JP2016106077A - 代謝障害に関するターゲッティングマイクロｒｎａ - Google Patents

代謝障害に関するターゲッティングマイクロｒｎａ Download PDF

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Abstract

【課題】代謝障害、特に血糖値上昇の防止、低減する治療の為の方法及び組成物の提供。【解決手段】（ｉ）被験者における血糖値を低減すること、または、（ｉｉ）被験者における血糖値上昇の開始を防止するかまたは遅延すること、において使用するための医薬品の製造における、ｍｉＲ−１０３及び／又はｍｉＲ−１０７の核酸塩基配列と少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドの使用。【選択図】なし

Description

（配列表）
本出願は、電子フォーマットでの配列表を伴って出願されたものである。配列表は、４Ｋｂのサイズで、ＥＴＨＺ０００１ＷＯＳＥＱ．ｔｘｔという表題のファイル（２０１０年５月１９日作成）として提示される。配列表の電子フォーマットでの情報は、参照により本明細書中で援用される。
代謝障害の治療のための方法および組成物が、本明細書中で提供される。
「成熟ｍｉＲＮＡ」としても知られているマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、植物および動物のゲノムにおいてコードされる小型（約１８〜２４ヌクレオチド長）非コードＲＮＡ分子である。ある場合には、高度に保存された内因的発現ｍｉＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）と結合することにより、遺伝子の発現を調節する。１０００より多くの異なるｍｉＲＮＡが、植物および動物において同定されている。ある成熟ｍｉＲＮＡは、しばしば数百ヌクレオチド長である長い内因性一時ｍｉＲＮＡ転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉｒ、ｐｒｉ−ｍｉＲまたはｐｒｉ−ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとしても既知である）から生じると思われる（Lee, et al., EMBO J., 2002, 21(17), 4663-4670）。
これらの小型非コードＲＮＡが、動物におけることなる生理学的過程、例えば発生時機、器官形成、分化、パターン化、胚形成、成長制御およびプログラムされた細胞死に寄与する、ということをｍｉＲＮＡの機能的分析は明示している。ｍｉＲＮＡが関与する特定の過程の例としては、幹細胞分化、神経形成、血管新生、造血およびエキソサイトーシスが挙げられる（Alvarez-Garcia and Miska, Development, 2005, 132, 4653-4662により再検討されている）。
ｍｉＲＮＡのファミリーは、シード配列として既知の領域であるｍｉＲＮＡの位置２〜８でのヌクレオチド同一性により特性化され得る。いくつかのｍｉＲＮＡファミリー、ならびにｍｉＲＮＡスーパーファミリー（関連シード配列により特性化される）を、Lewis等は記載する（Lewis et al. Cell. 2005, 120(1）: 15-20)。マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲＮＡ−１０７は、同一のシード量基を有するので、ファミリー成員である。したがって、これら２つのマイクロＲＮＡは、同一でないとしても、類似の組の標的遺伝子を調節する。
本明細書中では、代謝障害ならびに代謝障害に関連した症状を治療するための方法であって、マイクロＲＮＡに対して標的化されるオリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを包含する方法が提供される。ある実施形態では、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１０３である。ある実施形態では、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１０７である。
本明細書中では、被験者の血糖値を低減するための方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者の血糖値を低減することを包含する方法が提供される。
本明細書中では、被験者の血糖値を低減するための方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者の血糖値を低減することを包含する方法が提供される。
ある実施形態では、被験者は血糖値上昇を示す。ある実施形態では、方法は、被験者の血糖値を測定することを包含する。ある実施形態では、方法は、血糖値上昇を示す被験者を選択することを包含する。ある実施形態では、血糖値は空腹時血糖値である。ある実施形態では、血糖値は食後血糖値である。ある実施形態では、血糖値は全血血糖値である。ある実施形態では、血糖値は血漿血糖値である。
ある実施形態では、血糖値は２００ｍｇ／ｄＬより低い値に低減される。ある実施形態では、血糖値は１７５ｍｇ／ｄＬより低い値に低減される。ある実施形態では、血糖値は１５０ｍｇ／ｄＬより低い値に低減される。ある実施形態では、血糖値は１２５ｍｇ／ｄＬより低い値に低減される。ある実施形態では、血糖値は１２０ｍｇ／ｄＬより低い値に低減される。ある実施形態では、血糖値は１１５ｍｇ／ｄＬより低い値に低減される。ある実施形態では、血糖値は１１０ｍｇ／ｄＬより低い値に低減される。ある実施形態では、血糖値は１０５ｍｇ／ｄＬより低い値に低減される。ある実施形態では、血糖値は１００ｍｇ／ｄＬより低い値に低減される。ある実施形態では、血糖値は１１０ｍｇ／ｄＬより低い値に低減される。
本明細書中では、血糖値上昇を発症する危険がある被験者における血糖値上昇の開始を防止するかまたは遅延するための方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者における血糖値上昇の開始を防止するかまたは遅延することを包含する方法が提供される。
本明細書中では、血糖値上昇を発症する危険がある被験者における血糖値上昇の開始を防止するかまたは遅延するための方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者における血糖値上昇の開始を防止するかまたは遅延することを包含する方法が提供される。
本明細書中では、被験者における糖新生の低減方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者における糖新生を低減することを包含する方法が提供される。ある実施形態では、被験者は糖新生を示す。
本明細書中では、被験者における糖新生の低減方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者における糖新生を低減することを包含する方法が提供される。
本明細書中では、被験者におけるインスリン感受性の改善方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者におけるインスリン感受性を改善することを包含する方法が提供される。ある実施形態では、被験者はインスリン抵抗性を有する。ある実施形態では、方法は、インスリン抵抗性を有する被験者を選択することを包含する。
本明細書中では、被験者におけるインスリン感受性の改善方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者におけるインスリン感受性を改善することを包含する方法が提供される。
本明細書中では、インスリン抵抗性を発症する危険がある被験者においてインスリン抵抗性の開始を防止するかまたは遅延するための方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者におけるインスリン抵抗性の開始を防止するかまたは遅延することを包含する方法が提供される。ある実施形態では、方法は、インスリン抵抗性を発症する危険がある被験者を選択することを包含する。
本明細書中では、インスリン抵抗性を発症する危険がある被験者においてインスリン抵抗性の開始を防止するかまたは遅延するための方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者におけるインスリン抵抗性の開始を防止するかまたは遅延することを包含する方法が提供される。
本明細書中では、被験者における糖耐性の改善方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより糖耐性を改善することを包含する方法が提供される。ある実施形態では、被験者は糖耐性減損を有する。ある実施形態では、方法は、糖耐性減損を有する被験者を選択することを包含する。
本明細書中では、被験者における糖耐性の改善方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより糖耐性を改善することを包含する方法が提供される。
本明細書中では、被験者における血漿コレステロール値の減少方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者における血漿コレステロールを減少することを包含する方法が提供される。ある実施形態では、被験者は血漿コレステロール値上昇を示す。ある実施形態では、方法は、血漿コレステロール値上昇を示す被験者を選択することを包含する。ある実施形態では、血漿コレステロールはＬＤＬコレステロールである。ある実施形態では、血漿コレステロールはＶＬＤＬコレステロールである。
本明細書中で提供される方法のいずれかにおいて、被験者は代謝障害を有し得る。
本明細書中では、被験者における少なくとも１つの代謝障害の治療方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を代謝障害を有する被験者に投与し、それにより代謝障害を治療することを包含する方法が提供される。
本明細書中では、被験者における少なくとも１つの代謝障害の治療方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を代謝障害を有する被験者に投与し、それにより代謝障害を治療することを包含する方法が提供される。
本明細書中では、代謝障害を発症する危険がある被験者における少なくとも１つの代謝障害の開始を防止するかまたは遅延する方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者における代謝障害の開始を防止するかまたは遅延することを包含する方法が提供される。
本明細書中では、代謝障害を発症する危険がある被験者における少なくとも１つの代謝障害の開始を防止するかまたは遅延する方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者における代謝障害の開始を防止するかまたは遅延することを包含する方法が提供される。
ある実施形態では、少なくとも１つの代謝障害は、糖尿病前症、糖尿病、代謝性症候群、肥満症、糖尿病性異脂肪血症、高脂血症、高血圧症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、高コレステロール血症および高インスリン血症の中から選択される。
ある実施形態では、投与することは非経口投与を含む。ある実施形態では、非経口投与は静脈内投与または皮下投与を含む。ある実施形態では、投与することは経口投与を含む。
ある実施形態では、投与することは、少なくとも１つの付加的療法を施すことを包含する。ある実施形態では、少なくとも１つの付加的療法は血糖降下薬である。ある実施形態では、血糖降下薬は、ＰＰＡＲアゴニスト（ガンマ、デュアルまたはパン）、ジペプチジルペプチダーゼ（ＩＶ）阻害薬、ＧＬＰ−Ｉ類似体、インスリンまたはインスリン類似体、インスリン分泌促進薬、ＳＧＬＴ２阻害薬、ヒトアミリン類似体、ビグアニド、アルファ−グルコシダーゼ阻害薬、メグリチニド、チアゾリジンジオンおよびスルホニル尿素の中から選択される。ある実施形態では、少なくとも１つの付加的療法は脂質低下薬である。ある実施形態では、少なくとも１つの付加的療法は化合物と同時に投与される。ある実施形態では、少なくとも１つの付加的療法は化合物より低頻度で投与される。ある実施形態では、少なくとも１つの付加的療法は化合物より高頻度で投与される。ある実施形態では、少なくとも１つの付加的療法は化合物の投与の前に投与される。ある実施形態では、少なくとも１つの付加的療法は化合物の投与後に投与される。ある実施形態では、少なくとも１つの付加的療法および化合物は同時投与される。
ある実施形態では、化合物は薬学的組成物の形態で投与される。
本明細書中では、細胞または組織におけるインスリン抵抗性を改善する方法であって、細胞または組織を、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、配列番号１、２、３、４または５の核酸塩基配列と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物と接触することを包含する方法が提供される。ある実施形態では、細胞または組織は、肝臓、脂肪または骨格筋細胞または組織である。ある実施形態では、細胞または組織は脂肪細胞または組織である。ある実施形態では、細胞または組織はin vivoで接触される。
本明細書中では、被験者における脂肪細胞分化の増大方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者における脂肪細胞分化を増大することを包含する方法が提供される。ある実施形態では、被験者は過剰量の体脂肪を有する。ある実施形態では、投与は被験者の体重を低減する。ある実施形態では、投与することは、被験者における体脂肪を低減する。
本明細書中では、被験者における脂肪細胞分化の増大方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与し、それにより被験者における脂肪細胞分化を増大することを包含する方法が提供される。
本明細書中では、細胞におけるインスリン感受性の増大方法であって、細胞を、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、配列番号１、２、３、４または５の核酸塩基配列と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物と接触することを包含する方法が提供される。ある実施形態では、細胞はインスリンに対する感受性低減を示す。ある実施形態では、細胞は脂肪細胞である。
本明細書中では、脂肪細胞分化を誘導する方法であって、脂肪細胞を、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、配列番号１、２、３、４または５の核酸塩基配列と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物と接触することを包含する方法が提供される。
ある実施形態では、化合物はオリゴヌクレオチドからなる。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１、２、３、４または５の核酸塩基配列と少なくとも８５％相同である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１、２、３、４または５の核酸塩基配列と少なくとも９０％相同である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１、２、３、４または５の核酸塩基配列と少なくとも９５％相同である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１、２、３、４または５の核酸塩基配列と完全に相同である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１、２、３、４または５から選択される核酸塩基配列と２つ以下の不整合を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１、２、３、４または５から選択される核酸塩基配列と１つ以下の不整合を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１、２、３、４または５から選択される核酸塩基配列と１つの不整合を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１、２、３、４または５から選択される核酸塩基配列と不整合を有さない。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは修飾オリゴヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは少なくとも２つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは少なくとも３つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの最初および最後のヌクレオシド間結合は修飾ヌクレオシド間結合である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は修飾ヌクレオシド間結合である。ある実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ある実施形態では、ヌクレオチドは、修飾糖を含む少なくとも１つのヌクレオシドを含む。ある実施形態では、ヌクレオチドは、修飾糖を含む少なくとも２つのヌクレオシドを含む。ある実施形態では、ヌクレオチドは、修飾糖を含む少なくとも３つのヌクレオシドを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは修飾糖を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含む複数のヌクレオシドおよび２’−フルオロ糖修飾を含む複数のヌクレオシドを含む。ある実施形態では、各修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチル糖、２’−フルオロ糖、２’−Ｏ−メチル糖および二環式糖部分から独立して選択される。ある実施形態では、二環式糖部分はＬＮＡである。ある実施形態では、化合物はオリゴヌクレオチドと連結される共役体を含む。ある実施形態では、共役体はコレステロールである。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは異化の修飾を有する：各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メチルヌクレオシドであり、最初の２つの５’ヌクレオシド間結合の各々がホスホロチオエートであり、４つの３’末端ヌクレオシド間結合の各々がホスホロチオエートであり、残りのヌクレオシド間結合の各々がホスホジエステルであり、そして３’末端ヌクレオシドがヒドロキシプロリノール結合を介してコレステロールと連結される。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは７連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、８連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは９連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１０連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１１連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１２連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１３連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１４連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１５連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１６連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１７連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１８連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１９連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２０連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２１連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２２連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２３連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２４連結ヌクレオシドからなる。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号６、７または８の核酸塩基配列を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は配列番号６、７または８の核酸塩基配列からなる。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかの核酸塩基配列を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸塩基配列を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸塩基配列を含む。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかの核酸塩基配列からなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸塩基配列からなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸塩基配列からなる。このようなある実施形態では、各ヌクレオシドは糖修飾を含む。
本明細書中では、治療を必要とする被験者の同定方法であって、被験者から得られる試料中のマイクロＲＮＡの量を陰性対照の量と比較すること（この場合、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７であり、そして被験者から得られる試料中のより多い量のマイクロＲＮＡは、被験者がｍｉＲＮＡ−１０３／１０７と相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物による治療を必要とする、ということを示す）を包含する方法が提供される。ある実施形態では、試料は肝臓試料である。ある実施形態では、試料は脂肪組織試料である。ある実施形態では、被験者は代謝障害を発症する危険がある。ある実施形態では、被験者が代謝障害を有すると推測される。ある実施形態では、被験者は、ｍｉＲＮＡ−１０３および／またはｍｉＲ１０７あるいはその前駆体と相補的な核酸塩基を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物で治療される。
本発明のこれらのおよびその他の実施形態は、以下の図面、説明および特許請求の範囲と関連付けて明らかになる。
別記しない限り、野生型雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（〜２０ｇ）に、ＰＢＳ、抗ｍｉＲ−１０７（１×１５ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍｉＲ１０３（２×１５ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍｍ−１０７（２×１５μｇ／ｋｇ）または抗ｍｉＲ−１２４（２×１５μｇ／ｋｇ）の何れかを注射し、一方、雄ｏｂ／ｏｂ（４５ｇ）には、ＰＢＳ、抗ｍｉＲ−１０７（１×１５ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍｉＲ１０３（２×１５ｍｇ／ｋｇ）または抗ｍｉＲ−１２４（２×１５ｍｇ／ｋｇ）の何れかを注射した。図面全体を通して、抗ｍｉＲ処置のラベルには、以下の表中の記載と同様に記載した。
Figure 2016106077
 ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７は糖尿病および肥満症のモデルにおいて上方調節される。（Ａ）指示されたような野生型（ｗｔ）、ｏｂ／ｏｂ、正常固形試料（Ｃｈｏｗ）またはＤＩＯマウスの肝臓からの総ＲＮＡ２５μｇにおけるｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７に関するノーザンブロッティング（ｎ＝３）。総ＲＮＡの臭化エチジウム染色を、対照として示す。（Ｂ）０、１０または１００ｎＭ合成ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７におけるｍｉＲ−１０３に関するノーザンブロッティング。（Ｃ）抗ｍｉＲ−１０３および抗ｍｉＲ−１０７または対照としてＰＢＳを注射したｏｂ／ｏｂマウスの肝臓からの総ＲＮＡ３５μｇにおけるｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７またはｍｉＲ−１６に関するノーザンブロッティング。（Ｄ）抗ｍｉＲ−１０３、抗ｍｉＲ−１０７または対照としてＰＢＳを注射したｏｂ／ｏｂまたはＣ５７ｂｌ／６マウスの脂肪からの総ＲＮＡ３５μｇにおけるｍｉＲ−１０７またはｍｉＲ−１６に関するノーザンブロッティング。（Ｅ）抗ｍｉＲ−１０３処置を用いた場合と用いない場合の、Ｃ５７Ｂｌ／６の異なる器官からの総ＲＮＡ３５、１０または５μｇにおけるｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１６またはＵ６に関するノーザンブロッティング。（Ｆ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの肝臓および脂肪からの総ＲＮＡ３５μｇにおけるｍｉＲ−１０３に関するノーザンブロッティング。 ｍｉＲ−１０７のアデノウイルス媒介性過剰発現はｍｉＲ−１０７発現を増大しｍｉＲ−１０３／１０７標的を下方調節する。（Ａ）アデノウイルス注射Ｃ５７Ｂｌ／６またはＰＢＳ注射ｏｂ／ｏｂマウスにおける肝臓からのｍｉＲ−１０７のノーザンブロット分析。示した実験は全て、ｎ＝５からである。（Ｂ）３’ＵＴＲ中のｍｉＲ−１０７とシード整合を有するｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ中のｍｉＲ−１０７とシード整合を有さないｍＲＮＡと比較して、有意に下方調節された；下方調節は、進化選択圧下にあると推測されるシード整合を保有するｍＲＮＡの亜組に関してより顕著である。 ｍｉＲ−１０３／１０７の抗ｍｉＲ抑制はコレステロールを低減する。（Ａ）指示されたような、それぞれＬＤＬまたはＨＤＬのマーカーとしての抗アポＢまたは抗アポＡ１抗体でイムノブロットされた分画のウエスタンブロッティング。（Ｂ）指示されたような、それぞれＶＬＤＬ、ＬＤＬまたはＨＤＬのマーカーとしての抗アポＥ、抗アポＢまたは抗アポＡ１抗体でイムノブロットされた分画のウエスタンブロッティング。（Ｃ）トリグリセリドに関して検定された、ＰＢＳまたは抗ｍｉＲ−１０３を注射した８週齢雌ＬＤＬＲ−／−マウスの血漿１５０ｕｌからのＦＰＬＣゲル濾過により分離された主リポタンパク質分画。 ｍｉＲ−１０３／１０７の抗ｍｉＲ抑制は遺伝子標的を低減する。（Ａ）ｍｉＲ−１０３／１０７のサイレンシング時のｏｂ／ｏｂマウスからの肝臓ＲＮＡを用いた標的遺伝子の実時間ＰＣＲ。（Ｂ）ｍｉＲ−１０３／１０７の抗ｍｉＲサイレンシング後のｏｂ／ｏｂマウスからの脂肪ＲＮＡを用いた標的遺伝子の実時間ＰＣＲ。（Ｃ）ｍｉＲ−１０３／１０７の抗ｍｉＲサイレンシング後のｏｂ／ｏｂマウスからの筋肉ＲＮＡを用いた標的遺伝子の実時間ＰＣＲ。 ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の変調は標的タンパク質を調節する。（Ａ）図１ＡおよびＢの場合と同様にＰＢＳまたは抗ｍｉＲ−１０３を注射したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪からの総抽出物のウエスタンブロッティング。カベオリン１（Santa Cruz）、インスリン受容体ｂ（ＩＲｂ）、ｐＡＫＴ、ＡＫＴおよびｙ−チューブリンに対する抗体で、膜をブロッティングした。（Ｂ、Ｃ）タンパク質抽出物３５μｇ、あるいは指示されたような濃度でＰＢＳ、抗ｍｉＲ−１２４または抗ｍｉＲ−１０３でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの総ＲＮＡ ２５μｇのウエスタンブロッティング（Ｂ）およびノーザンブロッティング（Ｃ）。（Ｄ）６−ウェルフォーマット中に植え付けて、抗ｍｉＲ−１０３とともにインキュベートしたＨＥＫ２９３細胞からの総細胞抽出物のウエスタンブロッティング。抗ｍｉＲ処置の３日後に、細胞を収穫した。（ＥおよびＦ）２５０ｐｍｏｌ／６ウェルプレートのウエルの濃度で、模造、スクランブルまたはｍｉＲ１０３ ｓｉＲＮＡでトランスフェクト後２日目に収穫した６−ウェルフォーマットでプレート化したＨＥＫ２９３細胞からの総細胞抽出物のウエスタンブロット。（Ｇ）６−ウェルフォーマットでプレート化し、そして２５０ｐｍｏｌ／６ウェルプレートのウエルの濃度で、模造、スクランブル１、スクランブル２またはｍｉＲ１０３ ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後２日目に収穫した３Ｔ３細胞からの総細胞抽出物のウエスタンブロット。 抗ｍｉＲ−１０３のリポソーム送達。異なる量のＬｉｐ−抗ｍｉＲ−１０３、Ｌｉｐ−抗ｍｉＲ−１０７または対照としてのＰＢＳを注射したｏｂ／ｏｂマウスからの肝臓、脂肪または筋肉からの総ＲＮＡ ３０μｇにおけるｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１６に関するノーザンブロッティング。 脂肪組織におけるｍｉＲ−１０３／１０７抑制の作用。（Ａ）抗ｍｉＲ−１０７または抗ｍｉＲ−１０３注射ＤＩＯ（上部）またはｏｂ／ｏｂマウス（底部）におけるコンピューター断層撮影（ＣＴ）。（Ｂ、Ｃ）抗ｍｉＲ−１０７または抗ｍｉＲ−１０３ ｏｂ／ｏｂ（Ｂ）およびＤＩＯ（Ｃ）注射マウスのＳＣまたはＶ脂肪からのパラフィン切片のヘマトキシリン（ＨＥ）染色。（Ｄ）抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｉＲ−１０７の存在下での分化の８日後のＳＶＦ細胞におけるＢＯＤＩＰＹ脂質滴染色、ヘキスト核検出およびＳｙｔｏ６０サイトゾル染色。 ｍｉＲ−１０３による遺伝子発現およびインスリンシグナル伝達の調節。（Ａ）Ａｄ−ＧＦＰまたはａｄ−１０７／ＧＦＰを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウスの肝臓からの総タンパク質抽出物 ５０μｇのウエスタンブロッティング。（Ｂ）ａｄ−ＧＦＰまたはａｄ−１０７／ＧＦＰを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス外科的Ｖ脂肪のＶ脂肪からのタンパク質抽出物２０μｇに関するウエスタンブロッティング。（Ｃ）抗ｍｉＲ−１０７または抗ｍｉＲ−１０３注射ｏｂ／ｏｂマウスの脂肪からのタンパク質抽出物２０μｇに関するウエスタンブロッティング。（Ｄ）抗ｍｉＲ−１０７または抗ｍｉＲ−１０３を注射後８日目に、５週間高脂肪餌に保持されたＣ５７Ｂｌ／６またはＣａｖ１ノックアウト（Ｃａｖ１ ＫＯ）マウスの脂肪からの総タンパク質２０μｇに関するウエスタンブロッティング。マウスを１２時間絶食させて、１．２Ｕ／ｋｇの用量でインスリンで８分間刺激した。 ｍｉＲ−１０３結合部位。ヒトおよびマウスにおけるＣａｖ１コード配列（ＣＤＳ）およびシードモチーフを伴うその３’ＵＴＲを示すグラフ。シード配列を褐色で印を付け、そしてＣａｖ１ ３’ＵＴＲとシード配列に近位のｍｉＲ−１０３との間の整合残基を赤色で印を付けてある。Ｃａｖ１シード２ ３’ＵＴＲ領域の多重アラインメント。
