JP2018518169A - 非アルコール性脂肪肝疾患バイオマーカー - Google Patents
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Abstract
対象の非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)状態を特徴付けするための方法、組成物、キット、および系が提供される。一部の実施形態において、方法、組成物、キット、および系は、表1〜4、10〜14、および28〜29の少なくとも1つに列記される示差的に発現されるmiRNAから選択される少なくとも1つのmiRNAを含む。一部の実施形態において、方法、組成物、キット、および系は、対象の非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)状態を特徴付けするため、対象における肝線維症の出現を特徴付けするため、および/または対象における肝細胞バルーニングの出現を特徴付けするためのものである。【選択図】なし
Description
本出願は、ASCIIフォーマットで電子形式にて提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ASCII複写物は2016年6月2日に作成され、1007_002_PCT_SL.txtと命名され、34,463バイトのサイズである。
非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)は、アルコールにより引き起こされない肝細胞中の余分な脂肪の蓄積である。肝臓がいくらかの脂肪を含有することは正常である。しかしながら、肝臓重量の5%〜10%パーセント超が脂肪である場合、脂肪肝(脂肪変性)と呼ばれる。多くの人々は、肝臓中の脂肪の蓄積を有し、ほとんどの人々については、そのことは症状をもたらさない。NAFLDは、過体重もしくは肥満であり、または糖尿病、高コレステロールもしくは高トリグリセリドを有する人々において発症する傾向がある。NAFLDの最も重度の形態は、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)である。NASHは、肝硬変をもたらし得る肝臓の瘢痕化(線維症)を引き起こす。NASHは、長期の大量飲酒により引き起こされる肝疾患の種類と同様である。しかしNASHは、アルコールを乱用しない人々において生じる。どのNAFLD患者がNASHを発症するかを予測することは困難であり、NASHを有する人々は、自分がそれを有することを知らないことが多い。
肝生検は、NASH診断のための代表的な判断基準である。線維症、小葉炎症、脂肪変性および肝細胞バルーニングの存在は、組織病理学的データから使用される重要な基準である。非侵襲性NASH試験は利用可能でない。現在、肝細胞バルーニングおよび脂肪変性の検出は、生検試料からの組織病理学検査によってのみ達成される。これらのおよび他の理由のため、NAFLD疾患状態、例として、NASH、線維症、肝細胞バルーニングの診断および予後予測のための新たな方法、系、キット、および他のツールが必要とされている。本発明のある実施形態は、これらのおよび他の必要性を満たす。
本発明者らは、対象の非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)状態に応じて対象の血清中でmiRNAが示差的に発現されるという驚くべき発見をなした。これらのおよび他の観察により、部分的に、本発明者らが対象のNAFLD状態の特徴付けのための方法、組成物、キット、および系、ならびに本明細書に開示の他の発明を本明細書で提供することが可能となった。
一部の実施形態において、対象の非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)状態を特徴付けする方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、表1〜4、10〜14、および28〜29の少なくとも1つに列記される示差的に発現されるmiRNAから選択されるN個のマイクロRNA(miRNA)を有するバイオマーカーパネルを形成することと、対象からの試料中のパネル中のN個のmiRNAのそれぞれのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、Nは、1〜20、1〜5、6〜10、11〜15、または15〜20である。
一部の実施形態において、対象におけるNAFLD状態を特徴付けするさらなる方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表1〜4、10〜14、および28〜29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個または少なくとも15個のmiRNAのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、対象におけるNAFLDの存在および/またはより進行したNAFLD状態の存在を示す。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出し、対象を、NAFLDおよび/またはより進行したNAFLD状態を有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも1つのNAFLD療法を対象に施与することをさらに含む。
一部の実施形態において、対象のNAFLD状態を特徴付けする方法は、対象の非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)状態を特徴付けすることを含む。方法の一部の実施形態において、表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを、対象からの試料中で検出する。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、対象におけるNASHの存在および/またはより進行したステージのNASHの存在を示す。一部の実施形態において、NASHは、ステージ1、ステージ2、ステージ3またはステージ4のNASHである。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出し、対象を、NASHおよび/またはより進行したステージのNASHを有すると診断する。一部の実施形態において、対象を、ステージ1、ステージ2、ステージ3またはステージ4のNASHを有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも1つのNASH療法を対象に施与することをさらに含む。
一部の実施形態において、対象のNAFLD状態を特徴付けする方法は、対象における肝線維症の出現を特徴付けすることを含む。方法の一部の実施形態において、表10〜14の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを、対象からの試料中で検出する。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、対象における肝線維症の存在および/またはより進行した肝線維症の存在を示す。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出し、対象を、肝線維症および/またはより進行した肝線維症を有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも1つの肝線維症療法を対象に施与することをさらに含む。
一部の実施形態において、対象のNAFLD状態を特徴付けする方法は、対象における肝細胞バルーニングの出現を特徴付けすることを含む。方法の一部の実施形態において、表28および29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルの検出を、対象からの試料中で検出する。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、対象における肝細胞バルーニングの存在および/またはより進行した肝細胞バルーニングの存在を示す。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出し、対象を、肝細胞バルーニングおよび/またはより進行した肝細胞バルーニングを有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも1つの肝細胞バルーニング療法を対象に施与することをさらに含む。
一部の実施形態において、対象がNASHを有するか否かを判定する方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、NASHを有することが疑われている対象からの試料を提供することと、表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるN個のmiRNAを有するバイオマーカーパネルを形成することと、対象からの試料中のパネル中のN個のmiRNAのそれぞれのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、Nは、1〜20、1〜5、6〜10、11〜15、または15〜20である。一部の実施形態において、方法は、NASHが疑われている対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含み、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、対象がNASHを有することを示す。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表5に列記されるペア1〜10から選択される少なくとも1つのmiRNAのペアのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、試料は、軽度、中程度、または重度のNAFLDと診断された対象からのものである。一部の実施形態において、対象は、これまでNASHと診断されていない。一部の実施形態において、NASHは、ステージ1、2、3、または4のNASHである。一部の実施形態において、対象は、これまでNAFLDと診断されていない。一部の実施形態において、対象は、NASHの少なくとも1つの臨床的症状を呈している。一部の実施形態において、方法は、NASHが疑われている対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含み、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出し、対象を、NASHを有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも1つのNASH療法を対象に施与することをさらに含む。
一部の実施形態において、対象におけるNASH療法をモニタリングする方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、NASHのための治療を受けている対象からの試料を提供することと、表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるN個のmiRNAを有するバイオマーカーパネルを形成することと、対象からの試料中のパネル中のN個のmiRNAのそれぞれのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、Nは、1〜20、1〜5、6〜10、11〜15、または15〜20である。一部の実施形態において、方法は、NASHのための治療を受けている対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含み、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、NASHの重症度が増加していることを示し;それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルの不存在は、NASHの重症度が増加していないことを示す。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表5に列記されるペア1〜10から選択される少なくとも1つのmiRNAのペアのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、NASHは、ステージ1、2、3、または4のNASHである。
一部の実施形態において、NAFLDを有する対象がNASHを発症するリスクを特徴付けする方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、NAFLDを有する対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含み、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、対象がNASHを発症するリスクの増加を示し、および/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルの不存在は、対象がNASHを発症するリスクの減少を示す。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表5に列記されるペア1〜10から選択される少なくとも1つのmiRNAのペアのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、試料は、軽度、中程度、または重度のNAFLDと診断された対象からのものである。
