放出される蛍光γを検出して、金属膜１２０上の蛍光像を検出する。第２受光センサー２３４の種類は、特に限定されず、例えば、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管であり、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）やフォトダイオード（ＰＤ）、ＣＣＤイメージセンサーなどであってもよい。 The second light receiving sensor 234 detects the fluorescent image on the metal film 120 by detecting the fluorescence γ emitted from the fluorescent material 20 existing on the metal film 120. The type of the second light receiving sensor 234 is not particularly limited, and is, for example, a photomultiplier tube having high sensitivity and a high S / N ratio, such as an avalanche photodiode (APD), a photodiode (PD), or a CCD image sensor. Also good.

第２センサー制御部２３５は、第２受光センサー２３４の出力値の検出や、検出した出力値による第２受光センサー２３４の感度の管理、適切な出力値を得るための第２受光センサー２３４の感度の変更などを制御する。第２センサー制御部２３５は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。 The second sensor control unit 235 detects the output value of the second light receiving sensor 234, manages the sensitivity of the second light receiving sensor 234 based on the detected output value, and the sensitivity of the second light receiving sensor 234 for obtaining an appropriate output value. Control changes and so on. The second sensor control unit 235 includes, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.

位置切替機構２３６は、光学フィルター２３２の位置を、蛍光検出部２３０における光路上または光路外に切り替える。具体的には、第２受光センサー２３４が蛍光γを検出するときには、光学フィルター２３２を蛍光検出部２３０における光路上に配置し、第２受光センサー２３４がプラズモン散乱光δを検出するときには、光学フィルター２３２を蛍光検出部２３０における光路外に配置する。 The position switching mechanism 236 switches the position of the optical filter 232 on or off the optical path in the fluorescence detection unit 230. Specifically, when the second light receiving sensor 234 detects the fluorescence γ, the optical filter 232 is disposed on the optical path in the fluorescence detection unit 230, and when the second light receiving sensor 234 detects the plasmon scattered light δ, the optical filter 232 is arranged outside the optical path in the fluorescence detection unit 230.

送液部２４０は、チップホルダー２５２に保持された検出デバイス１００の金属膜１２０上に、検体や第２リガンド１５０を含む溶液、架橋剤１６０を含む溶液、洗浄液などを供給する。また、送液部２４０は、検出デバイス１００の金属膜１２０上の液体を除去する。送液部２４０は、液体チップ２４１、シリンジポンプ２４２および送液ポンプ駆動機構２４３を含む。 The liquid feeding unit 240 supplies a sample, a solution containing the second ligand 150, a solution containing the cross-linking agent 160, a cleaning solution, and the like onto the metal film 120 of the detection device 100 held by the chip holder 252. Further, the liquid feeding unit 240 removes the liquid on the metal film 120 of the detection device 100. The liquid feeding unit 240 includes a liquid chip 241, a syringe pump 242, and a liquid feeding pump driving mechanism 243.

液体チップ２４１は、検体や標識液、洗浄液などの液体を収容する容器である。液体チップ２４１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。本実施の形態では、液体チップ２４１は、検体、第２リガンド１５０を含む溶液、架橋剤１６０を含む溶液および洗浄液（緩衝液）をそれぞれ収容する。 The liquid chip 241 is a container for storing a liquid such as a specimen, a labeling liquid, or a cleaning liquid. As the liquid chip 241, a plurality of containers are usually arranged according to the type of liquid, or a chip in which a plurality of containers are integrated is arranged. In the present embodiment, the liquid chip 241 contains a specimen, a solution containing the second ligand 150, a solution containing the cross-linking agent 160, and a cleaning solution (buffer solution).

検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。アナライト１０の種類の例には、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。たとえば、第１リガンド１３０が抗体の場合は、アナライト１０はその抗体に対する抗原である。第１リガンド１３０が特定のタンパク質の場合は、アナライト１０はそのタンパク質に対する抗体である。第１リガンド１３０が特定の基質に結合する酵素の場合は、アナライト１０はその基質である。第１リガンド１３０が特定の酵素により結合される基質である場合は、アナライト１０はその酵素である。第１リガンド１３０がアビジンまたはストレプトアビジンの場合は、アナライト１０はビオチンである。第１リガンド１３０がビオチンの場合は、アナライト１０はアビジンまたはストレプトアビジンである。 Examples of the specimen include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, semen, and diluted solutions thereof. Examples of types of the analyte 10 include proteins (polypeptides and oligopeptides), amino acids, lipids, and modified molecules thereof. For example, when the first ligand 130 is an antibody, the analyte 10 is an antigen for the antibody. When the first ligand 130 is a specific protein, the analyte 10 is an antibody against the protein. In the case where the first ligand 130 is an enzyme that binds to a specific substrate, the analyte 10 is that substrate. If the first ligand 130 is a substrate that is bound by a particular enzyme, the analyte 10 is that enzyme. When the first ligand 130 is avidin or streptavidin, the analyte 10 is biotin. When the first ligand 130 is biotin, the analyte 10 is avidin or streptavidin.

