JP2016040540A - Specific determination of drebrin a and drebrin e - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ドレブリンＡ及びドレブリンＥを特異的に検出し定量する方法に関する。 The present invention relates to a method for specifically detecting and quantifying drebrin A and drebrin E.
ドレブリンは脳に多く存在するシナプスタンパク質であり、哺乳類では成熟型のＡタイプ（ドレブリンＡ）と幼弱型のＥタイプ（ドレブリンＥ）とが存在する。ドレブリンＡは成人の神経細胞に発現しており、その他の細胞腫には発現していない。
アルツハイマー病患者の死後脳を組織切片染色で病理診断するとドレブリンＡが著しく減少していることが分かっており、アミロイドベータオリゴマーを用いたin vitro実験でもドレブリンＡが減少することが報告されている。これらのことは、ドレブリンＡがアルツハイマー病に強く関与していることを示唆しており、ドレブリンはアルツハイマー病のメカニズムや診断マーカーへの利用などの研究対象となっている。
Drebrin is a synaptic protein that is abundant in the brain. In mammals, there are a mature A type (drebrin A) and a young E type (drebrin E). Drebrin A is expressed in adult neurons and not in other cell tumors.
Pathological diagnosis of postmortem brains of Alzheimer's disease patients by tissue section staining reveals that drebrin A is significantly reduced, and in vitro experiments using amyloid beta oligomers have also been reported to reduce drebrin A. These facts suggest that drebrin A is strongly involved in Alzheimer's disease, and drebrin is an object of research such as the mechanism of Alzheimer's disease and its use as a diagnostic marker.
これまでに、ドレブリンＡやドレブリンＥの検出には、上記の組織切片染色が用いられてきた。例えば、抗ドレブリンマウスモノクローナル抗体（Ｍ２Ｆ６）及び抗ドレブリンＡラビットポリクローナル抗体（ＤＡＳ２）を用いて蛍光二重染色法でそれぞれの画像を取得し、差分法によりドレブリンＡが存在せずドレブリンＥが存在する部分を定性的に示す方法が報告されている（非特許文献１）。
また、抗体を用いるウェスタンブロット法も用いられており、例えばＭ２Ｆ６及びＤＡＳ２を用いてドレブリンＡの発現を検出する方法が報告されている（非特許文献２）。また、Ｍ２Ｆ６を用いるウェスタンブロットにおいてドレブリンのバンドであって精製ドレブリンＥと同じ移動度を持つバンドのインテンシティを測定し、標準脳抽出物を用いて作成した標準曲線と比較し、任意単位でドレブリンＥを測定する方法もなされている（非特許文献３）。
So far, the above tissue section staining has been used for detection of drebrin A and drebrin E. For example, using the anti-drebrin mouse monoclonal antibody (M2F6) and the anti-drebrin A rabbit polyclonal antibody (DAS2), respective images are obtained by the fluorescent double staining method, and there is no drebrin A but drebrin E by the difference method. A method for qualitatively showing the portion has been reported (Non-Patent Document 1).
In addition, a Western blot method using an antibody is also used. For example, a method for detecting the expression of drebrin A using M2F6 and DAS2 has been reported (Non-patent Document 2). In addition, the intensity of a band of drebrin having the same mobility as purified drebrin E in a Western blot using M2F6 was measured, and compared with a standard curve prepared using a standard brain extract. A method for measuring E has also been made (Non-patent Document 3).
しかしながら、組織切片染色による病理診断は死後脳でしか行うことができない点や、抗体の非特異染色が生じる点、定量性が悪い点が問題となる。また、非特許文献１の蛍光二重染色法では、ドレブリンＡが存在する領域のドレブリンＥは検出できない点や、ＤＡＳ２陽性であるにもかかわらずＭ２Ｆ６陰性の領域が存在してドレブリンＥの量がマイナス値になる点が問題となる。
また、ウェスタンブロット法は、生体試料を対象とできる利点があるが、一度に解析できるサンプル数が少ない点、また定性的な検出の再現性は高い一方で定量的な解析の再現性は低い点に問題がある。また、非特許文献３の方法では、ドレブリンＥとドレブリンＡの分解産物を区別できないため、ドレブリンＥの量が過大に見積もられる場合があり、ドレブリンＥの定量法としては精度が低い。
However, there are problems in that pathological diagnosis by tissue section staining can be performed only in the postmortem brain, nonspecific staining of antibodies occurs, and the quantitativeness is poor. In addition, in the fluorescent double staining method of Non-Patent Document 1, drebrin E in the region where drebrin A is present cannot be detected, or there is a region that is M2F6-negative despite being DAS2-positive, and the amount of drebrin E is low. The point becomes a negative value.
In addition, Western blotting has the advantage of being able to target biological samples, but it has a small number of samples that can be analyzed at one time, and has high reproducibility of qualitative detection but low reproducibility of quantitative analysis. There is a problem. In addition, in the method of Non-Patent Document 3, since the degradation products of drebrin E and drebrin A cannot be distinguished, the amount of drebrin E may be overestimated, and the accuracy of the method for quantitative determination of drebrin E is low.
アルツハイマー病は認知症状が出てから問診などで診断されることが多いのが現状であるが、より早期に初期診断を行うことの需要がある。しかしながら、組織切片染色による病理診断は死後にしか行えず、ＣＴやＭＲＩ等の検査はスクリーニングに用いるには大が
かりすぎる。生体試料を対象としてin vitroでドレブリンを検出する方法を採用することが考えられるが、従来のウェスタンブロット法には上記の問題点がある。
係る状況に鑑みて、本発明は、高精度かつ簡便にドレブリンＡ及びドレブリンＥを検出・定量する方法を提供することを課題とする。
Alzheimer's disease is often diagnosed by interviews after cognitive symptoms occur, but there is a demand for early diagnosis early. However, pathological diagnosis by tissue section staining can be performed only after death, and examinations such as CT and MRI are too large for screening. Although it is conceivable to adopt a method for detecting drebrin in vitro in a biological sample, conventional Western blotting has the above-mentioned problems.
