JP2016054657A - 真核細胞の増殖方法および真核細胞の生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.プラズマ発生装置
1−1.装置全体の構成
本実施形態の真核細胞の増殖方法および真核細胞の生産方法に用いられるプラズマ発生装置100について説明する。プラズマ発生装置100は、非平衡大気圧プラズマを発生させる装置である。図1は、プラズマ発生装置100の概略構成を示す図である。図1に示すように、プラズマ発生装置100は、チャンバー110と、載置台120と、ガス供給部130と、ガス排出部140と、プラスチックカバー150と、ラジカル照射部200と、を有している。
図3は、ラジカル照射部200の内部構造を示す図である。ラジカル照射部200は、照射口210の他に、放電部250と、中間構造部260と、ノズル部270と、を有している。
2−1.面積照射量と体積照射量
ラジカルの照射量には、面積照射量と体積照射量とがある。面積照射量は、平坦面の上に配置されている真核細胞にラジカルを直接照射する場合に用いる。体積照射量は、液体中の真核細胞にラジカルを照射する場合に用いる。体積照射量については後述する。
ここで、ラジカルの面積照射量は、次式で表される。
DV = RD × V1 × ET × S1 / S2
DV:ラジカルの面積照射量(cm-2)
RD:ラジカル密度(cm-3)
V1:ラジカルの流速(m/sec)
ET:ラジカルの照射時間(sec)
S1:照射口の面積(cm2 )
S2:照射する領域の面積(cm2 )
面積照射量は、照射する領域に照射される単位面積あたりの三重項酸素原子の数である。ここで、ラジカル密度RDは、三重項酸素原子の密度である。
F1 = RD × V1
F1:フラックス(cm-2/sec)
本実施形態における真核細胞の増殖方法は、プラズマ発生装置100により発生させたラジカルを真核生物に照射するラジカル照射工程を有する。そして、ラジカル照射工程では、ラジカルの照射量を予め定めた第1の照射量以下として、ラジカルを真核細胞に照射し、真核細胞を増殖させる。また、ラジカル照射工程では、三重項酸素原子と一重項酸素分子との少なくとも一方を真核細胞に照射する。実際には、三重項酸素原子と一重項酸素分子との両方を真核細胞に照射する。また、さらにオゾンを照射することとしてもよい。
まず、真核細胞を準備する。例えば、寒天培地に真核細胞を培養する。または、その他の平坦面上に真核細胞を配置する。
次に、プラズマ発生装置100からラジカルを寒天培地の真核細胞に向けて照射する。本実施形態では、3.8×1017cm-2以下の三重項酸素原子を真核細胞に照射する。ここで、第1の面積照射量は、3.8×1017cm-2である。これにより、真核細胞は、増殖する。また、この照射に際して、一重項酸素分子も、真核細胞に照射される。
三重項酸素原子と一重項酸素分子とを含むラジカルを真核細胞に第1の照射量以下だけ照射すると、その真核細胞は増殖する。なお、ラジカルを真核細胞に第1の照射量より多い量だけ照射すると、その真核細胞は減少する。ラジカルの照射量の大小によって真核細胞が増殖したり減少する理由は、必ずしも明らかではない。実験結果については、後述する。
以上により説明した真核細胞の増殖方法を用いて、真核細胞を生産することができる。つまり、真核細胞の数を増加させて、短い時間で真核細胞を増産することができる。
以上詳細に説明したように、本実施形態の真核細胞の増殖方法は、第1の面積照射量として3.8×1017cm-2以下のラジカルを真核細胞に照射することにより、真核細胞を増殖させる。
第2の実施形態について説明する。本実施形態では、第1の実施形態と同様に、真核細胞にラジカルを照射することに変わりない。ただし、本実施形態では、真核細胞を懸濁した懸濁液にラジカルを照射する。そのため、本実施形態では、懸濁液に供給されたラジカルは、液体中で真核細胞に作用することとなる。
1−1.面積照射量と体積照射量
ラジカルの照射量には、面積照射量と体積照射量とがある。体積照射量は、液体中の真核細胞にラジカルを照射する場合に用いる。
液体に供給されるラジカルの体積照射量は、次式で表される。
SV = RD × V1 × ET × S1 / C1
SV:ラジカルの体積照射量(cm-3)
RD:ラジカル密度(cm-3)
