JP2016028595A

JP2016028595A - 腸内腐敗物質の低減作用を有するビフィズス菌

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Publication number: JP2016028595A
Application number: JP2015197460A
Authority: JP
Inventors: 公子天藤; Kimiko Amafuji
Original assignee: Meiji Co Ltd
Current assignee: Meiji Co Ltd
Priority date: 2010-07-05
Filing date: 2015-10-05
Publication date: 2016-03-03
Anticipated expiration: 2031-07-05
Also published as: CN102959075B; HK1183058A1; CN105671120A; CN105671120B; CN102959075A; JP6096263B2; HK1221748A1; WO2012005240A1; JPWO2012005240A1; JP5837879B2

Abstract

【課題】安全性の高い有用な微生物を有効利用して、腸内腐敗物質を効果的に低減することを第１の課題としている。【解決手段】本願発明者は、一般的にヒトの生体内（腸内）で優勢とされるビフィズス菌に着目して、スクリーニングし、インドールの低減作用が強く、血清中のインドキシル硫酸の低減作用も確認された菌株を選抜し、本願発明を完成させた。【選択図】なし

Description

本願発明は、腸内細菌の状態の改善方法に関する。より具体的には、腸内細菌による腐敗臭の原因であるインドール系化合物を低減する有用微生物の選抜及び当該選抜された微生物に関する。

食生活の乱れ、生活の不規則、ストレスなどから、便秘や下痢を繰り返したり、お腹が張る、ガスが出るなどの症状を訴えるヒトが増えている。これら症状は、腸内環境に影響される、言い換えれば、腸内細菌叢（フローラ）で腐敗菌が優勢となることが原因にあると考えられている。そして、腸内細菌叢は、嫌気性の条件下で、トリプトファンからインドールやその誘導体などの腐敗臭成分を生産する。このような腸内細菌叢と腐敗産物の産生との関係について幾つか研究されている（非特許文献１）。

また、インドールは、腸内腐敗菌によりトリプトファンから生産され、腸管から吸収された後に、肝臓においてインドキシルに代謝され、さらに硫酸と結合して、インドキシル硫酸になると考えられている。健康なヒトでは、インドキシル硫酸を尿中に排泄するが、透析患者などでは、尿毒症などの合併症の原因となると考えられている（非特許文献２）。

腸内の有害物質であるインドールなどの除去について、例えば、特許文献１では、インドール減少能を有するビフィドバクテイルム／サーモフィラムを使用している。また、特許文献２には、サラシア植物の抽出物又は微粉砕物を、乳酸菌及び／又はビフィズス菌と併用して、腸内環境を改善することが記載されている。さらに、特許文献３には、プロピオン酸菌を含有する組成物により、腸管内のビフィドバクテリウムの成長を促進し、悪臭ガスの放出を防ぐことが記載されている。また、イヌリンやオリゴ糖が腸内細菌叢の改善に役立つことが報告されている（非特許文献３）。

特開2006-158216 特開2007-031345 特開2007-186529

腸内細菌学雑誌第19巻 169-177頁（2005）透析会誌 24巻 3号 312-316頁（1991） The Journal of Nutrition 129 （7Suppl）: 1438S-1441S （1999）

ヒトの生体内（腸内）で生成される腐敗物質は、発ガンや老化を促進することが知られており、生体内の腐敗物質を積極的に低減できれば、ヒトの健康に寄与できると考えられる。そこで、まず、本願発明では、安全性の高い有用な微生物を有効利用して、腸内腐敗物質を効果的に低減することを課題としている。

上記の腐敗物質は主として大腸内で生成されるところ、大腸内で優勢な微生物（菌種）の一例として、乳酸菌やビフィズス菌（Bifidobacterium属）がある。このビフィズス菌は生体内で有用な機能を発揮する微生物として、古来より食品に利用され、食経験の実績がある。そこで、ヒトの生体内（腸内）で優勢とされるビフィズス菌から腐敗物質を効果的に低減できる微生物（菌株）を選抜することが本願発明の第１の課題である。