第２リガンド１５０は、蛍光物質２０で標識されており、アナライト１０に特異的に結合することができる。これにより、アナライト１０および第２リガンド１５０が互いに接触したときに、アナライト１０が第２リガンド１５０を介して蛍光物質２０により標識される。第２リガンド１５０の種類は、アナライト１０に特異的に結合することができるものであれば特に限定されないが、後述するように第２リガンド１５０のように、架橋剤１６０により架橋されうるものであることが好ましい。第２リガンド１５０の例には、抗体や酵素、レクチン、アビジン、ストレプトアビジンなどのタンパク質、アミノ酸、糖鎖、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、脂質、これらの修飾分子、およびこれらの複合体が含まれる。第２リガンド１５０は、蛍光物質２０で標識されている点を除いては第１リガンド１３０と同じであってもよいし、異なっていてもよい。本実施の形態では第２リガンド１５０は、蛍光物質２０で標識されている点を除いては第１リガンド１３０と同じである。 The second ligand 150 is labeled with the fluorescent substance 20 and can specifically bind to the analyte 10. Thus, when the analyte 10 and the second ligand 150 come into contact with each other, the analyte 10 is labeled with the fluorescent material 20 via the second ligand 150. The type of the second ligand 150 is not particularly limited as long as it can specifically bind to the analyte 10. However, as described later, the second ligand 150 can be crosslinked by the crosslinking agent 160. Preferably there is. Examples of the second ligand 150 include antibodies, enzymes, proteins such as lectin, avidin, and streptavidin, amino acids, sugar chains, nucleic acids such as DNA and RNA, lipids, modified molecules thereof, and complexes thereof. . The second ligand 150 may be the same as or different from the first ligand 130 except that the second ligand 150 is labeled with the fluorescent substance 20. In the present embodiment, the second ligand 150 is the same as the first ligand 130 except that the second ligand 150 is labeled with the fluorescent material 20.

第２リガンド１５０を蛍光標識する方法は、特に限定されない。第２リガンド１５０を蛍光標識するには、例えば、カルボキシル基を有する蛍光物質２０と、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドとを縮合剤（例えば、水溶性カルボジイミド）を用いて縮合反応させて、カルボキシル基を活性エステル化した後、当該蛍光物質２０と、アミノ基を有する第２リガンド１５０とを縮合剤を用いて縮合反応させればよい。または、イソチオシアネート基およびアミノ基をそれぞれ有する第２リガンド１５０および蛍光物質２０を反応させればよく、スルホニルハライド基およびアミノ基をそれぞれ有する第２リガンド１５０および蛍光物質２０を反応させてもよく、ヨードアセトアミド基およびチオール基をそれぞれ有する第２リガンド１５０および蛍光物質２０を反応させてもよく、ビオチン化された蛍光物質２０と、ストレプトアビジン化された第２リガンド１５０とを反応させてもよい。 The method for fluorescently labeling the second ligand 150 is not particularly limited. In order to fluorescently label the second ligand 150, for example, a fluorescent substance 20 having a carboxyl group and N-hydroxysuccinimide are subjected to a condensation reaction using a condensing agent (for example, a water-soluble carbodiimide), and then the carboxyl group is formed. After the active esterification, the fluorescent substance 20 and the second ligand 150 having an amino group may be subjected to a condensation reaction using a condensing agent. Alternatively, the second ligand 150 and the fluorescent substance 20 each having an isothiocyanate group and an amino group may be reacted, and the second ligand 150 and the fluorescent substance 20 each having a sulfonyl halide group and an amino group may be reacted. The second ligand 150 and the fluorescent material 20 each having an iodoacetamide group and a thiol group may be reacted, or the biotinylated fluorescent material 20 and the streptavidinated second ligand 150 may be reacted.

架橋剤１６０は、少なくとも第１リガンド１３０およびアナライト１０を架橋する。架橋剤１６０は、アルデヒド基を有する有機化合物である。アナライト１０がタンパク質である場合、架橋剤１６０のアルデヒド基と、タンパク質の側鎖のアミノ基とが反応し、結合することで、第１リガンド１３０と、アナライト１０とを架橋することができる。また、架橋剤１６０は、第１リガンド１３０またはアナライト１０と、第２リガンド１５０とも架橋できることが好ましい。これにより、第１リガンド１３０からアナライト１０および／または第２リガンド１５０が解離して、蛍光物質２０が分散することを防ぐこともできる。架橋剤１６０の種類は、上記架橋反応を起こすことができれば特に限定されず、アナライト１０、第１リガンド１３０および第２リガンド１５０の種類に応じて適宜選択されうる。架橋剤１６０の種類の例には、ホルムアルデヒドやパラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどが含まれる。また、架橋剤１６０が有するアルデヒド基の数も、上記架橋反応を起こすことができれば特に限定されない。上記の架橋剤１６０は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。 The cross-linking agent 160 cross-links at least the first ligand 130 and the analyte 10. The crosslinking agent 160 is an organic compound having an aldehyde group. When the analyte 10 is a protein, the aldehyde group of the cross-linking agent 160 and the amino group of the side chain of the protein react and bind to each other, whereby the first ligand 130 and the analyte 10 can be cross-linked. . The cross-linking agent 160 is preferably capable of cross-linking the first ligand 130 or the analyte 10 and the second ligand 150. Thereby, it is possible to prevent the analyte 10 and / or the second ligand 150 from dissociating from the first ligand 130 and the fluorescent material 20 from being dispersed. The type of the crosslinking agent 160 is not particularly limited as long as it can cause the above-described crosslinking reaction, and may be appropriately selected according to the types of the analyte 10, the first ligand 130, and the second ligand 150. Examples of the type of the crosslinking agent 160 include formaldehyde, paraformaldehyde, glutaraldehyde, and the like. Further, the number of aldehyde groups included in the crosslinking agent 160 is not particularly limited as long as the crosslinking reaction can be caused. Said crosslinking agent 160 may be used independently and may be used in combination of 2 or more type.