一部の実施形態において、対象が肝線維症を有するか否かを判定する方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、肝線維症が疑われている対象からの試料を提供することと、表10〜14の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるN個のmiRNAを有するバイオマーカーパネルを形成することと、対象からの試料中のパネル中のN個のmiRNAのそれぞれのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、Nは、1〜20、1〜5、6〜10、11〜15、または15〜20である。一部の実施形態において、方法は、対象が肝線維症を有する否かを判定することを含み、肝線維症を有することが疑われている対象からの試料を提供することと、表10〜14の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含み、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、肝線維症の存在を示す。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出し、対象を、肝線維症を有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも1つの肝線維症療法を対象に施与することをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、表15〜17の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、少なくとも1つのmiRNAは、miR−224である。一部の実施形態において、方法は、表18に列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、方法は、miR−224および/またはmiR−191のレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、肝線維症は、ステージ1、2、3、または4の肝線維症である。一部の実施形態において、試料は、軽度、中程度、または重度のNAFLDと診断された対象からのものである。一部の実施形態において、試料は、NASHと診断された対象からのものである。一部の実施形態において、NASHは、ステージ1、2、3、または4のNASHである。
一部の実施形態において、対象が肝細胞バルーニングを有するか否かを判定する方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、肝細胞バルーニングを有すると疑われている対象からの試料を提供することと、表28および29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるN個のmiRNAを有するバイオマーカーパネルを形成することと、対象からの試料中のパネル中のN個のmiRNAのそれぞれのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、Nは、1〜20、1〜5、6〜10、11〜15、または15〜20である。一部の実施形態において、方法は、対象が肝細胞バルーニングを有するか否かを判定することを含み、肝細胞バルーニングを有すると疑われている対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表28および29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含み、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、肝細胞バルーニングの存在を示す。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出し、対象を、肝細胞バルーニングを有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも1つの肝細胞バルーニング療法を対象に施与することをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表30に列記されるペアから選択される少なくとも1つのmiRNAのペアのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表35に列記されるペアから選択される少なくとも1つのmiRNAのペアのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、試料は、軽度、中程度、または重度のNAFLDと診断された対象からのものである。一部の実施形態において、試料は、NASHと診断された対象からのものである。一部の実施形態において、NASHは、ステージ1、2、3、4のNASHである。
本開示の方法の一部の実施形態において、方法は、PCRを含むプロセスにより検出することを含む。一部の実施形態において、検出は、定量的RT−PCRを含む。
本開示の方法の一部の実施形態において、試料は体液である。一部の実施形態において、試料は、血液、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択される。一部の実施形態において、試料は血清である。
本開示の方法の一部の実施形態において、方法は、医療保険料または生命保険料を決定する目的のために対象のNAFLDまたはNASH状態を特徴付けすることを含む。一部の実施形態において、方法は、対象についての医療保険料または生命保険料を決定することをさらに含む。
一部の実施形態において、組成物が提供される。一部の実施形態において、組成物は、対象からの試料のRNAまたは対象からの試料のRNAから逆転写されたcDNAと、表1〜4、10〜14、および28〜29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのポリヌクレオチドのセットと、を含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表10〜14の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表28および29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものである。一部の実施形態において、組成物中のそれぞれのポリヌクレオチドは、独立して、8〜100、8〜75、8〜50、8〜40、8〜30、12〜100、12〜75、12〜50、12〜40、または12〜30ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、試料は体液である。一部の実施形態において、試料は、血液、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択される。一部の実施形態において、試料は血清である。
一部の実施形態において、キットが提供される。一部の実施形態において、キットは、表1〜4、10〜14、および28〜29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのポリヌクレオチドのセットを含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表10〜14の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表28および29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものである。一部の実施形態において、キット中のそれぞれのポリヌクレオチドは、独立して、8〜100、8〜75、8〜50、8〜40、8〜30、12〜100、12〜75、12〜50、12〜40、または12〜30ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、マルチプレックスアッセイにおける使用のために包装されている。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、非マルチプレックスアッセイにおける使用のための包装である。
一部の実施形態において、系が提供される。一部の実施形態において、系は、表1〜4、10〜14、および28〜29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのポリヌクレオチドのセットと、対象からの試料のRNAまたは対象からの試料のRNAから逆転写されたcDNAと、を含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表10〜14の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表28および29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものである。一部の実施形態において、系中のそれぞれのポリヌクレオチドは、独立して、8〜100、8〜75、8〜50、8〜40、8〜30、12〜100、12〜75、12〜50、12〜40、または12〜30ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、試料は体液である。一部の実施形態において、試料は、血液、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択される。一部の実施形態において、試料は血清である。一部の実施形態において、対象からの試料のRNAまたは対象からの試料のRNAから逆転写されたcDNAは容器中に存在し、ポリヌクレオチドのセットは容器とは別個に包装されている。
一部の実施形態において、miRNAの示差的発現を検出する方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表1〜4、10〜14、および28〜29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個または少なくとも15個のmiRNAのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出する。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出しない。一部の実施形態において、対象は、NAFLDを有すると疑われている。一部の実施形態において、対象は、NAFLDを発症するリスクがある。一部の実施形態において、対象は、NAFLDを有する。
一部の実施形態において、miRNAの示差的発現を検出する追加の方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出する。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出しない。一部の実施形態において、対象は、NASHを有すると疑われている。一部の実施形態において、対象は、NASHを発症するリスクがある。一部の実施形態において、対象は、NASHを有する。一部の実施形態において、NASHは、ステージ1、ステージ2、ステージ3またはステージ4のNASHである。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表5に列記されるペア1〜10から選択される少なくとも1つのmiRNAのペアのレベルを検出することを含む。
一部の実施形態において、miRNAの示差的発現を検出する追加の方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料を提供することと、表10〜14の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含み、それを対象からの試料中で検出する。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出する。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出しない。一部の実施形態において、対象は、肝線維症を有すると疑われている。一部の実施形態において、対象は、肝線維症を発症するリスクがある。一部の実施形態において、対象は、肝線維症を有する。一部の実施形態において、方法は、表15〜17の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、少なくとも1つのmiRNAは、miR−224である。一部の実施形態において、方法は、表18に列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、方法は、miR−224および/またはmiR−191のレベルを検出することを含む。
一部の実施形態において、miRNAの示差的発現を検出する追加の方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表28および29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出する。一部の実施形態において、それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルを検出しない。一部の実施形態において、対象は、肝細胞バルーニングを有すると疑われている。一部の実施形態において、対象は、肝細胞バルーニングを発症するリスクがある。一部の実施形態において、対象は、肝細胞バルーニングを有する。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表30に列記されるペアから選択される少なくとも1つのmiRNAのペアのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表35に列記されるペアから選択される少なくとも1つのmiRNAのペアのレベルを検出することを含む。
表
表1〜39を、本明細書の終わりにまとめて提示する。それらの表は、本出願の本文において言及され、本出願の一部を形成する。
表1〜39を、本明細書の終わりにまとめて提示する。それらの表は、本出願の本文において言及され、本出願の一部を形成する。
本発明をある代表的な実施形態とともに記載する一方、本発明は、特許請求の範囲により定義され、それらの実施形態には限定されないことが理解される。
当業者は、本明細書に記載のものと類似または同等の多くの方法および材料を本発明の実施において使用することができることを認識する。本発明は、文字のとおり記載される方法および材料に決して限定されるものではない。
特に定義のない限り、本明細書において使用される技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法、装置、および材料を本発明の実施において使用することができるが、ある方法、装置、および材料が本明細書に記載される。
本明細書に引用される全ての刊行物、公開特許文献、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、公開特許文献、または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別的に示される場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
添付の特許請求の範囲を含む本出願において使用される単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確にそうでないことを示さない限り複数形を含み「少なくとも1つ」および「1つ以上」と互換的に使用することができる。したがって、「miRNA」への言及は、miRNAの混合物などを含む。