ところで、従来、生体内（腸内）で生成される腐敗物質を低減させる物質又は微生物は主としてin vitroの系で探索されてきた。いまだに腸内細菌叢をin vitroで再現できていないことから、実際の腸内の状況を反映して実験できているのか疑問があった。そこで、本願発明は、生体内（腸内）で生成される腐敗物質を低減させる物質又は微生物の作用効果の検証や探索系として適切なin vitro及びin vivoの系を提供することを第２の課題とする。

さらに、本願発明は、透析患者などでは、合併症の原因となるインドキシル硫酸の血清中の濃度の低減効果のある微生物を提供することを第３の課題とする。

本願発明者は、安全性の高い有用な微生物として乳酸菌とビフィズス菌から、本願発明のスクリーニング方法に基づいて、腸内腐敗物質を効果的に低減する菌株を分離することにより、本願発明を完成させた。

本願発明者は、生体内（腸内）で生成される腐敗物質を低減させる物質又は微生物の作用効果の検証系として、in vitroでスクリーニングする際に、緩衝液を使用して菌体が増殖しにくい条件を再現し、腐敗物質の低減効果（低減能）を評価する方法を検討した。そして、本願発明者は、乳酸菌やビフィズス菌が殆ど増殖しない条件で、かつ腐敗物質の低減に必要な最低限のエネルギーとなるグルコース量に、反応溶液を設定（設計）することを特徴とする、腸内細菌が産生する腐敗物質を低減させる微生物（乳酸菌やビフィズス菌など）のin vitroでの選抜方法及び／又は評価方法を確立した。

また、本願発明者は、生体内（腸内）で生成される腐敗物質を低減させる物質又は微生物の作用効果の検証系として、in vivoでスクリーニングする際に、マウスを使用して、血清中からインドキシル硫酸を計測することを検討した。そして、本願発明者は、フラクトオリゴ糖（FOS）及び／又はガラクトオリゴ糖（GOS）並びにトリプトファン（L-Tryptophan）を食餌（粉餌）へ添加し、マウスを飼育して、血清中のインドキシル硫酸の濃度を評価することを特徴とする、血清中のインドキシル硫酸の産生を低下させる微生物（乳酸菌やビフィズス菌など）の in vivo での選抜方法及び／又は評価方法を確立した。

さらに、本願発明者は、腐敗物質を効果的に低減できる微生物（菌株）を選抜するため、まず、安全性の高い有用な微生物として、一般にヒトの生体内（腸内）で優勢とされるビフィズス菌に着目し、Bifidobacterium breveの32菌株、Bifidobacterium longumの92菌株、Bifidobacterium adolescentiの72菌株の合計196菌株についてスクリーニングを実施して、 in vitro で評価し、9株を予備的に選抜した。次に、腐敗物質を生体内で低減する作用や効果を検証する目的から、それら選抜した9株について、動物実験を実施して、 in vivo で評価し、インドール低減作用が強く、血清中のインドキシル硫酸の低減作用も確認された、Bifidobacterium breve OLB6129を選抜し、本願発明を完成させた。

また、本願発明には、上記の選抜されたインドール低減作用が強く、血清中のインドキシル硫酸の低減作用を示すビフィズス菌を有効成分として含む医薬及び食品を包含する。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-152962号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

本願発明の Bifidobacterium breve (B. breve)は、ヒト由来の菌株であり、その菌株自体が増殖しない系において、インドール及び血清中のインドキシル硫酸を著量で低減するという優れた効果を奏する。また、長く食用とされている B. breveは、その安全性が高く、本発明のビフィズス菌OLB6129も、食品分野や医薬品分野へ広く適用や応用が可能である。