シリンジポンプ２４２は、シリンジ２４４と、シリンジ２４４内を往復動作可能なプランジャー２４５とによって構成される。プランジャー２４５の往復運動によって、液体の吸引および吐出が定量的に行われる。シリンジ２４４が交換可能であると、シリンジ２４４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ２４４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ２４４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ２４４を交換せずに使用することが可能となる。 The syringe pump 242 includes a syringe 244 and a plunger 245 that can reciprocate within the syringe 244. By the reciprocating motion of the plunger 245, the liquid is sucked and discharged quantitatively. If the syringe 244 can be replaced, the syringe 244 need not be cleaned. For this reason, it is preferable from the viewpoint of preventing contamination of impurities. When the syringe 244 is not configured to be replaceable, it is possible to use the syringe 244 without replacing it by adding a configuration for cleaning the inside of the syringe 244.

送液ポンプ駆動機構２４３は、プランジャー２４５の駆動装置、およびシリンジポンプ２４２の移動装置を含む。シリンジポンプ２４２の駆動装置は、プランジャー２４５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ２４２の送液量や送液速度を管理できるため、検出デバイス１００の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ２４２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ２４２を、シリンジ２４４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ２４２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。 The liquid feed pump driving mechanism 243 includes a driving device for the plunger 245 and a moving device for the syringe pump 242. The drive device of the syringe pump 242 is a device for reciprocating the plunger 245, and includes, for example, a stepping motor. A drive device including a stepping motor is preferable from the viewpoint of managing the remaining liquid amount of the detection device 100 because it can manage the liquid feeding amount and the liquid feeding speed of the syringe pump 242. The moving device of the syringe pump 242 freely moves the syringe pump 242 in two directions, for example, an axial direction (for example, a vertical direction) of the syringe 244 and a direction crossing the axial direction (for example, a horizontal direction). The moving device of the syringe pump 242 is configured by, for example, a robot arm, a two-axis stage, or a turntable that can move up and down.

送液部２４０は、液体チップ１４１より各種液体を吸引し、検出デバイス１００の流路１４１内に供給する。このとき、プランジャー２４５を動かすことで、検出デバイス１００中の流路１４１内を液体が往復し、流路１４１内の液体が撹拌される。これにより、液体の濃度分布の均一化や、流路１４１内における反応（例えば、後述する１次反応、２次反応および架橋反応）の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、検出デバイス１００の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ２４４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、検出デバイス１００およびシリンジ２４４が構成されていることが好ましい。 The liquid feeding unit 240 sucks various liquids from the liquid chip 141 and supplies them into the flow channel 141 of the detection device 100. At this time, by moving the plunger 245, the liquid reciprocates in the flow path 141 in the detection device 100, and the liquid in the flow path 141 is stirred. As a result, it is possible to achieve uniform distribution of the liquid concentration and promotion of reactions in the flow channel 141 (for example, a primary reaction, a secondary reaction, and a crosslinking reaction described later). From the viewpoint of performing such an operation, the detection device 100 and the syringe 244 are configured so that the injection port of the detection device 100 is protected by a multilayer film and the injection port can be sealed when the syringe 244 penetrates the multilayer film. It is preferable to be configured.

搬送部２５０は、検出デバイス１００を設置位置、検出位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「設置位置」とは、検出デバイス１００をＳＰＦＳ装置２００に設置するための位置である。また、「検出位置」とは、励起光照射部２１０が検出デバイス１００に励起光αを照射し、それに伴い発生する反射光β、蛍光γまたはプラズモン散乱光δを反射光検出部２２０または蛍光検出部２３０が検出する位置である。さらに、「送液位置」とは、送液部２４０が検出デバイス１００の流路１４１内に液体を供給するか、または検出デバイス１００の流路１４１内の液体を除去する位置である。搬送部２５０は、搬送ステージ２５１およびチップホルダー２５２を含む。チップホルダー２５２は、搬送ステージ２５１に固定されており、検出デバイス１００を着脱可能に保持する。チップホルダー２５２の形状は、検出デバイス１００を保持することができ、かつ励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー２５２には、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ２５１は、チップホルダー２５２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ２５１も、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。搬送ステージ２５１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。 The transport unit 250 transports and fixes the detection device 100 to the installation position, the detection position, or the liquid feeding position. Here, the “installation position” is a position for installing the detection device 100 in the SPFS apparatus 200. Further, the “detection position” means that the excitation light irradiation unit 210 irradiates the detection device 100 with the excitation light α, and the reflected light β, fluorescence γ or plasmon scattered light δ generated accordingly is reflected light detection unit 220 or fluorescence detection. This is a position detected by the unit 230. Furthermore, the “liquid feeding position” is a position where the liquid feeding unit 240 supplies the liquid into the flow channel 141 of the detection device 100 or removes the liquid in the flow channel 141 of the detection device 100. The transport unit 250 includes a transport stage 251 and a chip holder 252. The chip holder 252 is fixed to the transfer stage 251 and holds the detection device 100 in a detachable manner. The shape of the chip holder 252 is a shape that can hold the detection device 100 and does not obstruct the optical paths of the excitation light α, the reflected light β, the fluorescence γ, and the plasmon scattered light δ. For example, the chip holder 252 is provided with an opening through which excitation light α, reflected light β, fluorescence γ, and plasmon scattered light δ pass. The transfer stage 251 moves the chip holder 252 in one direction and the opposite direction. The transport stage 251 also has a shape that does not obstruct the optical paths of the excitation light α, reflected light β, fluorescence γ, and plasmon scattered light δ. The transfer stage 251 is driven by, for example, a stepping motor.