本明細書において使用される用語「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(includes)」、「含む(including)」、「含有する(contains)」、「含有する(containing)」、およびそれらの任意の変形語は、非排他的包含を包含するものとし、その結果、要素または要素のリストを含み(compirses)、含み(includes)、または含有するプロセス、方法、プロダクトバイプロセス、または物質の組成物は、明示的に列記されていない他の要素を含み得る。
本出願は、対象がNAFLDを有するか否かを判定するためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、系、およびキットを含む。本出願はまた、対象がNASHを有するか否かを判定するためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、系およびキットを含む。一部の実施形態において、NAFLDを有する対象がNASHを有するか否かを判定するためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、系およびキットが提供される。本出願はまた、対象が肝線維症を有するか否かを判定するためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、系、およびキットを含む。本出願はまた、対象が肝細胞バルーニングを有するか否か判定するためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、系、およびキットを含む。
本明細書において使用される「非アルコール性脂肪肝疾患」または「NAFLD」は、過剰のアルコール使用の不存在下で炎症および線維症を有し、または有さない、脂肪が肝臓中で堆積している病態(肝脂肪変性)を指す。
本明細書において使用される「非アルコール性脂肪性肝炎」または「NASH」は、肝臓中に炎症および/または線維症が存在するNAFLDを指す。NASHは4つのステージに分類することができる。NASHのステージを判定する例示的な方法は、例えば、Kleiner et al,2005,Hepatology,41(6):1313−1321、およびBrunt et al,2007,Modern Pathol,20:S40−S48に記載されている。
本明細書において使用される「肝線維症」は、肝臓中での過剰の繊維状結合組織の形成を指す。
本明細書において使用される「肝細胞バルーニング」は、肝細胞死のプロセスを指す。
「マイクロRNA」は、18〜25核酸塩基長の内因性非コードRNAを意味し、これは、酵素DicerによるプレマイクロRNAの開裂産物である。成熟マイクロRNAの例は、miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)として公知のマイクロRNAデータベースに見出される。ある実施形態において、マイクロRNAは「マイクロRNA」または「miRNA」または「miR」と省略される。いくつかの例示的なmiRNAが、それらの一般名およびそれらの核酸塩基配列により識別されて本明細書に提供される。
「プレマイクロRNA」または「プレmiRNA」または「プレmiR」は、ヘアピン構造を有する非コードRNAを意味し、これは、Droshaとして公知の二本鎖RNA特異的リボヌクレアーゼによるプリmiRの開裂産物である。
「ステム−ループ配列」は、ヘアピン構造を有し、成熟マイクロRNA配列を含有するRNAを意味する。プレマイクロRNA配列およびステム−ループ配列は、重複し得る。ステム−ループ配列の例は、miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)として公知のマイクロRNAデータベースに見出される。
「プリマイクロRNA」または「プリmiRNA」または「プリmiR」は、二本鎖RNA特異的リボヌクレアーゼDroshaの基質であるヘアピン構造を有する非コードRNAを意味する。
「マイクロRNA前駆体」は、ゲノムDNAに由来し、1つ以上のマイクロRNA配列を含む非コード構造化RNAを含む転写物を意味する。例えば、ある実施形態において、マイクロRNA前駆体はプレマイクロRNAである。ある実施形態において、マイクロRNA前駆体はプリマイクロRNAである。
本開示の方法の一部は、試料中の少なくとも1つのmiRNAのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、試料は体液である。一部の実施形態において、体液は、血液、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択される。一部の実施形態において、試料は血清である。試料中のレベルの検出は、対象から得られた未処理試料中のレベルを直接検出する方法およびさらには試料の処理後にレベルを検出する方法も包含する。一部の実施形態において、未処理試料は、他の成分に対して試料中の核酸を濃縮することおよび/または他の成分に対して試料中の小分子RNAを濃縮することを含むプロセスにより処理する。
実施形態において、試料中のmiRNAのレベルの検出は、試料中のmiRNA分子の直接検出を含む方法によるものであり得る。実施形態において、試料中のmiRNAのレベルの検出は、miRNA分子の一部もしくは全部を逆転写させ、次いでcDNA分子を検出すること、ならびに/または元のmiRNA配列に対応する部分およびcDNAに対応する部分を含む分子を検出することを含む方法によるものであり得る。
当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して少なくとも1つのmiRNAのレベルを検出することができる。このようなアッセイの1つのクラスは、固体担体上で固定化された1つ以上のアプタマーを含むマイクロアレイの使用を含む。アプタマーは、高度に特異的に、かつ極めて高い親和性で標的分子にそれぞれ結合し得る。例えば、米国特許第5,475,096号明細書、表題「Nucleic Acid Ligands」参照;例えば、米国特許第6,242,246号明細書、米国特許第6,458,543号明細書、および米国特許第6,503,715号明細書、それらのそれぞれの表題「Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip」も参照。マイクロアレイを試料と接触させると、アプタマーが試料中に存在するそれらのそれぞれの標的分子に結合し、それにより試料中のmiRNAに対応するmiRNAレベルの測定が可能となる。
本明細書において使用される「アプタマー」は、標的分子、例えば、miRNAまたはmiRNAによりコードされるcDNAに対して特異的な結合親和性を有する核酸を指す。親和性の相互作用は程度の問題であることが認識されており;しかしながら、この文脈において、アプタマーの標的に対する「特異的な結合親和性」は、アプタマーが、その標的に、一般に試験試料中の他の成分に結合する場合よりもかなり高い程度の親和性で結合することを意味する。「アプタマー」は、特定のヌクレオチド配列を有する1つのタイプまたは種の核酸分子のコピーのセットである。アプタマーは、任意の好適な数のヌクレオチドを含み得、任意数の化学修飾ヌクレオチドが含まれていてもよい。「アプタマー」は、2つ以上のこのような分子のセットを指す。異なるアプタマーは、同一または異なる数のヌクレオチドを有し得る。アプタマーは、DNAもしくはRNAもしくは化学修飾核酸であり得、一本鎖、二本鎖であり得、または二本鎖領域を含有し得、より高次の構造を含み得る。以下にさらに記載されるとおり、アプタマーは、タグを含み得る。アプタマーがタグを含む場合、必ずしもアプタマーのコピー全てが同一のタグを有する必要はない。さらに、異なるアプタマーそれぞれがタグを含む場合、これらの異なるアプタマーは、同一のタグまたは異なるタグのどちらでも有し得る。
本明細書において使用される用語「示差的に調節される」miRNAは、目的の疾患も病態も有さない対象からの試料中で生じるmiRNAの対照レベルと比較して、目的の疾患または病態を有する対象からの同様の試料中の存在量が増加または減少するmiRNAである。目的の疾患も病態も有さない対象は、いかなる関連疾患も病態も有さない対象(例えば、正常な対照対象)であり得、または対象は、異なる関連疾患または病態を有し得る(例えば、NAFLDを有するが、NASHを有さない対象)。
本明細書において使用される「示差的に増加する」miRNAは、目的の疾患も病態も有さない対象からの対照試料中で生じるmiRNAのレベルと比較して、目的の疾患または病態を有する対象からの試料中の存在量が増加するmiRNAである。
本明細書において使用される「示差的に減少する」miRNAは、目的の疾患も病態も有さない対象からの対照試料中で生じるmiRNAのレベルと比較して、目的の疾患または病態を有する対象からの試料中の存在量が減少するmiRNAである。
本明細書において使用されるmiRNAの「対照レベル」は、参照集団からの同様の試料中に存在するレベルである。miRNAの「対照レベル」は、本方法を実施するごとに測定する必要がなく、特定の試料中のレベルが正常レベルよりも高いか低いかを判定するために参照または閾値として使用されるレベルを事前に測定することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法における対照レベルは、NAFLDを有さない1つ以上の対象において観察されたレベルである。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法における対照レベルは、NAFLDを有するが、NASHを有さない1つ以上の対象において観察されたレベルである。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法における対照レベルは、複数の正常対象、またはNAFLDを有するがNASHを有さない対象において観察された、場合により統計的変動で上下する平均または平均レベルである。
本明細書において使用される「個体」および「対象」は、試験対象または患者を指すために互換的に使用される。種々の実施形態において、個体は哺乳動物である。哺乳動物個体は、ヒトでも非ヒトでもよい。種々の実施形態において、個体はヒトである。健常または正常個体は、慣用の診断法により目的の疾患も病態も(例えば、NASH)検出可能でない個体である。
「診断する」、「診断すること」、「診断」、およびそれらの変形語は、個体の健康状態または病態を、その個体に関する1つ以上の徴候、症状、データまたは他の情報に基づき検出、決定、または認識することを指す。個体の健康状態は、健康/正常と診断され得(すなわち、疾患も病態も不存在であるという診断)、または疾病/異常と診断され得る(すなわち、疾患もしくは病態の特徴の存在という診断、または疾患もしくは病態の特徴の評価)。用語「診断する」、「診断すること」、「診断」などは、特定の疾患または病態に関して、疾患の初期の検出;疾患の特徴付けもしくは分類;疾患の進行、寛解もしくは再発の検出;および/または個体に治療もしくは治療法を施与した後の疾患応答の検出を包含する。NAFLDの診断は、NAFLDを有する個体と、それを有さない個体とを区別することを含む。NASHの診断は、NASHを有する個体と、NAFLDを有するがNASHを有さない個体と、肝疾患を有さない個体とを区別することを含む。肝線維症の診断は、肝線維症を有する個体と、NAFLDを有するが、肝線維症を有さない個体とを区別することを含む。肝細胞バルーニングの診断は、肝細胞バルーニングを有する個体と、NAFLDを有するが肝細胞バルーニングを有さない個体とを区別することを含む。
「予後予測する」、「予後予測すること」、「予後予測」、およびそれらの変形語は、疾患または病態を有する個体における疾患または病態の将来的な経過の予測(例えば、疾患進行を予測すること)、および疾患も病態も有さない個体がその疾患または病態を発症するか否かの予測を指す。このような用語は、個体に治療または治療法を施与した後の疾患応答を評価することも包含する。
「特徴付けする」、「特徴付けすること」、「特徴付け」、およびそれらの変形語は、「診断する」および「予後予測する」の両方を包含し、さらに疾患を有さない個体における疾患または病態の将来的な経過に関する決定または予測、ならびに見かけ上、疾患が治癒した個体において疾患または状態が再発する見込みに関する決定または予測も包含する。用語「特徴付けする」は、治療法に対する個体の応答を評価すること、例えば個体が、治療剤に良好に応答する可能性が高いのか、治療剤に応答する可能性が低いのか(または例えば毒作用もしくは他の不所望な副作用を受けるのか)を予測すること、個体に投与するための治療剤を選択すること、または個体に施与された治療法に対する個体の応答をモニタリングもしくは決定することなども包含する。したがって、NAFLDを「特徴付けすること」は、例えば、以下の何れかを含み得る:個体におけるNAFLDの将来的な経過を予後予測すること;NAFLDがNASHに進行するか否かを予測すること;特定のステージのNASHが、より上のステージのNASHに進行するか否かを予測すること;NAFLDを有する個体が肝線維症を発症するか否かを予測すること;特定の状態の肝線維症が、次の状態の肝線維症に進行するか否かを予測すること;NAFLDを有する個体が肝細胞バルーニングを発症するか否かを予測することなど。
本明細書において使用されるmiRNAレベルに関して「検出すること」または「測定すること」は、miRNAレベルに対応するシグナルを観察および記録するために使用される機器ならびに、そのシグナルを生成するために要求される材料の両方の使用を含む。種々の実施形態において、レベルは、任意の好適な方法、例として、蛍光、化学発光、表面プラズモン共鳴、表面弾性波、質量分析、赤外分光分析、ラマン分光法、原子間力顕微鏡、走査トンネル顕微鏡、電気化学的な検出方法、核磁気共鳴、量子ドットなどを使用して検出される。
本明細書において使用される「NAFLDを有する対象」は、NAFLDと診断された対象を指す。一部の実施形態において、NAFLDは、定型的な健康診断、メタボリックシンドロームおよび肥満のモニタリング、または薬物(例えば、コレステロール降下剤またはステロイド)の効果の考えられる副作用についてのモニタリングの間に疑われる。一部の例において、肝酵素、例えば、ASTおよびALTが高い。一部の実施形態において、対象は、腹部または胸部イメージング、肝超音波、または磁気共鳴イメージング後に診断される。一部の実施形態において、他の病態、過剰アルコール消費、C型肝炎、およびウィルソン病は、NAFLD診断前に無視される。一部の実施形態において、対象は、肝生検後に診断されている。