In view of such a situation, an object of the present invention is to provide a method for detecting and quantifying drebrin A and drebrin E with high accuracy and ease.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、抗ドレブリン抗体と抗ドレブリンＡ抗体とを組み合わせてＥＬＩＳＡ（Eyzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）
法を行うことにより、高精度かつ簡便に試料中のドレブリンＡ及びドレブリンＥを検出・定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have combined ELISA (Eyzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) with an anti-drebrin antibody and an anti-drebrin A antibody.
By performing this method, it was found that drebrin A and drebrin E in a sample can be detected and quantified with high accuracy and ease, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］検体中のドレブリンＡを定量する方法であって、固定化抗体及び一次抗体として抗ドレブリン抗体及び／又は抗ドレブリンＡ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を行うことを含み、固定化抗体と一次抗体との組み合わせが、次のａ）〜ｃ）の何れかである方法。
ａ）固定化抗体が抗ドレブリン抗体であり、一次抗体が抗ドレブリンＡ抗体である。
ｂ）固定化抗体が抗ドレブリンＡ抗体であり、一次抗体が抗ドレブリン抗体である。
ｃ）固定化抗体が抗ドレブリンＡ抗体であり、一次抗体が前記固定化抗体と異なる抗ドレブリンＡ抗体である。
［２］固定化抗体が抗ドレブリン抗体Ｍ２Ｆ６であり、一次抗体が抗ドレブリンＡ抗体がＤＡＳ２である、［１］に記載の方法。
［３］検体中のドレブリンＥを定量する方法であって、［１］又は［２］に記載の方法により前記検体中のドレブリンＡを定量する工程、固定化抗体として抗ドレブリン抗体を用い、一次抗体として前記固定化抗体と異なる抗ドレブリン抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を行うことを含む方法により前記検体中の総ドレブリンを定量する工程、及び定量された総ドレブリン量からドレブリンＡ量を減じる工程、を含む方法。
［４］前記総ドレブリンを定量する工程において、固定化抗体がＭ２Ｆ６であり、一次抗体がＲＤＥ１である、［３］に記載の方法。
［５］抗ドレブリン抗体及び抗ドレブリンＡ抗体を含む、ドレブリン定量用キット。
［６］アルツハイマー病の診断用である、［５］に記載のキット。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method for quantifying drebrin A in a sample, comprising performing ELISA using an anti-drebrin antibody and / or anti-drebrin A antibody as an immobilized antibody and a primary antibody, the immobilized antibody and the primary antibody And the combination is any one of the following a) to c).
a) The immobilized antibody is an anti-drebrin antibody and the primary antibody is an anti-drebrin A antibody.
b) The immobilized antibody is an anti-drebrin A antibody and the primary antibody is an anti-drebrin antibody.
c) The immobilized antibody is an anti-drebrin A antibody, and the primary antibody is an anti-drebrin A antibody different from the immobilized antibody.
[2] The method according to [1], wherein the immobilized antibody is anti-drebrin antibody M2F6 and the primary antibody is anti-drebrin A antibody DAS2.
[3] A method for quantifying drebrin E in a sample, the step of quantifying drebrin A in the sample by the method according to [1] or [2], using an anti-drebrin antibody as an immobilized antibody, A step of quantifying total drebrin in the specimen by an ELISA method using an anti-drebrin antibody different from the immobilized antibody as an antibody, and a step of subtracting the amount of drebrin A from the total amount of drebrin quantified Including methods.
[4] The method according to [3], wherein in the step of quantifying total drebrin, the immobilized antibody is M2F6 and the primary antibody is RDE1.
[5] A kit for quantifying drebrin, comprising an anti-drebrin antibody and an anti-drebrin A antibody.
[6] The kit according to [5], which is for diagnosis of Alzheimer's disease.
本発明により、高精度かつ簡便にドレブリンＡ又はドレブリンＥを検出・定量する方法が提供される。 The present invention provides a method for detecting and quantifying drebrin A or drebrin E with high accuracy and ease.
本発明の第一の態様は、検体中のドレブリンＡを定量する方法である。
本態様の方法は、固定化抗体及び一次抗体として抗ドレブリン抗体及び／又は抗ドレブリンＡ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を行うことを含む。ここで、固定化抗体と一次抗体との組み合わせは、次のａ）〜ｃ）の何れかである。
ａ）固定化抗体が抗ドレブリン抗体であり、一次抗体が抗ドレブリンＡ抗体である。
ｂ）固定化抗体が抗ドレブリンＡ抗体であり、一次抗体が抗ドレブリン抗体である。
ｃ）固定化抗体が抗ドレブリンＡ抗体であり、一次抗体が前記固定化抗体と異なる抗ド
レブリンＡ抗体である。
The first aspect of the present invention is a method for quantifying drebrin A in a specimen.
The method of this aspect includes performing ELISA using an anti-drebrin antibody and / or anti-drebrin A antibody as an immobilized antibody and a primary antibody. Here, the combination of the immobilized antibody and the primary antibody is one of the following a) to c).
a) The immobilized antibody is an anti-drebrin antibody and the primary antibody is an anti-drebrin A antibody.
b) The immobilized antibody is an anti-drebrin A antibody and the primary antibody is an anti-drebrin antibody.
c) The immobilized antibody is an anti-drebrin A antibody, and the primary antibody is an anti-drebrin A antibody different from the immobilized antibody.