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語は全て、本発明が属する当該技術分野の当業者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。具体的な定義が提示されない限り、本明細書中で記載される分析化学、合成有機化学ならびに医学および薬学化学と関連して用いられる命名法、ならびにそれらの手法および技法は、当該技術分野で周知であり、一般に用いられる。本明細書中の用語に関して複数の意味が存在する場合には、この節の意味が採用される。標準技法は、化学合成、化学分析、薬学的調製、処方および送達、ならびに被験者の処置のために用いられ得る。ある種のこのような技法および手法は、例えば”Carbohydrate Modifications in Antisense Research” Edited by Sangvi and Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994；および”Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, Pa., 18th edition, 1990（これらの記載内容は、任意の目的のために参照により本明細書中で援用される）に見出され得る。容認される場合、本明細書中の全開示全体を通して言及される特許出願、公開出願および出版物、ＧＥＮＢＡＮＫ配列、ウエブサイトおよびその他の出版物は全て、別記しない限り、これらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。ＵＲＬ、あるいはこのような識別子またはアドレスに言及される場合、このような識別子は変わり得るし、インターネット上の特定の情報は是認（go）を命令し得るが、しかしインターネットを検索することにより等価の情報が見出され得る、と理解される。これらの参照は、そのような情報を利用できる証拠となり、また公に普及されていることの証拠にもなる。
本発明の組成物および方法が開示され、記載される前に、本明細書中で用いられる用語は特定の実施形態を説明するのみの目的のためであり、限定的であるよう意図されない、と理解されるべきである。明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形態である「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、状況が明らかにそうでないことを示さない限り、複数指示を含む、ということに留意しなければならない。
定義
「血糖値」は、被験者の血液中のグルコースの濃度を意味する。ある実施形態では、血糖値は、グルコースのミリグラム数／血液１デシリットルとして表される。ある実施形態では、血糖値はグルコースのｍｍｏｌ数／血液１リットルとして表される。
「上昇血糖値」は、正常より高い血糖値を意味する。
「空腹時血糖値」は、被験者が一定時間絶食した後の血糖値を意味する。例えば、被験者は、空腹時血糖値の測定前に少なくとも８時間絶食することがある。
「食後血糖値」は、被験者が食事を食べた後の血糖値を意味する。ある実施形態では、食後血糖値は、被験者が食事を食べた２時間後に測定される。
「全血血糖値」は、分離を施されていない全血中のグルコースの濃度を意味する。
「血漿血糖値」は、血漿および赤血球分画に全血が分離された後の血漿中のグルコースの濃度を意味する。
「インスリン感受性」は、インスリン作用に応答してグルコースを取り入れる細胞の能力を意味する。
「インスリン抵抗性」は、正常量のインスリンが、脂肪、筋肉および肝臓細胞からの正常インスリン応答を生じるのに不適切である状態を意味する。脂肪細胞におけるインスリン抵抗性は、保存トリグリセリドの加水分解を生じ、これが血液中の遊離脂肪酸を上昇させる。筋肉におけるインスリン抵抗性は、筋肉細胞による血液からのグルコースの取込みを低減する。肝臓におけるインスリン抵抗性は、グルコース保存を低減し、グルコース産生の抑圧失敗を低減する。遊離脂肪酸上昇、グルコース取込み低減、およびグルコース産生上昇は全て、血糖値上昇に寄与する。インスリン抵抗性のためのインスリンおよびグルコースの高血漿レベルは、しばしば、代謝症候群および２型糖尿病を引き起こす。
「インスリン抵抗性改善」は、正常インスリン応答を生じる細胞の能力を増大することを意味する。ある実施形態では、インスリン抵抗性は筋肉細胞において改善されて、筋肉細胞中のグルコースの取込み増大を生じる。ある実施形態では、インスリン抵抗性は肝臓細胞において改善されて、肝臓細胞中のグルコース保存増大を生じる。ある実施形態では、インスリン抵抗性は脂肪細胞において改善されて、トリグリセリドの加水分解の低減を生じ、その結果として、血中遊離脂肪酸を低減する。
「代謝障害」は、身体中の１つ以上の代謝過程における変更または妨害により特性化される症状を意味する。代謝障害としては、高血糖症、糖尿病前症、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満症、糖尿病性異脂肪血症、代謝性症候群および高インスリン血症が挙げられるが、これらに限定されない。「糖尿病」または「真性糖尿病」は、身体がインスリンを産生しないかまたは適正に用いずに、異常に高い血糖値を生じる疾患を意味する。ある実施形態では、糖尿病は１型糖尿病である。ある実施形態では、糖尿病は２型糖尿病である。
「糖尿病前症」は、被験者の血糖値が正常血糖値を有する被験者より高いが、しかし糖尿病の診断のためには低いか、十分に高くない症状を意味する。
「１型糖尿病」は、膵臓のランゲルハンス島のインスリン産生ベータ細胞を損失して、インスリンの欠乏をもたらすことにより特性化される糖尿病（インスリン依存性真性糖尿病またはＩＤＤＭとしても既知である）を意味する。１型糖尿病は、小児または成人に影響を及ぼし得るが、典型的には１０歳〜１６歳の間に現れる。
「２型糖尿病」は、インスリン抵抗性および相対的インスリン欠乏により特性化される糖尿病（２型真性糖尿病としても既知であり、そして以前は、２型真性糖尿病、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、肥満症関連糖尿病または成人発症性糖尿病と呼ばれていた）を意味する。
「肥満症」は、除脂肪体重に関して過度に高量の体脂肪または脂肪組織を意味する。体脂肪（脂肪過多）の量は、身体全体の脂肪の分布および脂肪組織沈着物のサイズの両方を含む。体脂肪分布は、皮膚皺測定、胴囲対腰囲比、あるいは超音波、コンピューター断層撮影または磁気共鳴画像法のような技法により概算され得る。疾病管理予防センターによれば、３０以上の体格指数（ＢＭＩ）を有する個体は肥満とみなされる。
「糖尿病性異脂肪血症」または「異脂肪血症を伴う２型糖尿病」は、２型糖尿病、ＨＤＬ−Ｃ低減、血清トリグリセリド上昇ならびに小型高密度ＬＤＬ粒子増大により特性化される症状を意味する。
「代謝性症候群」は、代謝起源の脂質および非脂質危険因子の群成により特性化される症状を意味する。ある実施形態では、代謝性症候群は、以下の因子のうちのいずれか３つの存在により同定される：男性では１０２ｃｍより大きい、女性では８８ｃｍより大きい胴囲；少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬの血清トリグリセリド；男性４０ｍｇ／ｄＬ未満、女性５０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ−Ｃ；少なくとも１３０／８５ｍｍＨｇの血圧；ならびに少なくとも１１０ｍｇ／ｄＬの空腹時グルコース。これらの決定因子は、臨床診察により容易に測定され得る（JAMA, 2001, 285: 2486-2497）。
「脂肪症」は、肝細胞におけるトリグリセリドの過剰な蓄積により特性化される症状を意味する。
「脂肪性肝炎」は、炎症を伴う脂肪症を意味する。
「非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）」は、アルコールをほとんど乃至全く消費しない被験者における肝臓中の脂肪の蓄積により特性化される症状を意味する。ある実施形態では、ＮＡＦＬＤは、インスリン抵抗性および代謝性症候群と関連する。
「非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）」は、肝臓における炎症および瘢痕と組合された肝臓中の脂肪の蓄積により特性化される症状を意味する。ある実施形態では、ＮＡＳＨはＮＡＦＬＤの進行悪化に起因する。
「アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）」は、肝臓における炎症および瘢痕と組合された肝臓中の脂肪の蓄積により特性化されるアルコール誘導性症状を意味する。
「糖耐性試験」または「ＧＴＴ」は、如何に迅速にグルコースが血液から除去されるかを確定するために実施される試験である。典型的には、試験は、グルコースの投与と、その後の、一定期間に亘る間隔での血中グルコースレベルの測定を含む。「ＩＰＧＴＴ」は、グルコースの腹腔内注射後に実施されるＧＴＴを意味する。「ＯＧＴＴ」は、グルコースの経口投与後に実施されるＧＴＴを意味する。ある実施形態では、ＧＴＴは、糖尿病前症に関して試験するために用いられる。ある実施形態では、ＧＴＴは、糖尿病を有する被験者を同定するために用いられる。ある実施形態では、ＧＴＴは、糖尿病を発症する危険がある被験者を同定するために用いられる。ある実施形態では、ＧＴＴは、インスリン抵抗性を有する被験者を同定するために用いられる。
「インスリン耐性試験（ＩＴＴ）」は、低血糖値のストレスに対するホルモン応答を通してインスリン感受性を測定するために実施される試験を意味する。ある実施形態では、ＩＴＴは、糖尿病前症に関して試験するために用いられる。ある実施形態では、ＩＴＴは、糖尿病を有する被験者を同定するために用いられる。ある実施形態では、ＩＴＴは、糖尿病を発症する危険がある被験者を同定するために用いられる。ある実施形態では、ＩＴＴは、インスリン抵抗性を有する被験者を同定するために用いられる。
「代謝率」は、所定期間おける代謝の速度または費やされるエネルギーの量を意味する。「基礎代謝率」は、吸収後状態（消化器系が不活性であることを意味し、これは、ヒトでは、約１２時間の絶食を要する）における、中性的温和環境中での安静時の間に費やされるエネルギーの量を意味する；この状態でのエネルギーの放出は、生命維持に不可欠な器官、例えば心臓、肺、脳および神経系の残りの器官、肝臓、腎臓、生殖器、筋肉および皮膚の機能に関してのみ十分である。
「抗ｍｉＲ」は、マイクロＲＮＡと相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを意味する。ある実施形態では、抗ｍｉＲは修飾オリゴヌクレオチドである。
「被験者」は、処置または療法のために選択されるヒトまたは非ヒト動物を意味する。
「それを必要とする被験者」は、療法または処置を必要とすると同定される被験者を意味する。ある実施形態では、被験者は肝臓癌を有する。このような実施形態では、被験者は、肝臓癌の１つ以上の臨床的適応症を有するか、あるいは肝臓癌を発症する危険がある。
「投与すること」は、被験者に薬学的作用物質または組成物を提供することを意味し、例としては医療専門家による投与および自己投与が挙げられるが、これらに限定されない。
「非経口投与」は、注射または注入による投与を意味する。非経口投与としては、皮下投与、静脈内投与または筋肉内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
「皮下投与」は、皮膚の真下の投与を意味する。
「静脈内投与」は、静脈中への投与を意味する。
「同時的に投与される」は、少なくとも２つの作用物質の両方の薬理学的作用が同時に被験者において明白である任意の方法で被験者にそれらをともに投与することを指す。同時投与は、両作用物質が単一薬学的組成物中で、同一剤形で、または同一投与経路により投与される、ということを必要としない。作用物質の作用時間は、同一である必要はない。作用は、時間に関して重複していることだけが必要で、同一範囲である必要はない。「持続時間」は、活性または事象が継続する期間を意味する。ある実施形態では、処置の持続時間は、薬学的作用物質または薬学的組成物の用量が投与される期間である。
「療法」は、疾患処置方法を意味する。ある実施形態では、療法としては、化学療法、外科的切除術、肝臓移植および／または化学塞栓療法が挙げられるが、これらに限定されない。
「処置」は、疾患の治癒または改善のために用いられる１つ以上の具体的手法の適用を意味する。ある実施形態では、具体的手法は、１つ以上の薬学的作用物質の投与である。
「改善」は、症状または疾患の少なくとも１つの指標の重症度を減少することを意味する。ある実施形態では、改善は、症状または疾患の１つ以上の指標の進行を遅延することまたは緩慢にすることを包含する。指標の重症度は、当業者に既知である主観的または客観的測定により決定され得る。
「発症する危険がある」は、被験者が症状または疾患を発症する素因を有することを意味する。ある実施形態では、症状または疾患を発症する危険がある被験者は、症状または疾患の１つ以上の症候を示すが、しかしその症状または疾患を有すると診断されるに十分な数の症候を示さない。ある実施形態では、症状または疾患を発症する危険がある被験者は、症状または疾患のうちの１つ以上の症候を示すが、しかし症状または疾患を有すると診断されるのに必要とされる程度よりは少ない。
「〜の開始を防止する」は、疾患または症状を発症する危険がある被験者における症状または疾患の発症を防止することを意味する。ある実施形態では、疾患または症状を発症する危険がある被験者は、当該疾患または症状を既に有する被験者が受けている処置と類似の処置を受ける。
「〜の開始を遅延する」は、疾患または症状を発症する危険がある被験者における症状または疾患の発症を遅延することを意味する。ある実施形態では、疾患または症状を発症する危険がある被験者は、当該疾患または症状を既に有する被験者が受けている処置と類似の処置を受ける。
「治療薬」は、疾患の治癒、改善または防止のために用いられる薬学的作用物質を意味する。
「用量」は、単一投与で提供される薬学的作用物質の特定量を意味する。ある実施形態では、用量は、２つ以上のボーラス、錠剤または注射で投与され得る。例えば、皮下投与が所望されるある実施形態では、所望用量は、単一注射により容易に収容されない容積を要する。このような実施形態では、所望用量を達成するために２回以上の注射が用いられる。ある実施形態では、個体における注射部位反応を最小限にするために、用量は２回以上の注射で投与され得る。
「投与単位」は、薬学的作用物質が提供される形態を意味する。ある実施形態では、投与単位は、凍結乾燥オリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。ある実施形態では、投与単位は再構成オリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。
「治療的有効量」は、動物に療法的利益を提供する薬学的作用物質の量を指す。
「薬学的組成物」は、薬学的作用物質を含む、個体に投与するのに適した物質の混合物を意味する。例えば薬学的組成物は、滅菌水溶液を含み得る。
「薬学的作用物質」は、被験者に投与された場合に治療作用を提供する物質を意味する。
「活性薬学的成分」は、所望の作用を提供する薬学的組成物中の物質を意味する。
「肝機能改善」は正常限界に向けての肝機能における変化を意味する。ある実施形態では、肝機能は、被験者の血液中に見出される分子を測定することにより査定される。例えば、ある実施形態では、肝機能改善は、血中肝臓トランスアミナーゼレベルの低減により測定される。
「許容可能な安全性プロフィール」は、臨床的に許容可能な限界内である副作用の一パターンを意味する。
「副作用」は、所望の作用以外の処置に起因する生理学的応答を意味する。ある実施形態では、副作用としては、注射部位反応、肝機能試験異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常および筋疾患が挙げられるが、これらに限定されない。このような副作用は、直接または間接的に検出され得る。例えば、血清中のアミノトランスフェラーゼレベル増大は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。例えば、ビリルビン増大は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。
「注射部位反応」は、個体における注射の部位での炎症または異常発赤を意味する。
「被験者コンプライアンス」は、被験者による推奨または処方療法に対する厳守を意味する。
「応諾する」は、被験者による推奨療法の厳守を意味する。
「推奨療法」は、疾患の処置、改善または防止のために医療専門家により推奨される処置を意味する。
「標的核酸」は、オリゴマー化合物がハイブリダイズするよう意図される核酸を意味する。
「ターゲッティング」は、標的核酸とハイブリダイズする核酸塩基配列の設計および選択の過程を意味する。
「〜に対して標的化される」は、標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有することを意味する。
「変調」は、機能または活性の摂動を意味する。ある実施形態では、変調は遺伝子発現の増大を意味する。ある実施形態では、変調は遺伝子発現の減少を意味する。
「発現」は、遺伝子のコードされた情報が、細胞中に存在し、作動する構造に転換される任意の機能およびステップを意味する。
「５’標的部位」は、特定オリゴヌクレオチドの最も５’の核酸塩基と相補的である標的核酸の核酸塩基を指す。
「３’標的部位」は、特定オリゴヌクレオチドの最も３’の核酸塩基と相補的である標的核酸の核酸塩基を意味する。
「領域」は、核酸内の連結ヌクレオシドの一部を意味する。ある実施形態では、ａｎは、標的核酸の領域と相補的である核酸塩基配列を有する。例えば、ある種のこのような実施形態では、ａｎは、ｍｉＲＮＡステム−ループ配列の一領域と相補的である。ある種のこのような実施形態では、ａｎはｍｉＲＮＡステム−ループ配列の一領域と完全に相補的である。
「セグメント」は、一領域のうちのより小さい部分またはサブ部分を意味する。
「核酸塩基配列」は、任意の糖、連鎖および／または核酸塩基修飾とは関係なく、５’から３’への配向での、連続核酸塩基の順序を意味する。
「連続核酸塩基」は、核酸中で互いに直に隣接する核酸塩基を意味する。
「核酸塩基相補性」は、水素結合を介して非共有的に対合する２つの核酸塩基の能力を意味する。
「相補的な」は、オリゴマー化合物が、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で標的核酸とハイブリダイズし得ることを意味する。
「完全に相補的な」は、オリゴマー化合物の各核酸塩基が、標的核酸中の各々の対応する位置で核酸塩基と対合し得ることを意味する。例えば、ある実施形態では、各核酸塩基がｍｉＲＮＡステム−ループ配列の一領域内の核酸塩基との相補性を有するオリゴマー化合物は、ｍｉＲＮＡステム−ループ配列と完全に相補的である。
「相補性パーセント」は、標的核酸の等長部分と相補的であるオリゴマー化合物の核酸塩基のパーセンテージを意味する。相補性パーセントは、標的核酸中の対応する位置での核酸塩基と相補的であるオリゴマー化合物の核酸塩基の数を、オリゴマー化合物の総長で割ることにより算定される。ある実施形態では、ａｎの相補性パーセントは、標的核酸と相補的である核酸塩基の数を修飾オリゴマー長で割った値を意味する。
「同一性パーセント」は、第二核酸中の対応する位置の核酸塩基と同一である第一核酸中の核酸塩基の数を、第一核酸中の核酸塩基の総数で割った値を意味する。
「ハイブリダイズする」は、核酸塩基相補性により生じる相補性核酸のアニーリングを意味する。
「不整合」は、第二核酸の対応する位置の核酸塩基と対合し得ない第一核酸の核酸塩基を意味する。
「同一の」は、同一核酸塩基配列を有することを意味する。
「ｍｉＲ−１０３」は、配列番号１（ＡＧＣＡＧＣＡＵＵＧＵＡＣＡＧＧＧＣＵＡＵＧＡ）で記述される核酸塩基配列を有する成熟ｍｉＲＮＡを意味する。
「ｍｉＲ−１０７」は、配列番号２（ＡＧＣＡＧＣＡＵＵＧＵＡＣＡＧＧＧＣＵＡＵＣＡ）で記述される核酸塩基配列を有する成熟ｍｉＲＮＡを意味する。「ｍｉＲ−１０３−１ステム−ループ配列」は、配列番号３（ＵＡＣＵＧＣＣＣＵＣＧＧＣＵＵＣＵＵＵＡＣＡＧＵＧＣＵＧＣＣＵＵＧＵＵＧＣＡＵＡＵＧＧＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣＡＵＵＧＵＡＣＡＧＧＧＣＵＡＵＧＡＡＧＧＣＡＵＵＧ）で記述される核酸塩基配列を有するｍｉＲ−１０３前駆体を意味する。
「ｍｉＲ−１０３−２」は、配列番号４（ＵＵＧＵＧＣＵＵＵＣＡＧＣＵＵＣＵＵＵＡＣＡＧＵＧＣＵＧＣＣＵＵＧＵＡＧＣＡＵＵＣＡＧＧＵＣＡＡＧＣＡＧＣＡＵＵＧＵＡＣＡＧＧＧＣＵＡＵＧＡＡＡＧＡＡＣＣＡ）で記述される核酸塩基配列を有するｍｉＲ−１０３前駆体を意味する。
「ｍｉＲ−１０７ステム−ループ配列」は、配列番号５（ＣＵＣＵＣＵＧＣＵＵＵＣＡＧＣＵＵＣＵＵＵＡＣＡＧＵＧＵＵＧＣＣＵＵＧＵＧＧＣＡＵＧＧＡＧＵＵＣＡＡＧＣＡＧＣＡＵＵＧＵＡＣＡＧＧＧＣＵＡＵＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＡ）で記述される核酸塩基配列を有するｍｉＲ−１０７前駆体を意味する。
「ｍｉＲ−１０３／ｍｉＲ−１０７」は、配列番号１または配列番号２の核酸塩基配列を有するマイクロＲＮＡを意味する。
「マイクロＲＮＡ」は、１８〜２５核酸塩基長の非コードＲＮＡを意味し、これは、酵素ダイサー（Dicer）による前ｍｉＲＮＡの切断の産物である。成熟ｍｉＲＮＡの例は、ｍｉＲＢａｓｅ（http://microrna.sanger.ac.uk/）として既知のｍｉＲＮＡデータベースに見出される。ある実施形態では、マイクロＲＮＡは、「ｍｉＲＮＡ」または「ｍｉＲ」として短縮される。
「プレｍｉＲＮＡ」または「プレｍｉＲ」は、ドロシャ（Drosha）として既知の二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼによるプリｍｉＲの切断の産物であるヘアピン構造を有する非コードＲＮＡを意味する。
「ステム−ループ配列」は、ヘアピン構造を有し、成熟ｍｉＲＮＡ配列を含有するＲＮＡを意味する。プレｍｉＲＮＡ配列およびステム−ループ配列は、重複し得る。ステム−ループ配列の例は、ｍｉＲＢａｓｅ（http://microrna.sanger.ac.uk/）として既知のｍｉＲＮＡデータベースに見出される。
「プリｍｉＲＮＡ」または「プリｍｉＲ」は、二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼ ドロシャに関する基質であるヘアピン構造を有する非コードＲＮＡを意味する。
「ｍｉＲＮＡ前駆体」は、ゲノムＤＮＡから生じ、そして１つ以上のｍｉＲＮＡ配列を含む非コード構造ＲＮＡを含む転写体を意味する。例えば、ある実施形態では、ｍｉＲＮＡ前駆体はプレｍｉＲＮＡである。ある実施形態では、ｍｉＲＮＡ前駆体はプリｍｉＲＮＡである。
「単一シストロン転写物」は、単一ｍｉＲＮＡ配列を含有するｍｉＲＮＡ前駆体を意味する。
「多シストロン転写物」は、２つ以上のｍｉＲＮＡ配列を含有するｍｉＲＮＡ前駆体を意味する。
「シード配列」は、成熟ｍｉＲＮＡ配列の５’末端からのヌクレオチド２〜６または２〜７を意味する。
多数の連結ヌクレオシド「からなるオリゴヌクレオチドを含む化合物」は、特定数の連結ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を意味する。したがって、化合物は、付加的置換基または共役体を含み得る。別記しない限り、化合物は、オリゴヌクレオチドのもの以外に如何なる付加的ヌクレオシドも含まない。「オリゴマー化合物」は、連結モノマーサブユニットのポリマーを含む化合物を意味する。
「オリゴヌクレオチド」は、その各々が、互いに独立して、修飾され得るかまたは修飾され得ない連結ヌクレオシドのポリマーを意味する。
「天然ヌクレオシド間結合」は、ヌクレオシド間の３’−５’ホスホジエステル結合を意味する。
「天然糖」は、ＤＮＡ（２’−Ｈ）またはＲＮＡ（２’−ＯＨ）中に見出される糖を意味する。
「天然核酸塩基」は、その天然形態に比して修飾されない核酸塩基を意味する。
「ヌクレオシド間結合」は、隣接ヌクレオシド間の共有結合を意味する。
「連結ヌクレオシド」は、共有結合により繋がれるヌクレオシドを意味する。
「核酸塩基」は、別の核酸塩基と非共有的に対合し得る複素環式部分を意味する。
「ヌクレオシド」は、糖と連結される核酸塩基を意味する。
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分と共有的に連結されるリン酸器を有するヌクレオシドを意味する。
「修飾オリゴヌクレオチド」は、天然の末端、糖、核酸塩基および／またはヌクレオシド間結合に比して１つ以上の修飾を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
「一本鎖修飾オリゴヌクレオチド」は、相補鎖とハイブリダイズされないａｎを意味する。
「ヌクレオシド間結合修飾」は、天然ヌクレオシド間結合からの任意の変化を意味する。
「ホスホロチオエートヌクレオシド間結合」は、非架橋原子のうちの１つがイオウ原子であるヌクレオシド間の結合を意味する。
「糖修飾」は、天然糖からの置換および／または任意の変化を意味する。
「核酸塩基修飾」は、天然核酸塩基からの任意の置換および／または変化を意味する。
「５−メチルシトシン」は、５’位置に結合されるメチル基を用いて修飾されたシトシンを意味する。
「２’−Ｏ−メチル糖」または「２’−ＯＭｅ糖」は、２’位置にＯ−メチル修飾を有する糖を意味する。
「２’−Ｏ−メトキシエチル糖」または「２’−ＭＯＥ糖」は、２’位置にＯ−メトキシエチル修飾を有する糖を意味する。
「２’−Ｏ−フルオロ」または「２’−Ｆ」は、２’位置のフルオロ修飾を有する糖を意味する。
「二環式糖部分」は、２つの非ジェミナル環原子の架橋により修飾される糖を意味する。
「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド」は、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾を有する２’−修飾ヌクレオシドを意味する。
「２’−フルオロヌクレオシド」は、２’−フルオロ糖修飾を有する２’−修飾ヌクレオシドを意味する。
「２’−Ｏ−メチルヌクレオシド」は、２’−Ｏ−メチル糖修飾を有する２’−修飾ヌクレオシドを意味する。
「二環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分を有する２’−修飾ヌクレオシドを意味する。
「モチーフ」は、オリゴヌクレオチド中の修飾および／または非修飾核酸塩基、糖および／またはヌクレオシド間結合のパターンを意味する。
「完全修飾オリゴヌクレオチド」は、各核酸塩基、各糖および／または各ヌクレオシド間結合が修飾されることを意味する。
「均一修飾オリゴヌクレオチド」は、各核酸塩基、各糖および／または各ヌクレオシド間結合が修飾オリゴヌクレオチド全体を通して同一修飾を有することを意味する。
「ギャップマー」は、連結ヌクレオシドの２つの外部領域間に配置される連結ヌクレオシドの内部領域を有する修飾オリゴヌクレオチドを意味し、この場合、内部領域のヌクレオシドは各外部領域のヌクレオシドのものと異なる糖部分を含む。
「ギャップセグメント」は、外部領域間に配置されるギャップマーの内部領域である。
「ウイングセグメント」は、内部領域の５’または３’末端に位置するギャップマーの外部領域である。
「対称性ギャップマー」は、各外部領域の各ヌクレオシドが同一糖修飾を含むことを意味する。
「非対称性ギャップマー」は、ある外部領域の各ヌクレオシドが第一糖修飾を含み、他の外部領域の各ヌクレオシドが第二糖修飾を含むことを意味する。
「安定化修飾」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合により連結される２’−でオキシヌクレオシドにより提供されるものに比して、ヌクレアーゼの存在下で、修飾オリゴヌクレオチドに安定性増強を提供するヌクレオシドに対する修飾を意味する。例えば、ある実施形態では、安定化修飾は安定化ヌクレオシド修飾である。ある実施形態では、安定化修飾はヌクレオシド間結合修飾である。
「安定化ヌクレオシド」は、２’−でオキシヌクレオシドにより提供されるものに比して、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ安定性増強を提供するよう修飾されるヌクレオシドを意味する。一実施形態では、安定化ヌクレオシドは２’−修飾ヌクレオシドである。
「安定化ヌクレオシド間結合」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合により提供されるものに比してオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ安定性改善を提供するヌクレオシド間結合を意味する。一実施形態では、安定化ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
大要
代謝障害は、身体の代謝機能における１つ以上の異常により特性化される。ある代謝障害は、身体が血糖を用いる方法における欠陥に関連し、異常に高い血糖値を生じる。代謝障害は、インスリン産生の欠乏、またはインスリンに対する感受性の欠乏によっても特性化され得る。代謝障害は、世界中の数百万の人々に影響を及ぼし、致命的障害であり得る。このようなものとして、代謝障害を治療し、防止し、あるいはその開始を遅延するための方法および組成物が必要とされている。
本明細書中で例証されるように、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７と相補的なオリゴヌクレオチドの投与は、血糖値改善、糖新生低減、インスリン感受性増強、および血漿コレステロール低減を生じた。これらの作用は、糖尿病／インスリン抵抗性の動物モデルで観察された。体重の低減も観察されたが、これは、体脂肪の低減によるものであった。ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７は１つの核酸塩基が異なるので、ｍｉＲ−１０３の核酸塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７の両方とハイブリダイズし得るし、それらの活性を抑制し得る。同様に、ｍｉＲ−１０７の核酸塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７の両方とハイブリダイズし、それらの活性を抑制し得る。このようなものとして、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７のいずれか一方または両方と相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、本明細書中に記載される表現型結果を達成し得る。
ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７またはそれらの前駆体と相補的なオリゴヌクレオチドを含む化合物の投与は、１つ以上の臨床的に望ましい結果を生じ得る。このような臨床的に望ましい結果としては、血糖値低減、ＨｂＡ１ｃ値低減、糖耐性改善、インスリン耐性改善および糖新生低減が挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、血糖値を低減し、糖新生を減少し、インスリン感受性を改善し、ならびに血漿コレステロールを減少させるための方法および組成物が、本明細書中で提供される。血糖値上昇、糖新生増大、インスリン感受性障害、ならびに血漿コレステロール増大に関連する代謝障害を治療し、防止し、またはその開始を遅延するための方法も提供される。ある実施形態では、代謝障害としては、糖尿病前症、糖尿病、例えば１型または２型糖尿病、代謝性症候群、肥満症、糖尿病性異脂肪血症、高血糖症、低血糖症および高インスリン血症が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、代謝障害を有する被験者は脂肪性肝疾患も有する。ある実施形態では、脂肪性肝疾患としては、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎が挙げられるが、これらに限定されない。