本明細書において使用される「NASHを有する対象」は、NASHと診断された対象を指す。一部の実施形態において、NASHは、一般に、NAFLDについて上記した方法により診断される。一部の実施形態において、進行線維症は、NAFLDを有する患者において、例えば、Gambino R,et.al.Annals of Medicine 2011;43(8):617−49に従って診断される。
本明細書において使用される「NAFLDを発症するリスクがある対象」は、1つ以上のNAFLD共存症、例えば、肥満、腹部肥満、メタボリックシンドローム、心血管疾患、および糖尿病を有する対象を指す。
本明細書において使用される「NASHを発症するリスクがある対象」は、1つ以上のNAFLD共存症、例えば、肥満、腹部肥満、メタボリックシンドローム、心血管疾患、および糖尿病を有し続ける、脂肪変性を有する対象を指す。
一部の実施形態において、パネル中のmiRNAの数およびアイデンティティは、miRNAバイオマーカー値の特定の組合せについての感度および特異度に基づき選択される。用語「感度」および「特異度」は、生物学的試料中で検出される1つ以上のmiRNAレベルに基づき個体を、疾患を有する、または疾患を有さないと正確に分類する能力に関して本明細書において使用される。一部の実施形態において、用語「感度」および「特異度」は、生物学的試料中で検出される1つ以上のmiRNAレベルに基づき個体を、疾患もしくは病態を有する、または有さないと正確に分類する能力に関して本明細書において使用することができる。このような実施形態において、「感度」は、疾患または病態を有する個体を正確に分類することに関するmiRNAの性能を示す。「特異度」は、疾患も病態も有さない個体を正確に分類することに関するmiRNAの性能を示す。例えば、対照試料(例えば、健常個体またはNASHを有さないことが既知の対象からの試料)および試験試料(例えば、NASHを有する個体からの試料)のセットを試験するために使用されるmiRNAのパネルについての85%の特異度および90%の感度は、対照試料の85%がパネルにより対照試料として正確に分類され、試験試料の90%がパネルにより試験試料として正確に分類されたことを示す。
本明細書に記載のmiRNAの任意の組合せは、好適なキット、例えば、本明細書に開示の方法の実施において使用されるキットを使用して検出することができる。さらに、任意のキットは、本明細書に記載の1つ以上の検出可能な標識、例えば、蛍光部分などを含有し得る。一部の実施形態において、キットは、(a)生物学的試料中の1つ以上のmiRNAを検出するための1つ以上の試薬、および場合により、(b)生物学的試料を得た個体が、NAFLD、NASH(例えば、ステージ1、2、3、もしくは4のNASH、またはステージ2、3、もしくは4のNASH、またはステージ3もしくは4のNASH)、肝線維症(例えば、ステージ1、2、3、もしくは4の線維症、またはステージ3もしくは4の線維症)を有するか否かを予測するための1つ以上のソフトウェアまたはコンピュータプログラムプロダクトを含む。あるいは、1つ以上のコンピュータプログラムプロダクトではなく、上記ステップを人力により手作業で実施するための1つ以上の説明書を提供することができる。
一部の実施形態において、キットは、本明細書に開示の少なくとも1つのmiRNA配列に特異的に結合する少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、キットは、シグナル生成材料をさらに含む。キットは、装置および試薬を使用するため、試料を取り扱うため、ならびにデータを分析するための説明書も含み得る。さらに、キットは、コンピュータシステムまたはソフトウェアにより使用して生物学的試料を分析し、その分析の結果を報告することができる。
キットは、生物学的試料を処理するための1つ以上の試薬(例えば、可溶化緩衝液、界面活性剤、洗浄液、または緩衝液)も含有し得る。本明細書に記載のキットの何れも、例えば、緩衝液、陽性対照試料、陰性対照試料、ソフトウェアおよび情報、例えば、プロトコル、指針および参照データも含み得る。
一部の実施形態において、NAFLDおよび/またはNASHおよび/または肝線維症および/または肝細胞バルーニングの分析のためのキットが提供され、キットは、本明細書に記載の1つ以上のmiRNAの増幅のためのPCRプライマーを含む。一部の実施形態において、キットは、miRNAの使用、およびmiRNAと、NAFLDおよび/またはNASHおよび/または肝線維症および/または肝細胞バルーニング診断および/または予後予測との相関についての説明書をさらに含み得る。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載のmiRNAの1つ以上の相補鎖、試料DNAを増幅もしくは単離するための試薬、および/または酵素を含有するDNAアレイを含み得る。キットは、リアルタイムPCR、例えば、定量的リアルタイムPCTのための試薬を含み得る。
以下の実施例は、説明目的のためにのみ提供され、添付の特許請求の範囲により定義され、または他の点で本明細書に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
miRNeasy 96 Kit(Qiagen、カタログ番号217061)を使用して、製造業者の説明書に従って140uLの血清を抽出した。
以下の手順を使用した:
逆転写(RT):
Megaplex(商標)Primer Pools,Human Pool A v2.1(439996)を使用して実施例1からの4uLのRNAを逆転写に供し、Megaplex(商標)Primer Pools,Human Pool B v3.0(Life Tech 4444281)を使用して第2の4uLのRNAを逆転写に供した。製造業者の説明書は、10uLの総反応容量について従った。熱サイクリングパラメータは以下のとおりであった。
逆転写(RT):
Megaplex(商標)Primer Pools,Human Pool A v2.1(439996)を使用して実施例1からの4uLのRNAを逆転写に供し、Megaplex(商標)Primer Pools,Human Pool B v3.0(Life Tech 4444281)を使用して第2の4uLのRNAを逆転写に供した。製造業者の説明書は、10uLの総反応容量について従った。熱サイクリングパラメータは以下のとおりであった。
RT試料の前増幅:
逆転写産物の前増幅は、パネルAおよびパネルBについてそれらのそれぞれの前増幅試薬を使用して製造業者の説明書に従って達成して40uLの反応を達成した。以下の熱サイクリングパラメータを使用した。
逆転写産物の前増幅は、パネルAおよびパネルBについてそれらのそれぞれの前増幅試薬を使用して製造業者の説明書に従って達成して40uLの反応を達成した。以下の熱サイクリングパラメータを使用した。
リアルタイムPCR分析。3ulの前増幅cDNA(上記のRT反応産物)を、117ulのRNアーゼ、DNアーゼフリーH2O中に希釈した。30uLの希釈cDNAを、製造業者の説明書(Life Technologies)に従って調製された30uLのOpen Array Master Mixを含有する96ウェルプレート中に移した。QuantStudio(商標)12K Flex Accufill System(4471021,Life Tech)を使用して、混合物をTaqMan(登録商標)OpenArray(登録商標)Human MicroRNA Panel(4470187,Life Tech)上にロードした。プレートをApplied Biosystems QuantStudio(商標)12K Flex Real−Time PCR System(4471090,Life Tech)中にロードし、以下の熱サイクリングパラメータを使用してリアルタイム増幅を開始した。
実施例3:NAFLD患者からの血清試料
156人のNAFLD患者からの凍結血清試料を入手し、最初に実施例1および2に記載の手順を使用してOpenArray(登録商標)Real−Time PCR System(ThermoFisher)を使用してプロファイリングした。未処理PCRデータをフィルタリングし、10未満のCt値は無視し、28を超えるCt値は無視し、または28に設定した。後続の分析に、両方の値のセットを適用した。フィルタリングデータを、検出されたmiRNAの幾何平均により正規化した。
156人のNAFLD患者からの凍結血清試料を入手し、最初に実施例1および2に記載の手順を使用してOpenArray(登録商標)Real−Time PCR System(ThermoFisher)を使用してプロファイリングした。未処理PCRデータをフィルタリングし、10未満のCt値は無視し、28を超えるCt値は無視し、または28に設定した。後続の分析に、両方の値のセットを適用した。フィルタリングデータを、検出されたmiRNAの幾何平均により正規化した。
これらのフィルタリング正規化値を、探索分析において使用した。主成分分析(PCA)を適用してmiRNA発現データにおける技術的および生物学的バイアスを発見した。PCA異常値、例えば、潜在的に分解されるRNAを有する試料は排除した。合計153個のNAFLD試料をこれらの手順に付し;これらを、NAFL血清試料とNASH血清試料とを分ける多重miRNA分類因子の発見において使用した。さらに、線維症グレード、脂肪変性および肝細胞バルーニングを使用してそれぞれのグレードを分ける分類因子を発見した。
PCA分析により、プロファイルと分類臨床パラメータ、例えば、性別、種別、民族性、喫煙、糖尿病(DM)、脂肪変性、線維症、小葉内炎症、門脈炎症、肝細胞バルーニング、NAFLD活動性スコア(NAS)、門脈三管および臨床NAFL分類との間に強い相関が存在しないことが明らかになった(目下、データを示す)。データ中の分散の<10%を占める3つ目の主成分のみが、分類可変要素、例えば、肝細胞バルーニング、NAFL分類、NAS、脂肪変性および線維症と統計的に有意に関連した(データ示さず)。
実施例4:NASHにおいて示差的に発現されるマイクロRNAの同定。
Kleiner et al,2005,Hepatology,41(6):1313−1321に記載の分類基準および手順を使用して153個の試料を以下のカテゴリーのそれぞれに分類した:NASH3(114)、ボーダーライン/疑い2(17)、NAFLD1(18)、および非NAFLD0(2)。2つの試料は、利用可能なNAFL/NASH分類を有さなかった。
Kleiner et al,2005,Hepatology,41(6):1313−1321に記載の分類基準および手順を使用して153個の試料を以下のカテゴリーのそれぞれに分類した:NASH3(114)、ボーダーライン/疑い2(17)、NAFLD1(18)、および非NAFLD0(2)。2つの試料は、利用可能なNAFL/NASH分類を有さなかった。
表1は、NASH患者の患者から得られた血清試料およびNASHを有さないNAFLD患者から得られた血清試料中で示差的に発現される、33個のmiRNAについての平均NASH対NAFLDの示差的発現データを提示する。これらのmiRNAの23個は、NASHを有さないと診断されたNAFLD患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対してNASH診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのmiRNAの10個は、NASHを有さないと診断されたNAFLD患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対してNASH診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
表2は、NAFLD1と診断された患者から得られた血清試料と比較して、NASH3と診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される24個のmiRNAについての平均NASH3対NAFLD1の示差的発現データを提示する。これらのmiRNAの17個は、NAFLD1の診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、NASH3を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのmiRNAの7つは、NAFLD1の診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、NASH3の診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
表3は、ボーダーライン2と診断された患者から得られた血清試料と比較して、NASH3と診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される17個のmiRNAについての平均NASH3対ボーダーライン2の示差的発現データを提示する。これらのmiRNAの9つは、ボーダーライン2の診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、NASH3の診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのmiRNAの8つは、ボーダーライン2の診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、NASH3の診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
表4は、NAFLD1と診断された患者から得られた血清試料と比較して、ボーダーライン2と診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される10個のmiRNAについての平均ボーダーライン2対NAFLD1の示差的発現データを提示する。これらのmiRNAの5つは、NAFLD1の診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ボーダーライン2の診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのmiRNAの5つは、NAFLD1の診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ボーダーライン2の診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