本発明の第二の態様は、検体中のドレブリンＥを定量する方法である。
本態様の方法は、前記第一の態様の方法により検体中のドレブリンＡを定量する工程、固定化抗体として抗ドレブリン抗体を用い、一次抗体として前記固定化抗体と異なる抗ドレブリン抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を行うことを含む方法により前記検体中の総ドレブリン（ドレブリンＡ＋ドレブリンＥ）を定量する工程、及び定量された総ドレブリン量からドレブリンＡ量を減じる工程、を含む。
The second aspect of the present invention is a method for quantifying drebrin E in a specimen.
The method of this embodiment is a step of quantifying drebrin A in a specimen by the method of the first embodiment, using an anti-drebrin antibody as an immobilized antibody and using an anti-drebrin antibody different from the immobilized antibody as a primary antibody. Quantifying the total drebrin (drebrin A + drebrin E) in the sample by a method comprising performing a method, and subtracting the drebrin A amount from the quantified total drebrin amount.
本発明におけるＥＬＩＳＡ法は、当該分野に周知の手法を指す。すなわち、固相に固定化された固定化抗体に、測定対象物質であるドレブリン（ドレブリンＡ、又はドレブリンＡ＋ドレブリンＥ）を捕捉させ、さらに捕捉されたドレブリンに標識化された一次抗体を結合させて、ドレブリンに前記２種類の抗体が結合した免疫複合体を固相表面上に形成させた後、標識物質を検出する手法である。なお、標識化されていない一次抗体を用い、さらに一次抗体を認識する標識化二次抗体を用いて、検出感度を上げてもよい。
免疫複合体を形成させる順序は特に限定されない。固定化抗体に対して、ドレブリンを含む検体、一次抗体、二次抗体の順で添加して結合させてもよいし、まずドレブリンを含む検体と一次抗体とを混合して複合体を形成させたものを固定化抗体に対して添加して結合させてもよい。
The ELISA method in the present invention refers to a method well known in the art. That is, drebrin (drebrin A or drebrin A + drebrin E) as a measurement target substance is captured by an immobilized antibody immobilized on a solid phase, and further, a primary antibody labeled with the captured drebrin is bound. In this method, an immunocomplex in which the two types of antibodies are bound to drebrin is formed on a solid surface, and then a labeling substance is detected. The detection sensitivity may be increased by using an unlabeled primary antibody and further using a labeled secondary antibody that recognizes the primary antibody.
The order in which the immune complex is formed is not particularly limited. A sample containing drebrin, a primary antibody, and a secondary antibody may be added and bound to the immobilized antibody in this order, or a sample containing drebrin and the primary antibody are first mixed to form a complex. Those may be added to the immobilized antibody and allowed to bind.
本発明における固定化抗体及び一次抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよいが、安定した品質の抗体を安定して供給するためには、モノクローナル抗体であることが好ましい。
また、本発明における固定化抗体及び一次抗体には、抗体をペプシンやパパインのようなタンパク質分解酵素で分解し、測定対象物質である抗原に対する結合性を維持した、Ｆ（ａｂ'）2フラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆａｂフラグメントや、２本のＨ鎖同
士を結びつけているジスルフィド結合を還元して解離させて、１本のＨ鎖と１本のＬ鎖からなるフラグメントとしたものも含まれる。また、本発明における抗体には、単鎖抗体やその２量体（ダイアボディー）もしくは３量体（トリアボディー）、又はミニボディーも含まれる。
本発明における固定化抗体及び一次抗体としては、一般的に用いられているマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、トリ由来のもの等が使用できるがこれらに限定されず、ドレブリン又はドレブリンＡに特異的に結合する抗体であれば何れも使用できる。
The immobilized antibody and the primary antibody in the present invention may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. However, in order to stably supply a stable quality antibody, it is preferably a monoclonal antibody.
Further, the immobilized antibody and the primary antibody in the present invention include an F (ab ′) 2 fragment obtained by degrading an antibody with a proteolytic enzyme such as pepsin or papain and maintaining the binding property to the antigen to be measured. Also included are Fab ′ fragments, Fab fragments, and fragments composed of one H chain and one L chain by reducing and dissociating disulfide bonds connecting two H chains. The antibody in the present invention also includes a single chain antibody, a dimer (diabody) or a trimer (triabody), or a minibody.
As the immobilized antibody and the primary antibody in the present invention, generally used mouse, rat, rabbit, goat, sheep, bird-derived and the like can be used, but are not limited thereto, and are specific to drebrin or drebrin A. Any antibody can be used as long as it binds sterically.
本発明における固定化抗体及び一次抗体は、ドレブリン又はドレブリンＡに対する結合に際して互いに競合しない関係であることが好ましい。ドレブリン又はドレブリンＡに対する結合に際して互いに競合しない関係とは、固定化抗体及び一次抗体がそれぞれドレブリン又はドレブリンＡの異なるエピトープ（抗原決定基）に結合する関係や、固定化抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体で一次抗体がポリクローナル抗体であって、一次抗体は固定化抗体と同一のエピトープに結合する抗体を含むが、異なるエピトープに結合する抗体も含む関係をいう。 The immobilized antibody and the primary antibody in the present invention preferably have a relationship that does not compete with each other for binding to drebrin or drebrin A. The relationship that does not compete with each other when binding to drebrin or drebrin A is the relationship in which the immobilized antibody and the primary antibody bind to different epitopes (antigenic determinants) of drebrin or drebrin A, respectively, or the immobilized antibody is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. The primary antibody is a polyclonal antibody, and the primary antibody includes an antibody that binds to the same epitope as the immobilized antibody, but also includes an antibody that binds to a different epitope.