V1:ラジカルの流速(m/sec)
ET:ラジカルの照射時間(sec)
S1:照射口の面積(cm2 )
C1:懸濁液の容積(cm3 )
体積照射量は、真核細胞を含む液体(懸濁液)の容積に対して供給される三重項酸素原子の数である。ここで、ラジカル密度RDは、三重項酸素原子の密度である。
本実施形態における真核細胞の増殖方法は、プラズマ発生装置100により発生させたラジカルを真核生物に照射するラジカル照射工程を有する。そして、ラジカル照射工程では、ラジカルの照射量を予め定めた第1の照射量以下として、ラジカルを真核細胞に照射し、真核細胞を増殖させる。また、ラジカル照射工程では、三重項酸素原子と一重項酸素分子との少なくとも一方を真核細胞に照射する。実際には、三重項酸素原子と一重項酸素分子との両方を真核細胞に照射する。その際に、真核細胞は、懸濁液中に分散されている。
寒天培地において真核細胞を培養する。そして、寒天培地から真核細胞を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS(−))に懸濁する。このように、真核細胞を懸濁した懸濁液を作製する。
次に、プラズマ発生装置100からラジカルを懸濁液の真核細胞に向けて照射する。ここでは、第1の照射量以下の三重項酸素原子を真核細胞に照射する。第1の照射量は、懸濁液の容積に対して供給される三重項酸素原子の数である第1の体積照射量である。第1の体積照射量は、3.0×1017cm-3である。これにより、真核細胞は、増殖する。また、この照射に際して、一重項酸素分子も、真核細胞に照射される。
三重項酸素原子と一重項酸素分子とを含むラジカルを真核細胞に第1の照射量以下だけ照射すると、その真核細胞は増殖する。なお、ラジカルを真核細胞に第1の照射量より多い量だけ照射すると、その真核細胞は減少する。ラジカルの照射量の大小によって真核細胞が増殖したり減少する理由は、必ずしも明らかではない。実験結果については、後述する。
以上により説明した真核細胞の増殖方法を用いて、真核細胞を生産することができる。つまり、真核細胞の数を増加させて、短い時間で真核細胞を増産することができる。
5−1.懸濁方法
または、液体培養しておいた真核細胞から、遠心分離機を用いて集菌する。そして、それらの真核細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS(−))3mlに懸濁してもよい。
以上詳細に説明したように、本実施形態の真核細胞の増殖方法は、第1の体積照射量として3.0×1017cm-3以下のラジカルを真核細胞を含む懸濁液に照射することにより、真核細胞を増殖させる。
第3の実施形態について説明する。本実施形態では、第2の実施形態と同様に、懸濁液中の真核細胞にラジカルを照射する。第2の実施形態と異なる点について説明する。
図4に、真核細胞の細胞分裂の細胞周期を示す。真核細胞は、いずれも、図4に示す細胞周期により細胞分裂を引き起こす。すなわち、図4に示す細胞周期は、あらゆる真核細胞に共通の事象である。
ここで、本実施形態における真核細胞の増殖方法について説明する。本実施形態のラジカル照射工程では、第1の周期でラジカルを真核細胞に周期的に照射する。この第1の周期は、真核細胞の細胞周期におけるG1期に同調している。これにより、真核細胞がG1期にあるときに、ラジカルを真核細胞に照射することができる。後述するように、真核細胞のうち、G1期にあるものが増殖し、G1期にないものがわずかに減少する。その結果、全体としては、通常よりも早く、真核細胞が増殖する。
寒天培地において真核細胞を培養する。そして、寒天培地から真核細胞を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS(−))に懸濁する。このように、真核細胞を懸濁した懸濁液を作製する。
次に、プラズマ発生装置100からラジカルを懸濁液の真核細胞に向けて照射する。ここでは、第1の照射量以下の三重項酸素原子を真核細胞に照射する。第1の照射量は、懸濁液の容積に対して供給される三重項酸素原子の数である第1の体積照射量である。第1の体積照射量は、3.0×1017cm-3である。これにより、真核細胞は、増殖する。また、この照射に際して、一重項酸素分子も、真核細胞に照射される。