ある実施形態では、被験者における血糖値の低減方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。
ある実施形態では、被験者における血糖値の低減方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。
ある実施形態では、本明細書中で提供される方法は、血糖値を測定することを包含する。血糖値は、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物の投与の前および／または後に測定され得る。血糖値は、全血で測定され得るし、あるいは血漿で測定され得る。血糖値は、臨床実験室で測定され得るし、あるいは血糖計を用いて測定され得る。
ある実施形態では、血糖値は、被験者が少なくとも８時間絶食した場合に、被験者で測定される。ある実施形態では、血糖値は無作為時に測定され、測定は食物または飲料の摂取によって時間を調節されない。ある実施形態では、血糖値は食後状態で、すなわち被験者が食事を食べた後に測定される。ある実施形態では、血糖値は、被験者が食事を食べた２時間後に被験者で測定される。ある実施形態では、被験者の身体が如何に迅速にグルコースを身体から掃去するかを確定するために、被験者へのグルコースの投与後、決まった間隔で血糖値は測定される。血糖値の任意の測定が、全血で、または血漿でなされ得る。
ある実施形態では、被験者は血糖値上昇を示す。ある実施形態では、被験者は、血糖値上昇を示すと同定される。このような同定は、典型的には、医療専門家によりなされる。ある実施形態では、上昇血糖値は、１００〜１２５ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖値である。ある実施形態では、上昇血糖値は、１２６ｍｇ／ｄＬより高い空腹時血糖値である。ある実施形態では、上昇血糖値は、１４０〜１９９ｍｇ／ｄＬの食後２時間血糖値である。ある実施形態では、上昇血糖値は、２００ｍｇ／ｄＬ以上の食後２時間血糖値である。
ある実施形態では、血糖値上昇を示す被験者は糖尿病前症を有する。ある実施形態では、被験者は糖尿病前症を有すると同定される。ある種のこのような実施形態では、被験者は、１００〜１２５ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖値を有する。ある種のこのような実施形態では、被験者は、１４０〜１９９ｍｇ／ｄＬの食後２時間血糖値を有する。糖尿病前症の診断は、典型的には、被験者が糖尿病前症を有するか否かを確定する場合に、血糖値のほかに複数の因子を考察し得る医療専門家によりなされる。
ある実施形態では、血糖値上昇を示す被験者は糖尿病を有する。ある実施形態では、被験者は、被験者の血糖値によって糖尿病を有すると同定される。ある種のこのような実施形態では、被験者は１２６ｍｇ／ｄＬより高い空腹時血糖値を有する。ある種のこのような実施形態では、被験者は、２００ｍｇ／ｄＬ以上の食後２時間血糖値を有する。糖尿病の診断は、典型的には、被験者が糖尿病を有するか否かを確定する場合に、血糖値のほかに複数の因子を考察し得る医療専門家によりなされる。
ある実施形態では、本明細書中で提供される方法は、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物の投与の前に血糖値をモニタリングすることを包含する。ある実施形態では、本明細書中で提供される方法は、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物の投与の後に血糖値を測定することを包含する。ある実施形態では、被験者は、毎日１回以上、血糖値を測定する。
ある実施形態では、血糖値を低減するための方法は、米国糖尿病会議または世界保健機関のような医療機関により望ましいと確定された血糖値に被験者の血糖値を下げることを包含する。ある実施形態では、被験者が食事を摂る前に測定される場合、血糖値は１３０ｍｇ／ｄＬより低い値に低減される。ある実施形態では、被験者が食事を摂った後に測定される場合、血糖値は１８０ｍｇ／ｄＬより低い値に低減される。
ある実施形態では、投与は、少なくとも週１回行なう。ある実施形態では、投与は２週間毎に１回行なう。ある実施形態では、投与は３週間毎に１回行なう。ある実施形態では、投与は４週間に１回行なう。投与頻度は、被験者における望ましい血糖値を達成するために医療専門家により設定され得る。投与頻度は、被験者の血糖値によって左右され得る。例えば、ある実施形態では、投与は、被験者が血糖値上昇を示す場合により頻度が高くなり得る。
ＨｂＡ１ｃレベルの測定は、被験者の血糖値が長期間に亘って如何に良好に制御されるかを確定するために用いられ得る。ＨｂＡ１ｃレベルは、血中の糖化ヘモグロビンの量の指標であり、被験者の血糖値が、ＨｂＡ１ｃレベルの測定前２〜３ヶ月に亘って如何に良好に管理されていたかの概算を提供し得る。高ＨｂＡ１ｃレベルは、眼性糖尿病、心疾患、腎疾患、神経障害または卒中のような糖尿病に関連した合併症を発症する危険を被験者に課し得る。このようなものとして、ある実施形態では、被験者のＨｂＡ１ｃレベルは、医療専門家により普通に考察される範囲内である、というのが望ましい。ある実施形態では、６％以下のＨｂＡ１ｃレベルが正常である。ある実施形態では、被験者のＨｂＡ１ｃレベルは７％以下である、と医療専門家は推奨し得る。ある実施形態では、投与はＨｂＡ１ｃレベル低減を生じる。
ある実施形態では、血糖値上昇を示す被験者は、インスリン抵抗性である。インスリンの主な機能のうちの１つは、血糖値を下げることである。その細胞がインスリンの作用に感受性である被験者は、正常範囲に血糖値を保持するために、相対的に少量のインスリンのみを必要とする。インスリン抵抗性である被験者は、同一の血糖低下作用を得るためには、より多くのインスリンを要する。インスリン抵抗性は、高インスリン血症を引き起こし得る。高インスリン血症は、高血圧、心疾患および心不全、肥満症（特に腹部肥満）、骨粗鬆症、ならびにある型の癌、例えば結腸癌、脳癌および前立腺癌と関連し得る。
インスリン抵抗性は、高インスリン血症性正常血糖クランプとして既知の手法（これは、低血糖血症を引き起こすことなくインスリンレベル増大を補償するために必要なグルコースの量を測定する）を用いて検出され得る。当該手法の間、インスリンは１０〜１２０ｍＵ／ｍ２／分で注入される。インスリン注入を補償するために、グルコースの２０％溶液が注入されて、血糖値を５〜５．５ｍｍｏｌ／Ｌに保持する。グルコース注入の速度は、５〜１０分毎に血糖値を点検することにより決定される。低用量インスリン注入は肝臓の応答を査定するためにより有用であり、一方、高用量インスリン注入は末梢（すなわち筋肉および脂肪）インスリン作用を査定するために有用である。試験の最後の３０分の間のグルコース注入速度は、インスリン感受性を確定する。高レベル（７．５ｍｇ／分以上）が必要とされる場合、被験者はインスリン感受性である。非常に低レベル（４．０ｍｇ／分以下）は、被験者がインスリン作用に抵抗性である、ということを示す。４．０〜７．５ｍｇ／分のレベルは、限定的でなく、糖耐性減損を示唆する。糖耐性減損は、インスリン抵抗性の早期徴候である。グルコーストレーサー、例えば３−３Ｈグルコース、６，６２Ｈ−グルコースまたは１−１３Ｃグルコースが、当該手法に用いられ得る。他の放射性形態のグルコースは、研究設定で用いられ得る。高インスリン血症期間の開始前に、３時間トレーサー注入は、グルコース産生の基本速度の決定を可能にする。クランプ手法中、血漿トレーサー濃度は、全身インスリン刺激性糖代謝、ならびに身体による糖産生（すなわち、内因性糖産生）の算定を可能にする。
ある実施形態では、被験者におけるインスリン抵抗性の改善方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはその前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、被験者はインスリン抵抗性を有する。ある実施形態では、方法は、インスリン抵抗性を有する被験者を選択することを包含する。
ある実施形態では、被験者におけるインスリン抵抗性の改善方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、血糖値上昇を示す被験者はインスリン抵抗性を有する。
ある実施形態では、糖尿病を有する被験者は、インスリン抵抗性を有する。ある実施形態では、２型糖尿病を有する被験者は、インスリン抵抗性を有する。ある実施形態では、１型糖尿病を有する被験者は、インスリン抵抗性を有する。
ある実施形態では、被験者における糖新生を低減するための方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはその前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、被験者は糖新生上昇を示す。ある実施形態では、被験者は、糖新生上昇を示すと同定される。ある実施形態では、投与することは糖新生の低減を生じる。ある実施形態では、ピルビン酸負荷試験を用いて、被験者における糖新生を測定する。ある実施形態では、血糖値を用いて、被験者における糖新生を測定する。ある実施形態では、糖新生率が被験者において測定される。ある実施形態では、糖新生の低減は、糖新生率の低減である。ある実施形態では、糖新生率は、投与前に被験者において測定される。ある実施形態では、糖新生率は、投与後に被験者において測定される。
ある実施形態では、被験者における血漿コレステロールの低減方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはその前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、被験者は、血漿コレステロール上昇を示す。ある実施形態では、被験者は血漿コレステロール上昇を示すと同定される。ある実施形態では、投与は、血漿コレステロールを低減する。ある実施形態では、血漿コレステロールは血漿ＬＤＬコレステロールである。ある実施形態では、血漿コレステロールは血漿ＶＬＤＬコレステロールである。
ある実施形態では、被験者における血漿コレステロールの低減方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。
ある実施形態では、被験者における代謝障害の治療方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはその前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、被験者は代謝障害を有する。ある実施形態では、被験者は、代謝障害を有すると同定される。ある実施形態では、代謝障害としては、糖尿病前症、糖尿病（例えば１型または２型糖尿病）、代謝性症候群、肥満症または糖尿病性異脂肪血症、高血糖症、低血糖症および高インスリン血症が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、被験者は、１つ以上の代謝障害に関して診断される。被験者は、医療専門家に周知の医学的試験を施した後に代謝障害に関して診断され得る。
ある実施形態では、被験者における代謝障害の治療方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。
脂肪性肝疾患は、しばしば代謝障害と関連する。ある実施形態では、代謝障害を有する被験者は脂肪性肝疾患も有する。ある実施形態では、脂肪性肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患である。ある実施形態では、脂肪性肝疾患は、アルコール性脂肪性肝疾患である。ある実施形態では、脂肪性肝疾患はアルコール性脂肪性肝炎である。
ある実施形態では、被験者における代謝障害の開始を防止するための方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはその前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、被験者は代謝障害を発症する危険がある。ある実施形態では、被験者は、代謝障害を発症する危険があると同定される。ある実施形態では、代謝障害は、糖尿病前症、糖尿病（例えば１型または２型糖尿病）、代謝性症候群、肥満症または糖尿病性異脂肪血症、高血糖症、低血糖症、高インスリン血症、ケトアシドーシスおよびセリアック病である。
ある実施形態では、被験者における代謝障害の開始を防止するための方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。
ある実施形態では、被験者における代謝障害の開始を遅延するための方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはその前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、被験者は代謝障害を発症する危険がある。ある実施形態では、被験者は、代謝障害を発症する危険があると同定される。ある実施形態では、代謝障害としては、糖尿病前症、糖尿病（例えば１型または２型糖尿病）、代謝性症候群、肥満症または糖尿病性異脂肪血症、高血糖症、低血糖症および高インスリン血症が挙げられるが、これらに限定されない。
ある実施形態では、被験者における代謝障害の開始を遅延するための方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。
ある実施形態では、被験者は１つ以上の代謝障害を有する。ある実施形態では、被験者は１つ以上の代謝障害に関して診断されている。被験者は、医療専門家に周知の医学的試験を施した後に代謝障害に関して診断され得る。
処置に対する被験者の応答は、代謝障害を診断するために用いられるものと類似の試験、例えば血糖値試験、糖耐性試験およびＨｂＡ１ｃ試験により評価され得る。処置に対する応答は、処置後試験結果を処置前試験結果と比較することによっても査定され得る。
脂肪性肝疾患は、代謝障害と関連し得る。ある実施形態では、脂肪性肝疾患は非アルコール性脂肪性肝疾患である。ある実施形態では、脂肪性肝疾患はアルコール性脂肪性肝疾患である。ある実施形態では、脂肪性肝疾患はアルコール性脂肪性肝炎である。
ある実施形態では、被験者における脂肪性肝疾患の治療方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはその前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。
ある実施形態では、被験者における脂肪性肝疾患の治療方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。
ある実施形態では、被験者における脂肪性肝疾患の防止方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはその前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。ある種のこのような実施形態では、被験者は脂肪性肝疾患を発症する危険がある。
ある実施形態では、被験者における脂肪性肝疾患の防止方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。
ある実施形態では、被験者における脂肪性肝疾患の開始を遅延するための方法であって、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７あるいはその前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。ある種のこのような実施形態では、被験者は脂肪性肝疾患を発症する危険がある。
ある実施形態では、被験者における脂肪性肝疾患の開始を遅延するための方法であって、７〜１２連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を被験者に投与することを包含する方法が、本明細書中で提供される。
ある実施形態では、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７の活性は、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７と相補的な核酸塩基を有する１つ以上の配列を含むマイクロＲＮＡスポンジの使用により抑制される。「マイクロＲＮＡスポンジ」は、当該マイクロＲＮＡとの多重タンデム結合部位を含有する強いプロモーターから発現される転写物の形態でのマイクロＲＮＡの競合的阻害剤を意味する。これらのスポンジをコードするベクターが細胞中に誘導される場合、スポンジは、化学的修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドと少なくとも同じくらい強力にマイクロＲＮＡ標的を抑圧する。それらは、具体的には、単一スポンジが完全マイクロＲＮＡシードファミリーを遮断するために用いられ得るよう、相補的ヘプタマーシードでマイクロＲＮＡを抑制する。ある実施形態では、マイクロＲＮＡシードファミリーは、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７を含む。
ある種の化合物
本明細書中で提供される化合物は、代謝障害の治療のために有用である。ある実施形態では、化合物はオリゴヌクレオチドを含む。ある種のこのような実施形態では、化合物はオリゴヌクレオチドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは修飾オリゴヌクレオチドである。
ある種のこのような実施形態では、化合物は、相補鎖とハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを含み、すなわち、化合物は二本鎖オリゴマー化合物を含む。ある実施形態では、相補鎖とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、少なくとも１つの平滑末端を形成する。ある種のこのような実施形態では、相補鎖とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、二本鎖オリゴマー化合物の各末端に平滑末端を形成する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの末端は、相補鎖の連結ヌクレオシドの数に比して１つ以上の付加的連結ヌクレオシドを含むある実施形態では、１つ以上の付加的ヌクレオシドはオリゴヌクレオチドの５’末端にある。ある実施形態では、１つ以上の付加的ヌクレオシドはオリゴヌクレオチドの３’末端にある。ある実施形態では、１つ以上の付加的ヌクレオシドのうちの一ヌクレオシドの少なくとも１つの核酸塩基は、標的ＲＮＡと相補的である。ある実施形態では、各々の１つ以上の付加的ヌクレオシドの各核酸塩基は標的ＲＮＡと相補的である。ある実施形態では、相補鎖の一末端は、オリゴヌクレオチドの連結ヌクレオシドの数に比して、１つ以上の付加的連結ヌクレオシドを含む。ある実施形態では、１つ以上の付加的連結ヌクレオシドは相補鎖の３’末端にある。ある実施形態では、１つ以上の付加的連結ヌクレオシドは相補鎖の５’末端にある。ある実施形態では、２つの付加的連結ヌクレオシドは一末端に連結される。ある実施形態では、１つの付加的ヌクレオシドは一末端に連結される。
ある実施形態では、化合物は結果的に生じるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを増強する１つ以上の部分と共役されるオリゴヌクレオチドを含む。ある種のこのような実施形態では、当該部分は、コレステロール部分または脂質部分である。共役のための付加的部分としては、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび染料が挙げられる。ある実施形態では、共役基は、オリゴヌクレオチドに直接結合される。ある実施形態では、共役基は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、不飽和（例えば二重または三重結合）、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、６−アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸまたはＡＨＡ）、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換または非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、および置換または非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルから選択される連結部分によりオリゴヌクレオチドと結合される。ある種のこのような実施形態では、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルから選択される。
ある種のこのような実施形態では、化合物は、例えばヌクレアーゼ安定性のような特性を増強するためにオリゴヌクレオチドの一方または両方の末端に結合される１つ以上の安定化基を有するオリゴヌクレオチドを含む。安定化基に含まれるのは、キャップ構造である。これらの末端修飾は、エキソヌクレアーゼ分解からオリゴヌクレオチドを保護し、細胞内での送達および／または局在化に役立ち得る。キャップは、５’末端（５’キャップ）にまたは３’末端（３’キャップ）に存在し得るし、あるいは両末端に存在し得る。キャップ構造としては、例えば逆デオキシ脱塩基キャップが挙げられる。
適切なキャップ構造としては、４′，５′−メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４′−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３′，４′−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３−３’−逆ヌクレオチド部分、３’−３’−逆脱塩基部分、３′−２′−逆ヌクレオチド部分、３’−２’−逆脱塩基部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホルアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、架橋メチルホスホネート部分および非架橋メチルホスホネート部分 ５’−アミノ−アルキルホスホネート、１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート、６−アミノヘキシルホスフェート、１，２−アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、５’−５’−逆ヌクレオチド部分、５’−５’−逆脱塩基部分、５’−ホスホルアミデート、５’−ホスホロチオエート、５’−アミノ、架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミデート、ホスホロチオエートおよび５’−メルカプト部分が挙げられる。
ある種の核酸塩基配列
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体と相補的である配列を有する。本明細書中に記載される成熟ｍｉＲＮＡの核酸塩基配列およびそれらの対応するステム−ループ配列は、http://microrna.sanger.ac.uk/で見出されるｍｉＲＮＡ配列および注釈のオンライン検索可能データベースであるｍｉＲＢａｓｅで見出される配列である。ｍｉＲＢａｓｅ配列データベースにおけるエントリーは、ｍｉＲＮＡ転写物の予測ヘアピン部分（ステム−ループ）を、成熟ｍｉＲＮＡ配列の一および配列に関する情報とともに表す。データベース中のｍｉＲＮＡステム−ループ配列は厳密には前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）ではなく、ある場合には、プレｍｉＲＮＡと、推定一次転写物からのいくつかのフランキング配列とを含み得る。本明細書中に記載されるｍｉＲＮＡ核酸塩基配列は、任意のバージョンのｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＢａｓｅ配列データベースのリリース１０．０に記載された配列、ならびにｍｉＲＮＡＢａｓｅ配列データベースの任意の初期リリースに記載された配列を包含する。配列データベースリリースは、ある種のｍｉＲＮＡの改名を生じ得る。本発明の組成物は、本明細書中に記載されるｍｉＲＮＡの任意の核酸塩基配列バージョンと相補的である修飾オリゴヌクレオチドを包含する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体と相補的である核酸塩基配列を有する。したがって、ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、その標的ｍｉＲＮＡまたは前駆体配列に関して１つ以上の不整合塩基対を有し得るし、依然としてその標的配列とハイブリダイズすることができる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体と完全に相補的である核酸塩基配列を有する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０３−１ステム−ループ配列、ｍｉＲ−１０３−２ステム−ループ配列およびｍｉＲ−１０７ステム−ループ配列から選択されるｍｉＲＮＡステム−ループ配列の核酸塩基配列と相補的である配列を有する。
ある実施形態では、ｍｉＲＮＡの核酸塩基配列が配列番号１または２から選択される場合、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡの核酸塩基配列と相補的である配列を有する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０３−１ステム−ループ配列（配列番号３）の領域と相補的である核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３の核酸塩基４８〜７０の領域と相補的である核酸塩基配列を有する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０３−２ステム−ループ配列（配列番号４）の領域と相補的である核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４の核酸塩基４８〜７０の領域と相補的である核酸塩基配列を有する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０７ステム−ループ配列（配列番号５）の領域と相補的である核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号５の核酸塩基５０〜７２の領域と相補的である核酸塩基配列を有する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０３（配列番号１）の核酸塩基配列と相補的である核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基配列ＵＣＡＵＡＧＣＣＣＵＧＵＡＣＡＡＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号６）の核酸塩基配列を含む核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基配列ＵＣＡＵＡＧＣＣＣＵＧＵＡＣＡＡＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号６）からなる核酸塩基配列を有する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０７（配列番号２）の核酸塩基配列と相補的である核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基配列ＵＧＡＵＡＧＣＣＣＵＧＵＡＣＡＡＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号７）の核酸塩基配列を含む核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基配列ＵＧＡＵＡＧＣＣＣＵＧＵＡＣＡＡＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号７）からなる核酸塩基配列を有する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の核酸塩基配列と相補的である核酸塩基配列を有し、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７間の配列類似性の結果として、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７の両方の活性を抑制し得る。ｍｉＲ−１０３と完全に相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドはｍｉＲ−１０７に比して１つの整合を有するだけであり、したがって、ｍｉＲ−１０３と完全に相補的なこのようなオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７の両方の活性を抑制し得る。同様に、ｍｉＲ−１０７と完全に相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０３に比して１つの不整合を有するだけであり、したがって、ｍｉＲ−１０７と完全に相補的なこのようなオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７の両方の活性を抑制し得る。このようなものとして、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７の一方または両方と相補的なオリゴヌクレオチドは、本明細書中で提供される方法に用いられ得る。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１（ｍｉＲ−１０３）の核酸塩基１〜２１と、または配列番号２（ｍｉＲ−１０７）の核酸塩基１〜２１と相補的である核酸塩基配列を有する。このようなオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７の両方と１００％相補的である。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基配列ＡＵＡＧＣＣＣＵＧＵＡＣＡＡＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号８）を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基配列ＡＵＡＧＣＣＣＵＧＵＡＣＡＡＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号８）からなる。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７間で共有されるシード配列と相補的である核酸塩基配列を含む。本明細書中に記載される任意の長さを有するオリゴヌクレオチドは、シード整合配列を含み得る。ある種のこのような実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、７連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、８連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、９連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１０連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１１連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１２連結ヌクレオシドからなる。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、核酸塩基配列ＡＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号１０）を含み、これは、ｍｉＲ−１０３（配列番号１）およびｍｉＲ−１０７（配列番号２）のヌクレオチド１〜８と相補的である。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は核酸塩基配列ＡＵＧＣＵＧＣ（配列番号１１）を含み、これは、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７のヌクレオチド１〜７と相補的である。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は核酸塩基配列ＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号１２）を含み、これは、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７のヌクレオチド１〜７と相補的である。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は核酸塩基配列ＡＵＧＣＵＧＣ（配列番号１３）を含み、これは、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７のヌクレオチド２〜８と相補的である。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は核酸塩基配列ＧＣＵＧＣＵ（配列番号１４）を含み、これは、ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７のヌクレオチド１〜６と相補的である。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は核酸塩基配列ＵＧＣＵＧＣ（配列番号１５）を含み、これは、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７のヌクレオチド２〜７と相補的である。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は核酸塩基配列ＡＵＧＣＵＧ（配列番号１６）を含み、これは、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７のヌクレオチド３〜８と相補的である。
