JP2016104735A - メラニン産生抑制剤 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、ケラチノサイトから放出されるエクソソームがメラノサイトに対して如何なる作用を示すのかは全く知られていない。
1)N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を有効成分とするメラニン産生抑制剤。
2)N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を有効成分とする美白剤。
3)N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を有効成分とするシミ若しくはソバカスの予防又は改善剤。
4)N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌促物質を有効成分とする皮膚色素沈着の予防又は改善剤。
ここで、「エクソソーム」とは、ケラチノサイトから恒常的に放出されるエクソソームを意味する。当該エクソソームは、直径が30〜100nmで、cup形状を有し、Heat shock protein 70(HSP70)、β−Actin、テトラスパニン(CD9、CD63)等のタンパク質を含むという特徴を有することが報告されているが、本発明においてはこれに限定されるものではない。
「分泌抑制」とは、ケラチノサイトからのエクソソームの分泌能を低減化し、ケラチノサイト外へのエクソソームの放出量を減少させることを意味する。
「物質」としては、その種類は特に限定されず、天然物でも合成物でもよく、また単一物質であっても組成物若しくは混合物であってもよい。
a)ケラチノサイトに被験物質を接触させ培養する工程
b)培養細胞からエクソソーム画分を単離し、分泌レベルを測定する工程
c)エクソソームの分泌レベルを低下又は減少させる被験物質を選択する工程
(invitrogen社、#4478359)等)を用いることでもよい。
そして、被験物質を添加したエクソソームの分泌レベルが被験物質を添加しない対照細胞でのレベルと比較して低下又は減少する物質をケラチノサイト由来エクソソーム分泌抑制物質として選択する。
各種測定は、当該分野で通常使用される任意の解析方法を用いればよく、遺伝子発現解析には、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、RNaseプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるレポーターアッセイ、RT−PCR法、DNAマイクロアレイ等を、タンパク質発現解析には、ウェスタンブロッティング法、免疫染色法、ELISA、バインディングアッセイ等を用いることができる。また、市販のキット(例えばCD63 ExoELISA Kit(System Biosciences社、#EXOEL-CD63A-1)等)やナノ粒子解析装置(NanoSight LM10(NanoSight社))を用いることもできる。
故に、ケラチノサイトからのエクソソームの分泌抑制はメラノサイトにおけるメラニン生成量を減少させ、またデンドライトの伸長を抑制すると云える。実際、後記実施例に示すように、ケラチノサイト由来エクソソームの放出抑制物質によりメラニン生成が抑制される(図8〜11)。
また、本発明において、「美白」とは、皮膚が明色化して白くなることを意味し、また、日焼けなどによる黒色化した皮膚が白くなること、さらには、皮膚の黒色化が防止されること、シミやソバカスが薄く目立たなくなること、シミやソバカスの生成が抑制されることを包含する。
「皮膚色素沈着」とは、皮膚に一過的又は慢性的にメラニンなどの色素が沈着または停滞して色素斑が形成された状態を意味する。
斯かる製剤は、それぞれ一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの化粧品、医薬部外品又は医薬品等には、それぞれの製剤に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗炎症剤、抗菌剤、清涼剤、抗脂漏剤等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
また、上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用対象者としては、それを必要としていれば特に限定されないが、美白を所望するヒト、シミ若しくはソバカスの予防又は改善を所望するヒト、あるいは皮膚色素沈着の予防又は改善を所望するヒトが挙げられる。
<1>N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を有効成分とするメラニン産生抑制剤。
<2>N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を有効成分とする美白剤。
<3>N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を有効成分とするシミ若しくはソバカスの予防又は治療剤。
<4>N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を有効成分とする皮膚色素沈着の予防又は改善剤。
<5>ケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質が、N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩である、<1>のメラニン産生抑制剤、<2>の美白剤、<3>のシミ若しくはソバカスの予防又は治療剤、又は<4>の皮膚色素沈着の予防又は改善剤。
<7>美白剤を製造するための、N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質の使用。
<8>シミ若しくはソバカスの予防又は改善剤を製造するための、N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質の使用。
<9>皮膚色素沈着の予防又は改善剤を製造するための、N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質の使用。
<10>メラニン産生を抑制するための、N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質の使用。