マウスへの Bifidobacterium breve（生菌）の投与による血清中のインドキシル硫酸の濃度に与える影響マウスへの Bifidobacterium longum（生菌）の投与による血清中のインドキシル硫酸の濃度に与える影響マウスへのB. breve OLB6129（生菌）の経口投与における、B. breve OLB6129（生菌）の濃度による血清中のインドキシル硫酸の濃度に与える影響 TOSプロピオン酸寒天培地で検出された便中（Fecal)及び盲腸内容物(cecal)中のB. breve OLB6129のコロニー数マウスへのB. breve OLB6129（生菌）の経口投与における、FOSの添加の有無による血清中のインドキシル硫酸の濃度に与える影響 TOSプロピオン酸寒天培地で検出された便中（Fecal)中のB. breve OLB6129のコロニー数とFOSの添加の有無の関係

１．はじめに
ヒトの生体内（腸内）で生成される腐敗物質は発ガンや老化を促進することが知られており、生体内の腐敗物質を積極的に低減できれば、ヒトの健康に寄与できると考えられる。主として大腸内で生成される腐敗物質として、フェノール、p-クレゾール、インドール、スカトール、アンモニアなどを列挙できる。これらの腐敗物質のうち特に、インドールやスカトールなどが悪臭成分であり、また、健康に悪影響を及ぼす可能性のある成分であることから、インドールやスカトールの低減が望まれている。

大腸内で優勢な微生物（菌種）の一例として、ラクトバチルス菌やビフィズス菌（Bifidobacterium 属）がある。ビフィズス菌は生体内で有用な機能を発揮する微生物として、古来より食品に利用されてきた。また、ビフィズス菌には整腸作用があるとされ、整腸剤などにも利用されており、腸内細菌叢の改善にも役立ち、腸内環境の改善を通じて、下痢抑制、肌荒れ防止、花粉症改善、免疫力の道教などにも効果があるとされている。

２．腸内腐敗物質を低減させる微生物の作用効果の検証や探索のための評価系
２−１．腸内腐敗物質を低減させる微生物の in vitro でのスクリーニング又は予備的なスクリーニング
微生物を使用して、腸内腐敗物質（腸内で生成され、悪臭成分などを発生する物質）を腸内環境で低減させるためには、その特定の微生物が腸内で優先的に存在することが重要である。つまり、そのような微生物が備えるべき性質として、腸内環境に適応した条件への耐性が必要となる。

そこで、腸内環境に存在する微生物（菌体）の状態（実情）に即した、スクリーニング方法や評価方法を適用することが望ましい。そのため、腸内腐敗物質を低減させる物質又は微生物を in vitro でスクリーニングする際に、本願発明者は、まず、緩衝液を使用して、微生物が増殖しにくい条件を再現し、腸内腐敗物質の低減効果（低減能）の評価方法を検討した。このような条件を採用することで、微生物が増殖しなくとも、腐敗物質を除去できるという、より腸内環境に近付けた条件で優れた微生物を選抜できる。例えば、対象の微生物が殆ど増殖しない条件で、かつ腐敗物質の低減に必要な最低限のエネルギーを設定するような条件に、反応溶液の成分や濃度を決定することができる。

より具体的には、エネルギー源となる培地成分の配合量では、例えば、グルコース、ラクトース、フルクトースなどの濃度を、対象の微生物の通常の培養条件よりも低下させ、かつ腸内腐敗物質を除去できる程度として0.3〜0.7（w/v）%を適用できる。

なお、スクリーニング（評価・選抜）方法（in vitro 試験）において、グルコースのような炭素源の反応溶液の濃度について検討した結果を例示したが、その他の成分でも同様に、反応溶液の組成や濃度を決定することができる。