本発明において「抗ドレブリン抗体」は、ドレブリンをサブタイプの区別なく認識することができる、すなわちドレブリンＡ及びドレブリンＥの両方を認識できる抗体である。抗ドレブリン抗体としては、例えば、抗ドレブリンマウスモノクローナル抗体（例えば、本発明者らが作製したＭ２Ｆ６；Dev. Brain Res., 29: 233-244, (1986)）、抗ドレブリンラビットポリクローナル抗体（例えば、本発明者らが作製したＲＤＥ１； J. Biol. Chem., 269: 29928-29933, (1994)）等が挙げられる。
本発明において「抗ドレブリンＡ抗体」は、ドレブリンＡを特異的に認識できる抗体である。抗ドレブリンＡ抗体としては、抗ドレブリンＡラビットポリクローナル抗体（例え
ば、本発明者らが作製したＤＡＳ２；J. Comp. Neurol., 483: 383-402, (2005)）、抗ドレブリンＡラットモノクローナル抗体等が挙げられる。
In the present invention, an “anti-drebrin antibody” is an antibody that can recognize drebrin without distinction of subtypes, that is, can recognize both drebrin A and drebrin E. Examples of anti-drebrin antibodies include anti-drebrin mouse monoclonal antibodies (for example, M2F6 produced by the present inventors; Dev. Brain Res., 29: 233-244, (1986)), anti-drebrin rabbit polyclonal antibodies (for example, RDE1 prepared by the present inventors; J. Biol. Chem., 269: 29928-29933, (1994)) and the like.
In the present invention, the “anti-drebrin A antibody” is an antibody that can specifically recognize drebrin A. Examples of the anti-drebrin A antibody include an anti-drebrin A rabbit polyclonal antibody (for example, DAS2 prepared by the present inventors; J. Comp. Neurol., 483: 383-402, (2005)), anti-drebrin A rat monoclonal antibody, etc. Is mentioned.
本発明に係るドレブリンＡを定量する方法においては、ａ）固定化抗体が抗ドレブリン抗体であり、一次抗体が抗ドレブリンＡ抗体である組み合わせが好ましく、固定化抗体がＭ２Ｆ６であり、一次抗体がＤＡＳ２である組み合わせがより好ましい。また、検体中のドレブリンＥの量がドレブリンＡの量と同じかそれ以上の場合は、ドレブリンＡのみかけの量が少なくなるのを避けるため、ｂ）固定化抗体が抗ドレブリンＡ抗体であり、一次抗体が抗ドレブリン抗体である組み合わせが好ましい。
本発明に係る総ドレブリンを定量する方法においては、固定化抗体がＭ２Ｆ６であり、一次抗体がＲＤＥ１である組み合わせが好ましい。
本発明に係るドレブリンＥを定量する方法においては、ドレブリンＡを定量する方法の工程と総ドレブリンを定量する方法の工程とで、用いる固定化抗体及び一次抗体の何れかが共通することが、検出精度の観点から好ましい。例えば、両工程とも固定化抗体にＭ２Ｆ６を用いることや、両工程とも一次抗体にＲＤＥ１を用いること等が好ましく挙げられる。
In the method for quantifying drebrin A according to the present invention, a) a combination in which the immobilized antibody is an anti-drebrin antibody, the primary antibody is an anti-drebrin A antibody is preferred, the immobilized antibody is M2F6, and the primary antibody is DAS2. The combination which is is more preferable. In addition, when the amount of drebrin E in the sample is equal to or greater than the amount of drebrin A, in order to avoid a decrease in the apparent amount of drebrin A, b) the immobilized antibody is an anti-drebrin A antibody, A combination in which the primary antibody is an anti-drebrin antibody is preferred.
In the method for quantifying total drebrin according to the present invention, a combination in which the immobilized antibody is M2F6 and the primary antibody is RDE1 is preferable.
In the method for quantifying drebrin E according to the present invention, it is detected that either the immobilized antibody or the primary antibody to be used is common in the method for quantifying drebrin A and the method for quantifying total drebrin. It is preferable from the viewpoint of accuracy. For example, it is preferable to use M2F6 as an immobilized antibody in both steps, or to use RDE1 as a primary antibody in both steps.
本発明において標識化二次抗体を用いる場合は、一次抗体を認識するものであれば特に限定されず使用できる。例えば、一次抗体がラビット抗体である場合は標識化抗ラビットＩｇＧ抗体を、一次抗体がマウス抗体である場合は標識化抗マウスＩｇＧ抗体を、二次抗体として用いることができる。 In the present invention, when a labeled secondary antibody is used, it can be used without any particular limitation as long as it recognizes the primary antibody. For example, when the primary antibody is a rabbit antibody, a labeled anti-rabbit IgG antibody can be used as the secondary antibody, and when the primary antibody is a mouse antibody, a labeled anti-mouse IgG antibody can be used as the secondary antibody.
本発明に用いられる標識物質としては、酵素、放射線同位元素、蛍光物質、発光物質、金コロイド等が挙げられる。
これらのうち、感度及び操作の簡便さの観点から酵素が好ましく、西洋わさび過酸化酵素（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等がより好ましい。標識物質としてＨＲＰを用いる場合はＴＭＢ（３, ３’, ５, ５’−テトラメチルベンジジン）等を、ＡＰを用いる場合はＡＭＰＰＤ（３−（２'−スピロア
ダマンタン）−４−メトキシ−４−（３''−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩）、９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン二ナトリウム塩等を基質として使用することができる。
また、標識物質としては、他にＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃ
ｙａｎａｔｅ）、ローダミン等の蛍光色素等も使用することができる。
Examples of the labeling substance used in the present invention include enzymes, radioisotopes, fluorescent substances, luminescent substances, and gold colloids.
Among these, an enzyme is preferable from the viewpoint of sensitivity and ease of operation, and horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP), glucose oxidase (GOD), and the like are more preferable. When HRP is used as the labeling substance, TMB (3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine) or the like is used. When AP is used, AMPPD (3- (2′-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3 ″ -phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane disodium salt), 9- (4-chlorophenylthiophosphoryloxymethylidene) -10-methylacridan disodium salt and the like can be used as a substrate. it can.