制御部２６０は、第１角度調整部２１２、光源制御部２１３、第２角度調整部２２２、第１センサー制御部２２３、第２センサー制御部２３５、位置切替機構２３６および送液ポンプ駆動機構２４３の動作を制御する。また、制御部２６０は、蛍光検出部２３０からの出力信号（検出結果）を処理する処理部としても機能する。具体的には、処理部は、蛍光検出部２３０（第２受光センサー２３４）が検出した検出値に基づいて、アナライト１０の存在または量を示すシグナル値を算出する。制御部２６０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含み、ソフトウェアを実行するコンピュータである。 The control unit 260 includes a first angle adjustment unit 212, a light source control unit 213, a second angle adjustment unit 222, a first sensor control unit 223, a second sensor control unit 235, a position switching mechanism 236, and a liquid feed pump drive mechanism 243. Control the behavior. The control unit 260 also functions as a processing unit that processes an output signal (detection result) from the fluorescence detection unit 230. Specifically, the processing unit calculates a signal value indicating the presence or amount of the analyte 10 based on the detection value detected by the fluorescence detection unit 230 (second light receiving sensor 234). The control unit 260 includes, for example, an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device, and is a computer that executes software.

（アナライトの検出方法）
次に、ＳＰＦＳ装置２００の検出動作（本実施の形態に係る検出方法）について説明する。図２は、ＳＰＦＳ装置２００の動作手順の一例を示すフローチャートである。図３は、本実施の形態に係る検出方法を説明するための模式図である。 (Analyte detection method)
Next, the detection operation (detection method according to the present embodiment) of the SPFS device 200 will be described. FIG. 2 is a flowchart illustrating an example of an operation procedure of the SPFS apparatus 200. FIG. 3 is a schematic diagram for explaining the detection method according to the present embodiment.

まず、検出の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、検出デバイス１００を準備して、ＳＰＦＳ装置２００のチップホルダー２５２に設置する。また、検出デバイス１００の金属膜１２０上に保湿剤が存在する場合は、アナライト１０が適切に第１リガンド１３０に結合できるように、金属膜１２０上を洗浄して保湿剤を除去する。 First, preparation for detection is performed (step S10). Specifically, the detection device 100 is prepared and installed in the chip holder 252 of the SPFS apparatus 200. Further, when a humectant is present on the metal film 120 of the detection device 100, the humectant is removed by washing the metal film 120 so that the analyte 10 can appropriately bind to the first ligand 130.

次いで、検体を金属膜１２０上に提供してアナライト１０を第１リガンド１３０に結合させる（工程Ｓ２０）。具体的には、制御部２６０は、搬送ステージ２５１を操作して、検出デバイス１００を設置位置から送液位置に移動させる。この後、制御部２６０は、送液ポンプ駆動機構２４３を操作して、液体チップ２４１内の検体を金属膜１２０（流路１４１内の反応場）上に提供する。これにより、検体中のアナライト１０を第１リガンド１３０に接触させ、結合させることができる（１次反応）。 Next, the specimen is provided on the metal film 120 to bind the analyte 10 to the first ligand 130 (step S20). Specifically, the control unit 260 operates the transport stage 251 to move the detection device 100 from the installation position to the liquid feeding position. Thereafter, the control unit 260 operates the liquid feed pump drive mechanism 243 to provide the specimen in the liquid chip 241 on the metal film 120 (reaction field in the channel 141). As a result, the analyte 10 in the specimen can be brought into contact with and bound to the first ligand 130 (primary reaction).

次いで、第２リガンド１５０をアナライト１０に結合させる（工程Ｓ３０）。具体的には、制御部２６０は、送液ポンプ駆動機構２４３を操作して、流路１４１内から検体を除去した後、液体チップ２４１内の第２リガンド１５０を含む溶液を金属膜１２０（流路１４１内の反応場）上に提供する。第２リガンド１５０は、蛍光物質２０で標識されており、アナライト１０に特異的に結合しうる。したがって、第２リガンド１５０を第１リガンドに結合しているアナライト１０に接触させ、結合させることができる。これにより、第２リガンド１５０を介してアナライト１０を蛍光物質２０で標識することができる（２次反応）。 Next, the second ligand 150 is bound to the analyte 10 (step S30). Specifically, the control unit 260 operates the liquid feed pump drive mechanism 243 to remove the specimen from the flow path 141, and then transfers the solution containing the second ligand 150 in the liquid chip 241 to the metal film 120 (flow (Reaction field in the channel 141). The second ligand 150 is labeled with the fluorescent substance 20 and can specifically bind to the analyte 10. Accordingly, the second ligand 150 can be brought into contact with and bound to the analyte 10 bound to the first ligand. Thereby, the analyte 10 can be labeled with the fluorescent substance 20 through the second ligand 150 (secondary reaction).