後述するように、真核細胞は、G1期に第1の照射量以下のラジカルを照射されると、増殖する。真核細胞は、G1期に第1の照射量より多い量のラジカルを照射されると、減少する。また、S期、M期では、真核細胞は、第1の照射量以下のラジカルを照射されると、わずかに減少する。
以上により説明した真核細胞の増殖方法を用いて、真核細胞を生産することができる。つまり、真核細胞の数を増加させて、短い時間で真核細胞を増産することができる。
以上詳細に説明したように、本実施形態の真核細胞の増殖方法では、真核細胞のG1期に合わせて周期的にラジカルを真核細胞に照射する。これにより、真核細胞を好適に増殖させることができる。
上記の実施形態で説明したように、ラジカルを照射することにより、真核生物を増殖させることができる。真核生物は、真核細胞を有する生物である。真核細胞は、動物細胞と、植物細胞と、を含む。
A−1.測定装置
ラジカルと真核細胞との関係について説明する前に、プラズマ発生装置100とそのプラズマ発生装置100から照射されるラジカルとの関係について説明する。図5は、本実験で用いたプラズマ発生装置300の概略構成を示す図である。本実験で用いるプラズマ発生装置300は、図1で説明したプラズマ発生装置100に、ラジカル等の中性粒子を測定する真空紫外吸収分光器350を付加したものである。なお、プラスチックカバー150については、図5では省略してある。また、既にプラズマ発生装置100で説明した構成については、記載を省略する。
ここで、実験で用いた条件について説明する。表1に示すように、放電部250のプラズマ発生領域で発生したプラズマの密度は、2×1016cm-3であった。そして、照射距離、すなわち、照射口211からサンプルまでの距離を10mmとした。そして、その照射距離における三重項酸素原子の密度は、2.25×1014cm-3であった。また、その照射距離におけるラジカルの流速は、10.4m/sであった。
プラズマ密度(発生領域) 2×1016cm-3
照射距離 10mm
三重項酸素原子の密度(照射領域) 2.25×1014cm-3
流速(照射領域) 10.4m/s
プラズマガス Ar+O2
総流量 5.0/min
O2 の含有率 0.6%
雰囲気ガス Arガス
図6は、スリット211からサンプルまでの照射距離と、三重項酸素原子の密度との関係を示すグラフである。図6に示すように、三重項酸素原子の密度は、照射距離が離れるにつれて、指数関数的に減少する。そして、スリット211からサンプルまでの照射距離が10mmのとき、三重項酸素原子の密度は、2.25×1014cm-3である。
図7の縦軸の他方は、D値である。D値については、後述する。三重項酸素原子の密度は、ラジカルの照射距離が大きくなるほど、指数関数的に減少する。一方、一重項酸素分子の密度は、ラジカルの照射距離が大きくなってもほぼ一定で変わらない。
以下、ラジカルと真核細胞との関係について説明する。
まず、サンプルの作製方法について説明する。直径90mmのシャーレに寒天培地を作成した。この寒天培地は、酵母エキス、ペプトン、ブドウ糖を含むものであった。そして、この寒天培地に、出芽酵母を培養した。出芽酵母は、真核細胞のうちの一つである。このように形成したコロニーを爪楊枝で取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS(−))3mlに懸濁した。培養した出芽酵母の菌の濃度は、1000000細胞/ml以上3000000細胞/ml以下の範囲内であった。
生菌率の変化量(%) = (N−N0 )/N0 × 100 ………(1)
N :ラジカルを照射したサンプルの生菌数
N0 :ラジカルを照射していないサンプルの生菌数
実験結果を図9に示す。図9の横軸は、サンプルにプラズマを照射した時間である。図9の縦軸は、その場合における式(1)の生菌率の変化量である。そして、例えば、生菌率の変化量が10%であった場合には、ラジカルを照射することで出芽酵母の菌数が10%増加したことを示唆している。
C−1.実験手順
実験条件は、実験Bで用いた実験条件とほぼ同じである。
図10は、プラズマの照射時間に対する酵母の生菌数を示すグラフである。図10の横軸は、ラジカルの照射時間である。図10の縦軸は、式(1)の生菌率の変化量である。ここでの、生菌率は、ラジカルを照射してから48時間経過後の生菌数から算出したものである。図10の領域L1は、酵母の生菌数が通常より多い場合を示す。領域L2は、酵母の生菌数が通常より少ない場合を示す。