７、８、９、１０または１１連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８または２〜７と相補的な修飾オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡの活性を抑制することが示されている。８連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜９と相補的な修飾オリゴヌクレオチドも、ｍｉＲＮＡの活性を抑制することが示されている。これらの修飾オリゴヌクレオチドのあるものは、各ヌクレオシドにＬＮＡ糖修飾を有する。このような抑制活性は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００９／０４３３５３（ｍｉＲＮＡシード配列をターゲッティングする修飾オリゴヌクレオチドについてのその記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３、４および５から選択されるｍｉＲステム−ループ配列の核酸塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸塩基配列と相補的である核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３、４および５から選択されるｍｉＲステム−ループ配列の核酸塩基配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％の同一性を、または１００％の同一性を有する核酸塩基配列と相補的である核酸塩基配列を有する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１および２から選択される核酸塩基配列を有するｍｉＲＮＡの核酸塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸塩基配列と相補的である核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１および２から選択されるｍｉＲＮＡ核酸塩基配列の核酸塩基配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％の同一性を、または１００％の同一性を有する核酸塩基配列と相補的である核酸塩基配列を有する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、本明細書中に列挙されるｍｉＲＮＡ核酸塩基配列またはその前駆体と完全に相補的である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の核酸塩基配列に関して１つの不整合を有する核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の核酸塩基配列に関して２つの不整合を有する核酸塩基配列を有する。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の核酸塩基配列に関して２つ以下の不整合を有する核酸塩基配列を有する。ある種のこのような実施形態では、不整合核酸塩基は連続的である。ある種のこのような実施形態では、不整合核酸塩基は連続的でない。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、それが相補的である成熟ｍｉＲの長さと等しい多数の連結ヌクレオシドからなる。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの連結ヌクレオシドの数は、それが相補的である成熟ｍｉＲＮＡの長さより短い。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの連結ヌクレオシドの数は、それが相補的である成熟ｍｉＲの長さより１つ短い。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端に１つ少ないヌクレオシドを有する。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３’末端に１つ少ないヌクレオシドを有する。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは５’末端に２つ少ないヌクレオシドを有する。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３’末端に２つ少ないヌクレオシドを有する。ｍｉＲＮＡの長さより短い多数の連結ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの各核酸塩基がｍｉＲＮＡ中の対応する位置の各核酸塩基と相補的である場合、ｍｉＲＮＡ配列の一部と完全に相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるとみなされる。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの連結ヌクレオシドの数は、それが相補的であるｍｉＲＮＡの長さより大きい。ある種のこのような実施形態では、付加的ヌクレオシドの核酸塩基は、ｍｉＲＮＡステム−ループ配列の核酸塩基と相補的である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの連結ヌクレオシドの数は、それが相補的であるｍｉＲＮＡの長さより１つ大きい。ある種のこのような実施形態では、付加的ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの３’末端にある。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの連結ヌクレオシドの数は、それが相補的であるｍｉＲＮＡの長さより２つ大きい。ある種のこのような実施形態では、２つの付加的ヌクレオシドがオリゴヌクレオチドの５’末端にある。ある種のこのような実施形態では、２つの付加的ヌクレオシドがオリゴヌクレオチドの３’末端にある。ある種のこのような実施形態では、１つの付加的ヌクレオシドはオリゴヌクレオチドの５’末端に位置し、１つの付加的ヌクレオシドはオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列の一部はｍｉＲＮＡの核酸塩基配列と完全に相補的であるが、しかし全部の修飾オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡと完全に相補的であるというわけではない。ある種のこのような実施形態では、完全相補的部分を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオシドの数は、ｍｉＲＮＡの長さより大きい。例えば、２４連結ヌクレオシドからなるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド１〜２３の核酸塩基が２３核酸塩基長であるｍｉＲＮＡの対応する部分と各々相補的である場合、ｍｉＲＮＡの核酸塩基配列と完全に相補的である２３ヌクレオシド部分を有し、ｍｉＲＮＡの核酸塩基配列と約９６％の全体的相補性を有する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、ｍｉＲＮＡの核酸塩基配列の一部と完全に相補的である。例えば、２２連結ヌクレオシドからなるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド１〜２２の核酸塩基が２３核酸塩基長であるｍｉＲＮＡの対応する部分と各々相補的である場合、ｍｉＲＮＡの核酸塩基配列の２２核酸塩基部分と完全に相補的である。このようなオリゴヌクレオチドは、全ｍｉＲＮＡの核酸塩基配列と約９６％の全体的相補性を有し、そしてｍｉＲＮＡの２２核酸塩基部分と１００％の相補性を有する。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の核酸塩基配列の一部と完全に相補的である。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの１５連続核酸塩基は、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の１５連続核酸塩基と各々相補的である。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの１６連続核酸塩基は、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の１６連続核酸塩基と各々相補的である。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの１７連続核酸塩基は、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の１７連続核酸塩基と各々相補的である。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの１８連続核酸塩基は、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の１８連続核酸塩基と各々相補的である。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの１９連続核酸塩基は、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の１９連続核酸塩基と各々相補的である。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの２０連続核酸塩基は、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の２０連続核酸塩基と各々相補的である。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの２１連続核酸塩基は、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の２１連続核酸塩基と各々相補的である。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの２２連続核酸塩基は、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の２２連続核酸塩基と各々相補的である。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの２３連続核酸塩基は、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の２３連続核酸塩基と各々相補的である。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの２４連続核酸塩基は、ｍｉＲＮＡまたはその前駆体の２４連続核酸塩基と各々相補的である。
本明細書中で記述される核酸塩基配列（例としては実施例にならびに配列表に見出されるものが挙げられるが、これらに限定されない）は、核酸に対する任意の修飾とは無関係である。このようなものとして、配列番号で明記される核酸は、独立して、１つ以上の糖部分に対する、１つ以上のヌクレオシド間結合に対する、および／または１つ以上の核酸塩基に対する１つ以上の修飾を含み得る。
このファイルを伴う配列表は、必要に応じて「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」として各核酸塩基配列を同定するが、しかし実際には、それらの配列は化学的修飾の任意の組合せで修飾され得る。修飾オリゴヌクレオチドを記載するための「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」といったような呼称はある程度随意である、と当業者は容易に理解する。例えば、２’−ＯＨ糖部分およびチミン塩基を含むヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、修飾糖を有するＤＮＡ（ＤＮＡの天然２’−Ｈに代わる２’−ＯＨ）として、または修飾塩基を有するＲＮＡ（ＲＮＡの天然ウラシルに代わるチミジン（メチル化ウラシル））として記載され得る。
したがって、本明細書中で提供される核酸配列（例えば配列表中のものが挙げられるが、これらに限定されない）は、天然または修飾ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの任意の組合せを含有する核酸（例えば、修飾核酸塩基を有する核酸が挙げられるが、これらに限定されない）を包含するよう意図される。さらなる例（限定されない）として、核酸塩基配列「ＡＴＣＧＡＴＣＧ」を有するオリゴマー化合物は、修飾または非修飾にかかわらず、このような核酸塩基配列を有する任意のオリゴマー化合物を包含し、例としては、ＲＮＡ塩基を含む化合物、例えば配列「ＡＵＣＧＡＵＣＧ」を有するもの、ならびにいくつかのＤＮＡ塩基およびいくつかのＲＮＡ塩基、例えば「ＡＵＣＧＡＴＣＧ」を有するもの、他の修飾塩基、例えば「ＡＴｍｅＣＧＡＵＣＧ」（ここで、ｍｅＣは５位置にメチル基を含むシトシン塩基を示す）を有するオリゴマー化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
ある種の修飾オリゴヌクレオチド
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、７〜２５連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、７〜１１連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２〜３０連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５〜３０連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１９〜２４連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２１〜２４連結ヌクレオシドからなる。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは７連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは８連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは９連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１０連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１１連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１２連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１３連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１４連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１５連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１６連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１７連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１８連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは１９連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２０連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２１連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２２連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２３連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２４連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２５連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２６連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２７連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２８連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは２９連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは３０連結ヌクレオシドからなる。
ある種の修飾
ある実施形態では、本明細書中で提供されるオリゴヌクレオチドは、核酸塩基、糖および／またはヌクレオシド間結合に対する１つ以上の修飾を含み得るし、このようなものとして、修飾オリゴヌクレオチドである。例えば細胞取込み増強、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸標的に対する親和性増強、ならびにヌクレアーゼの存在下での安定性増大といったような望ましい特性のため、非修飾型のものより修飾型の核酸塩基、糖および／またはヌクレオシド間結合が選択され得る。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。ある種のこのような実施形態では、修飾ヌクレオシドは安定化ヌクレオシドである。安定化ヌクレオシドの一例は、糖修飾ヌクレオシドである。
ある実施形態では、修飾ヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。ある種のこのような実施形態では、糖修飾ヌクレオシドはさらに、天然または修飾複素環式塩基部分および／または天然または修飾ヌクレオシド間結合を含み得るし、糖修飾とは関係なくさらなる修飾を包含し得る。ある実施形態では、糖修飾ヌクレオシドは２’−修飾ヌクレオシドであり、この場合、糖環は天然リボースまたは２’−デオキシ−リボースから２’炭素で修飾される。
ある実施形態では、２’−修飾ヌクレオシドは二環式糖部分を有する。ある実施形態では、二環式糖部分はアルファ立体配置のＤ糖である。ある実施形態では、二環式糖部分はベータ立体配置のＤ糖である。ある実施形態では、二環式糖部分はアルファ立体配置のＬ糖である。ある実施形態では、二環式糖部分はベータ立体配置のＬ糖である。
ある実施形態では、二環式糖部分は、２’および４’−炭素原子間に架橋基を含む。ある種のこのような実施形態では、架橋基は１〜８連結ビラジカル基を含む。ある実施形態では、二環式糖部分は１〜４連結ビラジカル基を含む。ある実施形態では、二環式糖部分は２または３連結ビラジカル基を含む。ある実施形態では、二環式糖部分は２連結ビラジカル基を含む。ある実施形態では、連結ビラジカル基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ１）−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲ１）−、−Ｓｉ（Ｒ１）（Ｒ２）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−および−Ｃ（＝Ｓ）−から選択され；この場合、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、置換オキシ（−Ｏ−）、アミノ、置換アミノ、アジド、カルボキシル、置換カルボキシル、アシル、置換アシル、ＣＮ、チオール、置換チオール、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｈ）、置換スルホニル、スルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｈ）または置換スルホキシルであり；ならびに置換基は、各々独立して、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、アミノ、置換アミノ、アシル、置換アシル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルコキシ、置換Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アミノアルコキシまたは保護基である。
いくつかの実施形態では、二環式糖部分は、−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（アルキル）−、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−、−Ｎ（アルキル）−（ＣＨ２）ｐ−、−Ｏ−ＣＨ（アルキル）−、−（ＣＨ（アルキル））−（ＣＨ２）ｐ−、−ＮＨ−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−、−Ｎ（アルキル）−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−または−Ｏ−Ｎ（ａｌｋｙｌ）−（ＣＨ２）ｐ−（ここで、ｐは１、２、３、４または５であり、各アルキル基はさらに置換され得る）から選択されるビラジカル基により２’および４’炭素原子間に架橋される。ある実施形態では、ｐは１、２または３である。ある実施形態では、二環式糖部分は−Ｏ−（ＣＨ２）であって、「ロックド核酸」または「ＬＮＡ」としても既知である。
ある実施形態では、２’−修飾ヌクレオシドは、ハロ、アリル、アミノ、アジド、ＳＨ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｏ−、Ｓ−またはＮ（Ｒｍ）−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ（Ｒｍ）−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ（Ｒｍ）−アルキニル；Ｏ−アルキレニル−Ｏ−アルキル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、Ｏ−アラルキル、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択される２’−置換基を含み、この場合、ＲｍおよびＲｎは、各々独立して、Ｈ、アミノ保護基あるいは置換または非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。これらの２’−置換基はさらに、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ（ＮＯ２）、チオール、チオアルコキシ（Ｓ−アルキル）、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルから独立して選択される１つ以上の置換基で置換され得る。
ある実施形態では、２’−修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＮＨ２、Ｎ３、ＯＣＦ３、Ｏ−ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２、ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、−Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２およびＮ−置換アセトアミド（Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択される２’−置換基を含み、この場合、ＲｍおよびＲｎは、各々独立して、Ｈ、アミノ保護基あるいは置換または非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。
ある実施形態では、２’−修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＯＣＦ３、Ｏ−ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ−（ＣＨ３）２およびＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３から選択される２’−置換基を含む。
ある実施形態では、２’−修飾ヌクレオシドは、Ｆ、Ｏ−ＣＨ３およびＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３から選択される２’−置換基を含む。
ある実施形態では、糖修飾ヌクレオシドは、４’−チオ修飾ヌクレオシドである。ある実施形態では、糖修飾ヌクレオシドは４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシドである。４’−チオ修飾ヌクレオシドは、β−Ｄ−リボヌクレオシドを有し、この場合、４’−Ｏは４’−Ｓに置き換えられる。４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシドは、２’置換基に取り替えられる２’ＯＨを有する４’−チオ修飾ヌクレオシドである。適切な２’−置換基としては、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３および２’−Ｆが挙げられる。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは１つ以上のヌクレオシド間修飾を含む。ある種のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。ある実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合はリン原子を含む。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
ある実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合はリン原子を含まない。ある種のこのような実施形態では、ヌクレオシド間結合は、短鎖アルキルヌクレオシド間結合により形成される。ある種のこのような実施形態では、ヌクレオシド間結合はシクロアルキルヌクレオシド間結合により形成される。ある種のこのような実施形態では、ヌクレオシド間結合は混合異種原子およびアルキルヌクレオシド間結合により形成される。ある種のこのような実施形態では、ヌクレオシド間結合は、混合異種原子およびシクロアルキルヌクレオシド間結合により形成される。ある種のこのような実施形態では、ヌクレオシド間結合は、１つ以上の短鎖異種原子性ヌクレオシド間結合により形成される。ある種のこのような実施形態では、ヌクレオシド間結合はアミド主鎖を有する。ある種のこのような実施形態では、ヌクレオシド間結合は、混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成成分部分を有する。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは１つ以上の修飾核酸塩基を含む。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは１つ以上の５−メチルシトシンを含む。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各シトシンは５−メチルシトシンを含む。
ある実施形態では、修飾核酸塩基は、５−ヒドロキシメチルシトシン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンから選択される。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンから選択される。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、例えば２アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンから選択される。
ある実施形態では、修飾核酸塩基は多環式複素環を含む。ある実施形態では、修飾核酸塩基は三環式複素環を含む。ある実施形態では、修飾核酸塩基はフェノキサジン誘導体を含む。ある実施形態では、フェノキサジンはさらに修飾されて、Ｇ−クランプとして既知の核酸塩基を形成し得る。
ある種のオリゴヌクレオチドモチーフ
本発明の修飾オリゴヌクレオチドに関する適切なモチーフとしては、完全修飾、均一修飾、位置修飾およびギャップマーが挙げられるが、これらに限定されない。均一修飾モチーフを含めた完全修飾モチーフを有する修飾オリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡを標的にするよう意図され得る。代替的には、均一修飾モチーフを含めた完全修飾モチーフを有する修飾オリゴヌクレオチドは、プリｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡのある部位を標的にして、成熟ｍｉＲＮＡへのｍｉＲＮＡの前駆体のプロセシングを遮断するよう意図される。完全修飾モチーフまたは均一修飾モチーフを有する修飾オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ活性の有効な阻害剤である。