なお、１次反応と２次反応の順番は、後述する架橋剤１６０を提供する工程（工程Ｓ４０）の前であれば、これに限定されない。たとえば、第２リガンド１５０をアナライト１０に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜１２０上に提供してもよい。また、金属膜１２０上に検体と第２リガンド１５０を含有する溶液を同時に提供してもよい。 In addition, if the order of a primary reaction and a secondary reaction is before the process (process S40) which provides the crosslinking agent 160 mentioned later, it will not be limited to this. For example, a liquid containing these complexes may be provided on the metal film 120 after the second ligand 150 is bound to the analyte 10. Further, a solution containing the specimen and the second ligand 150 may be provided on the metal film 120 at the same time.

次いで、第１リガンド１３０、アナライト１０および第２リガンド１５０を架橋する（工程Ｓ４０）。具体的には、制御部２６０は、送液ポンプ駆動機構２４３を操作して、流路１４１内から第２リガンド１５０を含む溶液を除去した後、液体チップ２４１内の架橋剤１６０を含む溶液を金属膜１２０（流路１４１内の反応場）上に提供する。図３に示されるように、架橋剤１６０は、第１リガンド１３０、アナライト１０および第２リガンド１５０に非特異的に結合する。これにより、第１リガンド１３０およびアナライト１０を架橋することができる（架橋Ａ）。本実施の形態では、これと同時に、アナライト１０および第２リガンド１５０も架橋することができる（架橋Ｂ）。また、本実施の形態のように１次反応と２次反応とを行った後に架橋剤１６０を提供した場合には、さらに近隣の第１リガンド１３０相互（架橋Ｃ）、近隣のアナライト相互（架橋Ｄ）、あるいは近隣の第２リガンド１５０相互（架橋Ｅ）、ならびに第１リガンド１３０および第２リガンド１５０（架橋Ｆ）の一部も架橋することができ、好ましい。結果として、架橋剤１６０は、第１リガンド１３０とアナライト１０との解離およびアナライト１０と第２リガンド１５０との解離を抑制することができる。 Next, the first ligand 130, the analyte 10, and the second ligand 150 are cross-linked (step S40). Specifically, the controller 260 operates the liquid feed pump drive mechanism 243 to remove the solution containing the second ligand 150 from the flow path 141, and then the solution containing the cross-linking agent 160 in the liquid chip 241. Provided on the metal film 120 (reaction field in the channel 141). As shown in FIG. 3, the cross-linking agent 160 binds nonspecifically to the first ligand 130, the analyte 10 and the second ligand 150. Thereby, the 1st ligand 130 and the analyte 10 can be bridge | crosslinked (bridge | crosslinking A). In the present embodiment, simultaneously with this, the analyte 10 and the second ligand 150 can also be crosslinked (crosslinking B). Further, when the crosslinking agent 160 is provided after the primary reaction and the secondary reaction as in the present embodiment, the neighboring first ligands 130 (crosslinking C), the neighboring analytes ( Cross-linking D), or neighboring second ligands 150 (cross-linking E), and part of the first ligand 130 and the second ligand 150 (cross-linking F) can also be cross-linked, which is preferable. As a result, the cross-linking agent 160 can suppress the dissociation between the first ligand 130 and the analyte 10 and the dissociation between the analyte 10 and the second ligand 150.

次いで、アナライト１０を標識する蛍光物質２０から放出される蛍光γを検出する（工程Ｓ５０）。具体的には、制御部２６０は、送液ポンプ駆動機構２４３を操作して、流路１４１内から架橋剤１６０を含む溶液を除去する。この後、制御部２６０は、励起光照射部２１０を操作して第１リガンド１３０が固定された領域（反応場）に対応する金属膜１２０の裏面にＳＰＲが生じるように励起光αを照射するとともに、第２受光センサー２３４の検出値を記録する。このとき、制御部２６０は、第１角度調整部２１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部２６０は、位置切替機構２３６を制御して、光学フィルター２３２を蛍光検出部２３０における光路内に配置する。これにより、制御部（処理部）２６０は、検体中のアナライト１０の量を示す蛍光γの光量を得る。 Next, the fluorescence γ emitted from the fluorescent substance 20 that labels the analyte 10 is detected (step S50). Specifically, the control unit 260 operates the liquid feed pump drive mechanism 243 to remove the solution containing the crosslinking agent 160 from the flow path 141. Thereafter, the control unit 260 operates the excitation light irradiation unit 210 to irradiate the excitation light α so that SPR is generated on the back surface of the metal film 120 corresponding to the region (reaction field) where the first ligand 130 is fixed. At the same time, the detection value of the second light receiving sensor 234 is recorded. At this time, the control unit 260 operates the first angle adjustment unit 212 to set the incident angle of the excitation light α to the enhancement angle. Further, the control unit 260 controls the position switching mechanism 236 to arrange the optical filter 232 in the optical path in the fluorescence detection unit 230. Thereby, the control unit (processing unit) 260 obtains the amount of fluorescence γ indicating the amount of the analyte 10 in the sample.