２−２．腸内腐敗物質を低減させる微生物のin vivoでのスクリーニング
当初には、動物実験を実施してin vivoにより、血清中のインドキシル硫酸の低減効果を十分に確認できなかった。血清中のインドキシル硫酸の低減効果は、腸内で発揮されることが期待されるが、生体内に微生物（菌体）が投与されても、腸内に到達する前に、その大部分が死滅している可能性や、腸内に到達した後に、それが安定して維持（保持）されていない可能性が考えられた。そこで、本願発明では、生体内に微生物が投与された後に、その生残性や安定性などの向上に寄与することを期待して、フラクトオリゴ糖（FOS）を食餌へ添加してみたところ、血清中のインドキシル硫酸の低減効果を確認できた。

また、動物実験で一般的に使用されるマウスは、若齢の健常個体であるため、生体内の腐敗物質は極めて少量に抑えられてしまい、検出限界を下回ることが多くなる。そこで、本願発明では、マウスを使用した動物実験において、生体内でインドールの前駆体となるトリプトファン（L-Tryptophan）を食餌（粉餌）へ添加し、生体内で生成されるインドールのベースラインの上昇を試行してみたところ、インドールのベースラインについて有意な上昇が確認された。つまり、腐敗物質の指標（マーカー）である、血清中のインドキシル硫酸の濃度を安定して確実に評価できるようになった。そして、特定の菌株について腐敗物質の低減効果を、対照群と比較した有意差として評価や確認できるようになった。

より具体的には、フラクトオリゴ糖（FOS）及び／又はガラクトオリゴ糖（GOS）並びにトリプトファン（L-Tryptophan）を食餌（粉餌）へ所定の濃度で添加し、一般的なマウス（動物実験用）を飼育して、血清中のインドキシル硫酸の濃度を評価できる。このとき、フラクトオリゴ糖（FOS）及び／又はガラクトオリゴ糖（GOS）の総量の濃度として、0.5〜20（w/v）%、好適には、0.5〜15（w/v）%、より好適には、0.5〜10（w/v）%に設定する。なお、具体的な実験結果は省略するが、フラクトオリゴ糖（FOS）の濃度として、0.5（w/v）%に設定すると、糞便中の生菌数として、B. breve OLB6129 の生残性が有意に向上することを確認済みである。また、トリプトファンの濃度として、1〜4（w/v）%、好適には、1.5〜3.5（w/v）%、より好適には、2〜3（w/v）%に設定する。これにより、血清中のインドキシル硫酸の産生を低下させる微生物（乳酸菌やビフィズス菌など）、特にビフィズス菌（ビフィドバクテリウム属の微生物）を、in vivo で選抜及び／又は評価や確認できる。

３．腸内腐敗物質を低減させる微生物
本願発明者は、腸内腐敗物質を低減させる微生物として、腐敗物質を効果的に低減できる微生物（菌株）を選抜する目的から、一般的にヒトの生体内（腸内）で優勢とされる乳酸菌やビフィズス菌、特にビフィズス菌を対象として検討した。そして、ビフィズス菌として、B. breveの32菌株、B. longumの92菌株、B. adolescentisの72菌株の合計で196菌株について、スクリーニングを実施して、in vitroで評価した。その結果として、B. breveの6菌株と、B. longumの3菌株の合計で9菌株を選抜した。

さらに、腐敗物質を生体内で低減する作用や効果を検証する目的から、それら選抜した9菌株について、動物実験を実施して、in vivoで評価した。その結果として、腸内のインドールの低減効果を発揮する菌株を選抜した。

なお、スクリーニングされた、Bifidobacterium breve OLB6129（B. breve OLB6129）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（連絡先: 郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター中央第６）に2010年5月26日に寄託され、本微生物は、受託番号でFERM BP-11257として受託されている。