ある実施形態では、完全修飾オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドに糖修飾を含む。ある種のこのような実施形態では、過半数のヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドであり、残りのヌクレオシドは２’−フルオロヌクレオシドである。ある実施形態では、複数のヌクレオシドの各々は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドであり、複数のヌクレオシドの各々は二環式ヌクレオシドである。ある種のこのような実施形態では、完全修飾オリゴヌクレオチドはさらに、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある種のこのような実施形態では、完全糖修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。ある実施形態では、完全糖修飾オリゴヌクレオチドはさらに、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある種のこのような実施形態では、完全糖修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
ある実施形態では、完全修飾オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシド間結合で修飾される。ある種のこのような実施形態では、完全修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
ある実施形態では、均一修飾オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドで同一糖修飾を含む。ある種のこのような実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾を含む。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル糖修飾を含む。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’−フルオロ糖修飾を含む。ある種のこのような実施形態では、均一修飾オリゴヌクレオチドはさらに、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある種のこのような実施形態では、均一糖修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。ある実施形態では、均一糖修飾オリゴヌクレオチドはさらに、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある種のこのような実施形態では、均一糖修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
ある実施形態では、均一修飾オリゴヌクレオシドは、全体にわたって同一ヌクレオシド間結合修飾を含む。ある種のこのような実施形態では、均一修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
ある実施形態では、位置修飾オリゴヌクレオチドは連結ヌクレオシドの領域を含み、この場合、各領域の各ヌクレオシドは同一糖部分を含み、そして各領域の各ヌクレオシドは隣接領域のものとは異なる糖部分を含む。
ある実施形態では、位置修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０の２’−フルオロ修飾ヌクレオシドを含む。このような位置修飾オリゴヌクレオチドは、以下の式Ｉにより表され得る：
５’−Ｔ１−（Ｎｕ１−Ｌ１）ｎ１−（Ｎｕ２−Ｌ２）ｎ２−Ｎｕ２−（Ｌ３−Ｎｕ３）ｎ３−Ｔ２−３’：
（式中、Ｎｕ１およびＮｕ３は、各々独立して、安定化ヌクレオシドであり；
少なくとも１０のＮｕ２は２’−フルオロヌクレオシドであり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、各々独立して、ヌクレオシド間結合であり；
Ｔ１およびＴ２は、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、任意連結共役基またはカップリング基であり；
ｎ１は、０〜約３であり；
ｎ２は、約１４〜約２２であり；
ｎ３は、０〜約３であるが；
但し、ｎ１が０である場合には、Ｔ１はＨまたはヒドロキシル保護基ではなく、そしてｎ３が０である場合には、Ｔ２はＨまたはヒドロキシル保護基ではない）。
ある種のこのような実施形態では、ｎ１およびｎ３は、各々独立して、１〜約３である。ある実施形態では、ｎ１およびｎ３は、各々独立して、２〜約３である。ある実施形態では、ｎ１は１または２であり、ｎ３は２または３である。ある実施形態では、ｎ１およびｎ３は、各々２である。ある実施形態では、ｎ１およびｎ３の少なくとも一方は０より大きい。ある実施形態では、ｎ１およびｎ３は、各々０より大きい。ある実施形態では、ｎ１およびｎ３の一方は０より大きい。ある実施形態では、ｎ１およびｎ３の一方は１より大きい。
ある実施形態では、ｎ２は１６〜２０である。ある実施形態では、ｎ２は１７〜１９である。ある実施形態では、ｎ２は１８である。ある実施形態では、ｎ２は１９である。ある実施形態では、ｎ２２０である。
ある実施形態では、Ｎｕ２ヌクレオシドのうちの約２〜約８は安定化ヌクレオシドである。ある実施形態では、Ｎｕ２ヌクレオシドのうちの約２〜約６は安定化ヌクレオシドである。ある実施形態では、Ｎｕ２ヌクレオシドのうちの約３〜約４は安定化ヌクレオシドである。ある実施形態では、Ｎｕ２ヌクレオシドのうちの３つは安定化ヌクレオシドである。
ある実施形態では、Ｎｕ２安定化ヌクレオシドの各々は、２〜約８の２’−フルオロヌクレオシドによりＮｕ３安定化ヌクレオシドから分離される。ある実施形態では、Ｎｕ２安定化ヌクレオシドの各々は、３〜約８の２’−フルオロヌクレオシドによりＮｕ３安定化ヌクレオシドから分離される。ある実施形態では、Ｎｕ２安定化ヌクレオシドの各々は、５〜約８の２’−フルオロヌクレオシドによりＮｕ３安定化ヌクレオシドから分離される。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは２〜約６のＮｕ２安定化ヌクレオシドを含む。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは３つのＮｕ２安定化ヌクレオシドを含む。
ある実施形態では、Ｎｕ２安定化ヌクレオシドの各々は、１連続配列で一緒に連結される。ある実施形態では、Ｎｕ２安定化ヌクレオシドのうちの少なくとも２つは、２’−フルオロヌクレオシドのうちの少なくとも１つにより分離される。ある実施形態では、Ｎｕ２安定化ヌクレオシドのうちの各々は、２’−フルオロヌクレオシドのうちの少なくとも１つにより分離される。
ある実施形態では、Ｎｕ２２’−フルオロヌクレオシドのうちの少なくとも２連続配列は安定化ヌクレオシドのうちの少なくとも１つにより分離され、この場合、連続配列の各々が同数の２’−フルオロヌクレオシドを有する。
ある実施形態では、Ｔ１およびＴ２は、各々独立して、Ｈまたはヒドロキシル保護基である。ある実施形態では、Ｔ１およびＴ２のうちの少なくとも１つは４，４’−ジメトキシトリチルである。ある実施形態では、Ｔ１およびＴ２のうちの少なくとも１つは任意に連結される接合基である。ある実施形態では、Ｔ１およびＴ２のうちの少なくとも１つはキャッピング基である。ある実施形態では、キャッピング基は逆デオキシ脱塩基基である。
ある実施形態では、位置修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある種のこのような実施形態では、位置修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合は修飾ヌクレオシド間結合である。ある実施形態では、位置修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ある種のこのような実施形態では、位置修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
ある実施形態では、位置修飾モチーフは、以下の式ＩＩにより表され、これは、連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを表す：
Ｔ１−（Ｎｕ１）ｎ１−（Ｎｕ２）ｎ２−（Ｎｕ３）ｎ３−（Ｎｕ４）ｎ４−（Ｎｕ５）ｎ５−Ｔ２：
（式中、Ｎｕ１およびＮｕ５は、独立して、２’安定化ヌクレオシドであり；
Ｎｕ２およびＮｕ４は、２’−フルオロヌクレオシドであり；
Ｎｕ３は、２’−修飾ヌクレオシドであり；
ｎ１およびｎ５は、各々独立して、０〜３であり；
ｎ２＋ｎ４の合計は、１０〜２５であり；
ｎ３は、０〜５であり；そして
Ｔ１およびＴ２は、各々独立して、Ｈおよびヒドロキシル保護基、任意連結共役基またはキャッピング基である）。
ある実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１６である。ある実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１７である。ある実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１８である。ある実施形態では、ｎ１は２であり；ｎ３は２または３であり；そしてｎ５は２である。
ある実施形態では、Ｎｕ１およびＮｕ５は、独立して、２’−修飾ヌクレオシドである。ある実施形態では、各ヌクレオシド間結合は修飾ヌクレオシド間結合である。ある種のこのような実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
ある実施形態では、ヌクレオシドは修飾核酸塩基を含む。ある実施形態では、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドがシトシンを含む場合、シトシンは５−メチルシトシンである。
ある実施形態では、Ｎｕ１はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、Ｎｕ３はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、そしてＮｕ５はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３である。
ある実施形態では、Ｎｕ１はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、Ｎｕ３はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、Ｎｕ５はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、Ｔ１はＨであり、そしてＴ２はＨである。
ある実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１３である。ある実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１４である。ある実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１５である。ある実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１６である。ある実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１７である。ある実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１８である。
ある実施形態では、ｎ１、ｎ２およびｎ３は、各々独立して、１〜３である。ある実施形態では、ｎ１、ｎ２およびｎ３は、各々独立して、２〜３である。ある実施形態では、ｎ１は１または２であり；ｎ２は２または３であり；そしてｎ３は１または２である。ある実施形態では、ｎ１は２であり；ｎ３は２または３であり；そしてｎ５は２である。ある実施形態では、ｎ１は２であり；ｎ３は３であり；そしてｎ５は２である。ある実施形態では、ｎ１は２であり；ｎ３は２であり；そしてｎ５は２である。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２０連結ヌクレオシドからなる。ある種のこのような実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１３であり；ｎ１は２であり；ｎ３は３であり；そしてｎ５は２である。ある種のこのような実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１４であり；ｎ１は２であり；ｎ３は２であり；そしてｎ５は２である。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２１連結ヌクレオシドからなる。ある種のこのような実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１４であり；ｎ１は２であり；ｎ３は３であり；そしてｎ５は２である。ある種のこのような実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１５であり；ｎ１は２であり；ｎ３は２であり；そしてｎ５は２である。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２２連結ヌクレオシドからなる。ある種のこのような実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１５であり；ｎ１は２であり；ｎ３は３であり；そしてｎ５は２である。ある種のこのような実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１６であり；ｎ１は２であり；ｎ３は２であり；そしてｎ５は２である。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２３連結ヌクレオシドからなる。ある種のこのような実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１６であり；ｎ１は２であり；ｎ３は３であり；そしてｎ５は２である。ある種のこのような実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１７であり；ｎ１は２であり；ｎ３は２であり；そしてｎ５は２である。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２４連結ヌクレオシドからなる。ある種のこのような実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１７であり；ｎ１は２であり；ｎ３は３であり；そしてｎ５は２である。ある種のこのような実施形態では、ｎ２とｎ４の合計は１８であり；ｎ１は２であり；ｎ３は２であり；そしてｎ５は２である。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２３連結ヌクレオシドからなる；ｎ１は２であり；ｎ２は１０であり；ｎ３は３であり；ｎ４は６であり；ｎ５は２であり；Ｎｕ１はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり；Ｎｕ３はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり；そしてＮｕ５はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３である。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２３連結ヌクレオシドからなる；ｎ１は２であり；ｎ２は１０であり；ｎ３は３であり；ｎ４は６であり；ｎ５は２であり；Ｎｕ１はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり；Ｎｕ３はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり；そしてＮｕ５はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり；そして各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２３連結ヌクレオシドからなり；配列番号６の核酸塩基配列を有する；ｎ１は２であり；ｎ２は１０であり；ｎ３は３であり；ｎ４は６であり；ｎ５は２であり；Ｎｕ１はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり；Ｎｕ３はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり；Ｎｕ５はＯ−（ＣＨ２）であり；各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり；核酸塩基２のシトシンは５−メチルシトシンであり；位置１４のシトシンは５−メチルシトシンであり；そして核酸塩基２２のシトシンは５−メチルシトシンである。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２３連結ヌクレオシドからなり；配列番号７の核酸塩基配列を有する；ｎ１は２であり；ｎ２は１０であり；ｎ３は３であり；ｎ４は６であり；ｎ５は２であり；Ｎｕ１はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり；Ｎｕ３はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり；Ｎｕ５はＯ−（ＣＨ２）であり；各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり；核酸塩基２のシトシンは５−メチルシトシンであり；位置１４のシトシンは５−メチルシトシンであり；そして核酸塩基２２のシトシンは５−メチルシトシンである。
ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２１連結ヌクレオシドからなり；配列番号８の核酸塩基配列を有する；ｎ１は２であり；ｎ２は８であり；ｎ３は３であり；ｎ４は６であり；ｎ５は２であり；Ｎｕ１はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり；Ｎｕ３はＯ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり；Ｎｕ５はＯ−（ＣＨ２）であり；各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり；核酸塩基２のシトシンは５−メチルシトシンであり；位置１４のシトシンは５−メチルシトシンである。
ある実施形態では、ｍｉＲＮＡと相補的で、２１連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドは、表２から選択される式ＩＩを有し、この場合、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ある実施形態では、表２から選択される式ＩＩを有する修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号８の核酸塩基配列を有する。
Figure 2016106077
ある実施形態では、ｍｉＲＮＡと相補的で、２２連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドは、表３から選択される式ＩＩを有し、この場合、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ある実施形態では、表３から選択される式ＩＩを有する修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号６、７または８の２２連結ヌクレオシドを含む。
Figure 2016106077
ある実施形態では、ｍｉＲＮＡと相補的で、２３連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドは、表４から選択される式ＩＩを有し、この場合、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ある実施形態では、表４から選択される式ＩＩを有する修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号６、７または８から選択される核酸塩基配列を含む。
Figure 2016106077
ある実施形態では、ｍｉＲＮＡと相補的で、２４連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドは、表５から選択される式ＩＩを有し、この場合、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ある実施形態では、表５から選択される式ＩＩを有する修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号６、７または８の核酸塩基配列を含む。
Figure 2016106077
ある実施形態では、ｍｉＲＮＡと相補的で、２５連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドは、表６から選択される式ＩＩを有し、この場合、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ある実施形態では、表６から選択される式ＩＩを有する修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号６、７または８の核酸塩基配列を含む。
Figure 2016106077
ある実施形態では、化合物は次式ＩＩＩで表される：
Figure 2016106077
ある実施形態では、Ｑは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドである。ある実施形態では、ｘはホスホロチオエートである。ある実施形態では、ｙはホスホジエステルである。ある実施形態では、ｚ１、ｚ２、ｚ３およびｚ４は、各々独立して、ホスホロチオエートまたはホスホジエステルである。ある実施形態では、ｎは６〜１７である。ある実施形態では、Ｌはコレステロールである。ある実施形態では、ｎは１２〜１７である。
ある実施形態では、ｘは、
Figure 2016106077
 （式中、ＡおよびＢの一方はＳであり、他方はＯである）。
であり、ｙは、
Figure 2016106077
 であり、ｚ１、ｚ２、ｚ３およびｚ４は、各々独立して、ｘまたはｙであり；ｎは６〜１７であり、Ｌは、
Figure 2016106077
 （式中、Ｘは、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり；
Ｒ１、Ｒ３およびＲ９は、各々独立して、Ｈ、ＯＨまたはＣＨ２ＯＲｂであるが、但し、Ｒ１、Ｒ３およびＲ９のうちの少なくとも１つはＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ３およびＲ９のうちの少なくとも１つはＣＨ２ＯＲｂであり；
Ｒ７は、ＲｄまたはＣ１−Ｃ２０アルキル（ＮＲｃＲｄまたはＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換される）であり；
Ｒｃは、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒｄは、炭水化物ラジカルであるか；またはステロイドラジカルであって、これは、任意に、少なくとも１つの炭水化物ラジカルにつなぎとめられ；そして
Ｒｂは、
Figure 2016106077
 （式中、ＡおよびＢの一方はＳであり、他方はＯである）である）
である。
ある実施形態では、Ｒｄはコレステロールである。ある実施形態では、ｚ１、ｚ２、ｚ３およびｚ４は、
Figure 2016106077
 （式中、ＡおよびＢの一方はＳであり、他方はＯである）である。
ある実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＯＲｂである。ある実施形態では、Ｒ９はＯＨである。ある実施形態では、Ｒ１およびＲ９はトランスである。ある実施形態では、Ｒ９はＯＨである。ある実施形態では、Ｒ１およびＲ３はトランスである。ある実施形態では、Ｒ３は−ＣＨ２ＯＲｂである。ある実施形態では、Ｒ１はＯＨである。ある実施形態では、Ｒ１およびＲ３はトランスである。ある実施形態では、Ｒ９はＯＨである。ある実施形態では、Ｒ３およびＲ９はトランスである。ある実施形態では、Ｒ９はＣＨ２ＯＲｂである。ある実施形態では、Ｒ１はＯＨである。ある実施形態では、Ｒ１およびＲ９はトランスである。ある実施形態では、ＸはＮＣ（Ｏ）Ｒ７である。ある実施形態では、Ｒ７は−ＣＨ２（ＣＨ２）３ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄである。
ある実施形態では、位置修飾モチーフを有する修飾オリゴヌクレオチドはＬＮＡを含む。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、以下に列挙するモチーフの１つから選択されるモチーフを有する（ここで、Ｌ＝ＬＮＡヌクレオシド、ｄ＝ＤＮＡヌクレオシド、Ｍ＝２’−ＭＯＥヌクレオシドおよびＦ＝２’−フルオロヌクレオシド）。ある実施形態では、カッコ内のヌクレオシドは、修飾ヌクレオチド中に任意に含まれる。言い換えれば、モチーフは、カッコ内の多数のヌクレオシドがどのように含まれるかによって、種々の長さの修飾オリゴヌクレオチドを包含する。
ＬｄＬｄｄＬＬｄｄＬｄＬｄＬＬ
ＬｄＬｄＬＬＬｄｄＬＬＬｄＬＬ
ＬＭＬＭＭＬＬＭＭＬＭＬＭＬＬ
ＬＭＬＭＬＬＬＭＭＬＬＬＭＬＬ
ＬＦＬＦＦＬＬＦＦＬＦＬＦＬＬ
ＬＦＬＦＬＬＬＦＦＬＬＬＦＬＬ
ＬｄｄＬｄｄＬｄｄＬ（ｄ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）
ｄＬｄｄＬｄｄＬｄｄ（Ｌ）（ｄ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（ｄ）（Ｌ）
ｄｄＬｄｄＬｄｄＬｄ（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（ｄ）
ＬＭＭＬＭＭＬＭＭＬ（Ｍ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）
ＭＬＭＭＬＭＭＬＭＭ（Ｌ）（Ｍ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｍ）（Ｌ）
ＭＭＬＭＭＬＭＭＬＭ（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｍ）
ＬＦＦＬＦＦＬＦＦＬ（Ｆ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）
ＦＬＦＦＬＦＦＬＦＦ（Ｌ）（Ｆ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｆ）（Ｌ）
ＦＦＬＦＦＬＦＦＬＦ（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｆ）
ｄＬｄＬｄＬｄＬｄＬ（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）
ＬｄＬｄＬｄＬｄＬ（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（Ｌ）（ｄ）（Ｌ）
ＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬ（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）
ＬＭＬＭＬＭＬＭＬ（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｌ）（Ｍ）（Ｌ）
ＦＬＦＬＦＬＦＬＦＬ（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）
ＬＦＬＦＬＦＬＦＬ（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｌ）（Ｆ）（Ｌ）
付加的モチーフは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００７／１１２７５４（オリゴヌクレオチド修飾およびオリゴヌクレオチド修飾のパターンについての説明に関するその記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に開示されている。
ギャップマーモチーフを有する修飾オリゴヌクレオチドは、連結２’−デオキシヌクレオチドからなる内部領域、ならびに連結２’−修飾ヌクレオシドからなる外部領域を有し得る。このようなギャップマーは、ｍｉＲＮＡ前駆体のＲＮアーゼＨ切断を引き出すよう設計され得る。内部２’−デオキシヌクレオシド領域は、ＲＮアーゼＨのための基質として役立ち、修飾オリゴヌクレオチドが標的にされるｍｉＲＮＡ前駆体の切断を可能にする。ある実施形態では、各外部領域の各ヌクレオシドは、同一２’−修飾ヌクレオシドを含む。ある実施形態では、一方の外部領域は第一２’−修飾ヌクレオシドで均一に構成され、他方の外部領域は第二２’−修飾ヌクレオシドで均一に構成される。
ギャップマーモチーフを有する修飾オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシドに糖修飾を有し得る。ある実施形態では、内部領域は、第一２’−修飾ヌクレオシドで均一に構成され、外部領域の各々は第二２’−修飾ヌクレオシドで均一に構成される。ある種のこのような実施形態では、内部領域は２’−フルオロヌクレオシドで均一に構成され、各外部領域は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドで均一に構成される。
ある実施形態では、ギャップマーの各外部領域は連結２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドからなる。ある実施形態では、ギャップマーの各外部領域は連結２’−Ｏ−メチルヌクレオシドからなる。ある実施形態では、ギャップマーの各外部領域は２’−フルオロヌクレオシドからなる。ある実施形態では、ギャップマーの各外部領域は連結二環式ヌクレオシドからなる。
ある実施形態では、ギャップマーの一方の外部領域の各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを含み、他方の外部領域の各ヌクレオシドは異なる２’−修飾を含む。ある種のこのような実施形態では、ギャップマーの一方の外部領域の各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを含み、他方の外部領域の各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを含む。ある種のこのような実施形態では、ギャップマーの一方の外部領域の各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを含み、他方の外部領域の各ヌクレオシドは２’−フルオロヌクレオシドを含む。ある種のこのような実施形態では、ギャップマーの一方の外部領域の各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを含み、他方の外部領域の各ヌクレオシドは２’−フルオロヌクレオシドを含む。ある種のこのような実施形態では、ギャップマーの一方の外部領域の各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを含み、他方の外部領域の各ヌクレオシドは二環式ヌクレオシドを含む。ある種のこのような実施形態では、ギャップマーの一方の外部領域の各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを含み、他方の外部領域の各ヌクレオシドは二環式ヌクレオシドを含む。