最後に、アナライト１０の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ６０）。具体的には、制御部（処理部）２６０は、第２受光センサー２３４の検出値と、あらかじめ作成しておいた検量線とを比較してアナライト１０の存在または量を示すシグナル値を算出する。 Finally, a signal value indicating the presence or amount of the analyte 10 is calculated (step S60). Specifically, the control unit (processing unit) 260 compares the detection value of the second light receiving sensor 234 with a calibration curve prepared in advance, and calculates a signal value indicating the presence or amount of the analyte 10. To do.

以上の手順により、第１リガンド１３０とアナライト１０との解離およびアナライト１０と第２リガンド１５０との解離を抑制しつつ、検体に含まれるアナライト１０の存在または量を高感度かつ高精度で検出することができる。 The above procedure suppresses dissociation between the first ligand 130 and the analyte 10 and the dissociation between the analyte 10 and the second ligand 150, and detects the presence or amount of the analyte 10 contained in the specimen with high sensitivity and high accuracy. Can be detected.

なお、本実施の形態に係る検出方法では、第２リガンド１５０をアナライト１０に結合させる工程（工程Ｓ３０）の前に、必要に応じて増強角の測定を行ってもよい。具体的には、制御部２６０は、励起光照射部２１０および第１角度調整部２１２を操作して励起光αを第１リガンド１３０が固定された領域（反応場）に対応する金属膜１２０の裏面に照射しながら、金属膜１２０に対する励起光αの入射角（例えば７１°±３°）を走査する。また、制御部２６０は、蛍光検出部２３０を操作して第２受光センサー２３４が金属膜１２０の近傍から放出されるプラズモン散乱光δを検出する。これにより、制御部２６０は、励起光αの入射角と、プラズモン散乱光δの強度との関係を含むデータを得る。そして、制御部２６０は、データを解析して、プラズモン散乱光δの強度が最大となる入射角（増強角；本実施の形態では７１°）を決定する。 In the detection method according to the present embodiment, the enhancement angle may be measured as necessary before the step of binding the second ligand 150 to the analyte 10 (step S30). Specifically, the control unit 260 operates the excitation light irradiation unit 210 and the first angle adjustment unit 212 to change the excitation light α of the metal film 120 corresponding to the region (reaction field) where the first ligand 130 is fixed. While irradiating the back surface, the incident angle (for example, 71 ° ± 3 °) of the excitation light α with respect to the metal film 120 is scanned. In addition, the control unit 260 operates the fluorescence detection unit 230 to detect the plasmon scattered light δ emitted from the vicinity of the metal film 120 by the second light receiving sensor 234. Thereby, the control unit 260 obtains data including the relationship between the incident angle of the excitation light α and the intensity of the plasmon scattered light δ. Then, control unit 260 analyzes the data and determines an incident angle (intensification angle; 71 ° in the present embodiment) at which the intensity of plasmon scattered light δ is maximized.

また、本実施の形態に係る検出方法では、第２リガンド１５０をアナライト１０に結合させる工程（工程Ｓ３０）の前に、必要に応じて光学ブランク値の測定を行ってもよい。ここで「光学ブランク値」とは、蛍光γの測定（工程Ｓ５０）において検出デバイス１００の上方に放出される背景光の光量を意味する。具体的には、制御部２６０は、蛍光検出部２３０を操作して、金属膜１２０に励起光αを照射するとともに、第２受光センサー２３４の出力値（光学ブランク値）を記録する。このとき、制御部２６０は、第１角度調整部２１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部２６０は、位置切替機構２３６を制御して、光学フィルター２３２を蛍光検出部２３０における光路内に配置する。 In the detection method according to the present embodiment, the optical blank value may be measured as necessary before the step of binding the second ligand 150 to the analyte 10 (step S30). Here, the “optical blank value” means the amount of background light emitted above the detection device 100 in the measurement of fluorescence γ (step S50). Specifically, the control unit 260 operates the fluorescence detection unit 230 to irradiate the metal film 120 with the excitation light α and records the output value (optical blank value) of the second light receiving sensor 234. At this time, the control unit 260 operates the first angle adjustment unit 212 to set the incident angle of the excitation light α to the enhancement angle. Further, the control unit 260 controls the position switching mechanism 236 to arrange the optical filter 232 in the optical path in the fluorescence detection unit 230.

（効果）
以上のとおり、本実施の形態に係る検出方法では、架橋剤１６０として、アルデヒド基を有する有機化合物を準備しておけばよく、従来の検出方法のように、第１リガンド１３０および第２リガンド１５０の種類に応じたナノ構造体をあらかじめ準備しておく必要がない。したがって、本実施の形態に係る検出方法では、より容易に第１リガンド１３０とアナライト１０との解離およびアナライト１０と第２リガンド１５０との解離を抑制することができ、アナライト１０を高感度かつ高精度に検出することができる。 (effect)
As described above, in the detection method according to the present embodiment, an organic compound having an aldehyde group may be prepared as the cross-linking agent 160. As in the conventional detection method, the first ligand 130 and the second ligand 150 are used. There is no need to prepare a nanostructure according to the kind of the material beforehand. Therefore, in the detection method according to the present embodiment, the dissociation between the first ligand 130 and the analyte 10 and the dissociation between the analyte 10 and the second ligand 150 can be more easily suppressed. Sensitivity can be detected with high accuracy.