<11>美白のための、N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質の使用。
<12>シミ若しくはソバカスを予防又は改善するための、N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質の使用。
<13>皮膚色素沈着を予防又は改善するための、N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質の使用。
<14>N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を投与又は摂取する、メラニン産生抑制方法。
<15>N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を投与又は摂取する、美白方法。
<16>N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を投与又は摂取する、シミ若しくはソバカスの予防又は改善方法。
<17>N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を投与又は摂取する、皮膚色素沈着の予防又は改善方法。
<18><6>〜<17>において、ケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質は、好ましくは、N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩である。
<19><10>〜<13>において、使用は非治療的使用である。
<20><14>〜<17>において、方法は非治療的方法である。
<21><1>〜<18>において、ケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質は製剤中に含有されるものであり、当該製剤中の前記ケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質の含有量は、好ましくは0.0001質量%以上であり、好ましくは0.1質量%以下である。また、好ましくは0.00001〜1質量%、より好ましくは0.0001〜0.1質量%である。
参考例1:ケラチノサイト由来エクソソームの単離とその特徴付け
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(凍結NHEK (F) Lightly; ケラチノサイト)、表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)はLife Technologies社より、その培地用増殖添加剤(Humedia-KG)はクラボウ社より購入した。ケラチノサイトは、37℃ 5Vol%CO2の環境下で培養した。
ケラチノサイトを2.5×106cells/flask (25mL/flask)の細胞密度で175cm2 flaskに播種した。この時の培地としては、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor)以外のHumedia-KG増殖添加剤(インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB)を含むEpilife培地を使用した。3日間の培養後、培養上清を回収し、300gで10分間、2,000gで20分間、10,000gで30分間と段階的に遠心分離することにより、余分な細胞(破片)を除去した。この操作を終えた後の培養上清に対し、100,000gで70分間の遠心分離を行った後で上清を除去し、Phosphate Buffered Saline (PBS)にて一度洗浄した。さらに、100,000gで70分間遠心分離した後に完全に上清を除去し、沈殿物をPBSにて懸濁した。100 mLの培養上清から遠心分離した場合、最終沈殿物は200 μLのPBSにて懸濁し、これを原液として評価に用いた。また、100,000g遠心後の上清はAmicon(R) Ultra Centrifugal Filters Ultra(R)-3K (Millipore)に供し、4,800rpmで45分間遠心処理を行った。遠心処理後にフィルター上部に残留した液を培養上清濃縮物として回収した。また、細胞非培養の培地に対して同様の処理を施した液を培地濃縮物として回収した。
単離したエクソソーム画分をPBSもしくはHEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) bufferにて適宜希釈した。その溶液を親水化処理したコロジオン膜貼付メッシュ 400メッシュ(日新EM)に5 μL滴下し、5分間静置した。膜上の水分を吸い取った後、2% Sodium Dodecatungsto(VI) phosphate n-Hydrate (wako)もしくはEMステイナー(日新EM)を10 μL滴下し、1分間もしくは30分間静置することにより、ネガティブ染色を行った。膜上の水分を除いた後、精製水を10 μL滴下した。余分な水分を除いた後、H7650透過型電子顕微鏡(日立)を用いて加速電圧100kVで観察した。その結果、既報と同様に、エクソソームに特徴的なサイズ (直径30-100 nm)と形態 (cup-shaped) を示す小胞を確認した(図1)。
単離したエクソソーム画分をResuspension buffer (ambion)にて溶解し、その溶液についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA(ビシンコニン酸)法によりタンパク質定量を行った後、細胞抽出物、培養上清濃縮物及び培地濃縮物と共に、タンパク質量を揃え、定法に従ってSDS-PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体は、anti-CD9 (Santacruz, 1:1000)抗体、anti-CD63 (Santacruz, 1:1000)抗体、anti-Calnexin (Cell Signaling, 1:1000)抗体、anti-HSP70 (Cell Signaling, 1:1000)抗体、あるいはanti-β-actin (Sigma-Aldrich, 1:5000)抗体を用いた。二次抗体は、anti-mouse IgG, HRP-Linked F(ab’)2Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)あるいはanti-rabbit IgG HRP-Linked F(ab’)2 Fragment Donkey (GE Healthcare Life Science) を用いた。 