Other labeling substances include FITC (fluorescein isothioc).
and fluorescent dyes such as rhodamine can also be used.
測定対象物質の検出・定量方法は、標識の方法によって異なり、当業者に周知慣用の方法で行うことができ、特に限定されない。
例えば、標識物質としてＨＲＰ、ＡＰ、ＧＯＤ等を用いた場合は、発色基質や発光基質を添加することで、吸光度や発光強度の変化を測定して測定対象物質を定量することができる。また、標識物質として蛍光物質を用いた場合は、その蛍光強度を測定することで測定対象物質を定量することができる。また、標識物質として放射性同位元素を用いた場合は、放射能を測定することで測定対象物質を定量することができる。また、標識物質として金コロイドを用いた場合は、吸光度を測定することで測定対象物質を定量することができる。
定量の際は、例えば、予め既知の濃度の試料で検量線（標準曲線）を作成しておき、測定値を検量線に照合して試料中のドレブリン濃度を算出することができる。
The method for detecting and quantifying the substance to be measured differs depending on the labeling method, and can be carried out by a method well known to those skilled in the art and is not particularly limited.
For example, when HRP, AP, GOD, or the like is used as a labeling substance, the measurement target substance can be quantified by adding a chromogenic substrate or a luminescent substrate to measure changes in absorbance or luminescence intensity. When a fluorescent substance is used as the labeling substance, the measurement target substance can be quantified by measuring the fluorescence intensity. When a radioisotope is used as the labeling substance, the substance to be measured can be quantified by measuring the radioactivity. When gold colloid is used as the labeling substance, the substance to be measured can be quantified by measuring the absorbance.
At the time of quantification, for example, a calibration curve (standard curve) is prepared in advance with a sample with a known concentration, and the concentration of drebrin in the sample can be calculated by comparing the measured value with the calibration curve.
固定化抗体を固定化する固相としては、通常ＥＬＩＳＡに用いられるものであれば特に限定されず、その形態はマルチウェルプレート、シャーレ、微粒子等が挙げられ、またその素材はポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、磁性素材等が挙げられる。
本発明において固定化抗体の固相への固定化量は、抗体−抗原反応及び標識物質の検出
を妨げない限り、また検体中のドレブリン量に対して過度に少なくない限り、特に限定されない。例えば、固相の単位面積当たりの固定化抗体量が３０〜３００μｇ/ｃｍ2になることが好ましい。また、固相の素材によるが、例えばポリスチレン製の固相に直接固定化する場合、１００ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ/ｍＬ未満の濃度の固定化抗体溶液を用いて固定
化することが好ましい。
固定化抗体の固相への固定化後は非特異吸着を防ぐため、アルブミン、カゼイン等で適宜ブロッキングしてもよい。
The solid phase for immobilizing the immobilized antibody is not particularly limited as long as it is usually used for ELISA, and its form includes multiwell plates, petri dishes, fine particles, etc., and the materials thereof are polyethylene, polystyrene, polypropylene And magnetic materials.
In the present invention, the amount of the immobilized antibody immobilized on the solid phase is not particularly limited as long as the antibody-antigen reaction and the detection of the labeling substance are not hindered and are not excessively small relative to the amount of drebrin in the sample. For example, the amount of immobilized antibody per unit area of the solid phase is preferably 30 to 300 μg / cm 2 . Moreover, although it depends on the material of the solid phase, for example, when directly immobilizing on a solid phase made of polystyrene, it is preferable to immobilize using an immobilized antibody solution having a concentration of 100 ng / mL or more and less than 1 μg / mL.
After immobilization of the immobilized antibody on the solid phase, it may be appropriately blocked with albumin, casein or the like in order to prevent nonspecific adsorption.
本発明に用いる一次抗体溶液の濃度は、抗原−抗体反応を妨げない限り、また検体中のドレブリン量に対して過度に少なくない限り特に限定されない。例えば、一次抗体としてＤＡＳ２を用いる場合の濃度は、０．４μｇ／ｍＬ以上であることが好ましい。 The concentration of the primary antibody solution used in the present invention is not particularly limited as long as it does not interfere with the antigen-antibody reaction and is not excessively small relative to the amount of drebrin in the sample. For example, the concentration when DAS2 is used as the primary antibody is preferably 0.4 μg / mL or more.
本発明において、抗原−抗体反応を行う時間、本発明の方法を行う温度、試料や試薬の希釈液及び洗浄液の組成やｐＨ等は特に限定されず、一般的に行われるＥＬＩＳＡ法に適用する条件でよい。
抗原−抗体反応（固定化抗体と測定対象物質との結合、測定対象物質と一次抗体との結合、又は一次抗体と二次抗体との結合）を行う時間は、特に限定されないが、通常３０分間以上１８０分間以内が好ましく、１２０分間以内がより好ましい。
本発明の方法を行う温度は、２５〜４０℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
希釈液及び洗浄液は、抗原−抗体反応や標識物質の検出反応の妨げにならない限り特に限定されない。例えば、ＰＢＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＰＢＳ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等が挙げられ、これらのバッファーに塩や、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ等の非イオン性の界面活性剤を加えたもの、またアルブミンやカゼイン等を添加したものを用いることもできる。
本発明の方法は、用手法で行うこともできるし、自動分析機で行うこともできる。
In the present invention, the time for carrying out the antigen-antibody reaction, the temperature at which the method of the present invention is carried out, the composition and pH of the diluted solution and washing solution of the sample and reagent, etc. are not particularly limited, It's okay.
The time for performing the antigen-antibody reaction (binding between the immobilized antibody and the measurement target substance, binding between the measurement target substance and the primary antibody, or binding between the primary antibody and the secondary antibody) is not particularly limited, but usually 30 minutes It is preferably within 180 minutes, more preferably within 120 minutes.