また、本実施の形態に係る検出方法では、架橋によって第１リガンド１３０とアナライト１０との解離を抑制するため、第１リガンド１３０とアナライト１０との結合力が弱くても、適切に第１リガンド１３０とアナライト１０との解離を抑制することができる。 Further, in the detection method according to the present embodiment, the dissociation between the first ligand 130 and the analyte 10 is suppressed by cross-linking, so that the first ligand 130 and the analyte 10 can be appropriately treated even if the binding force between the first ligand 130 and the analyte 10 is weak. Dissociation between one ligand 130 and the analyte 10 can be suppressed.

なお、上記の検出デバイス１００および架橋剤１６０は、アナライト１０を検出するための検出キットとして使用されうる。このとき、第２リガンド１５０および架橋剤１６０は、溶液として別々の容器に収容された状態で検出キットを構成する。なお、検出キットは、さらに検量線作成用の標準物質や取扱説明書などのアナライト１０の検出に必要な器材を有していてもよい。これにより、ユーザーは、当該検出キットを使用してアナライト１０の検出を容易に、好感度かつ高精度に行うことができる。 The detection device 100 and the crosslinking agent 160 described above can be used as a detection kit for detecting the analyte 10. At this time, the 2nd ligand 150 and the crosslinking agent 160 comprise a detection kit in the state accommodated in the separate container as a solution. The detection kit may further include equipment necessary for detecting the analyte 10, such as a standard substance for preparing a calibration curve and an instruction manual. Accordingly, the user can easily detect the analyte 10 with good sensitivity and high accuracy using the detection kit.

また、本実施の形態では、ＰＣ−ＳＰＦＳを利用した検出方法について説明したが、本発明に係る検出方法は、これに限定されず、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用してもよい。この場合、プリズム１１０は不要であり、金属膜１２０は回折格子を含む。第１リガンド１３０は、回折格子上に配置される。また、励起光照射部２１０および蛍光検出部２３０は、検出デバイス１００の金属膜１２０側において、励起光αの光軸と金属膜１２０との交点を通り、かつ金属膜１２０の表面に対する法線を挟むように互いに配置される。蛍光γの検出（工程Ｓ５０）では、回折格子に向けて励起光αを照射する。 Moreover, although this Embodiment demonstrated the detection method using PC-SPFS, the detection method which concerns on this invention is not limited to this, You may utilize GC-SPFS. In this case, the prism 110 is unnecessary, and the metal film 120 includes a diffraction grating. The first ligand 130 is disposed on the diffraction grating. In addition, the excitation light irradiation unit 210 and the fluorescence detection unit 230 pass through the intersection of the optical axis of the excitation light α and the metal film 120 on the metal film 120 side of the detection device 100, and set a normal to the surface of the metal film 120. They are arranged so as to sandwich each other. In the detection of fluorescence γ (step S50), the excitation light α is irradiated toward the diffraction grating.

また、本実施の形態では、ＳＰＦＳを利用した検出方法について説明したが、本発明に係る検出方法は、これに限定されない。たとえば、本発明に係る検出方法では、ＳＰＲ法を利用してもよい。この場合、蛍光γの検出の代わりに反射光βを検出する。したがって、２次反応（工程Ｓ３０）は、不要である。また、検出装置は、蛍光検出部を有さず、反射光検出部２２０（第１受光センサー２２１）が反射光βを検出する。この場合は、アナライト１０と第２リガンド１５０とを結合させないため、架橋剤は、第１リガンド１３０とアナライト１０とを架橋する。このように第２リガンド１５０を使用しない場合も、架橋剤により第１リガンド１３０とアナライト１０とを架橋することで、第１リガンド１３０とアナライト１０との解離を抑制することができ、アナライト１０を高感度かつ高精度で検出することができる。 Moreover, although this Embodiment demonstrated the detection method using SPFS, the detection method which concerns on this invention is not limited to this. For example, the detection method according to the present invention may use the SPR method. In this case, the reflected light β is detected instead of the fluorescence γ. Therefore, the secondary reaction (step S30) is unnecessary. Further, the detection device does not have a fluorescence detection unit, and the reflected light detection unit 220 (first light receiving sensor 221) detects the reflected light β. In this case, since the analyte 10 and the second ligand 150 are not bonded, the cross-linking agent cross-links the first ligand 130 and the analyte 10. Even when the second ligand 150 is not used as described above, the dissociation between the first ligand 130 and the analyte 10 can be suppressed by crosslinking the first ligand 130 and the analyte 10 with a crosslinking agent. The light 10 can be detected with high sensitivity and high accuracy.