ある実施形態では、一方の外部領域のヌクレオシドは２つ以上の糖修飾を含む。ある実施形態では、各外部領域のヌクレオシドは２つ以上の糖修飾を含む。ある実施形態では、外部領域の少なくとも１つのヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、同一外部領域の少なくとも１つのヌクレオシドは２’−フルオロ糖を含む。ある実施形態では、外部領域の少なくとも１つのヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、同一外部領域の少なくとも１つのヌクレオシドは二環式糖部分を含むある実施形態では、外部領域の少なくとも１つのヌクレオシドは２’−Ｏ−メチル糖を含み、同一外部領域の少なくとも１つのヌクレオシドは二環式糖部分を含む。ある実施形態では、外部領域の少なくとも１つのヌクレオシドは２’−Ｏ−メチル糖を含み、同一外部領域の少なくとも１つのヌクレオシドは２’−フルオロ糖を含む。ある実施形態では、外部領域の少なくとも１つのヌクレオシドは２’−フルオロ糖を含み、同一外部領域の少なくとも１つのヌクレオシドは二環式糖部分を含む。
ある実施形態では、ギャップマーの各外部領域は同数の連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、ギャップマーの各外部領域は、他の外部領域のものとは異なる多数の連結ヌクレオシドからなる。
ある実施形態では、外部領域は、独立して、１〜６ヌクレオシドを含む。ある実施形態では、外部領域は１つのヌクレオシドを含む。ある実施形態では、外部領域は２つのヌクレオシドを含む。ある実施形態では、外部領域は３つのヌクレオシドを含む。ある実施形態では、外部領域は４つのヌクレオシドを含む。ある実施形態では、外部領域は５つのヌクレオシドを含む。ある実施形態では、外部領域は６つのヌクレオシドを含む。ある実施形態では、外部領域は１７〜２８連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、内部領域は１７〜２１連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、内部領域は１７連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、内部領域は１８連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、内部領域は１９連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、内部領域は２０連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、内部領域は２１連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、内部領域は２２連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、内部領域は２３連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、内部領域は２４連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、内部領域は２５連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、内部領域は２６連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、内部領域は２７連結ヌクレオシドからなる。ある実施形態では、内部領域は２８連結ヌクレオシドからなる。
ある種の付加的療法
代謝障害のための治療は、１つより多くの療法を含み得る。このようなものとして、ある実施形態では、本発明は、代謝障害の治療方法であって、それを必要とする被験者に、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７またはその前駆体と相補的なオリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを包含し、そしてさらに少なくとも１つの付加的薬学的作用物質を投与することを包含する方法を提供する。
ある実施形態では、付加的薬学的作用物質は血糖降下薬である。
ある実施形態では、血糖降下薬は、ＰＰＡＲアゴニスト（ガンマ、デュアルまたはパン）、ジペプチジルペプチダーゼ（ＩＶ）阻害薬、ＧＬＰ−Ｉ類似体、インスリンまたはインスリン類似体、インスリン分泌促進物質、ＳＧＬＴ２阻害薬、ヒトアミリン類似体、ビグアニド、アルファ−グルコシダーゼ阻害薬、メグリチニド、チアゾリジンジオンまたはスルホニル尿素である。
ある実施形態では、血糖降下薬はＧＬＰ−Ｉ類似体である。ある実施形態では、ＧＬＰ−Ｉ類似体はエキセンジン−４またはリラグルチドである。
ある実施形態では、血糖降下薬はスルホニル尿素である。ある実施形態では、スルホニル尿素は、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリドまたはグリクラジドである。
ある実施形態では、血糖降下薬はビグアニドである。ある実施形態では、ビ津兄度はメトフォルミンである。ある実施形態では、メトフォルミン単独での処置後に観察される乳酸アシドーシスと比較して、乳酸アシドーシス増大を伴わずに、血糖値は低減される。
ある実施形態では、血糖降下薬はメグリチニドである。ある実施形態では、メグリチニドはナテグリニドまたはレパグリニドである。
ある実施形態では、血糖降下薬はチアゾリジンジオンである。ある実施形態では、チアゾリジンジオンは、ピオグリタゾン、ロシグリタゾンまたはトログリタゾンである。ある実施形態では、ロシグリタゾン処置単独で観察されるよりも大きい体重増加を伴わずに、血糖値は低減される。
ある実施形態では、血糖降下薬はアルファ−グルコシダーゼ阻害薬である。ある実施形態では、アルファ−グルコシダーゼ阻害薬はアカルボースまたはミグリトールである。
ある実施形態では、血糖降下薬は、ＰＴＰ１Ｂに対して標的化されるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
ある実施形態では、付加的療法は抗肥満薬である。ある実施形態では、抗肥満薬はオルリスタット、シブトラミンまたはリモナバントである。
ある実施形態では、付加的療法は治療的ライフスタイルの変化である。ある実施形態では、治療的ライフスタイル変化は、運動レジメンおよび／または食餌療法を包含する。
ある実施形態では、付加的薬学的作用物質の用量は、付加的薬学的作用物質が単独で投与された場合に施される用量と同一である。
ある実施形態では、付加的薬学的作用物質の用量は、付加的薬学的作用物質が単独で投与された場合に施される用量より低い。ある実施形態では、付加的薬学的作用物質の用量は、付加的薬学的作用物質が単独で投与された場合に施される用量より高い。
付加的薬学的作用物質のさらなる例としては、コルチコステロイド、例えばプレドニソン（これに限定されない）；免疫グロブリン、例えば静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）（これに限定されない）；鎮痛薬（例えばアセトアミノフェン）；抗炎症薬、例えば非ステロイド系抗炎症薬（例えば、イブプロフェン、ＣＯＸ−Ｉ阻害薬およびＣＯＸ−２阻害薬）（これらに限定されない）；サリチル酸誘導体；抗生物質；抗ウイルス薬；抗真菌薬；抗糖尿病薬（例えば、ビグアニド、グルコシダーゼ阻害薬、インスリン、スルホニル尿素およびチアゾリデンジオン）；アドレナリン作動性修飾因子；利尿薬；ホルモン（例えば、同化ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン、カルシトニン、プロゲスチン、ソマトスタンおよび甲状腺ホルモン）；免疫調節薬；筋弛緩薬；抗ヒスタミン薬；骨粗鬆症薬（例えば、ビホスホネート、カルシトニンおよびエストロゲン；プロスタグランジン、抗新生物薬；精神治療薬；鎮静薬；有毒オークまたはドクウルシ製品；抗体；ならびにワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。
ある実施形態では、付加的療法は、脂質低下療法である。ある種のこのような実施形態では、脂質低下療法は、治療的ライフスタイル変化である。ある種のこのような実施形態では、脂質低下療法はＬＤＬアフェレーシスである。
ある種の薬学的組成物
オリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、このような薬学的組成物は、代謝障害ならびに関連症状の治療のために用いられる。ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７またはその前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を含む。ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７またはその前駆体と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる化合物を含む。
適切な投与経路としては、経口、直腸、経粘膜、腸、経腸、局所、坐薬、吸入による、くも膜下腔内、脳室内、腹腔内、鼻内、眼内、腫瘍内および非経口（例えば、静脈内、筋肉内、髄内および皮下）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、薬学的くも膜下腔内薬は、全身曝露というよりむしろ局所的曝露を達成するために投与される。例えば、薬学的組成物は、所望作用の領域に（例えば肝臓中に）直接注射され得る。
ある実施形態では、薬学的組成物は、投与単位（例えば、錠剤、カプセル、ボーラス剤等）の形態で投与される。ある実施形態では、このような薬学的組成物は、２５ ｍｇ、３０ ｍｇ、３５ ｍｇ、４０ ｍｇ、４５ ｍｇ、５０ ｍｇ、５５ ｍｇ、６０ ｍｇ、６５ ｍｇ、７０ ｍｇ、７５ ｍｇ、８０ ｍｇ、８５ ｍｇ、９０ ｍｇ、９５ ｍｇ、１００ ｍｇ、１０５ ｍｇ、１１０ ｍｇ、１１５ ｍｇ、１２０ ｍｇ、１２５ ｍｇ、１３０ ｍｇ、１３５ ｍｇ、１４０ ｍｇ、１４５ ｍｇ、１５０ ｍｇ、１５５ ｍｇ、１６０ ｍｇ、１６５ ｍｇ、１７０ ｍｇ、１７５ ｍｇ、１８０ ｍｇ、１８５ ｍｇ、１９０ ｍｇ、１９５ ｍｇ、２００ ｍｇ、２０５ ｍｇ、２１０ ｍｇ、２１５ ｍｇ、２２０ ｍｇ、２２５ ｍｇ、２３０ ｍｇ、２３５ ｍｇ、２４０ ｍｇ、２４５ ｍｇ、２５０ ｍｇ、２５５ ｍｇ、２６０ ｍｇ、２６５ ｍｇ、２７０ ｍｇ、２７０ ｍｇ、２８０ ｍｇ、２８５ ｍｇ、２９０ ｍｇ、２９５ ｍｇ、３００ ｍｇ、３０５ ｍｇ、３１０ ｍｇ、３１５ ｍｇ、３２０ ｍｇ、３２５ ｍｇ、３３０ ｍｇ、３３５ ｍｇ、３４０ ｍｇ、３４５ ｍｇ、３５０ ｍｇ、３５５ ｍｇ、３６０ ｍｇ、３６５ ｍｇ、３７０ ｍｇ、３７５ ｍｇ、３８０ ｍｇ、３８５ ｍｇ、３９０ ｍｇ、３９５ ｍｇ、４００ ｍｇ、４０５ ｍｇ、４１０ ｍｇ、４１５ ｍｇ、４２０ ｍｇ、４２５ ｍｇ、４３０ ｍｇ、４３５ ｍｇ、４４０ ｍｇ、４４５ ｍｇ、４５０ ｍｇ、４５５ ｍｇ、４６０ ｍｇ、４６５ ｍｇ、４７０ ｍｇ、４７５ ｍｇ、４８０ ｍｇ、４８５ ｍｇ、４９０ ｍｇ、４９５ ｍｇ、５００ ｍｇ、５０５ ｍｇ、５１０ ｍｇ、５１５ ｍｇ、５２０ ｍｇ、５２５ ｍｇ、５３０ ｍｇ、５３５ ｍｇ、５４０ ｍｇ、５４５ ｍｇ、５５０ ｍｇ、５５５ ｍｇ、５６０ ｍｇ、５６５ ｍｇ、５７０ ｍｇ、５７５ ｍｇ、５８０ ｍｇ、５８５ ｍｇ、５９０ ｍｇ、５９５ ｍｇ、６００ ｍｇ、６０５ ｍｇ、６１０ ｍｇ、６１５ ｍｇ、６２０ ｍｇ、６２５ ｍｇ、６３０ ｍｇ、６３５ ｍｇ、６４０ ｍｇ、６４５ ｍｇ、６５０ ｍｇ、６５５ ｍｇ、６６０ ｍｇ、６６５ ｍｇ、６７０ ｍｇ、６７５ ｍｇ、６８０ ｍｇ、６８５ ｍｇ、６９０ ｍｇ、６９５ ｍｇ、７００ ｍｇ、７０５ ｍｇ、７１０ ｍｇ、７１５ ｍｇ、７２０ ｍｇ、７２５ ｍｇ、７３０ ｍｇ、７３５ ｍｇ、７４０ ｍｇ、７４５ ｍｇ、７５０ ｍｇ、７５５ ｍｇ、７６０ ｍｇ、７６５ ｍｇ、７７０ ｍｇ、７７５ ｍｇ、７８０ ｍｇ、７８５ ｍｇ、７９０ ｍｇ、７９５ ｍｇおよび８００ ｍｇから選択される用量でオリゴヌクレオチドを含む。ある種のこのような実施形態では、薬学的組成物は、２５ ｍｇ、５０ ｍｇ、７５ ｍｇ、１００ ｍｇ、１５０ ｍｇ、２００ ｍｇ、２５０ ｍｇ、３００ ｍｇ、３５０ ｍｇ、４００ ｍｇ、５００ ｍｇ、６００ ｍｇ、７００ ｍｇおよび８００ｍｇから選択される修飾オリゴヌクレオチドの用量を含む。
ある実施形態では、薬学的作用物質は、適切な希釈剤、例えば注射用の滅菌水または注射用の滅菌生理食塩水で再構成される滅菌凍結乾燥化修飾オリゴヌクレオチドである。再構成物質は、生理食塩水中に希釈後に、皮下注射として、または静脈内注入として投与される。凍結乾燥薬剤物質は、注射用に水中で、または注射用に生理食塩水中で調製され、調製中に酸または塩基でｐＨ７．０〜９．０に調整され、次いで凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドからなる。凍結乾燥修飾オリゴヌクレオチドは、２５〜８００ｍｇのオリゴヌクレオチドであり得る。これは、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５および８００ｍｇの修飾凍結乾燥オリゴヌクレオチドを包含する、と理解される。凍結乾燥薬剤物質は、ブロモブチルゴム栓で栓をされて、アルミニウム製フリップ・オフ（登録商標）オーバーシールで密閉される２ｍＬタイプＩ透明ガラスバイアル（硫酸アンモニウム処理）中に包装され得る。
ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、それらの技術分野で確立された使用量レベルで、薬学的組成物中に慣用的に見出される他の付加物構成成分を付加的に含有し得る。したがって、例えば氏瀬は、付加的な相溶性の薬学的に許容可能な物質、例えば鎮痒薬、収斂剤、局所麻酔薬または抗炎症薬を含有し得るし、あるいは本発明の組成物の種々の剤形を物理的に処方するのに有用な付加的物質、例えば染料、風味剤、防腐剤、酸化防止剤、不透明剤、濃化剤および安定化剤を含有し得る。しかしながら、このような物質は、付加された場合、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を過度に妨害すべきでない。処方物は、滅菌され、所望により、処方物のオリゴヌクレオチド（単数または複数）と有害に相互作用しない補助剤、例えば滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝剤、着色剤、風味および／または芳香性物質等と混合され得る。
脂質部分は、種々の方法で核酸療法に用いられてきた。一方法において、核酸は、予備成形リポソーム、あるいは陽イオン性脂質および中性脂質の混合物から作られるリポプレックス中に導入される。別の方法では、モノまたはポリ陽イオン性脂質とのＤＮＡ複合体が、中性脂質の存在を伴わずに形成される。ある実施形態では、脂質部分は、特定の細胞または組織への薬学的作用物質の分布を増大するために選択される。ある実施形態では、脂質部分は、脂肪組織への薬学的作用物質の分布を増大するために選択される。ある実施形態では、脂質部分は、筋肉組織への薬学的作用物質の分布を増大するために選択される。
ある実施形態では、ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤは、オリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物を調製するために用いられる。ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄは、静脈内投与のために調製される脂肪乳濁液である。それは、１０％のダイズ油、１．２％の卵黄リン脂質、２．２５％のグリセリン、および注射用の水から作られる。さらに、水酸化ナトリウムが付加されて、最終生成物のｐＨ範囲が６〜８．９となるよう、ｐＨを調整する。
ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、ポリアミン化合物または核酸と複合される脂質部分を含む。ある実施形態では、このような調製物は、式（Ｉ）により限定される構造を有する１つ以上の化合物またはその製薬上許容可能な塩を各々独立して含む。
Figure 2016106077
 （式中、ＸａおよびＸｂは、各々の出現に関して、各々独立して、Ｃ１−６アルキレンであり；ｎは、０、１、２、３、４または５であり；Ｒは、各々独立して、Ｈであり（ここで、調製における式（Ｉ）の化合物の分子の少なくとも約８０％２置いてＲ部分の少なくともｎ＋２は水素でない）；ｍは、１、２、３または４であり；Ｙは、Ｏ、ＮＲ２またはＳであり；Ｒ１は、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり；その各々は１つ以上の置換基で任意に置換されるが；但し、ｎ＝０である場合には、Ｒ部分の少なくともｎ＋３はＨでない。このような調製物は、ＰＣＴ公開 ＷＯ／２００８／０４２９７３（脂質調製の開示に関する記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。ある種の付加的調製物は、Akinc et al.、Nature Biotechnology 26, 561 - 569 (01 May 2008)（脂質調製の開示に関する記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、１つ以上の修飾オリゴヌクレオチドおよび１つ以上の賦形剤を含む。ある種のこのような実施形態では、賦形剤は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンから選択される。
ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、既知の技法、例えば混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、水簸、乳化、カプセル封入、エントラッピングまたは錠剤成形法（これらに限定されない）を用いて調製される。
ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、液体（例えば、懸濁液、エリキシルおよび／または溶液）である。ある種のこのような実施形態では、液体薬学的組成物は、当該技術分野で既知の成分、例えば水、グリコール、油、アルコール、風味剤、防腐剤および着色剤（これらに限定されない）を用いて調製される。
ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、固体（例えば、粉末、錠剤および／またはカプセル）である。ある種のこのような実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む固体薬学的組成物は、当該技術分野で既知の成分、例えばデンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、滑剤、結合剤および崩壊剤（これらに限定されない）を用いて調製される。
ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、デポー製剤として処方される。ある種のこのようなデポー製剤は、典型的には、非デポー製剤より長く作用する。ある実施形態では、このような製剤は、移植により（例えば皮下にまたは筋肉内に）、または筋肉内注射により投与される。ある実施形態では、デポー製剤は、適切な高分子または疎水性物質（例えば、許容可能な油中の乳濁液）、あるいはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として、調製される。
ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、送達系を含む。送達系の例としては、リポソームおよび乳濁液が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の送達系は、ある種の薬学的組成物、例えば疎水性化合物を含むものを調製するために有用である。ある実施形態では、ある種の有機溶媒、例えばジメチルスルホキシドが用いられる。
ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、特定の組織または細胞型に本発明の１つ以上の薬学的作用物質を送達するよう意図された１つ以上の組織特異的送達分子を含む。例えば、ある実施形態では、薬学的組成物は、組織特異的抗体で被覆されたリポソームを包含する。
ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、共溶媒系を含む。ある種のこのような共溶媒系は、例えば、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む。ある実施形態では、このような共溶媒系は疎水性化合物のために用いられる。このような共溶媒系の非限定例はＶＰＤ共溶媒系であり、これは、３％ｗ／ｖベンジルアルコール、８％ｗ／ｖの非極性界面活性剤ポリソルベート８０（商標）および６５％ｗ／ｖポリエチレングリコール３００を含む無水エタノールの溶液である。このような共溶媒系の割合は、それらの溶解性および毒性特質を有意に変えることなく、かなり変更され得る。さらに、共溶媒構成成分の同一性が変更され得る；例えば、他の界面活性剤がポリソルベート８０（商標）の代わりに用いられ得る；ポリエチレングリコールの分画サイズが変更され得る；他の生体適合性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンが、ポリエチレングリコールに取って代わり得る；そして、他の糖または多糖がデキストロースを置換し得る。
ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、徐放系を含む。このような徐放系の非限定例は、固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスである。ある実施形態では、徐放系は、それらの化学的性質によって、数時間、数日間、数週間または数ヶ月に亘って薬学的作用物質を放出し得る。
ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、経口投与のために調製される。ある種のこのような実施形態では、薬学的組成物は、オリゴヌクレオチドを含む１つ以上の化合物を、１つ以上の製薬上許容可能な担体と組合せることにより処方される。ある種のこのような担体は、被験者が経口摂取するための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として、処方物を処方させる。ある実施形態では、経口使用のための薬学的組成物は、オリゴヌクレオチドおよび１つ以上の固体賦形剤を混合することにより得られる。適切な賦形剤としては、充填剤、例えば糖、例えばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、このような混合物は任意に粉砕され、補助剤が任意に付加される。ある実施形態では、薬学的組成物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために形成される。ある実施形態では、崩壊剤（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天あるいはアルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウム）が付加される。
ある実施形態では、糖衣錠コアはコーティングとともに提供される。ある種のこのような実施形態では、濃縮糖溶液が用いられ得るが、これは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を任意に含有し得る。染料または色素が、錠剤または糖衣錠コーティングに付加され得る。
ある実施形態では、経口投与のための薬学的組成物は、ゼラチン製のプッシュ・フィットカプセルである。ある種のこのようなプッシュ・フィットカプセルは、１つ以上の充填剤、例えばラクトース、結合剤、例えばデンプン、および／または滑剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、ならびに任意に安定化剤と混合して、本発明の１つ以上の薬学的作用物質を含む。ある実施形態では、経口投与用の薬学的組成物は、ゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトールから作られる軟質密閉カプセルである。ある軟質カプセルでは、本発明の１つ以上の薬学的作用物質が、適切な液体、例えば脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール中に溶解されるかまたは懸濁される。さらに、安定化剤が付加され得る。
ある実施形態では、薬学的組成物は頬投与のために調製される。ある種のこのような薬学的組成物は、慣用的方法で処方される錠剤またはロゼンジである。
ある実施形態では、薬学的組成物は、注射（例えば、静脈内、皮下、筋肉内等）による投与のために調製される。ある種のこのような実施形態では、薬学的組成物は担体を含み、水溶液中、例えば水または生理学的適合性緩衝液、例えばハンクス溶液、リンガー溶液または生理学的食塩緩衝液中で処方される。ある実施形態では、他の成分（例えば、溶解性を手助けするかまたは防腐剤として役立つ成分）が含まれる。ある実施形態では、適切な液体担体、懸濁剤等を用いて、注射用懸濁液が調製される。注射用のある種の薬学的組成物は、単位剤形で、例えばアンプルで、または複数回用量容器中に存在する。注射用のある薬学的組成物は、油状または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液であり、処方剤、例えば懸濁安定化剤および／または分散剤を含有し得る。注射用の薬学的組成物中に用いるのに適したある種の溶媒としては、親油性溶媒および脂肪油、例えばゴマ油、合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド、ならびにリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘性を増大する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有し得る。任意に、このような懸濁液は、適切な安定化剤、または高濃縮溶液の調製を可能にするために薬学的作用物質の溶解性を増大する作用物質も含有し得る。
ある実施形態では、薬学的組成物は、経粘膜投与のために調製される。ある種のこのような実施形態では、透過されるべきバリアに適した浸透剤が、処方物中に用いられる。このような浸透剤は、当該技術分野で一般的に既知である。
ある実施形態では、薬学的組成物は、吸入による投与のために調製される。吸入のためのある種のこのような薬学的組成物は、加圧パックまたはネブライザー中にエーロゾル噴霧剤の形態で調製される。ある種のこのような薬学的組成物は、噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適切な気体を含む。加圧エーロゾルを用いるある実施形態では、投与単位は、計測量を送達するバルブで確定され得る。ある実施形態では、吸入器または散布器で用いるためのカプセルおよびカートリッジが処方され得る。ある種のこのような処方物は、本発明の薬学的作用物質および適切な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含む。
ある実施形態では、薬学的組成物は、直腸投与、例えば坐薬または停留浣腸のために処方される。ある種のこのような薬学的組成物は、既知の成分、例えばココアバターおよび／または他のグリセリドを含む。
ある実施形態では、薬学的組成物は局所投与のために調製される。ある種のこのような薬学的組成物は、低刺激性保湿基剤、例えば軟膏またはクリームを含む。適切な軟膏基剤の例としては、ワセリン、ワセリン＋揮発性シリコーン、ならびにラノリンおよび油中水エマルションが挙げられるが、これらに限定されない。適切なクリーム基剤の例としては、コールドクリームおよび親水性軟膏が挙げられるが、これらに限定されない。
ある実施形態では、本明細書中で提供される薬学的組成物は、治療的有効量でオリゴヌクレオチドを含む。ある実施形態では、治療的有効量は、疾患の症候を防止し、軽減し、または改善するのに、あるいは治療されている被験者の生存を延長するのに十分である。治療的有効量の決定は、当業者の能力内で十分になされ得る。
ある実施形態では、本明細書中で提供される１つ以上の修飾オリゴヌクレオチドは、プロドラッグとして処方される。ある実施形態では、in vivo投与時に、プロドラッグは、生物学的、薬学的または治療的により活性な形態のオリゴヌクレオチドに、化学的に転化される。ある実施形態では、プロドラッグは、対応する活性形態より投与が容易であるため、有用である。例えば、ある場合には、プロドラッグは、対応する活性形態より（例えば、経口投与によって）生物学的利用可能であり得る。ある場合には、プロドラッグは、対応する活性形態と比較して、改善された溶解性を有し得る。ある実施形態では、プロドラッグは、対応する活性形態より低水溶性である。ある場合には、このようなプロドラッグは、細胞膜に対する優れた透過性を保有する（この場合、水溶性は移動の障害となる）。ある実施形態では、プロドラッグはエステルである。ある種のこのような実施形態では、エステルは、投与時に、代謝によりカルボン酸に加水分解される。ある場合には、カルボン酸含有化合物は、対応する活性形態である。ある実施形態では、プロドラッグは、酸基と結合される短いペプチド（ポリアミノ酸）を含む。ある種のこのような実施形態では、ペプチドは投与時に切断されて、対応する活性形態を形成する。
ある実施形態では、活性化合物がin vivo投与時に再生されるよう製薬上許容可能な化合物を修飾することにより、プロドラッグは産生される。プロドラッグは、薬剤の代謝的安定性または運搬特質を変更し、副作用または毒性を遮蔽し、薬剤の風味を改良し、あるいは薬剤のその他の特質または特性を変更するよう設計され得る。in vivoでの薬力学的過程および薬剤代謝の知識に基づいて、当業者は、一旦薬物学的活性化合物が既知になれば、化合物のプロドラッグを設計し得る（例えば、Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392参照）。
ある種のキット
本発明は、キットも提供する。いくつかの実施形態では、キットは修飾オリゴヌクレオチドを含む１つ以上の本発明の化合物を含み、この場合、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列はｍｉＲ−１０３および／または１０７と相補的である。ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７と相補的な化合物は、本明細書中に記載される化合物のいずれかであり得るし、本明細書中に記載される修飾のいずれかを有し得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７と相補的な化合物は、バイアル内に存在する。複数のバイアル、例えば１０本のバイアルが、例えば、分配パック中に存在し得る。いくつかの実施形態では、バイアルは、注射器で到達可能であるよう製造される。キットは、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７と相補的な化合物を用いるための使用説明書も含有し得る。