表1〜4に提示されるデータは、異なるNAFLDおよびNASH疾患状態を有する患者から得られた血清試料中で示差的に発現されるmiRNAのセットを同定する。同定されたmiRNAを、個々に、または組合せとしてバイオマーカーとして使用して患者の血清試料中の選択miRNAのmiRNA発現プロファイルの決定に基づき患者の疾患状態を同定することができる。
実施例5:NASH対NAFLDについてのマイクロRNA発現分類因子
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロRNAプロファイルをNASHまたはNAFLに分類した:複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および/またはサポートベクターマシン。マイクロRNAの数は20(10個のペア)に設定した。グリーディペアアプローチ(Bo et al.2002)を使用してマイクロRNAのこれらの10個のペアを同定した。グリーディペア法は、個々のt−スコアに基づき全てのマイクロRNAをランク付けすることにより開始する。最高ランクのマイクロRNAを選択し、次いで手順は、その最高ランクのマイクロRNAと一緒に最良の区別を提供し、ペアt−スコアを最大化するマイクロRNAを検索する。次いで、このペアをマイクロRNAのセットから除去し、所望のマイクロRNAのペア数に到達するまで、マイクロRNAの残りのセットに対してこのプロセスを繰り返す。所望のペア数を先験的に規定する。種々のペア数を規定し、最良のAUCを有するものをピックした。グリーディペア法の背景の概念は、それぞれのマイクロRNAを別個に考慮する方法が、一緒には十分にクラスを分けるが、個々にはそれほど十分に分けないマイクロRNAのセットを漏らし得ることである(Bo et al.2002)。この手順は、表5に同定される10ペア分類因子を同定した。二元分類因子のそれぞれについての20個のmiRNAについての遺伝子重量を表6に提供する。
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロRNAプロファイルをNASHまたはNAFLに分類した:複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および/またはサポートベクターマシン。マイクロRNAの数は20(10個のペア)に設定した。グリーディペアアプローチ(Bo et al.2002)を使用してマイクロRNAのこれらの10個のペアを同定した。グリーディペア法は、個々のt−スコアに基づき全てのマイクロRNAをランク付けすることにより開始する。最高ランクのマイクロRNAを選択し、次いで手順は、その最高ランクのマイクロRNAと一緒に最良の区別を提供し、ペアt−スコアを最大化するマイクロRNAを検索する。次いで、このペアをマイクロRNAのセットから除去し、所望のマイクロRNAのペア数に到達するまで、マイクロRNAの残りのセットに対してこのプロセスを繰り返す。所望のペア数を先験的に規定する。種々のペア数を規定し、最良のAUCを有するものをピックした。グリーディペア法の背景の概念は、それぞれのマイクロRNAを別個に考慮する方法が、一緒には十分にクラスを分けるが、個々にはそれほど十分に分けないマイクロRNAのセットを漏らし得ることである(Bo et al.2002)。この手順は、表5に同定される10ペア分類因子を同定した。二元分類因子のそれぞれについての20個のmiRNAについての遺伝子重量を表6に提供する。
3つの分類法からの予測規則:
予測規則は、有意な遺伝子の重量(wi)および発現(xi)の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。
予測規則は、有意な遺伝子の重量(wi)および発現(xi)の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。
試料は、合計が閾値よりも大きい場合、すなわち、
Σiwixi>閾値
の場合、NAFLのクラスに分類する。
Σiwixi>閾値
の場合、NAFLのクラスに分類する。
複合共変量予測因子についての閾値は、−237.511である。対角線形判別予測因子についての閾値は、−71.996である。サポートベクターマシン予測因子についての閾値は、26.091である。
交差検証を使用して分類因子の性能を以下のとおり検定した。
一部のクラスAについて、
n11=Aとして予測されるクラスA試料の数、
n12=非Aとして予測されるクラスA試料の数、
n21=Aとして予測される非A試料の数、
n22=非Aとして予測される非A試料の数
とする。
n11=Aとして予測されるクラスA試料の数、
n12=非Aとして予測されるクラスA試料の数、
n21=Aとして予測される非A試料の数、
n22=非Aとして予測される非A試料の数
とする。
次いで、以下のパラメータは、分類因子の性能を特徴付けし得る:
感度=n11/(n11+n12)、
特異度=n22/(n21+n22)、
陽性予測値(PPV)=n11/(n11+n21)、
陰性予測値(NPV)=n22/(n12+n22)。
感度=n11/(n11+n12)、
特異度=n22/(n21+n22)、
陽性予測値(PPV)=n11/(n11+n21)、
陰性予測値(NPV)=n22/(n12+n22)。
感度は、クラスA試料がクラスAとして正確に予測される確率である。特異度は、非クラスA試料が非Aとして正確に予測される確率である。PPVは、クラスAとして予測される試料が実際にクラスAに属する確率である。NPVは、非クラスAとして予測される試料が実際にクラスAに属さない確率である。
複合共変量予測因子の分類因子の性能を表7に提示する。対角線形判別分析の分類因子の性能を表8に提示する。サポートベクターマシンの分類因子の性能を表9に提示する。
分類因子の受信者動作特性(ROC)をグラフ表示した。得られた曲線下面積(AUC)は、3つの分類法を使用して平均0.68であった:複合共変量予測因子(CCP)により得られた0.676のAUC、対角線形判別予測因子(DLDP)により得られた0.708のAUCおよびベイズ複合共変量予測因子(BCCP)により得られた0.669のAUC。
実施例6:肝線維症において示差的に発現されるマイクロRNAの同定
実施例3に記載の153個のNAFLD試料を、以下のカテゴリーのそれぞれに分類した:62個(および2つの非NAFLD試料)は線維症を有さなかった(ステージ0)。不明のNAFLスコアを有する2つの試料も、線維症を有さなかった(ステージ0)。51個の試料は線維症ステージ1を有し、16個は線維症ステージ2を有し、12個は線維症ステージ3を有し、10個は線維症ステージ4を有した。
実施例3に記載の153個のNAFLD試料を、以下のカテゴリーのそれぞれに分類した:62個(および2つの非NAFLD試料)は線維症を有さなかった(ステージ0)。不明のNAFLスコアを有する2つの試料も、線維症を有さなかった(ステージ0)。51個の試料は線維症ステージ1を有し、16個は線維症ステージ2を有し、12個は線維症ステージ3を有し、10個は線維症ステージ4を有した。
表10は、ステージ3またはステージ4の線維症と診断された患者から得られた血清試料および線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される28個のmiRNAについての平均線維症ステージ3および4対線維症なしの示差的発現データを提示する。これらのmiRNAの15個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ3またはステージ4の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのmiRNAの13個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ3またはステージ4の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
表11は、ステージ2の線維症と診断された患者から得られた血清試料および線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される30個のmiRNAについての平均線維症ステージ2対線維症なしの示差的発現データを提示する。これらのmiRNAの15個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ2の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのmiRNAの15個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ2の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
表12は、ステージ1の線維症と診断された患者から得られた血清試料および線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される16個のmiRNAについての平均線維症ステージ1対線維症なしの示差的発現データを提示する。これらのmiRNAの10個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ1の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのmiRNAの6個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ1の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
表13は、ステージ1またはステージ2の線維症と診断された患者から得られた血清試料および線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される25個のmiRNAについての平均線維症ステージ1および2対線維症なしの示差的発現データを提示する。これらのmiRNAの14個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ1またはステージ2の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのmiRNAの11個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ1またはステージ2の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
表14は、ステージ1またはステージ2の線維症と診断された患者から得られた血清試料およびステージ3またはステージ4の線維症と診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される5個のmiRNAについての平均線維症ステージ1/2対平均線維症ステージ3/4の示差的発現データを提示する。これらのmiRNAの3個は、ステージ3またはステージ4の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ1またはステージ2の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのmiRNAの2個は、ステージ3またはステージ4の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ1またはステージ2の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
表10〜14に提示されるデータは、異なるステージの線維症を有する患者から得られた血清試料中で示差的に発現され、線維症疾患状態の存在と線維症疾患状態の不存在とを区別し、軽度(ステージ1/2)および重度(ステージ3/4)の疾患状態を区別するmiRNAのセットを同定する。同定されたmiRNAを個々に、または組合せとしてバイオマーカーとして使用して患者の血清試料中の選択miRNAのmiRNA発現プロファイルの決定に基づき患者の線維症疾患状態を同定することができる。
実施例7:肝線維症についてのマイクロRNA発現分類因子
miR−224は、実施例6に提示されるデータにおいて肝線維症との強い相関を示した。0より大きい線維症グレードを有するNAFL患者の血清中のmiR−224の有意なモジュレーションが同定された。R/Bioconductorパッケージlimma(マイクロアレイデータ用の線形モデル)を使用して示差的発現分析を行った。血清レベルは、ステージ1の肝線維症対線維症なし、ステージ2対線維症なし、ならびにステージ3および4対線維症なしの患者において1.88、3.01および3.42倍高かった。したがって、miR−224の血清レベルは線維症の程度と相関し、単独で、または他のバイオマーカーとの組合せで使用して肝線維症の進行をモニタリングすることができる。
miR−224は、実施例6に提示されるデータにおいて肝線維症との強い相関を示した。0より大きい線維症グレードを有するNAFL患者の血清中のmiR−224の有意なモジュレーションが同定された。R/Bioconductorパッケージlimma(マイクロアレイデータ用の線形モデル)を使用して示差的発現分析を行った。血清レベルは、ステージ1の肝線維症対線維症なし、ステージ2対線維症なし、ならびにステージ3および4対線維症なしの患者において1.88、3.01および3.42倍高かった。したがって、miR−224の血清レベルは線維症の程度と相関し、単独で、または他のバイオマーカーとの組合せで使用して肝線維症の進行をモニタリングすることができる。
miR−224の血清レベルは、miR−191との組合せで、グレード3および4の肝線維症を有する患者と、線維症を有さない患者とを区別する能力を有する分類因子をもたらし、曲線下面積は約0.85であった。
表15は、表12からの示差的に発現されるmiR(ステージ1対ステージ0)を列記し、調整P値は<0.1であり;表16は、表11の示差的に発現されるmiR(ステージ2対ステージ0)を列記し、調整P値は<0.1であり;表17は、表11からの示差的に発現されるmiR(線維症ステージ3または4対ステージ0を列記し、調整P値は<0.1である。
図1は、線維症の不存在下でのmiRNAの存在量に対して異なるステージの線維症間でモジュレートされる同一のmiRNAの数を示すベン図を示す。miR−224およびmiR−34aは、肝線維症を有さない試料に対して、全ての線維症ステージについてモジュレートされることが見出された。miR−28、miR−30b、miR−30c、およびmiR−193a−5pは、肝線維症ステージ2以上を有する試料からのみモジュレートされることが見出された。
肝線維症についての12マイクロRNA分類因子