The temperature for performing the method of the present invention is preferably 25 to 40 ° C, more preferably 30 to 37 ° C.
The diluting solution and the washing solution are not particularly limited as long as they do not interfere with the antigen-antibody reaction or the labeling substance detection reaction. For example, PBS buffer solution, Tris buffer solution, PBS-Tris buffer solution, PIPES buffer solution and the like, and those obtained by adding salts, nonionic surfactants such as Tween and Triton to these buffers, and albumin And those added with casein or the like can also be used.
The method of the present invention can be carried out by a conventional method or by an automatic analyzer.
本発明の方法において、検体は特に限定されず、好ましくは生体試料である。生体試料としては、脳組織からの生検、脊髄液、血液、血漿、血清、リンパ液、尿等が挙げられるがこれらに限定されず、ドレブリンが含まれ得る検体であれば検体に含まれる。また、本発明の方法に供する前に、検体に対して希釈や夾雑物の除去等の前処理を適宜行ってもよい。
検体の由来は特に限定されないが、動物が好ましく、哺乳動物がより好ましく、ヒトが特に好ましい。
本発明の方法により検出・測定ができるドレブリン濃度は、通常、総ドレブリン量として１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬであり、少量のドレブリン含有試料からも高い感度でドレブリンを検出できる。
In the method of the present invention, the specimen is not particularly limited, and is preferably a biological sample. Biological samples include, but are not limited to, biopsy from brain tissue, spinal fluid, blood, plasma, serum, lymph, urine, and the like, and any sample that can contain drebrin is included in the sample. In addition, before being subjected to the method of the present invention, pretreatment such as dilution and removal of impurities may be appropriately performed on the specimen.
The origin of the specimen is not particularly limited, but animals are preferred, mammals are more preferred, and humans are particularly preferred.
The concentration of drebrin that can be detected and measured by the method of the present invention is usually 1 ng / mL or more and 10 μg / mL as the total drebrin amount, and it can be detected with high sensitivity even from a small amount of drebrin-containing sample.
本発明の第三の態様は、ドレブリンを定量するためのキットであり、該キットは抗ドレブリン抗体及び抗ドレブリンＡ抗体を含む。抗ドレブリン抗体及び抗ドレブリンＡ抗体に関する詳細な説明は、前述の本発明の方法における説明に準じる。
本発明のキットには、他に標識化二次抗体、標識が酵素である場合その基質、ＢＳＡ等のブロッキング剤等の試薬を含めることもできる。
本発明に係るキットは、本発明のドレブリンＡ又はドレブリンＥの定量方法に好ましく用いることができる。すなわち、キットに含まれる抗ドレブリン抗体及び抗ドレブリンＡ抗体を適切に組み合わせてＥＬＩＳＡを行うことにより、検体中のドレブリンＡ及びドレブリンＥを高精度かつ簡便に検出し定量することができる。
A third aspect of the present invention is a kit for quantifying drebrin, which kit includes an anti-drebrin antibody and an anti-drebrin A antibody. The detailed description regarding the anti-drebrin antibody and the anti-drebrin A antibody is in accordance with the description in the method of the present invention described above.
The kit of the present invention may also contain a labeled secondary antibody, a substrate when the label is an enzyme, and a reagent such as a blocking agent such as BSA.
The kit according to the present invention can be preferably used in the method for quantifying drebrin A or drebrin E of the present invention. That is, by performing an ELISA by appropriately combining the anti-drebrin antibody and anti-drebrin A antibody included in the kit, drebrin A and drebrin E in the sample can be detected and quantified with high accuracy and ease.
本発明に係る方法及びキットは、生体試料を含む検体中のドレブリンＡ及びドレブリンＥを高精度かつ簡便に検出し定量することができるため、ドレブリンＡが減少する疾患、例えばアルツハイマー病の診断（特に初期診断）に適用することができる。
また、中枢神経系の研究において、本発明の方法で測定したドレブリンＡのシナプスへの集積度を指標として、ＮＭＤＡ（N-methyl-D-aspartate）型受容体活性の評価にも適用することもできる。
また、未熟なシナプスにはドレブリンＥが集積し、成熟シナプスにはドレブリンＡが集積する。従来、シナプスの成熟度を評価するには非常に高度な技術を要する電気生理学的手法が用いられていたが、本発明の方法で各ドレブリンを定量することにより簡便に評価できる。
Since the method and kit according to the present invention can detect and quantify drebrin A and drebrin E in a specimen including a biological sample with high accuracy and simplicity, diagnosis of a disease in which drebrin A decreases, such as Alzheimer's disease (particularly, It can be applied to (initial diagnosis).
In addition, in the study of the central nervous system, it can be applied to the evaluation of NMDA (N-methyl-D-aspartate) type receptor activity using the degree of accumulation of drebrin A measured by the method of the present invention as an index. it can.
In addition, drebrin E accumulates in immature synapses, and drebrin A accumulates in mature synapses. Conventionally, an electrophysiological technique requiring a very advanced technique has been used to evaluate the maturity of synapses. However, it can be easily evaluated by quantifying each drebrin by the method of the present invention.
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention still in detail, this invention is not limited to a following example, unless the summary is exceeded.