４．腸内腐敗物質を低減させる微生物を含有する食品又は医薬品
４−１．腸内腐敗物質を低減させる微生物を含有する食品
本願発明の腸内腐敗物質を低減させる微生物（乳酸菌やビフィズス菌など、好ましくは、B. breve OLB6129）は、食品に添加することができる。つまり、本願発明の食品として、腸内腐敗物質を低減させる微生物を添加した任意の食品を挙げることができ、好適には、腸内腐敗物質を低減させる微生物を添加した発酵乳製品又は発酵乳飲料を挙げることができ、さらに好適には、腸内腐敗物質を低減させる微生物（B. breve OLB6129）、並びにフラクトオリゴ糖（FOS）及び／又はガラクトオリゴ糖（GOS）を添加した発酵乳製品又は発酵乳飲料を挙げることができる。なおGOSは、FOSと同様に利用できることが知られている（http://www.nyusankin.or.jp/scientific/hosono_3.html）。また、フラクトオリゴ糖（FOS）及び／又はガラクトオリゴ糖（GOS）の添加量は、総量の濃度として、0.5〜20（w/v）%、好適には、0.5〜15（w/v）%、より好適には、0.5〜10（w/v）%に設定することができる。

また、本願発明の腸内腐敗物質を低減させる微生物（乳酸菌やビフィズス菌など、好ましくは、B. breve OLB6129）を含む食品は、腎臓透析患者用の透析合併症の予防又は改善のための健康保健食品（機能性食品）として適用することができる。

４−２．
本願発明の腸内腐敗物質を低減させる微生物（乳酸菌やビフィズス菌など、好ましくは、B. breve OLB6129）を含む医薬品は、腸内腐敗物質の低減剤、又は腎臓透析患者用の透析合併症の予防剤又は改善剤として適用することができる。さらに、本願発明の医薬品は、お腹の張りの改善剤としても適用することができる。

本願発明の医薬品は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤などの適宜の剤形とすることができる。本願発明の医薬品には、フラクトオリゴ糖（FOS）及び／又はガラクトオリゴ糖（GOS）を含有させることができる。なお、フラクトオリゴ糖（FOS）及び／又はガラクトオリゴ糖（GOS）の含有量は、総量の濃度として、0.5〜20（w/v）%、好適には、0.5〜15（w/v）%、より好適には、0.5〜10（w/v）%に設定することができる。製剤化には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤などの製剤化のために常用される補助剤を添加することができる。賦形剤として、例えば、デンプン、乳糖、白糖、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、リン酸水素カルシウム、合成ケイ酸アルミニウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（PVP）、ハイドロキシプロピルスターチ（HPS）などがある。また、結合剤として、例えば、デンプン、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（PVP）、アラビアゴム末、ゼラチン、ブドウ糖、白糖などの水溶液、又はそれらの水・エタノール溶液などがある。そして、崩壊剤として、例えば、デンプン、カルボキシルメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースカルシウム、微結晶セルロース、ハイドロキシプロピルスターチ、リン酸カルシウムなどがある。さらに、滑沢剤として、例えば、カルナバロウ、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、天然ケイ酸アルミニウム、合成ケイ酸マグネシウム、硬化油、硬化植物油誘導体（ステロテックスHM）、ゴマ油、サラシミツロウ、酸化チタン、乾燥水酸化アルミニウム・ゲルステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、リン酸水素カルシウム、及びラウリル硫酸ナトリウムなどがある。

本願発明の医薬品は、経口投与することが望ましく、ビフィズス菌では、安全性が確立されているので、任意の量を投与できるが、例えば、その投与量は、１日あたり、ビフィズス菌を10億個〜5000億個とすることができ、好適には、100億個〜5000億個である。

［参考例１］腐敗物質の低減作用の有る微生物の選抜方法「in vitro試験」の条件設定
まず、反応溶液の組成では、ビフィズス菌が殆ど増殖せず、インドール（腸内腐敗物質の指標）の低減効果を発揮し、その効果を明確に評価できるように、反応溶液の組成を決定した。

今回の実験で使用する反応溶液では、例えば、グルコースを1.0（w/v）%に設定すると、ビフィズス菌が過剰に増殖してしまい、腸内の環境を十分に再現できなかった。すなわち、ビフィズス菌などの微生物（菌体）は、腸内では殆ど増殖しないことから、腸内の環境に近付けた状態で、ビフィズス菌などによる腐敗物質の低減効果を評価するためには、ビフィズス菌が殆ど増殖しない条件を設定し、そのような環境を再現するべきである。そこで、グルコースを例えば、0.7（w/v）%以下、好適には、0.6（w/v）%以下、より好適には、0.55（w/v）%以下に設定する。