その後、ECL plus western blotting detection reagents (GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000(富士フィルム)を用いて可視化した。その結果、エクソソームに特徴的に発現するマーカーとされるタンパク質群、すなわち、細胞質に存在するHeat shock protein 70、細胞骨格タンパク質であるActin、また、テトラスパニン(CD9、CD63)の発現がエクソソーム画分に確認され、さらにエクソソームには含有されないとして知られるCalnexinの発現が認められないことも確認された(図2)。それと同時に、ケラチノサイトの培養上清濃縮物(図2; lane2)には、Hsp70を除くエクソソームマーカータンパク質の発現が認められなかったことから、エクソソームがその濃縮過程で除去されていることを確認した。なお、Hsp70の発現が培養上清濃縮物で認められたことは既報(Chavez-Munoz C. et al., 2008, J.Cell. Biochem. 104:2165-2173)と同様の結果である。
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(凍結NHEM (NB) Darkly; メラノサイト)、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はLife Technologiesより購入した。メラノサイトは、37℃ 5Vol%CO2の環境下で培養した。
メラノサイトを1.0×104 cells/well (100 μL/well)、1.0×105 cells/well (500 μL/well)及び1.5×105 cells/well (1.5 mL/well)の細胞密度で96-well plate、12-well plate及び6-well plateにそれぞれ播種した。この時の試験用培地としては、Medium254 (増殖添加剤(HMGS)のうち、Fetal Bovine Serum (FBS)、Human Fibroblast growth factor-basic (hFGF-B)ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン含有、phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)及びbovine pituitary extract (BPE)不含)を用いた。2日後、PBSにて懸濁したエクソソーム画分を添加した後、さらに、96-well plateにおいては5日間、12-well plateにおいては3日間もしくは4日間培養し、それぞれドーパオキシダーゼ活性の計測及び定量的RT-PCR解析に用いた。6-well plateにおいては5日間培養した後に、細胞数の計測及び形態観察、ウェスタンブロッティング解析、さらに、細胞内メラニン定量に用いた。
96-well plateでの培養終了後、培地を全量置換し(100 μL/well)、アラマーブルー(Bio-Rad AbD Serotec Limited)試薬を10 μL/wellになるように添加した。37℃、5Vol%CO2の条件下で1時間インキュベートした後、培地の蛍光強度 (Ex544nm/Em590nm)を測定することで細胞呼吸鎖(増殖)活性を評価した。その後、細胞の培養プレートをPBSで3回洗浄して、抽出Buffer (0.1 M Tris-HCL (pH:7.2)、1% NP-40、0.01% SDS)を20 μL/well、Assay Buffer (4%ジメチルホルムアミド、100 mM Sodium phosphate-buffered (pH:7.1))を20 μL/well添加した。4℃にて2時間かけて細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行ったが、その活性測定は、MBTH法(Winder A. et al., 1991, Eur.J. Biochem. 198:317-326)を基本とした次に示す方法で行った。すなわち、可溶化した細胞溶液の各wellに、上記Assay Bufferを80 μL、20.7 mM MBTH (3-メチル-2-ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン)溶液を60 μL、基質として5 mM L-DOPA (L-ジヒドロキシフェニルアラニン)溶液を40 μL加え、37℃にて30〜60分間反応させた後、その吸光度を505 nmの測定波長で測定した。その結果、PBSのみを添加したコントロールと比較して、同画分添加による両活性の有意な上昇を確認した(図3A、B)。
12-well plateでの培養終了後、細胞をPBSで洗浄した後、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて定法に従いtotal RNAを抽出した。その抽出したtotal RNAを鋳型とし、High Capacity RNA to cDNA Kit (Life Technologies)を用いた逆転写反応によりcDNAを合成した。反応には、MH Research社製のPeltier Thermal Cyclerを用いた。続いて合成したcDNA及びTaqMan(R)probeを用いて、定量的PCR法による遺伝子発現解析を行った。各遺伝子に特異的なprobe及びprimerは、Life Technologies社製のTaqMan(R)Gene Expression Assays (P/N 4331182)を使用した。各々の発現量は、内部標準遺伝子であるribosomal protein, large, P0 (RPLP0)の発現量により補正した。反応条件は定法に従い、アプライドバイオシステムズ社製のシークエンスディテクター(ABI PRISM 7500 Real Time PCR System)を用いて行った。その結果、エクソソーム画分を添加して72時間後にMITFの発現上昇を確認し(図4A)、96時間後にはTYR、TYRP1、Dopachrome tautomerase (DCT) /TYRP2の発現上昇を確認した(図4B)。