いくつかの実施形態では、キットは、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７と相補的な化合物を被験者に投与するために用いられ得る。このような場合、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７と相補的な化合物のほかに、キットはさらに、以下のもののうちの１つ以上を含み得る：注射器、アルコール綿、綿球および／またはガーゼパッド。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７と相補的な化合物は、バイアル中よりもむしろ、充填済み注射器（例えば、例えば２７ゲージ、1/2インチ針（ニードルガード付き）を有する１回用量注射器）中に存在し得る。複数（例えば１０本）の充填済み注射器が、例えば分配パック中に存在する。キットは、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７と相補的な化合物を投与するための使用説明書も含有し得る。
ある種の実験モデル
ある実施形態では、本発明は、実験モデルにおいて本発明の修飾オリゴヌクレオチドを使用し、および／または試験する方法を提供する。当業者は、本発明の薬学的作用物質を評価するために、このような実験モデルに関するプロトコールを選択し、修正し得る。
一般的には、修飾オリゴヌクレオチドは、先ず、培養細胞中で試験される。適切な細胞型としては、オリゴヌクレオチドの送達がin vivoで所望される細胞型に関連したものが挙げられる。例えば、本明細書中に記載される方法の試験のために適せた細胞型としては、一次肝細胞、一次脂肪細胞、前脂肪細胞、分化脂肪細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞、３Ｔ３Ｌ１細胞およびＣ２Ｃ１２細胞（ネズミ筋芽細胞）が挙げられる。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡの活性を妨害する程度が、培養細胞で査定される。ある実施形態では、ｍｉＲＮＡ活性の抑制は、ｍｉＲＮＡのレベルを測定することにより査定され得る。代替的には、予測されるかまたは確認されるｍｉＲＮＡ標的のレベルが測定され得る。ｍｉＲＮＡ活性の抑制は、ｍｉＲＮＡ標的のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質における増大を生じ得る。さらに、ある実施形態では、ある種の表現型結果が測定され得る。例えば、適切な表現型結果としては、インスリンシグナル伝達が挙げられる。
本明細書中に記載される方法の試験のための適切な実験動物モデルとしては、以下のものが挙げられる：ｏｂ／ｏｂマウス（糖尿病、肥満症およびインスリン抵抗性に関するモデル）、ｄｂ／ｄｂマウス（糖尿病、肥満症およびインスリン抵抗性に関するモデル）、高脂肪餌Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウス、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病ラットおよびＰ２−ＳＲＥＢＰトランスジェニックマウス。
ある種の定量的検定
修飾オリゴヌクレオチドの投与後のｍｉＲＮＡのアンチセンス抑制の効果は、当該技術分野で既知の種々の方法により査定され得る。ある実施形態では、これらの方法は、in vitroまたはin vivoでの細胞または組織におけるｍｉＲＮＡを定量するために用いられる。ある実施形態では、ｍｉＲＮＡの変化は、マイクロアレイ分析により測定される。ある実施形態では、ｍｉＲＮＡレベルの変化は、いくつかの市販ＰＣＲ検定のうちの１つ、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡ検定（Applied Biosystems）により測定される。ある実施形態では、ｍｉＲＮＡのアンチセンス抑制は、ｍｉＲＮＡの標的のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを測定することにより査定される。ｍｉＲＮＡのアンチセンス抑制は、一般的に、ｍｉＲＮＡの標的のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルの増大を生じる。
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をさらに詳細に例証するために提示される。しかしながら、それらは、如何なる点でも、本発明の広範な範囲を限定するよう意図されるべきでない。
実施例全体を通して、別記しない限り、統計学的有意は以下のように示される：＊＝ｐ＜０．０５； ＊＊＝ｐ＜０．０１； ＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
(実施例)
実施例１：インスリン感受性組織におけるマイクロＲＮＡの発現
インスリンシグナル伝達および応答に関与するマイクロＲＮＡを同定するために、インスリン感受性組織をマイクロＲＮＡ発現に関してスクリーニングした。マイクロアレイ分析を実施して、その療法が肥満症、インスリン抵抗性および糖尿病の動物モデルであるｏｂ／ｏｂおよび高脂肪餌誘導性肥満（ＤＩＯ）Ｃ５７Ｂ１６／Ｊマウスの肝臓中で異常調節されるマイクロＲＮＡを同定した。マイクロＲＮＡｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７、２つの保存され、遍在的に発現されるマイクロＲＮＡ（図１Ｅ、Ｆ参照）は、ｏｂ／ｏｂマウスおよび高脂肪餌マウス（ＤＩＯマウス）を含めたこれらのモデルのいくつかにおける肝臓中で上方調節されることが判明した。
ノーザンブロッティングはこの結果を確証し、ｏｂ／ｏｂおよび高脂肪餌誘導性肥満マウスの両方の肝臓における２〜３倍上方調節を実証した（図１Ａ参照）。実時間ＰＣＲを用いて、ｍｉＲ−１０３を、位置２１の１つの塩基が異なるｍｉＲ−１０７と区別した（表７および図１Ｂ参照）。ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７はともに、ｏｂ／ｏｂおよび高脂肪餌誘導性肥満マウスの肝臓において上方調節された（表８参照）。
Figure 2016106077
Figure 2016106077
マイクロＲＮＡ発現を、健常個体、ＨＢＶ−およびＨＣＶ−感染個体、ならびにアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を有するヒト患者の肝臓生検においても分析した。ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７は、正常被験者、ならびにＨＢＶ−およびＨＣＶ−感染被験者において類似していた。しかしながら、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７レベルは、糖尿病にしばしば関連した症状であるＡＳＨ、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨを有する被験者の肝臓試料中で増大された（表９参照）。
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実施例２：ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の抑制は動物における高血糖症を軽減する
ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の抑制は、糖尿病またはインスリン抵抗性を有する被験者において治療的利益を生じ得る。肥満、インスリン抵抗性ｏｂ／ｏｂマウスは一般に、糖尿病および肥満症に関するモデルとして用いられる。高脂肪餌を与えられたマウスを、糖耐性減損および２型糖尿病のモデルとして用いる。したがって、ｏｂ／ｏｂマウスおよびＤＩＯマウスにおいて、ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の抑制を査定した。
別記しない限り、用いる抗ｍｉＲは、以下のように修飾される：
・ 配列番号６の配列を有する抗ｍｉＲ−１０３、 各糖での２’−Ｏ−メチル修飾、最初の４つのヌクレオシド間結合の各々でのホスホロチオエート修飾（５’末端で）、最後の２つのヌクレオシド間結合の各々でのホスホロチオエート修飾（３’末端で）、およびヒドロキシプロリノール結合により３’末端と連結されるコレステロール
・ 配列番号７の配列を有する抗ｍｉＲ−１０７、 各糖での２’−Ｏ−メチル修飾、最初の４つのヌクレオシド間結合の各々でのホスホロチオエート修飾（５’末端で）、最後の２つのヌクレオシド間結合の各々でのホスホロチオエート修飾（３’末端で）、およびヒドロキシプロリノール結合により３’末端と連結されるコレステロール
・ 核酸塩基配列ＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＴ（配列番号９）を有する対照抗ｍｉＲ抗−ｍｍ−１０７、 各糖での２’−Ｏ−メチル修飾、最初の４つのヌクレオシド間結合の各々でのホスホロチオエート修飾、最後の２つのヌクレオシド間結合の各々でのホスホロチオエート修飾、およびヒドロキシプロリノール結合により３’末端と連結されるコレステロール。ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７は単一ヌクレオチドが異なるので、抗ｍｍ−１０７はｍｉＲ−１０３（合計４つの不整合）およびｍｉＲ−１０７（合計５つの不整合）の両方に関して不整合化される；そして
・ 配列番号１９の核酸塩基配列を有する対照抗ｍｉＲ抗ｍｉＲ−１２４； 各糖での２’−Ｏ−メチル修飾、最初の４つのヌクレオシド間結合の各々でのホスホロチオエート修飾、最後の２つのヌクレオシド間結合の各々でのホスホロチオエート修飾、およびヒドロキシプロリノール結合により３’末端と連結されるコレステロール。
別記しない限り、野生型マウスは６〜８週齢野生型雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（〜２０ｇ）であった；ｏｂ／ｏｂマウスは６〜８週齢雄マウスであった；そしてＤＩＯマウスは８週間高脂肪餌であった１２週齢雄マウスであった。マウスに、ＰＢＳ、抗ｍｉＲ−１０７（１×１５ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍｉＲ−１０３（２×１５ｍｇ／ｋｇ）、抗ｍｍ−１０７（２×１５μｇ／ｋｇ）または抗ｍｉＲ−１２４（２×１５μｇ／ｋｇ）のいずれかを注射した。
野生型マウス
野生型マウスに、１５ｍｇ／ｋｇの抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｍ−１０７を、腹腔内に２回注射した。ＰＢＳを、対照処置として投与した。抗ｍｉＲ−１０３は、無関連マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−１６の発現に作用を及ぼすことなく、脂肪中のｍｉＲ−１０７をサイレンシングする、ということを、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７のノーザン分析は実証した（図１ｄ参照）。
処置後、随意摂餌および絶食状態の両方で、血糖値に関してマウスを試験した。ｍｉＲ−１０３／１０７のサイレンシングは、野生型マウスにおいては血糖値に如何なる有意の変化も明示しなかった。野生型マウスは、腹腔内グルコースチャレンジに対しても良好に応答した。さらに、抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｉＲ−１０７による処置は、ＡＬＴレベルにより判定した場合（ＰＢＳおよび抗ｍｉＲ−１０７で処置したマウスにおいて、それぞれ〜２５ＩＵ／Ｌおよび〜１９ＩＵ／Ｌ；ＰＢＳおよび抗ｍｉＲ−１０３で処置したマウスでは、それぞれ〜１７ＩＵ／Ｌおよび〜１８ＩＵ／Ｌ）、顕在性毒性を引き起こさなかった。
ｏｂ／ｏｂマウス
ｏｂ／ｏｂマウスに、１５ｍｇ／ｋｇの抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｉＲ−１０７を、腹腔内に２回注射した。ＰＢＳを、対照処置として投与した。処置後、血糖値（絶食ありおよびなし）、ＩＰＧＴＴ、ＩＴＴおよびピルビン酸耐性に関して、マウスを試験した。各処置群は、５〜６匹の８週齢マウスを含有した。対照処置は、ＰＢＳ、抗ｍｉＲ−１２４または抗ｍｍ−１０７であった。抗ｍｉＲ−１０３および抗ｍｉＲ−１０７が、無関連マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−１６の発現に作用を及ぼすことなく、肝臓および脂肪中のｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７の両方を有効にサイレンシングする、ということを、ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７のノーザン分析は実証した（図１Ｃ、Ｄ参照）。
随意摂餌状態での血糖値を試験するために、抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｉＲ−１０７の２回目用量投与後２、３および５日目に、血糖を測定した。ｍｉＲ−１０３の抑制は、ＰＢＳ処置と比較して、血糖の統計学的有意の低減を生じた。ｍｉＲ−１０７の抑制も、ＰＢＳ処置と比較して、統計学的有意の低減を生じた（表１０参照（Ｎ．Ｄ．は「確定されず」を意味する））。
Figure 2016106077
血糖の有意の低減は、抗ｍｍ−１０７処置と比較した場合に、抗ｍｉＲ−１０３により処置の３または６日後にも観察された（表１１参照）。
Figure 2016106077
ＩＰＧＴＴも実施した。１６時間絶食後、マウス（ｎ＝５）に、抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｉＲ−１０７の注射後６日目に、体重１ｋｇ当たり２ｇのグルコースを腹腔内注射した。０、１５、３０、６０、１２０および１８０分で、採血した。ＰＢＳ対照処置と比較して、抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｉＲ−１０７で処置したマウスにおいて、糖耐性の統計学的に有意の改善が観察された（表１２参照）。抗ｍｉＲ−１０３処置マウスからのＩＰＧＴＴ結果を抗ｍｉＲ−１２４処置マウスからのＩＰＧＴＴ結果と比較した場合にも、糖耐性の統計学的に有意の改善は明白である（表１３参照）。
Figure 2016106077
Figure 2016106077
抗ｍｉＲ処置後９日目に、抗ｍｉＲ−１０３処置マウス（ｎ＝５）においてインスリン耐性試験（ＩＴＴ）も実施した。６時間絶食後に、２Ｕインスリン／体重１ｋｇを投与した。０、１５、３０、６０、９０および１２０分に採血した；０分での値を１００に正規化した。ＰＢＳによる対照処置（表１４参照）に比して、あるいは抗ｍｉＲ−１２４による対照処置（表１５参照）に比して、血糖値の統計学的に有意の低減が観察されたが、これは、インスリン感受性における改善を示す。
Figure 2016106077
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糖新生（新規の肝臓グルコース産生としても知られている）の測定として、ピルビン酸耐性試験を実施した（ｎ＝５）。対照または抗ｍｉＲ−１０３による処置後１２日目に、一晩（１６時間）絶食後、マウス（ｎ＝５）に２ｇのピルビン酸塩／体重１ｋｇを腹腔内注射した。血糖値の統計学的有意の低減を観察した（表１６参照）。対照マウス（抗ｍｍ−１０７；ｎ＝５）と比較した場合、糖新生の減少は、抗ｍｉＲ−１０３処置マウス（ｎ＝５）におけるＧ−６−Ｐアーゼ、ＰＣおよびＦＢＰアーゼの肝臓レベルの低減によっても支持された（表１７参照）。
Figure 2016106077
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肝臓グリコーゲン含量も測定し（ｎ＝マウス５匹）、ＰＢＳ処置マウス（２４６ｕｍｏｌ）に比して、抗ｍｉＲ−１０３（３６７ｕｍｏｌ）処置マウスの肝臓で増大されることが判明した（メーカーの使用説明書に従って、BioVisionグリコーゲン検定キット）。
一晩絶食後に血漿インスリンを測定し（ｎ＝マウス１０匹）、対照処置マウス（抗ｍｍ−１０７；３４ｎｇ／ｍＬ）と比較して、抗ｍｉＲ−１０３（２６ｎｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０５）で処置したマウスでは低減されることが判明した。
ＡＬＴの測定値は、明白な毒性を示さなかった。ｏｂ／ｏｂマウスでは、ＡＬＴレベルは、ＰＢＳ、抗ｍｉＲ−１２４、抗ｍｉＲ−１０７および抗ｍｉＲ−１０３で処置したマウスにおいて、それぞれ１２５ ＩＵ／Ｌ、１０７ ＩＵ／Ｌ、９８ ＩＵ／Ｌであった。
高脂肪餌肥満マウス
抗ｍｉＲ−１０３も、グルコース耐性減損および２型糖尿病のモデルである高脂肪餌肥満マウス（餌誘導性肥満マウスまたはＤＩＯマウスとも呼ばれる）に投与した。４週齢で開始して、１２週間、マウスを高脂肪餌に保持した。マウスに、１５ｍｇ／ｋｇの抗ｍｉＲ−１０３を２回注射した。ＰＢＳを、対照処置として投与した。付加的対照処置は、抗ｍｉＲ−１２４または抗ｍｍ−１０７であった。各処置群は、４〜５匹のマウスを含有した。
３日後、血糖を測定し、ＰＢＳ対照（ｎ＝４；１０．５ｎＭ随意、８時間絶食後９．５ｎＭ）に比して、抗ｍｉＲ−１０３処置マウス（ｎ＝５；〜８ｎＭ随意、８時間絶食後〜７．５ｎＭ）において、摂餌および絶食状態の両方において、有意に低減されることを観察した。抗ｍｉＲ−１０３処置マウスにおける血糖も、抗ｍｍ−１０７処置マウスと比較して、摂餌および絶食状態の両方で有意に低減されることが判明した（表１８参照）。
Figure 2016106077
抗ｍｉＲまたはＰＢＳ処置後８日目に、一晩（１６時間）絶食後、２ｇ／ｋｇのグルコースを投与することにより、ＩＰＧＴＴも実施した（ｎ＝マウス５匹）。ＰＢＳ対照処置と比較した場合、糖耐性は、統計学的有意に改善された（表１９参照）。
Figure 2016106077
血漿インスリンレベルの測定値（ｎ＝５匹のマウス）は、対照処置マウス（７ｎｇ／ｍｌ、抗ｍｍ−１０７）に比して、抗ｍｉＲ−１０３処置マウス（５．４ｎｇ／ｍｌ）における血漿インスリンの低減を明示した。
同時に、糖尿病および肥満症の動物モデルにおけるこれらのデータは、ｍｉＲ−１０３／１０７の抑制がインスリン感受性を増強することを実証する。インスリン感受性を増強する化合物は、代謝障害、例えば糖尿病、糖尿病前症、代謝性症候群、高血糖症およびインスリン抵抗性の治療および／または防止のために有用である。
実施例３：ｍｉＲ−１０７の過剰発現は動物における高血糖症を誘導する
ｍｉＲ−１０７の役割をさらに調べるために、８週齢雄野生型マウスを、ｍｉＲ−１０７を発現するアデノウイルスベクターで処置して（ａｄ−１０７／ＧＦＰ；ｎ＝５）、種々の細胞型および組織、例えば肝臓においてｍｉＲ−１０７の過剰発現を生じた。アデノウイルスベクター発現緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で処置したマウス（ａｄ−ＧＦＰ；ｎ＝５）を、対照動物として用いた。各動物に、５×１０９ウイルス粒子を注射した。
ノーザンブロッティングは、ｏｂ／ｏｂマウスで観察されたレベルと同様のｍｉＲ−１０７のレベル増大を明示した（図２Ａ参照）。
血糖は、摂餌および絶食動物の両方において、ａｄ−ＧＦＰで処置したマウスに比して、ａｄ−１０７／ＧＦＰで処置したマウスで増大されることが判明した（表２０参照）。これらのデータは、ｍｉＲ−１０７発現増大が血糖増大をもたらす、ということを実証する。
Figure 2016106077
腹腔内糖耐性試験（ＩＰＧＴＴ）は、身体からの腹腔内注射グルコースのクリアランスを測定する。この試験を用いて、ａｄ−１０７／ＧＦＰで処置した動物が糖耐性減損を示すか否かを同定した。動物を約１５時間絶食させて、グルコースの溶液を２ｇ／ｋｇで腹腔内（ＩＰ）注射して、注射後の異なる時点で血糖を測定する。ＩＰＧＴＴ中、０、３０、６０および１２０分に、尾放血からの血中で、糖（ｍｇ／ｄｌ）を測定した。０、３０、６０および１２０分でのグルコース測定から台形方式により、曲線下糖面積（ＡＵＣ、ｍｇ／ｄｌ分）を、糖耐性減損の指標として算定した。ａｄ−１０７／ＧＦＰで処置した動物は、ａｄ−ＧＦＰを注射した動物に比して、グルコースに対する耐性減損を示した（表２１参照）。
Figure 2016106077
インスリン耐性試験（ＩＴＴ）は、インスリンに対する感受性を測定する。この試験を用いて、ｍｉＲ−１０７の過剰発現がインスリンに対する感受性を生じるか否かを同定した。ａｄ−１０７／ＧＦＰまたはａｄ−ＧＦＰでの処置の５日後に、マウスを約６時間絶食させ、次いで、０．７５Ｕ／ｋｇのインスリンを腹腔内注射した。ＩＴＴ中、０、１５、３０、６０、９０および１２０分に、尾放血からの血中で、血糖を測定した。６０分時点で、ａｄ−１０７／ＧＦＰ処置動物は、ａｄ−ＧＦＰ処置動物に比して、この時点でのより高量の血糖で測定されるような、インスリンに対する感受性減少を示した（表２２参照）。
Figure 2016106077
ピルビン酸耐性試験は、de novo肝臓グルコース産生としても既知である糖新生を測定する。この試験を用いて、ｍｉＲ−１０７の過剰発現が糖新生に悪影響を及ぼすか否かを査定した。ａｄ−１０７／ＧＦＰまたはａｄ−ＧＦＰでの処置の１０日後に、マウスを約１５時間絶食させ、次いで、２ｇ／ｋｇのピルビン酸塩を腹腔内注射した。試験中、０、２０、３０、６０および１２０分に、尾放血からの血中で、血糖を測定した。３０分時点および６０分時点で、ａｄ−１０７／ＧＦＰ処置動物は、ａｄ−ＧＦＰ処置動物に比して、血糖増大を示したが、これは、ｍｉＲ−１０７の過剰発現の結果としての糖新生の増大を示す（表２３参照）。
Figure 2016106077
実時間ＰＣＲを用いて、糖新生に関連する遺伝子のレベルを測定した；レベルを３６Ｂ４に正規化した；ｎ＝５匹のマウス。さらに、肝臓グルコース産生の増大には、グルコース６−ホスフェート（Ｇ６Ｐｃ）、ホスホエノールピルベートカルボキシナーゼ（Ｐｅｐｃｋ）、ピルベートカルボキシラーゼ（ＰＣ）およびフルクトース１，６ビスホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）の発現増大が同時に生じたが、これは、糖新生増大がグルコースレベル上昇の主因である、ということを示唆する（表２４参照）。これらのデータは、ｍｉＲ−１０７の過剰発現がde novo肝臓グルコース産生を増強する、ということを実証した。
Figure 2016106077
非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡｓ）も測定し、ｍｉＲ−１０７が過剰発現されると低減されることが判明した（ａｄ−ＧＦＰ処置マウスでは〜０．２５ｎｍｏｌ／ｕＬ；ａｄ−１０７／ＧＦＰ処置マウスでは〜０．３０ｎｍｏｌ／ｕＬ、ｐ＜０．０５）。
これらの結果は、ｍｉＲ−１０７の発現増大が、グルコースに対する耐性減損、インスリンに対する感受性減少および糖新生増大を生じる、ということを実証する。ｍｉＲ−１０７およびｍｉＲ−１０３は、シード配列を共有し、類似の標的を調節すると予測され、ｍｉＲ−１０７の過剰発現後に観察される作用は、ｍｉＲ−１０３の過剰発現時にも観察され得る。したがって、ｍｉＲ−１０７およびｍｉＲ−１０３は、代謝障害、例えば糖尿病およびインスリン抵抗性（これらに限定されない）の治療のための標的である。
実施例４：ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の抑制は血漿コレステロールを低減する
野生型（Ｃ５７Ｂｌ／６、８週齢）およびｏｂ／ｏｂマウス（１２週齢、８週間の高脂肪餌で）の両方における血中脂質レベルに及ぼすその作用に関して、ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の抑制をさらに試験した。各処置群は、マウス５匹を含有した。この実験では、抗ｍｉＲ−１０３は配列番号６の配列、 各糖での２’−Ｏ−メチル修飾、最初の４つのヌクレオシド間結合の各々でのホスホロチオエート修飾（５’末端で）、最後の２つのヌクレオシド間結合の各々でのホスホロチオエート修飾（３’末端で）、およびコレステロール共役体を含んだ。抗ｍｉＲ−１０７は、配列番号７の配列、 各糖での２’−Ｏ−メチル修飾、最初の４つのヌクレオシド間結合の各々でのホスホロチオエート修飾（５’末端で）、最後の２つのヌクレオシド間結合の各々でのホスホロチオエート修飾（３’末端で）、およびコレステロール共役体を含んだ。
野生型マウスに、ＰＢＳ注射、１５ｍｇ／ｋｇの用量での抗ｍｉＲ−１０７の腹腔内１回注射、または１５ｍｇ／ｋｇの用量での抗ｍｉＲ−１０３の腹腔内２回注射を施した。ｏｂ／ｏｂマウスには、ＰＢＳ注射、１５ｍｇ／ｋｇの用量での抗ｍｉＲ−１０７の腹腔内１回注射、または１５ｍｇ／ｋｇの用量での抗ｍｉＲ−１０３の腹腔内２回注射を施した。
総血漿コレステロールを測定し、ＰＢＳ処置マウス（２．６７ｕｇ／ｕｌ；ｎ＝５）に比して、抗ｍｉＲ−１０３（１．７５ｕｇ／ｕｌ、ｐ＜０．００１；ｎ＝５）または抗ｍｉＲ−１０７（１．８６ｕｇ／ｕｌ、ｐ＜０．００１；ｎ＝５）処置ｏｂ／ｏｂマウスでは有意に低下されることが判明した。総血漿コレステロールのＨＤＬおよびＬＤＬ分画を、血漿２００ｕｌからのＦＰＬＣゲル濾過により測定し、ＬＤＬコレステロールにおける優先的低減を明示した（表２５参照）。ＬＤＬおよびＨＤＬ粒子の数を測定するために、免疫ブロッティングを実施して、アポリポタンパク質Ｂ検出を用いてＬＤＬ粒子の数を測定し、アポリポタンパク質Ａ１検出を用いてＨＤＬ粒子の数を測定した（図３Ａ参照）。
Figure 2016106077
非エステル化脂肪酸も測定し、ＰＢＳ処置（〜０．３５ｎｍｏｌ／ｕｌ）に比して、ｍｉＲ−１０３（〜０．５ｎｍｏｌ／ｕｌ）またはｍｉＲ−１０７（〜０．４５ｎｍｏｌ／ｕｌ）の抑制後に増大されることを観察した（各群に関してｎ＝５）。
８週齢ＬＤＬ−受容体欠損マウス（ＬＤＬＲ−／−マウス）も、抗ｍｉＲ−１０３またはＰＢＳで処置し（ｎ＝３）、主要リポタンパク質分画を、血漿１５０ｕｌからのＦＰＬＣゲル濾過により分離して、ＶＬＤＬ、ＨＤＬおよびＬＤＬ分画に関して検定した。コレステロールに関して検定した分画でウエスタンブロッティングも実施し、アポリポタンパク質Ｂ抗体を用いて、ＬＤＬ粒子の数を検出し、アポリポタンパク質Ａ１抗体を用いてＨＤＬ粒子の数を検出した（図３Ｂ参照）。ＬＤＬコレステロールの優先的低減を観察した（表２６参照）。ＶＬＤＬの減少は、トリグリセリドの減少を示す（図３Ｃ参照）。
Figure 2016106077
これらのデータは、ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の抑制が、血糖値低減、インスリン感受性改善、糖新生低減および糖耐性改善のほかに、コレステロールレベル、優先的にはＬＤＬコレステロールレベルを低減する、ということをさらに実証する。
実施例５：ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７による遺伝子発現調節の分析
ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７がインスリン感受性を調節する考え得るメカニズムを検討するために、ＲＮＡ発現分析を実施して、ｍｉＲ−１０３／１０７が抑制されるかまたは過剰発現される組織中で遺伝子を測定した。実時間ＰＣＲを実行して、ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の標的であると予測される遺伝子のＲＮＡレベルを測定した。マイクロアレイ分析を実施して、遺伝子発現におけるゲノム幅変化を測定した。ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７の配列は１つの核酸塩基のみが異なるので、それらは標的遺伝子の重複組を有すると予期される。
ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−１０７がインスリン感受性を調節する考え得るメカニズムを検討するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイを用いてゲノム幅発現分析を実施して、ウイルス投与の１０日後に、Ａｄ−１０７／ＧＦＰおよびＡｄ−ＧＦＰに感染したＣ５７Ｂ１／６マウスからの肝臓を比較した（ｎ＝５／処置）。Ａｄ−１０７／ＧＦＰマウスの肝臓では、３’ＵＴＲ中にｍｉＲ−１０７に対するシード整合を保有するｍＲＮＡは、その３’ＵＴＲがｍｉＲ−１０７シード整合を保有しないｍＲＮＡと比較して、有意に下方調節され、下方調節は、進化的選択圧下にあると推測されるシード整合を保有するｍＲＮＡのサブセットに関してより健著であった（図２Ｂ）。データは、ｍｉＲ−１０７を発現する組換えアデノウイルスに感染したＣ５７Ｂ１／６マウスの肝臓から収集したＲＮＡで実施した実時間ＰＣＲ（表２７参照）によるｍｉＲ−１０７標的遺伝子のサブセットに関して確証された（実施例２におけると同様）。対照ウイルスＡｄ−ＧＦＰに比して、ｍｉＲ−１０７を発現するアデノウイルスの存在下でのＲＮＡレベルの低減は、ＲＮＡがｍｉＲ−１０３／１０７の標的である、ということを示す。下方調節化遺伝子の機能的注釈の分析は、代謝がｍｉＲ−１０３／１０７により影響を及ぼされる、ということを示した。
Figure 2016106077
抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｉＲ−１０７で処置したｏｂ／ｏｂマウス（実施例１と同様；ｎ＝５匹のマウス）の肝臓から収集したＲＮＡで、実時間ＰＣＲを実施した。ＰＢＳ対照に比して、抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｉＲ−１０７の存在下でのＲＮＡレベルの増大は、ＲＮＡがｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の標的である、ということを示す（表２８ならびに付加的遺伝子発現データの図４Ａを参照）。
Figure 2016106077
抗ｍｉＲ−１０３で処置したＬＤＬＲ−／−マウス（実施例４と同様）の肝臓から収集したＲＮＡで、実時間ＰＣＲを実施した。ＰＢＳ対照に比して、抗ｍｉＲ−１０３の存在下でのＲＮＡレベルの増大は、ＲＮＡがｍｉＲ−１０３の標的である、ということを示す（表２９参照）。
Figure 2016106077
抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｉＲ−１０７で処置したｏｂ／ｏｂまたはＣ５７Ｂ１／６マウス（実施例１と同様）の脂肪から収集したＲＮＡで、実時間ＰＣＲを実施した。ＰＢＳ対照に比して、抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｉＲ−１０７の存在下でのＲＮＡレベルの増大は、ＲＮＡがｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の標的である、ということを示す（表３０ならびに付加的遺伝子発現データの図４Ｂを参照）。
Figure 2016106077
抗ｍｉＲ−１０３で処置したｏｂ／ｏｂまたはＣ５７Ｂ１／６マウス（実施例１と同様）の筋肉から収集したＲＮＡで、実時間ＰＣＲを実施した。ＰＢＳ対照に比して、抗ｍｉＲ−１０３の存在下でのＲＮＡレベルの増大は、ＲＮＡがｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７の標的である、ということを示す（表３１ならびに付加的遺伝子発現データの図４Ｃを参照）。
Figure 2016106077
脂肪細胞中のカベオラの主要構成成分であり、インスリンシグナル伝達の媒介因子であるカベオリン１（Ｃａｖ１）は、ｍｉＲ−１０７過剰発現およびサイレンシング後のインスリン感受性組織中でそれぞれ下方または上方調節される遺伝子を含有するｍｉＲ−１０３／１０７シードの１つであった。上記の表中で例示したように、Ｃａｖ１転写物レベルは、ａｄ−１０７／ＧＦＰを注射したＣ５７Ｂ１／６マウスの肝臓中で約３０％低減され（ａｄ−ＧＦＰマウスに対して、ａｄ−１０７／ＧＦＰマウスにおいて０．７１の相対的発現）、抗ｍｉＲ−１０３注射ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓では約２２％増大された（ＰＢＳ処置マウスに対して、１．２２の相対発現）。Ｃ５７Ｂ１／６マウスの抗ｍｉＲ−１０３処置は、脂肪Ｃａｖ１ ｍＲＮＡレベルの１．５倍増大をもたらす（ＰＢＳ処置マウスの１．５９に対して、２．３７の相対発現）。特に、ｏｂ／ｏｂマウスの脂肪におけるｍｉＲ−１０３サイレンシングはＣａｖ１ ｍＲＮＡレベルを約３．５倍に増大し（ＰＢＳ処置マウスに対して３．４５の相対発現）、筋肉中のｍｉＲ−１０３サイレンシングは、Ｃａｖ１ ｍＲＮＡレベルの約１．４倍の上方調節を生じた（ＰＢＳ処置マウスに対して１．４３の相対発現）。