また、今回の実験で使用する反応溶液では、ビフィズス菌が殆ど増殖せず、腐敗物質の低減に必要な最低限のエネルギーを提供する条件を設定するべきであることから、そもそも培地成分をベースとして配合することは適切ではないと考えられる。

一方、今回の実験で使用する反応溶液では、例えば、グルコースを0.1（w/v）%に設定すると、ビフィズス菌の活動（活性）が低下することとなり、インドールの低減効果が発揮されにくくなる。そうなると、本来ならばビフィズス菌の菌種毎でインドールの低減効果などに差違が現れていたところ、その差違が現れにくくなり、その効果を明確に評価しにくくなる。そこで、グルコースを例えば、0.3（w/v）%以上、好適には、0.4（w/v）%以上、より好適には、0.45（w/v）%以上に設定する。また、その他の成分でも同様に、反応溶液の組成を決定した。

反応溶液の組成として、フェノール・p-クレゾール・インドール・スカトールを各20 μg、Bis-Trisを0.1M、硫酸マグネシウム（MgSO₄）を0.75mM、グルコースを0.5（w/v）%で使用することができ、pHは6.5程度である。

［実施例１］腐敗物質の低減作用の有る微生物の選抜「in vitro 試験」
B. breveの34菌株、B. longumの93菌株、B. adolescentisの72菌株の合計で199菌株について、静置培養したところ、B. breveの2菌株、B. longumの1菌株で生育が極端に遅かった。そこで、これら3菌株を実験の対象外とし、最終的には、B. breveの32菌株、B. longumの92菌株、B. adolescentisの72菌株の合計で196菌株について、スクリーニング（評価・選抜）した。

上記の菌株（生菌）を1 mgずつ、参考例１で決定した反応溶液（pH：6.5、フェノール・p-クレゾール・インドール・スカトール：各20μg、Bis-Tris：0.1M、硫酸マグネシウム（MgSO₄）：0.75mM、グルコース：0.5（w/v）%）の2mlへ懸濁した。そして、この懸濁液（反応溶液）を37℃、24hで静置して反応させた後に、遠心分離して、ビフィズス菌（菌体）を除去し、その上清のpHを7に調整した。

次に、この上清をジエチルエーテルにより2回に分けて抽出し、その抽出液を5mlにメスアップしてから、その溶液について、ガスクロマトグラフィー（GC）により、インドール、フェノール、p-クレゾール、スカトールの濃度を測定（検出）した。

なお、ガスクロマトグラフィー（GC）の分析条件は、次の通りである。すなわち、detector: GC-2014 (Shimadzu) equipped with flame ionization detector、column (size): TC-1 (GL Sciences Inc.), I.D.=0.25 mm, L=30 m, dF=0.25 mm、column temperature: 60-170℃(increased by 5℃/min), 170-250℃(increased by 20℃/min)、carrier gas: nitrogen、flow rate: 71.3 ml/min、injector temperature: 240℃、detector temperature: 250℃、injection volume: 1 μlである。

この結果を、表１（B. breveの32菌株）、表２（B. longumの92菌株）、表３（B. adolescentisの72菌株）に示した。

なお、整理番号が“JCM”で始まる菌株は、下記の保存機関に保存されている。

保存機関名：独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（連絡先：郵便番号351-0198 日本国埼玉県和光市広沢2−1、電話番号048-467-9560）

上記の結果では、微生物（菌体）の1g当たりのインドールの低減濃度が13mg／g-cell 以上となる菌株を選抜したところ、B. breveの6菌株と、B. longumの3菌株の合計で9菌株が該当した。なお、インドールの低減濃度で13mg／g-cell以上とは、インドールの低減率では65%以上に相当する。