D−1.実験手順
まず、酵母をYPD培地で培養した。その後、集菌し、出芽酵母をリン酸緩衝生理食塩水(PBS(−))3mlに懸濁した。酵母の培地に、α−factor、Hydroxyurea、Nocodazoleのそれぞれを処理した。α−factorを処理した酵母は、G1期のまま停止する。Hydroxyureaを処理した酵母は、S期のまま停止する。Nocodazoleを処理した酵母は、M期のまま停止する。これにより、G1期のみの酵母、S期のみの酵母、M期のみの酵母、を作製した。
実験結果を図13に示す。図13に示すように、G1期において、ラジカルを10秒照射した場合に、酵母は増殖した。その増加の割合は10%程度であった。G1期において、ラジカルを20秒照射した場合には、酵母は、減少した。ラジカルを照射しなかった場合に比べて、酵母の生菌数は、90%程度であった。G1期において、ラジカルを30秒照射した場合には、酵母は、減少した。ラジカルを照射しなかった場合に比べて、酵母の生菌数は、60%程度であった。
E−1.培養細胞
本実験では、動物の真核細胞を用いた。つまり、マウスの胎児皮膚細胞(NIH3T3)である。
まず、マウスの胎児皮膚細胞(NIH3T3)をディッシュ上に培養する。その細胞を集めてリン酸緩衝生理食塩水(PBS(−))3mlに懸濁した。プラスチックカバー150を用いて、周囲の大気の影響を排除した上で、プラズマを懸濁液に照射した。その後、遠心分離機で培養細胞を集めた後、血清入り培養液中でNIH3T3を培養した。そして、60時間経過後に、生存している細胞数を数えた。
図14は、三重項酸素原子ラジカルのドーズ量と、マウスの胎児皮膚細胞(NIH3T3)の細胞増殖率と、の関係を示すグラフである。図14に示すように、ラジカルの照射量が3.0×1017cm-3以下の範囲内では、NIH3T3細胞は、増殖する。ラジカルの照射量が3.0×1017cm-3より大きい場合には、上記の実験との整合性から、NIH3T3細胞は、減少するものと考えられる。
110…チャンバー
120…載置部
130…ガス供給部
140…ガス排出部
200…ラジカル照射部
210…照射口
211…スリット
250…放電部
260…中間構造部
270…ノズル部
Claims (6)
- ラジカルを真核細胞に照射するラジカル照射工程を有し、
前記ラジカル照射工程では、
ラジカルの照射量を予め定めた第1の照射量以下として、ラジカルを真核細胞に照射し、
真核細胞を増殖させること
を特徴とする真核細胞の増殖方法。 - 請求項1に記載の真核細胞の増殖方法において、
前記ラジカル照射工程では、
第1の周期でラジカルを真核細胞に周期的に照射すること
を特徴とする真核細胞の増殖方法。 - 請求項2に記載の真核細胞の増殖方法において、
前記第1の周期は、
真核細胞の細胞周期におけるG1期に同調していること
を特徴とする真核細胞の増殖方法。 - 請求項1から請求項3までのいずれか1項に記載の真核細胞の増殖方法において、
前記ラジカル照射工程では、
三重項酸素原子と一重項酸素分子との少なくとも一方を真核細胞に照射すること
を特徴とする真核細胞の増殖方法。 - 請求項1から請求項4までのいずれか1項に記載の真核細胞の増殖方法において、
前記真核細胞を懸濁した懸濁液を作製する懸濁液作製工程を有し、
前記ラジカル照射工程では、
前記懸濁液に三重項酸素原子を照射し、
前記第1の照射量は、
前記懸濁液の容積に対して供給される三重項酸素原子の数である第1の体積照射量であり、
前記第1の体積照射量は、
3.0×1017cm-3であること
を特徴とする真核細胞の増殖方法。 - 請求項1から請求項5までのいずれか1項に記載の真核細胞の増殖方法を用いて真核細胞の数を増加させること
を特徴とする真核細胞の生産方法。
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WO2011093497A1 (ja) * | 2010-01-31 | 2011-08-04 | 国立大学法人九州大学 | プラズマ酸化還元方法及びそれを用いた動植物成長促進方法、並びに動植物成長促進方法に用いるプラズマ生成装置 |
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