また、本実施の形態では、第２リガンド１５０の標識物質として蛍光物質２０を使用したが、本発明に係る検出方法および検出キットは、これに限定されない。例えば、第２リガンドの標識物質として、酵素を使用してもよい（例えばＥＬＩＳＡ）。この場合、蛍光γの検出の代わりに、酵素および酵素基質による呈色を確認すればよい。したがって、蛍光γの検出（工程Ｓ５０）およびシグナル値の算出（工程Ｓ６０）は、不要である。また、プリズム１１０および金属膜１２０は、不要である。 In the present embodiment, the fluorescent substance 20 is used as the labeling substance for the second ligand 150, but the detection method and the detection kit according to the present invention are not limited to this. For example, an enzyme may be used as a labeling substance for the second ligand (for example, ELISA). In this case, the coloration by the enzyme and the enzyme substrate may be confirmed instead of detecting the fluorescent γ. Therefore, detection of fluorescence γ (step S50) and calculation of a signal value (step S60) are unnecessary. Moreover, the prism 110 and the metal film 120 are unnecessary.

本発明に係る検出方法および検出キットは、アナライトを高い信頼性で検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。 Since the detection method and detection kit according to the present invention can detect analytes with high reliability, they are useful, for example, for testing diseases.

１０アナライト
２０蛍光物質
１００検出デバイス
１１０プリズム
１１１入射面
１１２成膜面
１１３出射面
１２０金属膜
１３０第１リガンド
１４０流路蓋
１４１流路
１５０第２リガンド
１６０架橋剤
２００表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
２１０励起光照射部
２１１光源
２１２第１角度調整部
２１３光源制御部
２２０反射光検出部
２２１第１受光センサー
２２２第２角度調整部
２２３第１センサー制御部
２３０蛍光検出部
２３１第１レンズ
２３２光学フィルター
２３３第２レンズ
２３４第２受光センサー
２３５第２センサー制御部
２３６位置切替機構
２４０送液部
２４１液体チップ
２４２シリンジポンプ
２４３送液ポンプ駆動機構
２４４シリンジ
２４５プランジャー
２５０搬送部
２５１搬送ステージ
２５２チップホルダー
２６０制御部（処理部）
α 励起光
β 反射光
γ 蛍光
δ プラズモン散乱光
Ａ〜Ｆ架橋 DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Analyte 20 Fluorescent substance 100 Detection device 110 Prism 111 Incident surface 112 Film-forming surface 113 Output surface 120 Metal film 130 First ligand 140 Channel lid 141 Channel 150 Second ligand 160 Crosslinker 200 Surface plasmon enhanced fluorescence measuring apparatus ( SPFS device)
210 Excitation light irradiation unit 211 Light source 212 First angle adjustment unit 213 Light source control unit 220 Reflected light detection unit 221 First light receiving sensor 222 Second angle adjustment unit 223 First sensor control unit 230 Fluorescence detection unit 231 First lens 232 Optical filter 233 Second lens 234 Second light receiving sensor 235 Second sensor control unit 236 Position switching mechanism 240 Liquid feed unit 241 Liquid chip 242 Syringe pump 243 Liquid feed pump drive mechanism 244 Syringe 245 Plunger 250 Transport unit 251 Transport stage 252 Chip holder 260 Control unit (processing unit)
α Excitation light β Reflected light γ Fluorescence δ Plasmon scattered light A to F Cross-linking

Claims

A method for detecting an analyte in a sample using a detection device comprising a support and a first ligand immobilized on one surface of the support and capable of specifically binding to the analyte. ,
Providing a specimen on the support of the detection device to bind the analyte contained in the specimen to the first ligand;
Providing a crosslinking agent which is an organic compound having an aldehyde group on the support, and crosslinking the first ligand and the analyte;
A detection method.

The detection method according to claim 1, wherein the crosslinking agent is formaldehyde, paraformaldehyde, glutaraldehyde, or a combination thereof.

Before or after the step of binding the analyte to the first ligand, and before the step of providing the cross-linking agent, the first labeled with a labeling substance and capable of specifically binding to the analyte. Binding two ligands to the analyte;
After the step of providing the cross-linking agent, detecting a signal derived from the labeling substance;
Further having
The detection method according to claim 1 or claim 2.

The detection device includes a prism made of a dielectric, and a metal film as the support disposed on the prism,
The labeling substance is a fluorescent substance,
In the step of detecting the signal, fluorescence emitted from the fluorescent material is detected when the back surface of the metal film corresponding to the region where the first ligand is fixed is irradiated with excitation light through the prism. ,
The detection method according to claim 3.

The support is a metal film including a diffraction grating in a region where the first ligand is fixed;
The labeling substance is a fluorescent substance,
The step of detecting the signal detects fluorescence emitted from the fluorescent material when the diffraction grating is irradiated with excitation light.
The detection method according to claim 3.

A detection kit for detecting an analyte in a sample,
A detection device comprising: a support; and a first ligand immobilized on one surface of the support and capable of specifically binding to an analyte;
A crosslinking agent which is an organic compound having an aldehyde group;
Having
Detection kit.

The detection kit according to claim 6, wherein the crosslinking agent is formaldehyde, paraformaldehyde, glutaraldehyde, or a combination thereof.

The detection kit according to claim 6 or 7, further comprising a second ligand labeled with a labeling substance and capable of specifically binding to the analyte.

The detection device includes a prism made of a dielectric, and a metal film as the support disposed on the prism,
The labeling substance is a fluorescent substance,
The detection kit according to claim 8.

The support is a metal film including a diffraction grating in a region where the first ligand is fixed;
The labeling substance is a fluorescent substance,
The detection kit according to claim 8.