［実施例２］腐敗物質の低減作用の有る微生物の選抜「in vivo 試験（動物実験）」
上記の実施例１で選抜した9菌株を動物実験（in vivo試験）により、スクリーニング（評価・選抜）した。

Balb/cマウスを購入した後に、飼料（粉末CRF-1／FOS（和光純薬工業(株)）：10（w/v）%、L-Tryptophan：2.5（w/v）%）を1週間、自由摂取させて馴化した。この馴化の期間が終了した後に、所定の菌株（生菌）を生理食塩水に懸濁し、1日に1回の頻度で午前中に2週間、連続して投与した。このとき、生理食塩水の投与容量、各菌株の投与容量、各菌株の投与濃度は、それぞれ10¹⁰cfu/ml、0.2ml／body／day、2x10⁹cfu／body／dayとした。この投与の期間（2週間）が終了したときに全採血し、血清中のインドキシル硫酸の濃度を測定した。

なお、マウスへ投与する菌株（生菌）は、in vitro試験で選抜（スクリーニング）した。具体的には、B. breveの6菌株（MEP22023004、OLB6129、MEP22023007、MEP22023012、MEP22023015、MEP22023016）と、B. longumの3菌株（MEP22023039、MEP22023061、MEP22023078）を選抜した。そして、対照群として等容量の生理食塩水を使用し、所定の菌株（生菌）の投与群と腐敗物質の低減効果について比較した。その結果を、図１（B. breveの6菌株）、図２（B. longumの3菌株）に示した。

上記の結果では、B. breveの6菌株（図１）と、B. longumの3菌株（図２）を生菌でマウスに投与し、この投与の期間が終了したときに、マウスの血清中のインドキシル硫酸の濃度を測定したところ、B. breve OLB6129の投与群において、その濃度が対照群と比較して有意に減少することを確認した。つまり、B. breve OLB6129（FERM BP-11257）の投与群では、対照群と比較して、血清中のインドキシル硫酸の濃度に有意な減少が認められた。この結果より、B. breve OLB6129は生体内で腐敗物質を低減できる可能性が示唆された。

［実施例３］生体へ投与する B. breve OLB6129 の濃度の腐敗物質の低減効果への影響
［実験手順］
Balb/cマウス（SLC, ♀, 6-week-old）を一週間で馴化した後に、表４のように、体重に基づいて 4群に分け、それぞれの群について、生理食塩水と生理食塩水の B. breve OLB6129（生菌）の懸濁液を、2週間で連続して午前中に経口投与した。馴化期間には全群に飼料（粉末CRF-1／FOS（和光純薬工業(株)）：10（w/v）%、L-Tryptophan：2.5（w/v）%）を自由摂取させた。

（１）B. breve OLB6129の投与期間の2週間後に、尾静脈より採血して、血清中インドキシル硫酸の濃度を測定した。血清を超純水（Milli-Q）で100倍に希釈してから、SYRINGELESS FILTER DEVICE 0.2 μm （Whatman）で濾過し、既報（Takayama et al., Am J Kidney Dis. 2003 Mar;41 （3 Suppl1）:S142-5）に則って、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により測定した。

（２）B. breve OLB6129の投与期間の終了時に、便を採取し、解剖時に、盲腸内容物を採取して、それぞれに含まれる、B. breve OLB6129（投与菌）の菌数を測定した。

［実験結果］
B. breve OLB6129の投与期間の終了時に、血清中インドキシル硫酸の濃度を確認したところ、インドキシル硫酸の濃度の低減効果について、2 x 10⁸ cfu/body/dayの投与群（III）と、2 x 10⁹ cfu/body/dayの投与群（IV）では、生理食塩水の投与群（コントロール）（I）と比べて有意差があったが、2 x 10⁷ cfu/body/dayの投与群（II）cfu/bodyでは、生理食塩水の投与群（コントロール）（I）と比べて有意差はなかった（図３）。