＜参考例＞ 精製リコンビナントドレブリンの作製
実施例１〜３に用いた精製リコンビナントドレブリンＡ及びＥを、Biochem Biophys Res Commun., 359, 398-401, (2007)を参照して、以下の手順で作製した。
ラットドレブリンＡ又はＥのｃＤＮＡを、ｐＥＴ１９ｂベクター（Novagen社製）のＮ
ｄｅＩ/ＢａｍＨＩサイトにサブクローニングした。そのクローニングベクターを大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３） ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ ＲＰ（Stratagene社製）に導入して、３７℃
で吸光度０．５（ＯＤ600）まで培養を行い、ＩＰＴＧ（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を１ ｍＭの濃度で加えて、さらに２８℃で３時間培養した。遠心分離器を用いて集菌してから、細胞塊を抽出バッファー（３００ ｍＭ ＮａＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＰｉバッファー（ｐＨ ７．０）、１０％グリセロール、１％ ＮＰ−４０）でソニケーションを行った後、１時間遠心分離を行った（１００，０００ｇ 、4℃）。その上清を５分間ボイルした後、２０分間遠心分離を行った（１０，０００ｇ 、4℃）。その上清を硫酸アンモニウム分画し、０〜２０ ｇ／１００ｍＬの分画を回収し、一晩透析（１００ ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）を行った。透析サンプルを、液体クロマトグラフィー及びＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＤＥＡＥ−６５０Ｓ（Tosoh社製）を用いて、バッファー（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ ｍＭ ＤＴＴ）にＮａＣｌ濃度１
００〜１０００ ｍＭのグラジエントをかけて溶出を行った。ドレブリンの多い分画を集
めて、さらにＳｕｐｅｒｒｏｓｅ ６ ｃｏｌｕｍｎを用いてゲルろ過（バッファー：１００ ｍＭ ＫＣｌ、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）を行った。ドレブリン画分
は、分子量３０，０００のフィルターで濃縮し、精製リコンビナントドレブリンＡ又はＥとした。
<Reference Example> Production of purified recombinant drebrin Purified recombinant drebrin A and E used in Examples 1 to 3 were produced by the following procedure with reference to Biochem Biophys Res Commun., 359, 398-401, (2007). did.
Rat drebrin A or E cDNA was transferred to N of pET19b vector (Novagen).
Subcloned into the deI / BamHI site. The cloning vector was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) codon plus RP (Stratagene),
The mixture was cultured to an absorbance of 0.5 (OD 600 ), IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) was added at a concentration of 1 mM, and further cultured at 28 ° C. for 3 hours. After collecting cells using a centrifuge, the cell mass was sonicated with an extraction buffer (300 mM NaCl, 50 mM NaPi buffer (pH 7.0), 10% glycerol, 1% NP-40). Centrifugation was performed for 1 hour (100,000 g, 4 ° C.). The supernatant was boiled for 5 minutes and then centrifuged for 20 minutes (10,000 g, 4 ° C.). The supernatant was fractionated with ammonium sulfate, and a fraction of 0 to 20 g / 100 mL was collected and dialyzed overnight (100 mM K
Cl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5). The dialysis sample was prepared by using liquid chromatography and TOYOPARAL DEAE-650S (Tosoh), in a buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM DTT) with a NaCl concentration of 1
Elution was performed with a gradient of 00 to 1000 mM. Fractions rich in drebrin were collected, and gel filtration (buffer: 100 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5) was performed using Superrose 6 column. The drebrin fraction was concentrated with a filter having a molecular weight of 30,000 to obtain purified recombinant drebrin A or E.
＜実施例１＞ ドレブリンＡの検出
固定化抗体としてＭ２Ｆ６を、一次抗体としてＤＡＳ２を用いて、以下の手順でＥＬＩＳＡを行った。
Ｍ２Ｆ６（医学生物学研究所ＭＢＬ、名古屋より入手）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解して１μｇ／ｍＬに調製し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加し、一晩静置した後、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で洗浄した。そこにブロッキング溶液（５重量％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ）を１００μＬずつ添加し、６０分間静置した後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。精製リコンビナントドレブリンＥ（ＤＥ）、精製リコンビナントドレブリンＡ（ＤＡ）、及び精製リコンビナントドレブリンＥと精製リコンビナントドレブリンＡの１：１（重量比）混合（ＤＥ＋ＤＡ）サンプル溶液を、それぞれＰＢＳで調製した。各サンプル溶液を、総ドレブリン量として０．１〜１０００ｎｇ/ｍＬずつ各ウェルに添加し、１２０分間静置した後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ＤＡＳ２
（免疫生物研究所ＩＢＬ、藤岡より入手）を０．１重量％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔに溶解して０．４μｇ/ｍＬに調製し、各ウェルに１００μＬずつ添加し、１２０分間静置した後、
ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。そこに、ＨＲＰ−抗ラビットＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア＃ＮＡ９３４）の１／１０００希釈溶液（０．１重量％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ）を１００μＬずつ
添加し、６０分間静置した後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。そこにＴＭＢ溶液（ＴＭＢ＜０．０５％（ｗ/ｖ）、SurModics社製）を１００μＬずつ添加し、２０分後に１Ｎ塩酸で反応停止させた。マイクロプレートリーダーで、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果を図１に示す。ＤＡサンプル溶液は検出・定量でき、ＤＥサンプル溶液は検出されなかった。また、ＤＥ＋ＤＡの混合サンプル溶液においても、ＤＡのみが検出・定量できた。
<Example 1> Detection of drebrin A ELISA was performed by the following procedure using M2F6 as an immobilized antibody and DAS2 as a primary antibody.
M2F6 (Medical and Biological Laboratories MBL, obtained from Nagoya) was dissolved in PBS (pH 7.4) to prepare 1 μg / mL, and 100 μL was added to each well of a 96-well microplate and allowed to stand overnight. And washed with PBS-T (0.05 wt% Tween 20 / PBS). 100 μL of blocking solution (5 wt% BSA / PBS-T) was added thereto, left still for 60 minutes, and washed with PBS-T. Purified recombinant drebrin E (DE), purified recombinant drebrin A (DA), and purified recombinant drebrin E and purified recombinant drebrin A in a 1: 1 (weight ratio) mixed (DE + DA) sample solution were each prepared in PBS. Each sample solution was added to each well as a total drebrin amount of 0.1 to 1000 ng / mL, allowed to stand for 120 minutes, and then washed with PBS-T. DAS2
(Immuno-Biological Laboratories IBL, obtained from Fujioka) was dissolved in 0.1 wt% BSA / PBS-T to prepare 0.4 μg / mL, 100 μL was added to each well and allowed to stand for 120 minutes.