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロRNAプロファイルを、進行線維症(ステージ3または4)または線維症なし(ステージ0)に分類した:複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および/またはベイズ複合共変量分類因子。マイクロRNA選択は、最初に、一連の有意値(0.01、0.005、0.001、0.0005)にわたる2つのクラス間の2試料t検定において有意に異なるマイクロRNAを同定することにより行った。それぞれの予測方法について、最低の交差検証誤分類率を有する有意値を予測因子について選択した。12マイクロRNA分類因子の組成を表18に提示する。3つの方法のそれぞれにより割り当てられる遺伝子重量を表19に提示する。
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロRNAプロファイルを、進行線維症(ステージ3または4)または線維症なし(ステージ0)に分類した:複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および/またはベイズ複合共変量分類因子。マイクロRNA選択は、最初に、一連の有意値(0.01、0.005、0.001、0.0005)にわたる2つのクラス間の2試料t検定において有意に異なるマイクロRNAを同定することにより行った。それぞれの予測方法について、最低の交差検証誤分類率を有する有意値を予測因子について選択した。12マイクロRNA分類因子の組成を表18に提示する。3つの方法のそれぞれにより割り当てられる遺伝子重量を表19に提示する。
3つの分類法からの予測規則:
予測規則は、有意な遺伝子の重量(wi)および発現(xi)の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。
予測規則は、有意な遺伝子の重量(wi)および発現(xi)の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。
試料は、合計が閾値よりも大きい場合、すなわち、
Σiwixi>閾値
の場合、進行線維症のクラスに分類する。
Σiwixi>閾値
の場合、進行線維症のクラスに分類する。
複合共変量予測因子についての閾値は、1.683である。対角線形判別予測因子についての閾値は、77.323である。サポートベクターマシン予測因子についての閾値は、2.268である。
交差検証を使用して分類因子の性能を以下のとおり検定した。
一部のクラスAについて、
n11=Aとして予測されるクラスA試料の数、
n12=非Aとして予測されるクラスA試料の数、
n21=Aとして予測される非A試料の数、
n22=非Aとして予測される非A試料の数
とする。
n11=Aとして予測されるクラスA試料の数、
n12=非Aとして予測されるクラスA試料の数、
n21=Aとして予測される非A試料の数、
n22=非Aとして予測される非A試料の数
とする。
次いで、以下のパラメータは、分類因子の性能を特徴付けし得る:
感度=n11/(n11+n12)、
特異度=n22/(n21+n22)、
陽性予測値(PPV)=n11/(n11+n21)、
陰性予測値(NPV)=n22/(n12+n22)。
感度=n11/(n11+n12)、
特異度=n22/(n21+n22)、
陽性予測値(PPV)=n11/(n11+n21)、
陰性予測値(NPV)=n22/(n12+n22)。
感度は、クラスA試料がクラスAとして正確に予測される確率である。特異度は、非クラスA試料が非Aとして正確に予測される確率である。PPVは、クラスAとして予測される試料が実際にクラスAに属する確率である。NPVは、非クラスAとして予測される試料が実際にクラスAに属さない確率である。
複合共変量予測因子の分類因子の性能を表20に提示する。対角線形判別分析の分類因子の性能を表21に提示する。サポートベクターマシンの分類因子の性能を表22に提示する。
分類因子の受信者動作特性(ROC)をグラフ表示した。得られた曲線下面積(AUC)は、3つの分類法を使用して平均0.81であった:複合共変量予測因子(CCP)により得られた0.82のAUC、対角線形判別予測因子(DLDP)により得られた0.808のAUCおよびベイズ複合共変量予測因子(BCCP)により得られた0.803のAUC。
肝線維症についての1ペア(2マイクロRNA)の分類因子
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロRNAプロファイルを、進行線維症(ステージ3または4)または線維症なし(ステージ0)に分類した:複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および/またはサポートベクターマシン。マイクロRNAの数を2(1つのペア)に設定した。グリーディペアアプローチ(Bo et al.2002)を使用してマイクロRNAの1つのペアを同定した。グリーディペア法は、個々のt−スコアに基づき全てのマイクロRNAをランク付けすることにより開始する。最高ランクのマイクロRNAを選択し、次いで手順は、その最高ランクのマイクロRNAと一緒に最良の区別を提供し、ペアt−スコアを最大化するマイクロRNAを検索する。次いで、このペアをマイクロRNAのセットから除去し、所望のペア数のマイクロRNAに到達するまで、マイクロRNAの残りのセットに対してこのプロセスを繰り返す。所望のペア数を先験的に規定する。種々のペア数を規定し、最良のAUCを有するものをピックした。グリーディペア法の背景の概念は、それぞれのマイクロRNAを別個に考慮する方法が、一緒には十分にクラスを分けるが、個々にはそれほど十分に分けないマイクロRNAのセットを漏らし得ることである(Bo et al.2002)。
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロRNAプロファイルを、進行線維症(ステージ3または4)または線維症なし(ステージ0)に分類した:複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および/またはサポートベクターマシン。マイクロRNAの数を2(1つのペア)に設定した。グリーディペアアプローチ(Bo et al.2002)を使用してマイクロRNAの1つのペアを同定した。グリーディペア法は、個々のt−スコアに基づき全てのマイクロRNAをランク付けすることにより開始する。最高ランクのマイクロRNAを選択し、次いで手順は、その最高ランクのマイクロRNAと一緒に最良の区別を提供し、ペアt−スコアを最大化するマイクロRNAを検索する。次いで、このペアをマイクロRNAのセットから除去し、所望のペア数のマイクロRNAに到達するまで、マイクロRNAの残りのセットに対してこのプロセスを繰り返す。所望のペア数を先験的に規定する。種々のペア数を規定し、最良のAUCを有するものをピックした。グリーディペア法の背景の概念は、それぞれのマイクロRNAを別個に考慮する方法が、一緒には十分にクラスを分けるが、個々にはそれほど十分に分けないマイクロRNAのセットを漏らし得ることである(Bo et al.2002)。
2マイクロRNA分類因子の組成を表23に提示する。3つの方法のそれぞれにより割り当てられる遺伝子重量を表24に提示する。
3つの分類法からの予測規則:
予測規則は、有意な遺伝子の重量(wi)および発現(xi)の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。試料は、合計が閾値よりも大きい場合、すなわち、
Σiwixi>閾値
の場合、進行線維症のクラスに分類する。
予測規則は、有意な遺伝子の重量(wi)および発現(xi)の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。試料は、合計が閾値よりも大きい場合、すなわち、
Σiwixi>閾値
の場合、進行線維症のクラスに分類する。
複合共変量予測因子についての閾値は、−120.631である。対角線形判別予測因子についての閾値は、−26.87である。サポートベクターマシン予測因子についての閾値は、−9.785である。
交差検証を使用して分類因子の性能を以下のとおり検定した。
一部のクラスAについて、
n11=Aとして予測されるクラスA試料の数、
n12=非Aとして予測されるクラスA試料の数、
n21=Aとして予測される非A試料の数、
n22=非Aとして予測される非A試料の数
とする。
n11=Aとして予測されるクラスA試料の数、
n12=非Aとして予測されるクラスA試料の数、
n21=Aとして予測される非A試料の数、
n22=非Aとして予測される非A試料の数
とする。
次いで、以下のパラメータは、分類因子の性能を特徴付けし得る:
感度=n11/(n11+n12)、
特異度=n22/(n21+n22)、
陽性予測値(PPV)=n11/(n11+n21)、
陰性予測値(NPV)=n22/(n12+n22)。
感度=n11/(n11+n12)、
特異度=n22/(n21+n22)、
陽性予測値(PPV)=n11/(n11+n21)、
陰性予測値(NPV)=n22/(n12+n22)。
感度は、クラスA試料がクラスAとして正確に予測される確率である。特異度は、非クラスA試料が非Aとして正確に予測される確率である。PPVは、クラスAとして予測される試料が実際にクラスAに属する確率である。NPVは、非クラスAとして予測される試料が実際にクラスAに属さない確率である。
複合共変量予測因子の分類因子の性能を表25に提示する。対角線形判別分析の分類因子の性能を表26に提示する。サポートベクターマシンの分類因子の性能を表27に提示する。
分類因子の受信者動作特性(ROC)をグラフ表示した。得られた曲線下面積(AUC)は、3つの分類法を使用して平均0.85であった:複合共変量予測因子(CCP)により得られた0.855のAUC、対角線形判別予測因子(DLDP)により得られた0.859のAUCおよびベイズ複合共変量予測因子(BCCP)により得られた0.842のAUC。
実施例8:肝細胞バルーニングにおいて示差的に発現されるマイクロRNAの同定
153個の試料を、肝細胞バルーニングについて分類した。33個はステージ0を有し、86個はステージ1を有し、28個はステージ2を有し、1個はステージ3を有し、4個はステージ0〜1を有した(分析においてスコア1としてカウント)。
153個の試料を、肝細胞バルーニングについて分類した。33個はステージ0を有し、86個はステージ1を有し、28個はステージ2を有し、1個はステージ3を有し、4個はステージ0〜1を有した(分析においてスコア1としてカウント)。
表28は、ステージ2またはステージ3の肝細胞バルーニングと診断された患者から得られた血清試料および肝細胞バルーニングを有さないと診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される29個のmiRNAについての平均肝細胞バルーニングステージ2/3対肝細胞バルーニングなしの示差的発現データを提示する。これらのmiRNAの17個は、肝細胞バルーニングを有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ2またはステージ3の肝細胞バルーニング診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのmiRNAの12個は、肝細胞バルーニングを有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ2またはステージ3の肝細胞バルーニング診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
表29は、ステージ2またはステージ3の肝細胞バルーニングと診断された患者から得られた血清試料およびステージ1の肝細胞バルーニングと診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される20個のmiRNAについての平均肝細胞バルーニングステージ2/3対肝細胞バルーニングステージ1の示差的発現データを提示する。これらのmiRNAの6個は、ステージ1の肝細胞バルーニング診断を有すると診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ2またはステージ3の肝細胞バルーニング診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのmiRNAの14個は、ステージ1の肝細胞バルーニング診断を有すると診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ2またはステージ3の肝細胞バルーニング診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
表28および29に提示されるデータは、異なるステージの肝細胞バルーニングを有する患者から得られた血清試料中で示差的に発現され、肝細胞バルーニング疾患状態の存在と肝細胞バルーニング疾患状態の不存在とを区別し、軽度(ステージ1/2)および重度(ステージ3)の疾患状態を区別するmiRNAのセットを同定する。同定されたmiRNAを個々に、または組合せとしてバイオマーカーとして使用して患者の血清試料中の選択miRNAのmiRNA発現プロファイルの決定に基づき患者の肝細胞バルーニング疾患状態を同定することができる。
実施例9:肝細胞バルーニングについてのマイクロRNA発現分類因子
実施例8に提示されるデータは、miR−224血清レベルと、肝細胞バルーニングの存在との相関の増加を同定する。この実施例は、肝細胞バルーニングスコア2または3と、スコア0(HBの組織病理学的証拠を有さないNAFL患者)とを区別する8ペアマイクロRNA分類因子ならびに肝細胞バルーニングスコア2または3と、肝細胞バルーニングスコア1とを区別する2ペア分類因子を記載する。
実施例8に提示されるデータは、miR−224血清レベルと、肝細胞バルーニングの存在との相関の増加を同定する。この実施例は、肝細胞バルーニングスコア2または3と、スコア0(HBの組織病理学的証拠を有さないNAFL患者)とを区別する8ペアマイクロRNA分類因子ならびに肝細胞バルーニングスコア2または3と、肝細胞バルーニングスコア1とを区別する2ペア分類因子を記載する。
肝細胞バルーニングについての8ペア(16マイクロRNA)分類因子
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロRNAプロファイルを、バルーニングスコア2もしくは3またはバルーニングスコア0に分類した:複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および/またはサポートベクターマシン。