6-well plateでの培養終了後、顕微鏡観察をおこない、画像を記録した。その後、0.25% Trypsin-EDTA 溶液(Life Technologies)処理を施して、細胞接着を剥離した後に回収し、血球計算板を用いて細胞数のカウントを行った。その結果、エクソソーム画分を添加して5日後に、PBSを添加したコントロールに対して、細胞数の有意な増加を確認すると共に(図5A)、デンドライトの顕著な伸長を確認した(図5B)。
6-well plateでの培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、RIPA buffer (Sigma-Aldrich)を用いて回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、15,000rpmで15分間遠心分離し、その上清についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA(ビシンコニン酸)法によりタンパク量を定量した後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってSDS-PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体は、anti-MITF (Santacruz, 1:200)、anti-Tyrosinase related protein (TRP) 1 (Santacruz, 1:1000)、anti-TRP2 (Santacruz, 1:200)、あるいはanti-Tyrosinase (Zymed, 1:1000)を用いた。二次抗体は、anti-mouse IgG, HRP-Linked F(ab’)2 Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)、あるいはanti-goat IgG, HRP-Linked F(ab’)2Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)を用いた。 その後、ECL plus western blotting detection reagents (GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000 (GE healthcare bioscience)を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ-actinの発現は、monoclonal antibody specific for β-actin (Sigma-Aldrich, 1:5000)を用いて評価した。上記タンパク質の検出バンドの強度を画像解析により定量した結果、PBSを添加したコントロールに対して、全てのタンパク質が有意に発現上昇していることを確認した(図6)。
6-well plateでの培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてエッペンドルフチューブに細胞を回収した。各エッペンドルフチューブに2M NaOHを150 μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405 nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、エクソソーム画分を添加して5日後に、PBSを添加したコントロールに対して、メラニン産生が促進傾向にあることを確認した(図7)。
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(凍結NHEK (F) Lightly; ケラチノサイト)、表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)はLife Technologies社より、その培地用増殖添加剤(Humedia-KG)はクラボウ社より購入し、また、正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(凍結NHEM (NB) Darkly; メラノサイト)、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はLife Technologies社より購入した。ケラチノサイト及びメラノサイトは、37℃ 5Vol%CO2の環境下で培養した。
ケラチノサイトを1.5×106 cells/flask (25mL/flask)の細胞密度で175cm2 flaskに播種した。この時の培地としては、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF; Human Epidermal Growth Factor) 以外のHumedia-KG増殖添加剤(インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB)を含むEpilife培地を使用した。播種した翌日に、エクソソームの放出抑制剤であるNeutral Sphingomyelinaseの阻害剤GW4869 (Sigma Aldrich)を終濃度で20μM(溶媒はDMSO)になるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で3日間培養を行った。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。培養終了後、細胞の培養上清から既に記載した遠心分離法によりエクソソーム画分を単離した。培養上清を除去した後に、底面に接着している細胞に対してプロナーゼ溶液(極東製薬工業)処理を施して、細胞接着を剥離した後に回収し、血球計算板を用いて細胞数のカウントを行った。また、エクソソーム画分についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA(ビシンコニン酸)法によりタンパク質定量を行い、それを細胞数で除することにより、1細胞あたりのエクソソーム放出量を算出した。その結果、GW4869の添加により、DMSOを添加したコントロールに対して、その放出量が有意に減少することが確認された(図8)。