Washed with PBS-T. Thereto, 100 μL each of a 1/1000 diluted solution (0.1 wt% BSA / PBS-T) of HRP-anti-rabbit IgG antibody (GE Healthcare # NA934) was added and allowed to stand for 60 minutes, then PBS-T Washed with. Thereto, 100 μL of TMB solution (TMB <0.05% (w / v), manufactured by SurModics) was added, and the reaction was stopped with 1N hydrochloric acid after 20 minutes. Absorbance at a wavelength of 450 nm was measured with a microplate reader.
The results are shown in FIG. The DA sample solution could be detected and quantified, and the DE sample solution was not detected. In addition, only DA could be detected and quantified in the mixed sample solution of DE + DA.
＜実施例２＞ 総ドレブリンの検出
固定化抗体としてＭ２Ｆ６を、一次抗体として ＲＤＥ１（J. Biol. Chem., 269: 29928-29933, (1994)に基づき作製、１／５０００希釈）を用いた他は、実施例１と同様の手
順でＥＬＩＳＡを行った。
結果を図２に示す。ＤＡ、ＤＥ、及びＤＥ＋ＤＡサンプル溶液のいずれにおいても、総ドレブリンが検出・定量できた。実施例１及び２で共通して用いたＤＥ＋ＤＡサンプル溶液において、実施例２の測定値から実施例１の測定値を減じることにより、同サンプル中のＤＥ量を算出することができる。
<Example 2> Detection of total drebrin Other than using M2F6 as an immobilized antibody and RDE1 (prepared based on J. Biol. Chem., 269: 29928-29933, (1994), diluted 1/5000) as a primary antibody The ELISA was performed in the same procedure as in Example 1.
The results are shown in FIG. Total drebrin could be detected and quantified in any of the DA, DE, and DE + DA sample solutions. In the DE + DA sample solution commonly used in Examples 1 and 2, the amount of DE in the sample can be calculated by subtracting the measured value of Example 1 from the measured value of Example 2.
＜実施例３＞ ドレブリンＥの定量
標準溶液として精製ドレブリンＥ溶液（０．１〜１０００ｎｍ／ｍＬ）を用いて、実施例２と同様の手順でＥＬＩＳＡを行い、標準曲線を作成した（図３）。次いで、マウス胎児脳の大脳皮質（１ｍｇ／ｍＬ）を検体として、同様にＥＬＩＳＡを行った。なお、マウス胎児ではドレブリンＥのみが発現している。検体のＥＬＩＳＡで得られた吸光度（０．６３３２５）を標準曲線に照合し、検体中のドレブリンＥ濃度２４５ｎｇ／ｍＬを算出した。
<Example 3> Quantification of drebrin E Using a purified drebrin E solution (0.1 to 1000 nm / mL) as a standard solution, ELISA was performed in the same procedure as in Example 2 to create a standard curve (FIG. 3). . Next, ELISA was similarly performed using mouse fetal brain cerebral cortex (1 mg / mL) as a specimen. Note that only drebrin E is expressed in mouse fetuses. The absorbance (0.63325) obtained by ELISA of the specimen was collated with a standard curve, and the concentration of drebrin E in the specimen was calculated to be 245 ng / mL.
本発明により、高精度かつ簡便にドレブリンＡ又はドレブリンＥを検出・定量する方法が提供されるため、アルツハイマー病の初期診断等への適用が期待でき、産業上非常に有用である。 Since the present invention provides a method for detecting and quantifying drebrin A or drebrin E with high accuracy and ease, it can be expected to be applied to early diagnosis of Alzheimer's disease and the like, which is very useful industrially.
Claims (6)
固定化抗体及び一次抗体として抗ドレブリン抗体及び／又は抗ドレブリンＡ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を行うことを含み、
固定化抗体と一次抗体との組み合わせが、次のａ）〜ｃ）の何れかである方法。
ａ）固定化抗体が抗ドレブリン抗体であり、一次抗体が抗ドレブリンＡ抗体である。
ｂ）固定化抗体が抗ドレブリンＡ抗体であり、一次抗体が抗ドレブリン抗体である。
ｃ）固定化抗体が抗ドレブリンＡ抗体であり、一次抗体が前記固定化抗体と異なる抗ドレブリンＡ抗体である。 A method for quantifying drebrin A in a sample, comprising:
Performing an ELISA method using an anti-drebrin antibody and / or an anti-drebrin A antibody as an immobilized antibody and a primary antibody,
The method in which the combination of the immobilized antibody and the primary antibody is any of the following a) to c).
a) The immobilized antibody is an anti-drebrin antibody and the primary antibody is an anti-drebrin A antibody.
b) The immobilized antibody is an anti-drebrin A antibody and the primary antibody is an anti-drebrin antibody.
c) The immobilized antibody is an anti-drebrin A antibody, and the primary antibody is an anti-drebrin A antibody different from the immobilized antibody.
請求項１又は２に記載の方法により前記検体中のドレブリンＡを定量する工程、
固定化抗体として抗ドレブリン抗体を用い、一次抗体として前記固定化抗体と異なる抗ドレブリン抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を行うことを含む方法により前記検体中の総ドレブリンを定量する工程、及び
定量された総ドレブリン量からドレブリンＡ量を減じる工程、を含む方法。 A method for quantifying drebrin E in a sample,
Quantifying drebrin A in the specimen by the method according to claim 1 or 2,
Quantifying total drebrin in the specimen by a method comprising performing an ELISA method using an anti-drebrin antibody as an immobilized antibody and an anti-drebrin antibody different from the immobilized antibody as a primary antibody; Reducing the amount of drebrin A from the amount of drebrin.
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