また、便中と盲腸内容物中におけるB. breve OLB6129（投与菌）は、用量依存的に検出された（図４）。

［実施例４］生体へ投与する FOS の有無の腐敗物質の低減効果への影響
［実験手順］
Balb/cマウス（SLC, ♀, 6-week-old）を一週間で馴化した後に、表５のように、体重に基づいて 4群に分け、それぞれの群について、FOSを無添加の生理食塩水と生理食塩水の B. breve OLB6129（生菌）の懸濁液、FOSを添加した生理食塩水と生理食塩水の B. breve OLB6129（生菌）の懸濁液を、2週間で連続して午前中に経口投与した。馴化期間には全群に飼料（粉末CRF-1／L-Tryptophan：2.5（w/v）%）を自由摂取させた。なお、B. breve OLB6129（生菌）の濃度は、実施例３において、腐敗物質の低減効果に関して必要性が示された最低限の用量である、2 x 10⁸ cfu/body/day に設定した。

（１）FOSの投与期間の2週間後に、尾静脈より採血して、血清中インドキシル硫酸の濃度を測定した。血清を超純水（Milli-Q）で100倍に希釈してから、SYRINGELESS FILTER DEVICE 0.2 μm （Whatman）で濾過し、既報（Takayama et al., Am J Kidney Dis. 2003 Mar;41 （3 Suppl1）:S142-5）に則って、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により測定した。

（２）FOSの投与期間の終了時に、B. breve OLB6129投与群の便を採取し、生体内を通過した B. breve OLB6129（投与菌）の菌数を測定した。

［実験結果］
FOSの投与期間の終了時に、血清中インドキシル硫酸の濃度を確認したところ、B. breve OLB6129のみの投与群では、インドキシル硫酸の濃度の低減効果は小さかった（図５）。また、インドキシル硫酸の濃度の低減効果について、FOSのみの投与群では、生理食塩水の投与群（I）と比べて有意差はなかった（図５）。一方、インドキシル硫酸の濃度の低減効果について、B. breve OLB6129とFOSの投与群では、生理食塩水の投与群（I）などと比べて有意差があった（図５）。なお、B. breve OLB6129のみの投与群と、B. breve OLB6129とFOSの投与群の2群（OLB6129 +）について、便中の B. breve OLB6129（投与菌）の菌数を測定したところ、FOSの投与群において生菌数が有意に高く観察された（図６）。

FERM BP-11257
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

腸内腐敗物質を低減させる微生物の in vitro のスクリーニング方法において、グルコースの濃度が0.3〜0.7（w/v）%となるように反応液へ添加することを特徴とする、前記方法。
微生物を反応液に懸濁させ、37℃で24時間反応させた後に、微生物を除去し、反応液からジエチルエーテルを用いて腸内腐敗物質を抽出して測定することを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
腸内腐敗物質が、少なくとも、インドール、フェノール、p-クレゾール、スカトールの中から選ばれる1つである、請求項２記載のスクリーニング方法。
腸内腐敗物質を低減させる微生物の in vivo のスクリーニング方法であって、フラクトオリゴ糖（FOS）及び／又はガラクトオリゴ糖（GOS）、並びにトリプトファン（L-Tryptophan）を食餌へ添加し、マウスを飼育して、血清中のインドキシル硫酸の濃度を評価することを特徴とする、前記方法。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の、腸内腐敗物質を低減させる微生物のin vitro のスクリーニング方法を、あらかじめ実施することを特徴とする、請求項４に記載の腸内腐敗物質を低減させる微生物の in vivo のスクリーニング方法。
フラクトオリゴ糖（FOS）の濃度及び／又はガラクトオリゴ糖（GOS）の濃度を0.5〜20（w/v）%、並びにトリプトファンの濃度を1〜4（w/v）%とする請求項４又は５に記載の方法。
微生物を乳酸菌及び／又はビフィズス菌とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。