ケラチノサイトを6-well plateに1×105cells/well (2 mL/well)の細胞密度で播種し、翌日、メラノサイトを2×105cells/well (1 mL/well)の細胞密度で播種した。さらにその翌日に、GW4869を終濃度で5、10、20 μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてhEGF以外のHumedia-KG増殖添加剤(インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン/アンフォテリシンB)を含むEpilife培地を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、RIPA buffer (Sigma-Aldrich)を用いて回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、15,000rpmで15分間遠心分離し、その上清についてBovine Serum Albumin (BSA)を標準物質としたBCA(ビシンコニン酸)法によりタンパク量を定量した後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってSDS-PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体はanti-Pmel17 (Dako, 1:250)を用いた。二次抗体は、anti-mouse IgG, HRP-Linked F(ab’)2 Fragment Sheep (GE Healthcare Life Science)を用いた。 その後、ECL plus western blotting detection reagents (GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000 (GE healthcare bioscience)を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ-actinの発現は、monoclonal antibody specific for β-actin (Sigma-Aldrich, 1:5000)を用いて評価した。Pmel17の検出バンドの強度を画像解析により定量した結果、DMSOを添加したコントロールに対して、GW4869を20μM処理した際に、それが有意に発現低下していることを確認した(図9)。Pmel17はメラノソームに特異的なタンパク質であることから、GW4869処理によりメラニン量が減少したものと考えられる。
メラノサイトを2×105 cells/well (2 mL/well)の細胞密度で播種した。その翌日に、GW4869を終濃度で5、10、20 μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養を行った。培地には、試験用培地としてMedium254 (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)及びbovine pituitary extract (BPE)不含)を用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いてエッペンドルフチューブに細胞を回収した。各エッペンドルフチューブに2M NaOHを150 μL加えた後100℃にて細胞を溶解させ、遠心処理によって得られた上清について405 nmの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、DMSOを添加したコントロールに対して、GW4869を添加した際にメラニン産生量に対する影響は確認されなかった(図10)。
米国スキンバンクNational Disease Research Interchange (NDRI)から、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を提供頂いた。ヒト皮膚組織は、皮下脂肪をトリミングした後に、ナイフで約1 cm×1 cmの大きさに小片化し、6-well plateを使用して37℃ 5Vol%CO2の環境下にて培養した。培養には、Fetal Bovine Serum (FBS)を10% (v/v)含むAdvanced DMEM培地 (いずれもLife Technologies)を使用した。ヒト皮膚組織を6-well plateに静置し、GW4869を終濃度で20 μMになるように培地中に添加した上で組織培養を実施した。2〜3日毎に培地を交換しながら、培養開始から7日間経過後に皮膚組織を回収、定法に従って凍結組織切片を作成後にフォンタナマッソン染色を実施し(図11A)、その染色像に関して、Image Jソフトウェアを用いて二値化を行うことにより、画像解析を行った。表皮と真皮の境界における単位長あたりの表皮メラニン量を算出した結果、DMSOを添加したコントロールに対して、GW4869を処理した皮膚では、有意にメラニン量が低下していることが確認された(図11B)。
Claims (5)
- N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を有効成分とするメラニン産生抑制剤。
- N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を有効成分とする美白剤。
- N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を有効成分とするシミ若しくはソバカスの予防又は治療剤。
- N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩、N−[(1R)−1−(ヒドロキシメチル)−2−オキソ−2−[(4−オキソ−1−オキサスピロ[2.5]オクタ−5,7−ジエン−7−イル)アミノ]エチル]−デカナミド、L−グルタチオン(還元型)、3−O−メチル−スフィンゴミエリン及び配列番号1に示されるセンス配列と配列番号2に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAから選ばれるケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質を有効成分とする皮膚色素沈着の予防又は改善剤。
- ケラチノサイト由来エクソソームの分泌抑制物質が、N,N’−ビス[4−(4,5−ジヒドロ−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]−3,3’−p−フェニレン−ビス−アクリルアミド 2塩酸塩である、請求項1記載のメラニン産生抑制剤、請求項2記載の美白剤、請求項3記載のシミ若しくはソバカスの予防又は治療剤、又は請求項4記載の皮膚色素沈着の予防又は改善剤。
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