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロRNAプロファイルを、バルーニングスコア2もしくは3またはバルーニングスコア0に分類した:複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および/またはサポートベクターマシン。
マイクロRNAの数を16(8つのペア)に設定した。グリーディペアアプローチ(Bo et al.2002)を使用してマイクロRNAのこれら8つのペアを同定した。グリーディペア法は、個々のt−スコアに基づき全てのマイクロRNAをランク付けすることにより開始する。最高ランクのマイクロRNAを選択し、次いで手順は、その最高ランクのマイクロRNAと一緒に最良の区別を提供し、ペアt−スコアを最大化するマイクロRNAを検索する。次いで、このペアをマイクロRNAのセットから除去し、所望のペア数のマイクロRNAに到達するまで、マイクロRNAの残りのセットに対してこのプロセスを繰り返す。所望のペア数を先験的に規定する。種々のペア数を規定し、最良のAUCを有するものをピックした。グリーディペア法の背景の概念は、それぞれのマイクロRNAを別個に考慮する方法が、一緒には十分にクラスを分けるが、個々にはそれほど十分に分けないマイクロRNAのセットを欠落し得ることである(Bo et al.2002)。
8ペア分類因子の組成を表30に提示する。3つの方法のそれぞれにより割り当てられる遺伝子重量を表31に提示する。
3つの分類法からの予測規則:
予測規則は、有意な遺伝子の重量(wi)および発現(xi)の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。試料は、合計が閾値よりも大きい場合、すなわち、
Σiwixi>閾値
の場合、スコア_0のクラスに分類する。
予測規則は、有意な遺伝子の重量(wi)および発現(xi)の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。試料は、合計が閾値よりも大きい場合、すなわち、
Σiwixi>閾値
の場合、スコア_0のクラスに分類する。
複合共変量予測因子についての閾値は、401.796である。対角線形判別予測因子についての閾値は、11.023である。サポートベクターマシン予測因子についての閾値は、−43.007である。
交差検証を使用して分類因子の性能を以下のとおり検定した。
一部のクラスAについて、
n11=Aとして予測されるクラスA試料の数、
n12=非Aとして予測されるクラスA試料の数、
n21=Aとして予測される非A試料の数、
n22=非Aとして予測される非A試料の数
とする。
n11=Aとして予測されるクラスA試料の数、
n12=非Aとして予測されるクラスA試料の数、
n21=Aとして予測される非A試料の数、
n22=非Aとして予測される非A試料の数
とする。
次いで、以下のパラメータは、分類因子の性能を特徴付けし得る:
感度=n11/(n11+n12)、
特異度=n22/(n21+n22)、
陽性予測値(PPV)=n11/(n11+n21)、
陰性予測値(NPV)=n22/(n12+n22)。
感度=n11/(n11+n12)、
特異度=n22/(n21+n22)、
陽性予測値(PPV)=n11/(n11+n21)、
陰性予測値(NPV)=n22/(n12+n22)。
感度は、クラスA試料がクラスAとして正確に予測される確率である。特異度は、非クラスA試料が非Aとして正確に予測される確率である。PPVは、クラスAとして予測される試料が実際にクラスAに属する確率である。NPVは、非クラスAとして予測される試料が実際にクラスAに属さない確率である。
複合共変量予測因子の分類因子の性能を表32に提示する。対角線形判別分析の分類因子の性能を表33に提示する。サポートベクターマシンの分類因子の性能を表34に提示する。
分類因子の受信者動作特性(ROC)をグラフ表示した。得られた曲線下面積(AUC)は、3つの分類法を使用して平均0.82であった:複合共変量予測因子(CCP)により得られた0.824のAUC、対角線形判別予測因子(DLDP)により得られた0.809のAUCおよびベイズ複合共変量予測因子(BCCP)により得られた0.821のAUC。
肝細胞バルーニングについての2ペア(4マイクロRNA)分類因子
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロRNAプロファイルを、バルーニングスコア2もしくは3、またはバルーニングスコア1に分類した:複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および/またはサポートベクターマシン。
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロRNAプロファイルを、バルーニングスコア2もしくは3、またはバルーニングスコア1に分類した:複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および/またはサポートベクターマシン。
マイクロRNAの数を4(2つのペア)に設定した。グリーディペアアプローチ(Bo et al.2002)を使用してマイクロRNAのこれら2つのペアを同定した。グリーディペア法は、個々のt−スコアに基づき全てのマイクロRNAをランク付けすることにより開始する。最高ランクのマイクロRNAを選択し、次いで手順は、その最高ランクのマイクロRNAと一緒に最良の区別を提供し、ペアt−スコアを最大化するマイクロRNAを検索する。次いで、このペアをマイクロRNAのセットから除去し、所望のペア数のマイクロRNAに到達するまで、マイクロRNAの残りのセットに対してこのプロセスを繰り返す。所望のペア数を先験的に規定する。種々のペア数を規定し、最良のAUCを有するものをピックした。グリーディペア法の背景の概念は、それぞれのマイクロRNAを別個に考慮する方法が、一緒には十分にクラスを分けるが、個々にはそれほど十分に分けないマイクロRNAのセットを漏らし得ることである(Bo et al.2002)。
2ペア分類因子の組成を表35に提示する。3つの方法のそれぞれにより割り当てられる遺伝子重量を表36に提示する。
3つの分類方法からの予測規則:
予測規則は、有意な遺伝子の重量(wi)および発現(xi)の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。試料は、合計が閾値よりも大きい場合、すなわち、
Σiwixi>閾値
の場合、スコア_1のクラスに分類する。
予測規則は、有意な遺伝子の重量(wi)および発現(xi)の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。試料は、合計が閾値よりも大きい場合、すなわち、
Σiwixi>閾値
の場合、スコア_1のクラスに分類する。
複合共変量予測因子についての閾値は、71.576である。対角線形判別予測因子についての閾値は、−8.12である。サポートベクターマシン予測因子についての閾値は、−5.262である。
交差検証を使用して分類因子の性能を以下のとおり検定した。
一部のクラスAについて、
n11=Aとして予測されるクラスA試料の数、
n12=非Aとして予測されるクラスA試料の数、
n21=Aとして予測される非A試料の数、
n22=非Aとして予測される非A試料の数
とする。
n11=Aとして予測されるクラスA試料の数、
n12=非Aとして予測されるクラスA試料の数、
n21=Aとして予測される非A試料の数、
n22=非Aとして予測される非A試料の数
とする。
次いで、以下のパラメータは、分類因子の性能を特徴付けし得る:
感度=n11/(n11+n12)、
特異度=n22/(n21+n22)、
陽性予測値(PPV)=n11/(n11+n21)、
陰性予測値(NPV)=n22/(n12+n22)。
感度=n11/(n11+n12)、
特異度=n22/(n21+n22)、
陽性予測値(PPV)=n11/(n11+n21)、
陰性予測値(NPV)=n22/(n12+n22)。
感度は、クラスA試料がクラスAとして正確に予測される確率である。特異度は、非クラスA試料が非Aとして正確に予測される確率である。PPVは、クラスAとして予測される試料が実際にクラスAに属する確率である。NPVは、非クラスAとして予測される試料が実際にクラスAに属さない確率である。
複合共変量予測因子の分類因子の性能を表37に提示する。対角線形判別分析の分類因子の性能を表38に提示する。サポートベクターマシンの分類因子の性能を表39に提示する。
Claims (78)
- 対象の非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)状態を特徴付けする方法において、表1〜4、10〜14、および28〜29の少なくとも1つに列記される示差的に発現されるmiRNAから選択されるN個のマイクロRNA(miRNA)を有するバイオマーカーパネルを形成することと、前記対象の試料中の前記パネル中の前記N個のmiRNAのそれぞれのレベルを検出することと、を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、Nが、1〜20、1〜5、6〜10、11〜15、または15〜20であることを特徴とする方法。
- 対象におけるNAFLD状態を特徴付けする方法において、
前記対象からの試料中の表1〜4、10〜14、および28〜29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個または少なくとも15個のmiRNAのレベルを検出することを含み、
それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、前記対象におけるNAFLDの存在および/またはより進行したNAFLD状態の存在を示すことを特徴とする方法。 - 請求項1乃至3の何れか1項に記載の方法において、前記対象のNAFLD状態の特徴付けが、前記対象の非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)状態を特徴付けすることを含むことを特徴とする方法。
- 請求項4に記載の方法において、表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを、前記対象からの試料中で検出し、
それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、前記対象におけるNASHの存在および/またはより進行したステージのNASHの存在を示すことを特徴とする方法。 - 請求項5に記載の方法において、前記NASHが、ステージ1、ステージ2、ステージ3またはステージ4のNASHであることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至3の何れか1項に記載の方法において、前記対象のNAFLD状態の特徴付けが、前記対象における肝線維症の出現を特徴付けすることを特徴とする方法。
- 請求項7に記載の方法において、表10〜14の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを、対象からの試料中で検出し、
それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、前記対象における肝線維症の存在および/またはより進行した肝線維症の存在を示すことを特徴とする方法。 - 請求項1乃至3の何れか1項に記載の方法において、前記対象のNAFLD状態の特徴付けが、前記対象における肝細胞バルーニングの出現を特徴付けすることを特徴とする方法。
- 請求項9に記載の方法において、表28および29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルの検出を、前記対象からの前記試料中で検出し、
それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、前記対象における肝細胞バルーニングの存在および/またはより進行した肝細胞バルーニングの存在を示すことを特徴とする方法。 - 対象がNASHを有するか否かを判定する方法において、
NASHを有することが疑われている対象からの試料を提供することと、
表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるN個のマイクロRNAのmiRNAを有するバイオマーカーパネルを形成することと、
前記対象からの前記試料中の前記パネル中の前記N個のmiRNAのそれぞれのレベルを検出することと、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項11に記載の方法において、Nが、1〜20、1〜5、6〜10、11〜15、または15〜20であることを特徴とする方法。
- 対象がNASHを有するか否かを判定する方法において、NASHが疑われている対象からの試料を提供することと、前記対象からの前記試料中の表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含み、
それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、前記対象がNASHを有することを示すことを特徴とする方法。 - 請求項13に記載の方法において、前記対象からの前記試料中の表5に列記されるペア1〜10から選択される少なくとも1つのmiRNAのペアのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
- 請求項13に記載の方法において、前記試料が、軽度、中程度、または重度のNAFLDと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
- 請求項13に記載の方法において、前記対象が、これまでNASHと診断されていないことを特徴とする方法。
- 請求項13に記載の方法において、前記NASHが、ステージ1、2、3、または4のNASHであることを特徴とする方法。
- 請求項13の何れか1項に記載の方法において、前記対象が、NAFLDと既に診断されていることを特徴とする方法。
- 請求項18に記載の方法において、前記試料が、軽度、中程度、または重度のNAFLDと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
- 請求項18に記載の方法において、前記対象が、NASHの少なくとも1つの臨床的症状を呈していることを特徴とする方法。
- 対象におけるNASH療法をモニタリングする方法において、
NASHのための治療を受けている対象からの試料を提供することと、
表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるN個のマイクロRNAのmiRNAを有するバイオマーカーパネルを形成することと、