Ｃａｖ１発現がｍｉＲ−１０３／１０７により直接的に調節されるかを試験するために、コード配列および３’ＵＴＲを、機能的結合部位に関して分析した。ネズミＣａｖ１（ｍＣａｖ１）は、３つのｍｉＲ−１０３シードモチーフを３’中に含有し、一方、ヒトＣａｖ１（ｈＣａｖ１）は、３つの６−ｍｅｒシードモチーフ（１つは５’、２つは３’ＵＴＲ中）を有する（図９）。
遺伝子がｍｉＲ−１０３／１０７により調節されるということの付加的確証として、ルシフェラーゼ検定を用いて、ｍｉＲ−１０３／１０７標的遺伝子の全長または部分的３’ＵＴＲを含有する構築物を試験した。３’ＵＴＲマウスおよびヒトＣａｖ１（それぞれ、ｍＣａｖ１およびｈＣａｖ１）を含有するプラスミド構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのルシフェラーゼ活性の測定値は、ｍｉＲ−１０３の存在下でのこれらのレポーター構築物の発現低減を示した（表３２参照）。シードの突然変異化（マウスにおいても保存される）（ＮＭ＿００１７５３、ＲｅｆＳｅｑ、２００４−２００９（ＡＴＧＣＴＧ））は、両ｈＣａｖ１ ３’ＵＴＲ構築物（ＮＭ＿００１７５３、１５０５−２６７９ｎｔ（Ｌ）および１７４９−２６７９ｎｔ（Ｓ））におけるルシフェラーゼ活性のｍｉＲ−１０３誘導性低減の完全逆転を生じた。さらに、突然変異体３’ＵＴＲ ｈＣａｖ１における総ルシフェラーゼ活性は、同様に、内因的発現ｍｉＲ−１０３による抑圧のため、野生型３’ＵＴＲ ｈＣａｖ１と比較して増大された。
Figure 2016106077
他のＲＮＡの中で、カベオリン１およびリピンを、ｍｉＲ−１０３／１０７の標的として同定した。これらの遺伝子は、抗ｍｉＲ−１０３および／または抗ｍｉＲ−１０７の作用を媒介する標的に関する候補である。
実施例６：ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７標的タンパク質発現の分析
ｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７による標的遺伝子の調節をさらに理解するために、抗ｍｉＲ処置マウスからの試料を、タンパク質発現に関して分析した。
ＰＢＳまたは抗ｍｉＲ−１０３で処置したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織からのタンパク質抽出物に関して、ウエスタンブロッティングを実施した（実施例１に記載）。カベオリン１、インスリン受容体ベータ、ｐＡＫＴ、ＡＫＴおよびガンマ・チューブリンに関して膜をプローブした。リン酸化ｐＡＫＴは、増大されることが観察された。ｐＡＫＴはインスリンシグナル伝達により活性化されるキナーゼであるので、同様の血漿インスリンレベルでのｐ−ＡＫＴレベル増大は、インスリン感受性増大を示した（図５Ａ参照）。
ＨＥＫ２９３細胞も抗ｍｉＲ−１０３で処置し、抗ｍｉＲ処置の３日後に細胞を収穫した。ウエスタンブロッティングを実施して、カベオリン１およびガンマ・チューブリンを検出した。カベオリン１タンパク質レベルは抗ｍｉＲ−１０３の濃度増大に伴って増大したが、これは、カベオリン１がｍｉＲ−１０３の抑制により抑制解除されたことを示す（図５Ｂおよび５Ｄ参照）。
ノーザンブロッティングを用いて、図５Ｂにおけると同様に処置したＨＥＫ２９３細胞においてｍｉＲ−１０３を検出した（図５Ｃ参照）。
細胞へのｍｉＲ−１０３の付加の作用を評価するために、ＨＥＫ２９３細胞をｍｉＲ−１０３ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。対照ｓｉＲＮＡも用いた。ｍｉＲ−１０３の付加は、カベオリン１タンパク質のレベル低減を引き起こした（図５Ｅおよび５Ｆ参照）。
細胞へのｍｉＲ−１０３の付加の作用を評価するために、３Ｔ３細胞をｍｉＲ−１０３ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。対照ｓｉＲＮＡも用いた。ｍｉＲ−１０３の付加は、カベオリン１タンパク質のレベル低減を引き起こした（図５Ｇ参照）。
ｍＲＮＡ発現に関する結果と合わせて解釈すると、これらのデータは、Ｃａｖ１が、マウスおよびヒトの両方において、ｍｉＲ−１０３の直接的標的である、ということを実証する。
実施例７：インスリン感受性に及ぼすｍｉＲ−１０３媒介性作用に対する肝臓の関与
インスリン感受性に及ぼす作用に関する肝臓の相対的関与を試験するために、リポソーム処方物を用いて、抗ｍｉＲを主に肝臓に送達した。抗ｍｉＲの肝臓標的化脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）処方物を、新規イオン化可能脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡを用いて調製した（Semple et al., Nature Biotechnology, 28, 172-176 (2010)）。ＬＮＰは、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびｍＰＥＧ２０００−ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５のモル比で使用)で構成された。約１１：１の総脂質：抗ｍｉＲ重量比で、ＬＮＰ中で抗ｍｉＲを処方した。
リポソーム中に処方した抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｉＲ−１０７を、１５ｍｇ／ｋｇの抗ｍｉＲの用量でマウスに投与した（抗ｍｉＲ−１０３に関してはｎ＝８、抗ｍｍ−１０７に関してはｎ＝７）。マウスに、２日間、１日１回注射した。肝臓、脂肪または筋肉からの総ＲＮＡ３０ｕｇを用いて、ノーザンブロッティングを実施した。リポソーム処方抗ｍｉＲ−１０３は、肝臓における（しかし脂肪および筋肉ではなく）特異的且つ強力なサイレンシングを誘導したが、しかしリポソーム処方抗ｍｍ−１０７は誘導しなかった（図６参照）。ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓におけるｍｉＲ−１０３／１０７のサイレンシングは、ランダムおよび絶食状態での血糖値に有意の作用を及ぼさなかったし（表３３参照）、この処置はインスリン感受性改善も生じなかった。この観察は、ｍｉＲ−１０３／１０７のインスリン感作作用が脂肪および筋肉のような肝臓外組織により主に媒介される、ということを示す。
Figure 2016106077
実施例８：脂肪組織におけるｍｉＲ−１０３抑制の作用
ｍｉＲ−１０３の発現は、肝臓および筋肉と比較して脂肪組織中では約８倍高いため、脂肪組織におけるｍｉＲ−１０３／１０７のサイレンシングの作用を、さらに詳細に検査した。
肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウスは、対照処置マウスと比較して、抗ｍｉＲ−１０３を用いてｍｉＲ−１０３／１０７が全身的にサイレンシングされた場合、体重のわずかな減少を示した（表３４参照）。これに対比して、リポソーム処方抗ｍｉＲ−１０３またはＡｄ−１０７／ＧＦＰを用いた肝臓におけるｍｉＲ−１０３／１０７発現の操作は、対照処置マウスと比較して、体重に影響を及ぼさなかった。この観察にかんがみて、高脂肪餌肥満およびｏｂ／ｏｂ動物の両方の脂肪分布を、抗ｍｉＲまたは対照による処置の１３日後に、コンピューター断層撮影（ＣＴ）により調べた（図７Ａ参照）。抗ｍｉＲ−１０３で処置した高脂肪餌およびｏｂ／ｏｂマウスはともに、皮下（ＳＣ）および内臓（Ｖ）脂肪の両方の減少のため、総脂肪低減を示した（表３４および３５参照）。
Figure 2016106077
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この低減が細胞数が少ないためかまたは脂肪細胞が小さいためかを調べるために、脂肪組織切片からの平均脂肪細胞サイズを、自動画像分析ソフトウエアを用いて定量した。抗ｍｉＲ−１０３処置高脂肪餌肥満およびｏｂ／ｏｂ動物は、抗ｍｍ−１０７注射対象と比較して、より小さい脂肪細胞を有した（図７Ｂ、７Ｃ；表３６で定量化）。
Figure 2016106077
小脂肪細胞の数の有意の増大ならびに大型脂肪細胞の減少も観察された（表３７および３８参照；値は総細胞数に対して正規化される）。
Figure 2016106077
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ＣＴで測定した脂肪パッドの低減を、脂肪細胞サイズの平均的低減と比較した結果は、抗ｍｉＲ−１０３マウスが抗ｍｍ−１０７対照より約１０〜２０％多い脂肪細胞を有する、ということを示した。これが前死脂肪細胞分化の変化によるものか否かを調べるために、間質−血管分画（ＳＶＦ）を野生型マウスのＶおよびＳＣ脂肪から単離して、抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｍ−１０７の存在下で分化を誘導した。培養中で８日後、抗ｍｉＲ−１０３トランスフェクト化細胞は、抗ｍｍ−１０７からの細胞より多い成熟脂肪細胞を含有した（図７Ｄ）が、これは、ｍｉＲ−１０３の非存在が細胞自律的に脂肪細胞分化を増強する、ということを示す。高含量画像処理による脂肪細胞数の定量は、それぞれＶまたはＳＣ脂肪由来の抗ｍｉＲ−１０３処置ＳＶＦにおける分化脂肪細胞の約２および２．５倍の増大を実証した（表３９参照）。逆に、Ａｄ−１０７／ＧＦＰ媒介性ｍｉＲ−１０３過剰発現は、Ａｄ−ＧＦＰ対照感染ＳＶＦと比較して、分化脂肪細胞数の３．７倍低減をもたらした（表３９参照）。
Figure 2016106077
前脂肪細胞分化におけるｍｉＲ−１０３の負の調節は、脂肪細胞分化マーカーＡｐ２およびＰＰＡＲ−ガンマの遺伝子発現分析によりさらに裏付けられた。両マーカーは、抗ｍｍ−１０７対照と比較してｍｉＲ−１０３／１０７が抗ｍｉＲ−１０３でサイレンシングされる分化ＳＶＦでのｍＲＮＡレベル増大を示した（表４０参照）。
Figure 2016106077
実施例９：ｍｉＲ−１０３媒介性グルコース取込み
小型脂肪細胞は、ヒトおよび齧歯類モデルにおいて、インスリン感受性増大に関連する。脂肪細胞におけるインスリン刺激性グルコース取込みがｍｉＲ−１０３抑制により影響を及ぼされるか否かを調べるために、一次脂肪細胞を抗ｍｉＲ−１０３または対照処置ｏｂ／ｏｂマウスから単離して、インスリン刺激性Ｄ−１４Ｃ−グルコース取込みをin vitroで測定した。
一試験において、一次脂肪細胞を、ＰＢＳまたは抗ｍｉＲ−１０３（各々１５ｍｇ／ｋｇの２回注射）で処置した７ヶ月齢ｏｂ／ｏｂマウスから単離した。抗ｍｉＲ−１２４または抗ｍｍ−１０７を、対照抗ｍｉＲとして用いた。１５日間絶食後の注射の６日後にマウスを屠殺し、一次皮下（ＳＣ）または内臓（Ｖ）脂肪細胞分画を、２０ｎＭインスリンを用いた場合と用いない場合とで、１０分間予備インキュベートして、次に、１ｍＭの１４Ｃ標識グルコースとともにさらに１時間インキュベートした。抗ｍｉＲ−１０３は、ＰＢＳまたは抗ｍｉＲ−１２４に比して、脂肪細胞におけるインスリン刺激性グルコース取込みを改善したが、これは、インスリン感受性の増大を示す（表４１参照）。２０ｎＭインスリンでの刺激後のグルコース取込みは、対照（抗ｍｍ−１０７またはＰＢＳ）と比較して、抗ｍｉＲ−１０３において有意に高かった（表４１）。
Figure 2016106077
さらに、インスリン感受性と正の相関を示すアディポネクチンレベルは、抗ｍｉＲ−１０３処置ｏｂ／ｏｂマウスで増大され（表４２）、ａｄ−１０７／ＧＦＰを注射したＣ５７Ｂ１／６マウスでは低減された。
Figure 2016106077
合わせて考えると、これらのデータは、ｍｉＲ−１０３／１０７のサイレンシングが脂肪細胞におけるインスリン感受性を増大する、ということを実証する。
実施例１０：ｍｉＲ−１０３媒介性リポタンパク質リパーゼヒドロラーゼ活性
ＰＢＳまたは抗ｍｉＲ−１０３で処置したＣ５７Ｂ１／６マウスまたはｏｂ／ｏｂマウスの脂肪におけるＬＰＬヒドロラーゼ活性を、酵素検定を用いて測定した。抗ｍｉＲ−１０３処置マウスにおけるＬＰＬヒドロラーゼ活性の増大は、インスリン感受性の増大を示した（表４３参照）。
Figure 2016106077
インスリン感受性増大は、インスリン抵抗性の改善を生じる。したがって、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７の活性を抑制することにより、インスリン感受性を増大し、したがってインスリン抵抗性を改善するための方法が、本明細書中で提供される。
実施例１１：カベオリン１遺伝子を欠くｍｉＲ−１０３抑制マウスの作用
Ｃａｖ１は、カベオラ（形質膜での別個の非イオン性界面活性剤不溶性、脂質およびコレステロール濃化血管嵌入）の主要タンパク質である。Ｃａｖ１は、カベオラおよびその関連ＩＲを安定化することによりほぼ同様にインスリンシグナル伝達を活性化する。具体的には、Ｃａｖ−１および−３由来の足場ドメインに対応するペプチドが、インスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）に対するインスリン受容体キナーゼ活性を強力に刺激する。Ｃａｖ３過剰発現は、２９３Ｔ細胞におけるＩＲＳ−１のインスリン刺激性リン酸化を増大し、インスリン刺激に応答して肝臓ＩＲリン酸化を増大し、それにより、糖尿病マウスの全体的グルコース代謝を改善する。無Ｃａｖ１（Ｃａｖ１ＫＯ）マウスは、通常餌で表現型正常である。しかしながら、高脂肪餌にすると、総脂肪ＩＲタンパク質レベルの９０％低減により立証されるように、ＩＲシグナル伝達減少のため、インスリン抵抗性を発症する。インスリンシグナル伝達がＣａｖ１発現におけるｍｉＲ−１０３／１０７媒介性変化と相関するか否かを調べた。ｏｂ／ｏｂマウスの脂肪細胞において、抗ｍｉＲ−１０７を用いたｍｉＲ−１０３／１０７のサイレンシングは、抗ｍｍ−１０７処置マウス（図８Ｃ）と比較して、Ｃａｖ１タンパク質レベル増大（図８Ｃ）、ＩＲｂ発現増大、ならびにｐＡｋｔレベル増強を生じた。これに対比して、分析の８日前にａｄ−１０７／ＧＦＰを腹腔脂肪に注射された野生型マウスは、Ｃａｖ１発現の低減ならびにＩＲｂおよびｐＡＫＴレベル低減を示した（図８Ｂ；ａｄ−ＧＦＰ注射に対するａｄ−１０７／ＧＦＰ注射後の相対Ｃａｖ１発現０．４）。組換えアデノウイルスによる肝臓中のｍｉＲ−１０７の過剰発現が肝臓インスリン抵抗性および糖耐性減損をもたらしたため、それらの動物における下流分子インスリンシグナル伝達事象を試験した。Ｃａｖ１のタンパク質レベルおよびｐＡＫＴレベルは、ａｄ−１０７／ＧＦＰ感染野生型マウスの肝臓において減少し、ＩＲｂタンパク質レベルにおいては変化は観察されなかった（図８Ａ）。この結果は、ｍｉＲ−１０３の過剰発現が肝臓インスリン抵抗性を誘導し得ることを示す表現型知見と、ならびに肝臓におけるＩＲｂレベル低減を示さないが、脂肪細胞におけるＩＲｂおよびｐＡｋｔレベル低減を示すＣａｖ１ＫＯマウスからのデータと一致する。最後に、Ｃａｖ１発現の変調がｍｉＲ−１０３／１０７サイレンシング時のインスリンシグナル伝達の増大に関与することを示すために、高脂肪餌肥満マウスまたはＣａｖ１ＫＯマウスを、抗ｍｉＲ−１０３または抗ｍｍ−１０７（１５ｍｇ／ｋｇ抗ｍｉＲ、１日１回腹腔内、２連続日間）で処置して、インスリン刺激後のインスリンシグナル伝達の活性化を試験した。ＣＡＶ１ＫＯマウスの高脂肪餌肥満野生型同腹の脂肪中のｍｉＲ−１０３／１０７のサイレンシングはＩＲｂの発現増大をもたらしたが、一方、インスリンシグナル伝達の活性化は、抗ｍｉＲ−１０３で処置した高脂肪餌肥満Ｃａｖ１ＫＯマウスの脂肪においては観察されなかった（図８Ｄ）。合わせて考えると、これらのデータは、ｍｉＲ−１０３／１０７がカベオリン媒介性過程によりインスリン感受性を調節する、ということを実証する。
実施例１２：実験方法
統計学的分析 バーは全て、平均±ＳＤを示すが、但し、表１０では、バーは平均±ＳＴＥを示す。スチューデントｔ検定を用いて、有意を算定した（ｐ＜０，０５； ｐ＜０，０１； ｐ＜０，００１）。実施例全体を通して、別記しない限り、統計学的有意は、表に示されている：＊＝ｐ＜０．０５； ＊＊＝ｐ＜０．０１； ＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
ＲＮＡ単離およびノーザンブロッティング分析 トリゾール試薬（Invitrogen）を用いて、総ＲＮＡを単離した。５〜３０μｇのＲＮＡを、１５Ｗ ｏｎ １４％ポリアクリルアミドゲル上で１５Ｗで分離した（Krutzfeldt et al., Nature, 2005, 438, 685-689）。
実時間ＰＣＲ ２μｇの総ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素(Invitrogen)を用いて、無作為六量体プライマーでのｃＤＮＡ調製のために用いた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｉ Ｍｉｘ（Roche）をＭｘ３００５Ｐ実時間ＰＣＲ系(Stratagene)とともに用いて、定量的実時間ＰＣＲにより、定常状態ｍＲＮＡ発現を測定した。転写物レベルを、ＧＡＰＤＨまたは３６Ｂ４に正規化した。実時間ＰＣＲに関するプライマー配列は、申し込み次第、入手可能である。ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ検定を用いて、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７またはＵ６（Applied Biosystem）に関して、ｍａＲＮＡレベルを測定して、ＰＣＲ結果をＵ６レベルに正規化した。
ルシフェラーゼ活性の検定 マウスまたはヒト３’ＵＴＲ配列を、特定のプライマーでＰＣＲ増幅し、その後、ａｔｔＢアダプタＰＣＲ処理して、ＢＰクロナーゼ（Invitrogen）を用いてｐＤＯＮＲ２２１エントリーベクター中にクローン化した。次に、陽性クローンを、二重リピン１／ホタル・ルシフェラーゼｐＥＭ３９３デスティネーションベクター中のホタルルシフェラーゼの停止コドンの後にさらにクローン化した。ＨＥＫ−２９３細胞を、２４ウェルプレート中で培養し、各ウェルを１００ｎｇの最終構築物を、ＰＢＳ、あるいは５０ｎｍｏｌの対照またはｓｉ−１０３二本鎖ｓｉＲＮＡ（Sigma）とともに用いて、四重反復実験で、トランスフェクトした。細胞を収穫し、二元的ルシフェラーゼレポーター検定系（Promega）を用いてトランスフェクト後４２〜４８時間に検定した。結果をリピン１ルシフェラーゼ対照に正規化して、対照ＰＢＳの平均値に比して表した。
動物 動物モデルはすべて、無菌動物施設中で、１２時間明暗周期で、Ｃ５７Ｂ１／６マウスバックグラウンドで保持した。６〜８週齢野生型またはレプチン欠乏（ｏｂ／ｏｂ）、あるいは１２週齢高脂肪餌（ＤＩＯ）マウス（６０％脂肪（Pvolimi Kliba AG）を８週間給餌）に、ＰＢＳ、抗ｍｉＲ、ａｄ−ＧＦＰまたはａｄ−１０７／ＧＦＰ（指示通りに）を尾静脈注射した。抗ｍｉＲを、１５ｍｇ／体重１ｋｇの用量で、０．２ｍｌ／注射で２連続日、投与した。ＰＢＳ０．２ｍｌ中に５×１０９プラーク形成単位（ＰＦＵ）で、尾静脈を通してアデノウイルスをマウスに注射した。
組換えアデノウイルスの生成 プライマー：
５’−ＡＡＴＡＣＣＣＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡ−３’（配列番号１７）および
５’−ＡＡＣＡＴＧＴＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＧＴ−３’（配列番号１８）
を有するＰＣＲ増幅ｍｉＲＮＡ前駆体配列を、ＧＦＰ発現シャトルベクターＡｄ５ＣＭＶＫ−ＮｐＡに挿入することにより、ｍｉＲ−１０７およびＧＦＰ（Ａｄ−１０７／ＧＦＰ）を発現するために用いられる組換えアデノウイルスを生成した。導入遺伝子を含有しないＡｄ−ＧＦＰ（ViraQuest）を、対照として用いた。
アデノウイルス脂肪注射 Ａｄ−ＧＦＰまたはａｄ−１０７／ＧＦＰを、外科的曝露後に４０μｌのＰＢＳ中に１×１０９ｐｆｕの濃度で、腹腔脂肪中に注射した。
コンピューター断層撮影 皮下および内臓脂肪パッドを、動物ＣＴスキャナー（LaTheta）を用いてスキャンした。画像を補正し、LaThetaソフトウエアを用いて分析した。
間質−血管（ＳＶ）分画および一次脂肪細胞の単離 皮下および内臓脂肪からの一次脂肪細胞および（ＳＶ）分画を、前に記載されたように調製した（Hansen et al., Mol. Endocrinol., 1998, 12, 1140-1149およびTozzo et al., Am. J. Physiol., 1995, 268, E956-964）。ＳＶ細胞が８０％集密になったら、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチンおよびロシグリタゾンで、脂肪細胞分化を誘導した（Tozzo et al）。抗ｍｉＲを用いて、２および３日目に、５．５μｇ／誘導期間の濃度で抗ｍｉＲを用いて、細胞を処置した。
脂肪細胞分化の自動分析 分化細胞を５％ホルムアルデヒドで固定した後、脂質小滴に関してＢＯＤＩＰＹで、核に関してヘキストで、サイトゾル染色のためにＳｙｔｏ６０で染色した（Invitrogen）。ウェル当たり２５枚の画像を自動顕微鏡画像処理システム（CellWorx）で撮影した。細胞プロファイラーソフトウェアを用いて、写真を分析した。
グルコース取込み ［１４Ｃ］スパイクグルコース取込みを、２０ｎＭインスリン刺激を用いた場合と用いない場合とで、記載されたように（Tozzo et al）測定した。
脂肪細胞サイズ 標準手法（例えば、Chen and Farese, J. Lipid. Res., 2002, 43, 986-989）に従って、１０μｍ切片５％パラホルムアルデヒド固定脂肪組織のヘマトキシリンおよびエオシン染色を実施し、細胞プロファイラーソフトウェアを用いて画像を解析した。少なくとも２０００個／動物の脂肪細胞を測定して、脂肪細胞サイズを確定した。
グルコース、インスリン、コレステロール、ＴＧおよびＮＥＦＡ測定 自動糖モニター（Glucometer Elite, Bayer）を用いて、血糖値を測定した。感受性ラットインスリンＲＩＡキット（Linco）を用いて、血漿からインスリンを測定した。標準としてｃ．ｆ．ａ．ｓ．（Roche/Hitachi）を用いて、それぞれＣｈｏｌまたはＴｒｉｇ／ＧＢ試薬を用いて、コレステロールおよびＴＡＧを測定した。ＮＥＦＡ−ＨＲ（２）Ｒ１／Ｒ２ Ｓｅｔ（Wako）を用いて、ＮＥＦＡを定量した。
グルコース、インスリンおよびピルビン酸耐性試験 グルコースおよびピルビン酸塩に関しては一晩絶食後（図に示したように）、インスリンに関しては６時間絶食後に、それぞれ、グルコース（生理食塩水中２ｇ／体重１ｋｇ）、インスリン（０．７５単位／体重１ｋｇ）またはピルビン酸塩（生理食塩水中２ｇ／体重１ｋｇ）の腹腔内注射により、グルコース、インスリンまたはピルビン酸耐性を試験した。注射前（時間＝０）、ならびに注射後１５、３０、６０および１２０分に、血糖値を測定した。
細胞培養、感染およびトランスフェクション Ｈｅｐａｌ−６、３Ｔ３−Ｌ１またはＨＥＫ２９３細胞を、４．５ｇ／リットルのグルコースを含有し、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補足した増殖培地ダルベッコ変法イーグル培地（Invitrogen）中に保持した。Ｈｅｐａｌ−６および３Ｔ３−Ｌ１を、コラーゲン被覆プレート上に保持した。Ｈｅｐａｌ−６を、増殖培地中で３６時間、５×１０ＰＦＵウイルスprepの１：１０００希釈でａｄ−ＧＦＰまたはａｄ−１０７／ＧＦＰに感染させた。ＨＥＫ２９３細胞を、増殖培地中で５．５μｇ／ｍｌの濃度で抗ｍｉＲで、あるいはＰＢＳ、ｓｉ−１０３またはｓｉ−１４１で、リポフェクタミン２０００（Invitrogen）を用いて、トランスフェクトした。
ウエスタンブロッティングおよび抗体 細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)）ならびにＨａｌｔホスファターゼ阻害剤(Thermo Scientific)）で４℃で抽出した。８〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、ニトロセルロースフィルター上に移して、以下の抗体で検出した：マウスモノクローナル抗ｙ−チューブリン(Sigma-Aldrich)、ウサギポリクローナル抗インスリン受容体ｂサブユニット（Ｃ−１９）:ｓｃ−７１１（ＩＲｂ）；抗−ｐ−インスリン受容体ｂサブユニット（Ｔｙｒ１１６２／１１６３）：ｓｃ２５１０３（ｐ−ＩＲｂ）；抗カベオリン１（Ｎ２０）：ｓｃ−８９４;および抗−ＧＭ１０３ （Ｂ１０）：ｓｃ−５５５９１(Santa Cruz Biotechnology);抗−ｐ−ＡＫＴ、抗−ＡＫＴ、抗−ｐ−Ｓ６ＢＰ；抗−ｐ−ＧＣＫ３（Cell Signaling）。
スクロース密度勾配分別およびインスリン刺激 Ａｄ−ＧＦＰまたはａｄ−１０７／ＧＦＰ感染Ｈｅｐａｌ−６細胞を、増殖培地中で１５分間、５００ｎＭインスリンで刺激した場合としない場合とで、ウシ胎仔血清を含有しないダルベッコ変法イーグル培地中で１２時間、血清不足にして、氷冷ＰＢＳ中に擦り取って、１．５ｍｌ均質化緩衝液（２５０ｍＭスクロース、４ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、４およびプロテアーゼ含有）およびＨａｌｔホスファターゼ阻害剤(Thermo Scientific)中に再懸濁した。細胞懸濁液を密閉加圧容器中で２５分間加圧し、１０００ｒｐｍで１０分後に、核周囲上清（ＰＮＳ）を０．４〜２Ｍ連続スクロース密度勾配で上部から負荷し（例えば、Ort et al., Eur. J. Cell Biol., 2000, 79, 621-630）、ベックマン遠心分離器で２５０００ｒｐｍ（１０００００ｇ）で４℃で１８時間、遠心分離した。限界水頭勾配実験のために、ＰＮＳを１：１で８５％スクロースと混合し、混合物１ｍｌを不連続スクロース勾配で底部から負荷して、最終５％（２ｍｌ）、３０％（５ｍｌ）および４２．５％（１ｍｌ）スクロースとして、ベックマン遠心分離器を用いて、ＳＷ４１ローター中で３９０００ｒｐｍで４℃で１９時間、遠心分離した。上部から０．５ｍｌ分画を収集し、１．５容積のエタノールとともに−８０℃で一晩沈澱させて、７０％エタノールで洗浄し、ローディング緩衝液を含有する２×ＳＤＳ中に再懸濁した。
具体的実施形態についての前述の説明は、一般的知識を適用することにより、他の者が、過度の実験を行なうことなく、そして一般的概念を逸脱せずに、種々の用途のためにこのような具体的実施形態を容易に修正し、および／または適合し得るよう、本発明の一般的性質を詳細に明示している。したがって、このような適合および修正は、開示された実施形態と等価の意味および範囲内に包含されるべきであり、そのように意図される。本発明を、具体的実施形態を用いて記載してきたが、多くの代替物、修正および変更がなされ得ることは当業者には明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広範な範囲内のこのような代替物、修正および変更は全て本発明に包含されるものとする。

Claims (16)

  1. （ｉ）被験者における血糖値を低減すること、または、
    （ｉｉ）被験者における血糖値上昇の開始を防止するかまたは遅延すること、
    において使用するための医薬品の製造における化合物の使用であって、
    前記化合物は、ｍｉＲ−１０３および／またはｍｉＲ−１０７の核酸塩基配列と少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含み、
    前記ｍｉＲ−１０３の核酸塩基配列は配列番号１であり、前記ｍｉＲ−１０７の核酸塩基配列は配列番号２である、使用。
  2. 前記被験者が、糖尿病前症、糖尿病、代謝性症候群、肥満症、糖尿病性異脂肪血症、高脂血症、高血圧症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、高コレステロール血症、および高インスリン血症から選択される少なくとも１つの代謝障害を有する、ならびに／または、前記被験者が、血糖値上昇、糖新生亢進、インスリン抵抗性、糖耐性減損、および過剰な体脂肪から選択される代謝障害に関連する少なくとも１つの症状を有する、請求項１記載の使用。
  3. 前記治療は、
    （ｉ）被験者におけるインスリン感受性を改善すること、または、
    （ｉｉ）インスリン抵抗性の開始を防止するかまたは遅延すること、
    を含む、請求項１または２に記載の使用。
  4. 前記治療は、被験者における糖耐性を改善することを含む、請求項１または２に記載の使用。
  5. 前記治療は、被験者における糖新生を低減することを含む、請求項１または２に記載の使用。
  6. 前記治療は、被験者における脂肪細胞分化を増大することを含む、請求項１または２に記載の使用。
  7. 前記修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０連結ヌクレオシドからなる、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
  8. 前記修飾オリゴヌクレオチドは、７〜１２連結ヌクレオシドからなる、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
  9. 前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列は、
    （ｉ）前記ｍｉＲ−１０３の核酸塩基配列と少なくとも９５％または１００％相補的である、および／または、
    （ｉｉ）前記ｍｉＲ−１０７の核酸塩基配列と少なくとも９５％または１００％相補的である、
    請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
  10. 前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾糖を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
  11. 前記修飾糖は、それぞれ、２’−Ｏ−メトキシエチル糖、２’−フルオロ糖、２’−Ｏ−メチル糖および二環式糖部分から独立して選択される請求項１０記載の使用。
  12. 前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
  13. 前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオシド間結合はそれぞれ、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項１２記載の使用。
  14. 前記修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１２または１３に記載の使用。
  15. 血糖値を低減するための治療、あるいは血糖値上昇の開始を防止または遅延するための治療を必要とする被験者の同定方法であって、
    前記被験者から得られる試料中のマイクロＲＮＡの量を対照試料中のマイクロＲＮＡの量と比較すること（この場合、前記マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１０３またはｍｉＲ−１０７であり、そして前記被験者から得られる試料中のより多い量のマイクロＲＮＡは、前記被験者がｍｉＲＮＡ−１０３／１０７と相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物による治療を必要とする、ということを示す）
    を包含する方法。
  16. 前記修飾オリゴヌクレオチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１連結ヌクレオシドからなる、請求項７に記載の使用。
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