前記対象からの前記試料中の前記パネル中の前記N個のmiRNAのそれぞれのレベルを検出することと、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項21に記載の方法において、Nが、1〜20、1〜5、6〜10、11〜15、または15〜20であることを特徴とする方法。
- 対象におけるNASH療法をモニタリングする方法において、NASHのための治療を受けている対象からの試料を提供することと、前記対象からの前記試料中の表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含み、
それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、前記NASHの重症度が増加していることを示し、
それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルの不存在は、前記NASHの重症度が増加していないことを示すことを特徴とする方法。 - 請求項23に記載の方法において、前記対象からの前記試料中の表5に列記されるペア1〜10から選択される少なくとも1つのmiRNAのペアのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
- 請求項23に記載の方法において、前記NASHが、ステージ1、2、3、または4のNASHであることを特徴とする方法。
- NAFLDを有する対象がNASHを発症するリスクを特徴付けする方法において、NAFLDが疑われている対象からの試料を提供することと、前記対象からの前記試料中の表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含み、
それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、前記対象がNASHを発症するリスクの増加を示し、および/または
それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルの不存在は、前記対象がNASHを発症するリスクの減少を示すことを特徴とする方法。 - 請求項26に記載の方法において、前記対象からの前記試料中の表5に列記されるペア1〜10から選択される少なくとも1つのmiRNAのペアのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
- 請求項26に記載の方法において、前記試料が、軽度、中程度、または重度のNAFLDと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
- 対象が肝線維症を有するか否かを判定する方法において、
肝線維症が疑われている対象からの試料を提供することと、
表10〜14の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるN個のmiRNAを有するバイオマーカーパネルを形成することと、
前記対象からの前記試料中の前記パネル中の前記N個のmiRNAのそれぞれのレベルを検出することと、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項29に記載の方法において、Nが、1〜20、1〜5、6〜10、11〜15、または15〜20であることを特徴とする方法。
- 対象が肝線維症を有するか否かを判定する方法において、肝線維症が疑われている対象からの試料を提供することと、表10〜14の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含み、
それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、肝線維症の存在を示すことを特徴とする方法。 - 請求項31に記載の方法において、表15〜17の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
- 請求項32に記載の方法において、前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−224であることを特徴とする方法。
- 請求項31に記載の方法において、表18に列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
- 請求項31に記載の方法において、miR−224および/またはmiR−191のレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
- 請求項31に記載の方法において、前記肝線維症が、ステージ1、2、3、または4の肝線維症であることを特徴とする方法。
- 請求項31に記載の方法において、前記試料が、軽度、中程度、または重度のNAFLDと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
- 請求項31に記載の方法において、前記試料が、NASHと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
- 請求項39に記載の方法において、前記NASHが、ステージ1、2、3、または4のNASHであることを特徴とする方法。
- 対象が肝細胞バルーニングを有するか否かを判定する方法において、
肝細胞バルーニングが疑われている対象からの試料を提供することと、
表28および29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるN個のmiRNAを有するバイオマーカーパネルを形成することと、
前記対象からの前記試料中の前記パネル中の前記N個のmiRNAのそれぞれのレベルを検出することと、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項40に記載の方法において、Nが、1〜20、1〜5、6〜10、11〜15、または15〜20であることを特徴とする方法。
- 対象が肝細胞バルーニングを有するか否かを判定する方法において、肝細胞バルーニングが疑われている対象からの試料を提供することと、前記対象からの前記試料中の表28および29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10個のmiRNAのレベルを検出することと、を含み、
それぞれのmiRNAの対照レベルよりも高い少なくとも1つの示差的に増加するmiRNAのレベルおよび/またはそれぞれのmiRNAの対照レベルよりも低い少なくとも1つの示差的に減少するmiRNAのレベルは、肝細胞バルーニングの存在を示すことを特徴とする方法。 - 請求項42に記載の方法において、前記対象からの前記試料中の表30に列記されるペアから選択される少なくとも1つのmiRNAのペアのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
- 請求項42に記載の方法において、前記対象からの前記試料中の表35に列記されるペアから選択される少なくとも1つのmiRNAのペアのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
- 請求項42に記載の方法において、前記試料が、軽度、中程度、または重度のNAFLDと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
- 請求項42に記載の方法において、前記試料が、NASHと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
- 請求項46に記載の方法において、前記NASHが、ステージ1、2、3、または4のNASHであることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至47の何れか1項に記載の方法において、前記検出が、RT−PCRを含むことを特徴とする方法。
- 請求項48に記載の方法において、前記検出が、定量的RT−PCRを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1乃至49の何れか1項に記載の方法において、前記試料が体液であることを特徴とする方法。
- 請求項50に記載の方法において、前記試料が、血液、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項51に記載の方法において、前記試料が血清であることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至52の何れか1項に記載の方法において、医療保険料または生命保険料を決定する目的のために前記対象のNAFLDまたはNASH状態を特徴付けすることを含むことを特徴とする方法。
- 請求項53に記載の方法において、前記対象についての医療保険料または生命保険料を決定することをさらに含むことを特徴とする方法。
- 対象からの試料のRNAまたは対象からの試料の前記RNAから逆転写されたcDNAと、
表1〜4、10〜14、および28〜29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのポリヌクレオチドのセットと、
を含むことを特徴とする組成物。 - 請求項55に記載の組成物において、前記ポリヌクレオチドのセットが、表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものであることを特徴とする組成物。
- 請求項55に記載の組成物において、前記ポリヌクレオチドのセットが、表10〜14の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものであることを特徴とする組成物。
- 請求項55に記載の組成物において、前記ポリヌクレオチドのセットが、表28および29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものであることを特徴とする組成物。
- 請求項55乃至58の何れか1項に記載の組成物において、それぞれのポリヌクレオチドが、独立して、8〜100、8〜75、8〜50、8〜40、8〜30、12〜100、12〜75、12〜50、12〜40、または12〜30ヌクレオチドを含むことを特徴とする組成物。
- 請求項55乃至58の何れか1項に記載の組成物において、前記試料が体液であることを特徴とする組成物。
- 請求項63に記載の組成物において、前記試料が、血液、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択されることを特徴とする組成物。
- 請求項64に記載の組成物において、前記試料が血清であることを特徴とする組成物。
- 表1〜4、10〜14、および28〜29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのポリヌクレオチドのセット
を含むことを特徴とするキット。 - 請求項63に記載のキットにおいて、前記ポリヌクレオチドのセットが、表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものであることを特徴とするキット。
- 請求項63に記載のキットにおいて、前記ポリヌクレオチドのセットが、表10〜14の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものであることを特徴とするキット。
- 請求項63に記載のキットにおいて、前記ポリヌクレオチドのセットが、表28および29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものであることを特徴とするキット。
- 請求項63乃至66の何れか1項に記載のキットにおいて、それぞれのポリヌクレオチドが、独立して、8〜100、8〜75、8〜50、8〜40、8〜30、12〜100、12〜75、12〜50、12〜40、または12〜30ヌクレオチドを含むことを特徴とするキット。
- 請求項63乃至67の何れか1項に記載のキットにおいて、前記ポリヌクレオチドが、マルチプレックスアッセイにおける使用のための包装であることを特徴とするキット。
- 請求項63乃至67の何れか1項に記載のキットにおいて、前記ポリヌクレオチドが、非マルチプレックスアッセイにおける使用のための包装であることを特徴とするキット。
- 表1〜4、10〜14、および28〜29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのポリヌクレオチドのセットと、
対象からの試料のRNAまたは対象からの試料の前記RNAから逆転写されたcDNAと、
を含むことを特徴とする系。 - 請求項70に記載の系において、前記ポリヌクレオチドのセットが、表1〜4の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものであることを特徴とする系。
- 請求項70に記載の系において、前記ポリヌクレオチドのセットが、表10〜14の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものであることを特徴とする系。
- 請求項70に記載の系において、前記ポリヌクレオチドのセットが、表28および29の少なくとも1つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するmiRNAから選択されるmiRNAからなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または10個のRNAを検出するためのものであることを特徴とする系。
- 請求項70乃至74の何れか1項に記載の系において、それぞれのポリヌクレオチドが、独立して、8〜100、8〜75、8〜50、8〜40、8〜30、12〜100、12〜75、12〜50、12〜40、または12〜30ヌクレオチドを含むことを特徴とする系。
- 請求項70乃至75の何れか1項に記載の系において、前記試料が体液であることを特徴とする系。
- 請求項76に記載の系において、前記試料が、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択されることを特徴とする系。
- 請求項77に記載の系において、前記試料が血清であることを特徴とする系。
- 請求項70乃至75の何れか1項に記載の系において、対象からの試料の前記RNAまたは対象からの試料の前記RNAから逆転写されたcDNAが容器中に存在し、前記ポリヌクレオチドのセットが前記容器とは別個に包装されていることを特徴とする系。
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